10
Nick Callamaras and Ian Parker 1 Laboratory of Cellular and Molecular Neurobiology, Department of Neurobiology and Behavior, University of California Irvine, CA 92697-4550, USA 1 Corresponding author e-mail: [email protected] Ca 2+ liberation by inositol 1,4,5-trisphosphate (IP 3 ) is `quantal', in that low [IP 3 ] causes only partial Ca 2+ release, but further increasing [IP 3 ] evokes more release. This characteristic allows cells to generate graded Ca 2+ signals, but is unexpected, given the regenerative nature of Ca 2+ -induced Ca 2+ release through IP 3 receptors. Two models have been pro- posed to resolve this paradox: (i) all-or-none Ca 2+ release from heterogeneous stores that empty at vary- ing [IP 3 ]; and (ii) phasic liberation from homo- geneously sensitive stores. To discriminate between these hypotheses, we imaged subcellular Ca 2+ puffs evoked by IP 3 in Xenopus oocytes where release sites were functionally uncoupled using EGTA. Puffs were little changed by 300 mM intracellular EGTA, but sites operated autonomously and did not propagate waves. Photoreleased IP 3 generated ¯urries of puffsÐ different to the prolonged Ca 2+ elevation following waves in control cellsÐand individual sites responded repeatedly to successive increments of [IP 3 ]. These data support the second hypothesis while refuting the ®rst, and suggest that local Ca 2+ signals exhibit rapid adaptation, different to the slower inhibition following global Ca 2+ waves. Keywords: Ca 2+ signaling/inositol trisphosphate/quantal Ca 2+ release/Xenopus oocyte Introduction The liberation of Ca 2+ from intracellular stores into the cytosol through channels gated by inositol 1,4,5- trisphosphate (IP 3 ) mediates the initial Ca 2+ mobilization step during transduction of signals initiated by many neurotransmitters and hormones (Berridge, 1993). Numerous observations from permeabilized cell prepar- ations and single cells have shown that Ca 2+ is released from intracellular stores in proportion to the strength of stimulation, so that a sustained elevation of [IP 3 ] at sub- maximal levels causes only a transient, partial release of Ca 2+ , whereas further increments of [IP 3 ] evoke additional pulses of Ca 2+ liberation (Muallem et al., 1989; Meyer and Stryer, 1990; Bootman, 1994a,b; Bootman et al., 1994; Parys et al., 1996). This characteristic was termed `quantal' Ca 2+ release, because it was thought to arise from the abrupt, all-or-none emptying of discrete intra- cellular stores that respond at differing threshold concen- trations of IP 3 (Muallem et al., 1989). However, that hypothesis remains unproven, and the mechanism underlying quantal liberation is unclear (for reviews see Taylor, 1992; Bootman, 1994a; Parys et al., 1996; Koizumi et al., 1999). In particular, the graded nature of Ca 2+ release is dif®cult to reconcile with the well- established stimulatory effect of cytosolic Ca 2+ on IP 3 receptor (IP 3 R) activity (Iino, 1990; Bezprozvanny et al., 1991; Finch et al., 1991), which would be expected to lead to regenerative, all-or-none responses through Ca 2+ - induced Ca 2+ release (CICR). Two major models have been proposed to resolve this discrepancy: (i) all-or-none release from stores exhibiting heterogeneous sensitivities to IP 3 , as discussed above (Muallem et al., 1989; Bootman et al., 1992; Cheek et al., 1994; Beecroft and Taylor, 1997); and (ii) a `steady-state' model, involving intra- cellular stores with similar sensitivities to IP 3 that each release Ca 2+ in a phasic or adaptive manner in response to stepwise increments of [IP 3 ] (Irvine, 1990; Missiaen et al., 1991, 1992, 1999; Nunn and Taylor, 1992; Tanimura and Turner, 1996; van de Put and Elliott, 1996; Koizumi et al., 1999). A possible means to discriminate between these models is provided by recent improvements in single cell imaging techniques, which have revealed that IP 3 evokes Ca 2+ liberation as elementary packets (`Ca 2+ puffs'), arising at discrete subcellular sites comprised of a few tens of IP 3 R (Parker and Yao, 1991; Parker et al., 1996; Berridge, 1997; Bootman et al., 1997; Swillens et al., 1999). Puffs are generated at low concentrations of IP 3 by the concerted opening of several channels within a cluster, whereas at higher concentrations, neighboring sites become function- ally coupled by Ca 2+ diffusion and CICR so as to support global Ca 2+ waves that propagate in a saltatory manner throughout the cell (Parker and Yao, 1991; Lechleiter and Clapham, 1992; Parker et al., 1996; Berridge, 1997; Bootman et al., 1997; Callamaras et al., 1998; Marchant et al., 1999). The puff sites are believed to be formed from clusters of IP 3 R distributed on a contiguous endoplasmic reticulum (ER) and, although not physically discrete, they represent functionally discrete subcellular Ca 2+ stores (Parker et al., 1996; Berridge, 1997). We were, therefore, interested to study the responses of individual puff sites to determine whether they exhibit all-or-none or phasic Ca 2+ release in response to incremental steps of [IP 3 ]. Our earlier attempts to do this were frustrated, however, because separable puffs could be observed only over a narrow range of IP 3 concentrations (Sun et al., 1998). Because of the steep dose dependence for activation of puffs, a certain thresh- old [IP 3 ] was required to evoke any events, whereas concentrations less than twice as great evoked propagating Ca 2+ waves (Callamaras et al., 1998). To circumvent this problem, the present experiments were done by imaging Phasic characteristic of elementary Ca 2+ release sites underlies quantal responses to IP 3 The EMBO Journal Vol. 19 No. 14 pp. 3608±3617, 2000 3608 ã European Molecular Biology Organization

Phasic characteristic of elementary Ca2+ release sites underlies

  • Upload
    danganh

  • View
    236

  • Download
    0

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Phasic characteristic of elementary Ca2+ release sites underlies

���� �������� ��� �� �����

���������� �� ������ � � �������� ������������ ������ � ������������� � � �������� � ������� �� ������ �� ���� �� � !�"#$%%&� �'�

(������ �� � ������#����) ����*�+���,��

���� �������� � ������� ���������������� ����� ����������� �� �� ��� ���! "����� ��� ����� ����

������� �� #��� ��"�����$ ���! �%�&�� '��������( )��� "���"����" ������ "���� � $�����$�*�* ���� ��$����� �� �� ���+��"�*� $�%�� ���$�����%� ���� �# �������*�"�* ���� ���������$� ��� �"����( )�� '�*��� ��%� ���� �������* � ����%� ��� ���*�+, ��� ���������� ����

������ #�' ����$������ ���� �� �'� � %� ���$ ���!- ��* ���� �����" �������� #�' ��'��$������� ������%� ����( )� *��"�'���� ���������� � �������� �� �'�$�* ���"������ ���� ��##��%�&�* � ��� �� ������� ��" �� ���� ������ ������� #��"������ ��"�����* ����$ ./)0( ��##� ������� "���$�* � �11 �2 ���"������ ./)0� ������ �����* �����'���� ��* *�* �� ����$����%��( ����������* ��� $�����* 3���� �# ��##�4*�##��� � �� �����$�* ���� ���%���� #�������$��%�� �� "���� "����4��* ��*�%�*��� ���� �����*�*�����*� � ��""����%� ��"�'��� �# ���!( )����*�� ����� �� ��"��* � ������� ����� �#���$ ��5�� ��* ��$$�� �� ��"�� ���� ��$���� �+���� ���*�*������� *�##��� � �� ����� ��������� #�������$$����� ���� ��%��(��������) � - ��� ��� �.� ������ ������������./�� ���� - ����.����� �����

����������

0� �������� �� � - ���� � ���������� ����� � ���� ������� ������� ��� �� ���� �� � ������ (�$�%#������������ 1�234 ������ �� � ����� � - ������5���� ��� ���� � ��� ������� �� ��� ��� � ������ �� �� � ������ ������� � � ����� � 1������� (��34,������� ��������� � ���� ��������5� ��� �����#���� � � � �� �� ���� ��� ���6 ���� � - �� ��������� � ���������� ����� � ��������� �� �� ��� ��� ������������ � �� ���� � ������ � ������ �� 7�238 �� ���#��9���� ���� ����� � �� � ��� �� �� ������� ���� ��� -� 6���� ������ � ��� �� �� 7�238 ��* ������� ������� �� � - �������� 1������ � ��,� (�:�; ��� � �'����� (��&; ������ � (��$���; ������ � ��,� (��$;2���� � ��,� (��!4, 0��� ������������� 6�� ����</�� ���= � - ����� ����� �� 6�� ������� �� �������� �� ������� ���#��# � ����� � �� ������ � ���#������� ����� ���� ���� � �� ������ � �������� �� � #

������ � �� �23 1������ � ��,� (�:�4, >�6��� ������������� ���� � � ���� � � � �� ���� ���� ����� � /�� ��� �������� �� � ���� 1��� ���6� �0������ (�� ; ������ � (��$�; 2���� � ��,� (��!;?��5��� � ��,� (���4, � ����������� �� ����� ���� ��� - ���� �� ���@���� �� ��� ��� 6��� �� 6��#��������� ����������� ���� �� ��������� � - � �23������ 1�23A4 �������� 1�� �� (��&; �5���5�� � � ��,�(��(; B� �� � ��,� (��(4� 6���� 6���� � 9���� �� ����� �� ������ ���#��# � ���� �� ������� � -#� ���� � - ���� 1�A4, 06� ��C�� ����� ���� ������� �� ����� ���� ������� ��) 1�4 ���#��# � ���� ���� ����� 9������ � ����� ��� � ����������� �23� �� �������� ���� 1������ � ��,� (�:�; ������ � ��,� (�� ; �* � ��,� (��$; ������ � � 0������(��"4; � � 1��4 � <�����#����= ����� � ����� � � ���#������� ����� 6��� ������� � ��������� �� �23 ���� ������� � - � � ������ �� ������� �� � � ���� � �����6�� � ��� �� �� 7�238 1���� � (��&; ������ � ��,�(��(� (�� � (���; �� � � 0������ (�� ; 0� ������ � 0�� �� (��!; �� � 2�� � � D������� (��!; ?��5���� ��,� (���4,

� ������� �� � �� �������� �� ��6 ��� ������� ������� �� �� � ������� �� � �� �� ��� ����� ���� �/��� 6���� ��� ����� ���� �23 ��*� � -

�������� �� �� ���� ���*�� 1<� - �����=4� ����� � �������� ���������� ���� �������� �� � �6 � � �� �23A12��*� � � E��� (��(; 2��*� � ��,� (��!; ������� (��";������ � ��,� (��"; '6��� � � ��,� (���4, 2���� ��� ���� �� ��6 �� � ������ � �� �23 �� �� �� ������ � � �� ����� ��� �� 6���� � ������� 6���� ������� �� � ������ �� ������� � ���� ���� �� ���� #���� ������ �� � - �������� � � �A �� �� �� ������������� � - 6��� ���� �������� � � ��������� �� ����������� �� ��� 12��*� � � E��� (��(; ������� � �������� (�� ; 2��*� � ��,� (��!; ������� (��";������ � ��,� (��"; ��������� � ��,� (��:; ������ �� ��,� (���4,

0� ���� ���� �� ����� �� � ����� ���� ������� ���23A ���������� � � �� ������� ��������� ��������1DA4 � �� �������� �� ���������� ������� ��� ���� ��� ���� ���� ������ ���������� � - ����� 12��*� � ��,�(��!; ������� (��"4, F 6�� ������� � ����� ������� �� ���� �� �� � �������� ���� ���� �� ����� 6���� ��� 9����� ���#��# � �� ������ � - ���� � ���� � �� � ��� ��� ���� �� 7�238, G�� ����� ��������� �� ���� 6� ���������� ��6��� ����� ������������ ����� � ������ � �� ��� � ����6 �� � �� �23�� � ������ � 1'� � ��,� (��:4, ����� �� �� ������ �� � � ��� ��������� �� ������ � ����� �����#��� 7�238 6�� �/���� �� ��* � � � ��� 6������ � ������ � ��� ��� �6�� �� ���� ��*� ��������� �� - 6��� 1��������� � ��,� (��:4, 0� ������� � ����������� �� ��� � 9���� �� 6� �� �� ����� �

����� ����������� �� ��������� ���� ����� ���������� ������� ����� �� ��

��� ��� !����� ���� �� ��� �� � �� ����� ����

�� �������� ��������� ������� �������� ���

Page 2: Phasic characteristic of elementary Ca2+ release sites underlies

� - ��� ��� � ����� ������ ���� 6� ����� 6��� ��� - ����� DH0�, G6� � �� ��� ���6 � #��� ��� � -

�� �� � 1 & ��I(�I(4� DH0� � ������ � - �������� ����������� ����� �� ��6 ���� ���� 1A������(��$; >�� � � ���� (��"; '� � � ��,� (��:; ?���� ��,� (���4� 6��� ����� � �����#�� � � - �����*��6 �23 ������� ������� 6���� J && � ��� �������� ���� ���� 1'� � ��,� (��:; '6��� � � ��,�(���4, 0��� ������ � � �� ���� �� � ������ � ��6 ���� ����� ���� ���� �� �������� �� � �������� �����6� ����� ��� ��� ��� ���� ���� �� �� �� �� ��������� ������� � � ��� �� �������� � - 6��� � ������ 7�238,

G�� ��� @ �� �� 6� ���� � ������ ���� ����� ���� ����� � �� ��� �� ��� �����6� � � ��� � ������ 7�238 ���K� ���*� �� ����� �� �� ��� �� ��� ������� �� � - �������� ���� ������� ��� � � ����� �� �����6� � � - 6��� 12��*� � � ������� (��&;���� � � 2��*�� (��$4K6� ���� ��� �� ��* ����������6� � ������ ���6�� � ����� �� 7�238, 0�������� �������� �� ������ ���������� ���� ���������*� � /�� ��� ���� ������, B��������� � ��#������ ���� 9������ ������ ���� �� �� ���6�� � ��#� �� �� �23� �� ���� � 6��� � <�����#����= ����� 6���� /�� ��� ���� �� ����� ���� ������ ������ � - ���� � ���������� ����� �������� � �������� ��������� �� �23,

"����

��������� �������� �� ����� ����� �� ����D9���� �� 6� ������ ��� ��� � ������� ������������ ����� ��� � � �� ��� �� ����� ��������� ���� ���� L����� � �� �� � - � ������� G��� H� $:: ��20� ( 1GH#(4 ��� � � (&& �� ��� �� ������ � �� � ���� ������� �� � ���� �� 3I% �� ���6 �� ��������� 1��������� � � 2��*�� (���4, B����� �� �M����� ���� � ������ ��� ���� 6� ������ �� � && ������ ���� � �� ��� �� �� ����6 � ����� ���������� ������ �23 ����� � �� �� ���, 0� L��� ������� � �� � ����� � � ���� �� 9� � �� ���������� 6�������� �� � ����� �� ������ � � ����� � ����@���� 1��������� � � 2��*�� (��:4,

� �� ���� ���� 1���� ����� � 6��� DH0�4� �������������� L���� ��*� ��� �� � � - ����� ����� � �������� ����� 6���� ����������� �� �� L���� ��*���������� � � - 6��� � � �� ���� ������� ���� - ���� ���� ������� ���� ��� � �� ��� �� 1B���� (�; ��������� � ��,� (��:4, 0� �� � �� �23�� � ������ � ��� 6���� ������ ����� 6� ������6�� ����6� � � 6��� 6� ������� � ������ �� L����N%&O ���� �� ��� ���� �/���� �� ��* � �� �6� �������� � �� ��� �� , 0�� ������#������� ����� � �� � -

��� ��� 6� ������������ ����� ���� � ���������� ����#� � �� DH0�, � �� ��� � �� DH0� �� ��� �� � ��

6�$( �( B� ���� �� � ������ � �� �23#� ����� � - ���� ���� �����6� � � ���������� � C���� �� DH0�, 2� �� ���6 �� ��� ����� �� � -#�� � � L����� �� 6��� ����� � ��� � �� ��� �� ������ ��������� � � ��� �� � � ���� ��� �� �����, � ����� � L����� � ����� 1��.�41� ����� � �� 7� -84 �� � ��� �� � ����� ��� <6���= ������ 1�� � ������ �� �� ����� ���4, 104 A����� ���6� � ���� �� �� ���������� L������ ����� � ������� 1� ������ � ��4 ������ �� �� ���� � ������ �� ������� 6��� �� � � �� �����, 174 �������� ���� �� ��*� � ����� ����� ���� � C��� � DH0� �� � @ �� � ���������� �� � ������ �� 3&& ��� ������ 6��� (%& �� � -, A����� �� ���� ����� �� @ �� ��� (" ������ 1��� �� �� �����4, 1�4 ����� ���6 ������ �� ����� � � �� �� ��� ���� � C��� � DH0�� � � ���� ����������� ����� � DH0� ��@ �� � ���������� �� � ������ � �� 3&& � � �&& ��, D��� ���� �� � ����� �� ���� � ��� ���� � �� ���� ��*� � ���� � � ���, 0���� ���6�� ��� ����� �� L����� � ��� ��� ������ ���� ��� ��9� 1&,$ ��4 ���� � � ��� � �� ������ ���� �����,

����� ����� �� ��#�����$� ���� ����� ���

���

Page 3: Phasic characteristic of elementary Ca2+ release sites underlies

L��� ������� � ��*� � �� �����, 0�� ���� 6��� �������/� �� � � ������ ��� �� 6��� � ����� � 7�238� ������� � ������ � � ��� �� ������� ��������� � 6���1B���� (�4,

'������ ������ 6� ����� � 6� DH0� 6�� � C������� ��� 1���� ������4 �� ������ 6��� ���@�� � � -

1(& �� DH0� - % �� �� ; (� ������4 �� ����� ��

7� -8 � �� � C���� ������� �� � ��� 1N(%& �4��������� �� �� ����� ��� �� ����� � ������������ � ������ , 0���� �� � ������ � ��6 �������� �� � ��*�� �� ��� ���� ����� �� �� �� � ��� - �� � �� DH0� �� �� � ������ �� ���� � - �� �� �������� �� ��������� �� 7� -8, B��������� ��������� ����� ���� � � - ����� � �� DA �� ������

6�$( �( A��� �� �� ����� ���������� L���� ���� � � ���� ����� � 6��� DH0�, 104 �� ��� ���� ���6� ������� ��� ��� � � �� ���� ����� � ���� � �� �6� �� ����� ���������� L���� 1%& �� ������� 4� ������ 6� ���*� �� �� ����6�, 0� @��� L��� ��*� ������� 6��� ����� ��� ��� �6� ���� 1<M= ����� �4� 6���� ��������� ������ ��� ��� �� ��6� ���� �� �� ��� �� , 0� ��� � L��� ��*� ����� ������� �� ������� ����� ���� � ���� ���� �� �� �� @��� L���� ��� ������� � 6�� � �� ���� ���� ����� �� ���� �, 0� ����� ���6 L����� � ���@�� 1��������� ��9��4 ������ �� �� �6� ���� 1� � � �4 � ������ � �� ����, 174 A��� �� � � ����� � ������ ����� 6��� 3&& �� DH0� ����(%& �� � -, 0� ��� 6�� ��������� 6��� ���� ����� ���������� L���� �� ������ � ������� �� �� � ������ � ��, 0� ���� ���6� L����� ��� ����� ���� � & �� ���� �� �� � �� �� �� ����,

�%�������� ��! %����

���

Page 4: Phasic characteristic of elementary Ca2+ release sites underlies

����� 1P�� � � � ������� (�� ; ������ � ��,�(��:4, � ����� �� �� � 1 ��4 � ��� �� ��� � ��� DH0������� � ���� ������ ���� ��� ���6 � #��� ��� � - �� �� �1>�� � � ���� (��"; '� � � ��,� (��:; ?��� � ��,�(���4 �� �� ���� � 6��� � ������� �� � - ������� ���6 ���� ���� ����� I3 �� ����� 1���������� ��,� (��:4 6��� ����� � �����#�� � � - �����*��6 �23 ������� ������� 6���� J && � ��� �������� ���� ���� 1E�� � ��,� (��%; ������� (��";'� � ��,� (��:; '6��� � � ��,� (���4, ��� ����/� �9���� �� 6� ������� ��� � 3&& �� � ����������DH0� 1-(%& �� � -4� �� ���� �������� � ���������� 6������ ������ ������ ������ � �� ��5 �� *� ���� ������� 1�� ����) ��.� &,:(% � &,&$(� ���� ���� ���(3% � (& ��� Q %� � ��; DH0�) ��.� &,!� � &,& !����� ���� ��� ((3 � " ��� Q �& � ��; ����������� �� � @� ������4, >���� �� � ������ � ��DH0� ������ � ����� ������� � � ���� ��������1B���� (4,

�������� �� ��� ������ ���� �� �����G�� ��� ��C�� 6�� �� ����� � - ���� ���� � ������������ � ���� � �� ���6�� � ����� �� 7�238 � ������ �������� ���������� L����, B���� � �������������� ����� ���� �� � � �� ���� ��� 1 �� ����� 6���DH0�4 ��*� �� �6� �� ����� ���������� L����������� �� � � ����� �� ,% �, 0� @��� L��� �������������� 6��� ���� ��������� ������ ���� �� �� ���

�� , � ��� � L��� ����/� ��� ��*� � �� � ��� ������������ � ���� � 7� -8 ���������� ���� ���� � ��������� ���� ���� � 6�� ������ � � ���� ���� 6�� ��� ���� �� �� � ����� 6��, 0� � ������� �� � -

���� � �����6� � �� @��� 6�� ��� �� ����� ������� ��������� �� �� � ������� ��� ����� 6 ������������ ������ � ������� � ������� �� �� �� � ��6#��@ ���� ������� 1���� � � 2��*�� (��$4 � � �� ������ � ��� ��� � -#�������� �I ���� �� � �� �����12��*� � � ������� (��&4,

� ������������ ����� � ����� �� � - ���� �� 6�������� ���� � ���������� ����� � �� DH0� 1B���� �4,� � ����� L��� ��*� � ��� �� � L���� �� ����� �� ������ ���� ��� � �� ��� �� � 6���� ������ ����6���� � �6 �� ��� �������� �� � � �� ������ � -

��� ���� � ������� ��6��� �� ����� , � ��� � L����� � � ����� �� ( � �� ��*� � ���� ��� �� � L���� �������, � ��� �� � �������� �� ���� ��� 6�� ����� ��� ��� �� @��� L��� � �� � �� 9���� � ����������� 6����� � �� ������� �� �� ��� � L��� �� �6�#������ ������ �� @���� �� �� �� ��* � ���� � �� ������� ��� ����,������� �� ���� �� 6� �� ��*� �� ����� L������ ������ ����� ������� , 0� ������� �������� ��������� ���� ����� � ������ �� �� ��6� ���� � B���� �� ���� �������� � �������� �� � - ��� �� �� � ���� � �� ����� ��������� �� �23� ������ � ��������� �� /�� ��� ���� �� �� � ������� � ���������� 1���6� � �� � ��������� 4,

6�$( �( � - ���� ���� 9����� ������ ���� �� �����6� � ��� � ����� � 7�238, 104 �� ��� ����� ��������� ����� ��*� �� ���������� L������ ����� � ������� � ������ �� �� ���� � ������ �� �� ����6�, >��������� ���6 �� ������� �� � ��/� ��� �� ���� ������ � �� � �� ���� �� ��� ���� �� L����, ���� 6� ����� � ���� � @9� ��� �� � � �� �� ������ � � ����� �� � �� 6� ������ � %& �� ��� �� � ����� �� � ��� ����� ������� � ��� � �� ��� �� � ���� � �� ����� ���� � � @� ����� ������ � �� � � � �� ���������, '������ ����������� � 6������� � �6� ������� �� ������, 174 ��� �� ����������� � ������ � � ���� ������ ������ � �������� �� ������ � �� �� @��� 1�� 4 � �����/� � 1��4 ����� �� ��� ���� ��� �����6� � L���� �� ����� � ������� 1� ������ � ��4,

����� ����� �� ��#�����$� ���� ����� ���

���

Page 5: Phasic characteristic of elementary Ca2+ release sites underlies

����� � ��� � �������� ������� ��� ������ ������ �����0� � ���5 �� *� ���� �� � - ���� �� � �������� ����� ��� ������ 6 @��� ������ �� ������ � �� ������ ���� �� �� �� ���������� L���� � �� ��� � ��DH0� 1B���� 34, F�* ��������� ��*� ����� �������� 6��� � �������� �� � �� ��� ��� � � 6������� �� � ��������� ���� � � ��� ��� ����� ��� ������ �� L��� 1B���� 3��4, F� �� L��� ������� 6��� ��� � ������������ �� �� ��� ��� �� �� ���������� �� � � ��� ���� � ����� ��� �� ��� �������� ���� L����� ������� ���� �� L���� �������� ����������� 1��� 6��� ����� ������ ����� �� ��� ������4�� �� �� �� � ��6 ��/� �� ��� ����� ��� ��1B���� 3�� � � �4, B���� 3� ���6� ��� �� ����������� ������� �������� ��� �� � ����� ���� � ���� �� ������ 1�� 4 � � ��� ����/� � ����� � ���� �� �������� �����6� � ��� L��� 1��4, F��� �� 6�*�� L����

����� � �������� ���� ������� ���� �� � �� � �� � ��6 �� � � ��� �� 6� � �� ����� ����� �� � ��� ��� 1B���� 3��4, 2���������� �� �� L���� ��*�� ����� � ����� �� ����/� � ������ � � ���� <����= ��� �� ������� 6��� ����� ���� ���� ��� ����� ��� �������� �� ���*� ����� � � � �� ��� �� �� ��� ����� ����� 1B���� 3��I�4,

� ������� 9��� ���� ��� �� ��� �� � ������ � ������� �����6� � ���� �� L���� ����� � ���� ������������ L���� � ���� � ������� ���� � � ���* ��7�238� ����� ��� � �������� ������ � ��� � ����,'���� ��������� � � ����� ���� ���� 6�� �� �� ���,B����� �� ��� ������ � ������ � �� ����� �����6� �6�* ������� 1B���� 3�� � � ��4 � ������ ���� �23���� � ��� � ��� ����� ��� ��, '�� ���� ����������������� �� �23 � �� ����� �� ���6 1����#��� !& �;'��� � � ��������� � (��:4, B� ����� 6 ������� ������ �� 7�238 � �� ��� 9���� ��� �� ����� � ��� � �

6�$( �( D�������� �� ���� �� 7�238 �����6� � ���������� ��� � �����#���� ����������� , 104 �� ��� ����� ���6 � - ���� �� ��*� ������� ���������� L����� ������ 6� ���*� �� �� ����6� �� ����� � � ��#���� � ������ 1� ������ � �4, ��� ���������� L���� 6� �� � @9�������� 1 & ��4� ���� �� ���� � �� �� L��� ��*� � �� � ��� ������ ���� �, 2����� �� �& � 6� ����6� ��6 ��� �����, 0� �� ��� ����������� �� ������ ���� � �� ��� ��6 L���� �� �� �� � ������ 1(% � � 3& �4, 174 ������ �� ���� ����� ��* ���� � 1�4� ����� � � �6� ������� ���6� � �� ���� �� ����������� �� �� ��� � ���� � �� � �� ���� �� � ����� ��6 �� L����, ���� 6� ����� � �� � ������ ��� � - ��� �� ��� � �� ��� ��� �� � � � �� ������ �� �� ��* L����� � ����� ��� � ��*� �� �� ��� � L��� �� �� ���� ��*� �� ��@��� L��� � ���� �����,

�%�������� ��! %����

���

Page 6: Phasic characteristic of elementary Ca2+ release sites underlies

�������� ���� � �� � #�� �� � �������� �� � - ������ �23 12��*� � � ������� (�� 4, 2���� �� �� ��������������� L���� 6� ������� 6��� ���� ������� ��C���� �� ���� �� @��� L��� ��*� � �� � ������������ ���� �, ���� ����� ���� �� 6� �� ��*� �� �� ��� � L��� �� �� ����� � �� � ��#L���� ������ �� �� � �� 3& � 1B���� $�4� ��������� ������������ �23 ���� � � ���� �� @��� L��� ������� 6������� ���������� �� �� ��� � L���� �� � ��� ������ - ���� 12��*� � � ������� (�� 4, 0� ���� �������#���� ����������� �� ���� � ����� �� ������ �� 7�238� 6����� ���� �� ���� �� B���� $��������� 6��� � ����#��� �� N(& �, G �� ������� �� ���9���� ��� ������� �� ���������� L���� �� ��� ����� �� ������ �������� ������ � ���� �� 7�238�� � �� ����� ���� �� ���� ������ � 6���� � �6�� ��� �������� �� �����6� � ���� �� L���� �������� � � ����� � ���� ����������� �� ������� ������ �� ������ � ������ �� 7�238,

������ ������� �� ���� ���� ����� �����0� ����� ��� �� � � - ��� ��� �� �������� �����#����� L���� ���������� � B���� � ����� ��� ���� ���� ����� � �������� ���� � ���� ����� ���� #��� �� ����� 6 ���� 6� ������� 6��� ���� �������� �� �� � ������� L��� ���� � ��������� � �

����� �� ���� � ���� , 0� �������� �� ��6 ��������������� 6 ������ ����� ������ �� @9� �� ��� ������� �� �� ���� �� �������� �� ����@� ���� ����� ��� ����� � ���� � �� (& �� ��� ������ 1������ �� ��������� ����� �� �� ���4, B���� % ���6� ���������� ����� �� 9���� �� � � ����� �� ( ������,0� ����� 6�� @��� ��������� �� � �� �� L���� ��� � �������� ���� �� ��* � L���� �� ����� ���� ���������� 6���� N%&& �� 1B���� %� � � �4, 2���� L����6� �� ������ �� � � ����� �� ( �� 6��� �� ������� �� �� ��� � L��� ����� �� %&O� �� ���� ����������� �� 6� ��*� �� ���� �������, 0� ��� � L������� ��*� � ��� �� � L���� �� ������ ��� � � ����������� �� L��� �� � ��� 6� � �� ���� � �� @������� � ��� ������ ���� 1B���� % � � �4, ����������� ���� �� � ���� � ���� ����� � ���� � �� ����L���� 1B���� %D�4� �������� � ��� � ��� �� ����������� ��� ���� �� �� � �� � �� ���� L���1B���� %D� � � �4, 0��� ����������� � ����� � �� ���� ��������� ���� ������ ���� �� ����������� ��*������ ������ ������� �, ����� �� ����������� �� ������ �� ���� ��5 �� ���� ��*� �� �� ��� � L��� �� ����� �@�� ��� ��� �� ���� � �� ���� ��� �� �� @��� L���,������ �� �� ����� ����� ��*� �� ��� �������6� ���� �� ��*������ �� ������ � � ���� ���� ����� � L��� 6�� �� ��� �@�� ��� ����� � 6���� �� ��

6�$( �( � ��� ��� ���� �� �� � - ���� ���� � ���� � �� ����� ���������� L����, 10 � � 74 �� ��� ���� � � ��� �� ������������������� � ����� ��*� �� � �� �� ���������� L��� 1$& �� ������� 4, 1� � � 84 ������ �� � ������ ���6� � ���� �� �� ����� L���� �� � � ����� �� ( �, ���� 6� ����� � ���� �� ��� ��� �� �� � 1�4� � � 6��� � �� ����� @��� L���) �� ������� �� �� ��� � L��� 6�� & ��,��� �� ����������� � 6� ����� ���� �� ������ � 1�4 � � � ������ � 1�4, 1.4 � ��� �� 6� ��� ���� 9������ ����� � ���� � �� � ���� @��� �� ��� � L��� 1� � � �4 �� �� ���� L���� 1�4, 0���� ���6 L����� � ������ ������ ���� @� ��9� 1&,!% ��4 ���� � �� �� ��� �� �� ��� � ���� ����, A����� �� ���� ����� �� ������ �� !% �� ��� ������� � � ( ������,

����� ����� �� ��#�����$� ���� ����� ���

��

Page 7: Phasic characteristic of elementary Ca2+ release sites underlies

���� ��� ��� ��� � ���� �� �� @��� L��� 1B���� !�4� � ��� �� �������� �� ����� ��*� �� �� ��� � L���6�� ��������� � ��� �� 6���� �� �� ��� 6������ �� � ���� � ���� � �� �� @��� L���1B���� !�4, B��������� ��� 6�� ����� �� � ��������� ��6 �� ��5 �� �� ��� � ���� � � ���� �� ������� � ���� �� �� ��� ��� 1B���� !4,

� �������� ���� ���� ���� ���� �� � � �������� � �� �������� ���� �� 7�238� � � 6 ��� � ���� � ���� ��� ���� � �������� �� ��������� � 6� �� � ��#L��� � ����� 6�� ����� � �� ���� ���� � ���� 6�� ��*� ������ ��������� ���� � @���,B���� " ���������� ���� �� ��*� �� ����� L���� ��� � ����� �� $&& ��� 6���� 6�� �� ������� ��� ���� ���������6� � ���� �������� �� ����� ����� � ���� ��� L���,� �� �� L��� ��*� ����� ���� 6� ������ ������6���� � ����� �� N$&& �� 1B���� "��4� � � ������ ���� ��� � L��� �� ��*� ������ � �� ����� � 6��� ������� ������� ����������� �� ��� ��� 1B���� "��4, � �� � � ��� ��� ��� � ����� ��� ���� �� � - ��� ���� �� @��� ���� ��� ���� � �� �� ���� � ���,

&������

!����� "�#$ ��� �����G�� ������ ��� ����� ���� � �������� ���������� � -

���� ���� 9����� � ��� ��� ���� �� �� �23� � ������ ����������� �� � ���� � � - ���� � �� 1�����46�� ����� � �� ��� �� ��� �����6� � � ��� � ���� ��7�238� ��� 6�� ���� ��� �� ��� � ����� �����6� � ������� ������ �� 7�238, ����������� � - ��� ����������� ��� ������ ���������� ���� ����� 6����� � ������� �� �� /�� ��� � - �������� ����� ����������� � ��������5� ��� ��������� � 1������� ��,� (�:�4� 6���� �����9���� 7�238 ��*� ��� �� ����� �� � �� � ������� �� �� ���� �� � �,

R�� ��� ���� �� ��� � ������� �� � ���� ���#��# � ����� � �� ������ ����� �������� � ����� ���� ��������� �� �23 1������ � ��,� (�:�; ������ � ��,�(�� ; �* � ��,� (��$; ������ � � 0������ (��"4� ������ � ��6 ��� �� �23 ����� � �� �� ���� � ���������� 6���� ������ � ��� �� ������� ���� �����6��� ����������� ��6� � ���������, 0��� 6�� �� ����� ��� ����� � �������� �� ���� ���� ����������� ���� �� � �������� �� ����� ���� �� 7�238,�������� � ��� �� 6� ������ 6�� � ���������� ������ � ���� �� � �� � @���� �� � �� � ��� � ��� �� �23���� �������� ���� ���� ����� �� �� ����������������������� �� ���� ������� � � �� � ������ � -

���� �� � ��� � ��� 6�� �� � L� �� �� 6���� ������� ��� ���� �� �� �� @��� ���, 0� ������� � ���������� � �����#���� ���� 1���� � (��&; ������ � ��,�(��(; �� � � 0������ (�� ; 0� ����� � � 0�� ��(��!; �� � 2�� � � D������� (��!; ?��5��� � ��,� (���;������ � ��,� (���4� � 6���� /�� ��� ���� �� ��������� ����� ��� ����� �� � - ���� ���� ���������� ���� ���� ��� ������� ������� � ��������� �� �23,� ������ ��� � �� ���� �� �������� �� � ��� � ���� 6������� ���� ���� � 6� �� ���� 6���� � �6 �� ����������� �� �� � ����� � � �� � ������ � ���� ������ �� � - ��� 6�� �� ���������� �����, � - �#����* ���� �� ������� �� �������� ��� ���6 �� ����@��� �� ���� ���� � �� � ��#���� � ����� 1����#���N( �; E�� � ��,� (��%4� ������� � ���� ���� ����� ������� �� � ����� ������� �� �� ���� �� � �� �� ���� ����������� �� ���� �� � - �� � ���� ��� �� ���������� ���� �� �������� �� � - ���� ������� ��� ��� ���� � �� �� DA 1������ � ��,� (��"4,

0� ���� ���� � ����� � �� ���� ���� �� � -

���� ���� � ������ � � ��� �#������� � �� � � ��� #��� ��� �� 7�238 ���� � ����, G ����������� �� ���� ����� � ����� ��������� �� � �� � ������� �� �� �23������� ������� �� � ���� ���� 6���� �� ������������� �� ���� � ���� ��*� �� � ��� � ��� �� 7�238������� ���� ������� ���� 6� �� �������� ���� � ��� ����� � �, 0��� �� ���@���� �� ��� ���� ��6��� 6������������ � ���� ����� ��*� �� � ��� � �������� 6��� ������ � ���� ���� �� �� ������ � �� � ����#� � ����� � � ���� � �������� ���� ���� ���� �� � ����� �������� �� ����� ���6�� � ��� �� � 7�238,A� � ����� � ������ 1'6��� � � ��,� (���4 � ��������� � ���� ��� ��� �� ��� N % �23A�� �� 6���� @� ��(& �� �������� ���� � � ������� ����; ����� ���� ��9���� �� ����� � � ���*� �������� �� ��������������� ��� ��������� ���� � �������� � ��, � ���

6�$( 9( 0� ����������� �� ������ � � � �������� �� ����� � ���� � �� �� ��� � L��� �� � �� � � �� 6���� � ������������� � ���� � ���� � ���� � �� �� @��� L���, 104 2�� ��� ������ ���� ���� ����� �� ���6 ����� � ���� � �� � ��� � L���� �� ��� ���� �� 6���� �� �� ��� ��� ��� � ���� �� �� @��� L���,174 ��������� �� ����� � ���� �� � ��� � L���� �� � �� ���� ��6���� �� �� ���� ��� ���� �� �� �� @��� L���, ���� � 1�4 � � 1�4�� ���� � ����� ������ 1����� L����4 �� � �� �� ��� �� �������� � (! ������ ���� ����, D���� ���� � ����� � ( 'D�,2���� L���� 6� ������ �� � ( � � ������ 6��� ������� ������� ��� 3& � � & ��, 2���� 6� ��*� �� �� @��� L��� � 3:O 1%$.($$4�� � ��� ��, 1�4 '����� ���� ���6� � ������ �� �� �� ��������1�.��4 �� ��� � ����� �� � �� ���� �� �� ��5 �� �� @��� ���� ���� �� �������� ������ �� ��� ����, ���� �� � ����� � �� ���� � ��� ��6� ����� 6� ��*� �� ���� L����� � � �� ������5� �� ���� ��� �� �� �� ���� ��5 ������ ��� ����� ������ �� ������,

�%�������� ��! %����

���

Page 8: Phasic characteristic of elementary Ca2+ release sites underlies

��������� ����������� �� ���� �23A� 9����� � �������� �������� �� �23� � ������� �� ���� ������� ��� ������������ ��� ��� �������, 0� ���� ���� � ��#��� � ���� ��������� ���� � ����� ��� ��� � ����� ��� ��� ������ ��������� 1H���* � � B���� (��3;>�C �S�5*� � � 0������ (��$; '�� � (��!4� ��������� �� ������ � �������� �� ���� �� 7� -8 1�� � �0������ (�� ; 0� ����� � � 0�� �� (��!; ?��5���� ��,� (���; ������ � ��,� (���4� �� ������ �� � -#�� � � � ������� �� ����� 7�238 1������ � ��,� (��%;��* � ��,� (��:4,

������ �� ����� � �� ��� ��� ���� "�#$ ������0� � ��� ��� ������� �� <� ������= ���� ����������� �� �� ���*��� ����� � ���� �� ���� �

� ������� ���� �����6� � - 6��� � ���� � �� ������ ����� � 16������ DH0�4� � 6���� ���� �� �� 7�238�� ���� ��� �������� ��� ����� ��� �� 12��*� � �������� (��&; ���� � � 2��*�� (��$4, 0��� ���� �� �23#��*� � - �������� � � ��� ����/� � ������ ��������� �� � ���� �� ���� �6� ����� �� ������� �� �������������� � � ���6� � ������� � 6���� �� ��*�� �� �������� � ���� � ����� � � ������ ���� �� ������� � -

��� ��� �� ��������� 1E�� � ��,� (��%; ������� (��";������ � ��,� (��"; ������ � � ��,� (���4, �������� ��� � �� � - ����� ������� � �� � ��� ���� ������ � � � �� �� ������ ����� �� � �� � ����� ��������� 6���� � - 6��� ���� � � ���� �� <�������=��� ��� � 6���� �������� ��� ��� �� ���� �� ����/� �� �� ���#��# � � - ���*� 12��*� � ��,� (��!;

6�$( :( � ��� ��� ���� �� �� ���� ���� �� ����� � ������, 104 �� ��� ����� � � ���� ��� �� ����������� � ���6� � ���� �� �� � �� �� L��� ��3& �� ������� 1�4� � � �� ����� L���� 6��� ������� � �� 3& � � & �� ������ �� � � ����� �� $&& �� 1�4, B����� 6� ������ 6� ���*��� �� ����6�, ��� �� ����������� � 6� ����� ���� ��� ������ � ��� � ��� �� � � �� �� �����, 174 D9����� �� ��� � ����� ��*� �� �������� ��� �����6� � � ����� � ��� ���6 � 9�� �� ��� � � ����� � �����, 0���� � �� ����� ���6 L����� � ������ �� ���� &,% ������ � �� �� ���� ���*� �� �� �� ����6�,

����� ����� �� ��#�����$� ���� ����� ���

��"

Page 9: Phasic characteristic of elementary Ca2+ release sites underlies

������� (��"4, � �� ����� ����� �� �� � �� 7�238��� 6���� ����� �� ������� �� ����6� ���������L��� � �� ������� �� ���� �� �� �23I� - ����6���� � ��� � � - 6�� ���� � �� ������5���� 1��������� ��,� (��34, 0� ������ � �6���� � ��� ��� � ��������������6� � � ��������� �� DH0� ����� �� ����������� �������� ��� ���� ��� 9���� ��� ��� � - ������ 6�������@� *� ���� � � ��@ ���� �� �� �� <������= �� ������#������� �� ����� �� � - ��� ��� � �� ���� ���������� ��,

������� ��� ������

D9���� �� 6� ������� � ������� ������ ����� � ��������� ������ �� ������� ��������� 1��������� � ��,� (��:; '� � ��,� (��:4, B���� 6� � �����5� �� ������� � � &,(%O �/����������� �� �'# 13#��� �� 5��� ���� ���� ���4 ��� (% �� � � ������ ���� �� ����� ����� �� ������, D�������� ����� 6������ ���� ������ ���� �� ����� �� �� ������ �� ����� �1'���� 0�� �� ��� �� ( ��.�� ��� ( �4, G����� 6� ������ C��� ( ������ �� ������ � 6��� GH#( ������ 6��� ���� �23 7���#� ������(�$�%#������������� 2$1%4#(#1 # ������ ��4 ���� ���8� �� @ �� � ���#������� �� � ������ � �� N$& � � % ��� ���������, '���/� �� C���� � �� DH0� 6� ��� ���� ����� � � �� ���� ���� ��� � � ������ �� T% �� 6�� ����6� ���� � C���� ���� ����� 6� ����� ����� , 0� � C���� ������� 1�> ",&; �� �� ?G>4 �� ��� � (& ��DH0�� ���� ��� �� ������ 6��� % �� �� � � � ������ 6�������� ����� 6��� 3& � �� �� �� ����� � @ �� ��������� �� � ������ �� N3&& �� DH0�, ��� ������ �� 6� ��� �� ���� �������������� � � �� � ���� ������� �� ������ ����� � A� ��=� ������� 1( & �� ���� �� ?�� (,: �� �� � % �� >D2D' �> ", 4, GH#(� � ���� �23 6� ����� � ���� �������� 2���� � �, 1D�� � GA4,��� ���� ��� �� 6� ���� '���� ������ �, 1'� ������ �G4,�� ��� �� ����� � - ����� 6� ����� � ��� � � ������#�����

��� � 1��������� � � 2��*�� (���4 � � ����� L����� � �� �������� � � (&& �� �� 1"!& ��9��4 ��� � ��� $ �� � � ������ �� ����� �� �� ���� � ��� ��� � �� �����, B������ � �� 9����� �� ����������� 1��.�4 �� �� � � ���� �� ��� ��9� ������ �� ���� �� ����� ��9� ���� ���������� , �23 6�� ���������� �� ������ �L���� �� �M ������ ������ � ������� ���������� � && �� ������ ���������� �� � �� ����� � ��� �� 1��������� � � 2��*�� (��:4,M���� � L��� ������� � 6� ��� �� �� ���� 1� � �� �� �� �4 ������ � �� ���������� �23, ����� ��� L��� �� ���� � �������������� �� �� �������� ���� �23 1��������� � � 2��*�� (��:4� ������ �� ���� � ���� �� 6� ��*� �� ����� L����, � �������� T!& � 6� ����6� ��6 ������,

'����(���)�����

F ��� * �� U,?��� ��� �������� ������� � � � �� U,������ � ��������� ��������� �, 0��� 6��* 6�� �������� �� �� ��> 1H� $:&"(4,

"�������

��������,�, � � 0������,F, 1(��"4 � ��� ��� � - ������5���� �� � ������ ������������ ������� �� � ��*�� �� � ������ �� ������ ����5���� �� �������� �� ���� �� �� ��������� � -, �������� �����9� (%I &,

��������,U, 1(��34 � ������ ������������ � � ������� ��� ��� �,�� ���� �9�� 3(%I3 %,

��������,U, 1(��"4 D�� ���� � � ������ ������ �� ���������� ���� �, �� �������� ������� �;;� �(I3&!,

�5���5�� ���,� F������U, � � D��������,D, 1(��(4 ���#������������#���� � ����� ��� � �1(�$�%423# � � �������#������� �� ���� ��������� �������� �� �������, �� ���� ����"%(I"%$,

������ ��,�, 1(��$�4 R�� ��� � - ���� ���� � �23#� ������ ���������� � - �����, ���� ����� ��������� ;<� (%"I(!!,

������ ��,�, 1(��$�4 R����� � ����� /�� ��� � - ����, ����������� �� (!�,

������ ��,�,� ��������,U, � � 0������,F, 1(�� 4 ���#��# ���� �

� - ������5���� ���� �� � ���������� ����� �� ������� #���������>�� ����, �� �������� ������� ��1� (!3I(":,

������ ��,�,� �*�0,A,� ����� �A,�,� � ����,�, � ���������,U, 1(��$4 '������� ����� � - ���� ���� � ������(�$�%#������������#� ����� � - �����, �� ����� ������ �9;� $":3I $"�(,

������ ��,�,� ������ ��,� 2�����U,�,� � '����>, � � ������A,1(��%4 � ���� �� � ������ (�$�%#������������#� ���� � - ���� ����������� � -, �������� ��� �19� $$%I$%(,

������ ��,�,� ��������,U, � � �����2, 1(��"4 ��*� � 6��� �������;�� ����� ��� ������� � ������ ��� ��� ���� �� ���� � ��, �����;�� 3!"I3"3,

�����������, � � 2��*���, 1(��:4 ��� � ������ (�$�%#��������������� ������ � ���� �� � - ���� � ���������� �����, �� ���� !������ �;�� 3:&I$&3,

�����������, � � 2��*���, 1(���4 � �������� �� � ������� �� ��� �� ����� ��������� ��� ������������� ������ �, �� ���� !�������1:� (% I("&,

�����������,� ������ ��U,',� '� �V,#2, � � 2��*���, 1(��:4 ��������� � � ������ ���� �� � �23#������ �� ���� � - � �� ���� ������� � - ��� ��� � ����� ������, �� �������� ������� �1;� :(I�(,

�*�0,A,� ��������,U,� ����� �A,�,� '������� �?,�,�����6�*���,�, � � ������ ��,�, 1(��$4 R�� ��� � -

������5���� �� ��� ��� ������� �� �� �� ���#��# � �������� �� ���� ���� ������ � ���������� �����, �������� ��� �1�� :"�I::3,

B� ���D,�,� 0�� ��0,U, � � H���� �',�, 1(��(4 ������ �� � ����� ����� � ������ (�$�%#������������#� ���� ������� ����, "������ ����$$3I$$!,

H���*�', � � B�����, 1(��34 A�� ��� ������ ��������� ) �� �������� ��� �� � -#� ���� � - ���� � ����, "������ �91� :&"I:&�,

>�C �S�5*��H, � � 0�������,2, 1(��$4 0� � ������ ������������������� ��� � �� � �������� �� � ������ ������������, �� �����:1� $"$I$"",

>�� �U,>, � � ����0, 1(��"4 D�� ���� �������#���� � ���� ���� �� � ������ ������������, "������ �:9� (!�&I(!�3,

�� ���, 1(��&4 �������� � -#�� � � �� � ������ (�$�%#������������#� ���� � - ���� � ������ ����� ���� �� ����� � ��� �� �� ����, �� #�� ��������� ;�� ((&3I(( ,

���� �M, � � 2��*���, 1(��$4 A�� �� ��������� � - � � ������� ��� �23#��*� � - ���� � ����� ������, �� �������� ��������::� %&3I%&�,

���� �A,B, 1(��&4 <R�� ���= � - ���� � � �� �� ���� �� � - ����� � ������ ���������K� ������� ���� ���, � �" �� �� �9�� %I�,

?����U,B,� B�������?,D,� 0����A,�, � � 0��� �2, 1(���4 0� ��� �� � -

�����* � ����� � � �23#��*� � - ��� ��� � ���� �� ��������� �� ����, �� �������� ������� ��1� (:"I &(,

?��5����',� �����2,� ��������,U, � � ������ ��,�, 1(���4A������� �� ��� ��� ������ �� � � �� ���� �� � - � �����/�� ��� � - ���� � 2( ����, �� ����� ������ �:�� 333 "I33333,

��������U,�, � � ��������,D, 1(�� 4 �������� ���� ���� ��� ���������� ������� 9���������� � ������� ������, ����� 9;� :3I �$,

��*��,G,� �������', � � B��*���U,?, 1(��:4 � ������ (�$�%#������������ ��������� �� � ������ ������������ ������ � -

��� � �� ���� � �� � � �� � - � ������� , ����� �� � $���� "���%"$� ;�� (%: (I(%: %,

������ ��U,� �����������, � � 2��*���, 1(���4 � ������� �� �23#������ � - 6��� � ����� ������, ��& ��� �<� % :%I% ��,

����0, � � '������, 1(��&4 0�� �� � ������� ���� � ���� ���������� � ��� �� �� � ������ ������������, ����� �� � $���� "���%"$� <:� 3:$(I3:$%,

������ ��,� 0������,F, � � ��������,U, 1(��(4 '�� �� ���������� ���� ���� � ������ ������������#� ����� ������� �����,�� ���� ���� $(I $$,

������ ��,� � '����>,� ������� ��H, � � ������A, 1(�� 4 � -

���� � ���� �� � ������ (�$�%#������������ �� � �����#������ �� � �� ������ �� ���� �� � - � ��������5� ����,�� ���� ��:� %��I!& ,

������ ��,� '�����>,� 2����� U�,� � '���2,� ���6����H,� >����D,���������0,M, � � � '����>, 1(���4 �23#� ���� � - ���� � �"�% �������� ������#����� ���� ���� �� � ������� ����� � ���� ����� � � �� � ���#��# � � - ���� �� ������ /�� ��,�'�(��� $����� ��:� !�(I!�$,

�������>,� ��*� ��?,� 0��*� ��,M, � � 2��� �G,>, 1(��"4 � -

�%�������� ��! %����

���

Page 10: Phasic characteristic of elementary Ca2+ release sites underlies

L�6 ��� �� �� � ������5� ����) ������� � �� ������ � - ����� ������� � - ��� ������� ����� ����� �����, ����� <<� $�I%%,

�������>,� 0��*� ��,M, � � 2��� �G,>, 1(��:4 0��� ���� ����������� � - ��� ���) � - �����* � �� � ���������� ����� ��������� �� �� �� � - �� � ������ � �� ���� ��� , ��& ����:� $3%I$$ ,

�������',� 2� ����',U, � � �*��0,H, 1(�:�4 >���� ��*�������� ���� ���� � ���������� ����� �� � /�� ��� ������, �� ����������� �9�� &%I ( ,

���������A,� E����,�, � � '�����0, 1(��34 0� ����#� ���� � -

6�� �����6� � ������5���� �� �� ����� �� �/���� ����������� �� � �1(�$�%423, )��� ������ ��<� &&I ( ,

�� ��,�, � � 0������,F, 1(�� 4 ���� �� � - � ����� ��� �������� �� � - ����� �� � ������ (�$�%#������������, ��������������� ��� ((%I((�,

2��*���, � � ��������, 1(��&4 � ������� �� � - �� � ������ ������������#������ � - �������� ) � ������� ���� ��� ��� ����������� ������ � -, ����� �� � $���� "��� %"$� <:� !&I !$,

2��*���, � � ��������, 1(�� 4 ������������� �� ����� ���� ����*� �� ���������� � ������ ������������ � ����� ������,$�� �� ��������� �9�� (%$I(!%,

2��*���, � � E���E, 1(��(4 A� ����� ���� �� ������� ������ ���� ���� ������ ���������� ����� �� � ������ ������������, �����*� "��� ���� � ����� "���� ��9� !�I "$,

2��*���,� ����U, � � E���E, 1(��!4 D�� ���� � �� �� � �23#� ����� - �������� � ����� ������) ��� ������ ����� � � �����, ������������ �1� (&%I( (,

2�����U,�,� ������ ��,� '����>,�,� '� �����, � � ������A, 1(��!4���� ���� ���� ���� ��� /�� ��� � - ���� ���� � ������������������#� ����� ������� �����, �'�(��� $����� ���� 3%�I3!",

A������F,�, 1(��$4 ������5���� �� ������� ��� ��� �� � ������������ ����� � ���� �������� ���� ����, �� ���������� ��� 3 $!I3 ! ,

'����,D, � � ��������� ��,�, 1(��:4 ��������� �� � ������ (�$�%#������������ � � � ������ (�3�$�%#����*���������� �� �� ������ ������� ������, �� ����� ������ �:�� $&% I$&%:,

'� ���,',� '����U,',� '�� ��,�,� ��*�����D,H, � � � ��>, 1(��:4����� ������ � �� 'A ���� L�9 �� ����*� � <� - ���*�= ���������� �������, �� �������� ������� ���� !""I!�(,

'�� ��,�, 1(��!4 <�������= ������� �� ���� �#���� �� ��� ��)�� ����� �� �� ������� �����, �������� ��� :1� (&&I (&�,

'� �V,#2,� �����������,� ������ ��U,', � � 2��*���, 1(��:4 ��� �� ��� �� � �23#������ �� ���� � - ��� ���� � � �� � ����� ������, �� �������� ������� �1;� !"I:&,

'6��� ��',� ���� ��H,� ��������, � � ��������2, 1(���4 B���������� ����� �� ������� �����) ��������� � ������ �� �� �/���� ����� � ����� � ����� ������ , ����� �� � $���� "��� %"$� ;9�(3"%&I(3"%%,

0� �������, � � 0�� ��A,U, 1(��!4 ������ ���� � >'E ������ ����� �� � �����#���� ���� ��� � ����� � �������� �� ��� ������ (�$�%#������������ ������ � - ��� � �� ���� �� 7� -8,�� ���� ������ ���� !&"I!(!,

0������,F, 1(�� 4 ?� ���� �� � ������ (�$�%#������������#���������� - ������5���� , $��� "���� �����(�� ���������� �� *���� �9�(&�I($ ,

�� � 2���B,>,�,�, � � D��������, 1(��!4 ����� � �� � ����������������� ����� � � �������� ��������5� �� ������ ��� �� ����,�� ����� ������ �:�� $���I%&&!,

E���E,� ����U, � � 2��*���, 1(��%4 R�� ��� ����� �� � ���������� � -

��*� �� � ������ ������������ � ����� ������, �� ��������������� �<�� %33I%%3,

P�� ���,V, � � �������', 1(�� 4 B����* � ������� �� � - ������ � - �� �� � ����� � ���� ��� �� ��� ���#��*� � ����������� - ���������� � � �� ������ ��� �� ����, �� ����� ������ �9:� $3:"I $3�3,

*������� $���� +,- +.../ ������� �� ����� �� ��� 0.- +...

����� ����� �� ��#�����$� ���� ����� ���

���