48
1 PEWARNAAN GRAM BAKTERI BAB I PENDAHULUAN A. LATAR BELAKANG Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung. Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan LILI HANDAYANI O1A1 14 022

Pewarnaan bakteri

  • Upload
    noname

  • View
    111

  • Download
    11

Embed Size (px)

DESCRIPTION

mikrobiologi farmasi

Citation preview

PEWARNAAN GRAM BAKTERI40BAB IPENDAHULUANA. LATAR BELAKANGBakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), coccus, spirilum. Bakteri yang berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil.Sedangkan pada coccus dibagi menjadi monococcus, diplococcus, sampai stophylococcus. Khusus pada spirilum hanya dibagi dua yaitu setengah melengkung dan melengkung. Melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit, karena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Prinsip dasar dari pewarnaan ini adalah adanya ikatan ion antara komponen seluler dari bakteri dengan senyawa aktif dari pewarnaan yang disebut kromogen. Terjadi ikatan ion karena adanya muatan listrik baik pada komponen seluler maupun pada pewarnaan. Berdasarkan adanya muatan ini maka dapat dibedakan pewarna asam dan pewarna basa. Teknik Pewarnaan bukan pekerjaan yang sulit tapi perlu ketelitian dan kecermatan bekerja serta mengikuti aturan dasar yang berlaku. Oleh karena itu yang melatar belakangi praktek ini yaitu untuk mengetahui teknik pewarnaan mikroorganisme sehingga mempermudah kita dalam melihat bagian-bagian bakteri. Inti/nucleusDengan mikroskop electron tampak bahwa badan atau inti tidak mempunyai dinding inti/membran inti.b. Struktur sitoplasmaBahan sel yang dikandung didalam membran sitoplasma dibagi menjadi : Daerah sitoplasma,daerah kromatin,bagian zat cair.c. Membran sitoplasmaMembran sitoplasma disebut juga membrab sel yang komposisinya terdiri dari fosfolipid(20-30%).d. Dinding selDinding sel adalah suatu struktur yang kaku yang memberi bentuk pada sel.e. KapsulUkuran kapsul sangaat dipengaruhi oleh medium tempat ditumbuhkannya bakteri tersebut.f. FlagelFlagel adalah bagian yang berbentuk seperti benang/rambut yang teramat tipis mencuat menmbus dinding dibawah membran sel didalam sitoplasma.g. Piil = fimbriaeBeberapa bakteri gram negatif memiliki rambut pendek dan keras yang disebut pili,berukuran lebih kecil,lebih pendek dan lebih banyak dari pada flagella.h. SporaSpesies-spesies tertentu bakteri menghasilkan spora,diluar sel vegetatif.

Selain itu bakteri juga memiliki morfologi. Adapun bentuk bakteri bermacam-macam yaitu sebagai berikut : Bakteriberbentukbulat ( bola )1. Bakteri bulat dinamakan juga kokus (coccus) dapat dibedakan atas :a. Monokokus : Bakteri yang berbentuk bola tunggal,misalnya neisseria gonorrhoeae,penyebab penyakit kencing nanah.b. Diplokokus : Bakteri berbentuk bola yang bergandengan duadua,misalnya diplococcus pneumoniae,penyebab penyakit pneumonia atau radang paru-paru.c. Sarkina : Bakteri berbentuk bola yang berkelompok empat- empat,sehingga bentuknya mirip kubus.d. Sterpkokus : Bakteri bentuk bola yang berkelompok memenjang membentuk rantai.e. Stafilokokus : Bakteri berbentuk bola yang berkoloni membentuk sekelompok sel tidak teratur,sehingga bentuknya mirip dongkolan buah anggur.2. Bakteri berbentuk batangBakteri berbentuk batang dinamakan basilus (bacillus yang berarti batang). Bentuk basilus dapat pula dibedakan atas :a. Basil tunggal : Bakteri yang hanya berbentuk satu batang tunggal misalnya salmonella typhi,penyebab penyakit tifus.b. Diplobasil : Bakteri berbentuk batang yang bergandengan duadua.c. Sterptobasil : Bakteri berbentuk batang yang bergandengan memanjang membentuk rantai misalnya bacillus anthracis,penyebab penyakit antraks.3. Bakteri berbentuk melilitBakteri berbentuk melilit,yang dinamakan spirillum atau spiral. Ada 3 macam bentuk spiral,yaitu sebagai berikut :a. Spiral:golongan bakteri yang bentuknya seperti spiral,misalnya spirillum. Sel tubuhnya umumnya kaku.b. Vibrio atau bentuk koma yang dianggap sebagai bentuk spiral tak sempurna,misalnya vibrio cholerae. Penyebab penyakit kolera.c. Spirochaeta:golongan bakteri berbentuk spiral yang bersifat lentur pada saat bergerak,tubuhnyan dapat memenjang dan mengerut.B. RUMUSAN MASALAH Rumusan masalahnya adalah bagaimana membedakan bakteri gram positif dan gram negatif melalui pewarnaan?C. TUJUAN Tujuannya adalah untuk membedakan bakteri gram positif dan gram negatif melalui pewarnaan.D. MANFAATManfaat dari pembuatan makalah ini adalah dapat mengetahui cara pewarnaan bakteri khususnya pewarnaan Gram dan perbedaan antara bakteri Gram positif dan Gram negatif.

1.

BAB IITINJAUAN PUSTAKAA. Teori UmumMikroorganisme sulit dilihat dengan mikroskop cahaya, karena tidak mengadsorpsi ataupun membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme ataupun latar belakangnya. Zat warna mengadsorpsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroorganisme disekelilingya ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan struktur sel seperti spora dan bahan infeksi yang mengandung zat pati dan granula fosfat. Pewarnaan yang digunakan untuk melihat salah satu struktur sel disebut pewarnaan khusus. Sedangkan pewarnaan yang digunakan untuk memilahkan mikroorganisme disebut pewarnaan diferensial yang memilahkan bakteri menjadi kelompok gram positif dan gram negatif. Pewarnaan diferensial lainnya ialah pewarnaan ziehl neelsen yang memilihkan bakterinya menjadi kelompok-kelompok tahan asam dan tidak tahan asam (Dwidjoseputro.1998).Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian Gram pada tahun 1884. Dengan metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri gram positif dan bakteri gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak bias dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp (Waluyo, 2004). Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna negatif (Hadiutomo. 1990). Sebelum dilakukan pewarnaan dibuat ulasan bakteri di atas kaca objek. Ulasan ini kemudian difiksasi. Jumlah bakteri yang terdapat pada ulasan haruslah cukup banyak sehingga dapat terlihat bentuk dan penataanya sewaktu diamati. Kesalahan yang sering kali dibuat adalah menggunakan suspensi bakteri yang terlalu padat terutama bila suspensi tersebut berasal adari bukan media padat. Sebaliknya pada suatu suspensi bakteri bila terlalu encer, maka akan diperoleh kesulitan sewaktu mencari bakteri pada preparatnya (Sutedjo.1991).Pada pewarnaan sederhana hanya digunakan satu macam zat warna untuk meningkatkan kontras antara mikroorganisme dan sekelilingnya. Lazim, prosedur pewarnaan ini menggunakan zat warna basa seperti seperti crystal violet, biru metilen, karbol fuchsin basa, safranin atau hijau malakit. Kadang kala digunakan zat warna negatif untuk pewarnaan sederhana : zat warna asam yang sering digunakan adalah nigrosin dan merah kongo Prosedur Pewarnaan sederhana mudah dan cepat, sehingga pewarnaan ini sering digunakan untuk melihat bentuk ukuran dan penataan pada mikoorganisme bakteri pada bakteri dikenal bentu yang bulat (coccus), batang (basil), dan spiral. Dengan pewarnaan sederhana dapat juga terlihat penataan bakteri. Pada coccus dapat terlihat pewarnaan seperti rantai (stertococcus), buah anggur ( stafilococcus), pasangan (diplococcus), bentuk kubus yang terdiri dari 4 atau 8 (saranae).Beberapa mikroba sulit diwarnai dengan zat warna yang bersifat basa, tetapi mudah dilihat dengan pewarnaan negatif, pada metode ini mikroba dicampur dengan tinta cina atau nigrosin, kemudian digesekkan diatas kaca objek.Zat warna tidak akan mewarnai bakteri, akan tetapi mewarnai lingkungan sekitar bakteri. Dengan mikroskop mikroba akan terlihat tidak berwarna dengan latar belakang hitam (Lay,1994)

BAB IIIPEMBAHASANA. Pengertian Pewarnaan Gram Bakteri Pewarnaan sederhana yaitu pewarnaan dengan menggunakan satu macam zat warna dengan tujuan hanya untuk melihat bentuk sel bakteri dan untuk mengetahui morfologi dan susunan selnya . Pewarnaan ini dapat menggunakan pewarnaan basa pada umumnya antara lain kristal violet , karbol , fuchsin , dan safranin. Pewarnaan negatif yaitu pewarnaan yang ditujukan terhadap bakteri yang sulit diwarnai, dimana bakterinya tidak diwarnai melainkan latar belakangnya, Metode pewarnaan negatif merupakan suatu metode perwarnaan umum, dimana digunakan larutan zat warna yang tidak meresap ke dalam sel-sel bakteri melainkan melatar belakangi sehingga kelihatan atau nampak sebagai bentuk-bentuk kosong tak berwarna (negatif). Pewarnaan gram merupakan pewarnaan yang digunakan untuk mengelompokan bakteri gram positif dan gram negatif. Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna crystal violet dan akan tampak berwarna ungu tua di bawah mikroskop. Adapun bakteri gram negatif akan kehilangan zat warna kristal violet setelah dicuci dengan alkohol, dan sewaktu diberi zat pewarna air fucsin atau safranin akan tampak berwarna merah. Perbedaan zat warna ini disebabkan oleh perbedaan dalam struktur kimiawi dinding selnya. Pewarna yang digunakan dalam pewarnaan gram antara lain kristal violet, alkohol, safranin, dan iodine. Prinsip pewarnaan negatif yaitu suatu metode pewarnaan tidak langsung dimana digunakan larutan zat warna yang tidak meresap kedalam sel bakteru melainkan ke dalam latar belakangnya. Sedangkan Prinsip pewarnaan gram didasarkan pada perbedaan struktur dinding sel bakteri ; sehingga menyebabkan perbedaan reaksi dengan permeabilitas zat warna dan penambahan larutan pencuci.Prinsip pewarnaan spora yaitu suatu metode pewarnaan yang menggunakan malachite green dan safranin, yang dalam hasilnya pewarnaan akan muncul warna hijau pada sporanya dan warna merah pada sel vegetatifnya Kristal violet atau ungu gentian adalah pewarna triaryl methane. Pewarna ini digunakan sebagai histologis noda dalam metode gram klasifikasi bakteri. Kristal violet memiliki sifat sifat anti bakteri, jamur dan obat cacing, dan sebelumnya penting sebagai antiseptik topikal Lugols yodium, juga dikenal sebagai solusi lugol, merupakan solusi dari iodium dan iodida dalam air. Larutan yodium lugol digunakan sebagai antiseptik dan desinfektan, dan untuk desinfikasi darurat air minum, dan sebagai reagen untuk deteksi pasti di dalam laboratorium, pewarnaan dan tes meis. Safranin dalah noda biologis yang digunakan dalam histologi dan sitologi. Safranin digunakan sebagai conterstain dalam beberapa protokol pewarnaan. Mewarnai seluruhinti sel darah merah. Ini adalah counterstain klasik dalam gram stain. Hal ini juga dapat digunakan untuk deteksi tulang rawan, musin dan butiran sel mast. Safranin biasanya memilki struktur kimia. Ada juga trimetil safranin kedua senyawa berperilaku dasarnya identik dan aplikasi pewarnaan biologi dan kebanyakan prosedur safranin tidak membedakan diantara keduanya. Persiapan safranin komersial sering mengandung campuran dari kedua jenis. Safranin juga digunakan sebagai indikator redok dalam kimia analitik Fiksasi adalah suatu metode persiapan untuk menyiapkan suatu sampel agar tampak realistik dengan menggunakan grutaldehid dengan proses pemabakaran. Fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur selnya. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana. Istilah pewarna sederhana dapat diartikan dalam mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat dibedakan menjadi empat macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan negatif, pengecatan diferensial dan pengecatan struktural. Pemberian warna pada bakteri atau jasad- jasad renik lain dengan menggunakan larutan tunggal suatu pewarna pada lapisan tipis, atau olesan, yang sudah difiksasi, dinamakan pewarnaan sederhana. Prosedur pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel microbe atau bagian-bagian sel mikroba disebut teknik pewarnaan diferensial. Sedangkan pengecatan struktural hanya mewarnai satu bagian dari sel sehingga dapat membedakan bagian-bagian dari sel. Termasuk dalam pengecatan ini adalah pengecatan endospora, flagella dan pengecatan kapsul. Mikroba sulit dilihat dengan cahaya karena tidak mengadsorbsi atau membiaskan cahaya. Alasan inilah yang menyebabkan zat warna digunakan untuk mewarnai mikroorganisme. Zat warna mengadsorbsi dan membiaskan cahaya sehingga kontras mikroba dengan sekelilingnya dapat ditingkatkan. Penggunaan zat warna memungkinkan pengamatan strukur seperti spora, flagela, dan bahan inklusi yng mengandung zat pati dan granula fosfat. Melihat dan mengamati bakteri dalam keadaan hidup sangat sulit, kerena selain bakteri itu tidak berwarna juga transparan dan sangat kecil. Untuk mengatasi hal tersebut maka dikembangkan suatu teknik pewarnaan sel bekteri, sehingga sel dapat terlihat jelas dan mudah diamati. Olek karena itu teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salahsatu cara yang paling utama dalam penelitian-penelitian mikrobiologi. Beberapa faktor kesalahan pada praktikum antara lain pemberian zat warna yang berlebihan sehingga sel bakteri tidak nampak, kurang maksimalnya dalam proses fiksasi sehingga masih ada bakteri yang belum mati, dan faktor yang lain adalah pada proses pencucian terlalu deras dalam membilas zat warna dengan air sehingga dapat menyebabkan bakteri larut terbawa air. B. Tujuan Pewarnaan Tujuan pewarnaan terhadap mikroorganisme ialah untuk :1.Mempermudah melihat bentuk jasad, baik bakteri, ragi, maupun fungi.2.Memperjelas ukuran dan bentuk jasad3.Melihat struktur luar dan kalau memungkinkan struktur dalam jasad.4.Melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia dapat diketahui.C. Teknik PewarnaanLangkah-langkah utama teknik pewarnaan ialah :1. Pembuatan olesan bakteri, olesan bakteri tidak boleh terlalu tebal atau tipis2.Fiksasi, dapat dilakukan secara pemanasan atau dengan aplikasi bahan kimia seperti sabun, formalin, fenol.3.Aplikasi zat warna : tunggal, atau lebih dari 1 zat warnaD. Macam-Macam PewarnaanDalam pewarnaan garam bakteri ini tentunya digunakan cat-cat khsus untuk mewarninya. Pewarna asam memiliki negatif charge kromogen,tidak akan menembus atau berpenetrasi ke dalam sel karena negative charge pada permukaan bakteri. oleh karena itu, sel tidak berwarna mudah dilihat dengan latar belakang berwarna.Komposisi Cat Gram:1.Gram A :Kristal Gentian Violet.2.Gram B : KI dan I23.Gram C : Aseton + EtOH4.Gram D : Safranin

1. Pengecatan Gram

Cat Gram A: Kristal Violet:2 gram Etil Alkohol 95:20 ml Ammonium Oksalat:0,8 gram Akuades:80 mlberwarna ungu (karena mengandung kristalviolet).cat primerCat Gram A merupakan cat primer yang akan memberi warna mikroorganisme target.semua mikroorganisme akan berwarna ungu sesuai warna cat Gram ACat Gram B: Yodium:1 gramKalium Yodida:2 gram Akuades:300 mlberwarna coklatmerupakan cat Mordan, yaitu cat atau bahan kimia yang berfungsi memfiksasi cat primer yang diserap mikroorganisme targetpengikatan warna oleh bakteri akan lebih baik (lebih kuat)

Cat Gram C:Aseton:50 ml Etil Alkohol 95 %:50 mlTidak berwarnaBerfungsi untuk melunturkan cat sebelumnyaAkibat pemberian cat C akan terjadi 2 kemungkinan:a.Mikroorganisme (bakteri) akan tetap berwarna ungu,karena tahan terhadap alkohol. Ikatan antara catdengan bakteri tidak dilunturkan oleh alkohol. Bakteriyang bersifat demikian disebut bakteriGram positifb.Bakteri akan tidak berwarna, karena tidak tahanterhadap alkohol. Ikatan antara cat dengan bakteridilunturkan oleh alkohol. Bakteri yang bersifat demikiandikelompokkan sebagai bakteriGram negativeCat Gram D: Safranin:0,25 gram Etil Alkohol 95 %:10 mlAkuades:90 mlBerwarna merahMerupakan cat sekunder atau kontrasCat ini berfungsi untuk memberikan warnamikroorganisme non targetCat sekunder mempunyai spektrum warnayang berbeda dari cat primerAkibat pemberian cat Gram D, akan terjadi 2 kemungkinan :a.Bakteri Gram positif akan tetap berwarnaungu, karena telah jenuh mengikat cat Gram A sehingga tidak mampu mengikat cat Gram D.b.Bakteri Gram negative akan berwarnamerah, karena cat sebelumnya telah dilunturkan oleh cat Gram C maka akan mampu mengikat cat Gram D.Mikroorganisme berwarnaunguGrampositifMikroorganisme berwarnamerahGram negative1.TeoriSalton:Gram negative : kadar lipid tinggi (20 %) didalam dinding sel. Zat lipid ini akan larut selama pencucian dengan alkohol. Pori-pori pada dinding sel membesar,sehingga zat warna yang sudah diserap mudah dilepaskan dan bakteri menjadi tidak berwarna.Bakteri Gram positif : mengalami denaturasi protein pada dinding selnya akibat pencucian dengan alkohol.Protein menjadi keras dan beku, pori-pori mengecil sehingga kompleks Kristal yodium yang berwarna ungu dipertahankan dan bakteri akan tetap berwarna ungu

2.Teori permeabilitas dinding sel:Gram positif : mempunyai susunan dinding yang kompak dengan lapisan peptidoglikan yang terdiri dari 30 lapisan. Permeabilitas dinding sel kurang, dan kompleks Kristal yodium tidak dapat keluar.Gram negatif : lapisan peptidoglikan yang tipis,hanya 1 2 lapisan dan susunan dindingselnya tidak kompak. Permeabilitas dinding sel lebih besar sehingga masih memungkinkan terlepasnya kompleks kristal yodium.Secara garis besar teknik pewarnaan bakteri dapat dikategorikan sebagai berikut :1. Pewarnaan sederhanaMenggunakan satu macam zat warna (biru metilen/air fukhsin) tujuan hanya untuk melihat bentuk sel. Pewarnaan sederhana, merupakan pewarna yang paling umum digunakan. Berbagai macam tipe morfologi bakteri (kokus, basil, spirilum, dan sebagainya) dapat dibedakan dengan menggunakan pewarna sederhana, yaitu mewarnai sel-sel bakteri hanya digunakan satu macam zat warna saja. Kebanyakan bakteri mudah bereaksi dengan pewarna-pewarna sederhana karena sitoplasmanya bersifat basofilik (suka akan basa) sedangkan zat-zat warna yang digunakan untuk pewarnaan sederhana umumnya bersifat alkalin (komponen kromoforiknya bermuatan positif). Zat warna yang dipakai hanya terdiri dari satu zat yang dilarutkan dalam bahan pelarut. Pewarnaan Sederhana merupakan satu cara yang cepat untuk melihat morfologi bakteri secara umum. Beberapa contoh zat warna yang banyak digunakan adalah biru metilen (30-60 detik), ungu kristal (10 detik) dan fukhsin-karbol (5 detik).Adapun prosedur kerjanya yaitu : Pewarnaan Gram Sederhana1. Bakteri disiapkan untuk diamati 2. Dibersihkan object glass atau kaca objek dengan kapas atau tisuue 3. Di pindahkan bakteri dengan mengunakan jarum inoculum pada kaca objek 4. Difiksasikan dengan api Bunsen hingga kering dan merata5. Di tetesi dengan pewarna crystal violet ditunggu 30 menit6. Dilap kaca objek dengan tissue 7. Di cuci aquades 8. Di tutup kaca objeknya9. Di amati dibawah mikroskop2. Pewarnaan differensial Pewarnaan bakteri yang menggunakan lebih dari satu zat warna seperti pewarnaan gram dan pewarnaan tahan asam. Adapun prosedur kerjanya yaitu :1. Bakteri disiapkan untuk diamati 2. Dibersihkan kaca objek dengan kapas 3. Diberi label warna bakteri pada kaca objek4. Di pindahkan bakteri dengan mengunakan jarum inokulasi 1 ulasan pada kaca objek.5. Difiksasi kaca objek dengan api Bunsen hingga kering .6. Diteteskan Kristal violet sebagai pewarna utama.7. Di tunggu 1 menit 8. Dicuci dengan aquades 9. Diteteskan larutan 1000 l10. Ditunggu 1 menit dan Dicuci aquades 11. Diberi larutan etanol setetes hingga etanol jatuh jernih dan dicuci lagi dengan aquades12. Ditetes safranin dan di tunggu 30 detik dan dicuci aquades13. Di tutup kaca objeknya14. Diamati mikroskopAdapun Penjelasan sebagai berikut:a) Pewarnaan GramPewarnaan Gram atau metode Gram adalah suatu metode untuk membedakan spesies bakteri menjadi dua kelompok besar, yakni gram-positif dan gram-negatif, berdasarkan sifat kimia dan fisik dinding sel mereka. Metode ini diberi nama berdasarkan penemunya, ilmuwan Denmark Hans Christian Gram (18531938) yang mengembangkan teknik ini pada tahun 1884 untuk membedakan antara pneumokokus dan bakteri Klebsiella pneumoniae. Dengan metode pewarnaan Gram, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri Gram positif dan Gram negatif berdasarkan reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya. Oleh karena itu, pengecatan Gram tidak bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma sp.Dalam pewarnaan gram diperlukan empat reagen yaitu :1. Zat warna utama (violet kristal)2. Mordan (larutan Iodin) yaitu senyawa yang digunakan untuk mengintensifkan warna utama.3. Pencuci / peluntur zat warna (alcohol / aseton) yaitu solven organic yang digunakan uantuk melunturkan zat warna utama.4. Zat warna kedua / cat penutup (safranin) digunakan untuk mewarnai kembali sel-sel yang telah kehilangan cat utama setelah perlakuan dengan alkohol.b) Pewarnaan Tahan AsamBeberapa spesies bakteri pada genus Mycobacterium, Cryptosporidium dan Nocardia tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan sederhana. Namun, mikroorganisme ini dapat diwarnai dengan menggunakan Karbol Fuchsin yang dipanaskan. Panas membuat pewarna dapat terserap oleh sel bakteri karena panas dapat menghilangkan lapisan lilin pada dinding sel bakteri. Sekali bakteri tahan asam menyerap karbol fuchsin, maka akan sangat sulit untuk dilunturkan dengan asam-alkohol, oleh karena itu merka disebut bakteri tahan asam. Bakteri tahan asam memiliki kadar lemak (asam mycolic) yang tinggi pada dinding sel mereka. Pada pewarnaan bakteri asam menggunakan metode Ziehl-Neelsen (juga disebut Hot Stain), bakteri tahan asam akan berwarna merah karena menyerap pewarna karbol fuchsin yang dipanaskan, karena pada saat pemanasan dinding sel bakteri yang memiliki banyak lemak membuka sehingga pewarna dapat terserap. Namun tidak dapat dilunturkan dengan asam alkohol karena pada saat suhu normal lemak pada dinding sel bakteri kembali menutup, sehingga ketika diwarnai dengan pewarna tandingan, yaitu Methylene Blue, warnanya tetap merah. Berbeda dengan bakteri tidak tahan asam, ia akan menyerap pewarna tandingan yaitu methylene blue sehingga berwarna biru.

Pada metode Kinyoun-Gabbet, tidak perlu dilakukan pemanasan, maka dari itu metode Kinyoun-Gabbet juga disebut Cold Stain. Metode Kinyoun-Gabbet tidak perlu dilakukan dengan pemanasan karena pada pewarna Kinyoun terdapat alkali fuchsin dengan konsentrasi yang tinggi, sehingga walau tanpa pemanasan dapat menghilangkan lapisan lilin pada dinding sel bakteri tahan asam. Komposisi Kinyoun antara lain: alkali fuchsin, fenol, alkohol 95%, dan aquades. Sebagai pewarna tandingan adalah Gabbet, yang memiliki komposisi antara lain : methylene blue, asam sulfat 96%, alkohol murni, dan aquades. Sama seperti pada metode Ziehl-Neelsen, bakteri tahan asam akan berwarna merah, sedangkan bakteri tidak tahan asam akan berwarna biru. Contoh bakteri yang tergolong bakteri tahan asam, yaitu dari genus Mycobacterium dan beberapa spesies tertentu dari genus Nocardia. Bakteribakteri dari kedua genus ini diketahui memiliki sejumlah besar zat lipodial (berlemak) di dalam dinding selnya sehingga menyebabkan dinding sel tersebut relatif tidak permeabel terhadap zat-zat warna yang umum sehingga sel bakteri tersebut tidak terwarnai oleh metode pewarnaan biasa, seperti pewarnaan sederhana atau Gram.Adapun prosedur kerjanya yaitu: Mula mula ambil mikroskop dilemari dengan seksama, kemudian letakkan diatas meja dengan hati hatia. Buka iris diafrogma, kemudian atur cahayab. Ambil objek glass dan dengan bersihkan dengan alcohol agar bebas dari lemakc. Beri etiket dan lingkari objek glass dengan spidol permanen kira - kira 1 2cm dibelakang objek glassd. Oles sampel sputum diatas objek glass dan keringkan pada suhu kamare. Fixasi diatas api selama 3x berturut turutf. Teteskan karbol fukhsin kuat pada sediaan sambil diuapkan selama 5 menit. Lalu bilas menggunakan aquadestg. Kemudia tetesin Hc1 alkohol pada sediaan. Lalu tunggu selama 30 detik kemudian bilas dengan aquadesth. Setelah itu teteskan methyien blue pada sediaan dan biarkan selama 2 menit lalu bilas menggunakan auadest.i. Tunggu sampai kering dan periksa dibawah mikroskop dengan menggunakan imersi dan pembesaran 100 x.3. Pewarnaan Gram NegatifBakteri Gram-negatif adalah bakteri yang tidak mempertahankan zat warna metil ungu pada metode pewarnaan Gram. Bakteri gram-positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram-negatif tidak. Pada uji pewarnaan Gram, suatu pewarna penimbal (counterstain) ditambahkan setelah metil ungu, yang membuat semua bakteri gram-negatif menjadi berwarna merah atau merah muda. Pengujian ini berguna untuk mengklasifikasikan kedua tipe bakteri ini berdasarkan perbedaan struktur dinding sel mereka.Pengecatan gram dilakukan dalam 4 tahap yaitu :1. Pemberian cat warna utama (cairan kristal violet) berwarna ungu.2. Pengintesifan cat utama dengan penambahan larutan mordan JKJ.3. Pencucian (dekolarisasi) dengan larutan alkohol asam.4. Pemberian cat lawan yaitu cat warna safranin

4. Pewarnaan SporaSpora bakteri (endospora) tidak dapat diwarnai dengan pewarnaan biasa, diperlukan teknik pewarnaan khusus. Pewarnaan Klein adalah pewarnaan spora yang paling banyak digunakan. Endospora sulit diwarnai dengan metode Gram. Untuk pewarnaan endspores, perlu dilakukan pemanasan supaya cat malachite hijau bisa masuk ke dalam spora, seperti halnya pada pewarnaan Basil Tahan Asam dimana cat carbol fuschsin harus dipanaskan untuk bisa menembus lapisan lilin asam mycolic dari Mycobacterium .

Adapun prosedur kerjanya yaitu : Mula mula ambil mikroskop dilemari dengan seksama, kemudian letakkan diatas meja dengan hati hatia. Buka iris diafrogma, kemudian atur cahayab. Ambil objek glass dan dengan bersihkan dengan alcohol agar bebas dari lemakc. Beri etiket dan lingkari objek glass dengan spidol permanen kira - kira 1 2cm dibelakang objek glassd. Oles sampel sputum diatas objek glass dan keringkan pada suhu kamare. Fixasi diatas api selama 3x berturut turutf. Teteskan karbol fukhsin kuat pada sediaan sambil diuapkan selama 5 menit. Lalu bilas menggunakan aquadestg. Kemudia tetesin Hc1 alkohol pada sediaan. Lalu tunggu selama 30 detik kemudian bilas dengan aquadesth. Setelah itu teteskan methyien blue pada sediaan dan biarkan selama 2 menit lalu bilas menggunakan auadest.i. Tunggu sampai kering dan periksa dibawah mikroskop dengan menggunakan imersi dan pembesaran 100 x.

5. Pewarnaan flagelPewarnaan flagel dengan memberi suspense koloid garam asam tanat yang tidak stabil, sehingga terbentuk presipitat tebal pada dinding sel dan flagel.

6. Pewarnaan kapsulPewarnaan ini menggunakan larutan Kristal violet panas, lalu larutan tembaga sulfat sebagai pembilasan menghasilkan warna biru pucat pada kapsul, karena jika pembilasan dengan air dapat melarutkan kapsul. Garam tembaga juga memberi warna pada latar belakang yang berwana biru gelap atau kehitaman sedang bakterinya sendiri akan berwarna merah.

E. Perbedaan Bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram NegatifPerbedaan dasar antara bakteri gram positif dan negatif adalah pada komponen dinding selnya. Kompleks zat iodin terperangkap antara dinding sel dan membran sitoplasma organisme gram positif, sedangkan penyingkiran zat lipida dari dinding sel organisme gram negatif dengan pencucian alcohol memungkinkan hilang dari sel. Bakteri gram positif memiliki membran tunggal yang dilapisi peptidohlikan yang tebal (25-50nm) sedangkan bakteri negative lapisan peptidoglikogennya tipis (1-3 nm).Sifat bakteri terhadap pewarnaan Gram merupakan sifat penting untuk membantu determinasi suatu bakteri. Beberapa perbedaan sifat yang dapat dijumpai antara bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif yaitu:a) Ciri-ciri bakteri gram negatif yaitu:1. Struktur dinding selnya tipis, sekitar 10 15 mm, berlapis tiga atau multilayer.2. Dinding selnya mengandung lemak lebih banyak (11-22%), peptidoglikan terdapat didalam.3. Lapisan kaku, sebelah dalam dengan jumlah sedikit 10% dari berat kering, tidak mengandung asam tekoat.4. Kurang rentan terhadap senyawa penisilin.5. Pertumbuhannya tidak begitu dihambat oleh zat warna dasar misalnya kristal violet.6. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan relatif sederhana.7. Tidak resisten terhadap gangguan fisik.8. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) lebih pekat9. Peka terhadap streptomisinb) Ciri-ciri bakteri gram positif yaitu:1. Struktur dinding selnya tebal, sekitar 15-80 nm, berlapis tunggal atau monolayer.2. Dinding selnya mengandung lipid yang lebih normal (1-4%), peptidoglikan ada yang sebagai lapisan tunggal. Komponen utama merupakan lebih dari 50% berat ringan. Mengandung asam tekoat3. Bersifat lebih rentan terhadap penisilin.4. Pertumbuhan dihambat secara nyata oleh zat-zat warna seperti ungukristal.5. Komposisi nutrisi yang dibutuhkan lebih rumit.6. Lebih resisten terhadap gangguan fisik.7. Resistensi terhadap alkali (1% KOH) larut.8. idak peka terhadap streptomisin.9. Toksin yang dibentuk Eksotoksin EndotoksinKELEBIHAN DAN KEKURANGAN PENGECATAN GRAM1. Kelebihan :Pengecatan Gram penting sebagai pedoman awal untuk memutuskan terapi antibiotik, sebelum tersedia bukti definitif bakteri penyebab infeksi (kultur dan tes kepekaan bakteri terhadap antibiotik). Hal ini karena bakteri Gram positif dan negatif mempunyai kepekaan yang berbeda terhadap berbagai jenis antibiotika. Kadang-kadang morfologi bakteri yang telah dicat Gram mempunyai makna diagnostik. Misalnya pada pemeriksaan Gram ditemukan Gram negatif diplococci intraseluler dari spesimen pus (nana) uretral, maka memberikan presumptive diagnosis untuk penyakit infeksi gonore.2.Kekurangan :Pengecatan Gram memerlukan mikroorganisme dalam jumlah banyak yakni lebih dari 104 per ml. Sampel yang cair dengan jumlah kecil mikroorganisme misalnya cairan serebrospinal, memerlukan prosedur sentrifuge dulu untuk mengkonsentrasikan mikroorganisme tersebut. Pellet (endapan hasil sentrifuge) kemudian dilakukan pengecatan untuk diperiksa secara mikroskopis.

BAB IVPENUTUPA. KESIMPULANKesimpulan yang dapat diambil dari makalah ini ialah sebagai berikut :1. Metode pengecatan atau pewarnaan adalah salah satu cara untuk mengamati bentuk sel bakteri sehingga mudah untuk diidentifikasi.2. Tujuan pengecatan terhadap bakteri ialah untuk mempermudah melihat bentuk jasad bakteri, memperjelas ukuran dan bentuk jasad dari bakteri, melihat struktur luar dan jika memungkinkan struktur dalam jasad, dan dapat melihat reaksi jasad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat-sifat fisik dan kimia dapat diketahui.3. Pengecatan/pewarnaan bakteri terdiri dari pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial, pewarnaan khusus, dan pewarnaan negatif.4. Perbedaan dasar antara bakteri Gram positif dan negatif adalah pada struktur dan komponen dinding selnya. Bakteri Gram positif mengandung lipid, lemak atau substansi seperti lemak dalam presentase yang lebih rendah daripada yang dikandung bakteri Gram negatif. Dinding sel bakteri Gram positif juga lebih tebal daripada dinding sel bakteri Gram negatif. 5. Cara pengecatan bakteri khususnya pewarnaan Gram adalah sebagai berikut. Disiapkan bakteri untuk di amati, dibersikan objek gelas/kaca objek dengan kapas/tissue. Kemudian diberi label nama bakteri pada kaca objek inokulasi atau ulasan pada kaca objek. Dipindahkan bakteri dengan menggunakan jarum inokulum satu ulasan pada kaca objek, selanjutnya difiksasi kaca objek dengan api bunsen hingga kering dan merata. Di tetesi dengan pewarna kristal violet sebagai pewarna utama. Ditunggu 1 menit supaya penerapan warnanya maksimal, kemudian dicuci dengan aquades dan diteteskan larutan lugol di tunggu selama satu menit. Dicuci dengan aquades dan diberi larutan etanol setetes demi setetes hingga etanol jatuh jernih. Kemudian kembali dicuci dengan aquades dan ditetesi dengan safranin ditunggu 45 menit. Selanjutnya kembali dicuci dengan aquades dan diamati dengan mikroskop bentuk / morfologi bakteri.

B. SaranSaran yang dapat penulis berikan adalah sebaiknya dalam melakukan pengecatan bakteri, lebih diperhatikan cara kerja dengan teknik aseptis agar bakteri yang diuji cobakan tidak terkontaminasi oleh praktikan.

DAFTAR PUSTAKADelfahedah, Yuldnia, Surmayati Syukur, dan Jamsari. 2013. Isolasi, Karakterisasi dan Identifikasi DNA Bakteri Asam Laktat yang Berpotensi sebagai Antimikroba dari Fermentasi Kakao Varietas Hibrid. Jurnal Kimia Unand. Volume 2, Nomor 2.Dewi, Amalia Krishna. 2013. Isolasi, Identifikasi dan Uji Sensitivitas Staphylococcus aureus terhadap Amoxillin dari Sampel Susu Kambing Peranakan Ettawa (PE) Penderita Mastitis di Wilayah Girimulyo, Kulonprogo, Yogyakarta. Jurnal Sain Veteriner. Volume 2, Nomor 31.Fitrah, Ilham Deskarifal, Darmawi, dan Rasmaidar. 2013. Isolasi Pasteurella multicoda pada Kuda dan Sensitivitasnya terhadap Antibiotik. Jurnal Medika Veterinaria. Volume 7, Nomor 2.Litaay, Magdalena, Risco B. Global, Asadi Abdullah, Karunia Alis, dan Serli Lejab 2007. Kualitas Media Pemeliharaan Larva Lola Merah dan Kima Sisik Hasil Filtrasi Bertingkat di Hatchery. Jurnal Ilmu Kelautan. Volume 12, Nomor 1.Meisji, Liana Sari, Arfan Abrar, dan Merin. 2013. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Asam Laktat pada Usus Ayam Broiler. Jurnal Agripet.Volume 13, Nomor 1.Pastra, Defin Ari, Melki, dan Heron Surbakti. 2012. Penapisan Bakteri yang Bersimbiosis dengan Spons Jenis Aplysina sp sebagai Penghasil Antibakteridari Perairan Pulau Tegal Lampung. Maspari Journal. Volume 4, Nomor 1.Purwani, Eni, Estu Retnaningtyas, dan Dyah Widowati. 2013. Pengembangan Model Pengawet Alami dari Ekstrak Lengkuas, Kunyit, dan Jahe sebagai Pengganti Formalin pada Daging Besar. Seminar Nasional IX Pendidikan Biologi FKIP UNS.Puspitasari, Dyah Ayu, Artini Pangastuti, dan Kusumo Winarno. 2005. Isolasi Bakteri Pendegradasi Limbah Industri Karet dan Uji Kemampuannya dalam Perbaikan Kualitas Limbah Industri Karet. Jurnal Bioteknologi. Volume 2 Nomor 2.

LILI HANDAYANIO1A1 14 022