LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI

PEWARNAAN SEL BAKTERI

Oleh:

Nama : I Gede Dwija Bawa Temaja

Nim : 0808505031

Kelompok : II

Tanggal Praktikum : 5 April 2010

Asisten : Ni Komang Sri Indrawati

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS UDAYANA

2010

I. PENDAHULUAN

1.1 Dasar Teori

Pengenalan bentuk mikroba (morfologi), kecuali mikroalgae harus dilakukan

pewarnaan terlebih dahulu agar dapat diamati dengan jelas (Ramona dkk, 2007). Pada

umumnya bakteri bersifat tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang

tidak mempunyai zat warna (Waluyo, 2004). Tujuan dari pewarnaan adalah untuk

mempermudah pengamatan bentuk sel bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati

struktur dalam dan luar sel bakteri, dan melihat reaksi jazad terhadap pewarna yang

diberikan sehingga sifat fisik atau kimia jazad dapat diketahui (Ramona dkk, 2007).

Berhasil tidaknya suatu pewarnaan sangat ditentukan oleh waktu pemberian warna

dan umur biakan yang diwarnai (umur biakan yang baik adalah 24 jam). Umumnya zat

warna yang digunakan adalah garam-garam yang dibangun oleh ion-ion yang bermuatan

positif dan negatif dimana salah satu ion tersebut berwarna. Zat warna dikelompokkan

menjadi dua, yaitu zat pewarna yang bersifat asam dan basa. Jika ion yang mengandung

warna adalah ion positif maka zat warna tersebut disebut pewarna basa. Dan bila ion

yang mengandung warna adalah ion negatif maka zat warna tersebut disebut pewarna

negatif (Ramona dkk, 2007).

Beberapa jenis pewarnaan antara lain adalah pewarnaan langsung dengan

pewarnaan basa, pewarnaan tidak langsung atau pewarnaan negatif dengan pewarnaan

asam, pewarnaan gram, dan pewarnaan endospora. Pewarna basa akan mewarnai dinding

sel bakeri yang relatif negatif, contohnya metiline blue dan kristal violet. Sedanglan pada

pewarnaan tidak langsung, yang terwarnai adalah lingkungan sekitar sel, tetapi tidak

mewarnai sel karena daya mewarnai pada zat ini berada pada ion negatif dan tidak

bereaksi dengan ion negatif lainnya dari sel bakteri (Ramona dkk, 2007).

1.2 Tujuan

1. Untuk mengetahui tujuan pewarnaan sel bakteri.

2. Untuk mengetahui metode-metode yang digunakan dalam pewarnaan sel bakteri.

3. Untuk mengetahui bentuk sel bakteri hasil isolasi setelah dilakukan pewarnaan.

4. Untuk mengetahui perbedaan warna antara bakteri gram positif dan gram negatif.

II. MATERI DAN METODE

Dalam praktikum kali ini, bakteri yang digunakan dalam pewarnaan adalah isolat

bakteri Streptococcus pyogene, E.coli, dan dari jenis Bacillus Pada pewarnaan secara

langsung dengan pewarna basa, sebuah kaca objek bebas lemak ditetesi setetes air steril pada

bagian tengahnya. Dengan mengguunakan jarum ose yang telah dipijarkan, diambil sedkit

biakan yang telah diisolasi. Selanjutnya dibuat apusan bakteri pada air yang diletakkan pada

kaca objek dengan cara menggesek-gesekkan jarum ose yang berisi biakan bakteri sehingga

didapatkan suatu campuran yang tipis dan merata. Difiksasi diatas nyala api Bunsen dengan

jarak sekitar 30 cm dari nyala api. Dalam memfiksasi ini tidak boleh terlalu panas karena

dapat merusak bentuk sel. Seteleh itu diteteskan metiline blue dan didiamkan selama 30-60

detik. Selanjutnya dicuci dengan air air mengalir dan dikeringkan dengan meletakkannya

diatas kertas tissue. Sediaan diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 100x dan diolesi

minyak emersi terlebih dahulu yang bertujuan untuk memperjelas bentuk sel. Bentuk dan

warna sel bakteri dicatat dan digambar.

Pada pewarnaan secara tidak langsung, satu tetes tinta cina diteteskan pada pinggiran

kaca objek. Lalu dengan menggunakan jarum ose yang telah dipijarkan, diambil sedikit

biakan bakteri dan disuspensikan pada tetesan tinta cina pada permukaan kaca objek.

Suspense bakteri dalam tinta cina tersebut selanjutnya diratakan dengan menggunakan kaca

objek lainnya dan dibiarkan kering pada suhu kamar. Setelah kering lalu diamati di bawah

mikroskop dengan pembesaran 100x dan memakai minya emersi. Bentuk dan warna sel

bakteri dicatat serta digambar.

Untuk pewarnaan gram, terlebih dahulu dibuat apusan bakteri pada kaca objek yang

kering dan bersih. Kemudian difiksasi diatas nyala api Bunsen atau di udara barulah

dilakukan pewarnaan dengan larutan kristal violet selama 1-1,5 menit. Selanjutnya dicuci

dengan air suling dan ditetesi dengan larutan garam iodine, dibiarkan selama 1 menit.

Kemudian dicuci dengan larutan alkohol 95% sampai warnanya terhapus yang biasanay

selama 30 detik. Cuci kembali dengan air dan kemudian diwarnai dengan safranin atau karbol

fuhsin selama 5 – 15 menit. Cuci lagi dengan air, kelebihan air dibuang dengan menggunakan

kertas hisap tanpa menggosok sediaan. Selanjutnya dikeringkan di udara atau diatas nyala api

Bunsen. Diamati dibawah mikroskop dengan pembesaran 100x memakai minyak emersi.

Hasil pengamatan kemudian dicatat dan digambar.

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Hasil Pengamatan

Klp Bakteri Pengamatan Keterangan

P. tidak langsung P. langsung P. gram

I Bacillus 100x10 100x10 100x10 Bakteri bentuk batang

Bakteri gram(-)

II Streptococcus pyogenes

40x10 100x10 40x10 Bakteri bentuk bulat berantai

Bakteri gram(+)

III Bacillus 40x10 40x10 40x10 Bakteri bentuk batang

Bakteri gram(+)

IV Streptococcus pyogenes

100x10 100x10 100x10 Bakteri bentuk bulat berantai

Bakteri gram(+)

V E. coli 40x10 40x10 40x10 Bakteri bentuk batang

Bakteri gram(-)

VI E. coli 40x10 40x10 100x10 Bakteri bentuk batang

Bakteri gram(-)

3.2 PembahasanPada praktikum pewarnaan bakteri kali ini, sampel yang digunakan adalah isolat

Streptococcus pyogenes, E.coli, dan dari jenis Bacillus. Untuk pewarnaan bakteri secara

langsung, digunakan satu larutan pewarna yaitu larutan metiline blue. Adapun hasil yang

didapatkan adalah bakteri Streptococcus pyogenes dengan pembesaran 100x10 berbentuk

bulat (coccus) yang membentuk untaian rantai (streptococcus) dengan warna ungu violet,

bakteri E.coli dengan pembesaran 40x10 berbentuk batang dengan warna ungu violet,

dan bakteri jenis Bacillus dengan pembesaran 40x10 dan 100x10 berbentuk batang

(basil) dengan warna ungu violet. Akan tetapi pada pengamatan Streptococcus pyogenes

terlihat juga bakteri dengan bentuk berbeda yang merupakan kontaminan. Adanya

kontaminan ini kemungkinan disebabkan pada saat pemindahan isolat ke kaca objek

terjadi kontaminasi karena kurangnya pemanasan jarum ose pada saatpengambilan

biakan sehingga masih ada bakteri lain dari udara yang ikut dalam apusan atau telah

terkontaminasinya isolat bakteri yang digunakan. Adapun hasil dari pengamatan ini telah

sesuai dengan pustaka yang menyebutkan bahwa bentuk bakteri Streptococcus pyogenes

adalah berbentuk bulat (coccus) yang membentuk untaian rantai, bakteri E.coli berbentuk

batang, dan bakteri dari jenis Bacillus berbentuk batang (basil) (Ramona dkk, 2007).

Terwarnainya bakteri oleh pewarna basa disebabkan karena bakteri kaya akan asam

amino dan mengandung muatan negatif seperti kelompok fosfat. Sifat ini bereaksi

dengan zat warna yang bermuatan positif (Jawetz et al, 2005). Sitoplasma bakteri bakteri

umumnya bermuatan negatif sementara pewarna memiliki muatan positif sehingga

pewarna akan terikat oleh sitoplasma dan akhirnya sel menjadi terwarnai (Alcamo,

1996). Dalam pewarnaan bakteri ini dilakukan fiksasi yang bertujuan untuk memperkuat

perlekatan warna dan bakteri pada kaca preparat (Pelczar, 2005). Fiksasi tidak boleh

dilakukan terlalu lama sebab dapat mengakibatkan perubahan bentuk struktur bakteri

yang diamati dari bentuk normalnya. Hal ini disebabkan karena semakin lamanya fiksasi,

maka suhu yang dihasilkan dari fiksasi tersebut akan semakin tinggi sehingga bentuk

bakteri akan mengalami lisisnya cairan dan menyebabkan bentuk yang diamati nantinya

akan berbeda dari bentuk aslinya (Entjang, 2003).

Pada pewarnaan tidak langsung digunakan suatu larutan pewarna yaitu nigrosin atau

tinta cina. Dari hasil pengamatan didapatkan hasil pada bakteri Streptococcus pyogenes

dengan pembesaran 40x10 dan 100x10 terlihat berbentuk bulat (coccus) yang

membentuk untaian rantai berwarna kuning coklat dengan warna lingkungan hitam atau

gelap. Hal ini terjadi karena adanya minyak emersi yang ditambahkan, akan tetapi warna

aslinya adalah bening. Pada bakteri E.coli dan Bacillus dengan pembesaran 40x10 dan

100x10 terlihat bernbentuk batang (basil) berwarna bening dengan warna lingkungan

hitam atau gelap. Lingkungan yang berwarna hitam disebabkan oleh pewarna yang

digunakan adalah nigrosin atau tinta cina yang memiliki warna dasar hitam. Hal ini telah

sesuai dengan pustaka yang menyebutkan bahwa zat pewarna asam membawa suatu

muatan negatif, maka pada sel yang permukaannya juga negatif akan ditolak oleh

sitoplasma sel sehingga zat warna ini akan berkaitan dengan lingkungan yang

mengelilingi sel dan bagian dalam sel akan tetap berwarna bening (Alcamo, 1996).

Selain itu disebutkan juga pada pustaka bahwa bakteri merupakan organisme

mikroselular yang pada dinding selnya mengandung ion negatif, zat warna (nigrosin)

yang bermuatan negatif tidak akan mewarnai sel tetapi yang terwarnai adalah lingkungan

luarnya saja (Entjang, 2003).

Pada pewarnaan gram didapatkan hasil bahwa bakteri Streptococcus pyogenes

dengan pembesaran 40x10 dan 100x10 berbentuk bulat (coccus) yang membentuk

untaian rantai dengan warna ungu. Warna ini menunjukkan bakteri Streptococcus

pyogenes termasuk golongan bakteri gram positif. Hal ini disebabkan karena bakteri

menyerap zat warna dasar yaitu kristal violet dan warnanya tidak terhapuskan oleh

pencucian alkohol, sehingga sel bakteri ini tidak menyerap warna sfranin yang

merupakan warna kontras (Ramona dkk, 2007). Warna violet (ungu) ini timbul karena

bakteri gram positif mempunyai lapisan peptidoglikan yang tebal dan kandungan

lipidnya rendah sehingga akan mengikat lebih banyak kompleks zat warna sehingga

warnanya menjadi violet (ungu) (Alcamo, 1996). Pada pengamatan bakteri E.coli

dengan pembesaran 40x10 dan 100x10 didapatkan hasil bahwa bakteri ini berbentuk

batang (basil) dengan warna merah muda. Warna ini menunjukkan bakteri E.coli

termasuk golongan bakteri gram negatif. Hal ini disebabkan karena bakteri ini setelah

diwarnai oleh pewarna dasar yaitu kristal violet menyerap warna dasar, setelah dicuci

dengan alkohol maka warna dasarnya akan terhapus dan menyerap pewarna safranin atau

karbol fushin yang digunakan sebagai pewarna kontras sehingga akan berwarna merah

(Ramona dkk, 2007). Warna merah ini timbul karena bakteri gram negatif memiliki

lapisan peptidoglikan yang tipis sehingga ikatan antara kristal violet-iodine dengan

lapisan peptidoglikan lebih sedikit terjadi dan bakteri lebih dominan terwarnai oleh

pewarna safranin yang berwarna merah (Alcamo, 1996). Pada pengamatan bakteri jenis

Bacillus dengan pembesaran 40x10 dan 100x10 didapatkan hasil yang berbeda dimana

terdapat Bacillus yang berbentuk batang dengan warna ungu dan Bacillus yang

berbentuk batang dengan warna merah. Perbedaan hasil ini disebabkan karena

kemungkinan pada saat pewarnaan dengan safranin terlalu banyak dilakukan

penambahan safranin sehingga warnanya ikut terserap. Berdasarkan warna yang

diperoleh menunjukkan bahwa dua bakteri jenis bacillus yang diamati merupakan

golongan bakteri gram positif dan bakteri gram negatif. Bacillus yang termasuk golongan

gram positif karena bakteri ini setelah diwarnai dengan pewarna dasar kristal violet dan

dicuci alkohol tetap berwarna ungu dan tidak menyerap pewarna kontras (Ramona dkk,

2007). Hal ini disebabkan karena bakteri gram positif memiliki lapisan peptidoglikan

yang tebal dan kandungan lipidnya rendah sehingga akan mengikat kompleks yang lebih

banyak dan warnanya akan menjadi violet (Alcamo, 1996). Untuk hasil bacillus bakteri

gram negatif terjadi karena penambahan safranin yang berlebihan sehingga warna

safranin ikut terserap, karena menurut pustaka disebutkan bahwa bacillus merupakan

golongan bakteri gram positif (Waluyo, 2004).

Dalam pewarnaan gram dilakukan juga penambahan iodine yang merupakan proses

fiksasi warna untuk mempertahankan struktur dalam dan luar sel tetap pada posisinya.

Fiksasi juga berperan untuk menginaktivasi enzim yang mungkin dapat mengganggu

bentuk sel dan menguatkan struktur mikroba. Mikroba umumnya dibunuh dan dilekatkan

kuat pada kaca objek selama fiksasi (Prescott et al, 1993).

IV. KESIMPULAN

1. Tujuan dilakukan pewarnaan adalah untuk mempermudah pengamatan bentuk sel

bakteri, memperluas ukuran jazad, mengamati struktur dalam dan luar sel bakteri, dan

melihat reaksi jazad terhadap pewarna yang diberikan sehingga sifat fisik atau kimia

jazad dapat diketahui.

2. Metode-metode yang dapat digunakan dalam pewarnaan sel bakteri adalah pewarnaan

langsung dengan pewarnaan basa, pewarnaan tidak langsung atau pewarnaan negatif

dengan pewarnaan asam, pewarnaan gram, dan pewarnaan endospora. Tetapi dalam

praktikum, tidak dilakukan metode pewarnaan endospora.

3. Bentuk bakteri hasil isolasi yang terlihat adalah coccus yang membentuk untaian rantai

(streptococcus) pada Streptococcus pyogenes, basil untuk bakteri E.coli dan bacillus

4. Bakteri gram positif mempunyai ciri berwarna ungu karena mengikat warna pada

pewarna dasar dan tidak terhapus oleh pencucian dengan alkohol serta tidak menyerap

pewarna kontras sedangkan bakteri gram negatif mempunyai ciri berwarna merah karena

menyerap pewarna dasar dan terhapuskan oleh pencucian dengan alkohol serta menyerap

pewarna kontras. Pada praktikum ini bakteri Streptococcus pyogenes termasuk golongan

bakteri gram positif, E.coli termasuk golongan bakteri gram negatif, dan bacillus

termasuk golongan bakteri gram positif.

DAFTAR PUSTAKA

Alcamo, I.E. 1996. Fundamental of Microbiology, 5th Edition. Addison Wesly Longman, Inc:

New York

Entjang, I. 2003. Mikrobiologi dan Parasitologi Untuk Akademi Keperawatan. Citra Aditya

Bakti. Bandung.

Jawetz, E., J.L. Melnick, dan E.A. Adelberg. 2005. Mikrobiologi kedokteran. Penerbit Buku

Kedokteran. Jakarta.

Pelczar, M.J, E.C.S. Chan. 2006. Dasar-dasar Mikrobiologi. UI Press. Jakarta.

Prescott, Lansing M., John P. Harley, Donald A. Klein. 1993. Microbiology 2nd Edition USA:

WMC Brown Publisher.

Ramona, Y., R. Kawuri, I.B.G. Darmayasa. 2007. Penuntun Praktikum Mikrobiologi Umum

Untuk Program Studi Farmasi FMIPA UNUD. Laboratorium Mikrobiologi Jurusan

Biologi Fakultas MIPA Universitas Udayana. Bukit Jimbaran.

Waluyo. L.2004. Mikrobiologi Umum. UMM Press. Malang