Upload
trinhliem
View
214
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
ISSN 1907-9850
41
PERBANDINGAN KUALITAS DNA DENGAN MENGGUNAKAN METODE BOOM ORIGINALDAN BOOM MODIFIKASI PADA ISOLAT Mycobacterium tuberculosis 151
Dewi Andayani Farmawati1, I Nengah Wirajana2,3, dan Sagung Chandra Yowani1,3
1Jurusan Farmasi FMIPA Universitas Udayana, Bukit Jimbaran, Bali2Jurusan Kimia FMIPA Universitas Udayana, Bukit Jimbaran, Bali
3Kelompok Studi MDR & XDR-TB FMIPA Universitas Udayana, Bukit Jimbaran, BaliEmail : [email protected]
ABSTRAK
Tuberkulosis (TB) merupakan penyakit yang disebabkan oleh bakteri Mycobacterium tuberculosis. IsolasiDNA adalah tahapan yang diperlukan untuk memperoleh DNA kromosomal bakteri yang akan digunakan dalampendeteksian M. tuberculosis menggunakan Polymerase Chain Reaction (PCR). Metode Boom merupakan metodeisolasi yang umum digunakan dalam isolasi DNA M. tuberculosis. Di Bali, proses isolasi DNA M. tuberculosisdilakukan di Laboratorium Biomolekuler FK UNUD menggunakan metode Boom modifikasi. Penelitian inibertujuan untuk membandingkan kualitas DNA yang dihasilkan oleh metode Boom dan metode Boom modifikasi.Penelitian ini diawali dengan proses isolasi DNA menggunakan metode Boom dan metode Boom modifikasi untukselanjutnya diamplifikasi dengan metode PCR. Deteksi produk PCR dilakukan dengan metode elektroforesis.Kualitas DNA ditentukan dengan ketebalan pita DNA hasil PCR dan analisis kemurnian dengan spektrofotometriUV-Vis. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa kualitas DNA isolat Mycobacterium tuberculosis 151 yangdihasilkan pada metode Boom modifikasi (Laboratorium Biomolekuler FK UNUD) relatif lebih baik dibandingkanmetode Boom original (Boom et al, 1990).
Kata kunci : Tuberkulosis, Mycobacterium tuberculosis, isolasi DNA, metode isolasi, kualitas DNA
ABSTRACT
Tuberculosis (TB) is a disease caused by the Mycobacterium tuberculosis. Isolation DNA is a necessarystep to obtain the bacterial chromosomal DNA used in the Polymerase Chain Reaction (PCR). Boom isolationmethod is an isolation method commonly used in isolation DNA of M. tuberculosis. In Bali, the isolation DNA of M.tuberculosis conducted at the Laboratory of Biomolecular FK UNUD uses boom modification method. This researchaims to compare the quality of DNA produced by the Boom methods and Boom modification methods. This researchwas started with the isolation process using Boom method and Boom modification and subsequently amplified byPCR. Detection of PCR products was performed with electrophoresis method. DNA quality was determined by thethickness of bands DNA PCR product and purity analysis by spectrophotometry UV-Vis. The results obtained showthat the quality of DNA Mycobacterium tuberculosis 151 isolate using Boom modification method (Laboratory ofBiomolecular FK UNUD) is relatively better than Boom original methods (Boom et al, 1990)..
Keywords : Tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis, DNA isolation, isolation method, DNA quality
PENDAHULUAN
Tuberkulosis (TB) merupakan salah satupenyakit yang telah lama dikenal dan sampai saatini masih menjadi penyebab utama kematian di
dunia (Saptawati, et al., 2012). Penyakit inidisebabkan oleh Mycobacterium tuberculosis, yangpenyebarannya melalui udara pada saat pasientuberkulosis mengalami batuk atau bersin. (Amin,et al, 2011). Pada tahun 2011, secara global jumlah
JURNAL KIMIA 9 (1), JANUARI 2015: 41-46
42
kasus tuberkulosis diperkirakan terjadi 125 kasusper 100.000 penduduk. Lima negara dengankejadian TB terbesar pada tahun 2011 adalahIndia (2,0-2,5 juta), China (0,9-1,1 juta), AfrikaSelatan (0,4-0,6 juta), Indonesia (0,4-0,5 juta) danPakistan (0,3-0,5 juta). Dari data tersebut,Indonesia berada pada peringkat ke-4 dunia(WHO, 2012).
Berbagai teknik pemeriksaan telahdilakukan untuk mendeteksi adanyaMycobacterium tuberculosis, salah satunya yangrelatif baru dan sedang populer adalah PolymeraseChain Reaction (PCR). Prinsip utama teknik iniadalah amplifikasi DNA bakteri sehingga deteksidapat dilakukan (Jasaputra, et al., 2007).Identifikasi M. tuberculosis dengan teknik PCRdapat dilakukan dengan waktu yang relatif cepatyaitu 24 jam dan tidak memerlukan jumlah bakteriyang banyak. PCR memiliki spesifisitas,sensitifitas yang tinggi dan cepat untuk diagnosispenyakit infeksi. Proses identifikasi M.tuberculosis dengan teknik PCR memerlukanDNA kromosom dari bakteri itu sendiri sehinggaperlu dilakukan proses isolasi untuk memperolehDNA M. tuberculosis. Isolasi DNA merupakanlangkah penting dari sampel klinis untuk diagnosismolekuler tuberkulosis dengan PCR (Aygan,2006).
M. tuberculosis memiliki dinding sel yangterbuat dari struktur kompleks impermeable (tidakdapat ditembus) sehingga menyebabkan lisis selmenjadi sulit. Dinding sel yang tahan terhadap lisismengganggu metode isolasi DNA konvensional(Amaro, et al, 2008). Akibatnya, sebagian besarprosedur isolasi yang sederhana dan umumdigunakan menghasilkan kualitas DNA yang burukserta jumlahnya sedikit (Amita, et al, 2002). Adaberbagai macam metode isolasi DNA, salahsatunya metode Boom yang umum digunakandalam isolasi DNA M. tuberculosis. Diagnosisterhadap M. tuberculosis khususnya di Bali seringdilakukan di Laboratorium Biomolekuler FKUNUD, dengan menggunakan metode Boom yangtelah dimodifikasi. Perlu dilakukan suatu telaahmengenai kualitas DNA yang dihasilkan darimetode Boom yang dimodifikasi (LaboratoriumBiomolekuler FK UNUD) terhadap metode Boomoriginal (Boom, et al, 1990), sehingga nantinyadapat memberikan informasi mengenai metodemana yang dapat memberikan hasil kualitas terbaik
yang dapat digunakan dalam proses isolasi DNAM. tuberculosis.
MATERI DAN METODE
BahanSampel yang digunakan dalam penelitian
ini adalah isolat M. tuberculosis 151 yangdiperoleh dari Instalasi Mikrobiologi KlinikRumah Sakit Umum Pusat (RSUP) SanglahDenpasar. Larutan pelisis L6 (GuSCN, Tris-HCl,EDTA dan Triton-X), buffer L2 (GuSCN, Tris-HCl), buffer Tris-EDTA (TE) pH 8, suspensidiatom, etanol 70%, aseton, aquades steril,agarosa, etidium bromida, dan Tris-Borat-EDTA(TBE) 1x, marker 100 pb (Invitrogen).
PeralatanPeralatan yang digunakan dalam penelitian
ini adalah inkubator, vorteks, shaker rotatory, satuset pipet mikro, tabung mikro 1,5 mL, SorvallBiofuge Primo R Centrifuge, lemari pendingin,Biological Safety Cabinet Class II, thermalcycler(Applied Biosystems), Eppendorf Microfuge,horizontal elektroforesis (Power Pac Basic™,USA), Gel Doc (Bio-Rad), Spektrofotometer UV-Vis (Pharmacia Biotech), autoklaf dan alat-alatgelas.
Cara KerjaIsolasi DNAMetode Boom Original (Boom et al, 1990)
Metode Boom merupakan metode yangdilakukan pertama kali oleh Boom et al (1990).Proses isolasi DNA dilakukan dengan carasebanyak 50 µL sampel isolat M. tuberculosisditambahkan dengan 900 µL buffer lisis L6 dan 40µL suspensi diatom. Larutan tersebut divorteksdengan segera ± 5 detik. Tabung didiamkan selama10 menit pada suhu ruangan, kemudian tabungreaksi divorteks kembali (5 detik) dandisentrifugasi (15 detik) dalam Eppendorfmicrofuge dengan kecepatan 12.000 x g.Supernatan yang diperoleh dibuang.
Pelet yang diperoleh dicuci denganpenambahan 1 mL buffer L2, divorteks,disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 x g selama15 detik. Supernatan yang diperoleh dibuang,diambil peletnya (proses ini dilakukan sebanyak 2
ISSN 1907-9850
43
kali). Selanjutnya pelet ditambahkan 1 mL denganetanol 70% (v/v), divorteks, disentrifugasi dengankecepatan 12.000 x g selama 15 detik. Supernatanyang diperoleh dibuang, diambil peletnya (prosesini dilakukan sebanyak 2 kali). Pelet ditambahkan1 mL aseton ke dalam tabung, divorteks,disentrifugasi dengan kecepatan 12.000 x g selama15 detik. Supernatan yang diperoleh dibuang,diambil peletnya.
Setelah asetonnya dibuang, tabung reaksidikeringkan pada suhu 56ºC dengan penutupdalam keadaan terbuka dan dipanaskan selama 10menit. Buffer elusi (buffer TE pH 8) ditambahkandan tabung reaksi ditutup, divorteks dengan cepatdan diinkubasi selama 10 menit pada suhu 56ºC.Tabung reaksi divorteks dengan cepat dandisentrifugasi selama 2 menit pada kecepatan12.000 x g dan supernatan yang mengandung DNAdapat digunakan. Proses ini dilakukan di dalamBiological Safety Cabinet Class II.Metode Boom Modifikasi (LaboratoriumBiomolekuler FK UNUD, unpublished)
Metode ini merupakan metode yangdilakukan di Laboratorium Biomolekuler FKUNUD yang belum dipublikasikan. Pada metodeini telah dilakukan beberapa modifikasi darimetode Boom yang dikerjakan oleh Boom, et al(1990). Modifikasi dilakukan pada beberapa tahapyaitu jumlah isolat, jumlah buffer, kecepatan danwaktu sentrifugasi serta cara dan waktupengeringan pelet. Sebanyak 100 µL sampel dan40 µL suspensi diatom dimasukkan ke dalamtabung mikro yang berisi 1 mL buffer L6.Divorteks hingga homogen kemudian dikocokmenggunakan shaker dengan kecepatan 100 rpmselama 15 menit. Larutan disentrifugasi selama 1menit dengan kecepatan 12.000 rpm dansupernatan yang diperoleh dibuang sehinggadiperoleh pelet.
Pelet ditambahkan dengan washing bufferL2 sebanyak 0,5 mL dan disentrifugasi selama 1menit dengan kecepatan 12.000 rpm. Supernatanyang diperoleh dibuang kembali (langkah tersebutdiulangi 1 x). Pelet dicuci dengan etanol 70%sebanyak 1 mL, disentrifugasi selama 1 menitdengan kecepatan rpm, kemudian supernatandibuang kembali. Pelet dicuci kembali denganaseton sebanyak 1 mL, disentrifugasi selama 1menit dengan kecepatan rpm, kemudian supernatandibuang. Pelet dikeringkan dalam waterbath suhu
56ºC selama 10 menit. Aquades steril ditambahkansebanyak 50 µL, divorteks, kemudian diinkubasiselama 10 menit pada suhu 56ºC. Divortekskembali dan kemudian disentrifugasi selama 5menit dengan kecepatan 12.000 rpm. Suspensidipipet dan dipindahkan ke dalam tabung mikrosteril baru sehingga diperoleh DNA kromosomal.Proses ini dilakukan di dalam Biological safetycabinet class II.Proses amplifikasi DNA dengan metode PCR
Proses amplifikasi dilakukanmenggunakan alat thermalcycler (AppliedBiosystems) dengan menggunakan sepasangprimer oligonukleotida yaitu terdiri atas primerforward (mabA-inhA-promoter-FS) dengan urutan5’ACATACCTGCTGCGCAAT3’ dan primerreverse (mabA-inhA-promoter-R) dengan urutanyaitu 5’CTCCGGTAACCA GGACTGAA3’(Chen et al., 2011). Proses ini teriri dari beberapatahap, yaitu dengan denaturasi awal pada 95°Cselama 15 menit, 45 siklus amplifikasi yang terdiridari denaturasi selama 1 menit pada 94°C,annealing selama 1 menit 20 detik pada 54°C, danelongasi selama 1 menit 10 detik pada 72°C.Tahap akhir amplifikasi adalah elongasi akhir pada72°C selama 10 menit.Deteksi produk PCR dengan metodeElektroforesis
Produk PCR dianalisis denganelektroforesis gel agarosa 1,5% b/v. Sebanyak 3µL sampel hasil PCR dan 3 µL DNA ladder 100 pbdimasukkan ke dalam sumur yang terbentuk darisisir. Kemudian dielektroforesis dengan runningbuffer TBE (Tris-Boric Acid-EDTA) 1x padategangan 65 volt selama 35 menit. Hasilelektroforesis kemudian divisualisasi pada alat UVTransiluminator (Gel Doc).Analisis Kemurnian
Deteksi kemurnian DNA hasil isolasi padakedua metode dilakukan dengan menggunakanmetode spektrofotometri UV-Vis. Sampeldianalisis pada dua panjang gelombang yaitu padapanjang gelombang 260 nm dan 280 nm denganmenggunakan aquadest sebagai blanko sehinggaakan diperoleh nilai absorbansinya. Nilaiabsorbansi sampel pada panjang gelombang 260nm dan 280 nm dibandingkan sehingga akandiperoleh rasio Absorbansi λ260/Absorbansi λ280.
JURNAL KIMIA 9 (1), JANUARI 2015: 41-46
44
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada penelitian ini menggunakan sampelisolat Mycobacterium tuberculosis 151 yangdiperoleh dari Instalasi Mikrobiologi KlinikRumah Sakit Umum Pusat (RSUP) SanglahDenpasar. Sampel terlebih dahulu disubkultur padamedia Lowenstein-Jensen (LJ) dan diinkubasi padasuhu 37ºC selama 3 minggu. Metode isolasi DNAyang pertama kali dilakukan dalam penelitian iniadalah metode Boom original (Boom, et al, 1990),yang kemudian diikuti oleh metode isolasi DNABoom modifikasi (Laboratorium Biomolekuler FKUNUD). Setiap metode dilakukan pengulangansebanyak 3 kali.
Isolasi DNA merupakan langkah pentingdari sampel klinis untuk diagnosis molekulertuberkulosis dengan PCR (Aygan, 2006). Prinsipdasar isolasi DNA adalah serangkaian proses untukmemisahkan DNA dari komponen-komponenlainnya yang harus dilakukan dengan baik danbebas dari kontaminasi sehingga diperoleh DNAhasil isolasi dengan kualitas yang baik (Tenriulo,et al., 2001). Salah satu metode yang umumdigunakan dalam isolasi M. tuberculosis adalahmetode Boom. Prinsip dari metode Boom yaitudidasarkan pada melisiskan dan menonaktifkannuklease dari agen chaotropic guanidiniumtiosianat bersama dengan sifat ikatan asam nukleatpada partikel silika atau diatom dengan adanyaagen ini (Boom, et al, 1990). Proses isolasi metodeBoom original dengan metode Boom modifikasihampir sama, namun terdapat beberapa perbedaanperlakuan baik dalam jumlah larutan, waktusentrifugasi, proses pencucian DNA dan larutanpensuspensi DNA yang digunakan.
Proses isolasi DNA dengan menggunakanmetode Boom dilakukan dengan menggunakanlarutan buffer lisis L6 yang terdiri dari Tris-HCl,GuSCN (Guanidine tiosianat), EDTA dan Triton-X-100. Buffer lisis L6 mengandung GuSCNsebagai chaotropic agent yang melisis sel padasampel sehingga akan mengeluarkan DNA.GuSCN dalam konsentrasi tinggi mengakibatkanDNA akan terikat pada diatom (fosil dari dindingsel alga uniseluler) yang akan diendapkan denganproses sentrifugasi. EDTA (EthylenediamineTetraacetic Acid) akan membentuk kompleks(chelate) dengan ion logam seperti Mg2+ yangmerupakan kofaktor DNAase. EDTA berfungsi
sebagai perusak sel dengan cara mengikat ionmagnesium (ion ini berfungsi untuk memper-tahankan aktifitas enzim nuklease yang merusakasam nukleat). Triton X-100 (nonionic detergent)merupakan sejenis deterjen yang berfungsimerusak membran sel dan menyebabkan pecahnyakromosom. Suspensi diatom ditambahkanbertujuan untuk pengikatan DNA (Lina, et al.,2007; Faatih, 2009; Tenriulo, et al., 2001). Larutantersebut divorteks untuk menghomogenkan larutankemudian dilakukan sentrifugasi. Prinsip utamasentrifugasi adalah memisahkan substansiberdasarkan berat jenis molekul dengan caramemberikan gaya sentrifugal sehingga substansiyang lebih berat akan berada di dasar, sedangkansubstansi yang lebih ringan akan terletak di atas(Faatih, 2009). DNA pada saat sentrifugasi akanberada pada pelet DNA karena DNA terikat padadiatom, sehingga pada proses ini bagian peletdiambil sedangkan supernatannya dibuang.
Pelet DNA yang diperoleh selanjutnyadicuci dengan menggunakan washing buffer(buffer L2) dan etanol 70% yang bertujuan untukmembersihkan DNA dari pengotor-pengotornya.Selain digunakan dalam tahap pencucian DNA,etanol 70% juga digunakan untuk presipitasi DNAbersama dengan aseton. Larutan divorteks,disentrifugasi dan diambil kembali bagianpeletnya. Langkah akhirnya adalah denganpemberian Tris-EDTA yang bertujuan untukmelarutkan kembali DNA untuk dipreservasi.(Faatih, 2009; Lina, et al., 2007). Pada metodeBoom modifikasi digunakan aquadest steril untukmelarutkan DNA kembali. Penggunaan buffer TEatau aquadest steril ini memiliki fungsi sebagaipengelusi agar DNA terlepas dari diatom danberada pada supernatan, sehingga tahap akhirdiambil supernatan yang mengandung DNA. DNAini selanjutnya akan digunakan sebagai DNAtemplate pada proses amplifikasi dengan metodePCR untuk kemudian dideteksi menggunakanmetode elektroforesis.
Analisis kualitas DNA dapat dilihat daripita elektroforegram DNA hasil PCR keduametode dengan mengamati ketebalan danketajaman pitanya. Selain itu, kualitas DNA jugaditentukan dengan analisis kemurnian DNA hasilisolasi pada kedua metode yang dilakukanmenggunakan metode spektrofotometri UV-Vis
ISSN 1907-9850
45
dengan melihat rasio Absorbansi λ260/Absorbansiλ280.
Berdasarkan hasil elektroforegramGambar 1. menunjukkan bahwa pita DNA produkPCR menggunakan metode Boom modifikasimenghasilkan pita yang relatif lebih tebal dantajam dibandingkan dengan pita DNA produk PCRmenggunakan metode Boom original. Hal inimenandakan bahwa kualitas DNA yang dihasilkanoleh metode Boom modifikasi relatif lebih baikdibandingkan dengan DNA yang dihasilkan olehmetode Boom original.
Keterangan: M=Marker DNA ladder 100 pb, B1-B3=metode Boom original, BL1-BL3=metode Boom modifikasi
Gambar 1. Elektroforegram DNA produk PCR M.tuberculosis 151 dengan 3 kalipengulangan
Tabel 1. Kemurnian DNA hasil isolasi M.tubercu-losis 151 dengan 3 kalipengulangan
Sampel 151Pengu- Metode Boom Metode Boom modifikasiLangan Kemurnian
RasioAλ260/A λ280)
KemurnianRasio
A λ260/A λ280
1 1,464 1,9792 1,819 1,8013 1,489 2,573
Kemurnian DNA yang baik dilihat darihasil rasio A λ260/A λ280 sebesar 1,8-2,0 (Sambrook
and Russell, 2001). Berdasarkan hasil nilai rasioAbsorbansi λ260 nm/Absorbansi λ280 nm DNA hasilisolasi pada isolat M. tuberculosis 151, diperolehhasil 2 sampel pada metode Boom modifikasimemiliki nilai rasio kemurnian di antara 1,8-2,0sedangkan pada metode Boom hanya 1 sampelyang berada dalam rentang nilai kemurnian. Halini menunjukkan bahwa kemurnian DNA yangdihasilkan oleh metode Boom modifikasi relatiflebih murni dibandingkan dengan DNA yangdihasilkan metode Boom. Nilai rasio absorbansi dibawah 1,8 menunjukkan adanya kontaminasiprotein dan polisakarida (Rosilawati, 2002).Apabila DNA hasil isolasi terkontaminasi olehfenol rasio A260/A280 lebih besar dari 2,0. Hal inidapat terjadi karena fenol memiliki serapanmaksimal di panjang gelombang 270 nm danmampu memberi sumbangan kecil serapan dipanjang gelombang 260 nm (Wirajana et al.,2013).Berdasarkan kedua parameter yang telahdijabarkan, maka dapat dikatakan metode Boommodifikasi (Laboratorium Biomolekuler FKUNUD) menghasilkan kualitas DNA isolatMycobacterium tuberculosis 151 yang relatif lebihbaik dibandingkan dengan metode Boom original(Boom, et al, 1990).
SIMPULAN DAN SARAN
SimpulanDalam mengisolasi DNA pada isolat
Mycobacterium tuberculosis 151, metode Boommodifikasi (Laboratorium Biomolekuler FKUNUD) menghasilkan kualitas DNA yang relatiflebih baik dari metode Boom original (Boom et al,1990)
SaranPengujian terhadap kuantitas DNA yang
dihasilkan oleh metode Boom original (Boom etal, 1990) dan metode Boom modifikasi(Laboratorium Biomolekuler FK UNUD) perludilakukan untuk lebih memastikan metode manayang merupakan metode yang paling baikdigunakan dalam mengisolasi DNA M.tuberculosis.
15002072
600
pb
JURNAL KIMIA 9 (1), JANUARI 2015: 41-46
46
UCAPAN TERIMA KASIH
Pada penelitian ini penulis mengucapkanterimakasih kepada seluruh staff LaboratoriumBiomolekular Fakultas kedokteran UniversitasUdayana, Laboratorium Forensik FakultasMatematika dan Ilmu Pengetahuan AlamUniversitas Udayana, serta semua pihak yang telahmembantu dalam pelaksanaan penelitian ini.
DAFTAR PUSTAKA
Amaro, A., Duarte, A., Amado, A., Ferronha, H.and Botelho, A., 2008, Comparison ofThree DNA Extraction Methods forMycobacterium bovis, Mycobacteriumtuberculosis and Mycobacterium aviumsubsp.avium, Original Article: Letters inApplied Microbiology, 47 : 8-11
Amin, I., Awan, M, Z., Shahid, M., Afzal, S., andHussain, A., 2011, PCR could be aMethod of Choice for Identification ofboth Pulmonary and Extra-PulmonaryTuberculosis, BMC Research Note, 4 : 1-5
Amita, J., Vandana, T., Guleria, R. S., and Verma,R. K., 2002, Qualitative Evaluation ofMycobacterial DNA Extraction Protocolsfor Polymerase Chain Reaction, MolecularBiology, 3 : 43-50
Aygan, A., 2006, Nucleic Acid Extraction fromClinical Specimens for PCR Application,Turk J Biol, p. 107-120
Boom, R., Sol, C. J. A., Salimans, M. M. M.,Jansen, C. L., Wertheim van Dillen, P. M.E., and van Der Noordaa, J., 1990, Rapidand Simple Method for Purification ofNucleic Acids, Journal of ClinicalMicrobiology, 28 (3) : 495-503
Faatih, M., 2009, Isolasi dan Digesti DNAKromosom, Jurnal Penelitian Sains &Teknologi, 10 (1) : 61-67
Jasaputra, D. K., Widjaja, J. T., Wargasetia, T. L.,dan Makangiras, I., 2007, DeteksiMycobacterium tuberculosis denganTeknik PCR pada Cairan Efusi PleuraPenderita Tuberkulosis Paru, JKM, 7 (1) :86-92
Lina R, M., Bela, B., dan Syaifudin, M., 2007,Deteksi Gen Target INH pada DNASputum Basil ahan Asam Positif denganTeknik Polymerase Chain Reaction,Majalah Kedokteran Indonesia, 57 (8) :245-250
Rosilawati, M. L., Sudarmono, P., dan Ibrahim, F.,2002, Sensitivitas Metode PCR(Polymerase Chain Reaction) dalamMendeteksi Isolat Klinis Mycobacteriumtuberculosis, J. Kedoktera Trisakti, 21 (1): 7-14
Sambrook, J. and Russell, D. W., 2001,Molecular Cloning: A LaboratoryManual. 3rd Edition, Cold Spring HarborLaboratory Press, New York
Saptawati, L., Mardiastuti, Karuniawati, A., danRumende, C. M., 2012, Evaluasi MetodeFASTPlaqueTBTM Untuk MendeteksiMycobacterium tuberculosis pada Sputumdi Beberapa Unit Pelayanan Kesehatan diJakarta-Indonesia, Jurnal TuberkulosisIndonesia, 8 (1829-5118) : 1-6
Tebriulo, A., Suryati, E., Parenregi, A., danRosmiat, 2001, Ekstraksi DNA RumputLaut Kappaphycus alvarezii denganMetode Fenol Kloroform, Marina ChimicaActa, 2 (2) : 6-10
WHO, 2012, Global Tuberculosis Report 2012,WHO Press, Switzerland, p. 8-28
Wirajana, I N., Yuliana, D. A., dan Ratnayani, K.,2013, Isolasi DNA Metagenomik dariTanah Hutan Mangrove Pantai SuwungBali, Jurnal Kimia, 7 (1) : 19-24