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Raimondo Germani Università degli Studi di Perugia
Dipartimento di Chimica, Biologia e Biotecnologie
11 & 21 Ottobre 2016
PLS
Far conoscere come le proteine siano dei co-polimeri naturali.
Mettere in evidenza come queste biomacromolecole sono ottenute per reazione di policondensazione.
Far conoscere le peculiarità del legame ammidico/peptidico.
Far conoscere le varie strutture della catena polipeptidica.
Illustrare l’importanza delle proteine come Biomolecole fondamentali per ogni organismo vivente.
Evidenziare l’importanza delle relazione che intercorre tra struttura (forma) della biomolecola e la sua funzione.
Far conoscere i principali ruoli biologici delle proteine.
Far conoscere le procedure di sintesi di una catena polipeptidica.
Evidenziare l’azione catalitica di alcune proteine.
Conoscere le famiglie dei composti acilici (acidi carbossilici, cloruri acilici, ammidi, anidridi, esteri)
Conoscere la reazione di sostituzione nucleofila acilica (SNAc)
Conoscere l’ordine di reattività dei derivati acilici nella SNAc
Conoscere il significato di conformazione di una struttura molecolare
Conoscere e saper identificare la natura delle interazioni intermolecolari (non covalenti)
Conoscere il concetto di velocità di una reazione
Conoscere il ruolo svolto da un catalizzatore durante una reazione chimica
Conoscenze e abilità che lo studente dovrebbe avere prima di iniziare a trattare
questi contenuti
Le proteine sono semplici molecole o polimeri?
Alcuni nomi di proteine che conoscete
Le proteine sono solo di origine animale?
Cosa è la proteomica?
Conoscete alcune funzioni delle proteine?
Gli ormoni sono proteine?
Cosa succede alle albumine dell’uovo quando viene cotto?
Nel corpo umano dove si sintetizzano le proteine?
Perché gli enzimi sono strutture polimeriche?
Insulina Ormone regolatore
C254H377N65O76S6
Legame ammidico
Monomero amminoacidico
Importanza del legame Ammidico
Esempi di farmaci contenenti il legame ammidico
La risonanza del gruppo ammidico comporta una serie di conseguenze.
La rotazione attorno al legame C—N è ristretta a causa del suo parziale carattere di doppio legame.
Nella conformazione s-trans i due gruppi R sono da lati opposti rispetto al legame C-N.
Nella conformazione s-cis invece sono dalla stessa parte rispetto al legame C-N.
La conformazione s-trans del legame ammidico (peptidico) è più stabile della s-cis a causa
dell’ingombro sterica tra i gruppi R.
Il gruppo ammidico per questo motivo può esistere in 2 possibili conformazioni.
• Una ulteriore conseguenza della risonanza è che tutti e 6 gli atomi coinvolti nel gruppo amminico giacciono sullo stesso piano.
• Tutti gli angoli di legame sono ~120° e i legami C=O e N—H sono orientati tra loro a 180°.
Sei atomi giacciono sullo stesso piano (3 C, 1O, 1N, 1H)
Piano ammidico
Rotazione impedita
Legame peptidico
(ammidico)
Formalmente è una Reazione di condensazione
1. Il COOH della cisteina può legarsi con NH2 dell’alanina, generando il dipeptide Cys-Ala.
Un dipeptide può essere formato in un due differenti modi
2. Il COOH dell’alanina può legarsi al NH2 della cisteina, generando il dipeptide Ala-Cys.
La parola proteina dal greco “proteios = primario”, descrive una classe di composti di primaria importanza per tutti gli organismi viventi.
Le proteine sono di diversi tipi e presentano funzioni diverse, si stima che quelle contenute nel corpo umano siano > 100.000. Tutte le proteine sono costituite da amminoacidi.
Le proteine sono dei copolimeri dei 20 possibili monomeri. Sono polimeri ottenuti per policondensazione, dove i vari monomeri sono legati tra di loro attraverso legami ammidici.
Legame ammidico
Gruppo ammino terminale Gruppo carbossile terminale
L’aspartame è 180 volte più dolce del saccarosio.
Ambedue gli amminoacidi sono di configurazione L.
Se si sintetizza il dipeptide Asp-Phe con i due amminoacidi con configurazione D, il composto ha, invece, un sapore amaro.
Aspartame
Il metil estere del dipetide Asp-Phe
Ottenuto dagli L--amminoacidi aspartico e fenilalanina
NH
OOO
CH3
NH2
OH
O
Esempio di un dipeptide è l’aspartame, usato come dolcificante sintetico ipocalorico
Ossitocina e vasopressina sono dei nonapeptidi. La loro sequenza è molto simile, eccetto per la presenza di due residui ammino acidici. Questo è sufficiente a conferire ad essi una differente attività biologica.
La Ossitocina induce il travaglio e stimola il flusso di latte nelle partorienti.
La Vasopressina controlla la pressione del sangue regolando la contrazione muscolare.
Peptidi relativamente semplici possono avere importanti funzioni biologiche:
S
Cys
S
Cys
Tyr
Asn
Ile
Gln
Pro
Leu
H2NGly-
Ponte disolfuro
Ossitocina
S
Cys
S
Cys
Tyr
Asn
Phe
Gln
Pro
Arg
H2NGly-
Ponte disolfuro
Vasopressina
Esempi di oligopeptidi:
N
O
R R1
H
N
O
R H
R1
N+
O-
R H
R1
Il legame ammidico è un legame forte, ed è richiesta energia per la sua formazione. Il legame peptidico non si forma semplicemente mescolando in acqua due amminoacidi. Per formare il legame ammidico è necessario convertire il gruppo -OH della funzione carbossilica –COOH con un migliore gruppo uscente -Y.
10 Kcal/mole s-cis s-trans
OH
O
R
Y
O
R
Attivazione del gruppo carbossilico
O
ClR
+ N R1
H
H
O
NR
H
R1 + ClH
Energia libera di idrolisi del legame ammidico Gidrolisi = -3/-4 Kcal/mole Energia libera di idrolisi per un alogenuro acilico Gidrolisi = -7 Kcal/mole
Buon gruppo uscente
Attivazione via acil cloruro
OH
O
R
SOCl2Cl
O
R
Attivazione via sistema anidridico
X = Ossigeno, Azoto
Nei sistemi biologici l’attivazione passa tramite il
legame anidridico (e tioestereo)
ZXR R
O O
Strutture tipo anidridi sono strutture a alta energia e potenziali risorse di energia. Ogni composto con struttura anidridica possiede un Gidrolisi > -7.0 Kcal/mole
La riserva biologica di energia è l’ATP, che possiede la struttura anidridica nella catena del gruppo trifosfato
O
O
O
CH3 CH3
O
CH3 NN
O
OP
O
CH3 O-
OH
Anidride acetica Acetilimidazolo Acetilfosfato
N
N
N
N
NH2
O
OH OH
OP
OOH
O
O-
PO
O
O-
P
O
O-
I° II° Legami ad alto contenuto di energia
Adenosina-3’- Trifosfato ATP
(coenzima)
N
N
N
N
NH2
O
OH OH
OO
O
P
O
O-
ONH2
O-
L’acido benzoico (sostanza tossica) può essere reso innocuo dall’organismo trasformandolo in acido ippurico. Ciò avviene ad opera dell’ATP.
Detossificazione
Acido ippurico Specie non tossica
Glicina
N
N
N
N
NH2
O
OH OH
OP
OOH
O
O-
PO
O
O-
P
O
O-
O-
ON
N
N
N
NH2
O
OH OH
OO
O
P
O
O-
-PPi
NH
O
O-
O-AMP
Anidride mista
Nel secondo caso il legame ammidico coinvolge il carbossile della cisteina e il gruppo amminico
della fenilalanina.
Se per esempio se si ha a disposizione due ammino acidi come la fenilalanina e la cisteina abbiamo visto
che si possono formare dalla loro unione due dipeptidi: il dipeptide Fenilalanina-Cisteina o il dipeptide
Cisteina-Fenilalanina.
Nel primo caso il legame ammidico coinvolge il carbossile della fenilalanina e il gruppo amminico
della cisteina.
O
NH2 OH
SHH
O
NH2
OH
O
NH2
O
NHOH
SHH
+
O
NH2 OH
SHH
O
NH2 OH
H+
O
NH2
SHH
O
NHOH
H
Chi controlla la sequenza nella biosintesi?
La costruzione della sequenza peptidica inizia con l’attivazione del gruppo carbossilico del primo amminoacido da parte dell’ATP con formazione di un legame anidridico misto tra il carbossile dell’ammino acido e l’ATP.
Il secondo passaggio consiste nell’attacco della molecola templato (il polinucleotide tRNA) all’amminoacido attivato in maniera da rispettare la sequenza amminoacidica del polipetide o proteina. (Reazione catalizzata dall’enzima amminoacil-tRNA sintasi)
Ogni amminoacido ha il suo specifico tRNA e un suo enzima amminoacil-tRNA sintetasi
Terminata la sintesi dell’amminoacil-tRNA c’è il riconoscimento della porzione del tRNA
(anticodone) con il mRNA (codone).
• Il ribosoma è costituito da due subunità
– Maggiore
– Minore
• Ha la funzione di una stazione di lavoro dove vengono assemblati gli amminoacidi per ottenere la sequenza polipeptidica.
O
OH OH
OP
O
O-
Ad
NH3
+
R
O
O
+ AMP
L’enzima Amminoacil tRNA sintetasi catalizza i vari passaggi:
Amminoacil-tRNA
1. Attivazione dell’amminoacido con ATP
intermedio anidridico
2. Attacco all’ossidrile 3’ (o 2’) dell’acido adenilico terminale per dare l’amminoacil-tRNA.
O
OH OH
OP
OOH
O
O-
PO
O
O-
P
O
O-
Ad
NH3
+
R O
O-
Mg++
-PPi
tRNA
NH3
+
R
O
OO
OH OH
OP
O
O-
Ad
NH3
+
R
O
O
tRNAOH Ancoraggio via legame estereo
La sequenza amminoacidica inizia con N-terminale del primo amminoacido formilato: N-formilmetionil-tRNA. La formilazione impedisce al gruppo amminico del primo ammino acido di partecipare alle successive reazioni (Azoto amminico trasformato in azodo
ammidico molto meno nucleofilo). La formilazione protegge il gruppo amminico del I° ammino acido.
Terminata la sequenza amminoacidica l’enzima formilasi libera il gruppo amminico formilato.
O
O
NH
S
CH3
O
H
tRNA
Gruppo formilico Cambia il comportamento chimico di N
N-formilmetionil-tRNA
Agisce in un certo senso come la resina
L’intero processo avviene nei ribosomi e coinvolge due siti di legame, quello peptidico (P) dove cresce la catena peptidica, e quello amminoacidico (A) dove si avvicendano i vari ammino acidi legati al tRNA.
La reazione è catalizzata dall’enzima peptidil transferasi.
La corretta sequenza amminoacidica è regolata dal RNA messaggero mRNA
Ribosoma
Non tutti i polipeptidi sono sintetizzati tramite tRNA e mRNA nei ribosomi. Alcuni peptidi con basso numero di amminoacidi vengono sintetizzati tramite l’ausilio di
enzimi di grandi dimensioni multifunzionali: le sintetasi peptidiche (NRPS non ribosomial peptide synthetase). La sintesi di questi peptidi richiede solo l’ausilio
dell’ATP per attivare la funzione carbossilica degli amminoacidi.
NH
NH
O
O
O
O
OH
NH2
SH
OH
Glutatione: L-γ-glutamil-L-cisteinil-glicina
Esempio
Molti di questi peptidi non ribosomiali presentano strutture cicliche, in cui sono presenti ammino acidi modificati di tipo non proteico.
Ciclosporina A
Enniatina B
Isopenicillina N Gramicidina S
Sono enzimi di grandi dimensioni Sono prodotti da microorganismi come batteri e funghi Le NRPS presentano una struttura ripetitiva Il meccanismo prevede l’azione di gruppi tiolici -S-H (meccanismo tio-templato) Sequenze amminoacidiche del sito attivo mettono in evidenza la presenza di
cisteina e serina Si forma un legame tioestere tra l’amminoacido e l’enzima
La Gramicidina S è un ciclo-decapeptide bioattivo isolato dal batterio Bacillus brevis che mostra attività antibiotica (contro batteri gram positivi e negativi ed alcuni funghi).
La molecola è costituita da 2 identici pentapeptidi uniti testa-coda a formare un ciclo.
La funzione del ciclodecapeptide è quella di complessare ioni di metalli alcalini come Na+ e K+ e di trasportarli attraverso la membrana cellulare.
Crea un canale ionico nella membrana.
Ciclo [-Val-Orn-Leu-(D)-Phe-Pro]2 Bacillus brevis
Due molecole di Gramidina S si inseriscono nella membrana cellulare creando un canale, gli ioni Na+ e K+ diffondono attraverso la membrana alterando il rapporto
elettrolitico dei due ioni nella cellula, determinandone la morte.
:http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd
N
N
N
H
N
H
NH
NH
NH NH
NH
N
H
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
NH2
NH2
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
L-ornitina
L-ornitina
L-leucina
D-fenilalanina
L-valina
L-prolina
L-prolina D-fenilalanina
L-valina
L-valina
La struttura è costituita da 5 differenti amminoacidi ognuno usato due volte. Nella struttura sono presenti due amminoacidi inusuali nei peptidi: la L-ornitina e la D-fenilalanina.
Come viene sintetizzata la Gramicidina S?
Si forma tramite una sequenza attivazione-condensazione utilizzando l’ATP come fonte di energia e l’enzima Gramicidina Sintasi.
Amminoacido + ATP Amminoacido-AMP + P-Pi
La sintesi della Gramicidina S è quindi svolta completamente in assenza di tRNA e mRNA.
Tutte le informazioni per la sequenza peptidica (riconoscimento degli amminoacidi) sono contenute nei siti attivi dei due enzimi che catalizzano il processo.
La struttura primaria di una proteina è la semplice sequenza degli amminoacidi.
La struttura secondaria di una proteina descrive come segmenti dello scheletro peptidico si organizzano in uno schema regolare .
La struttura terziaria descrive la forma complessiva tridimensionale dell'intera spira della molecola proteica.
La struttura quaternaria descrive come differenti molecole di proteine si uniscono per produrre grandi strutture aggregate.
La struttura I è determinata degradando in maniera sequenziale la proteina.
Le strutture II, III e IV sono determinate tramite raggi-X o spettroscopia di risonanza magnetica nucleare ( NMR).
Aumento della complessità
La struttura primaria rappresenta semplicemente l’esatta sequenza degli
amminoacidi, vale a dire l’ordine con cui i monomeri amminoacidici si succedono
lungo la catena polimerica lineare della proteina.
La sequenza degli amminoacidi influenza successivamente le strutture superiori,
che sono regolate dalle interazioni deboli tra vari siti della catena.
Dr. Frederick Sanger, Premio Nobel per la Chimica
1958 e 1980 Sequenza peptidica
Le conformazioni tridimensionali di regioni localizzate di una proteina sono
determinano la sua struttura secondaria. Queste regioni nascono a causa dei
legami idrogeno tra il protone N-H di una ammide e l’ ossigeno del C = O di
un altro gruppo ammidico.
Due arrangiamenti sono particolarmente stabili l’-elica e il foglietto pigato
.
La -elica si forma quando una catena peptidica si attorciglia su se stessa in una spirale destrorsa (in senso orario).
3,6 aminoacidi costituiscono un giro di elica (passo elica 0,54 nm)
I legami N-H e C = O puntano lungo l'asse dell'elica. Tutti i legami C = O puntano in una direzione, mentre tutti i legami N-H puntano nella direzione opposta.
Il gruppo C=O di un amminoacido interagisce via legame idrogeno a un gruppo N—H del 4° amminoacido successivo lungo la catena. Così, il legame idrogeno avviene tra due amminoacidi nella stessa catena (distanza N-H····O di 2,8 Å).
I legami idrogeno sono quasi paralleli all’asse dell’elica.
I residui R degli amminoacidi si estendono verso l'esterno dal nucleo del -elica.
La Prolina, il cui atomo di azoto fa parte di un anello a cinque membri, è più rigida degli altri aminoacidi, e il suo legame C-N non può ruotare della quantità necessaria. Inoltre, non ha protoni N-H con cui formare un legame idrogeno intramolecolare per stabilizzare l'elica. Così, la prolina non può far parte di un -elica.
La struttura secondaria a fogli a pieghe si forma quando due o più di peptidi si dispongono uno accanto all'altro. Tutti i -sheet hanno le seguenti caratteristiche:
I legami C=O e N—H giacciono nel piano del foglietto.
Il legame idrogeno si instaura tra i gruppi N-H e C = O dei residui amminoacidici vicini. I gruppi R sono orientati sopra e sotto il piano del foglio, e si alternano da un lato all'altro lungo una direzione.
La disposizione a foglietto a pieghe si verifica più comunemente con aminoacidi con piccoli gruppi R, come alanina e glicina. Con gruppi R grandi, le interazioni steriche impediscono le catene di avvicinarsi insieme, e quindi la disposizione a foglio non può essere stabilizzata da legami idrogeno.
La forza e l’elasticità del filo della ragnatela di ragno sono dovute alla presenza nella catena proteica di regioni a foglietto ripiegato e a regioni di -elica. Le regioni ad -elica impartiscono l’elasticità, mentre le ragioni a foglietto ripiegato impartiscono la resistenza.
Differenti regioni della struttura secondaria della seta della ragnatela
La forma tridimensionale assunta dall’intera catena pepetidica è definita struttura terziaria.
Le proteine generalmente si ripiegano in una conformazione di massima stabilità.
Nell’ambiente acquoso cellulare, questo generalmente dispone la maggior parte delle catene laterali non polari all'interno della proteina, in cui le interazioni van der Waals fra questi gruppi idrofobi aiutano a stabilizzare la molecola. In questa disposizione, il maggior numero di gruppi polari e carichi rimangono sulla superficie per massimizzare le interazioni a legame idrogeno con l’acqua.
La presenza di gruppi polari, di legami idrogeno e di gruppi laterali carichi -COO¯ e –NH3
+ possono stabilizzare la struttura terziaria tramite interazioni elettrostatiche.
La struttura quaternaria si origina quando due o più catene polipeptidiche si aggregano tra loro tramite interazioni intermolecolari per dare origine ad un un
complesso proteico (sistema supramolecolare).
• Ogni catena polipeptidica individuale è detta subunità della proteina totale.
• Un esempio è l’emoglobina che consiste di 2 subunità e 2 subunità tenute insieme da forse intermolecolari in una forma compatta tridimensionale.
• La funzione dell’emoglobina è possibile solo quando le 4 subunità sono legate insieme.
Rubisco Emoglobina
Le proteine sono generalmente classificate in base alla loro struttura tridimensionale
Le proteine globulari sono arrotolate in forme compatte con superfici esterne idrofile
che le rendono idrosolubile. Enzimi e molecole di trasporto sono globulari per renderli
solubili nel sangue e in altri ambienti acquosi.
Le proteine fibrose sono costituite da catene di polipeptidi lineari lunghe che sono intrecciate insieme per formare fasci. Queste proteine sono insolubili in acqua e svolgono ruoli strutturali, dando forza e protezione ai tessuti e cellule.
Le -Cheratine sono le proteine che si trovano nei capelli, zoccoli, unghie, pelle e lana.
Sono composte quasi esclusivamente di lunghi tratti di unità di -elica.
Sono molto insolubili in acqua.
Le -Cheratine hanno anche un certo numero di residui di cisteina, e quindi possono formare legami disolfuro tra le eliche adiacenti. Il numero di ponti disolfuro determina la resistenza del materiale.
Due eliche di -cheratina si attorcigliano a vicenda, formando una struttura chiamata
superelica. Questa a loro volta forma fasci sempre più grandi di fibre, in ultima analisi,
la formazione di una ciocca di capelli.
La manipolazione dei legami disolfuro della -cheratina nei capelli può trasformare i capelli da ricci in capelli lisci.
La Chimica della permanente
Per fare i capelli ricci bisogna prima rompere i ponti disolfuro intercatena trasformandoli in gruppi tiolici (–SH) per riduzione. I gruppi tiolici S-H poi possono essere riossidati rigenerando ponti disolfuro (S-S) intracatena e i capelli diventano ricci.
Capelli lisci Capelli ricci
L’ossidazione ricrea i ponti S-S Riduzione dei ponti disolfuro
Il collagene è la proteina più abbondante nei
vertebrati, si trova nei tessuti connettivi come
osso, cartilagine, tendini, valvole cardiache,
denti, pelle e vasi sanguigni.
Gli amminoacidi L-glicina e L-prolina sono
presenti in una grande frazione di residui
aminoacidici, mentre la cisteina è poco presente.
A causa dell'elevato contenuto di prolina, non si
può formare una -elica destrorsa. Invece, si
forma un elica allungata sinistrorsa, tre di queste
eliche si avvolgono l’una con l’altra per formare
un superelica destrorsa (o tripla elica).
Fibre di collagene
Emoglobina e mioglobina sono proteine globulari.
Esse sono chiamate proteine coniugate perché sono composte di una unità proteine e una molecola non proteica chiamata un gruppo prostetico.
Il gruppo prostetico di queste due proteine è l’eme, un composto di coordinazione organico contenente lo ione Fe2+ complessato da atomi di azoto di un composto eterociclico detto protoporfirina IX.
Lo ione Fe2+ delle due proteine lega l’ossigeno nel sangue.
La Mioglobina stocca O2 nei tessuti, mentre l’Emoglobina lo trasporta dove esso necessita.
mioglobina emoglobina
eme
Le strutture III e IV sono dovute alle interazioni intramolecolari e intermolecolari
– Variazioni di temperatura, di pH, stress meccanico o la presenza di additivi (es. urea) sono spesso sufficienti per distruggerle e causare la denaturazione della proteina.
• La denaturazione generalmente avviene sotto condizioni miti tali da non distruggere generalmente la struttura primaria.
Denaturazione
• É accompagnata da cambi sia nelle proprietà fisiche che biologiche.
– La solubilità della proteina cambia drasticamente
• Molti enzimi perdono tutta l’attività catalitica
• Molte denaturazioni sono irreversibili
– In alcuni casi si verifica re-naturazione spontanea di una proteina spiegata alla sua struttura terziaria stabile ed è accompagnata da un recupero completo delle funzioni biologiche.
Proteina attiva Proteina attiva Proteina inattiva
Riattivazione
Denaturazione mite
C O O -
N H 3 +
C O O H
N H
C O O -
N H 3 +
C O O
N H 2
Protezione NH2
Protezione COOH
Condensazione
N H C
O
H N C O O
C O O H 2 N C
O
H N N H C
O
H N C O O H
COOH Deprotezione NH2-Deprotezione
I due amminoacidi sono protetti in funzione della sequenza ammino acidica voluta; quindi sono fatti reagire in presenza di un agente di condensazione.
A secondo del gruppo deprotetto, la sequenza sintetica può continuare con il gruppo amminico o con quello carbossilico.
O
NH2
CH3NH
O
OHH
Ala-Gly
O
NH2
CH3
H
OH NH2
O
OH+
1. Potezione –NH2 Alanina
O
NH3+
CH3
H
O-
O
NH
CH3
H
O-
PG
Gruppi da proteggere
2. Potezione –COOH Glicina
NH3+
O
OPGNH3
+
O
O-
Esempio
3. Formazione legame ammidico
O
NH
CH3
H
O-
PG
NH3+
O
OPG
DCC +
O
NH
CH3NH
O
OH
PG
PG
4. Rimozione gruppi protettivi
O
NH
CH3NH
O
OH
PG
PG
O
NH3+
CH3NH
O
O-
H
DCC = C NN
La sintesi in soluzione del legame peptidico va bene se usata per
costruire piccoli peptidi. Il metodo è molto laborioso ed è
impraticabile per la sintesi di grandi peptidi o proteine.
Per sintetizzare grandi peptidi è molto più vantaggioso ed utile
utilizzare il metodo della sintesi in fase solida. Solid Phase Peptide
Synthesis (SPPS).
La tecnica consiste nell’ancorare un ammino acido ad un polimero
insolubile e realizzare la sequenza primaria aggiungendo un ammino
acido alla volta. Poiché le impurità ed i reagenti sono solubili nei
solventi, al contrario del polimero, le fasi di purificazione sono molto
rapide ed efficienti. Alla fine la catena polipeptidica viene stacca dal
polimero.
Uno dei più comuni supporti solidi nella SPPS è un derivato del polistirene che contiene gruppi clorometile (–CH2Cl), legati ad alcuni gruppi fenile del polimero (circa il 30%). La resina presenta quindi dei gruppi clorobenzilici molto reattivi, adatti ad ancorare covalentemente gruppi che possono agire da nucleofili.
Nu:
Viene clorometilato circa il 30% del polistirene
Ph
Ph
HCl
H2CO
Ph
Ph
CH2Cl
Polistirene
Gruppo clorometile
La clorometilazione viene oggi fatta trattando il polimero con il clorometiletere (ClCH2OCH3) e SnCl4 come acido di Lewis.
Alla resina è ancorato il primo amminoacido. Il gruppo che dovrà formare in seguito il legame ammidico, è mascherato tramite protezione.
Ancoraggio via COOH
Ph
Ph
CH2ClH
NH
R
HOOC Boc
Ph
Ph
CH2OOC
H
R
NH Boc
Ancoraggio via NH2
Ph
Ph
CH2ClH
NH2
R
PhCH2OOC
Ph
Ph
CH2NH
H
R
COOCH2Ph
+ HOOC
H
R
NH
Attacco del C terminale alla resinaCH2Cl
CH2 OOC
R
NH
R Purificazione mediante filtrazione e lavaggio
CF3COOH
CH2Cl2Reazione di deprotezione del gruppo es. Boc
CH2 OOC
R
NH2
R Purificazione mediante filtrazione e lavaggio
R1
H
COOH
NHDCC Reazione per attaccare il secondo amminoacido
con l'ammino gruppo protetto
CH2 OOC
R
NH
R
C
O R1
NH
H
+ Dicicloesilurea
Purificazione mediante filtrazione e lavaggio
Reazione di deprotezione del gruppo es. BocCF3COOH
CH2Cl2
CH2 OOC
R
NH
R
C
O R1
NH2
HRipetizione dei vari passaggi
Schema sequenza sintetica
Bruce Merrifield
Premio Nobel per la Chimica nel 1984
Nel 1962 sintetizzò un nonapeptide (bradykinin) in 8 giorni con una resa totale del 68 %.
Nel 1969 sintetizzò una ribonucleasi (124 ammino acidi), 369 reazioni e 11.391 passaggi.
Con l’automatizzazione della sua sintesi in fase solida egli sintetizzò diversi polipeptidi.
Un robot, gestito da un computer, esegue i vari passaggi ripetitivi di accoppiamento, lavaggio, protezione, deprotezione ed infine distacco della catena dalla resina.
Ogni passaggio avviene con alte rese.
Utilizzando questa procedura è possibile preparare circa 50 mg di polipeptide (20-30 amminoacidi) in maniera standard.
Oggi il Metodo di Merrifield è completamente automizzato
dddmag.com
Effetto della resa dei singoli passaggi sulla resa complessiva
Numero residui Ammino acidici
Resa complessiva (%) del peptide
96,0 (%) 99,8 (%)
11 66 98
21 44 96
31 29 94
51 13 90
100 1,7 82
Visto l’alto numero di passaggi, è fondamentale avere rese quasi quantitative nei vari step,
altrimenti la resa finale diventa veramente bassa.
Nei sistemi biologici la maggior parte delle trasformazioni chimiche cellulari sono catalizzate da macromolecole dette enzimi, per la maggior parte sono di natura proteica, ma esistono anche enzimi appartenenti agli acidi nucleici.
Molto spesso gli enzimi vengono prodotti dalla cellula come precursori inattivi o “zimogeni”, che vengono poi attivati nella sede in cui agiscono mediante tagli proteolitici. Un esempio di questo tipo di attivazione è rappresentato dalle proteasi pancreatiche, prodotte dal pancreas come zimogeni e riversate nell’intestino tenue dove assumono la forma cataliticamente attiva.
In base alla loro localizzazione nella cellula gli enzimi si possono classificare in:
idrosolubili e non solubili
l’α-chimotripsina, è un esempio di enzima idrosolubile, mentre la lipasi pancreatica è un esempio di enzima che agisce all’interfaccia in mezzi microeterogenei come sono le emulsioni.
Le caratteristiche che rendono gli enzimi dei catalizzatori importanti sono:
Elevatissimo incremento di velocità- la velocità di reazione catalizzata da un enzima risulta da 6 a 12 ordini di grandezza superiore rispetto alla velocità della stessa reazione non catalizzata;
Condizioni di reazione blande- le reazioni catalizzate da un enzima avvengono in condizioni piuttosto moderate, come bassa temperatura, pressione atmosferica e pH neutro, al contrario di reazioni chimiche che molto spesso richiedono condizioni estreme di pH, temperatura e pressione;
Elevata specificità della reazione: gli enzimi sono altamente specifici sia per il substrato che per il prodotto, per cui difficilmente si ottengono sottoprodotti, mentre la resa di prodotto si avvicina al 100%, al contrario delle reazioni comuni che molto spesso producono sottoprodotti indesiderati;
Capacità di regolazione: l’attività enzimatica è rigidamente regolata mediante una serie di meccanismi che vanno dagli effetti allosterici alla modificazione covalente, al controllo della quantità di prodotto sintetizzato.
Ad esempio, le glicosidasi, che idrolizzano i polisaccaridi, aumentano la velocità di reazione di un fattore più di 1017, modificando il tempo di reazione richiesto per
l’idrolisi da milioni di anni a pochi millisecondi.
PM 480.000
(NH2)2CO + H2O → CO2 + NH3
Reazione catalizzata
Enzima Substrato
PM 60
Esempio di bio-polimero con funzione catalitica (Enzima)
Macromolecola Piccola molecola
Perché gli enzimi hanno una struttura polimerica?
10 35 64 88 132
L’efficienza catalitica di un enzima è legata alla sua azione multicatalitica, ciò è all’azione contemporanea di più siti catalitici, che possono agire intramolecolarmente.
1. Una catena polimerica permette di avere numerosi siti catalitici, la flessibilità della catena, inoltre, permette un arrangiamento dei siti catalitici in maniera di ottenere il massimo effetto di prossimità.
10
132
35
64
88
Siti reattivi
2. Una catena polimerica permette di fornire una maggiore stabilità al complesso Enzima-Substrato tramite interazioni deboli non covalenti.
3. Solo una lunga catena polimerica, una volta che si ripiega tridimensionalmente, è in grado di fornire una complementarità stereochimica in grado di riconoscere la struttura del substrato.
4. Solo una lunga catena polimerica, una volta che si ripiega tridimensionalmente, è in grado di fornire un proprio microambiente di reazione.
enzima su
bst
rato
Ulteriori ragioni perché gli enzimi devono essere delle macromolecole
Associazioni multiple (cofattori, coenzimi, 2 substrati, ecc.)
Funzioni multiple
Associazione ad altri biolpolimeri
Viscosità
Proprietà idrodinamiche
Etc.
Solo una catena polimerica comporta:
la formazione di un elevato livello di complessità che determina proprietà che non sono presenti nei
componenti di base
Sono altamente specifici nella loro azione
Spesso, un enzima catalizza solo una singola reazione di un singolo substrato.
Il grado di specificità di un enzima è sempre molto grande e in alcuni casi totale. In natura esistono numero moltissimi enzimi e la ragione di ciò è da ricercare proprio in questa loro caratteristica che generalmente non permette l’uso dello stesso enzima per più reazioni diverse.
La specificità di un enzima si manifesta in vari modi: esiste prima di tutto una specificità stereochimica a cui si uniformano tutti gli enzimi, quindi
Esiste una specificità di legame
Esiste una specificità di gruppo
Esiste una specificità di substrato
Specificità di ‘legame’ l’enzima riconosce solo il legame su cui deve agire, indipendentemente dal contesto molecolare. Specificità di “gruppo” l’enzima è in grado di riconoscere sia il legame che il gruppi adiacenti. Specificità definita “assoluta” l’enzima riconosce e agisce soltanto su un particolare tipo di substrato.
Differenti enzimi hanno differenti specificità
• Alcuni agiscono specificatamente su un singolo substrato.
– L’amilasi, per esempio, catalizza solamente l’idrolisi dell’amido per dare glucosio.
• Altri enzimi, invece, sono in grado di operare su un “range” di substrati.
– La papaina, enzima proteolitico, è proteina globulare costituita da 212 ammino acidi (dal frutto della papaia) catalizza l’idrolisi di molti tipi di legami peptidici.
Il motivo della specificità risiede soprattutto nella struttura tridimensionale dell’enzima, in particolare
nella struttura terziaria che ha un notevole effetto sulle distanze tra i vari residui amminoacidici.
Amminoacidi lontani tra loro nella struttura primaria possono essere avvicinati nella struttura terziaria
mediante un ripiegamento che porta ad una determinata conformazione; tale ripiegamento è reso
possibile da interazioni deboli come legami idrogeno, ponti disolfuro, forze di van der Waals, interazioni
idrofobiche ed interazioni elettrostatiche.
Papaina
La demolizione dell'amido in frammenti più piccoli ha inizio nella bocca ad opera di una sostanza presente nella saliva: l'amilasi salivare o ptialina. L’amilasi è un enzima che catalizza la reazione di rottura del legame glucosidico 1-4 (idrolisi legame acetalico) nei carboidrati complessi come l’amido, formando maltosio. L’amilasi è presente nella saliva e nel succo pancreatico.
-amilasi salivare umana Ca++, Cl-
Amido
Amilasi
Maltosio
Amilasi
Glucosio
L’azione catalitica dell’enzima.
L’abilità dell’enzima è quella di stabilizzare, e cosi abbassare l’energia dello stato di transizione (ST) o degli stati di transizione coinvolti nella reazione.
Il sito attivo dell’enzima è complementare allo stato di transizione della reazione che viene catalizzata.
L’enzima interagisce (si associa o si lega) allo stato di transizione con costanti di associazione che sono fino a 1012 volte più alte rispetto alle costanti di associazione del substrato o del prodotto della reazione.
L’azione enzimatica si sviluppa attraverso un percorso che coinvolge inizialmente la formazione di un complesso enzima substrato E-S, successiva conversione chimica multi-step del substrato legato all’enzima nel complesso enzima prodotto E-P, ed in fine il rilascio del prodotto dal complesso.
Turnover number
• Rappresenta il numero di molecole di substrato che l’enzima converte nell’unità di tempo in prodotto. Generalmente si hanno valori di 103 al secondo.
Tutte le reazioni chimiche che avvengono negli organismi viventi sono catalizzate dagli enzimi. La catalisi procede attraverso la formazione di complessi tra l'enzima e i reagenti. La più semplice reazione catalizzata da un enzima può essere così rappresenta da:
E + S E-S E-P E + P
Meccanismo della catalisi enzimatica
Chiave-serratura
Adattamento indotto
Molti enzimi, come già abbiamo accennato in precedenza, contengono (o hanno bisogno) di cofattori per espletare la loro attività catalitica.
Cofattore Può essere anche una specie inorganica, come per esempio lo ione Zn2+ Possono essere molecole organiche di piccole dimensioni detti coenzimi
Coenzima Una specie chimica che subisce una trasformazione durante la reazione catalizzata
dall’enzima ed ha bisogno di essere rigenerato tramite un passaggio aggiuntivo. Molti coenzimi derivano da strutture di vitamine .
– Esempi sono:
Coenzima A dal pantotenato (vitamina B3),
NAD+ dalla niacina
FAD dalla riboflavina (vitamina B2)
Tetraidrofolato dall’acido folico
Piridossale fosfato dalla piridossina (vitamina B6)
Tiamina difosfato dalla tiamina (vitamina B1)
Molti coenzimi derivano la loro struttura da quella delle vitamine, sostanze che vengono introdotte con i cibi in quanto non sono sintetizzate dall’organismo. Alcuni esempi sono:
SS
O
OH
H
Acido lipoico
Trasferimento gruppi acilici
Piridossale fosfato Metabolismo amminoacidi
dalla Vitamina B6
N+
OHH
CH3
COHO
-
O-
O
O
P
Adenosina trifosfato (ATP) Fosforilazione
ON
OHOH
N
N
N
NH2
PO
O-
O
P
O-
O
OP
O-
O
O-
N
N
O
N
O
N
O
OH
NH2
PO
-
O
O-
PO
O
O-
PO
O
O-
NH NH
CH3CH3
OH
OO
SH
Coenzima A Trasferimento gruppi acilici
dalla Vitamina B3 CoASH
O
CH3 SCoA
Sito elettrofilo, trasferimento
del gruppo acile
H acidi, sito nucleofilo per reazioni di condensazionie
(reazione di Claisen)
Poiché tutte le trasformazioni chimiche coinvolte nei processi biologici, avvengono in un ambiente acquoso sono necessari speciali attivatori detti coenzimi, che facilitano l’azione enzimatica. Variazioni strutturali di queste molecole portano a drastiche variazione dell’attività biologica.
Coenzima A (un Tiol-coenzima)
HS-CoA + CH3COO-
Gruppo tioestere
L’α-chimotripsina è un enzima globulare di massa 24800 dalton, costituita da 291 residui amminoacidici che costituiscono tre catene polipeptidiche unite da due ponti disolfuro intercatena; la struttura tridimensionale ha la forma di un ellissoide compatto di dimensioni 51 X 40 X 40 Å, paragonabile ad una sfera di raggio 22 Å. L’enzima presenta molte regioni con struttura β antiparallela e poche regioni ad α elica; tutti i gruppi carichi sono sulla superficie della molecola (residui lisinici).
L’α-chimotripsina è un enzima digestivo dei mammiferi appartenente alla classe delle serino-proteasi (come la tripsina, la trombina e l’elastasi). viene secreta dal pancreas come zimogeno e riversata nell’intestino tenue dove subisce un taglio proteolitico ad opera della tripsina, assumendo così la conformazione cataliticamente attiva per l’idrolisi delle proteine alimentari. È specifica per la scissione di legami peptidici sul lato carbonilico di amminoacidi con catene laterali aromatiche come tirosina, triptofano, fenilalanina; riconosce e taglia anche legami esterei, purchè venga mantenuta la specificità di gruppo.
Il sito catalitico si trova in una tasca idrofobica che esclude il solvente, per cui il gruppo ossidrilico del residuo Serina 195 che si trova all’interno è altamente reattivo e consente la formazione di un legame covalente con il substrato; il potere nucleofilo dell’ossigeno ossidrilico è inoltre esaltato da un meccanismo a rilascio di carica ad opera dei residui Istidina 57 e Aspartato 102 che insieme alla Serina 195 costituiscono la triade catalitica.
Studi condotti sull’idrolisi del legame estereo del p-nitrofenilacetato hanno dimostrato che la reazione avviene in due passaggi
Nel sito attivo sono presenti tre amminoacidi (triade catalitica) responsabili dell’attività catalitica:
O
NH3
+
OH
O-
Serina-195
O
NH3
+
N
H
N
O-
Istidina-57
O
ONH3
+
OH
O-
Acido aspartico-102
La - chimotripsina presenta una alta specificità per legami ammidici in cui sono coinvolti amminoacidi di tipo aromatico (selettività di substrato).
NH3
+
COO-
H
CH2
NH3
+
COO-
H
CH2
OH
NH3
+
COO-
H
CH2
N
Fenilalanina Tirosina Triptofano
Schema generale del processo idrolitico:
O
║
Enz-OH + R-C-X [Enz-OH · R-CO-X]
O-
│
Enz-O-C-X
│
R
-HX
O
║
Enz-O-C-R
Complesso di Michaelis
H2O
O-
│
Enz-O-C-R
│
OH
O
║
Enz-OH + R-C-OH
Acil-enzima
R = Fenilalanina, Triptofano, Tirosina X = OR’, NHR’
Catalisi covalente
Catalisi basica generale?
Charge-relay system
H O
Serina-195
Istidina-57
N NH
H O
Serina-195Serina-195
Istidina-57
N NH
O
R
X
O-
O
Aspartico-102
Ia Ipotesi
IIa Ipotesi (sulla base di dati cristallografici)
Allineamento dei tre amminoacidi Triade catalitica
Intermedio tetraedrico carico (-)
Charge-relay system
Stabilizzazione dell’intermedio tetraedrico carico (-) tramite formazione di legami ad idrogeno
pKa His-57 > pKa Asp-102
H O
Serina-195Serina-195
Istidina-57
N NH
O
R1NHR2
O-
O
Aspartico-102
O-
R1NHR2
O
Serina-195
Istidina-57
N N+H HO
-
O
Aspartico-102
Intervento del legame ad H con l’azoto ammidico
