221

Pengembangan Antibodi Poliklonal dari Stadium Oosista,Sporosista, dan Sporozoit Eimeria tenella

(THE DEVELOPMENT OF POLYCLONAL ANTOBODYFROM EIMERIA TENELLA OOCYST, SPOROCYST, AND SPOROZOITE STADIUM)

Galuh Tresnani1), Joko Prastowo2), Wisnu Nurcahyo3), Budi Setiadi Daryono4)

1)Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas MataramJl. Majapahit No. 62 Mataram, Nusa Tenggara Barat

Telp (0370) 646506, email : galuht@yahoo.com2),3)Bagian Parasitologi, Fakultas Kedokteran Hewan,

4)Lab Genetika, Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta

ABSTRAK

Penelitian untuk mengembangkan teknik diagnosis, vaksin, maupun obat-obatan untuk mengatasikoksidiosis banyak difokuskan pada pencarian senyawa imunogenik yang terdapat pada Eimeria.Identifikasi senyawa imunogenik ini membutuhkan antibodi yang mampu mengenali biomolekul dalamsuatu antigen. Dalam pengembangannya, antibodi yang dihasilkan harus dianalisis terlebih dahulu, dansalah satu jenis analisis yang banyak digunakan adalah dot blot. Penelitian ini bertujuan untukmenganalisa hasil pengembangan antibodi poliklonal E. tenella dari stadium oosista, sporosista, dansporozoit dengan menggunakan metode analisa dot blot. Antigen yang dibutuhkan dibuat dari masing-masing stadium E. tenella dengan menggunakan teknik sonikasi. Lima belas ekor mencit dibagi dalamtiga kelompok dan diinjeksi secara subkutan dengan antigen oosista, sporosista, dan sporozoit. Serumdari masing-masing mencit dikoleksi, diukur titernya dengan ELISA, dan selanjutnya digunakan dalamanalisis dot blot. Hasil analisis dot blot menunjukkan bahwa antibodi poliklonal yang dikembangkanpada mencit mampu bereaksi terhadap antigen dari tiga stadium perkembangan E. tenella. Berdasarkanhal ini dapat disimpulkan bahwa antibodi poliklonal yang dikembangkan pada mencit telah berhasil dandapat digunakan untuk penelitian imunoproteomik lainnya.

Kata-kata kunci : analisa dot blot, antibodi poliklonal, E. tenella

ABSTRACT

The research on developing diagnostic method, vaccine, and drugs for coccidiosis has been focused onthe finding of the immunogenic molecule in Eimeria. The identification of this agent will need the antibodywhich can recognize the biomolecule in the antigen. Antibody that has been developed for this purposeshould be analyzed first, and one of the simple methods for analyzing this antibody is through dot blotanalysis. The objective of this research was to analyze the polyclonal antibody which developed from theoocyst, sporocyst, and sporozoite of E. tenella using dot blot analysis. The antigen for this polyclonalantibody was made from each of the E. tenella stadium by sonication. Fifteen mice, divided into 3 groups,were then injected subcutaneously with each antigen. The sera from these mice were then collected, analyzedby using ELISA and then it will be used for the dot blot analysis. The research result showed that thepolyclonal antibody which has been developed in mice from each antigen can react with the antigen itself.From this result it can be concluded that the developing of this antibody is successful and it can be used forfurther research in immunoproteomic.

Jurnal Veteriner Juni 2013 Vol. 14 No. 2: 221-227ISSN : 1411 - 8327

222

Keywords : analisa dot blot, antibodi poliklonal, E.Tenella

PENDAHULUAN

Dalam industri ternak unggas, koksidiosismerupakan salah satu penyakit yangmenimbulkan kerugian ekonomi yang cukupbesar (Williams 1998; Shirley et al., 2005).Penyakit ini disebabkan oleh infeksi protozoaEimeria, dan salah satu jenis yang cukuppatogen adalah Eimeria tenella (Fernando,1990).

Penelitian untuk mengembangkan teknikdiagnosis, vaksin, maupun obat untukkoksidiosis telah banyak dilakukan baik didalam maupun luar negeri. Penelitian saat inibanyak difokuskan pada upaya pencariansenyawa imunogenik yang dapat digunakanuntuk mengembangkan vaksin dan alatdiagnostik Eimeria . Dalam prosesnya,penelitian seperti ini membutuhkan sejumlahantibodi poliklonal yang mampu mengenalisenyawa imunogenik yang berasal dari berbagaistadium Eimeria. Penggunaan analisisimunoproteomik, analisis yang melibatkanreaksi ikatan antara antigen dan antibodi,merupakan salah satu langkah yang dapatdigunakan untuk mengidentifikasi molekulimunogenik dan faktor patogenisitas yangterdapat pada E. tenella (Liu et al., 2009).

Identifikasi siklus hidup parasit danperkembangan antigen spesifik pemicu sistemimun merupakan langkah penting dalampengembangan vaksin Eimeria (Min et al.,2004). E. tenella memiliki siklus hidup yangkompleks, mencakup beberapa stadiumperkembangan yang berbeda-beda.Pengembangan antibodi poliklonal daribeberapa stadium E. tenella diharapkan dapatdigunakan untuk memeriksa keberadaansenyawa imunogenik yang terkandung dalamE. tenella. Senyawa ini selanjutnya dapatdikembangkan untuk memutus siklus hidup E.tenella sehingga penyakit koksidiosis dapatdikendalikan. Antigen permukaan yangimunogenik atau produk sekresi yang mampumenimbulkan gejala patologi merupakanadaptasi protozoa parasitik terhadap kekebalantubuh inangnya. Identifikasi senyawa-senyawatersebut dapat digunakan untuk mengembang-kan vaksin maupun obat-obatan yang akanmembasmi protozoa parasitik (Jenkins, 2001).

Antibodi poliklonal E. tenella dapat

dikembangkan pada ayam maupun hewan yangmemiliki jenis yang berbeda, seperti mencit,tikus ataupun kelinci. Antibodi poliklonal yangdihasilkan sebaiknya diuji terlebih dahulureaksinya terhadap antigen E. tenella yangdigunakan untuk mengembangkan antiboditersebut. Salah satu metode yang dapatdigunakan untuk memeriksa reaksi antaraantigen dengan antibodi adalah analisis dot blot.Dot blot atau slot blot adalah suatu teknik yangdigunakan untuk mendeteksi biomolekul dalamsuatu zat (baik antigen maupun antibodi) denganmenggunakan suatu membran yang ditetesiantigen ataupun antibodi.

Penelitian ini bertujuan untuk menga-nalisis hasil pengembangan antibodi poliklonalE. tenella dari stadium oosista, sporosista, dansporozoit dengan menggunakan metode analisisdot blot. Hasil analisis ini diharapkan dapatmemberi gambaran reaksi antibodi yangdikembangkan dengan antigen yang berasaldari E. tenella.

METODE PENELITIAN

Koleksi Sampel ParasitPerbanyakan parasit E. tenella dilakukan

dengan menginfeksi 50 ekor ayam pedaging usiadua minggu. Masing-masing ayam diinfeksi10.000 oosista. Oosista dikoleksi setelah tujuhhari masa inkubasi (Smith dan Ruff, 1975).Oosista yang baru diperoleh merupakan oosistayang belum bersporulasi. Oosista ini kemudiandisporulasikan dengan menggunakan medium2,5% kalium bikromat dan diinkubasikanselama tiga hari (Shirley, 1995). Suspensi oosistayang sudah bersporulasi kemudian diberitambahan glass beads dan divortex selama 10sampai 15 menit untuk menghancurkan dindingoosista dan melepaskan sporosista. Untukmendapatkan sporozoit, sebagian sampelsporosista diinkubasikan dalam mediumeksistasi (2,5% sodium taurokolat dan 0,15%tripsin) pada suhu 41ºC selama 6 jam. Semuasampel yang diperoleh kemudian disimpandalam medium PBS pH 7,2 pada suhu -20ºC.

Pembuatan AntigenPembuatan atau pengembangan antigen

dari tiga stadium perkembangan E. tenella(oosista, sporosista, dan sporozoit) dilakukandengan mengacu pada metode yang disampaikanoleh Guzman et al., (2003). Masing-masingstadium E. tenella yang telah disuspensikan

Tresnani et al Jurnal Veteriner

223

dalam PBS pH 7,2 dibeku-cairkan beberapa kali.Selanjutnya suspensi ini disonikasi selama 30detik dengan jeda 5 detik sebanyak 10 kali.Suspensi disentrifus pada kecepatan 12.000 gselama 15 menit, kemudian supernatan yangterbentuk dikoleksi dan disimpan pada -20ºC.

Pengembangan AntiseraSebanyak 15 ekor mencit (Mus musculus)

usia satu bulan dibagi dalam tiga kelompoksesuai dengan tiga stadium perkembangan E.tenella. Kelompok I diinjeksi dengan antigenoosista, kelompok II dengan antigen sporosista,dan kelompok III dengan antigen sporozoit.Mencit diinjeksi secara subkutan dengancomplete Freund’s adjuvant dan antigen dengankonsentrasi antigen antara 5 sampai 10 μg perekor mencit. Dua minggu setelah injeksipertama, mencit diinjeksi untuk yang keduakalinya dengan campuran antigen danincomplete Freund’s adjuvant. Dua minggusetelah injeksi kedua, mencit diinjeksi lagidengan antigen yang sama untuk ketigakalinya. Satu sampai dua minggu setelah injeksiketiga, antisera dari masing-masing kelompokmencit dikoleksi (Tomley, 1994; Wallach et al.,1995; Hafeez et al., 2007).

ELISAAnalisis ELISA dilakukan terhadap serum

berisi antibodi poliklonal yang diperoleh darimencit. Analisis ELISA mengikuti prosedur dariConstantinoiu et al., (2007). Lempeng mikrotiterdiberi lapisan antigen dengan konsentrasi 5 μg/ml dan diinkubasi selama satu malam padasuhu 37ºC. Lempeng mikrotiter kemudian dicucitiga kali dengan washing buffer dan diberiblocking buffer yang kemudian diinkubasiselama satu jam pada suhu 37ºC. Lempengselanjutnya dicuci lagi tiga kali dan diberi serum(antibodi poliklonal) yang akan dianalisistiternya, dan diinkubasi lagi selama satu jampada suhu 37ºC. Lempeng mikrotiter dicuci lagitiga kali lalu diinkubasikan dengan anti-mouseIgG 1:3000 selama satu jam pada suhu 37ºC.Lempeng dicuci kembali tiga kali dan diberisubstrat (nitrophenyl phosphate) lalu titerantibodi dibaca dengan menggunakan ELISAreader pada panjang gelombang 405 nm.

Analisis Dot BlotMembran nitroselulosa dipersiapkan dan

diberi tanda untuk masing-masing reaksi dotblot. Masing-masing antigen dari tiap-tiapstadium E. tenella diteteskan di permukaan

membran nitroselulosa sebanyak 2 μL, lalumembran dibiarkan mengering beberapa saatdan kemudian membran direndam dalamlarutan blocking buffer (5% bovine serumalbumin dalam tris-buffered saline tween 20)selama satu jam. Selanjutnya, membrandiinkubasi selama 30 menit dengan antibodipoliklonal yang dikembangkan dari masing-masing stadium E. tenella. Membran kemudiandicuci tiga kali masing-masing selama limamenit dengan menggunakan tris-buffered saline(TBS) Tween 20. Setelah itu membrandiinkubasi dengan konjugat (anti-mouse IgG)selama 30 menit. Membran yang telah dicucidengan tris-buffered saline Tween 20 kemudiandiberi substrat nitro blue tetrazolium (NBT) dandiamati.

HASIL DAN PEMBAHASAN

ELISAPada penelitian ini digunakan tiga stadium

perkembangan dari E. tenella yaitu stadiumoosista, sporosista, dan sporozoit. Ketiga stadiumini yang selanjutnya akan digunakan dalampengembangan antibodi poliklonal, analisisELISA dan analisis dot blot. Gambaran masing-masing stadium perkembangan E. tenella yangdigunakan dalam pengembangan antibodipoliklonal disajikan pada Gambar 1.

Stadium sporozoit merupakan stadiuminfektif dari E. tenella. Stadium ini berupaorganisme protozoa satu sel yang mampumenginvasi sel epitel saluran pencernaan ayam.Stadium ini memiliki dua generasi selamaperkembangannya di dalam usus ayam.Generasi pertama akan menginvasi sel epitelusus lalu berkembangbiak menghasilkangenerasi kedua. Generasi kedua merupakangenerasi yang memicu sistem kekebalan tubuhinang, mengakibatkan perdarahan danrusaknya sejumlah jaringan epitel. Perusakanini terjadi umumnya lima hari setelah infeksioosista pada tubuh inang (Long, 1982). Stadiumsporozoit juga dikenal sebagai stadiumperkembangan aseksual pada Eimeria. Stadiumini merupakan stadium yang memilikiimunogenisitas paling tinggi bila dibandingkandengan stadium seksualnya. Penelitian yangberkaitan dengan respons kekebalan tubuhayam terhadap Eimeria, umumnya difokuskanpada stadium sporozoit (Rose, 1987; Lillehoj,2005).

Hasil pembacaan ELISA Reader pada

Jurnal Veteriner Juni 2013 Vol. 14 No. 2: 221-227

224

panjang gelombang 405 nm menunjukkan nilaiabsorbansi titer antibodi yang bervariasi. Nilaiyang cukup tinggi diperoleh pada pengenceran10x sampai dengan 40x. Untuk antibodipoliklonal yang dikembangkan dari stadiumoosista, nilai absorbansinya berada di antara0,631–1,579. Antibodi yang dikembangkan darisporosista memiliki nilai absorbansi antara0,754–1,895, sedangkan antibodi poliklonal darisporozoit memiliki nilai absorbansi antara1,236–2,687. Berdasarkan nilai absorbansi,dapat diperkirakan titer antibodi poliklonal

tertinggi ditemukan pada stadium sporozoit.Nilai absorbansinya mencapai 1,236 padapengenceran serum 40x, sedangkan stadiumoosista dan sporosista pada pengenceran serumyang sama, memiliki nilai absorbansi 0,631untuk oosista dan 0,754 untuk sporosista.

Hasil pemeriksaan ELISA terhadap titerantibodi poliklonal yang dikembangkan dari tigastadium perkembangan E. tenella selanjutnyadigunakan sebagai dasar untuk pengenceranserum dalam analisis dot blot. Berdasarkan hasilELISA, selanjutnya ditentukan pengenceranserum yang digunakan dalam analisis dot blotadalah 40x. Nilai pengenceran serum inidiharapkan dapat memberikan gambarantimbulnya reaksi ikatan antara antigen danantibodi pada analisis dot blot.

Analisis Dot BlotHasil analisis dot blot ditunjukkan dengan

terbentuknya noktah bulat berwarna ungu yangmenunjukkan bahwa terjadi reaksi pengikatanantara antigen dan antibodi poliklonal yangdikembangkan (Guzman et al., 2003). Analisis

Gambar 1. Stadium perkembangan E. tenella. Stadium oosista (A), stadium sporosista (B), danstadium sporozoit (C).

(A) (B) (C)

Gambar 2. Hasil analisis dot blot antibodipoliklonal oosista (A), hasil analisis dot blotserum kontrol (B)

(A) (B)

Gambar 3. Hasil analisis dot blot antibodipoliklonal sporosista (A), hasil analisis dot blotserum kontrol (B)

Gambar 4. Hasil analisis dot blot antibodipoliklonal sporozoit (A), hasil analisis dot blotserum kontrol (B)

(A) (B)

Tresnani et al Jurnal Veteriner

225

dot blot dilakukan terhadap antibodi poliklonalyang dikembangkan dari tiga stadium E. tenellapada mencit, dan sebagai kontrol digunakanserum mencit yang tidak diberi perlakuan. Hasilanalisis dot blot antibodi poliklonal yangdikembangkan dari stadium oosista disajikanpada Gambar 2 :

Pada analisis dot blot antara antibodipoliklonal oosista dengan antigen oosistamenunjukkan adanya reaksi positif, yaitudengan munculnya noktah berwarna ungu padamembran nitroselulosa. Reaksi positif inimenunjukkan bahwa pengembangan antibodipoliklonal oosista pada mencit telah berhasil. Halini berarti bahwa di dalam serum mencit yangdisuntikkan dengan antigen oosista telahmenghasilkan antibodi poliklonal yang dapatdigunakan untuk mendeteksi keberadaanantigen oosista melalui analisis dot blot (Moniset al., 2005).

Hasil analisis dot blot berikutnya dilakukanuntuk antibodi poliklonal yang dikembangkandari stadium sporosista. Hasilnya disajikan padaGambar 3.

Antibodi poliklonal sporosista yangdikembangkan pada mencit terbuktimemberikan reaksi positif ketika direaksikandengan antigen sporosista dalam analisis dotblot. Reaksi positif ini menunjukkan bahwapengembangan antibodi poliklonal sporosista initelah berhasil.

Selain antibodi poliklonal oosista dansporosista yang memberikan hasil analisis dotblot positif, antibodi poliklonal yangdikembangkan dari stadium sporozoit jugamemberikan hasil yang sama dan disajikan padaGambar 4.

Hal ini membuktikan bahwa antibodipoliklonal dari stadium sporozoit yangdikembangkan pada mencit telah berhasil.Antibodi ini sesuai untuk mendeteksikeberadaan antigen sporozoit E. tenella karenasetelah direaksikan dengan antigen sporozoit,antibodi ini mampu mengikat antigen danmemberikan reaksi noktah berwarna ungu.

Reaksi negatif pada analisis dot blotterhadap ketiga jenis antibodi poliklonalditunjukkan dengan tidak terbentuknya noktahberwarna ungu pada membran nitroselulosa.Pada reaksi ini digunakan antigen yang samayaitu antigen oosista, sporosista, dan sporozoityang diteteskan ke permukaan membran,namun antibodi yang digunakan dalam reaksiini merupakan antibodi atau serum yang berasaldari mencit yang tidak diberi perlakuan. Hal

ini menunjukkan bahwa dalam serum tersebuttidak dijumpai antibodi yang secara spesifikmampu mengenali dan berikatan denganantigen yang berada di permukaan membrannitroselulosa (Monis et al., 2005).

Seluruh hasil analisis dot blot yangdilakukan terhadap antibodi poliklonal yangdikembangkan dari tiga stadium perkembanganE. tenella menunjukkan hasil reaksi positif.Reaksi positif ditunjukkan dengan terbentuknyanoktah bulat berwarna ungu di tiap-tiapmembran nitroselulosa. Hal ini menunjukkanbahwa antibodi yang dikembangkan padamencit (bukan pada ayam sebagai inang utama)mampu mengenali dan berikatan denganantigen oosista, sporosista, dan sporozoit dari E.tenella (Brake et al., 1997).

Berdasarkan hasil analisis ini, dapatdiasumsikan bahwa pengembangan antibodipoliklonal terhadap tiga stadium perkembanganE. tenella telah berhasil. Antibodi iniselanjutnya dapat digunakan sebagai mediadiagnosis E. tenella secara serologi ataupunsebagai media pendeteksi antigen imunogenikatau senyawa imunogenik pada E. tenella.

SIMPULAN

Pengembangan antibodi poliklonal padamencit dari stadium oosista, sporosista, dansporozoit E. tenella memberikan hasil positif danantibodi ini dapat digunakan untuk penelitianlainnya dibidang imunoproteomik. Hal iniditunjukkan dari reaksi positif pengikatanantara antigen dan antibodi dalam analisis dotblot.

SARAN

Saran yang dapat disampaikan penelitiadalah perlu dilakukannya penelitian lebihlanjut untuk mengembangkan antibodimonoklonal E. tenella yang merupakan antibodiyang lebih spesifik. Antibodi poliklonal yangdikembangkan dalam penelitian ini selanjutnyadapat digunakan untuk analisa proteomiklainnya seperti analisa Western Blot untukmencari antigen (protein) spesifik yang dapatdigunakan untuk mengembangkan vaksin danobat-obatan untuk menangani koksidiosis.

UCAPAN TERIMA KASIH

Jurnal Veteriner Juni 2013 Vol. 14 No. 2: 221-227

226

Ucapan terima kasih disampaikan penuliskepada Lembaga Penelitian dan PengabdianPada Masyarakat, Universitas Gadjah Madaatas bantuan dana penelitian yang diberikandalam bentuk Penelitian Hibah DisertasiDoktor. Ucapan terima kasih juga disampaikankepada seluruh teknisi LaboratoriumBioteknologi Pusat Antar Universitas,Universitas Gadjah Mada yang banyakmembantu dalam penyelesaian penelitian ini.

DAFTAR PUSTAKA

Allen PC, Fetterer RH. 2002. Recent Advancesin Biology and Immunobiology of EimeriaSpecies and in Diagnosis and Control ofInfection With These Coccidian Parasitesof Poultry. Clinical Microbiology Reviews15 (1) : 58–65.

Brake DA, Fedor CH, Werner BW, Miller TJ,Taylor RL, Clare RA. 1997.Characterization of Immune Response toEimeria tenella Antigens in A NaturalImmunity Model With Hosts Which DifferSerologically At The B Locus Of The MajorHistocompatibility Complex. Infection andImmunity. 65 (4) : 1204–1210.

Constantinoiu CC, Molloy JB, Jorgensen WK,Coleman GT. 2007, Development andValidation Of An ELISA For DetectingAntibodies To Eimeria tenella In Chickens.Veterinary Parasitology. 150 : 306–313.

Fernando MA. 1990. Eimeria : Infections of TheIntestine. In : Long, P.L. (Ed). Coccidiosisof Man and Domestic Animals. Boca Raton,Florida. CRC Press. Pp : 63–77.

Fetterer RH, Jenkins MC, Miska KB, BarfieldRC. 2007. Characterization of The AntigenSO7 During Development of Eimeriatenella. J Parasitol 93(5) : 1107–1113.

Guzman VB, Silva DAO, Kawazoe U, Mineo JR.2003. A Comparison Between IgG AntibodiesAgainst Eimeria acervulina, E. maxima,and E. tenella Oocyst Shedding in Broilers-Breeders Vaccinated With Live AnticoccidialVaccines. Vaccine 21 : 4225-4233.

Hafeez MA, Akhtar M, Javed MT, ul Haq A.2007. Maternal Immunization By EggsPropagated Gametocyte Vaccine To ControlEimeria tenella Infections In Newly HatchedChicks. Parasitology Research 100 : 1139–1141.

Jenkins MC. 2001. Advances and Prospects forSubunit Vaccines Against Protozoa ofVeterinary Importance. VeterinaryParasitology 101 : 291–310.

Khyseanderson J. 1984, Electroblotting OfMultiple Gels : A Simple Apparatus WithoutBuffer Tank For Rapid Transfer Of ProteinsFrom Polyacrylamide To Nitrocellulose,Biochemical and Biophysical Methods 10 :203–209.

Laemmli UK. 1970. Cleavage of StructuralProtein During The Assembly of The Headof Bacteriophage T4. Nature 227 : 680–685.

Lillehoj HS. 2005. Immune Response ToCoccidia. In : Proceedings of The IXthInternational Coccidiosis Conference, Brazil.

Liu L, Xu L, Yan F, Yan R, Song X, Li X. 2009.Immunoproteomic Analysis of The Second-Generation Merozoite Proteins of Eimeriatenella. Veterinary Parasitology 164 : 173–182.

Long PL. 1982. The Biology of The Coccidia.University Park Press. Pp : 292–333.

Maresca B, Carratu L. 1992, The Biology of TheHeat Shock Response in Parasites,Parasitology Today 8(8) : 260–266.

Min W, Dalloul RA, Lillehoj HS. 2004,Application Of Biotechnological Tools ForCoccidia Vaccine Development. Journal ofVeterinary Science 5 (4) : 279–288.

Monis PT, Giglio S, Keegan AR, Thompson RCA.2005, Emerging Technologies For TheDetection and Genetic Characterization OfProtozoan Parasites. Trends in Parasitology21 (7) : 340–346.

Morrissey JH. 1981, Silver Stain For ProteinsIn Polyacrylamide Gels : A ModifiedProcedure With Enhanced UniformSensitivity. Analytical Biochemistry 117 :307–310.

Rose ME. 1987. Eimeria, Isospora, andCryptosporidium. In : Soulsby, E.J.L (Ed),Immune Responses In Parasitic Infections: Immunology, Immunopathology, andImmunoprophylaxis. CRC Press. Pp : 275–312.

Shirley MW. 1995. Eimeria Species and Strainsof Chicken, In : Eckert J, Brawn R, ShirleyMW, Coudert P. (Eds.). Biotechnology-Guidelines on Techniques in CoccidiosisResearch, European Commission DGXII,Luxembourg, Pp : 8–19.

Tresnani et al Jurnal Veteriner

227

Shirley MW, Smith AL, Tomley FM. 2005. TheBiology of Avian Eimeria With an Emphasison Their Control by Vaccination. AdvanceParasitology 60 : 285–330.

Smith RR, Ruff M. 1975. A Rapid Technique forThe Cleaning and Concentration of EimeriaOocyst. Poultry Science 54 : 2081–2086.

Talebi A. 1995. Protein Profiles of Five AvianEimeria Species. Avian Pathology 24 : 731–735.

Tomley FM. 1994. Characterization of RhoptryProteins of Eimeria tenella Sporozoites :Antigenic Diversity of Rhoptry Epitopes

Within Species of The Genus Eimeria andAmong Three Asexual Generations of ASingle Species, E. tenella. Infection andImmunity. 62 (10) : 4656–4658.

Wallach M, Smith NC, Braun R, Eckert J. 1995.Potential Control Of Chicken Coccidiosis byMaternal Immunization. ParasitologyToday 11 : 262–265.

William RB. 1998. Epidemiological Aspects ofThe Use of Live Anticoccidial Vaccines forChickens. International Journal forParasitology 28 : 1089–1098.

Wisher MH. 1968. Identification of the SporozoiteAntigens of Eimeria tenella. Mol BiochemParasitol 21 : 7–15.

Jurnal Veteriner Juni 2013 Vol. 14 No. 2: 221-227