Pmceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Saif/.8dart 1'eknologi Menuju Era Tinggal Landas

Bandung, 8 -10 Oktober 1991PPTN - BATAN

PENGARUH IRADIASI NEUTRON CEPAT TERHADAP LAJUTUMBUH, PRODUKTIVITAS DAN KANDUNGAN PROTEIN

KHAMIR

Nurhayati T. *, P. Soedigdo**,S. Soedigdo*** Pusat Penelitian Teknik Nuklir - Badan Tenaga Atom Nasional

** Departemen Kimia - Institut Teknologi Bandung

ABSTRAKPENGARUH IRADASI NEUTRON CEPAT TERHADAP LAJU TUMBUH,

PRODUKTIVITASDANKANDUNGANPROTEIN KRAMIR. Studi biologi molekular denganmenggunakan khamir sudah banyak dilakukan di luar negeri. Beberapa macam galur khamirSa£charomyces cerevisiae seperti D4, D5 dan D7 sudah banyak digunakan untuk ujikarsinogenitas/mutagenitas. Pembuatan mutan baru yang peka terhadap karsinogen untukjenis khamir yang ada di Indonesia, akan memungkinkan pengurangan risiko masyarakatterhadap penggunaan senyawa sintetis untuk pangan yang umum dikonsumsi olehmasyarakat Indonesia. Usaha pembuatan mutan baru dari S. cerevisiae A3 ialah denganmengiradiasi khamir tersebut dengan neutron cepat pada USIF reaktor Triga Mark IIBandung. Dosis iradiasi dibuat beberapa macam, dari 1000 - 5000 rad. Dugaan adanyamutasi dapat dipelajari melalui pola laju tumbuh, produktifitaslbobot kering dan kandunganprotein sel khamir. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa laju tumbuh, hasil bobot keringmengalami penekanan sebanding dengan besarnya dosis iradiasi, sedangkan terhadapkandungan protein, tampaknya pengaruh yang ditunjukkan berbeda dengan kedua hal yangtelah disebutkan terdahulu.

ABSTRACTTHE INFLUENCE OF FASTNEUTRON IRRADIATIONONYEAST'S GROWTHRATE,

PRODUCTIVITY AND PROTEIN CONTENT. Plenty of studies on molecular biology usingyeasts have been carried out in developed countries. Some strains of Sa£chromyces cerevisiaeas D4, D5 and D7 have been used to test carcinogenic/mutagenic effect of some organiccompounds. Development ofnew mutant ofcertain yeasts found in Indonesia which is sensitiveto carcinogens/ mutagens, is hoped to be able in reducing cancerous risk in population thatconsumes synthetic materials, such as Indonesia. New mutant of Sa£charomyces cerevisiaeA3 was induced by irradiating the yeast in liquid medium with several doses of fast neutron,i.e. from 1000-5000 rads. Irradiation was done in the USIF of TRIGA MARK II reactor. Theoccurrence of mutation was determined by measuring the growth rate, productivity andprotein content ofyeast cells. The result shows that proportionally with irradiation doses, thegrowth rate and productivity of yeast cells were suppressed, and a different effect with theformer was found in the protein content.

PJE:NDAHULUAN

Penelitian dengan menggunakan khamirdi dalam bidang biologimolekular sudah banyakdilakukan di luar negeri, beberapa macam galurkhamir Sat:charomyces cerevisiae seperti D4, D5dElnD7 [1,2,3] sudah banyak digunakan untukmenguji mutagenitas/karsinogenitas senyawa­senyawa yang diduga mutagenikfkarsinogenik.Dibandingkan dengan penggunaan sel mama­lin, cara ini memberikan keuntungan khusus­nya dalam hal proses pelaksanaan uji.

Sejauh ini di Indonesia, studi mutasi terha­dElpsel khamir yang mengarah ke pembuatanmutan baru yang peka terhadap senyawa karsi­nogen/mutagen belum banyak dilakukan.Mengingat Indonesia adalah salah satu negara

yang cukup banyak mengkonsumsi bahan sin­tetis untuk keperluan sandang dan pangan, mu­tan khamir baru yang peka terhadap mutagen!karsinogen dapat mengurangi risiko gangguankesehatanyang ditimbulkan olehbahan sintetisyang bersifat karsinogenik/mutagenik.

Secara fisik, mutasi dapat ditimbulkan k9.­rena aksi sinal' pengion atau neutron cepat.Dengan mangatur dosis iradiasi, diharapkandapat mengubah sistem genetik tertentu darikhamir, sehingga dengan demikian dapat ditim­bulkan suatu mutan baru yang diharapkan.

Perubahan sistem genetik khamir dapatdipelajari melalui beberapa kelainan sifatbiokimiawinya. Di antaranya ialah laju

265

Proceedings Seminar Reciktor Nuklir dalam Penelitian Sainsdan Tekrwlogi Menuju Era Tinggal Landas

pertumbuhan, produktivitas/bobot kering dankandungan protein dari selmikroorganismetersebut.

Hasil penelitian yang diperoleh ini diha­rapkan dapat menunjang khasanah ilmu penge­tahuan, khususnya yang berkaitan dengan stu­di mutasi.

BAHAN DAN TATA KERJA

Bahan

Bahan kimia yang digunakan adalah da­lam derajat analisi3. Ragi yang digunakan ialahSaccharomyces cerevisia£ A3 yang diperoleh da­ri laboratorium Biokimia ITB. Sebelum diguna­kan untuk penelitian ini, khamir terse but di­adaptasikan dulu dalam medium etanol1 %.

.Thta kerjaPembuatan media cair

Medium etanoll%

Ditimbang eejumlah pepton, eketrak kha­mir dan KH2P04• CampJ.lran terse but dilarut­kan dalam eejumlah volume air hingga dicapaikonsentrasi akhir untuk maeing-masing kom­ponen eenyawa tersebut 1% (b/v).Sebelum volu­me akhir medium dicapai, ditambahkan sejum­lah etanol eehingga diperoleh konsentrasi akhiretanol1 % (v/v).Selanjutnya medium ini diste­rilkan dengan otoklaf pada tekanan 15 psi dansuhu 121°C selama 15 menit.

Medium glukosa 2%

Campuran pepton, ekstrak khamir danKH2P04 sarna seperti pada pembuatan mediaetanol1 %. Di sini etanol diganti dengan glukosa(b/v).Selain itu, pada sterilisasi, campuran pep­ton, ekstrak khamir dan KH2P04 dipisahkandari larutan glukosa. Setelah selesai sterilisasi,kedua macam larutan tersebut dicampurkansecara aseptik agar tidak terjadi kontaminasi.

lradiasi khamir Saccharomyces cerevisiae A3dengan neutron cepat

Ragi Saccharomyces cerevisise A3 ditum­buhkan dalam medium etanol1 %. Setelah dica­pai fase eksponensial (lihat gambar di atas),diambil 6 buah cuplikan masing-masing 5 ml

, dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril.Selanjutnya tabung ditutup dengan kapas yangdibalut kain kasa agar tidak terjadi kontak de­ngan udara luar.

Cuplikan khamir ini diiradiasi denganneutron cepat pada fasilitas USIF. Satu tabungcuplikan digunakan sebagai blanko dan tabunglainnya memperoleh dosis iradiasi masing-ma­sing 1000,2000, 3000, 4000 dan 5000 rad. Dosis

Bandung, 8 - 10 Oktober n'91PPTN - BAT,W

--

c

CII

o..J

1

----.- t ( 18m)

Gambar. Kurva laju tumbuh ragiI. Fase adaptasiII. Fase ekeponensialIII. Fase stasioner

iradiasi ini merupakan dosis lanjutan dari doniepenjajagan. Perlakuan ini diulang dua kali.

Selesai iradiasi, biakan khamir disentri­fuga agar sel khamir mengendap. Setelah it;u,disuspensikan kembali dalam 5 ml medium eta­nolI % baru. Hal ini dikerjakan dengan tujul:muntuk mengurangi efek sampingan yang mung­kin terjadi akibat radiolisis molekul air padamedia biakan.

Penentuan laju tumbuh \Laju tumbuh sel khamir ditentukan secara

turbidimetri dengan spektrofotometer merkHitachi pada A = 650 nm. Fase pertumbuhanyang diamati ialah dari fase adaptasi sampaidengan fase stasioner. Waktu biak khamir iahhwaktu yang diperlukan oleh populasi sel khamiruntuk menjadi dua kali jumlah populasi sel fie­mula [4]. Di dalam kurva pertumbuhan, waktubiak diukur pada daerah pertumbuhan ekspo­nensial, yaitu dengan jalan menghitung waktuyang diperlukan oleh sel khamir dari suatu hur­ga resapan cahaya (OD1)menjadi duakali hargaresapan cahaya semula (OD2 ; OD2 = 2 x OD1;lihat gambar ).Laju tumbuh khamir yang sudahdiiradiasi dengan neutron cepat ini dipelajaripada dua macam media cair, yaitu media etanol1 % dan glukosa 2 %.

Ragi yang sudah diiradiasi dengan berba­gai dosis neutron cepat diinokulasikan ke dala.mkedua macam media cairo Inokulasi dilakuk:mdalam ruang steril Laminar Air Flow Bench(LAFB) dan dilakukan secara aseptis. Biak~nkhamir dengan berbagai dosis iradiasi disertaidengan khamir yang tidak diiradiasi (blanko),dikocok dengan pengocok biakan mikroba merk

266

Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian SainseLm Tekrwlogi Menuju Era Tinggal Landas

dikocok dengan pengocok biakan mikroba merkE:dmun Buhler pada frekuensi 180 kocokan/menit. Pengukuran resapan cahaya untuk me­nentukan laju pertumbuhan, dilakukandengan pengambilan beberapa cuplikan biakanpada fase adaptasi, fase eksponensial dan fasestasi- oner. Resapan cahaya dibaca denganspektro- fotometer pada f... = 650 nm. Waktutumbuh ditentukan melalui kurvapertumbuhan setiap macam biakan.

Setelah dipanen, khamir disuspensikan da­lam air suling. Ragi dalam suspensi ini dicuci 3k.alidengan air suling. Pencucian dilakukan se­cara sentrifugasi. Setelah itu sel khamir disus­pensikan kembali ke dalam 7,5 ml bufer fosfat,pH 7,5. Penentuan bobot kering dilakukan de­ngan mengambil1 ml cuplikan suspensi kham1rdalam bufer fosfat dan dikeringkan di dalamoven sela~a 1jam pada suhu 100°C.

Sisa suspensi sel khamir digunakan untukpenentuan kandungan protein. Lisat khamir di­peroleh dengan memecah sel khamir dengansonikator pada intensitas 0,6 A selama 6 menit.Untuk mencegah kemungkinan denaturasi pro­tein/enzim yang akan diteliti lebih lanjut makasuhu pada waktu memecah sel dibuat serendahlI1ungkin yaitu dengan jalan membenamkanwadah suspensi dalam bongkahan es.

Lisat sel khamir diperoleh dengan men­sentrifuga homogenat khamir pada kecepatanfiOOO rpm, selama 30 menit dan suhu 4°C.Setelah itu ditentukan kandungan protein dariHsat sel khamir secara metode Lowry [5].

HASILDAN PEMBAHASANWaktu biak khamir blanko dan khamir

yang sudah diiradiasi dengan berbagai dosisneutron cepat dapat dilihat pada Tabel1 dan 2,rnasing-masing untuk media etanol 1% danglukosa 2 %. Tabel 3 dan 4 menunjukkan bobotkering khamir di dalam kedua macam media(air, sedangkan Tabel 5 dan 6 menampilkanpersen kandungan protein khamir dalam tiaptol suspensi khamir.

Dari hasH yang diperoleh tampak bahwa!:;ecarakeseluruhan laju tumbuh khamir lebihc:epatbila ditumbuhkan khamir lebih cepat biladitumbuhkan di dalam media glukosa 2 %daripada di dalam media etanol 1 %. Polapengaruh iradiasi neutron cepat terhadap lajutumbuh khamir di dalam kedua media tersebutdi atas tampak sarna, yaitu makin besar dosisiradiasi makin lama waktu biak khamir (lihat~['abel1dan 2 ).

Produktivitasfbobot kering khamir jugadipengaruhi oleh radiasi neutron cepat. Dosis

B(mdung, 8 - 10Oktober 1991PPTN - BATAN

Tabell. Laju tumbuh khamir normal dan kha­mil' yang diradiasi neutron cepat dalam medi­um etanol1 %

Jenis Waktu biak%+/-khamir

X ± S.K.terhadap(%)normal

Normal

128 ± 2,251000 R

141 ± 1,73110+ 102000 R

137 ± 5,25107+ 73000 R

146 ± 1,56114+ 144000 R

150 ± 4,02117+ 175000 R

179 ± 3,18140+ 40

Catatan:X = harga rata-rata waktu biakS.K . = standar kesalahan1000 R = khamir yang diiradiasi dengan dosis1000 rad2000 R = khamir yang diiradiasi dengan dosis2000 rad dan seterusnya.

Tabel 2. Laju tumbuh khamir normal dan kha­mil' yang diiradiasi neutron cepat dalam medi­um glukosa 2 %

Jenis Waktu biak%+/-khamir

X ± S.K.terhadap(%)normalNormal

68 ± 2,271000 R

67 ± 4,15106+ 102000 R

77 ± 3,00122+ 73000 R

85 ± 6,58135+ 144000 R

91 ± 4,98144+ 175000 R

96 ± 3,00152+ 40

Catatan :Lihat catatan Tabell.

5000 rad menekan produktivitas khamir relatifnyata dari pada dosis sebelumnya (Tabel 3 dan4).

Pola penekanan terhadap bobot kering ti­dak sarna seperti yang terlihat pada penekananterhadap laju tumbuh sel khamir. Intensitaspenekanan radiasi neutron cepat terhadap lajutumbuh sel khamir yang dibiakkan di dalammedia etanol1 % dan glukosa 2 % lebih kurangsarna, sedangkan pada produktivitas khamirtampaknya penekananyang te1jadi relatiflebihnyata pada sel khamir yang dibiakkan dalammedium etanol 1 %.

Selanjutnya dalam hal kandungan protein(Tabel 5 dan 6), pola pengaruh radiasi neutron

267

Proceedings Seminar Reriktor Nuklir dalam Penelitian Sainsdan Tekrwlogi Menuju Era Tinggal Landas

Tabel3. Bobot kering khamir normal dan kha­mir yang diiradiasi neutron cepat dalam medi­um etanol1 %

Jenis Bobot% terhadapkhamir

keringfmlnormal(Ilg')normal

29,52 x 1031000 R

23,68 x 103802000 R

22,99 x 103783000 R

24,09 x 103824000 R

24,17 x 103825000 R

20,71 x 10370

Catatan:normal = khamir yang tidak diiradiasi1000 R = khamir yang diiradiasi dengan dosis1000 rad2000 R = khamir yang diiradiasi dengan dosis200 rad dan seterusnya

Tabel 4. Bobot kerin~ khamir normal dan kha­mir yang diiradiasi neutron cepat dalam medi­um glukosa 2%

Jenis Bobot%terhadapkhamir

keringfmlnormal(ue:)normal

30,35 x 1031000 R

29,11 X 103962000 R

28,96 x 103953000 R

29,36 X 103974000 R

27,82 X 103925000 R

27,49 X 10391

Catatan :Lihat catatan Tabel 3.

mena sebelumnya. Di sini justru makin tinggidosis iradiasi neutron cepat, makin besar pulakandungan protein sel khamir. Pada dosis 5000rad, kandungan protein khamir etanol menca­pai satu setengah kali lipat dan khamir glukosahampir dua kali lipat dari khamir blankomasing-masing.

Kedua kelompok fenomena biokimiawiyang berlawanan yang terjadi akibat iradiasineutron cepat terhadap sel khamir S. cerevisiaeA3 ini, sungguh menarik. Mungkinkah iradiasipada dosis 5000 rad ini sudah mampu menim­bulkan mutan baru ? Untuk dapat membuk-

BaILdung, 8 - 10 Oktober 199JPPTN - BATAN

Tabel5. Kandungan 1'(otein sel khamir normaldan khamir yang diiradiasi neutron cepat da­lam medium etanol1 %

Jenis ~ndungan % terha-%

khamir protein dap bobotterhadap

(ml) kerine:normal

normal

14885,01000 R

12785,41082000 R

14396,31263000 R

13445,31064000 R

13505,61125000 R

16217,8158

Catatan:Lihat catatan Tabel 3.

Tabel5. Kandungan protein sel khamir normaldan khamir yang diiradiasi neutron cepat da­lam mediumglukosa 2%

Jenis ~ndungan % terha-%

khamir protein dap bobotterhadap

(ml) kerine:normal

normal

13734,51000 R

12784,4982000 R

20647,11583000 R

13934,71044000 R

12624,51005000 R

26579,7246

Catatan:Lihat catatan Tabel 3.

tikan hal tersebut, perlu dilakukan penentuanlebih lanjut beberapa sifat biokimiawi lainnyadari S. cerevisiae A3.

KESIMPULAN

Iradiasi neutron cepat dengan dosis 1000­5000 rad1. Menghambat laju tumbuh dan menekan pro­

duktivitas S. cerevisiae A3. Penghambatanlpenekanan sebanding dengan dosis iradiasi,

2. Cenderung meningka tkan kandungan prob~­in, terutama pada dosis iradiasi 5000 rad.

UCAPAN TERIMA KASIH

Penulis mengucapkan terima kasih kepadaSaudari Rina Stefania, mahasiswa dari Aka­demi Kimia Analisis Bogoryang telah memban­tu banyak di dalam penelitian ini.

268

Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam, Penelitian Sains<inn Tekrwlogi Menuju Era Tinggal Landas

DAFTAR PUSTAKA

Bandung, 8- 10 Oktober 1991PPTN - BATAN

1. Callen, D.F. and Philpot, RM., Cytochrome P450 and the activation of promuta gens in Sac­charomyces cerevisiae, Mutation Research, 45 (1977) 309 - 324

2. Cellen, D.F., Roland Wolf and Philpot, R M., Cytochrome P450 mediated genetic activity andcytotoxicity of seven halogenated aliphatic hydrocarbons in Saccharomyces cerevisiae, Muta­tion Research, 77 (1980) 55 - 63

3. Eckardt, F., Muliawan, H., N de Ruiter and Kappus, H., "Rat hepatic vinyl chloride metabo­lites induce gene conversion in the yeast strain D7RAD in vitro and in vivo", Mutation Re­search, 91 (1981) 381 - 390

4. Brock, T.D., Biology of Microorganisms, 3rd. ed., Prentice/Hall International Editions, (1979)211-218.

5. Lowry, a.H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L. and Randall, R J., Protein measurement withFolin phenol reagent, J. BioI. Chern. 193 (1951), 265 - 275.

DISKUSI

Gunanjar :1. Kalau kita lihat, penggunaan iradiasi neutron cepat kurang menguntungkan dibandingdengan iradiasi dengan sinar y, karena iradiasi neutron cepat terjadi pula reaksi (n,y) walaudengan tampang serapan rendah, sedang y( untuk Ey < 2 MEV)tidak terjadi reaksi inti, iradiasineutron cepat perlu fasilitas reaktor nuklir dengan operator khusus dan dengan prosedur operasiyang ketat, sedang iradiasi dengan sinary tidak demikian. Keuntungan/keunggulan apa sehinggaibu memilih iradiasi dengan neutron cepat ?2. Pada penelitian ini diperoleh bahwa makin besar dosis yang diberikan, kandungan proteinlebih tinggi. Mohon bisa dijelaskan kenaikan protein ini berasal dari mana?Nurhayati T.: ,1. Keunggulan/keuntungan yang dipertimbangkan :- sasaran iradiasi dengan neutron cepat ialah inti sel organisme- di PPTN tidak tersedia iradiator y; tetapi reaktor nuklir- media biakan yang digunakan ialah media cair, iradiasi dengan neutron cepat tidakmenimbulkan radiolisis air pada media biakan2. Peningkatan kandungan protein diduga karena adanya miskonsepsi dari DNA misalnyaduplikasi gen yang berperan dalam sintesis protein.

M. Yanis Musdja :1.Apakah telah dapat dikonversikan dari dosis penyinaran penelitian ini khamir telah mati sarnasekali ?

2. Bagaimana caranya dari penelitian ini dapat diketahui bahwa khamir yang terbentuk bersifatkarsinogenik/mutasigenik ?Nurhayati T. :1. Secara analogi, khamir akan mati pada dosis iradiasi neutron cepat tertentu. Dalam rancanganpenelitian kami, hal tersebut tidak dicakup.2. Mutan yang diinginkan adalah yang peka terhadap prokarsinogen/promutagen, bukan khamiryang karsinogenik/mutagenik.

Irwan :1. Apa dicoba dengan dosis dibawah 1KR?2. Kemampuan khamir yang diduga mutan dalam masalah fermentasi ?Nurhayati T. :1. Dilakukan, observasi hanya pada laju tumbuh saja.2. Akan dipelajari dari aspek enzimatisnya ( menyusul ).

269

Proceedings Seminar Reaktor Nuklir dalam Penelitian Sainsdan Teknologi MenuJu Era Tinggal Landas

Bandung, 8 - 10 Oktober 1J91PPTN - BAT AN

H. I. Komala :

Lalu kalau sudah ditemukan mutan baru dari khamir, apa hubungannya dengan pernyataanmemungkinkan pengurangan resiko masyarakat terhadap penggunaan senyawa sintetis untukpangan. Pernyataan ini tidak diterangkan dalam pembicaraan.Nurhayati T. :Dengan mutan tersebut dapat diuji/diseleksi secara cepat dan tepat senyawa sintetis untukpangan yang bersifat karsinogen/mutagen. Dengan demikian maka penggunaan zat/senyawatersebut dapat dihentikan dari peredaran sedini mungkin.

270