Proeeedings Seminar Pendayagunaan Reaktor NllldirUntllk Kesejahteraan Masyarakat

Bandung, 26-27 September 1990PPTN-BATAN

PENENTUAN KARAKTERISTIKA ANTIBODI T4UNTUK BAHAN PEREAKSI RIA

Ratnawati Kukuh , Pringgo SoedigdoPus at Penelitian Teknik Nuklir - Badan Tenaga Atom Nasional

AJBSfRAKPENENTUAN KARAKTERISTIKA ANTIBODI T4 UNTUK BAHAN PEREAKSI RIA.

Agar antiserum dapat digunakan untuk keperluan RIA maka harus memenuhi beberapapersyaratan yaitu mengandung antibodi dengan kespesifikan tinggi, cukup peka pada daerahkerja yang diinginkan serta mempunyai titer yang tinggi. Untuk men~i apakah antiserumT4 yang dihasilkan dapat digunakan untuk keperluan RIAmaka pada penelitian ini dilaku­kan 1.\iikarakteristika antiserum yaitu dengan menentukan nilai aviditas dan kespesifikan.Kespesifikan dievaluasi dengan mempelajari reaksi silang antiserum T4 terhadap berbagaisenyawa yaitu 3,3,S-triiodo-L-tironina (Tg), diiodotironina (3,S-T2), 3-iodo-L-tirosina (MIT),3,S-diiodo-L-tirosina (DIT).Hasil analisis menuDjukkan bahwa anti- serum T4 yang diha­silkan cukup spesifik untuk penentuan RIA. Aviditas antiserum atau harga K ditentukandengan menggunakan kurva Scatchard yang menuDjukkan hubungan antara perbandinganfraksi terikat terhadap fraksi bebas (BIF) dan jumlah antigen terikat. Dari hasil percobaandiperoleh nilai K sebesar 3,6 x 1071/mol untuk kelinci 2,S3 kg dan 2,9 x 1071/mol untuk kelinci2,39 kg. Limit deteksi yang dapat dicapai dengan antibodi T4 adalah 2,8 x 10,8 molll dan 3,4x 10,8 molll berturut-turut untuk kelinci dengan berat 2,S3 kg dan kelinci dengan berat 2,39kg. Dari hasil seluruh percobaan dapat disimpulkan bahwa antiserum T4 yang dihasilkancukup memenuhi persyaratan untuk digunakan sebagai bahan pereaksi RIA. Hasil penelitianini diharapkan akan sangat berguna bagi produksi kit T4 buatan dalam negeri.

AJBSTRACTDETERMINATION OF· THE CHARACTERISTICS OF T4 ANTIBODY FOR

RADIOIMMUNOASSAY. Antisera for radioimmunoassay should meet a number ofrequirements such as having high spesificity, adequate sensitivity in the desired workingrange and high titre. In order to test the suitability of the T4 antiserum produced, thecharacteristics of the antiserum was studied by determining avidity and specificity. Thespecificity was evaluated through cross-reaction studies of the T4 antiserum with severalcompounds,i.e. 3,3,S-triiodo-L-thyronine (T2), diiodothyronine (3,S-T2), 3 iodo-L-tyrosine(MIT), 3,5-diiodo-L-tyrosine (DIT).The analytical results showed that the T4 antiserumproduced is sufficiently specific for radioimmunoassay. The avidity or K value was calculatedfrom Scatchard's plot which shows the relationship between the ratio of bound and freefractions and the amount of bound antigen. A K value of 3.6 x 1071/mole was obtained for therabbit weighing 2.53 kg and 2.9 x 1071/mole for the one weighing 2.39 kg. The detection limitswere found to be 2.8 x 10,8 molell and 3.4 x 10,8 molell respectively for the two rabbits. It canbe concluded that the T4 antiserum produced meet requirement for radioimmunoassay andshould make a significant contribution for the local production ofT4 kits.

PENDAHULUAN

Antiserum adalah salah satu komponente:rpenting dalam kit RIA. Agar antiserum da­pat digunakan untuk keperluan RIA maka ha­rus memenuhi beberapa persyaratan yaituml:!ngandungantibodi dengan kespesifikan danaviditas yang tinggi, cukup peka pada daerahkeIja yang diinginkan serta mempunyai titeryang tinggi [1,2].

Antiserum tidak dapat diseleksi atas da­sar titer semata- mata. Antiserum dengan titeryang tinggi belum tentu memenuhi persyaratanuntuk keperluan RIA. Untuk menguji apakah

1

antiserum dapat digunakan untuk keperluanRIA maka dalam penelitian ini dilakukan pe­nentuan karakteristika antiserum lainnya.

Kespesifikan adalah kemampuan antibodiuntuk bereaksi dengan antigen yang dimaksud,tanpa disertai reaksi dengan antigen yang lain.Umumnya kespesifikan ini tidak bersifatmutlak, sehingga antibodi dapat bereaksi de­ngan molekul lain yang strukturnya mengan­dung persamaan dengan analit yang bersang­kutan. Jika dalam plasma tidak terdapat se­nyawa lain yang mempunyai struktur yang se-

Proceedings Seminar Pendayagunaan Reaktor NuklirUntuk Kesejahteraan Masyarakat

rupa dengan senyawa yang harus ditentukankonsentrasinya, maka dapat diharapkan tidakakan ada gangguan dari zat lain. Akan tetapibagi banyak senyawayang mempunyai arti pen­ting secara biologis, terdapat sejumlah senyawalain dengan struktur kimiawi yang serupa. Bia­sanya kita tidak menginginkan senyawa terse­but ikut tertentukan dalam suatu penentuan,karena efek biologisnya berbeda. Jadi kespe­sifikan antibodi merupakan salah satu faktorutama yang menentukan kualitas dari penen­tuan. Adanya reaksi silang akan mempenga­ruhi hasil analisis [2,3].

Kepekaan suatu sistem penentuan RIAsangat bergantungpada aktifitasjenis senyawabertanda dan aviditas antibodi. Aviditas ataunilai K menggambarkan energi ikatan atau ke­kuatan ikatan antara antigen dan antibodi.Pada penentuan RIA nilai K menggambarkankepekaan dari suatu penentuan, makin kecilkonsentrasi antigen yang akan ditentukan di­perlukan antibodi dengan aviditas yang tinggi.

Perhitungan nilai K dapat ditentukan daridata kurva baku dengan menggunakan metodeScatchard. Harga K diperoleh dari kemiringangaris (slope)[4,5].

Dalam penelitian ini antiserum T4 diujidengan menentukan titer, daerah kerja optimal,nilai aviditas dan kespesifikan. Kespesifikan di­evaluasi dengan mempelajari reaksi silang anti­serum T4 terhadap T3 ' 3,5- T2 ' MIT(3-iodo-L-tirosina), DIT (3,5-diiodo-L-tirosina),dan nilai aviditas ditentukan dari kurvaScatchard.

BAHAN DAN PERALATAN

Bahan yang digunakanAntibodi yang digunakan adalah antibodi

hasil penelitian yang terdahulu yaitu antibodidari kelinci 2,39 Kg dan kelinci 2,53 Kg.3,5-diiodo-L-tirosina (DIT), 3-iodo-L-tirosina(MIT), 3,5-T2(diiodotironina), T3 ' polietilengli­kol (PEG-6000), dapat diperoleh dari Sigma.NaN3, NaH2 P04 ' Na2 HP04 ' diperoleh dariE. Merck. Semua bahan mempunyai tingkatkemurnian pereaksi analitik. Selain itu diguna­kan pula serum bebas, T4 bertanda 1125,danbaku T4 produksi PPTN.Peralatan

Perala tan yang digunakan adalah alatpencacah sinar y (Miniassay type 6-20), alatpemusingyang diperlengkapi pendingin (lECCentra-7R), alat pH meter (Metrohm HerisauE520), alat freeze dryer (Labconco).Kecuali alat­alat tersebut digunakan pula pipet ependorf

2

Bandung, 26·27 Septemb~r 1990PP1'N·BA1'AN

dengan ukuran 50 !!l,100!!1, 500 !!l,dan 1000!!1,dan tabung reaksi.

TATAKERJA

Pembuatan kurva baku dengan berbagai variasipengenceran

Mula-mula dilakukan pembuatan kurvabaku dengan berbagai pengenceran antiserum,hingga diperoleh pengenceran yang memberi­kan daerah keIja dengan kepekaan yang dii­nginkan. Untuk pembuatan kurva baku digu­nakan 25 !!l larutan baku T4 dengan konsen­trasi 0, 10, 50, 100, 150, dan 250 nmol/l. Kemu­dian ditambahkan 100!!1T4bertanda 1251clan100!!1 antiserum T4(hasil pengenceran). Cam­puran diaduk dengan pengaduk vortex, diinku­basi selama 1 jam pada suhu kamar. Selan­jutnya ditambahkan 1 ml larutan PEG 18%untuk memisahkan fraksi terikat dan fraksibebas. Setelah dipusing, cairan dari setiap ta­bung didekantasi dan keaktifan residu dicacahdengan menggunakan pencacah sinar-y. Pro­tokol RIA untuk percobaan ini dapat dilihatpada Tabell.

Tabell. Protokol RIA

vo-b

konsentrasi baku T4lum

I (nmol/l)(!!l)

a uppen0105010(l5(25(lik-mbk anan-0

dingSerum bebas

-25-------T

12tl-T410010C10C10C10(10C10C10(10(

Larutan--252525252525-

baku Anti---10C10C10C10(10C10C-

serum Cuplik---------:~5

anInkubasi suhu kamar selama 1 iam

LarutanPEG-11111111

18%

Pemusingan : selama 20 menit pada 2000 g.Dekantasi supernatan d~Il cacal1.eIl4~pl:!n.Ni,lai keakt~fan senyawa b~rtan':ia digu~k;~nuntuk menentukan % ikatan. f< ,', •

Dari hasil seluruh percob~an dibuat grafilii ... _;~-',j i.. ,~ ~."

antara fraksi terikat dan konsentrasi T4 serta

Proceedings Seminar Pendayagunaon Reakror NllklirUntuk Kesejahteraan Masyaralwt

gl'afik profil presisi yang menggambarkan hu­bungan antara % koefisien variasi (%CV)de­ngan konsentrasi.

Plmentuan volum pereaksi optimal un/uk menda­p,!tkan daerah kerja dan kepekaan yang diinginkan

Setelah diperoleh pengenceran antiserumynng tepat ditentukan pula volum pereaksiyangoptimal untuk mendapatkan daerah kerja dankopekaan yang diinginkan. Untuk maksud inidilakukan berbagai kombinasi dengan disainporcobaan sebagai berikut:

d 12511. 25 ~llarutan bakuT4, 50 ~l T4bertan a ,50 ~l antiserum T4

2. 25 ~llarutan baku T4, 100 ~l T4 bertanda1251, 50 ~l antiserum T4

3. 25 ~llarutan baku T4, 50 ~l T4 bertanda1251,100 ~l antiserum T4

4. 25 I-!llarutan baku T4, 100 ~l T4 bertanda1251,100~l antiserum T4

5. 50 ~llarutan baku T4 , 50 ~l T4 bertanda1251.00~l antiserum T4

Percobaan dilakukan sesuai dengan pro­takol RIAyang tertera pada Tabel1. Dari selu­ruh percobaan kemudian dibuat grafik antarafraksi terikat dan konsentrasi T4 serta grafikprofil presisi.Plmentuan aviditas

Penentuan aviditas dilakukan setelah di­kdahui pengenceran antiserum dan volum pe­reaksi optimal. Aviditas ditentukan dari kurvaS<:atchard yaitu hubungan antara B/F (fraksiterikat/fraksi bebas) danjumlah antigen terikat(molm yang diperoleh dari data kurva baku.Aviditas dinyatakan dengan harga K pada re­aksi antigen-antibodi. Nilai K ini diperoleh da­ri koefisien arah (slope) pada kurva Scatchard.

P~'nentuan kespesifikan antibodi T4Kespesifikan ditentukan dari reaksi silang

3,5-T2' DIT,MIT,dan T3, terhadap antibodi T4Untuk maksud ini dilakukan 5 seri percobaan.Sori pertama dibuat kurva baku T4 dengankonsentrasi 0, 10, 50, 100, 150, dan 250 nmol/ldIm seri ke 2 hingga ke 5 dibuat kurva pengen­ceran berbagai senyawa tersebut dengan kon­sentrasi 10, 100, 1000, 10.000, 100.000 nmol/l.Prosedur percobaan dilakukan sesuai denganprotokol yang terdahulu. Derajat reaksi silangda.pat dihitung dengan membandingkan Ed 50pa.da kurva baku T4 dengan Ed 50 pada kurvapengenceran senyawa-senyawa T3 ' 3,5-T2 'DIT, MIT.

3

Brmdung, 26-27 September 1990PPTN8ATAN

HASILDAN DISKUSI

Antiserum yang digunakan pada peneli­tian ini adalah antiserum yang diperoleh darikelinci 2,53 kg dengan nilai titer 1 x 104 dankelinci 2,39 kg dengan nilai titer 6 x 102 (hasilpenelitian yang terdahulu).

Antiserum tidak dapat diseleksi atas da­sar titer semata-mata. Keuntungan antiserumdengan titer tinggi ialah sedikit antiserum da­pat digunakan untuk sejumlah besar penentuan[4,5,6]. Umumnya antiserum dengan pengen­ceran tinggi memberikan kepekaan analisisyang tinggi. Akan tetapi pada daerah kerja yangdiinginkan sering tidak memberikan kondisiyang optimal. Jadi untuk menentukanpengenceran antiserum optimal pada daerahkerja yang diinginkan dilakukan pembuatankurva baku dan kurva profil presisi dariberbagai pengenceran antiserum.

Kurva profil presisi sangat berguna untukmengetahui sej~uh mana kepekaan dan daerahkerja yang dapat dicapai dengan sistem analisistersebut (7). Kurva profil presisi diperolehdengan mengalurkan % CV terhadapkonsentrasi. Daerah kerja yang diinginkanadalah daerah konsentrasi yang memberikankesalahan < 10%.

Untuk memperoleh daerah pengenceranantiserum yang optimal dilakukan pengenceranantiserum T4 antara 1/1000 -1/7500 untuk ke­linci dengan berat 2,53 kg dan 1/200 - 1/400untuk kelinci dengan berat 2,39 kg. Hasil opti­masi pengenceran antiserum T4 dapat dilihatpada Gambar 1, Gambar 2, dan Tabel 2 (lihathalaman berikut).

Kurva profil presisi menunjukkan bahwamakin encer konsentrasi antibodi akan membe­rikan limit deteksi yang makin rendah. Jadiapabila diinginkan penentuan pada konsentrasiyang sangat rendah diperlukan antibodi de­ngan tingkat pengenceran yang tinggi. Walau­pun antibodi dengan tingkat pengenceran tinggidapat mencapai limit deteksi yang rendah tetapipresisi percobaan kurang baik karena nilai ikat­an maksimum (BolT) rendah. Hal ini akan mem­berikan bentuk kurva baku yang landai danakan mengurangi kepekaan analisis.

Pada penentuan klinis untuk hormon ti­roksina (T4) daerah hipotiroida dan hipertiro­ida merupakan daerah yang sangat penting un­tuk pemeriksaan klinis, maka kurva baku harusmencakup kedua daerah tersebut. Dari hasilpengujian diperoleh bahwa pengenceran anti­bodi optimal adalah 1/2000 untuk kelinci de­ngan berat 2,53 kg, dan 1/300 untuk kelinci

Proceedings Seminar Pendayagunaan Reaktor NuhlirUntuh Kesejahteracm Masyarakat

1

13andung, 26-27 September 1990PPTN-BATAN

a, ",Ii)

':::':"i2~",=".",_._.~_nmol/l

"rcU:.~ pAdo. I:Ct•.•••••••t,.••.•~clka,tar'l ",Wc••t,'ftU •••1

o p."''Jenc.,-an .~oo; • r""'.nc.' ••..•. C p.n9 ••.•c:.,-Qn •.•••'''00; • p.n,_ncerGn J./200~o p.ng_ •.•c:..rGn ,-",•.500; A p.n9.ncer ••••.•

Gambar 1. Kurva baku dan kurva profil presisi pada berbagai pengenceran antiserum T4 ( kelinci2,53 kg ).

'/. ~s.

-='-'~::~<:'\'. ...

\';.. ~..•~~. '"

''0.\.. Q. •.

....~t. "0

'.~:-.,a ••.•••'"010 J~ n nil 01 / I

---to- K Dn~tntuli

1

a •

••• ',It '\..• \\ ..

"" ... \ ..' ", ..

\ ••• ~\,~. ~,.., ~':,:; ••~ •••• o

.tr-:'1....~.~~_ .• ';;;-;-"IDI/I

o P••.•9.roc:.,. ••••.•1/ .•00; • p.n9 ••.•c.,-on , .••.:Joo• p."g.ru:.r_ •.• L/250; 0 pon9.nc.,-.. ~.••.~_oo

Gambar 2. Kurva baku dan kurva profil presisi pada berbagai pengenceran antiserum T4 ( kelinci2,39 kg )..

4

Proceedings Seminar Pendayagunaan Reaktor NuklirUntuk Kesejahteraan Masyarakai

Bandung, 26-27 September 1990PPTN-BATAN

b. Kelinei denean berat 2.39 k~.

Tabel 4. Hasil penentuan reaksi silang terha­dap antibodi T4'

a. Kelinei dengan berat 2,53 kISenvawa

Dari hasil analisis dapat disimpulkan bah­wa antiserum T4 yang dihasilkan eukup spes i­fik.

1002,75

< 0,0001< 0,0001< 0,0001

T4

T3MITDIT

3,5 T2

Senvawa

Kepekaan dari suatu sistem penentuanerat hubungannya dengan aviditas atau hargaK antibodi. Maka untuk dapat memperoleh sua­tu sistem dengan kepekaan yang tinggi umum­nya digunakan antiserum yang mempunyai a­viditas tinggi. Aviditas atau harga K antiserumdapat dipelajari dengan menggunakan kurvaSeatehard.

Pada prinsipnya penentuan harga K sa­ngat sederhana, teta pi dalam prakteknya sering

1005

< 0,0001< 0,0001< 0,0001

lang biasanya ditentukan sebagai perbandingankonsentrasi antigen spesifik terhadap konsen­trasi senyawa yang mengadakan reaksi silangpada Ed 50 (BfBo = 50%) (1,3). Dari data yangdiperoleh T3 adalah antigen yang bereaksi si­lang terhadap antibodi T4 sedang untuk senya­wa MIT,DIT,dan T2 derajat reaksi silangnya sa­ngat keeil. Besar reaksi silang T3 adalah 5,0 %atau 0,1 nmol/l untuk kelinei 2,53 kg dan 2,75 %atau 0,06 nmol/l untuk kelinei 2,39 kg. Dari datatersebut di atas ternyata reaksi silang T3 untukkedua antiserum yang dihasilkan tidak mem­berikan perbedaan yang nyata. Kadar T3 dalamserum darah normal berkisar antara 1,5 - 2,2nmol/l, yang berarti jauh lebih kecil dari kadarT4 ' maka adanya reaksi silang tidak signifikanpengaruhnya terhadap hasil pengukuran kon­sentrasi T4 . Hasil penentuan reaksi silang ter­hadap antibodi T4 selengkapnya dapat dilihatpada Tabel 4.

a. Kelinei dem1;anberat 2,53 kg.Pengeneer-

BolTEd50Batas profilan antibodi

(%)(nmol/l)presisi(nmol/l)1/1000

81,777,632 - 10001/1500

73,947,020 - 7501/2000

65,642,018 - 7001/3000

63,725,711 - 4001/4000

59,118,28 - 3001/7500

57,611,85.5 - 130

b. Kelinei denean berat 2.30 ke. Pengeneer-

BolTEd50Batas profilan antibodi

(%)(nmol/l)preSlSl(nmol/l)

1/200

74,5,112,345 - 10001/250

67,542,920 - 6001/300

65,346,219 - 6001/400

63,232,013,5 -420

'Pabel 2. Hasil optimasi pengeneeran antibodi'P4'

Dengan kondisi pengeneeran ini dilakukanpula penentuan volum pereaksi optimal untukmendapatkan daerah kerja yang diinginkan.Hasil penentuan dari berbagai kombinasi pere­aksi dapat dilihat pada Tabel 3, Gambar 3 dan4, masing-masing untuk kelinei dengan berat2,53 kg dan 2,39 kg. Dari data yang diperolehternyata disain penentuan dengan 25 f..lliarutanbaku T4(euplikan), 100 f..llT4bertanda 1251, dan100 f..llantiserum T4 memberikan hasilpereobaan yang eukup peka pada daerah kerjayang diinginkan yaitu antara 18 - 700 nmol/l1.lntukkelinei dengan berat 2,53 kg dan 19 - 600nmol/l untuk kelinci dengan berat 2,39 kg. Nilainormal T4 berkisar antara 60 - 150 nmol/l [5].(lihat halaman berikut ).

Mengingat bahwa untuk penentuan T4de­ngan metode RIA tidak diperlukan pemisahanantibodi T4dari antibodi lainnya yang ada makaperlu dilakukan uji kespesifikan. Kespesifikandapat dievaluasi dengan mempelajari reaksiBilangantiserum T4terhadapsenyawa-senyawayangmempunyai struktur molekulyang hampir:3ama.Adanya reaksi silang akan inenyebabkanhasil pengukuran eenderung terlalu tinggi. Ha­:3ilpenent).lan reaksi silang terhadap antibodi:3pesifikT4 dapat dilihat pada Gambar 5 dan 6(lihat halaman berikutnya). Derajat reaksi si-

dengan berat 2,39 kg (Gambar 1,2).Pada kondisipengeneeran ini diperoleh daerah kerja yangc:ukuplebar.

5

Proceedings Seminar Pendayaguncum Reaktor NukliJ'Untuk Kesejahteraan. Masyarakat

Bandllng, 26-27 September 1990PPTN-BATAN

Tabel 3. Hasil optimum dari berbagai kombinasi pereaksi.

a. Kelinci dengan berat 2,53 kg.

Kombinasi pereaksi

Bo/l' (%)Ed 50 (nmol/l)Batas profil presisi (nmoI(l)

50 I!IIarutan baku

100 !AI 125I-T4

80,320,630 - 370

100 !AIantiserum T4

25 !AIlarutan baku

50 !AI 125I-T479,015,47 - 300

50 !AIantiserum T4

25 !AIlarutan baku

100 !AI 125I-T462,119,18 - 300

50 !AIantiserum T4

25 !AIIarutan baku

50 !AI 125I-T482,839,217 - 500

100 !AIantiserum T4

25 !AIIarutan baku

100 !AI 125I-T465,642,018 - 700

100 !AIantiserum T 4

b. Kelinci dengan berat 2,39 kg.Kombinasi pereaksi

Bo/l' (%)Ed 50 (nmol/l)Batas profil presisi (nmol(l)

50 !AIIarutan baku

100 !AI 125I-T454,613,47,5-220

100 !AIantiserum T4

25 !AIIarutan baku

50 !AI 125I-T456,945,725 - 300

50 !AIantiserum T 4

25 f.!llarutan baku

100 !AI 125I-T440,533,215 - 250

50 f.!1antiserum T4

25 !AIlarutan baku

50 !AI 125I-T463,244,020 - 400

100 !AIantiserum T4

25 !AIlarutan baku

100 !AI 125I-T465,346,219 - 600

100 !AIantiserum T4

6

Pl'Ooeedings Seminar Penria)'agunaon. Reaktor NuklirUntuk Kesejrihteraon. Masyarakat

1

---+ Kuuntrul

Ban-dung, 26-27 September 1990PPTN-BATAN

'{, tV

--+ ko" II ••Hui

•• 'ra.il:.l t.rU••t: loa 1,.II..t potlo. k." •• ntru.o~ 0

X • to..rlolCo."ba.ku: Y • I.Z':"T.1 Z • o,..Ubodt T.•

o 25 J.J\ X, iDO ."'\ Y, &00 ,..~ 2; (1\ z::II JJl )C, :SO JJ\ V, "" J.JL 'Z

• ao J.J~ V, 100 ~\ Y, JOO ""I %.:0 t:s ,..U X. ,n $01\ Y. 400 fit 2­

o U }.Il x. 100 }.It Y, 50 #1 Z

Gambar 3. Kurva baku dan kurva profil presisi pada berbagai kombinasi pereaksi ( kelinci 2,53kg)

~I,~,

rnmol/I

r

,.

.•...

q0:.,",

\~:'.. \

'." '~'~::;~-~?~!\-'''-''''''~1f<;;;;i~-...~,o''''100 f5D UO

Kon,enrrui1000 n Mol/I

x • \.(U"u\a.n bCLku: Y • 1:1.~:I_T./ Z • IISntlbodi T'"

o 2:1' ~l )c. aDo ,&It Y, sCa jJl. 2; 425 lolL X. :SO pi Y. 50 Jolt "Z• ~O #-ILx, 1.00 }Jl Y, .1.00 Ii' %:. 1$ }oJl X. !So }Jt y. SOD pI ZD ~ J.I\ )( •.• 00 J.I' Y, :tO}lt z:

Gambar 4. Kurva baku dan kurva profil presisi pada berbagai kombinasi pereaksi ( kelinci 2,39kg)

7

Proceedings Seminar Pendayagunaan Reakwr NuklirUntuk Kesejahteraan Masyarakat

Bandung, 26-27 September 1990PPTN-BATAN

'I, !B.

!~

.<0... •......•

.~..• .•.o..•~-.oT,!

____ • Ko_.entrHi

.aoooo "mol}1

"100000 nmol/l

Gambar 5. Hasil penentuan reaksi silang antibodi T4 (kelinci 2,53 kg).

"'r'~'...."c:::::.:', .." •.•:':'~"':'." ••. ", .'~' ,,,, ..,,,,,!, ~::~o~ ", '''' ••

80 " ..0.•••

r"C'U"U•••••••••••• _"'u ••• ,

- ----------.-- ----- .o ,

"", '..'!

'0•

•• 'b '.- ~-'"

Gambar 6. Hasil penentuan reaksi silang antibodi T4 (kelinci 2,39 kg).

8

Proceedings Seminar Pendayagunaan Reaktor NuhlirUntuh KesejahteraOR Masyarakai

mengalami banyak persoalan. Hal ini disebab­kan karena antiserum yang dihasilkan adalahantiserum poliklonal yang mengandung bebe­rapa populasi antibodi clansetiap antibodi mem­berikan harga K yang berbeda. Keadaan inilahyang memberikan kurva Seatehard sering tidakberupa garislurus tetapi berupa garis lengkungyang merupakan superposisi beberapa fungsilinier dari setiap antibodi spesifik.

Pada Gambar 7 clan 8 terlihat bahwa kur­va Seatehard merupakan superposisi dua fungsilinier dengan kemiringan masing-masing ialahK1 = 3,6x 107l1moldan~ = 8,8x 1051/moluntukkelinci berat 2,53 kg dan K1 = 2,9 x 107 lImoldan K 2 = 9 x 105 limoI untuk kelinei berat 2,39kg . Sekalipun antiserum yang dihasilkanadalah antiserum poliklonal yang mengandungheberapa populasi antibodi tetapi dengan dila­kukannya pengeneeran antiserum, maka anti­hodi dengan konsentrasi yang rendah dapat dia­haikan.

l.G'~..

0.'.,

r

..•

____ t Konu"trUi (10.71'101/1)

Gambar 7. Kurva penentuan aviditas antise­rum T4 ( kelinei 2,53 kg ).

Dari data kurva baku dengan mengguna­kan metode Seatchard diperoleh bahwa anti­serum T4 terdiri dari 2 populasi antibodi yaitudengan kemiringan K1 dan ~ . Kedua nilai Kini menggambarkan kepekaan analisis untukkedua jenis antibodi dalam serum yang dihasil­k9.n.Dengan pereobaan menggunakan baku T4

9

Bandung, 26-27 September 1990PP1'N-BATAN

,,12.c, :

.,B

r

1

Gambar 8. Kurva penentuan aviditas antise­rum T4 (kelinei 2,39 kg).

pada berbagai konsentrasi dapat disimpulkanbahwa antibodi yang peka untuk penentuan T4

ialah kurva dengan kemiringan K1 . Harga Kuntuk antibodi yang umum digunakan dalamRIA berkisar antara 107- 10121/mol [2,4].HargaK yang diperoleh untuk antiserum T4 dalampereobaan ini relatifrendah (107l/mol). Kenya­taan ini sering dijumpai apabila imunogen yangdisuntikkan identik dengan material endogenpada hewan penerima. Sehingga antibodi yangdihasilkan akan bereaksi dengan kedua mate­rial tersebut, yang akan mengubah karakteris­tika dari antiserum. Antigen endogen akan beri­katan dengan antibodi yang mempunyai avidi­tas tinggi. Apabila konstanta disosiasi reaksiikatan antigen antibodi rendah, maka prosesyang terjadi tak reversibel sehingga antiserumyang dihasilkan mempunyai aviditas relatifren­dah [4]. Keterangan molekuler tentang hal inibelum diketahui seeara pasti dan masih perludipeeahkan. Mengingat bahwa T4 adalah zatyang endogen, maka aviditas antiserum T4 re­latif rendah. Aviditas suatu antiserum menen­tukan limit deteksi dari suatu sistem penentu­an. Limit deteksi adalah sebanding dengan 11K,maka limit deteksi yang dapat dieapai denganantibodi T4 yang dihasilkan oleh kelinei 2,53 kgadalah 2,8 x 10-8 mol/l dan untuk kelinei 2,39 kgadalah 3,4 x 10-8mol/l. Limit deteksi dari kedua

Proceedings Seminar Pendayagunaan Reaktor NllklirUntllk Kesejahteraan Masyarakai

antibodi yang dihasilkan tidak memberikanperbedaanyang nyata. Mengingat bahwa kadarhormon T4 dalam serum cukup tinggi antara 60- 150 nmol/l maka antibodi T4yang dihasilkancukup peka untuk penentuan T4.

KESIMPULAN

Kondisi penentuan daerah keIja optimaldiperoleh dengan melakukan pengenceran1/2000 untuk kelinci 2,53 kg dan 1/300 untukkelinci 2,39 kg, serta percobaan mengunakan25 !AIbaku/ cuplikan T4, 100 !AIT4berlanda 1251,

DAFTAR PUSTAKA

Bandllng, 26-27 September }990PPTN-BATAN

dan 100 !AIantiserum T4yang memberikan dae­rah kerja antara 18-700 nmol/l untuk kelinci2,53 kg dan 19-600nmol/l untuk kelinci 2,39 kg.

Hasil uji karakteristik antiserum menun­jukkan bahwa antiserum T4 yang dihasilkancukup spesifik untuk penentuan RIA denganbatas deteksi 2,8 x 10-8 molJI untuk kelinci 2,5:3kg dan 3.4 xlO-8 molJIuntuk kelinci 2,39 kg.

Antiserum yang dihasilkan cukup meme­nuhi persyaratan untuk digunakan sebagai ba­han pereaksi RIA.

1. Anonim,"Laboratory Training Manual on Radioimmunoassay in Animal Reproduction", Tech­nical Report Series No 223, IAEA, Vienna, 1984, 100-105.

2. Edward, R, "An Introduction", Immunoassay, William Heinemann Medical Books, London,1985, 12-23.

3. Mera, V., "Preparation and Characterization of Antibody", Diklat Radioimmunoassay ke II,PPTN-BATAN, Bandung, 1988.

4. Chard, T., "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology",An Introductionto Radioimmunoassay and Related Techniques, 2ed., Elsevier Biomedical Press, Amsterdam,1982,22-24,95-109.

5. Thorell, J.I., S.M. Larson, "Methodology and Clinical Application", Radioimmunoassay andRelated Techniques, The C.V.Mosby Company, 1978, 11-31, 114-118.

6. Pillay, M.RA.and RS. Mani, "Radioimmunoassay", Ind. J. Pharm. Edu., 12, 1978, 172-183.

7. Ekins, RP., "Quality Control and Assay Design", Radioimmunoassy and Related Procedure:;in Medicine, vol. II, IAEA,Vienna, 1978, 39-56.

DISKUSI

Salman Umar:

Penandaan T4 menggunakan radioisotop 12512 1251 ini mempunyai beberapa kelemahan- kele··mahan. Karena telah ditemukan radioisotop 1 31yang mempunyai sifat-sifat yang ideal, apakahtidak terbayang untuk mengembangkan kit RIA dengan penandaan 1231 tersebut.Ratnawati Kukuh:Mengingat bahwa radioisotop 1231 mempunyai waktu paruh yang pendek, sehingga untukpenandaan T4 kurang memenuhi syarat, sebab sebagai radioisotop penanda dibutuhkan radio··isotop yang mempunyai waktu paruh yang cukup panjang (1251 mempunyai waktu paruh 60 hari),agar tidak diperlukan pembuatan antigen T4bertanda yang berulang-ulang.

10