PENAPISAN PSEUDOMONAS SPP. DARI RIZOSFER

TANAMAN KEDELAI YANG BERPOTENSI SEBAGAI

RIZOBAKTERIA PEMACU PERTUMBUHAN TANAMAN

DAN BIOKONTROL FUNGI PATOGEN

RENELITA ARTATI

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2008

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN

SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Penapisan

Pseudomonas spp. dari Rizosfer Tanaman Kedelai yang Berpotensi sebagai

Rizobakteria Pemacu Pertumbuhan Tanaman dan Biokontrol Fungi

Patogen adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum

diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber

informasi yang berasal atau dikutipkan dari karya yang diterbitkan maupun tidak

diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam

Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Mei 2008

Renelita Artati

G 351060091

ABSTRACT

RENELITA ARTATI. Screening of Pseudomonas spp. from Rhizosphere of

Soybean Plant for Potential Plant Growth-Promoting Rhizobacteria and

Biocontrol of Pathogenic Fungi. This thesis is advised by ARIS TRI

WAHYUDI and GIYANTO.

Soybean is one of the most important crops in Indonesia. To explore the

role of bacteria colonizing rhizosphere of soybean plant, we have isolated and

identified 50 bacterial isolates from rhizosphere classified as Pseudomonas spp.

after partially biochemical and physiological characterization. All these isolates

produce indole acetic acid (IAA) after measurement by spectrophotometry using

Salkowsky reagent. The ability for phosphate solubilization was tested

quantitatively by plating the bacteria in Pikovskaya agar, 32 isolates were

positively exhibited to solubilize phosphate, that have index of phosphate

solubilization from 0.10 to 0.80. All of the isolates were inoculated on soybean

seedlings and 8 among of them significantly induced elongation of primary root,

numerous of lateral root and shoot growth. The Pseudomonas spp. isolates were

further tested for studying antifungal activity against soil-borne fungal pathogens.

Thirthteen isolates showed inhibition, in vitro, against Fusarium oxysporum.

While 10 isolates inhibited Sclerotium rolfsii and 32 isolates inhibited

Rhizoctonia solani. Hypersensitivity test revealed that 19 bacterial strains of

Pseudomonas spp. were classified as non-pathogenic bacteria. According to these

traits, 3 Pseudomonas spp. isolates (Crb 74, Crb 84, and Crb 95) can be

recommended as plant growth promotion as well as biocontrol of pathogenic

fungi causing rot root desease of soybean plant. 16S rRNA sequence analysis

revealed that Crb 60, Crb 82 have similarity with P. fluorescens, while Crb 74

and Crb 93 have similarity with P. putida and Crb 84, Crb 94, and Crb 95 have

similarity with P. plecoglossicida.

Keywords: Pseudomonas sp., PGPR, indole acetic acid (IAA), pathogenic

fungi,16S rRNA.

RINGKASAN

RENELITA ARTATI. Penapisan Pseudomonas spp. dari Rizosfer Tanaman

Kedelai yang Berpotensi sebagai Rizobakteria Pemacu Pertumbuhan

Tanaman dan Biokontrol Fungi Patogen. Dibimbing oleh ARIS TRI

WAHYUDI dan GIYANTO.

Sejumlah bakteri mempunyai peranan penting di bidang pertanian karena

berperan dalam berbagai proses kunci pada ekosistem seperti sebagai biokontrol

patogen tanaman, pada siklus nutrisi, dan persemaian. Bakteri yang berperan di

bidang pertanian tersebut mempunyai karakteristik mampu memacu pertumbuhan

tanaman (Plant-Growth Promoting Rhizobacteria, PGPR), dengan karakter dapat

berkoloni di rizosfer, mampu memproduksi berbagai hormon pertumbuhan, yaitu

asam indol asetat (indol acetic acid, IAA), asam giberelin, sitokinin dan etilen;

menambat N2, menekan pertumbuhan mikroorganisme fitopatogen dengan

memproduksi siderofor, -1,3-glukanase, kitinase, antibiotik dan sianida;

melarutkan fosfat; dan penyedia nutrien lainnya.

Salah satu bakteri yang ditemukan secara luas di dalam ekosistem tanah

rizosfer adalah Pseudomonas spp., yang mampu mendegradasi dan menggunakan

sejumlah besar senyawa organik, berinteraksi dengan tanaman dan berasosiasi

dalam rizosfer. Beberapa galur Pseudomonas mampu memproduksi siderofor dan

IAA, melarutkan fosfat, dan menghambat pertumbuhan cendawan secara in vitro.

Dengan adanya kemampuan ini, beberapa Pseudomonas spp. merupakan bakteri

yang dapat berperan sebagai pemacu pertumbuhan tanaman dan sekaligus sebagai

agen biokontrol mikroba patogen tanaman.

Penelitian mengenai peran Pseudomonas spp. sebagai PGPR telah

dilaporkan pada banyak tanaman pangan, namun pada kedelai sangatlah terbatas.

Kedelai merupakan komoditas pertanian penting di Indonesia yang hingga kini

produksinya belum dapat mencukupi kebutuhan. Salah satu usaha untuk

meningkatkan produksi kedelai adalah dengan memperbaiki kualitas

pertumbuhan dan kesehatan tanaman. Sehubungan dengan hal tersebut, dilakukan

penelitian untuk mengisolasi spesies Pseudomonas spp. dari rizosfer kedelai

yang mempunyai karakteristik sebagai PGPR dan biokontrol fungi patogen akar

tanaman kedelai. Isolat-isolat yang mempunyai karakter khusus diidentifikasi dan

dianalisis secara molekuler berdasarkan gen penyandi 16S rRNA.

Isolasi dan karakterisasi fisiologi Pseudomonas spp. secara parsial

dilakukan dengan menggunakan metode pengenceran berseri dan disebarkan

diatas media agar-agar King’s B. Identifikasi Pseudomonas meliputi pewarnaan

gram, uji katalase, dan uji oksidase, mengikuti Bergey’s Manual of Determinative

Bacteriology.

Analisis Produksi Asam Indol Asetat (IAA) oleh Pseudomonas spp.

dengan metode kolorimetri menggunakan reagen Salkowsky. Pengukuran

menggunakan spektrofotometer (spectronic 20) pada panjang gelombang 510 nm.

Uji Pelarutan Fosfat dilakukan dengan menumbuhkan isolat-isolat bakteri

pada media agar-agar Pikovskaya. Zona bening yang terdapat di sekeliling koloni

diamati dan diukur indeks pelarutan fosfatnya.

Telaah Pemacuan Pertumbuhan Kecambah menggunakan kedelai varietas

Slamet. Inokulasi kultur bakteri pada kecambah kedelai dilakukan pada

kecambah berumur 1 hari. Setelah diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang

dalam kondisi gelap, dilakukan pengukuran panjang batang, panjang akar primer,

dan jumlah akar lateral. Hasil pengukuran dianalisis secara statistik dengan one-

way Analysis of Variance (ANOVA) menggunakan program SPSS dan diuji

lanjut dengan Duncan.

Uji antagonis terhadap cendawan patogen dilakukan dengan menggunakan

metode standar kultur ganda. Cendawan yang diuji masing-masing adalah

Rhizoctonia solani, Sclerotium rolsfii dan Fusarium oxysporum. Adanya interaksi

antagonis ditandai dengan terbentuknya zona penghambatan antara isolat

Pseudomonas dengan cendawan.

Reaksi hipersensitivitas isolat-isolat Pseudomonas spp. diujikan pada

tanaman tembakau. Sebanyak 1 ml kultur Isolat Pseudomonas spp. yang

ditumbuhkan pada media King’s B berumur 24-48 jam diinjeksikan ke ruang

interseluler diantara vena-vena daun tembakau. Reaksi hipersensitif positif

ditunjukkan dengan nekrosis kecoklatan dan kekeringan pada jaringan daun yang

diinokulasi dalam 24 sampai 48 jam.

Analisis genetik secara parsial Pseudomonas spp. dilakukan

menggunakan sekuen gen 16S rRNA yang diekstraksi terlebih dahulu, kemudian

diamplifikasi dengan menggunakan mesin Gene Amp PCR 2400 (Perkin Elmer,

USA). DNA hasil PCR dianalisis sekuennya menggunakan mesin DNA squencer

ABI 310 (Perkin Elmer, USA) menggunakan jasa Charoen Phokphan, Jakarta.

Hasil sekuensing dibandingkan dengan data pada GenBank menggunakan

program BLASTN melalui layanan National Centre for Biotechnology

Information (NCBI). Perbandingan sekuen dilakukan menggunakan program

ClustalX, dendogram dibuat menggunakan metode neighbor-joining.

Penelitian ini telah berhasil mengisolasi 50 isolat Pseudomonas spp. yang

berasal dari rizosfer kedelai asal Cirebon, Jawa Barat. Isolat-isolat ini mempunyai

karakteristik Gram negatif, sel berbentuk batang, lurus, atau sedikit bengkok,

dengan panjang 1,5 – 5,0 μm dengan ukuran dan penataan yang berbeda-beda.

Reaksi katalase positif dan oksidase positif. Koloni isolat Pseudomonas spp.

berwarna putih sampai krem, memiliki bentuk bervariasi antara bulat sampai

bundar tak beraturan dengan tepian licin, dengan elevasi cembung, timbul dan

berbukit. Lima puluh isolat Pseudomonas spp. menghasilkan IAA dengan

konsentrasi berkisar antara 0.33 ppm sampai 23.04 ppm pada media pertumbuhan

yang ditambah dengan triptofan. Pada bakteri produksi IAA tidak berfungsi nyata

sebagai hormon pertumbuhan bagi selnya, hal ini memungkinkan peranannya

menjadi penting dalam interaksi antara bakteri dengan tanaman.

Dari hasil uji kemampuan pemacuan pertumbuhan, didapatkan 8 isolat

Pseudomonas spp. yang mampu memacu pertumbuhan kecambah kedelai pada

taraf signifikansi 5%, yaitu Crb 60, 63, 74, 82 , 84, 93, 94, dan 95.

Sebanyak 32 (64%) isolat Pseudomonas spp. mampu melarutkan fosfat

dalam bentuk trikalsium fosfat yang terkandung di dalam media Pikovskaya,

ditandai dengan zona bening yang terbentuk di sekitar koloni isolat Pseudomonas

spp. dengan indeks pelarutan fosfat berkisar antara 0.10 sampai 0.80.

Dari uji antagonis terhadap cendawan patogen diperoleh 13 (26%) isolat

Pseudomonas spp. mampu menghambat pertumbuhan cendawan F. oxysporum,

10 (20%) isolat mampu menghambat pertumbuhan cendawan S. rolsfii, dan 32

(64%) isolat Pseudomonas spp. memiliki kemampuan dalam menghambat

cendawan R. solani. Uji reaksi hipersensitif tanaman tembakau terhadap isolat

Pseudomonas spp. memperlihatkan bahwa 19 (38%) isolat Pseudomonas spp.

nonpatogen.

Hasil amplifikasi gen 16S rRNA pada isolat-isolat Pseudomonas spp.

yang memacu pertumbuhan dengan PCR memperlihatkan pita-pita DNA

berukuran sekitar 1300 pb. Hasil analisis homologinya menunjukkan bahwa

isolat Crb 60 dan Crb 82 mempunyai kemiripan dengan Pseudomonas

fluorescens, isolat Crb 74 dan Crb 93 mempunyai kemiripan dengan

Pseudomonas putida , sedangkan isolat Crb 84, 94, dan 95 mempunyai kemiripan

dengan Pseudomonas plecoglossicida. Perbandingan sekuen antara isolat-isolat

Pseudomonas spp. yang memacu pertumbuhan dengan galur-galur Pseudomonas

spp. lain yang telah diketahui bersifat PGPR menghasilkan dendogram

filogenetik yang memperlihatkan bahwa isolat-isolat tersebut lebih dekat

hubungan kekerabatannya dengan galur pf-5 dan CHAO dibandingkan hubungan

kekerabatannya dengan galur pp-K31-3 dan pf-K30-2. Isolat Crb 82, 94, 74, dan

60 berada satu kelompok dengan galur pf-5 dan CHAO.

Kesimpulan dari penelitian ini adalah bahwa 50 isolat Pseudomonas spp.

yang diisolasi dari tanah rizosfer kedelai menghasilkan IAA. Tujuh isolat yaitu

Crb 60, 74, 82, 84, 93, 94, dan 95 secara signifikan mampu memacu

pertumbuhan kedelai dan nonpatogenik, 5 isolat diantaranya yaitu Crb 60, 74,

82, 84, dan 95 juga berpotensi sebagai pengendali fungi patogen akar. Isolat-

isolat Crb 74, 84, dan 95 berpotensi sebagai PGPR karena mempunyai

karakteristik dapat mensintesis IAA, dapat menginduksi perkecambahan secara

signifikan, dapat melarutkan fosfat dan dapat menghambat pertumbuhan

cendawan fitopatogen, serta tidak patogen pada tanaman. Hasil identifikasi

berdasarkan gen 16S rRNA menyatakan bahwa Pseudomonas spp. isolat Crb 60

dan 82 memiliki kemiripan dengan Pseudomonas fluorescens, isolat Crb 74 dan

93 memiliki kemiripan dengan Pseudomonas putida, sesangkan isolat Crb 84,

94, dan 95 memiliki kemiripan dengan Pseudomonas plecoglossicida.

@Hak cipta milik IPB, tahun 2008

Hak cipta dilindungi Undang-undang,

1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa

mencantumkan atau menyebutkan sumber

a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian,

penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau

tinjauan suatu masalah

b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB

2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh

karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

PENAPISAN PSEUDOMONAS SPP. DARI RIZOSFER

TANAMAN KEDELAI YANG BERPOTENSI SEBAGAI

RIZOBAKTERIA PEMACU PERTUMBUHAN TANAMAN

DAN BIOKONTROL FUNGI PATOGEN

RENELITA ARTATI

Tesis

Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar

Magister Sains pada

Departemen Biologi

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2008

Judul Tesia : Penapisan Pseudomonas spp. dari Rizosfer Tanaman

Kedelai yang Berpotensi sebagai Rizobakteria Pemacu

Pertumbuhan Tanaman dan Biokontrol Fungi Patogen

Nama : Renelita Artati

NIM : G351060091

Disetujui

Komisi Pembimbing

Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si Dr. Ir. Giyanto, M.Si

Ketua Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Biologi Dekan Sekolah Pascasarjana IPB

Dr. Ir. Dedy Duryadi S.,DEA Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, M.S.

Tanggal ujian: 12 Mei 2008 Tanggal lulus:

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. Anja Meryandini, MS.

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala limpahan

rahmat dan kemudahan-Nya sehingga tesis dengan judul Penapisan Pseudomonas

spp. dari Rizosfer Tanaman Kedelai yang Berpotensi sebagai Rizobakteria

Pemacu Pertumbuhan Tanaman dan Biokontrol Fungi Patogen ini berhasil

diselesaikan.

Terima kasih penulis sampaikan kepada Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si dan

Dr. Ir. Giyanto, M.Si selaku pembimbing atas bimbingan dan arahan yang

diberikan. Kepada Dr. Anja Meryandini, MS selaku penguji luar komisi kami

juga mengucapkan terima kasih atas saran yang diberikan. Penelitian ini didanai

oleh Kerjasama Kemitraan Penelitian Pertanian dengan Perguruan Tinggi

(KK3PT) Tahun 2007 kepada Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si dan kerjasama

Departemen Agama RI-IPB, oleh karena itu kami mengucapkan terima kasih.

Terima kasih kepada pengelola Laboratorium Mikrobiologi, Departemen Biologi

FMIPA IPB atas segala fasilitas dan penggunaan alat pengujian.

Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada Bapak dan Ibu, suami

dan anak-anak atas segala doa, curahan kasih sayang dan pengertiannya. Penulis

mengucapkan terima kasih kepada Rika, mbak Ari, dan teman-teman di

Laboratorium Mikrobiologi atas diskusi, saran, dukungan, dan bantuannya.

Terima kasih kepada pimpinan MAN Insan Cendekia Serpong dan teman-teman

sejawat atas dukungan moril dan materilnya sehingga dapat terselesaikannya tesis

ini.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Mei 2008

Renelita Artati

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 14 Maret 1965 dari ayah Suyadi

dan Ibu Sudiyatmini. Penulis merupakan putri pertama dari tiga bersaudara.

Pendidikan sarjana ditempuh di Jurusan Pendidikan Biologi, Fakultas Pendidikan

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam IKIP Negeri Jakarta, lulus tahun 1987.

Pada tahun 2006 penulis mendapat kesempatan untuk melanjutkan studi pada

Sekolah Pascasarjana IPB melalui program beasiswa dari Departemen Agama

Republik Indonesia.

Penulis bekerja sebagai guru bidang studi Biologi di Madrasah Aliyah

Negeri Insan Cendekia Serpong Banten, sejak tahun 1996.

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ............................................................................................ xii

DAFTAR GAMBAR.............................. ....................................................... ... xiii

PENDAHULUAN

Latar Belakang .................................................................................... 1

Tujuan ................................................................................................. 2

TINJAUAN PUSTAKA

Rizobakteria Pemacu Pertumbuhan Tanaman ...................................... 3

Fungi Patogen Akar ............................................................................. 9

Pseudomonas spp ................................................................................. 11

Analisis Sekuen Gen 16S rRNA ........................................................... 12

BAHAN DAN METODE

Isolasi dan Karakterisasi Fisiologi secara Parsial Pseudomonas spp. .. 14

Analisis Produksi Asam Indol Asetat (IAA) ........................................ 14

Uji Pelarutan Fosfat .............................................................................. 15

Uji Pemacuan Pertumbuhan Kecambah Kedelai .................................. 15

Uji Antagonisme Terhadap Cendawan Patogen. .................................. 16

Uji Reaksi Hipersensitivitas ................................................................. 16

Analisis Genetik secara Parsial Pseudomonas spp.Berdasarkan

Sekuen Gen 16S rRNA ........................................................................ 17

HASIL

Isolasi dan Karakterisasi Fisiologi secara Parsial Pseudomonas spp ... 18

Karakteristik Pseudomonas spp. sebagai Pemacu Pertumbuhan ......... 18

Karakteristik Pseudomonas spp sebagai Agen Biokontrol ................. 25

Analisis Genetik secara Parsial Pseudomonas spp. Berdasarkan

Sekuen Gen 16S rRNA ......................................................................... 27

PEMBAHASAN

Isolasi dan Karakterisasi Fisiologi secara Parsial Pseudomonas spp ... 29

Karakteristik Pseudomonas spp. sebagai PGPR ................................... 29

Analisis Genetik secara Parsial Pseudomonas spp. Berdasarkan

Sekuen Gen 16S rRNA ........................................................................ 36

KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan .......................................................................................... 37

Saran .................................................................................................... 37

DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................... 38

LAMPIRAN ..................................................................................................... 42

DAFTAR TABEL

Halaman

1. Potensi Pseudomonas spp. dalam memproduksi IAA dan melarutkan

fosfat. ............................................................................................................. 20

2. Hasil uji pemacuan pertumbuhan tanaman kedelai varietas Slamet yang

diinokulasi dengan Pseudomonas spp. ...................................................... 22

3. Penghambatan Pseudomonas spp. pada uji antagonisme terhadap

cendawan patogen in vitro. ......................................................................... 25

4. Hasil analisis homologi sekuen gen 16S rRNA dari isolat Pseudomonas

spp. pemacu petumbuhan tanaman menggunakan program BLASTN ...... 28

5. Potensi isolat Pseudomonas spp. yang mampu memacu pertumbuhan

tanaman kedelai dan nonpatogen ............................................................... 35

xii

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1. Diagram alir lintasan biosintesis IAA pada bakteri ................................. 5

2. Penampilan Isolat Pseudomonas spp ......................................................... 19

3. Zona bening pada uji pelarutan fosfat ....................................................... 20

4. Reaksi hipersensitivitas tanaman tembakau terhadap Pseudomonas spp .. 21

5. Pertumbuhan kecambah kedelai berumur tujuh hari ................................. 24

6. Antagonisme antara Pseudomonas spp. dengan cendawan patogen ........ 26

7. Hasil amplifikasi PCR Gen 16S rRNA isolat Pseudomonas spp . ............ 27

8. Dendogram filogenetik yang memperlihatkan hubungan kekerabatan

antara isolat-isolat Pseudomonas spp. yang memacu

pertumbuhan.............................................................................................. 28

xiii

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Penggunaan pupuk dan pestisida secara berlebihan dan terus-menerus pada

pertanian modern telah menimbulkan dampak negatif diantaranya terhadap

kondisi tanah dan lingkungan, yaitu pencemaran dan eutrofikasi. Penggunaan

pestisida juga dapat menimbulkan resistensi hama dan penyakit tumbuhan

terhadap bahan beracun tersebut.

Permasalahan yang timbul pada pertanian modern tersebut dan kesadaran

akan lingkungan yang sehat, mendorong penggalian berbagai potensi alam yang

ramah lingkungan. Perkembangan di bidang bioteknologi telah menunjukkan

hasil yang menggembirakan, diantaranya penggunaan mikroorganisme, terutama

bakteri dan cendawan, yang sangat potensial sebagai agen pupuk hayati dan

pengendali hayati (biocontrol).

Di bidang pertanian, penggunaan produk-produk mikroba mempunyai

beberapa keuntungan dibanding penggunaan bahan kimia karena: (i) produk-

produk mikroba lebih aman; (ii) senyawa kimia dan mikroba itu sendiri tidak

akan terakumulasi dalam rantai makanan; (iii) pengembangbiakan mikroba dapat

diatur untuk pemakaian berulang; (iv) organisme target jarang menjadi resisten

seperti pada kasus ketika agen-agen kimia digunakan untuk mengeliminasi hama

yang berbahaya; dan (v) sebagai agen pengembangan biokontrol tidak berbahaya

baik dalam proses ekologis maupun lingkungan (Gloud 1990).

Bakteri-bakteri tertentu berperan dalam bidang pertanian diantaranya

Azotobacter, Azospirillum, Pseudomonas, Acetobacter, Burkholderia dan

Bacillus; karena dapat berkoloni di rizosfer, di permukaan akar, atau bahkan di

ruang permukaan interseluler tanaman. Mikroorganisme ini mampu

memproduksi atau mengubah konsentrasi hormon pertumbuhan asam indol asetat

(indol acetic acid, IAA), asam giberelin, sitokinin dan etilen, menambat N2,

menekan pertumbuhan mikroorganisme fitopatogen dengan memproduksi

siderofor, -1,3-glukanase, kitinase, antibiotik dan sianida, melarutkan fosfat dan

menyediakan nutrien lainnya. Bakteri-bakteri dengan karakteristik tersebut

dikelompokkan kedalam bakteri yang mampu memacu pertumbuhan tanaman

(Plant Growth promoting Rhizobacteria, PGPR) (Glick 1995).

Salah satu mikroorganisme yang ditemukan secara luas di dalam ekosistem

tanah rizosfer adalah Pseudomonas spp. Pseudomonas adalah bakteri berbentuk

batang, lurus, atau sedikit bengkok, berdiameter 0,5 – 1, 0 μm dengan panjang

1,5 – 5,0 μm, gram negatif, motil dengan satu atau beberapa flagel, aerob, dan

tidak berspora. Beberapa galur Pseudomonas mampu meningkatkan panjang akar

tanaman kacang tanah secara signifikan, memproduksi siderofor dan IAA,

melarutkan fosfat, dan menghambat pertumbuhan cendawan secara in vitro (Dey

et al. 2004). Dengan adanya kemampuan ini, beberapa Pseudomonas spp.

merupakan bakteri yang dapat berperan sebagai pemacu pertumbuhan tanaman

dan sekaligus sebagai agen biokontrol mikroba patogen tanaman.

Penelitian mengenai peran Pseudomonas spp. sebagai PGPR telah

dilaporkan pada banyak tanaman pangan, namun pada kedelai sangatlah terbatas.

Kedelai merupakan komoditas pertanian penting di Indonesia yang hingga kini

produksinya belum dapat mencukupi kebutuhan. Salah satu usaha untuk

meningkatkan produksi kedelai adalah dengan memperbaiki kualitas

pertumbuhan dan kesehatan tanaman. Sehubungan dengan hal tersebut maka

perlu dilakukan penelitian untuk mengisolasi spesies Pseudomonas dari rizosfer

kedelai yang mempunyai karakteristik sebagai PGPR dan biokontrol fungi

patogen akar tanaman kedelai. Isolat-isolat yang mempunyai karakter khusus

diidentifikasi dan dianalisis secara molekuler berdasarkan gen penyandi 16S

rRNA.

Tujuan

Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan mengkarakterisasi rizobakteria asal

rizosfer tanaman kedelai, Pseudomonas spp., yang diduga berpotensi sebagai

pemacu pertumbuhan tanaman dan biokontrol fungi patogen akar. Karakter yang

diteliti meliputi kemampuannya dalam produksi IAA, pemacuan pertumbuhan in

vitro, melarutkan fosfat, menghambat pertumbuhan fungi patogen, dan

mengidentifikasinya berdasarkan gen penyandi 16S rRNA.

2

TINJAUAN PUSTAKA

Rizobakteria Pemacu Pertumbuhan (Plant Growth-Promoting Rhizobacteria)

Mikroorganisme tumbuh subur di tanah, terutama di daerah rizosfer

tanaman. Sejumlah spesies bakteri dan cendawan mempunyai hubungan dan

membentuk sistem holistik dengan tumbuhan (Wu et al. 2005). Interaksi mikroba

dengan tanaman di rizosfer dapat berupa hubungan yang menguntungkan, netral,

berubah-ubah, atau mengganggu pertumbuhan tanaman (Husen 2003). Interaksi

antara mikroorganisme tanah dan tumbuhan dapat berpengaruh terhadap

pertumbuhan tanaman baik secara langsung maupun tidak langsung dengan

menghasilkan metabolit yang memodifikasi keadaan rizosfer (Kapulnik & Okon

2002). Pengaruh secara tidak langsung terjadi ketika mikroorganisme tersebut

mengurangi atau mencegah perusakan satu atau lebih organisme fitopatogen,

sedangkan pengaruh langsung terjadi ketika mikroorganisme tersebut mesintesis

senyawa yang dibutuhkan tanaman atau memudahkan pengambilan nutrien

tertentu dari lingkungan (Glick 1995).

Sejumlah bakteri patut mendapat perhatian di bidang pertanian karena

berperan dalam berbagai proses kunci pada ekosistem seperti dalam biokontrol

patogen tanaman, siklus nutrisi dan persemaian. Bakteri tersebut mempunyai

karakteristik mampu memacu pertumbuhan (Plant-Growth Promoting

Rhizobacteria, PGPR). Terdapat dua istilah : PGPR interseluler (iPGPR) jika

bakteri terletak di dalam sel tanaman, menghasilkan bintil dan terletak dalam

struktur khusus, dan PGPR ekstraseluler (ePGPR) jika bakteri hidup di luar sel

tanaman dan tidak menghasilkan bintil, tetapi meningkatkan pertumbuhan

tanaman dengan menghasilkan senyawa yang secara langsung merangsang

pertumbuhan tanaman, menambah resistensi tanaman terhadap penyakit, atau

meningkatkan mobilisasi nutrien tanah. ePGPR dapat dibagi menjadi 3 tipe

berdasarkan tingkat hubungan dengan akar tanaman: yang hidup dekat akar,

tetapi tidak bersentuhan dengan akar; yang mengolonisasi permukaan akar; dan

yang hidup di ruang antar sel korteks akar (Gray & Smith 2005). Kelompok

bakteri yang mempunyai kemampuan sebagai PGPR tersebut diantaranya

Azotobacter, Azospirillum, Pseudomonas, Acetobacter, Burkholderia dan

Bacillus. (Glick 1995).

PGPR mampu memproduksi atau mengubah konsentrasi hormon

pertumbuhan asam indol asetat (indol acetic acid, IAA), asam giberelin, sitokinin

dan etilen, menambat N2, menekan pertumbuhan mikroorganisme fitopatogen

dengan memproduksi siderofor, -1,3-glukanase, kitinase, antibiotik dan sianida,

melarutkan fosfat dan menyediakan nutrien lainnya (Glick 1995).

Produksi IAA oleh PGPR

Bakteri PGPR umumnya menghasilkan fitohormon seperti auksin,

sitokinin, dan giberelin dengan auksin sebagai perhatian utama. Indol Acetic Acid

(IAA) merupakan hormon utama pada tanaman yang mengontrol berbagai proses

fisiologis penting termasuk pertumbuhan dan pembelahan sel, diferensiasi

jaringan, dan respon terhadap cahaya dan gravitasi (Leveau & Lindow 2005).

IAA terdapat di akar dan di bagian tumbuhan lainnya dalam konsentrasi yang

hampir sama. Karena tumbuhan mungkin tidak mensintesis IAA dalam jumlah

cukup untuk pertumbuhan optimalnya, maka pemberian auksin dapat memacu

pemanjangan akar, tetapi hanya pada konsentrasi yang sangat rendah (10-7

sampai

10-13

M, bergantung pada spesies dan umur akar tanaman) (Salisbury & Ross,

1992).

Bakteri penghasil IAA mempunyai kemampuan untuk membantu berbagai

proses tersebut di atas dengan memasukkan IAA ke dalam pool auksin tanaman.

Akar merupakan organ tanaman yang paling sensitif terhadap fluktuasi kadar

IAA, dan responnya pada peningkatan jumlah IAA eksogenus meluas dari

pemanjangan akar primer, pembentukan akar lateral dan akar adventif, sampai

penghentian pertumbuhan (Leveau & Lindow 2005).

Pada bakteri, triptofan (Trp) merupakan prekursor utama dalam biosintesis

IAA. Triptofan merupakan salah satu asam amino aromatik yang dihasilkan dari

senyawa berkarbon 7, yakni 3-deoksi-7-fosfo-D-asam arabinoheptulosonat yang

merupakan hasil kondensasi dari D-eritrosa-4-fosfat (senyawa berkarbon 4) dan

fosfo-enol-piruvat (senyawa berkarbon 3). Biosintesis triptofan melibatkan

banyak gen yang membentuk suatu kelompok di dalam kromosom. Manulis

(1998) mengemukakan beberapa lintasan dalam sintesis IAA pada bakteri yang

4

melibatkan senyawa intermediet indole-3-pyruvate (IpyA), indole-3-acetamide

(IAM), tryptamine, indole-3-acetonitrile. Tetapi dua jalur utama yang ada pada

semua bakteri adalah lintasan IAM dan IpyA (Gambar 1). Lintasan IAM terdapat

pada semua bakteri pembentuk bintil akar (Bradyrhizobium japonicum,

Rhizobium fredii), Azospirillum brasilense dan Streptomyces. Menurut Brandl et

al (1996) biosintesis IAA melalui IPyA dijumpai pada tanaman tingkat tinggi dan

beberapa jenis bakteri meliputi Rhizobium spp, Azospirillum spp, Rolstonia

solanacearum dan Enterobacter cloacae.

Reaksi awal pengubahan triptofan menjadi indol-3-piruvat dikatalisis oleh

aminotransferase aromatik, dimana empat enzim berhasil diidentifikasi pada A.

lipoferum. Enzim-enzim yang ditemukan ini spesifik terhadap berbagai asam

amino aromatik dan tidak hanya pada triptofan, sehingga deteksi pada protein-

protein ini kurang membuktikan bahwa IAA disintesis melalui indole-3-piruvat

pada Azospirillum (Elmerich 1992). Produksi IAA meningkat sesuai dengan

peningkatan konsentrasi triptofan dari 1-100 g/ml (Ahmad et al. 2005)

Konsentrasi IAA juga meningkat seiring dengan umur kultur sampai bakteri

mencapai fase stasioner. Pengocokan lebih disukai untuk memproduksi IAA,

Triptofan

Indole-acetamide typtamine Indole-3-pyruvic acid (IpyA)

Indole-3-acetic acid (IAA) Indole-3-acetic acid

Indole-3-acetaldehyde

Indole-3-acetic acid

Gambar. 1. Diagram alir lintasan biosintesis IAA pada bakteri (Brandl et al.

1996; Manulis 1998). Gen-gen iaaM, iaaH dan ipdC masing-

masing menyandikan triptofan-2-monooksigenase, indol-3-

asetamid hidrolase dan indol-piruvat dekarboksilase.

iaaM

iaaH

ipdC

5

terutama pada media yang mengandung nitrogen, sedangkan fitohormon lainnya

juga terdeteksi pada medium kultur, yakni giberelin dan senyawa serupa sitokinin

(Tien et al. 1979).

Produksi IAA tidak berfungsi nyata sebagai hormon dalam sel bakteri,

dimungkinkan terdapat dalam sel bakteri karena hormon tersebut berperan

penting dalam interaksi antara bakteri dan tanaman. Bakteri yang memproduksi

IAA akan menstimulasi pertumbuhan sistem perakaran inang. (Patten & Glick

2002).

Pengaruh IAA pada tanaman bergantung pada konsentrasi auksin yaitu,

konsentrasi IAA yang rendah dapat memacu pertumbuhan tanaman sedangkan

konsentrasi IAA yang tinggi dapat menghambat pertumbuhan tanaman. Tanaman

yang berbeda dapat memberi respon yang berbeda terhadap variasi konsentrasi

IAA dan tipe mikrooganisme (Ahmad et al. 2005). Campbell et al. (2006) pada

penelitian pengaruh auksin pada tanaman kacang tanah mengemukakan bahwa

IAA memacu pertumbuhan batang hanya dalam kisaran konsentrasi tertentu.

Konsentrasi IAA diatas 0.9 g/l dapat menghambat pemanjangan batang kacang

tanah, hal ini dimungkinkan karena konsentrasi IAA yang tinggi dapat

menginduksi produksi etilen, hormon yang biasanya mengakibatkan efek

berlawanan dengan auksin. Di lain pihak, konsentrasi auksin yang cukup tinggi

untuk dapat memacu pemanjangan batang adalah kisaran konsentrasi auksin

yang menghambat pemanjangan akar.

Pelarutan Fosfat oleh PGPR

Sejumlah besar fosfat anorganik terlarut yang ditambahkan ke tanah saat

pemberian pupuk di lahan pertanian dengan cepat berubah menjadi bentuk yang

tidak terlarut segera setelah ditaburkan dan menjadi tidak tersedia bagi tanaman.

Fosfor yang tersedia bagi tanaman ada di dalam larutan tanah sebagai anion-

anion ortofosfat, terutama H2PO4- dan HPO4

2-. Fosfat anorganik dan organik

padat ditemukan dalam bentuk yang labil dan sangat tidak larut di dalam tanah,

sehingga tingkat efektivitas penyediaan fosfat sangat bervariasi (Rodriguez &

Fraga 1999).

6

Mikroba pelarut fosfat adalah spesies bakteri dan cendawan yang

mempunyai kemampuan untuk melarutkan senyawa fosfat anorganik yang tidak

terlarut seperti trikalsium fosfat, dikalsium fosfat, hidroksiapatit, dan batuan

fosfat. Beberapa bakteri pelarut fosfat diantaranya adalah Pseudomonas,

Bacillus, dan Rhizobium, yang potensial dalam meningkatkan tersedianya fosfor

bagi tanaman, terutama di tanah yang mengandung banyak endapan fosfat

(Rodriguez & Fraga 1999). Ketika tanah kekurangan fosfat bagi tanaman dan pH

tanah sangat kondusif untuk pelarutan fosfat, mikroba pelarut fosfat berperan

penting dalam pertumbuhan tanaman, hasil panen dan pengambilan nutrien

(Altomare et al. 1999).

Mikroba pelarut fosfat yang hidup bebas selalu ada di dalam tanah. Fallah

(2006) menyatakan bahwa dari 50 sampel tanah yang dikoleksi dari bagian utara

Iran mengandung bakteri dan cendawan pelarut fosfat, dengan jumlah populasi

bakteri antara 106 sampai 10

9 sel/g tanah atau dengan rasio rata-rata bakteri

pelarut fosfat terhadap total populasi bakteri adalah 3,98%.

Mekanisme utama pelarutan fosfat pada bakteri adalah produksi asam

organik dan asam fosfatase. Asam glukonat dan asam 2-ketoglukonat adalah

asam-asam organik yang dihasilkan oleh Pseudomonas, Erwinia, Burkholderia,

Rhizobium, dan Bacillus (Igual et al. 2001). Asam-asam organik lain seperti asam

laktat, isovalerat, isobutirat, asetat, glikonat, oksalat, malonat, dan suksinat juga

dihasilkan oleh berbagai bakteri pelarut fosfat (Rodriguez & Fraga 1999).

Kemampuan asam organik dalam melarutkan fosfat dapat terjadi melalui

tiga mekanisme yaitu asidifikasi, pengkelatan, dan reaksi pertukaran ligan

(Arcand & Schneider 2006). Pada mekanisme asidifikasi, asam organik berperan

dalam menurunkan pH larutan, karena asam organik akan terdisosiasi dalam

suatu kesetimbangan yang tergantung pada pH menjadi anion atau kationnya. Ion

H+ akan melarutkan batuan fosfat dengan mengubah kesetimbangan. Mekanisme

kedua, anion asam organik dapat melarutkan fosfat melalui reaksi pengkelatan

yang melibatkan pembentukan dua atau lebih ikatan koordinat antara suatu anion

atau molekul polar dan suatu kation, sehingga menghasilkan struktur cincin yang

kompleks. Anion asam organik dengan hidroksil yang mengandung oksigen

mempunyai kemampuan untuk membentuk kompleks yang stabil dengan kation-

7

kation seperti Ca2+

, Mg2+

, Fe3+

, dan Al3+

yang sering berikatan dengan fosfat.

Terbentuknya kompleks tersebut pada permukaan mineral mengakibatkan anion

asam organik kehilangan ikatan kation-oksigen dari struktur mineralnya dan

mengkatalisis pelepasan kation ke larutan. Anion asam organik secara terus-

menerus mengubah keseimbangan reaksi pemecahan dengan membentuk

kompleks dengan kation di larutan, yang secara efektif menurunkan titik jenuh

larutan. Mekanisme ketiga terjadi melalui kompetisi dengan anion-anion fosfat

yang terserap ke permukaan kristal Fe(OH)3 dan Al(OH)3. Anion asam organik

dapat berperan memobilisasi fosfor melalui reaksi pertukaran ligan. Hasil

penelitian menunjukkan bahwa mobilisasi fosfor berhubungan dengan pertukaran

ligan antara sitrat dan fosfat yang terserap ke sisi Fe dan Al daripada hasil

pemecahan dari presipitat Ca-P. Di tanah, sitrat dapat memobilisasi fosfat ketika

terserap pada tingkat yang lebih besar dari 10 mol/g tanah, tetapi di bawah nilai

kritis ini sitrat tidak akan mengalahkan kompetisi fosfat untuk sisi adsorbsi tanah.

Sejumlah besar fosfat yang diabsorbsi dari tanah digunakan untuk menghasilkan

ATP, salah satu di antaranya dibutuhkan dalam fiksasi nitrogen (Dey et al. 2004).

PGPR sebagai Agen Biokontrol yang Prospektif

Secara umum istilah biokontrol mengacu pada penggunaan organisme

hidup untuk membatasi pertumbuhan dan proliferasi organisme lainnya yang

tidak diinginkan. Mikrorganisme rizosfer dapat menjadi garis pertahanan

terdepan melawan serangan patogen sehingga ideal digunakan sebagai agen

biokontrol. Biokontrol melibatkan mikroorganisme penekan penyakit untuk

meningkatkan kesehatan tanaman. Penekanan penyakit oleh agen biokontrol

adalah manifestasi interaksi antara tanaman, patogen, agen biokontrol, komunitas

mikroba disekitar tanaman, dan lingkungan fisik (Siddiqui 2006).

Banyak PGPR yang menguntungkan karena meningkatkan produksi

pertanian melalui mekanisme antibiosis dan biokontrol; serta mampu menekan

sejumlah bakteri, cendawan, nematoda, dan virus yang bersifat patogen pada

tanaman ( Whipps 2001). Spesies Pseudomonas yang berfluoresen dan Bacillus

dapat mensekresi metabolit ekstraseluler yang berperan aktif dan sangat efektif

dalam menghambat dan menekan pertumbuhan mikroorganisme patogen.

8

PGPR Pseudomonas spp. menghasilkan berbagai antibiotik termasuk

antifungi (fenazin, pirolnitrin, pioluteorin, diasetil floroglusinol, ramnolipid, dll),

antibakteri (asam pseudomonat, azomisin), antitumor (FR901463, sepafungins),

dan anti virus (karalisin) (Fernando et al. 2006). Senyawa-senyawa tersebut dapat

menyebabkan modifikasi struktural dinding sel dan perubahan

biokimiawi/fisiologis pada sintesis protein yang terlibat dalam mekanisme

pertahanan tanaman. Lipopolisakarida, siderofor, dan asam salisilat adalah faktor

utama pada PGPR yang menginduksi sistem pertahanan (Antoun & Prevost 2006,

Siddiqui 2006). Whipps (2001) melaporkan bahwa galur P. fluorescence tipe liar

mampu melindungi tanaman ketimun dari Pythium ultimum. Pseudomonas spp.

dapat menghasilkan hidrogen sianida yang menghambat beberapa cendawan

fitopatogen. Strain PGPR lainnya dapat menghasilkan enzim hidrolase yang

menghidrolisis dinding sel cendawan. P. stutzeri menghasilkan kitinase dan

laminarinase ektraseluler yang mampu menghancurkan miselium cendawan

Fusarium solani (Lim et al. 1991).

Enzim kitinase yang diproduksi oleh Serratia marcescens digunakan

untuk melawan Sclerotium rolsfii. -1,3-glukanase yang disintesis oleh

Paenibacillus sp. galur 300 dan Streptomyces sp. galur 385 dapat melisis dinding

sel Fusarium oxysporum f. Sp. cucumerinum. Bacillus cepacia mensintesis -1,3-

glukanase untuk menghancurkan dinding sel Rizoctonia solani, S. rolsfii, dan

Pythium ultimum (Chompant et al. 2005).

Fungi Patogen Akar

Interaksi patogenik dapat terjadi antar mikroorganisme, seperti

parasitisme antara satu fungi dengan fungi lainnya (mikoparasitisme) maupun

produksi antibiotik oleh organisme yang menghambat atau membunuh

mikroorganisme lainnya. Interaksi patogenik lainnya melibatkan mikroorganisme

dan akar tanaman yang mengakibatkan penyakit tanaman. Penyakit tanaman yang

bersumber dari tanah dapat disebabkan oleh nematoda, kutu, bakteri, virus, dan

fungi. Beberapa fungi menyebabkan kerusakan lebih parah pada tanaman

pertanian dan interaksinya dengan patogen tanaman lainnya umumnya

mempunyai efek sinergis pada penyakit tanaman.

9

Fusarium oxysporum adalah fungi saprofit yang tumbuh dan dapat

bertahan hidup dalam periode yang lama pada bahan organik, di dalam tanah dan

di rizosfer berbagai tanaman. Beberapa spesies Fusarium menyebabkan layu atau

busuk akar sedangkan yang lainnya nonpatogen. Baik yang patogen maupun yang

nonpatogen dapat melakukan penetrasi pada akar tanaman (Bolwerk &

Lugtenberg 2006). Fumonisin dan trikotekanes merupakan toksin utama yang

diproduksi oleh Fusarium. Cendawan ini menyerang tanaman pada bagian akar

tanaman dengan menggunakan pembuluh sporangia dan miseliumnya. Serangan

tersebut terjadi melalui ujung akar, luka pada akar, atau melalui akar lateral

(Gonsalves et al. 1993). Hasil penelitian terdahulu menyatakan bahwa

Pseudomonas flourescent dapat berperan sebagai agen biokontrol terhadap

Fusarium sp. pada tanaman tomat. B. cepacia dan B. gladioli di dalam rizosfer

memiliki kemampuan menyerang F. oxysporum f. sp cubense yang menginfeksi

tanaman tersebut dengan mengkolonisasi permukaan hifa dan makrospora (Dikin

et al. 2006).

Cendawan Sclerotium rolfsii dapat menyebabkan busuk akar pada

berbagai tanaman termasuk kedelai dengan gejala infeksi layu pada pucuk

tanaman akibat kerusakan pada pangkal batang dan akar. Fitopatogen ini

dicirikan dengan pertumbuhan miselia yang menyerupai kapas dan adanya

bulatan sklerotia berwarna coklat muda yang kemudian menjadi coklat gelap

ketika tua. S. rolsfii dapat bertahan hidup pada sisa tumbuhan yang mati di dalam

tanah dalam bentuk sklerotia, kemudian dapat tumbuh dan menyerang tanaman

inang, menyebabkan nekrosis pada dinding selnya. Enzim selulase dan kitinase

dihasilkan untuk mendukung kemampuannya menyerang tanaman inang.

Terdapat sejumlah mikroorganisme yang mampu melawan Sclerotium rolfsii,

diantaranya Trichoderma harzianum, T. viride, Bacillus subtilis, Penicillium spp

dan Glicodium virens (Moussa & Tharwat 2007).

Rhizoctonia solani adalah cendawan patogen yang dapat menyebabkan

penyakit busuk daun pada padi, busuk pangkal batang (damping-off) pada

tanaman gula bit, dan busuk akar pada kedelai. Menurut Bertagnolli et al. (1996)

cendawan ini mengeluarkan endoproteinase, eksokitinase, glukanase, dan

fosfolipase yang semuanya berpotensi merusak dinding sel/integritas membran

10

sel tanaman. Hasil penelitian Vidhyasekaran et al. (1997) menyatakan bahwa R.

solani menghasilkan toksin karbohidrat yang mengandung glukosa, manosa, N-

asetilgalaktosamin, dan N-asetilglukosamin. Beberapa agen biokontrol fungi

antagonis melawan Rhizoctonia diantaranya Trichoderma dan Bacillus

megaterium.

Pseudomonas spp.

Pseudomonas adalah bakteri berbentuk batang, lurus, atau sedikit bengkok,

tetapi tidak berpilin, berdiameter 0,5 – 1, 0 μm dengan panjang 1,5 – 5,0 μm.

Bersifat Gram negatif. Motil dengan satu atau beberapa flagel polar; jarang yang

nonmotil. Aerob, mempunyai tipe metabolisme respirasi terbatas dengan oksigen

sebagai akseptor elektron terakhir; pada beberapa kasus nitrat dapat digunakan

sebagai alternatif akseptor elektron terakhir, yang memungkinkan pertumbuhan

pada keadaan anaerob (Pallroni & Moore 2004).

Menurut Madigan et al. (2000), Pseudomonas tidak berspora, bersel satu

atau bersel banyak, bertunas, respirasi metabolisme, tidak pernah fermentatif,

walaupun dapat menghasilkan sejumlah kecil asam dari glukosa aerobik;

menggunakan molekul berbobot rendah atau senyawa organik, bukan polimer,

beberapa kemolitotrof, menggunakan H2 atau CO2 sebagai satu-satunya donor

elektron, beberapa dapat menggunakan arginin sebagai sumber energi anaerob.

Melakukan metabolisme glukosa melalui jalur Entner-Doudoroff. Dua enzim

kunci pada jalur Entner-Doudoroff adalah 6-fosfoglukonat dehidrase dan 2-keto-

3-deoksiglukosafosfat aldolase. Menghasilkan oksidase (tetapi bakteri usus tidak

menghasilkan oksidase); menghasilkan katalase; tidak mempunyai pigmen

fotosintetik (yang membedakannya dari bakteri ungu nonsulfur); tidak

menghasilkan senyawa indol; tidak dapat memfermentasi asam-asam campuran;

tidak dapat membentuk 2,3-butanadiol. Kebutuhan nutrisinya sederhana dan

tumbuh secara kemoorganotrof pada pH netral dan kisaran temperatur mesofilik.

Pseudomonas ditemukan secara luas di dalam ekosistem tanah dan air,

mendegradasi sejumlah besar senyawa organik, berinteraksi dengan tanaman dan

berasosiasi dalam rizosfer yang bersifat menguntungkan di bidang pertanian, dan

sebagian lainnya bersifat patogen yang berbahaya. Pseudomonas dan

pseudomonad (yaitu, bakteri yang menyerupai Pseudomonas) terdiri atas takson

11

organisme yang secara metabolik mampu menggunakan senyawa organik dan

anorganik dalam kisaran yang luas dan hidup di bawah kondisi lingkungan yang

beragam (Pallroni & Moore 2004).

Menurut Loccoz dan Defago (2004), banyak galur Pseudomonas

menguntungkan bagi tanaman secara langsung, yaitu melalui pemacuan

pertumbuhan dan peningkatan kesehatan tanaman, dan/atau secara tidak langsung

melalui penghambatan pada, atau kompetisi dengan patogen, parasit, atau

tumbuhan kompetitor. Tidak semua pseudomonad mampu berperan sebagai

biokontrol, dan diantaranya terlihat melakukan beberapa mekanisme biokontrol

yang berbeda. Interaksi biotik penting untuk menekan fitoparasit dan terjadi

ketika pseudomonad biokontrol berasosiasi dengan tanaman untuk mengurangi

fitoparasit dalam tanah.

Analisis Sekuen Gen 16S rRNA

Membandingkan gen atau genom dua spesies adalah cara paling tepat

untuk melacak nenek moyang. Pembandingan dapat dilakukan melalui analisis

sekuen DNA (DNA sequence analysis) yaitu, pembandingan urutan nukleotida

bagian dari DNA. Dalam hal ini digunakan alat polymerase chain reaction (PCR)

untuk mengklon bagian DNA, yang kemudian dilanjutkan dengan pengurutan

basa secara otomatis menggunakan mesin pengurut DNA (DNA sequencer). Para

ahli sistematika sekarang menggunakan data sekuen nukleotida dari DNA

nukleus, mtDNA atau keduanya untuk menarik kesimpulan filogeni, membentuk

pohon filogenetik, dan mengelompokkan organisme (Madigan 2000).

Woose (1987) menggunakan gen 16S rRNA untuk mengklasifikasikan

makhluk hidup ke dalam tiga kelompok yakni Archaea, Bacteria dan Eukarya.

Daerah gen 16S rRNA merupakan daerah terkonservatif pada makhluk hidup dan

menunjukkan ciri spesifik pada setiap spesies. Ribosomal RNA (rRNA) adalah

salah satu molekul RNA yang berperan dalam pembentukan kerangka ribosom

dan merupakan organel penting dalam proses translasi RNA untuk membentuk

asam amino (Glick & Pasternack 2003).

Molekul rRNA bersifat homolog baik secara fungsional ataupun

evolusinya pada organisme yang berbeda dan merupakan molekul yang

12

strukturnya terkonservatif. Ukuran molekul rRNA yang cukup besar

memudahkan proses isolasi terutama komponen 16S rRNA yang telah banyak

dijadikan sumber analisis filogeni dan pengklasifikasian makhluk hidup (Broun-

Howland et al. 1992).

13

BAHAN DAN METODE

Isolasi dan Karakterisasi Fisiologi Pseudomonas spp. secara Parsial

Sebanyak 1 gram tanah sampel tanah rizosfer dari perkebunan kedelai asal

Cirebon dimasukkan ke dalam 10 ml larutan garam fisiologis 0.85 % ( 2.55 g

NaCl dalam 300 ml akuades). Kemudian divortex, selanjutnya diencerkan berseri

hingga 10-2

, 10-3

, 10-4

, dan 10-5

. Dengan menggunakan pipet mikro 1 ml, diambil

0.1 ml dan disebarkan diatas media agar-agar King’s B (komposisi 4.5 g agar-

agar, 6 g pepton, 0.45 g K2HPO4, 0.45 g MgSO4, 4.5 ml gliserol dalam 300 ml

aquades), menggunakan batang penyebar. Cawan selanjutnya diinkubasi pada

suhu 28 0C selama 24 jam. Koloni yang tumbuh kemudian dimurnikan dengan

menggunakan media yang sama. Identifikasi Pseudomonas spp. meliputi

pewarnaan gram, uji katalase, dan uji oksidase, mengikuti Bergey’s Manual of

Determinative Bacteriology.

Analisis Produksi Asam Indol Asetat (IAA)

IAA yang diproduksi oleh Pseudomonas spp. diukur dengan metode

colorimetry dengan reagen Salkowski (komposisi 150 ml H2SO4 pekat, 250 ml

Aquades, 7.5 ml FeCl3.6 H2O 0.5 M) menggunakan spektrofotometer pada

panjang gelombang 510 nm (Aryantha et al. 2004). Isolat diinokulasikan kedalam

5 ml media King’s B cair yang telah ditambahkan triptofan 0.1 mM (dari stok 20

mg/ml), diinkubasi dan dikocok pada kecepatan 110 rpm pada suhu ruang selama

48 jam dalam keadaan gelap. Masing-masing diambil 3 ml, kemudian

dimasukkan ke dalam 2 eppendorf, masing-masing 1.5 ml (dikerjakan secara

duplo), selanjutnya disentrifuse pada 10000 rpm selama 15 menit. Tiap eppendorf

diambil 1 ml supernatannya dimasukkan ke dalam tabung reaksi dan

ditambahkan ke dalamnya 4 ml reagen Salkowski lalu diinkubasi selama 30

menit dalam ruang gelap pada suhu ruang. Kandungan IAA diukur dengan

menggunakan spektrofotometer (spectronic 20) pada panjang gelombang 510 nm.

Konsentrasi IAA yang terdapat dalam kultur ditentukan berdasarkan kurva

standar IAA.

Uji Pelarutan Fosfat

Uji pelarutan fosfat dilakukan menggunakan metode standar yaitu dengan

cara menumbuhkan isolat-isolat Pseudomonas spp. pada media agar-agar

Pikovskaya yang mengandung trikalsium fosfat (Rao & Sinha 1962; Rao 1999).

Komposisi media tersebut yaitu 5 g glukosa, 2.5 g Ca3(PO4)2, 0,1 g NaCl, 0.1 g

KCl, 0.05 g MgSO4.7H2O, 1.25 mg MnSO4.2H2O, 1.25 mg FeSO4.7H2O, 0.25 g

ekstrak khamir, 0.5 g (NH4)2SO4, 7.5 g agar-agar dalam 500 ml akuades. Isolat

Pseudomonas spp. digoreskan pada media tersebut, setelah inkubasi pada suhu 28

0C selama 3 hari, zona bening yang terdapat di sekeliling koloni diamati dan

diukur indeks pelarutan fosfatnya berdasarkan rumus:

Indeks Pelarutan fosfat = diameter zona bening – diameter koloni

diameter koloni

Uji Pemacuan Pertumbuhan Kecambah Kedelai

Uji perkecambahan biji menggunakan kedelai varietas Slamet. Biji

kedelai disterilisasi permukaannya dengan cara direndam dalam etanol 95%

selama 10 detik, kemudian direndam dalam H2O2 5% selama 5 menit dan dibilas

dengan aquades steril sebanyak 7 kali untuk menghilangkan residu peroksida.

Biji yang telah disteril diletakkan pada cawan yang dialasi kertas saring

yang telah dibasahi dengan aquades steril, kemudian diletakkan di ruang gelap

selama 24 jam. Isolat Pseudomonas ditumbuhkan dalam media agar-agar King’s

B pada suhu ruang selama 24 jam, kemudian diresuspensikan dengan 5-8 ml NB.

Sembilan biji yang telah mulai berkecambah diletakkan dalam cawan dengan

media agar-agar 1% dan masing-masing biji diberi 100 μl kultur bakteri (± 8 x

109 sel/ml). Perkecambahan tanpa kultur bakteri digunakan sebagai kontrol.

Cawan tersebut diinkubasi selama 7 hari pada suhu ruang dalam kondisi gelap.

Kemudian dilakukan pengukuran panjang batang, panjang akar primer, dan

jumlah akar lateral. Setiap perlakuan diulang sebanyak tiga kali. Hasil

pengukuran dianalisis secara statistik dengan one-way Analysis of Variance

(ANOVA) menggunakan program SPSS dan diuji lanjut dengan Duncan.

15

Uji Antagonisme terhadap Cendawan Patogen Akar

Uji antagonis dilakukan dengan menggunakan metode standar kultur ganda.

Pada bagian tengah dari medium Potato Dextrose Agar (PDA) dalam cawan petri

berdiameter 9 cm diinokulasi kultur cendawan Rhizoctonia solani, Sclerotium

rolsfii atau Fusarium oxysporum berdiameter 5 mm. Kemudian isolat

Pseudomonas spp. digores pada sisi lain dari medium tersebut dengan jarak 3 cm

dari kultur cendawan (Gambar 2). Kultur ini diinkubasi pada suhu 28 0C selama

3-5 hari dan diamati perkembangannya. Adanya interaksi antagonis ditandai

dengan terbentuknya zona penghambatan antara isolat Pseudomonas spp. dengan

cendawan (Dikin 2006). Radius zona penghambatan diukur dalam mm.

Persentase penghambatan diukur dengan rumus :

Persentase penghambatan =. B

A1 x 100%

Keterangan:

A : Jarak pertumbuhan fungi pada sisi isolat bakteri

B : Jarak pertumbuhan fungi pada sisi lain pada cawan yang sama sebagai

kontrol

Uji Reaksi Hipersensitivitas

Suspensi isolat Pseudomonas spp. dari kultur berumur 24-48 jam dengan

kepadatan 108- 10

9 sel/ml diinjeksikan ke ruang interseluler diantara vena-vena

daun tembakau menggunakan siring berukuran 1 ml. Untuk setiap isolat yang

diuji dilakukan dengan ulangan sebanyak tiga kali. Pada sisi lain dari daun

tembakau juga disuntikkan akuades dan bakteri E. coli sebagai kontrol negatif,

serta bakteri Ralstonia solanacearum sebagai kontrol positif.

Reaksi hipersensitif positif ditunjukkan dengan kematian cepat,

kekeringan dan nekrosis kecoklatan pada jaringan daun yang diinokulasi dalam

24 sampai 48 jam. Jaringan yang berwarna kekuningan tidak menunjukkan reaksi

positif (Lelliott & Stead 1987).

16

Analisis Genetik secara Parsial Pseudomonas spp. Berdasarkan Sekuen Gen

16S rRNA

Ekstrasi DNA

Isolat Pseudomonas spp. yang telah diidentifikasi dapat memacu

pertumbuhan secara signifikan dan nonpatogenik, ditumbuhkan pada suhu ruang

selama 24 jam di dalam medium cair King’s B dan dikocok pada kecepatan 110

rpm. Kemudian suspensi sel bakteri di masukkan ke dalam ependorf dan

disentrifus pada 12000 rpm selama 4 menit. Supernatan dibuang dan DNA dari

pelet bakteri diekstraksi menggunakan metode seperti yang dijelaskan dalam

Sambrook (1989).

Amplifikasi 16S rDNA

Reaksi PCR dilakukan dengan total volume reaksi 50 μl yang

mengandung 0.5 μl Taq polimerase, 25 μl buffer GC, 8 μl dNTP, 10 μl DNA

template, 1 μl primer forward (10 pmol), 1 l primer reverse (10 pmol) dan 2.5

l ddH2O steril. Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen 16S rDNA adalah

63f : 5’-CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’ dan 1387r : 5’- GGG CGG

W(purin)GT GTA CAA GGC-3’ (Marchesi et al. 1998). PCR dilakukan

menggunakan mesin Gene Amp PCR 2400 (Perkin Elmer, USA) dengan siklus

thermal diatur sebagai berikut: langkah denaturasi awal pada suhu 94 0C selama 2

menit, dilanjutkan dengan 30 siklus yang masing-masing terdiri dari: denaturasi

pada suhu 92 0C selama 30 detik, annealing pada suhu 55

0C selama 30 detik,

ekstensi pada suhu 75 0C selama 1 menit, dengan ekstensi akhir pada suhu 75

0C

selama 5 menit. Selanjutnya hasil PCR dilarikan pada elektroforesis gel agarosa

1% dan divisualisasi menggunakan pewarnaan dengan etidium bromida.

Analisis Sekuen DNA

DNA hasil amplifikasi dengan PCR dimurnikan dan dianalisis secara parsial

sekuennya menggunakan mesin DNA squencer ABI 310 (Perkin Elmer, USA)

menggunakan jasa Charoen Phokphan Indonesia, Jakarta. Hasil sekuensing DNA

dibandingkan dengan data yang ada pada GenBank menggunakan program BLAST

melalui layanan National Centre for Biotechnology Information (NCBI).

Perbandingan sekuen dilakukan menggunakan program ClustalX, dendogram dibuat

menggunakan metode neighbor-joining (NJPLOT). Kriteria untuk identifikasi seperti

yang dijelaskan oleh Drancourt et al. (2000).

17

HASIL

Isolasi dan Karakterisasi Fisiologi secara Parsial Pseudomonas spp.

Telah berhasil diisolasi 50 isolat Pseudomonas spp. yang berasal dari

rizosfer kedelai asal Cirebon, Jawa Barat. Isolat-isolat ini diidentifikasi mengikuti

Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology dan mempunyai karakteristik

parsial Gram negatif, sel berbentuk batang, lurus, atau sedikit bengkok, dengan

panjang 1,5 – 5,0 μm dengan ukuran dan penataan yang berbeda-beda. Reaksi

katalase positif dan reaksi oksidase positif. Koloni isolat Pseudomonas spp.

memiliki bentuk bervariasi antara bulat sampai bundar tak beraturan dengan

tepian licin, dengan elevasi cembung, timbul dan berbukit. Koloni memiliki

warna putih, krem muda sampai krem tua (Gambar 2).

Karakteristik Pseudomonas spp. sebagai Pemacu Pertumbuhan

Dari keseluruhan isolat yang diteliti, terdapat 50 isolat Pseudomonas spp.

yang memiliki kemampuan mensintesis IAA di dalam kultur medium yang

ditambahkan dengan triptofan. Pengukuran IAA dilakukan berdasarkan

perubahan warna supernatan setelah ditambah reagen Salkowski dan kemudian

diinkubasi. Perubahan warna terjadi dari kuning menjadi warna merah muda

sampai kecoklatan. Penghitungan konsentrasi IAA dilakukan melalui uji

kolorimetrik. Konsentrasi IAA yang dihasilkan berkisar antara 0.33 ppm sampai

23.04 ppm, yang dapat dikelompokkan menjadi tiga kelompok kisaran

konsentrasi IAA, yakni konsentrasi rendah (0.33-8.00 ppm), konsentrasi sedang

(8.01-16.00 ppm), dan konsentrasi tinggi (lebih dari 16.00). Sebanyak 20 (40%)

isolat menghasilkan IAA dengan konsentrasi rendah, 18 (36%) isolat

menghasilkan IAA dengan konsentrasi sedang, dan 12 (26%) isolat menghasilkan

IAA dengan konsentrasi tinggi. Diperoleh hasil bahwa isolat Pseudomonas sp.

Crb 90 adalah yang menghasilkan IAA dengan konsentrasi tertinggi yaitu 23.04

ppm.

Sebanyak 32 (64%) isolat Pseudomonas spp. mampu melarutkan fosfat

yang terkandung di dalam media Pikovskaya. Media ini berwarna putih, zona

bening yang terbentuk di sekitar koloni sebaran isolat Pseudomonas spp.

A B

Gambar 2 Penampilan isolat Pseudomonas spp. (A) Koloni isolat Crb 83 pada media agar-agar King’s B

(B) Sel Pseudomonas spp. menunjukkan Gram negatif berbentuk batang (perbesaran 1000 kali).

__

1 µm

19

menunjukkan adanya aktivitas pelarutan fosfat (Gambar 3). Indeks pelarutan

fosfat dihitung setelah kultur berumur tiga hari, dan diperoleh kisaran antara 0.06

sampai 0.80. Isolat Crb 53 mempunyai indeks pelarutan fosfat tertinggi, yaitu

0.80.

A B

Gambar 3 Zona bening pada uji pelarutan fosfat oleh : (A) isolat Crb 80 dan (B)

isolat Crb 64

Data karakteristik isolat Pseudomonas spp. meliputi karakter kemampuan

memproduksi IAA dan melarutkan fosfat secara rinci tertera pada Tabel 1.

Tabel 1 Potensi isolat Pseudomonas spp. dalam memproduksi IAA dan

melarutkan fosfat

Isolat Produksi

IAA

(ppm)

Indeks

Pelarutan

Fosfat

Isolat

Produksi

IAA

(ppm)

Indeks

Pelarutan

Fosfat

Isolat

Produksi

IAA

(ppm)

Indeks

Pelarutan

Fosfat

Crb 51 10.17 0.53 Crb 68 19.30 0.53 Crb 85 19.72 0.43

Crb 52 17.53 0.49 Crb 69 14.42 0.28 Crb 86 6.31 0.17

Crb 53 16.86 0.80 Crb 70 14.46 0.34 Crb 87 6.26 0

Crb 54 16.90 0 Crb 71 18.90 0.30 Crb 88 7.26 0

Crb 55 8.79 0.35 Crb 72 11.74 0.26 Crb 89 5.45 0

Crb 56 18.47 0.37 Crb 73 17.65 0.20 Crb 90 23.04 0

Crb 57 9.18 0.65 Crb 74 7.72 0.27 Crb 91 1.52 0

Crb 58 11.66 0 Crb 75 7.14 0 Crb 92 1.44 0.42

Crb 59 11.27 0 Crb 76 7.86 0 Crb 93 7.60 0.26

Crb 60

8.04 0 Crb 77 6.04 0 Crb 94 1.13 0.24

Crb 61 12.29 0.37 Crb 78 6.40 0 Crb 95 7.24 0.28

Crb 62 6.31 0.23 Crb 79 19.67 0 Crb 96 11.60 0.61

Crb 63 10.60 0 Crb 80 4.45 0.31 Crb 97 13.55 0.47

Crb 64 9.18 0.14 Crb 81 18.67 0 Crb 98 18.07 0.45

Crb 65 8.12 0.06 Crb 82 6.63 0 Crb 99 0.81 0.28

Crb 66 10.68 0.10 Crb 83 5.04 0 Crb 100 0.33 0.40

Crb 67 8.43 0.13 Crb 84 14.63 0.56

A B

1 cm

20

Uji reaksi hipersensitif tanaman tembakau terhadap isolat Pseudomonas

spp. yang dilakukan dengan menginokulasikan suspensi isolat Pseudomonas spp.

berumur 24-48 jam pada jaringan daun tanaman tembakau. Hasilnya

memperlihatkan bahwa 31 (62%) isolat mengakibatkan reaksi hipersensitif

positif yang ditunjukkan dengan kematian cepat, kekeringan dan nekrosis

kecoklatan pada jaringan daun tembakau yang diinokulasi Pseudomonas spp.

setelah 24 sampai 48 jam (Gambar 4). Sedangkan 19 (38%) isolat Pseudomonas

spp. lainnya tidak memperlihatkan perubahan warna daun atau jaringan daun

hanya berwarna kekuningan yang tidak menunjukkan reaksi hipersensitif positif,

sama seperti keadaan daun pada kontrol negatif yang menggunakan Escherichia

coli dan akuades.

A B

Gambar 4 Reaksi hipersensitivitas tanaman tembakau terhadap Pseudomonas

spp. (A) Dari sebelah kiri: isolat Crb 72, Crb 71, Crb 70, dan Crb 69

yang memberi reaksi positif dan (B) isolat-isolat yang memberi reaksi

hipersensitif negatif.

Keseluruhan isolat Pseudomonas spp. diuji kemampuan pemacuan

pertumbuhannya pada kecambah kedelai varietas Slamet berumur satu hari.

Setelah kecambah berumur tujuh hari dilakukan pengukuran panjang batang,

panjang akar primer, dan jumlah akar lateral. Hasil pengukuran dianalisis secara

statistik dan memperlihatkan bahwa 8 (16%) isolat mampu memacu pertumbuhan

kecambah kedelai pada taraf signifikansi 5%, yaitu isolat Crb 60, 63, 74, 82, 84,

93, 94, dan 95 (Tabel 2). Isolat-isolat tersebut menghasilkan IAA dengan

konsentrasi yang bervariasi antara 1.13 ppm sampai 14.63 ppm. Isolat Crb 93

dapat memacu pemanjangan batang, sedangkan Crb 60, Crb 82, dan Crb 84

mampu memacu peningkatan jumlah akar lateral. Isolat Crb 94 mampu

21

meningkatkan panjang akar primer dan panjang batang. Crb 74 mampu

meningkatkan panjang akar dan jumlah akar lateral. Isolat Crb 63 mampu

memacu pemanjangan akar primer, pemanjangan batang, dan peningkatan jumlah

akar lateral. Isolat Crb 90 yang menghasilkan IAA tertinggi (23.04 ppm) tidak

mampu memacu pertumbuhan kecambah kedelai. Gambar 5 memperlihatkan

kecambah tanaman kedelai yang diinokulasi dengan Pseudomonas sp. isolat Crb

93 yang secara signifikan memacu pertumbuhan.

Tabel 2 Hasil uji pemacuan pertumbuhan tanaman kedelai varietas Slamet yang

diinokulasi dengan Pseudomonas spp.

No Perlakuan

Rata-rata

Panjang akar primer

(cm)

Panjang batang

(cm)

Jumlah Akar

lateral

Kelompok 1

1 Kontrol 11.9000a 8.8667ab 49.7667a

2 Crb-56 13.7333a 8.8000ab 51.4667a

3 Crb-73 11.0333a 7.6000ab 42.2333a

4 Crb-79 13.9667a 8.5333ab 49.8000a

5 Crb-81 16.1667a 10.1000b 63.1000a

6 Crb-85 15.3000a 9.0000ab 52.8333a

7 Crb-98 14.9000a 9.5000ab 51.7000a

Kelompok 2

8 Kontrol 13.5667ab 8.9667a 60.1333ab

9 Crb-90 11.9667a 9.3000ab 49.5333a

Kelompok 3

10 Kontrol 20.3667b 11.2667a 79.0333a

11 Crb-51 17.7000ab 11.2667a 80.0667a

12 Crb-52 14.0667ab 11.3000a 64.2000a

13 Crb-53 12.1667a 9.8333a 66.5333a

Kelompok 4

14 Kontrol 17.8000b 10.9667c 71.6333b

15 Crb-57 9.6333ab 7.8000b 44.5000a

16 Crb-58 14.9333ab 10.5333c 66.4000a

17 Crb-61 13.7333a 10.5333a 60.9333a

18 Crb-62 13.2000a 9.2667ab 53.0667a

Kelompok 5

19 Kontrol 17.1000ab 11.0000a 72.3333a

20 Crb-86 15.7333a 9.7333a 70.9667a

21 Crb-87 13.6333a 11.5667a 67.6000a

22 Crb-91 23.0667b 11.8000a 94.6000a

23 Crb-92 15.6667a 11.2000a 75.0667a

Kelompok 6

24 Kontrol 17.5000b 10.6667b 66.2333b

25 Crb-67 12.0333a 8.6667a 47.5667a

26 Crb-69 20.9000b 10.0333b 74.6667ab

27 Crb-70 19.3667b 10.8000b 60.2000b

28 Crb-71 19.2000b 10.7667b 62.5667ab

22

No Perlakuan

Rata-rata

Panjang akar primer

(cm)

Panjang batang

(cm)

Jumlah Akar lateral

Kelompok 7

29 Kontrol 16.8000a 11.3333a 49.9667a

30 Crb-72 16.0667a 10.3000a 58.7333ab

31 Crb-74 22.8333b* 12.1000a 72.1000b*

32 Crb-75 17.1667ab 10.2667a 59.0333ab

Kelompok 8

33 Kontrol 12.0333a 9.5667a 43.5667a

34 Crb-77 14.7667a 11.3333a 55.4667ab

35 Crb-80 16.1333a 10.3333a 52.3000ab

36 Crb-82 15.6000a 10.9667a 59.0000b*

37 Crb-84 16.1000a 10.9667a 60.8333b*

Kelompok 9

38 Kontrol 14.7000ab 10.9333bc 55.6000a

39 Crb-54 11.0667ab 7.5667a 45.6667a

40 Crb-55 12.0000ab 9.3000ab 51.4333a

41 Crb-59 10.3667ab 8.4667a 49.2333a

42 Crb-60 20.7667b 13.0667c 77.8000b*

Kelompok 10

43 Kontrol 7.4000a 6.7667a 30.3000a

44 Crb-63 11.2000b* 9.5333b* 56.5333b* 45 Crb-93 9.6333ab 9.6000b* 39.6333a

46 Crb-94 11.2667b* 11.6333c* 46.7667ab

47 Crb-95 9.0333ab 8.7667b* 38.1667a

Kelompok 11

48 Kontrol 16.2000ab 12.7667a 60.6000bc

49 Crb-65 11.1000a 10.9333a 41.7333a

50 Crb-68 16.0000ab 13.8333a 54.5667ab

51 Crb-76 17.5000ab 14.0000a 73.0000c

52 Crb-78 18.4333b 13.7333a 63.9333bc

53 Crb-89 16.9000ab 12.5667a 59.6667bc

Kelompok 12

54 Kontrol 16.2333c 12.0333b 63.0667c

55 Crb-64 10.1000ab 8.6333a 38.8000a

56 Crb-66 9.7667a 7.7333a 40.2667ab

57 Crb-83 11.8000ab 11.0333b 51.1667abc

58 Crb-88 11.6667ab 12.5667b 52.3000abc

59 Crb-96 12.3000b 11.1667b 53.2667bc

Kelompok 13

60 Kontrol 13.8333ab 12.2000a 24.9667a

61 Crb-97 16.2000b 12.9333a 25.7667a

62 Crb-99 12.0667a 10.6000a 22.0000a

63 Crb-100 11.1000a 10.8333a 22.7333a

Keterangan: 1. Angka yang diikuti dengan huruf yang sama dengan rata-rata kontrol tidak

berbeda nyata pada taraf 5% dengan uji ANOVA, pada kelompok yang sama.

2. Angka yang diikuti dengan huruf yang berbeda dengan rata-rata kontrol

menunjukkan berbeda nyata (signifikan) pada taraf 95% dengan uji ANOVA,

pada kelompok yang sama.

3. Isolat yang dicetak tebal dan tanda bintang menunjukkan bahwa isolat tersebut

secara signifikan memacu pertumbuhan kecambah kedelai varietas Slamet

pada taraf 95% dengan uji ANOVA.

23

A B

Gambar 5 Pertumbuhan kecambah kedelai berumur tujuh hari. (A) Kontrol dan (B) Kecambah kedelai diinokulasi dengan

suspensi Pseudomonas sp. isolat Crb 93.

30 cm

24

Karakteristik Pseudomonas spp. sebagai Agen Biokontrol

Uji antagonisme dengan metode oposisi langsung antara Pseudomonas

spp. dengan cendawan patogen baik secara kualitatif dan kuantitatif

memperlihatkan bahwa sebanyak 13 (26%) isolat Pseudomonas spp. mampu

menghambat pertumbuhan cendawan Fusarium oxysporum dengan persentase

hambatan tertinggi sebesar 30.26% oleh isolat Crb 86. Pada pengujian antara

cendawan Sclerotium rolsfii dengan Pseudomonas spp. didapatkan 10 (20%)

isolat Pseudomonas spp. mampu menghambat pertumbuhan cendawan S. rolsfii

dengan persentase hambatan tertinggi sebesar 20% oleh isolat Crb 80.

Antagonisme Pseudomonas spp. melawan cendawan Rhizoctonia solani yang

diuji memperlihatkan bahwa sebanyak 32 (64%) isolat Pseudomonas spp.

memiliki kemampuan dalam menghambat cendawan R. solani dengan persentase

hambatan tertinggi sebesar 52.22% oleh isolat Crb 99 dan Crb 80 (Gambar 6).

Data karakteristik isolat Pseudomonas spp. pada kemampuannya dalam

menghambat pertumbuhan cendawan patogen secara rinci tertera pada Tabel 3.

Tabel 3 Penghambatan Pseudomonas spp pada uji antagonisme terhadap

cendawan patogen in vitro

Isolat Persentase Hambatan terhadap ...

Isolat Persentase Hambatan terhadap ...

F. oxysporum S. rolsfii R. solani F. oxysporum S. rolsfii R. solani

Crb 51 - - - Crb 76 10 - -

Crb 52 - - - Crb 77 14.29 - -

Crb 53 - - - Crb 78 10 - -

Crb 54 - - - Crb 79 - - -

Crb 55 - 14.55 - Crb 80 - 20 52.22

Crb 56 - 10.26 - Crb 81 - - 10

Crb 57 10 12.96 10 Crb 82 10 - 38.88

Crb 58 - - 10 Crb 83 - - 10

Crb 59 - 9.90 33.33 Crb 84 10 - -

Crb 60

- - 10 Crb 85 - - 10

Crb 61 - 12.18 10 Crb 86 30.28 - 36.88

Crb 62 - - 10 Crb 87 12.81 16.84 -

Crb 63 - - 10 Crb 88 - - -

Crb 64 - - 10 Crb 89 10 - -

Crb 65 - 13.65 37.50 Crb 90 10 - 10

Crb 66 - - 10 Crb 91 - - 10

Crb 67 - - 32.43 Crb 92 - - 10

Crb 68 - 7.14 10 Crb 93 - - -

Crb 69 - - 10 Crb 94 - - -

Crb 70 - - 10 Crb 95 - - 10

Crb 71 - - 10 Crb 96 - 3.1 -

Crb 72 - - 10 Crb 97 23.89 - 10

Crb 73 - - 10 Crb 98 - - -

Crb 74 - - 10 Crb 99 - - 52.22

Crb 75 11.15 - 37.77 Crb 100 11.76 - 10

Keterangan: Isolat yang dicetak tebal tidak memberi reaksi hipersensitif pada daun tembakau

25

A B C

Gambar 6 Antagonisme antara Pseudomonas spp. dengan cendawan patogen. (A) Penghambatan F. oxysporum oleh Pseudomonas sp.

isolat Crb 86 pada hari keenam. (B) Penghambatan S.rolfsii oleh Pseudomonas sp. isolat Crb 80 pada hari ketiga. (C)

Penghambatan R. solani oleh Pseudomonas sp. isolat Crb 82 pada hari kedua.

26

Analisis Genetik secara Parsial Pseudomonas spp. Berdasarkan Sekuen Gen

16S rRNA

Total DNA diekstraksi dari 7 isolat Pseudomonas spp. yang memacu

pertumbuhan yaitu isolat Crb 60, Crb 74, Crb 82, 84, 93, 94, dan Crb 95

menggunakan metode yang dikemukakan dalam Sambrook (1989). Amplifikasi

gen 16S rRNA dengan PCR menggunakan primer 63f : 5’-CAG GCC TAA CAC

ATG CAA GTC-3’ dan 1387r : 5’- GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3

.menghasilkan fragmen pita berukuran sekitar 1300 bp (Gambar 7).

M 1 2 3 4 5 6 M 7

Gambar 7 Hasil amplifikasi PCR gen 16S rRNA isolat Pseudomonas spp. Baris

ke-1 sampai ke-7 berturut-turut adalah gen 16S rRNA dari isolat Crb

60, 74, 82, 84, 93, 94, dan 95 yang berukuran ~1300 bp.

Hasil amplifikasi gen 16S rRNA dari ketujuh isolat tersebut kemudian

disekuen untuk mengetahui urutan nukleotidanya. Hasil sekuen parsial gen 16S

rRNA dianalisis homologinya dengan menggunakan program BLASTN terhadap

data GenBank (NCBI) dan menunjukkan bahwa isolat Crb 60 dan Crb 82

mempunyai kemiripan dengan Pseudomonas fluorescens, isolat Crb 74 dan Crb

93 mempunyai kemiripan dengan Pseudomonas putida , sedangkan isolat Crb 84,

94, dan 95 mempunyai kemiripan dengan Pseudomonas plecoglossicida seperti

tertera pada Tabel 4.

pb

10.000 __

6000 __

3000 __

2000 __

1500 ---

1000 __

500 __

250 ___

→ ~ 1300 pb

27

Tabel 4 Hasil analisis homologi sekuen gen 16S rRNA dari isolat Pseudomonas

spp. pemacu pertumbuhan tanaman menggunakan program BLASTN.

Isolat Sekuen Homolog Skor

(bit)

Nilai

Ekspektasi

Identitas

(%)

Crb 60 Gen 16S rRNA dari Pseudomonas fluorescens

galur B

684 0.0 95

Crb 74 Gen 16S rRNA dari Pseudomonas putida

galur HRB-4

617 2x10-176

86

Crb 82 Gen 16S rRNA dari Pseudomonas fluorescens

galur BFPB92

981 0.0 92

Crb 84 Gen 16S rRNA dari Pseudomonas

plecoglossicida galur S14

532 1x10-150

80

Crb 93 Gen 16S rRNA dari Pseudomonas putida

galur 24 2R3

206 2x10-52

86

Crb 94 Gen 16S rRNA dari Pseudomonas

plecoglossicida galur NyZ12

894 0.0 95

Crb 95 Gen 16S rRNA dari Pseudomonas

plecoglossicida galur Pw8

398 2x10-112

80

Perbandingan sekuen antara isolat-isolat Pseudomonas spp. yang memacu

pertumbuhan dengan galur-galur Pseudomonas spp. lain yang telah diketahui

bersifat PGPR dilakukan menggunakan program ClustalX, menghasilkan

dendogram filogenetik yang dibuat menggunakan metode neighbor-joining

(NJPLOT) (Gambar 8).

Gambar 8 Dendogram filogenetik. Hubungan kekerabatan antara isolat-isolat

Pseudomonas spp. yang memacu pertumbuhan dengan P. fluorescens

galur CHAO, galur pf-5, galur K30-2, dan P. putida galur K31-3; yang

telah diketahui mempunyai karakteristik PGPR.

0.11

0.11

0.05

28

PEMBAHASAN

Isolasi dan Karakterisasi Fisiologi secara Parsial Pseudomonas spp.

Pseudomonas spp. ditemukan secara luas di dalam ekosistem tanah dan air,

mendegradasi sejumlah besar senyawa organik, berinteraksi dengan tanaman dan

berasosiasi dalam rizosfer yang menguntungkan bidang pertanian, sebagian

lainnya patogen yang berbahaya (Pallroni dan Moore 2004). Isolasi Pseudomonas

sp. dilakukan dengan cara menyebarkan larutan tanah sampel dari rizosfer kedelai

pada media selektif King’s B, kemudian dimurnikan. Ketika dilakukan uji

pewarnaan Gram, dinding sel isolat, yang mengandung lipid tinggi larut saat

pembilasan dengan alkohol sehingga kompleks pewarna primer ungu kristal

yodium tidak dapat ditahan dan hilang tetapi kemudian terwarnai oleh pewarna

tandingan safranin, sehingga sel-selnya tampak berwarna merah yang

menunjukkan bahwa isolat adalah Gram negatif. Pengamatan mikroskopis

menunjukkan sel-sel berbentuk batang, lurus, atau sedikit bengkok dengan

panjang 1,5 – 5,0 μm. Uji oksidase pada koloni isolat menggunakan larutan

dimetil-p-fenildiamina hidroklorida 1% ditandai dengan berubahnya koloni

menjadi merah muda, lalu merah tua, merah gelap, dan akhirnya hitam yang

menandakan bahwa isolat menghasilkan oksidase. Sedangkan pada uji katalase

menunjukkan bahwa isolat mengeluarkan gelembung-gelembung oksigen hasil

dari reaksi enzim katalase yang dimilikinya, dengan hidrogen peroksida. Dari

hasil seleksi melalui pengamatan morfologi dan ciri-ciri fisiologis tersebut

diperoleh 50 isolat Pseudomonas spp.

Karakteristik Pseudomonas spp. sebagai PGPR

Menurut Loccoz dan Defago (2004), banyak strain Pseudomonas

menguntungkan tanaman secara langsung, melalui pemacuan pertumbuhan dan

peningkatan kesehatan tanaman, dan/atau secara tidak langsung melalui

penghambatan pada, atau kompetisi dengan patogen, parasit, atau tumbuhan

kompetitor. Dengan kemampuan tersebut, Pseudomonas termasuk ke dalam

Plant-Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR). Untuk mengetahui potensi

isolat Pseudomonas spp. sebagai PGPR baik langsung maupun tak langsung

tersebut telah dilakukan karakterisasi yang meliputi karakternya sebagai pemacu

pertumbuhan langsung dan karakternya sebagai agen biokontrol yang memacu

pertumbuhan secara tidak langsung.

Kemampuan PGPR secara langsung diantaranya adalah melalui produksi

hormon pertumbuhan asam indol asetat (indol acetic acid, IAA) dan

kemampuannya melarutkan fosfat (Glick 1995). Pada bakteri, triptofan

merupakan prekursor utama dalam biosintesis IAA, produksi IAA meningkat

sesuai dengan peningkatan konsentrasi triptofan dari 1-100 g/ml (Ahmad et al.

2004). Pada penelitian ini 50 isolat Pseudomonas spp. menghasilkan IAA dengan

konsentrasi berkisar antara 0.33 ppm sampai 23.04 ppm (setara dengan 10-9

sampai 1.3 x 10-7

) pada media pertumbuhan yang ditambahkan dengan triptofan.

Produksi IAA dengan konsentrasi yang beragam tersebut dapat terjadi karena

adanya perbedaan kemampuan mikroba dalam menggunakan triptofan, serta

adanya perbedaan mekanisme dalam mensintesis IAA. Menurut Patten & Glick

(1996) ada dua jalur utama yang dapat digunakan bakteri untuk menyintesis IAA

dengan prekursor triptofan yaitu jalur indolepiruvic acid (IpyA) dan jalur

indoleacetamide (IAM), bakteri galur yang berbeda dapat menggunakan jalur

yang berbeda.

Pada bakteri produksi IAA tidak berfungsi nyata sebagai hormon

pertumbuhan bagi selnya, dimungkinkan peranannya penting dalam interaksi

antara bakteri dan tanaman. IAA terdapat di akar dan di bagian tumbuhan lainnya

dalam konsentrasi yang hampir sama. Karena tumbuhan mungkin tidak

mensintesis IAA dalam jumlah cukup untuk pertumbuhan optimalnya, maka

pemberian IAA dapat memacu pemanjangan akar, tetapi hanya pada konsentrasi

yang sangat rendah (10-7

sampai 10-13

M, bergantung pada spesies dan umur akar)

(Salisbury & Ross, 1992). Pengaruh IAA pada tanaman adalah mengontrol

berbagai proses fisiologis penting termasuk pertumbuhan dan pembelahan sel,

diferensiasi jaringan, dan respon terhadap cahaya dan gravitasi (Leveau &

Lindow 2005).

Dari hasil uji kemampuan pemacuan pertumbuhan isolat Pseudomonas spp.

pada kecambah kedelai varietas Slamet didapatkan 8 isolat Pseudomonas spp.

yang mampu memacu pertumbuhan kecambah kedelai pada taraf signifikansi

30

5%, yaitu isolat Crb 60, 63, 74, 82, 84, 93, 94, dan 95. Kemampuan pemacuan

pertumbuhan yang diukur meliputi peningkatan panjang batang, panjang akar,

dan jumlah akar lateral. Isolat-isolat tersebut menghasilkan IAA dengan

konsentrasi yang bervariasi antara 1.13 ppm sampai 14.63 ppm. Menurut

Campbell et al. (2006), pemberian hormon dengan konsentrasi tertentu dapat

mempunyai efek berbeda pada sel target yang berbeda. Auksin menginisisasi

pemanjangan dengan melemahkan dinding sel dengan mekanisme sebagai

berikut:

1. Auksin akan menstimulasi protein tertentu pada membran plasma sel

tanaman untuk memompa ion hidrogen ke dalam dinding sel, sehingga

menurunkan pH di dalam dinding sel. pH yang rendah akan mengaktivasi

enzim yang merenggangkan ikatan molekul selulosa.

2. Lemahnya dinding sel tidak cukup untuk menahan masuknya air secara

osmosis, sehingga sel mengembang dan memanjang.

3. Pada petumbuhan selanjutnya sel akan mensintesis material dinding sel dan

sitoplasma yang prosesnya juga distimulasi oleh auksin.

Isolat-isolat lainnya yang menghasilkan IAA dengan konsentrasi yang lebih

tinggi dari 14.63 ppm tidak memperlihatkan kemampuannya dalam memacu

pertumbuhan kecambah kedelai. Hal ini dimungkinkan karena pengaruh IAA

pada tanaman bergantung pada konsentrasinya, konsentrasi IAA yang rendah

dapat memacu pertumbuhan tanaman sedangkan konsentrasi IAA yang tinggi

dapat menghambat pertumbuhan tanaman. Tanaman yang berbeda dapat memberi

respon yang berbeda terhadap variasi konsentrasi IAA dan tipe mikrooganisme

(Ahmad et al. 2004, Gray & Smith 2005). Banyak penelitian melaporkan bahwa

tingginya konsentrasi IAA akan meningkatkan transkripsi dan aktivitas 1-

aminosilklopropana-1-karboksilat (ACC) sintase yang akan mengkatalisis

produksi ACC pada tanaman. Senyawa ini merupakan prekursor hormon etilen

pada tanaman, yang berperan mencegah terjadinya pertumbuhan yang berlebihan

(overgrowth), dan menghambat proses elongasi akar (Husen 2003, Campbell et

al. 2006).

Bakteri yang memproduksi IAA menstimulasi pertumbuhan sistem

perakaran inang. Hal ini menunjukkan bahwa isolat-isolat Pseudomonas spp.

31

tersebut mempunyai kemampuan untuk memasukkan IAA ke dalam pool auksin

tanaman, dan akar merupakan organ tanaman yang paling sensitif terhadap

fluktuasi kadar IAA, responnya pada peningkatan jumlah IAA eksogenus meluas

dari pemanjangan akar primer, pembentukan akar lateral dan akar adventif,

sampai penghambatan pertumbuhan (Leveau & Lindow 2005). Menurut

Aryantha et al. (2004), isolat yang memproduksi IAA dengan konsentrasi tinggi

dapat digunakan sebagai PGPR dengan melakukan pengenceran pada kultur yang

diberikan pada kecambah kacang hijau yang ditumbuhkan secara hidroponik dan

terbukti mampu meningkatkan panjang optimum kecambah.

Kemampuan melarutkan fosfat merupakan karakter lain yang dimiliki oleh

PGPR. Mikroba pelarut fosfat mempunyai kemampuan untuk melarutkan

senyawa fosfat anorganik yang tidak terlarut seperti trikalsium fosfat, dikalsium

fosfat, hidroksiapatit, dan batuan fosfat. Menurut Rodriguez dan Fraga (1999),

Pseudomonas, Bacillus, dan Rhizobium, adalah kelompok bakteri pelarut fosfat

yang potensial dalam meningkatkan tersedianya fosfor bagi tanaman, terutama di

tanah yang mengandung banyak endapan fosfat. Ketika tanah kekurangan fosfat

bagi tanaman dan pH tanah sangat kondusif untuk pelarutan fosfat, mikroba

pelarut fosfat berperan penting dalam pertumbuhan tanaman, hasil panen dan

pengambilan nutrien (Altomare et al. 1999).

Sebanyak 32 (64.9%) isolat Pseudomonas spp. mampu melarutkan fosfat

dalam bentuk trikalsium fosfat yang terkandung di dalam media Pikovskaya,

yang ditandai dengan zona bening yang terbentuk di sekitar koloni sebaran isolat

Pseudomonas spp. Hasil perhitungan indeks pelarutan fosfat isolat yang dihitung

setelah kultur berumur tiga hari berkisar antara 0.06 sampai 0.80 (indeks

pelarutan fosfat tertinggi yang dhasilkan oleh isolat Crb 53). Hal ini dapat

disebabkan karena terdapat berbagai jenis asam organik yang dihasilkan oleh

mikroorganisme dengan mekanisme pelarutan fosfat yang berbeda-beda,

sehingga mengakibatkan kemampuan setiap isolat untuk dapat melarutkan fosfat

juga berbeda-beda. Delapan belas (36%) isolat lainnya yang tidak mampu

melarutkan fosfat dapat disebabkan karena isolat tersebut tidak menghasilkan

asam organik yang dapat melarutkan fosfat atau dapat pula karena asam organik

yang dihasilkannya tidak dapat melarutkan fosfat yang terikat dengan kalsium

32

seperti yang terkandung dalam media Pikovskaya tersebut, tetapi kemungkinan

dapat melarutkan fosfat dalam bentuk senyawa yang lain. Asam glukonat dan

asam 2-ketoglukonat adalah asam-asam organik yang dihasilkan oleh

Pseudomonas, Erwinia, Burkholderia, Rhizobium, dan Bacillus (Igual et al.

2001). Asam-asam organik lain seperti asam laktat, isovalerat, isobutirat, asetat,

glikonat, oksalat, malonat, dan suksinat juga dihasilkan oleh berbagai bakteri

pelarut fosfat (Rodriguez & Fraga 1999).

Menurut D’Argenio (2004), sebagian Pseudomas spp. adalah patogen pada

tanaman, misalnya Pseudomonas syringae yang dapat menyebabkan penyakit

hawar daun. Dari 8 isolat Pseudomonas spp. yang memacu pertumbuhan, satu

diantaranya (Crb 63) mengakibatkan reaksi hipersensitif positif ketika diujikan

pada daun tanaman tembakau yang ditandai dengan kekeringan dan nekrosis

kecoklatan pada jaringan daunnya, sehingga isolat ini tidak disarankan untuk

digunakan sebagai PGPR. Tujuh isolat Pseudomonas spp. yang menghasilkan

IAA dan tidak patogen bagi tanaman adalah Crb 60, 74, 82, 84, 93, 94, dan 95.

Mekanisme aksi PGPR yang secara tidak langsung memacu pertumbuhan

tanaman adalah melalui penghambatan pada, atau kompetisi dengan patogen,

parasit, atau tumbuhan kompetitor. Banyak PGPR yang menguntungkan produksi

pertanian melalui mekanisme antibiosis dan biokontrol; mampu menekan

sejumlah bakteri, cendawan, nematoda, dan virus yang patogen pada tanaman

(Whipps 2001). Menurut Glick (1995), mekanisme antibiosis dan biokontrol

terhadap mikroorganisme fitopatogen diantaranya dengan memproduksi

siderofor, -1,3-glukanase, kitinase, antibiotik dan sianida.

Interaksi patogenik dapat terjadi antar mikroorganisme, maupun antara

mikroorganisme dan akar tanaman yang mengakibatkan penyakit tanaman.

Penyakit tanaman yang bersumber dari tanah dapat disebabkan oleh nematoda,

kutu, bakteri, virus, dan fungi. Fungi menyebabkan kerusakan lebih parah pada

tanaman pertanian dan interaksinya dengan patogen tanaman lainnya umumnya

mempunyai efek sinergis pada penyakit tanaman.

Fusarium oxysporum adalah fungi saprofit yang tumbuh dan dapat bertahan

hidup dalam periode yang lama pada bahan organik, di dalam tanah dan di

rizosfer berbagai tanaman. Spesies Fusarium yang patogen dapat melakukan

33

penetrasi pada akar tanaman melalui ujung akar, luka pada akar atau melalui akar

lateral dengan menggunakan pembuluh sporangia dan miseliumnya, sehingga

menyebabkan layu atau busuk akar (Gonsalves et al. 1993, Bolwerk &

Lugtenberg 2006). Fumonisin dan trikotekanes merupakan racun utama yang

diproduksi oleh Fusarium. Uji antagonisme dengan metode oposisi langsung

antara Pseudomonas spp. dengan cendawan patogen baik secara kualitatif dan

kuantitatif memperlihatkan bahwa sebanyak 13 (26%) isolat Pseudomonas spp.

mampu menghambat pertumbuhan cendawan F. oxysporum dengan persentase

hambatan tertinggi sebesar 30.28% oleh isolat Crb 86.

Cendawan Sclerotium rolfsii dapat menyebabkan busuk akar pada berbagai

tanaman termasuk kedelai dengan gejala infeksi layu pada pucuk tanaman akibat

kerusakan pada pangkal batang dan akar. Pertumbuhan miselianya menyerupai

kapas dengan bulatan sklerotia berwarna coklat muda yang kemudian menjadi

coklat gelap ketika tua. S. rolsfii dapat bertahan hidup pada sisa tumbuhan yang

mati di dalam tanah dalam bentuk sklerotia, kemudian dapat tumbuh dan

menyerang tanaman inang, menyebabkan nekrosis pada dinding selnya. Enzim

selulase dan kitinase dihasilkan untuk mendukung kemampuannya menyerang

tanaman inang (Moussa & Tharwat 2007). Hasil pengujian antara cendawan S.

rolsfii dengan Pseudomonas spp. mendapatkan 10 (20%) isolat Pseudomonas

spp. yang mampu menghambat pertumbuhan cendawan S. rolsfii dengan

persentase hambatan tertinggi sebesar 20% oleh isolat Crb 80.

Rhizoctonia solani adalah cendawan patogen nekrotropik yang dilaporkan

dapat menyebabkan penyakit busuk daun pada padi, busuk pangkal batang

(damping-off) pada tanaman gula bit, dan busuk akar pada kedelai. Menurut

Bertagnolli et al. (1996) cendawan ini mengeluarkan endoproteinase,

eksokitinase, glukanase, dan fosfolipase yang semuanya berpotensi merusak

dinding sel/integritas membran sel tanaman. Sedangkan hasil penelitian

Vidhyasekaran et al. (1997) menyebutkan bahwa cendawan ini menghasilkan

toksin karbohidrat yang mengandung glukosa, manosa, N-asetilgalaktosamin, dan

N-asetilglukosamin. Antagonisme Pseudomonas spp. melawan cendawan R.

solani yang diuji memperlihatkan bahwa sebanyak 32 (64,8%) isolat

34

Pseudomonas spp. memiliki kemampuan dalam menghambat cendawan R. solani

dengan persentase hambatan tertinggi sebesar 52.22% oleh isolat Crb 80 dan 99.

Isolat-isolat yang mampu menghambat pertumbuhan cendawan patogen

tersebut dimungkinkan karena Pseudomonas spp. selain dapat menghasilkan

siderofor, HCN, dan/atau kitinase juga menghasilkan berbagai antibiotik

termasuk antifungi (fenazin, pirolnitrin, pioluteorin, diasetil floroglusinol,

ramnolipid, dll), antibakteri (asam pseudomonat, azomisin), antitumor

(FR901463, sepafungins), dan anti virus (karalisin) (Fernando et al. 2006).

Senyawa-senyawa tersebut dapat menyebabkan modifikasi struktural dinding sel

dan perubahan biokimiawi/fisiologis pada sintesis protein yang terlibat dalam

mekanisme pertahanan tanaman (Antoun & Prevost 2006, Siddiqui 2006).

Data karakteristik 7 isolat Pseudomonas spp. yang mampu memacu

pertumbuhan kecambah kedelai dan karakternya dalam kemampuan produksi

IAA, kemampuan melarutkan fosfat dan kemampuan menghambat pertumbuhan

cendawan patogen, serta nonpatogen tertera pada Tabel 5.

Tabel 5 Potensi isolat Pseudomonas spp. yang mampu memacu pertumbuhan

tanaman kedelai dan nonpatogen

Isolat Produksi IAA

(ppm)

Indeks Pelarutan

fosfat

Persentase Hambatan terhadap ...

F. oxysporum S. rolsfii R. solani

Crb 60

8.04 0 - - 10

Crb 74 7.72 0.27 - - 10

Crb 82 6.63 0 10 - 38.88

Crb 84 14.63 0.56 10 - -

Crb 93 7.60 0.26 - - -

Crb 94 1.13 0.24 - - -

Crb 95 7.24 0.28 - - 10

Suatu isolat dikatakan berpotensi sebagai PGPR jika memiliki karakter

sebagai berikut: mampu mengolonisasi akar tanaman, mampu memacu

pertumbuhan tanaman dan dapat digunakan sebagai agen biokontrol. Hasil

penelitian menyatakan bahwa 3 isolat Pseudomonas spp. yaitu Crb 74, Crb 84,

dan Crb 95 (tercetak tebal pada Tabel 5), adalah yang terbaik di antara isolat

lainnya, karena mempunyai paling sedikit 3 karakter yang memperlihatkan

kemampuan produksi IAA, mampu melarutkan fosfat, juga mampu menekan

35

pertumbuhan fungi fitopatogen. Isolat-isolat tersebut juga menunjukkan reaksi

hipersensitif negatif pada daun tembakau, sehingga dapat direkomendasikan

sebagai inokulan untuk memacu pertumbuhan dan biokontrol fungi patogen akar

pada tanaman kedelai.

Analisis Genetik secara Parsial Pseudomonas spp. Berdasarkan Sekuen

Gen 16S rRNA

Tujuh isolat Pseudomonas spp. yaitu Crb 60, 74, 82, 84, 93, 94, dan 95

diteliti lebih lanjut pada bidang molekulernya berdasarkan analisis secara parsial

sekuen gen 16S rRNA. Dari analisis homologi menunjukkan bahwa isolat Crb 60

dan Crb 82 mempunyai kemiripan dengan Pseudomonas fluorescens, isolat Crb

74 dan Crb 93 mempunyai kemiripan dengan Pseudomonas putida, sedangkan

isolat Crb 84, 94, dan 95 mempunyai kemiripan dengan Pseudomonas

plecoglossicida. P. putida dan P. fluorescens hidup di air dan di tanah, dikenal

dengan perananannya sebagai agen biokontrol potensial, yang efektif melawan

penyakit damping off, yang disebabkan oleh Pythium dan Fusarium. P.

fluorescens juga diketahui sebagai PGPR karena mampu menghasilkan siderofor,

HCN, dan antibiotik fenazin (Duffy & Defago 1999). Sedangkan P.

plecoglossicida umumnya ditemukan pada ikan ayu (Plecoglossus altivelis) di

Jepang, dan secara genotipe berkerabat dekat dengan P. putida yang biasa

digunakan sebagai inokulan pada berbagai pupuk pertanian (Nishimori et al.

2000).

Dari dendogram filogenetik memperlihatkan bahwa isolat-isolat tersebut

lebih dekat hubungan kekerabatannya dengan Pseudomonas sp. galur pf-5 dan

CHAO dibandingkan hubungan kekerabatannya dengan Pseudomonas sp. galur

pp-K31-3 dan pf-K30-2. Isolat Crb 82, 94, 74, dan 60 berada satu kelompok

dengan Pseudomonas sp. galur pf-5 dan CHAO.

36

KESIMPULAN DAN SARAN

Kesimpulan

Hasil penelitian menunjukan bahwa 50 isolat Pseudomonas spp. yang

diisolasi dari tanah rizosfer kedelai menghasilkan IAA. Tujuh isolat yaitu Crb 60,

74, 82, 84, 93, 94, dan 95 secara signifikan mampu memacu pertumbuhan kedelai

dan non-patogenik, 5 isolat diantaranya yaitu Crb 60, 74, 82, 84, dan 95 juga

berpotensi sebagai pengendali fungi patogen akar. Isolat-isolat Crb 74, 84, dan 95

berpotensi sebagai PGPR karena mempunyai karakteristik dapat mensintesis

IAA, dapat menginduksi perkecambahan secara signifikan, dapat melarutkan

fosfat dan dapat menghambat pertumbuhan cendawan fitopatogen, serta tidak

patogen pada tanaman. Hasil identifikasi berdasarkan gen 16S rRNA menyatakan

bahwa Pseudomonas spp. isolat Crb 60 dan 82 memiliki kemiripan dengan

Pseudomonas fluorescens, isolat Crb 74 dan 93 memiliki kemiripan dengan

Pseudomonas putida, sesangkan isolat Crb 84, 94, dan 95 memiliki kemiripan

dengan Pseudomonas plecoglossicida.

Saran

Isolat-isolat Pseudomonas spp. yang berpotensi sebagai PGPR dan telah

teruji secara in vitro perlu dilakukan pengujian kompetisi untuk mengetahui

kemampuan hidupnya bila digabung antara satu isolat potensial dengan isolat

potensial lainnya. Kemampuan kolonisasi isolat-isolat potensial tersebut pada

akar tanaman kedelai secara in vivo perlu diuji lebih lanjut.

DAFTAR PUSTAKA

Ahmad F, Ahmad I, Khan MS. 2005. Indole acetic acid production by the

indigenous isolat of Azotobacter and flourescent Pseudomonas in the

presence and absence of tryptophan. Turk J Biol. 29: 29-34.

Altomare, Norvell WA, Bjorkman T, Harman GE. 1999. Solubization of

phosphates and micronutrients by the plant-growth-promoting and biocontrol

fungus Trichoderma harzianum Rifai 1295-22. Appl Environ Microbiol 65:

2926-2933.

Arcand MM, Schneider KD. 2006. Plant-and microbial-based mechanisms to

improve the agronomic effectiveness of phosphate rock: A Review. An Acad

Bras Sci 78:791-807.

Aryantha IP, Lestari DP, Pangesti NPD. 2004. Potensi isolat bakteri penghasil

IAA dalam meningkatkan pertumbuhan kecambah kacang hijau pada kondisi

hidrophonik. J Mikrobiol Indones 9: 43-46.

Antoun H, Prevost D. 2006. Ecology of plant growth promoting rhizobacteria. Di

dalam: Siddiqui ZA, editor. PGPR: Biocontrol and Biofertilization.

Netherlands: Springer.

Bertagnolli BL, Dal SFK, Sinclair JB. 1996. Extracellular enzyme profiles of the

fungal pathogen Rhizoctonia solani isolate 2B-12 and of two antagonist,

Bacillus megaterium strain B153-2-2 and Trichoderma harzianum isolate

Th008.I. possible correlations with inhibition of growth and biocontrol.

Physiol Mol Plant Pathol 48:145-160.

Bolwerk A, Lugtenberg BJJ. 2006. Visualization of interactions of microbial

biocontrol agents and phytopatogenic fungus Fusarium oxysporum f.sp.

radicis-lycopersici on tomato roots. Di dalam: Siddiqui ZA, editor. PGPR:

Biocontrol and Biofertilization. Netherlands: Springer.

Brandl M, Clark EM, Lindow SE. 1996. Characterization of indole-3-acetic acid

(IAA) biosynthetic pathway in a epiphytic of Erwinia herbicola and IAA

production in vitro. Can J Microbiol 42: 287-304.

Broun-Howland EB, Danielsen SA, Niezwicki-Bauer SA. 1992. Development of

rapid method for detecting bacterial cell in situ using 16S rRNA-targeted

probes. Biotechniques 13: 928-933.

Campbell NA, Reece JB, Taylor MR, Simon EJ. 2006. Biology: Concepts &

Connections. San Francizco: Pearson Education, Inc.

Cattelan AJ, Hartel PG, Fuhrmann JJ. 1999. Screening for plant growth

promoting rhizobakteria to promote early soybean growth. Soil Sci Soc Am J

63:1670-1680.

Compant S, Duffy B, Nowak J, Cle’ment C, Barkai E. 2005. Use of plant growth-

promotion bacteria for biocontrol of plant disease: principles, mechanisms of

action and future prospect. Environ Microbiol 71: 4951-4959.

D’Argenio DA. 2004. The pathogenic lifestyle of Pseudomonas aeruginosa in

model systems of virulence. Di dalam: Ramos JL, editor. Pseudomonas. Vol

ke-1. New York: Plenum Publishers.

Dey R, Pal KK, Bhatt DM, Chauhan SM. 2004. Growth promotion and yield

enhancement of peanut (Arachis hypogaea L.) by application of plant growth-

promoting rhizobacteria. Microbiol Res 159: 371-394.

Dikin A, Sijiam K, Kadir J, Seman IA. 2006. Antagonistic bacteria against

Schizophyllum commune fr in Peninsular Malaysia. Biotropia 13: 111-121.

Drancourt M, Bollet C, Carlioz A, Martelin R, Gayral JP et al. 2000. 16S

ribosomal DNA sequence analysis of a large collection of environmental and

clinical unidentifiable bacterial isolates. J Clin Microbiol 38:3623-2630.

Duffy BK, Defago G. 1999. Environmental factors modulating antibiotic and

siderophore biosynthesis by Pseudomonas fluorescens biocontrol strains.

Appl Environ Microbiol 65:2429-2438.

Elmerich C. 1992. Nodulatoins genes and biosynthesis of indoleacetic acid

in Azospirillum brasilense. Di dalam Khush GS, Bennet J. Editor. Nodulation

and Nitrogen Fixation in Rice : Potential and Prospect. IRRI. Hlm. 87-91.

Fallah A. 2006. Abundance and distribution of phosphate solubilizing bacteria

and fungi in some soil samples from North Iran. The 18th

World Congress of

Soil Science. 9-15 Juli 2006. Philadelphia. Pennsylvania. USA.

Fernando WGD, Nakkeeran S, Zhang Y. 2006. Biosynthesisi of antibiotics by

PGPR and its relation in biocontrol of plant diseases. Di dalam: Siddiqui ZA,

editor. PGPR: Biocontrol and Biofertilization. Netherlands: Springer.

Glick BR. 1995. The enhancement of plant growth promotion by free living

bacteria. Can J Microbiol 41: 109-117.

Glick BR, Pasternak JJ. 2003. Molecular Biotechnology, Principles and

Apllications of Recombinant DNA. Washington: ASM Press. Hlm 436.

Gloud WD. 1990. Biological control of plant root disease by bacteria. Di dalam:

Nakas JP, Hagedorn C, Editor. Biotechnology of Plant-mikcrobe Interaction.

New York: McGraw-Hill. hlm 287-372.

Gonsalves AK, Ferreira S. 1993. Fusarium oxysporum. Departement of Plant

Pathology, CTAHR. University of Hawaii: Manoa.

39

Gray EJ, Smith DL. 2005. Intracellular and extracellular PGPR: commonalities

and distinctions in the plant-bacterium signaling processes. Soil Biol Biochem

37: 395-412.

Husen E. 2003. Screening of soil bacteria for plant growth promoting activities in

vitro. Short communication. Indones J Agric Scienc 4: 27-31.

Igual JM, Valverde A, Cervantes E, Velásquez E. 2001. Phosphate solubilizing

bacteria as inoculants for agriculture: Use of update molecular techniques in

their study. Review article. Agronomie 21:561-568.

Kapulnik Y, Okon Y. 2002. Plant growth promotion by rhizosphere bacteria. Di

dalam: Warsel Y, Eshel A, Kafkafi U, editor.Plant Roots: The Hidden Half.

Ed. Ke-3. New York: Marcel Dekker, Inc.Hlm 869-885.

Lelliott RA, Stead DE. 1987. Methods for the Diagnosis of Bacterial Diseases of

Plants. Vol ke-2. London: Blackwell Scientific Publications.

Leveau JHJ, Lindow SE. 2005. Utilization of the plant hormone indole-3-acetic

acid for growth by Pseudomonas putida strain 1290. Appl Environ Microbiol

71: 2365-2371.

Lim HS, Kim YS, Kim SD. 1991. Pseudomonas stutzeri YPL-1 genetic

transformation and antifungal mechanism against Fusarium solani, an agent

of plant root rot. Appl Environ Microbiol 57: 510-516.

Loccoz YM, Defago G. 2004. Life as a biocontrol Pseudomonads. Di dalam:

Ramos JL, editor. Pseudomonas. Vol ke-1. New York: Plenum Publishers.

Madigan MT, Martinko JM, Parker J. 2000. Brock Biology of Microorganisms.

New Jersey: Upper saddle river

Manulis SA. 1998. Differential involvement of indole-3-acetic acid biosynthetic

pathway in pathogenicity and epiphytic fitness of Erwinia herbicola pv.

Gypsophilae. Mol Plant Mic Interac 11: 623-642.

Marchesi JR, Sato T, Weightman AJ, Martin TA, Fry JC et al. 1998. Design and

evaluation of usefull bacteria spesific PCR primers that amplify genes coding

for bacteria 16S rRNA. Appl Environ Microbiol 64: 795-799.

Moussa TAA, Tharwat NA. 2007. Optimization of cellulose and β-glukosidase

induction by sugarbeet pathogen Sclerotium rolfsii. Afr J Biotech 6:1048-

1054.

Nishimori E, Tsukamoto KK, Wakabayashi H. 2000. Pseudomonas

plecoglossicida sp. nov., the causative agent of bacterial haemorrhagic ascites

of ayu, Plecoglossus altivelis. Int J Syst Evol Microbiol 50:83-89.

40

Palleroni JN, Moore ERB. 2004. Taxonomy of pseudomonads: experimental

approaches. Di dalam: Ramos JL, editor. Pseudomonas. Vol ke-1. New York:

Plenum Publishers.

Patten CL, Glick BR. 1996. Bacterial biosynthesis of indole-3-acetic acid. Can

J Microbiol 42:207-220.

Patten CL, Glick BR. 2002. Role of Pseudomonas putida indole acetic

acid indevelopment of the plant root system. Appl Environ Microbiol

68:3795–3801.

Rao SWCB, Sinha MK. 1962. Phosphate dissolving microorganism in the soil

and rhizosphere. Ind J Sci 23:272-278.

Rodriguez H, Fraga R. 1999. Phosphate solubilizing bacteria and their role in

plant growth promotion. Biotechnol Adv 17:319-339.

Salisbury FB, Roos CW. 1992. Plant Physiology. Ed ke-4. California:Worth

Publishing, Inc.

Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular Cloning A Laboratory

Manual. Ed. Ke-2. USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press.

Siddiqui ZA. 2006. PGPR: Prospective biocontrol agents of plant patogens. Di

dalam: Siddiqui ZA, editor. PGPR: Biocontrol and Biofertilization.

Netherlands: Springer.

Subba Rao. 1999. Soil Microorganism and Plant Growth Ed-4. Science Publisher

Inc. USA

Tien TM, Gaskins H, Hubbell DH. 1979. A taxonomic study of the Spirillum

lipoferum group with description of a new genus, Azospirillum gen nov and

two species Azospirillum lipoferum (Beijerink) comb. nov and Azospirillum

brasilense sp. nov. Can J Microbiol 24: 967-980.

Vidhyasekaran P, Ponmalar TR, Samiyappan R, Velazhahan R, Vimala R et al.

1997. Host-specific toxin productinon by Rhizoctonia solani, the rice sheath

blight pathogen. Phytopatology 87:1258-1263.

Whipps JM. 2001. Microbial interactions and biocontrol in the rhizosphere. J Exp

Bot 52: 487-511.

Woese CR. 1987. Bacterial evolution. Microbiol Rev 51:221-271.

Wu SC, Cao ZH, Li ZG, Cheung KC, Wong MH. 2005. Effect of biofertilizer

containing N-fixer, P and K solubizers and AM fungi on maize growth: a

green house trial. Geoderma 125: 155-166.

41

LAMPIRAN

Lampiran

Data sekuen parsial gen 16S-rRNA isolat Pseudomonas spp. dan analisisnya

menggunakan program BLASTN

>Crb_60 GCCAGCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATG

GAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAG

GGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGG

GTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTG

GAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGG

GCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGGTTGTAAAGTA

CTTTCAGCGGGGAAGAAAGGTGTTGTGGTTAATAACCCCAGCATTGGACGTTACCCCCAA

AGAAACCACCGGCTTACTTCCGTGCAAGCAACCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTT

ATCGGAATTTCTGGGGCGTNAAGCCCCCCCAGGGGGTCTTTCCAATCCGGAATGTGAAAT

TCCCCGGGCTCCCCCTGGGAAATTGTTTCCAAAATTGGCAGGTTAAATTTTTGGAAAAAG

GGGGGTAAAATTCCAGGGTTACCGGGGAAATGCCTAAAAATTTGGGGAGAATTCCCGGG

GGGCAAAGGGGGCCCCCTTGAAAAAAAATTAACCCTTTGGGGGGAAAAAACGTGGGGGA

AAAAAAAAAAAATTTAAAACCCTGGGTTTTCCCCCCCCCCAAAAAAAATTTAATTTTGGGG

TTTGGCCCTTTAGGGGGGGTTTTCCGG

gb|U63900.1|PFU63900 Pseudomonas fluorescens bv. B (Pf_B)16S

rRNA gene, partial sequence

Length=482

Score = 684 bits (370), Expect = 0.0

Identities = 411/430 (95%), Gaps = 6/430 (1%)

Strand=Plus/Plus

Crb_60 5 GCTCTCGGGTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGG 64

|||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Pf_B 55 GCTCTCGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGG 114

Crb_60 65 GGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGAC 124

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Pf_B 115 GGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGAC 174

Crb_60 125 CTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGG 184

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||

Pf_B 175 CTTCGGGCCTCTTGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAATGG 234

Crb_60 185 CTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAG 244

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Pf_B 235 CTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAG 294

Crb_60 245 ACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCC 304

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Pf_B 295 ACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCC 354

Crb_60 305 TGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGG 364

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||

Pf_B 355 TGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGG-TTGTAAAGTACTTTCAGCGA 413

Crb_60 365 GGAAGAAAGGTGTTGTGGTTAATAACCCCAGC-ATTGGACGTTACCCCCA-AAGAAACCA 422

||| ||| || ||| ||||||||||| ||| |||| ||||||| | || ||||| | |

Pf_B 414 GGAGGAA-GGCATTGAGGTTAATAACCTCAGTGATTG-ACGTTACTCGCAGAAGAAGC-A 470

Crb_60 423 CCGGCTTACT 432

|||||| |||

Pf_B 471 CCGGCTAACT 480

42

>Crb_74 GCTCACTCCTTGATTCGACGACGGACGGGTGACTACTGCCTATCTACTCTGCCTGGCTAG

TGGGGGTACAACGCTTTCACAAAGGAACGCTATTACCGCATACGTCCTACGGGGAGAAAG

CAGGGGCACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTACTTGGTG

AGGTAGTGGCCACCAAGGCAACGATCCGTAGCTGGTCTGACAGGATGATCACTCACACTG

GAGCTGACACACGGTCCATACTCCTACGGGAGGCAGCACCTGGGGAATATTGGACNATG

GGCGAATGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTTAACAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCAC

TTTAAGTAGGCAGGAGGGCATTAAGCTAATACCTCGCTGTTTTGACGATACCGACAGAAT

AGCTCCGGATAACTNGGTGCCAACACCGGGTAATACAAATGGGGCAGGGTTAATCCCAAT

TACTGGCCCTAAGGACCGCCTATAGGGGTTCGTTTAACTTGGAAGGGAAAAACCTGGGCT

CAACTTGGAAATGGGATCCAAAATTGGGAAAATAAATTAAGGAAAAAGGGTGGGGGGAA

ATTTCCCTTTTTGGGCCCTAAAATGGCCCAAAATTGGGAAAAAAACCCCCGGGGGGCAAA

AGGCAAACCCCTTGGCCCTGGTTTTTCCCCCCCGGGGGG

CAAAAAACTGTGGGGCCCCCAAAAACATTTAAAATTCCCTGGGGTTCCCCCCCCCTAAAA

AAAATTTTCCCCCCGGGGGGAACCCCTTGAAAATTTTGGG

gb|DQ870553.1| Pseudomonas putida strain HRB-4 (Pp_HRB4)16S

ribosomal RNA gene, partial sequence

Length=840

Score = 617 bits (334), Expect = 2e-176

Identities = 497/573 (86%), Gaps = 25/573 (4%)

Strand=Plus/Plus

Crb_74 6 CTCCTTGATTCGA-CGACGGACGGGTGACTACTGCCTATCTACTCTGCCTGGCTAGTGGG 64

||||||||||| | || ||||||||||| || |||||| | ||||||||| |||||||

Pp_HRB4 54 CTCCTTGATTC-AGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTA-GGAATCTGCCTGG-TAGTGGG 110

Crb_74 65 GGTACAACGCTTTCACAAAGGAACGCTATTACCGCATACGTCCTACGGGGAGAAAGCAGG 124

|| |||||| |||| |||||||||||| ||||||||||||||||| |||||||||||||

Pp_HRB4 111 GG-ACAACG-TTTC-GAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTAC-GGGAGAAAGCAGG 166

Crb_74 125 GGCACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTACTTGGTGAGGT 184

|| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||

Pp_HRB4 167 GG-ACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGT 225

Crb_74 185 AGTGGCTCACCAAGGCAACGATCCGTAGCTGGTCTGACAGGATGATCACTCACACTGGAG 244

| |||||||||||||| |||||||||| ||||||||| |||||||||| ||||||||||

Pp_HRB4 226 AATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAA 285

Crb_74 245 CTGACACACGGTCCATACTCCTACGGGAGGCAGCACCTGGGGAATATTGGACNATGGGCG 304

|||| |||||||||| ||||||||||||||||||| ||||||||||||||| |||||||

Pp_HRB4 286 CTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-TGGGGAATATTGGACAATGGGCG 344

Crb_74 305 AATGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTTAACAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTA 364

|| |||||||||||||||||||||||||| || |||||||||||||||||||||||||||

Pp_HRB4 345 AAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTA 404

Crb_74 365 AGTAGGCAGGA-GGGCATTAAGCTAATACCTCGCTGTTTTGACGATACCGACAGAATA-G 422

||| || |||| ||||| ||||||||||||| |||||||||||| ||||||||||||| |

Pp_HRB4 405 AGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGCTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAG 464

Crb_74 423 CTCCGGATAACTNGGTGCCAACAACC-CGGGTAATACAAATGGG-GCAGG-GTTAATCCC 479

| |||| ||||| |||||| || || ||| ||||||| | ||| ||| | |||||||

Pp_HRB4 465 CACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGG-TAATACAGA-GGGTGCAAGCGTTAATCGG 522

Crb_74 480 AATTACTGGCCCTAAGGAC-CGCCTATAGG-GGTTCGTTTAACTTGGAAGGGAAAAACCT 537

||||||||| | ||| | | ||| || || |||||||| || ||||| | |||| ||

Pp_HRB4 523 AATTACTGGGCGTAAAG-CGCGCGTA--GGTGGTTCGTT-AAGTTGGATGTGAAAGCCCC 578

Crb_74 538 GGGCTCAACTTGGAAA-TGGGATCCAAAATTGG 569

||||||||| ||| || || |||||||| |||

Pp_HRB4 579 GGGCTCAACCTGGGAACTGC-ATCCAAAACTGG 610

43

>Crb_82 GAGGGCGCTCACTCCTTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCT

GGTAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAA

AGCAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGT

GAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACAC

TGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAAT

GGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGC

ACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGTAAGCTAATACCTTGCTGTTTTTGACGTTACCGACA

GAATAAGCACCGGCTACCTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGTGCAAGCGTTAA

TCGGAATTACTGGGCGTAAGCCCCCGTAAGTGGTTCGTAAGTTGAAAGGGAAAACCCCGG

GCCCCACCTGGGAACTGCCTCCAAAACTGGCAAACTAAAATACGGGTAAAGGGTGGGGG

AATTTCCCTGTTCACCGGTGAAATGCCTTAAAATTAAGAAAGGAACCCCTTGGGCGAAGG

GGCACCCCCTTGGAATTAATTTACCCTTGGGGGGGAAAACGGTGGGGAAAAACAAGATTA

AAAACCCCGGTGTTCCCCCCCCTAAAAAAGTCCCACACCCGGGGGAAACCCTAAAAATTT

TTGGGGCCCCCAACCCCTTTTTTTA

gb|EF600890.1| Pseudomonas fluorescens strain BFPB92 (pf_BFPB92)

16S ribosomal RNA gene, partial sequence

Length=748

Score = 981 bits (531), Expect = 0.0

Identities = 656/713 (92%), Gaps = 21/713 (2%)

Strand=Plus/Plus

Crb_82 12 CTCCTTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGA 71

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

pf_BFPB92 44 CTCCTTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGA 103

Crb_82 72 CAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTT 131

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

pf_BFPB92104 CAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTT 163

Crb_82 132 CGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTC 191

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||

pf_BFPB92164 CGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTC 223

Crb_82 192 ACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACA 251

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

pf_BFPB92224 ACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACA 283

Crb_82 252 CGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGA 311

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

pf_BFPB92284 CGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGA 343

Crb_82 312 TCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAG 371

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

pf_BFPB92344 TCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAG 403

Crb_82 372 GAAGGGCAGTAAGCTAATACCTTGCTGTTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCT 431

||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||

pf_BFPB92404 GAAGGGCAGTAAGCTAATACCTTGCTGTTTT-GACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCT 462

Crb_82 432 ACCTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGG-TGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGG 490

| ||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||

pf_BFPB92463 AACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGG 522

Crb_82 491 CGTAA-GCCCCCGTAAGTGGTTCGT-AAGTTGAAAGGGAAAACCCCGGGCCCCACCTGGG 548

||||| || | |||| |||||| || |||||| | | |||| |||||||| | |||||||

pf_BFPB92523 CGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTTGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGG 582

Crb_82 549 AACTGCCTCCAAAACTGGCAAACTAAAATACGGGTAAAGGGTGGGGGAATTTCCCTGT-T 607

|||||| |||||||||||||| ||| | ||||| || ||||||| ||||||||| ||| |

pf_BFPB92583 AACTGCATCCAAAACTGGCAAGCTAGAGTACGG-TAGAGGGTGGTGGAATTTCC-TGTGT 640

Crb_82 608 CACCGGTGAAATGCCTTAAA-ATTAAGAAAGGAACCCCT-TGGGCGAAGGGGCACCCCCT 665

| ||||||||||| | | | || | ||| ||||| || ||| |||||| | ||| |||

pf_BFPB92641 -AGCGGTGAAATGCGT-AGATAT-AGGAA-GGAACACCAGTGG-CGAAGGCG-ACCACCT 694

Crb_82 666 TGGAATTA-ATTTACCCTTgggggg-gAAAACGGTGGGGAA-AAACAAGATTA 715

||| | | | | || || | || | |||| || |||||| ||||| |||||

pf_BFPB92695 -GGACTGATACTGACACT-GAGGTGCGAAAGCG-TGGGGAGCAAACAGGATTA 744

44

>Crb_84 GAGATGAGCTAGCTCCTTCGACGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCT

ACCTTATAGTTTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGAATAATCTGTTTCACC

TCATGGTGAAACACTGAAAGACGGTTTCGGCTGTCGCTATAGGATGGGCCCGCGGCGCAT

TAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGG

TGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGG

AATCTTCCACAATGGGCGAAAGCCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGATTTC

GGTTCGTAAAACTCTGTTGGTAAGGGAAGAACAAGTACAGTAGTAACTGGCTGTACCTTG

ACGGTACCTTATTAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGG

TGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTG

ATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCA

GAATAGGATAGTGGAATTCCAAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTTGGAGGAACACC

AGTGGCGAAGGCGACTATCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGGAG

CAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCCCCCATAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGG

GTTCCCCCCCTTAGTGCTGCAGCTACCGCATAAGCACTCCCCTGGGGGAGACCGGCGAAG

GGATGGAACCTCAAAGGATTTGACGGGGGCCCGCCCAACCGGTGGAGCATGGGGTTTTA

TTCCAACCAACCCCAAAAACTTTACCAGGTCTTGACTTCCCGTGGACCATTGTAAAAATTA

ATTTCCCCTTCCGGGGCCAACGGTAACAGGGGGTGCTTGTTGTCCTCCCCCCCTTTCCGG

AAATTTGGGTTAATTCCCCAACACGCCCCCTTGTATTTCTTGCCCCTTTTTTTTGGCCCTT

AAGGGACTGCCGGGAAACCCGAAAAAGGGGGAAA

gb|DQ095902.1| Pseudomonas plecoglossicida strain S14 (Ppl

_S14) 16S ribosomal RNA genes, partial sequence

Length=1429

Score = 532 bits (288), Expect = 1e-150

Identities = 632/787 (80%), Gaps = 67/787 (8%)

Strand=Plus/Plus

Crb_84 178 ATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGG 237

||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| |||| | | ||||||||

Ppl_S14 196 ATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGG 255

Crb_84 238 GTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGG 297

||||| | |||||||| |||||||||||| ||||||||||||||||||||||||| |||

Ppl_S14 256 ATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGG 315

Crb_84 298 AATCTTCCACAATGGGCGAAAGCCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGAT-TT 356

||| || |||||||||||||||||||| ||| | |||||||| |||||||||| | ||

Ppl_S14 316 AATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGG-TCTT 374

Crb_84 357 CGG-TTCGTAAA--ACTCT--GTTGGTAAGGGAAGAACAAGTACAGT-AGTAACTGGCTG 410

||| || ||||| ||| | ||||| | || ||| || ||| ||| | || || ||||

Ppl_S14 375 CGGATT-GTAAAGCACTTTAAGTTGGGA-GG-AAGGGCA-GTA-AGTTAATACCTTGCTG 429

Crb_84 411 TACCTTGACGGTACCTTATTAGAA-A-GCCAC-GGCTAACTAC-GTGCCAGCAGCCGCGG 466

| |||||| |||| | |||| | || || |||||||| | ||||||||||||||||

Ppl_S14 430 TT--TTGACGTTACCG-AC-AGAATAAGC-ACCGGCTAACT-CTGTGCCAGCAGCCGCGG 483

Crb_84 467 TAATAC-GTAGG-TGGCAAGCGTTG-TCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTG 523

|||||| | ||| || |||||||| || ||||||| ||||||||||||||||| |||||

Ppl_S14 484 TAATACAG-AGGGTG-CAAGCGTTAATC-GGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTG 540

Crb_84 524 GTTTC-TTAAGTCTG-ATGTGAAAGCCCACGG-CTCAACCGTGG-AGG-GTCATTGGAAA 578

||||| |||||| || |||||||||||| ||| ||||||| ||| | | ||| |||

Ppl_S14 541 GTTTCGTTAAGT-TGGATGTGAAAGCCC-CGGGCTCAACC-TGGGAACTG-CATCCAAAA 596

Crb_84 579 CTGG-GAGACTTGAGTGCAGAATAGGATAGTGGAATT-CCAAGTGTAGCGGTGAAATGCG 636

|||| ||| || |||| | | | ||| | |||||||| || ||||||||||||||||||

Ppl_S14 597 CTGGCGAG-CTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCT-GTGTAGCGGTGAAATGCG 654

Crb_84 637 TAGAGATTTGGA-GGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTATCTGGTCTG-TAACTGACACTG 694

|||| || ||| ||||||||||||||||||||||| | |||| ||| || |||||||||

Ppl_S14 655 TAGATATA-GGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATA-CTGACACTG 712

Crb_84 695 AGGCGCGAAAGCGTGGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCCC-CCATAAAC 753

||| |||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||||||| | || |||||

Ppl_S14 713 AGGTGCGAAAGCGTGGGG-AGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAAC 771

45

Crb_84 754 GATGAGTGCTAAGT-GTTAGGGGGTTccccccc-TT--AGTG-CTGCAGCTACCGCAT-A 807

|||| ||| | ||| || | || || |||| | ||||||| ||||| |

Ppl_S14 772 GATGTCAACTA-GCCGTT-GGAA-T-CCTTGAGATTTTAGTGGC-GCAGCTAACGCATTA 826

Crb_84 808 AGCACTCC-CCTGGGGGAG-ACCGGC-G-AAGGGATGGAACCTCAAAGGATTTGACGGGG 863

|| || ||||||| || || ||| | |||| | ||| ||||| || |||||||||

Ppl_S14 827 AGTTGACCGCCTGGGG-AGTAC-GGCCGCAAGGT-TAAAAC-TCAAATGAATTGACGGGG 882

Crb_84 864 GCCCGCCCAACCGGTGGAGCATGGGGTTTTATTCCAACCAACCCCAAAAACTTTACCAGG 923

|||||| ||| |||||||||||| ||||| |||| || |||| | || ||| ||||||||

Ppl_S14 883 GCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGG 942

Crb_84 924 TCTTGAC 930

||||||

Ppl_S14 943 CCTTGAC 949

>Crb_93

GCCAAGCTCCTTGCCCCGTATGAATGCGTTCCCGGGACCTTGATACTCGCCCTCCCATAC

CTTATAGTTTGAGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGAATAATCTGTTTCACCT

CATGGTGAAACACTGAAAGACGGTTTCGGCTGTCGCTATAGGATGGGCCCGCGGCGCATT

AGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGT

GATCGACCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGA

ATCTTCCACATGGGCGAAAGCCTGATGGAACAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGATTTCG

GTTCGTAAAACTCTGTTGTAAGGTAAGAACAGGTTCCAGTATAACTGGGCTGTTACTTGA

CGGTACCTTATTTACAAAGCCCCCGGCTAAACTACGTGCCACCAGCCCGGGGTAATACTT

TAGGTGGGCAAGCGGTTTTTCCAGGAAATTTTTGGGCCGTAAAAGCCCCCCCGCGGGGGT

TTTTTAAAGGTCTGAGGGGGAAGCCCCCCGGTTCCACCGGGGAAGGATTTTTTGGAAAAC

TGGGGAAAACTTTAGGTGGCAAAAAAAAAAAAGGGCAATTTCAACGGATCCCGGTGAAAA

AGTGCGTAAAAAATTTTGGAAGAAAACCCCCTGGGGGGAAAGGCGAAATATTTTGGTTCT

TTAAAAAGAAACCTGGGGGGCCCCAAAACGGGGGGGGCAAAAAAAAGAGGAATATAAAA

ACCCCGGGGGGTCCACCCCCCCCC

emb|AM086255.1| Pseudomonas putida 16S rRNA gene, isolate 24 2R3

(Pp_24)

Length=968

Score = 206 bits (111), Expect = 2e-52

Identities = 167/193 (86%), Gaps = 7/193 (3%)

Strand=Plus/Plus

Crb 93 178 ATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGG 237

||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||| |||| | | ||||||||

Pp_24 155 ATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGG 214

Crb 93 238 GTGATCGA-CCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGG 296

||||| | |||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||

Pp_24 215 ATGATC-AGTCACACTGGAACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGG 273

Crb 93 297 GAATCTTCCACA-TGGGCGAAAGCCTGATGGAACAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGAT-T 354

|||| || ||| |||||||||||||||| | | | |||||||| |||||||||| | |

Pp_24 274 GAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGG-TCT 332

Crb 93 355 TCGG-TTCGTAAA 366

|||| || |||||

Pp_24 333 TCGGATT-GTAAA 344

46

>Crb_94 GCGGCCGCCACTCCTTGATTCGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGG

TAGTGGGGGACAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAG

CAGGGGACCTTCGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGA

GGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTG

GAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGG

GCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACT

TTAAGTTGGGGAGGAAGGGCAGTAAGATAATACCTTGCTGTTTTTGACGTTACCGACAGA

ATAAGCACCGGGCTAACTCTGTGCCAACAGCCCCGGTAATACAAAGGGGGCAAGCGTTAA

TCGGAATTACTGGGGCGTAAAAGCCCCGTTAGGGGGTTCGTTAAATTTGGAAGGGAAAAG

CCCCGGCCTCAACTTGGGAAAACTGCCTTCCAAAACTGGGCGAACTTAAAAAAACCGGGT

AAAAGGGGGGGGGGAAATTTCCTGGGTTACCGGGGGAAAATGCCTTAAAATTTAGGGAA

GAAACCCCCTGTGGGGGAAAGGGCAACCCCCTTGGACTTTTTTTTACACCTTGGGGGGGC

CAAAACGTTTGGCAAACAAACAAGAATTAAAAACCCCCGGGTTTTCCCCCCCGAAAAAAA

ATTTCCCCACCCCCCGGGGAAAAC

gb|EF544606.2| Pseudomonas plecoglossicida strain NyZ12

(Ppl_NyZ) 16S ribosomal RNA gene, partial sequence

Length=1394

Score = 894 bits (484), Expect = 0.0

Identities = 545/572 (95%), Gaps = 14/572 (2%)

Strand=Plus/Plus

Crb_94 11 CTCCTTGATTC-GCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGA 69

||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Ppl_NyZ 5 CTCCTTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGA 84

Crb_94 70 CAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTT 129

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Ppl_NyZ 85 CAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTT 144

Crb_94 130 CGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTC 189

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Ppl_NyZ 145 CGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTC 204

Crb_94 190 ACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACA 249

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Ppl_NyZ 205 ACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACA 264

Crb_94 250 CGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGA 309

||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||

Ppl_NyZ 265 CGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGA 324

Crb_94 310 TCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGGA 369

|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |

Ppl_NyZ 325 TCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGG-A 383

Crb_94 370 GGAAGGGCAGTAAGATAATACCTTGCTGTTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGG 429

|||||||||||||| ||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||

Ppl_NyZ 384 GGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTT-GACGTTACCGACAGAATAAGCACCGG- 441

Crb_94 430 CTAACTCTGTGCCAACAGCCCCGGTAATACAAAGGGGGCAAGCGTTAATCGGAATTACTG 489

|||||||||||||| ||||| |||||||||| |||| |||||||||||||||||||||||

Ppl_NyZ 442 CTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTG 501

Crb_94 490 GGGCGTAAAAGCCC-CGTTAGGGGGTTCGTTAAATTTGGAAGGGAAAAGCCCCGGCCTCA 548

|| |||||| || | ||| ||| |||||||||| || ||| | |||| ||||||| ||||

Ppl_NyZ 502 GG-CGTAAA-GCGCGCGT-AGGTGGTTCGTTAAGTT-GGATGTGAAA-GCCCCGGGCTCA 556

Crb_94 549 ACTTGGGAAAACTGCCTTCCAAAACTGGGCGA 580

|| |||||| |||| | |||||||||| |||

Ppl_NyZ 557 ACCTGGGAA--CTGCAT-CCAAAACTGG-CGA 584

47

>Crb_95 GATACAGCTAGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGC

CCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGC

ATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTA

GCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTG

ATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAA

TCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCG

GGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGA

CGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGT

GGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGA

TGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAG

AAGAGGAAAGTGGAATCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCA

GTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAA

CAGGATAAGATACCCTGGTAGTCCCCCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTAAAAGGGTTT

CCGCCCTTAGTGCTGAGTTACCCCTTTAGCACTCCCCCTGGGGAGTACCGCCCCAAGCTG

AAACTCAAAGAAATTGACGGGGGCCCCCCAACCGGGGGAACATGTGGTTTATTTCAAACC

GCCCGAAAAACCTTACAGGTCTTGACTCCTTTGAAAACCCTAAAAATAGGCCTTTCCTTCG

GAGCACCAACCCTGATCTTATTGCACTTTAANGGGGACCTTAAGGGACTGCAGGAAAACC

GGAAGAGGGGGGAAACCCCAATCTTTGCCTTTANA

gb|EF595656.1| Pseudomonas plecoglossicida clone Pw8(Ppl_Pw8)16S

ribosomal RNA gene, partial sequence

Length=839

Score = 398 bits (215), Expect = 2e-112

Identities = 478/597 (80%), Gaps = 49/597 (8%)

Strand=Plus/Plus

Crb_95 172 GTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTG 231

|||| ||||||||||||||| ||||| ||||||||||||| ||||| |||| | | |||

Ppl_Pw8 194 GTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTG 253

Crb_95 232 AGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAG 291

||||| ||||| | |||||||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||

Ppl_Pw8 254 AGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCCC 313

Crb_95 292 TAGGGAATCTTCCG-CAATGGACGAAAGTCTGA-CGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAA 349

| |||||| || | |||||| |||||| |||| | ||| | |||||||| |||| |||

Ppl_Pw8 314 TGGGGAATATTG-GACAATGGGCGAAAGCCTGATCC-AGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAA 371

Crb_95 350 GG-CTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTT--GTTAGGGAAGAACAAGT-GCTA-GTTGAATAA 404

|| ||| ||| | ||||| | || || ||| |||| ||| | | || | | ||||

Ppl_Pw8 372 GGTCTT-CGGATTGTAAAGCACT-TTAAGTT-GGGAGGAAGG-GCAG-TAAGCT-AATAC 425

Crb_95 405 GCTGGCACCTT-GACGGTACCTAACCAGAA-A-GCCAC-GGCTAACTAC-GTGCCAGCAG 459

|| || || |||| |||| | | |||| | || || |||||||| | ||||||||||

Ppl_Pw8 426 -CTTGCTGTTTTGACGTTACCGA-C-AGAATAAGC-ACCGGCTAACT-CTGTGCCAGCAG 480

Crb_95 460 CCGCGGTAATAC-GTAGG-TGGCAAGCGTTA-TCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCG 516

|||| ||||||| | ||| || ||||||||| || ||||||| |||||||||||||||||

Ppl_Pw8 481 CCGCCGTAATACAG-AGGGTG-CAAGCGTTAATC-GGAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCG 537

Crb_95 517 CAGGTGGTTTC-TTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGG-CTCAACCGTGG-AGG-GTCATT 572

| |||||| | ||||||| ||||||||||||| ||| ||||||| ||| | | |||

Ppl_Pw8 538 TACGTGGTT-CGTTAAGTCGGATGTGAAAGCCC-CGGGCTCAACC-TGGGAACTG-CATC 593

Crb_95 573 GGAAACTGG-GAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAAT--CCATGTGTAGCGGTGAA 629

||||||| ||| || |||| | | ||||| ||||||| || |||||||||| |||

Ppl_Pw8 594 CCAAACTGGCGAG-CTAGAGTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCC-TGTGTAGCGGCGAA 651

Crb_95 630 ATGCGTAGAGATATGGA-GGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTG-TACTGAC 687

||||||||| ||| ||| ||||||||||||||||||||||| |||| ||| |||||||

Ppl_Pw8 652 ATGCGTAGATATA-GGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTGAC 710

Crb_95 688 ACTGAGGCGC-GAAAGCGTGGGGAGC-AACAGGATAAGATACCCTGGTAGTCCCCCC 742

||||||| || | ||||||||||||| ||| |||| |||| ||||||| ||||||||

Ppl_Pw8 711 ACTGAGGTGCCGCAAGCGTGGGGAGCCAACCGGATTAGATCCCCTGGTTGTCCCCCC 767

48