P03928RO_03/SK00621-2/2016.11 p. 1/14

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx SK006 50 de teste de utilizat cu Autostainer Link 48 Destinaţie Pentru diagnosticare in vitro

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx este o analiză imunohistochimică calitativă în care se utilizează anticorpul monoclonal de şoarece clonă 22C3 împotriva PD-L1 (Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3) pentru detectarea proteinei PD-L1 în ţesut cu cancer pulmonar nonmicrocelular (NSCLC) fixat cu formol şi introdus în parafină cu ajutorul sistemului de vizualizare EnVision FLEX în Autostainer Link 48. Expresia proteinei PD-L1 se identifică cu ajutorul scorului de proporţie tumorală (TPS), care este procentul de celule tumorale viabile care indică colorare membranoasă parţială sau completă.

Analiza PD-L1 IHC 22C3 pharmDx este indicată ca ajutor la identificarea pacienţilor cu NSCLC pentru tratarea acestora cu KEYTRUDA® (pembrolizumab).

Rezumat şi explicaţie Legarea liganzilor PD-1, PD-L1 şi PD-L2, la receptorul PD-1 de pe celulele T inhibă proliferarea celulelor T şi producţia de citochină. În unele dintre tumori se produce hiperreglarea liganzilor PD-1, iar semnalizarea pe această cale poate contribui la inhibarea supravegherii active a tumorilor de sistemul imunitar prin celule T. KEYTRUDA este un anticorp monoclonal umanizat, care se leagă de receptorul PD-1 şi îi blochează interacţiunea cu PD-L1 şi cu PD-L2, eliberând inhibarea mediată pe calea PD-1 a răspunsului imun, inclusiv a răspunsului imun antitumoral. La modelele tumorale singene de şoareci, blocarea activităţii receptorului PD-1 a condus la reducerea dezvoltării tumorii (1).

Principiul procedurii PD-L1 IHC 22C3 pharmDx conţine reactivii optimizaţi şi protocolul necesare pentru realizarea procedurii de colorare IHC a specimenelor FFPE, cu ajutorul instrumentului Autostainer Link 48. După incubare cu anticorpul monoclonal primar împotriva PD-L1 sau cu reactivul de control negativ (NCR), specimenele sunt incubate cu un anticorp Linker specific speciei gazde a anticorpului primar, apoi sunt incubate cu un reactiv de vizualizare pregătit pentru utilizare, care constă din molecule de anticorp secundar şi din molecule de peroxidază din hrean cuplate cu coloană vertebrală polimerică din dextran. Conversia enzimatică a cromogenului adăugat ulterior generează precipitarea unui produs de reacţie vizibil pe locul antigenului. Culoarea reacţiei cromogene este modificată de un reactiv potenţiator de cromogeni. După aceea, specimenul poate fi contracolorat şi acoperit cu lame. Rezultatele se interpretează cu ajutorul unui microscop optic.

Materiale furnizate Fiecare kit conţine 19,5 ml de anticorp primar împotriva PD-L1 (o concentraţie proteinică de aproximativ 3 µg/ml) şi reactivii necesari pentru efectuarea a 50 de teste în până la 15 cicluri individuale. Materialele indicate mai jos sunt suficiente pentru 50 de teste (50 de lame incubate cu anticorp primar împotriva PD-L1 şi 50 de lame incubate cu reactivul de control negativ corespunzător, în total 100 de lame). Numărul de teste se bazează pe utilizarea a 2 x 150 µl per lamă din fiecare reactiv, cu excepţia DAB+ şi a Target Retrieval Solution.

Kitul oferă materiale suficiente pentru maximum 15 cicluri de colorare individuale. Cantitate Descriere 1 x 34,5 ml Peroxidase-Blocking Reagent

Soluţie tampon care conţine apă oxigenată, detergent şi 0,015 mol/l de azidă de sodiu.

1 x 19,5 ml

Anticorp primar: Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3

Anticorp monoclonal de şoarece (IgG1) împotriva PD-L1 în soluţie tampon, care conţine proteină stabilizatoare şi 0,015 mol/l de azidă de sodiu.

1 x 15 ml

Reactiv de control negativ

Anticorp monoclonal de şoarece IgG de control în soluţie tampon, care conţine proteină stabilizatoare şi 0,015 mol/l de azidă de sodiu.

1 x 34,5 ml Mouse LINKER

Anticorp secundar de iepure împotriva imunoglobulinelor de şoarece în soluţie tampon, care conţine proteină stabilizatoare şi 0,015 mol/l de azidă de sodiu.

1 x 34,5 ml Visualization Reagent-HRP

Dextran cuplat cu molecule de peroxidază şi cu molecule de anticorp secundar de capră împotriva imunoglobulinelor de iepure şi de şoarece în soluţie tampon, care conţine proteină stabilizatoare şi un agent antimicrobian.

VISUALIZATION REAGENT-HRP

LINKER, ANTI-MOUSE

NEGATIVE CONTROL REAGENT

MONOCLONAL MOUSE ANTI-PD-L1 CLONE 22C3

PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT

P03928RO_03/SK00621-2/2016.11 p. 2/14

15 x 7,2 ml DAB+ Substrate Buffer

Soluţie tampon care conţine apă oxigenată şi un agent antimicrobian.

1 x 5 ml DAB+ Chromogen

3,3’-diaminobenzidină tetraclorură în solvent organic.

1 x 34,5 ml DAB Enhancer

Sulfat de cupru în apă.

6 x 30 ml EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, 50x

Soluţie tampon, pH 6,1, care conţine detergent şi un agent antimicrobian.

15 lame PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Control Slides

Fiecare lamă conţine secţiuni de două linii celulare în suspensie fixate cu formol şi introduse în parafină: NCI-H226* cu expresie moderată a proteinei PD-L1 şi MCF-7 cu expresie negativă a proteinei PD-L1.

P

D-L

1 IH

C 2

2C3

ph

arm

Dx

XX

XX

X

*Dr. AF Gazdar şi dr. JD Minna din cadrul NIH sunt recunoscuţi pentru contribuţia adusă la dezvoltarea liniei NCI-H226 (Număr ATCC: CRL-5826™) (2). Notă: Toţi reactivii incluşi sunt concepuţi special pentru a fi utilizaţi cu acest kit. Pentru ca testul să se deruleze conform specificaţiilor, nu se poate efectua nicio înlocuire în afară de EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, 50x (Cod K8005). Analiza PD-L1IHC 22C3 pharmDx a fost adaptată pentru utilizarea cu Autostainer Link 48. Pentru mai multe informaţii, consultaţi ghidurile de utilizare a instrumentelor Autostainer Link 48 şi PT Link. Materiale necesare, dar nefurnizate PT Link Pre-treatment Module (Cod PT100/PT101) Autostainer Link 48 (Cod AS480) EnVision FLEX Wash Buffer, 20x (Cod K8007) Hematoxylin (Cod K8008) Apă distilată sau deionizată (apă de calitatea unui reactiv) Cronometru Ţesuturi pozitive şi negative de utilizat ca controale de proces (consultaţi secţiunea Controlul calităţii) Lame pentru microscop: Dako FLEX IHC Microscope Slides (Cod K8020) sau lame încărcate Fisherbrand Superfrost Plus Lame de acoperire Mediu de montare permanent şi reactivi auxiliari necesari pentru lamele de acoperire la montare Microscop optic (obiectiv cu mărire de 4x–40x) Precauţii 1. Pentru diagnosticare in vitro 2. Pentru utilizatori profesionişti. 3. Acest produs conţine azidă de sodiu (NaN3), o substanţă chimică deosebit de toxică în formă pură. La concentraţiile produsului,

deşi nu este clasificată ca fiind periculoasă, NaN3 poate reacţiona cu plumbul şi cu cuprul din conducte, formând acumulări de azide metalice extrem de explozive. La eliminare, spălaţi din abundenţă cu apă, pentru a preveni orice acumulare de azidă metalică în conducte (3).

4. Anticorpul primar, reactivul de control negativ, linkerul şi reactivul de vizualizare conţin materiale de origine animală. 5. Specimenele, înainte şi după fixare şi toate materialele expuse la acestea trebuie să fie manipulate ca şi cum ar putea transmite

infecţii şi să se elimine luându-se măsurile de precauţie adecvate (4). 6. Alte durate de incubare, temperaturi sau metode în afară de cele specificate pot genera rezultate eronate. 7. Reactivii au fost diluaţi corect. Diluarea suplimentară poate conduce la pierderea colorării antigenice. 8. Reactivul de vizualizare, cromogenul lichid DAB+ şi soluţia substrat-cromogen DAB+ preparată pot fi afectate negativ dacă sunt

expuse la niveluri de lumină cu intensitate foarte mare. Nu depozitaţi componentele sistemului şi nu realizaţi analize în lumină puternică, de exemplu în lumină solară directă.

9. Resturile de parafină pot genera rezultate fals negative. 10. Utilizarea altor volume de reactiv în afară de cele recomandate poate conduce la pierderea imunoreactivităţii vizibile a PD-L1. 11. Rezultatele unui studiu de mică amploare au arătat un interval dinamic asemănător al expresiei proteinei PD-L1 la perechile de

specimene cu NSCLC primar şi metastatic. Este posibil să existe diferenţe de expresie a proteinei PD-L1 între tumorile primare şi punctele metastatice la acelaşi pacient.

CONTROL SLIDES

EnVision™ FLEXTARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW pH (50X)

DAB ENHANCER

DAB+ CHROMOGEN

DAB+ SUBSTRATE BUFFER

MCF-7: PD-L1 negativă

NCI-H226: PD-L1 pozitivă

P03928RO_03/SK00621-2/2016.11 p. 3/14

12. Este posibil ca pentru secţiunile mari de ţesut să fie nevoie de 3 x 150 µl de reactiv. 13. Ca regulă generală, persoanele sub 18 ani nu au permisiunea de a lucra cu acest produs. Utilizatorii trebuie să fie instruiţi cu

atenţie cu privire la procedurile corecte de lucru, la proprietăţile periculoase ale produsului şi la instrucţiunile de siguranţă necesare. Consultaţi Fişa cu date de siguranţă (SDS) pentru informaţii suplimentare.

14. Purtaţi echipament individual de protecţie adecvat, pentru a evita contactul cu ochii și cu pielea. 15. Soluţia neutilizată trebuie eliminată în conformitate cu reglementările locale, naţionale şi federale. 16. Fişă cu date de siguranţă disponibilă pentru utilizatorii profesionişti, la cerere.

Pericol DAB+ Chromogen: 1–5% bifenil-3,3',4,4'-tetraclorură de tetrametiltetraamoniu H350 Poate cauza cancer. H341 Suspectat de cauzarea unor defecte genetice. P201 Procuraţi instrucţiuni speciale înainte de utilizare. P202 A nu se manipula decât după ce au fost citite şi înţelese toate măsurile de securitate. P280 Purtaţi mănuşi de protecţie. Purtaţi echipament de protecţie a ochilor sau a feţei. Purtaţi îmbrăcăminte de protecţie. P308 + P313 ÎN CAZ DE expunere sau de posibilă expunere: Consultaţi medicul. P405 A se depozita sub cheie. P501 Aruncaţi conţinutul şi recipientul în conformitate cu toate reglementările locale, regionale, naţionale şi

internaţionale.

Avertisment EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH (50x): 1-5% Acid citric H319 Cauzează iritaţii grave ale ochilor. H411 Toxic pentru formele de viaţă acvatice, cu efecte pe termen lung. P280 Purtaţi echipament de protecţie a ochilor sau a feţei. P273 Evitaţi eliberarea în mediu. P264 Spălaţi-vă mâinile bine după utilizare. P305 + P351 + P338

ÎN CAZ DE CONTACT CU OCHII: Clătiţi cu atenţie cu apă, timp de mai multe minute. Scoateţi lentilele de contact, dacă este cazul şi dacă acest lucru se poate face cu uşurinţă. Continuaţi să clătiţi.

P337 + P313 Dacă iritarea ochilor persistă: Consultaţi medicul. P501 Aruncaţi conţinutul şi recipientul în conformitate cu toate reglementările locale, regionale, naţionale şi

internaţionale. Depozitare Depozitaţi toate componentele kitului PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, inclusiv lamele de control, la întuneric la 2-8 °C atunci când nu le utilizaţi în Autostainer Link 48.

Nu utilizaţi kitul după data de expirare înscrisă la exteriorul cutiei kitului. În cazul în care reactivii sunt depozitaţi în alte condiţii decât cele specificate în acest prospect, aceştia trebuie să fie validaţi de către utilizator.

Nu există semne vizibile care să indice instabilitatea acestui produs, aşadar controalele pozitive şi negative trebuie să fie testate simultan cu specimenele pacienţilor.

Pregătirea specimenelor Specimenele trebuie să fie manevrate astfel încât să se protejeze ţesutul pentru colorarea IHC. Pentru toate specimenele trebuie să se folosească metode standard de procesare a ţesuturilor.

Secţiuni introduse în parafină Ţesuturile corespunzătoare pentru utilizare sunt cele fixate în formol şi introduse în parafină. Alţi agenţi de fixare nu au fost validaţi şi pot genera rezultate eronate. Se recomandă o durată de fixare de 12–72 de ore în 10% formol cu soluţie tampon (NBF), deşi un studiu efectuat pe un număr limitat de probe a arătat că o durată de fixare de 4–168 de ore în 10% NBF nu a modificat sistematic detectarea PD-L1. O durată de fixare ≤ 3 ore poate genera o detecţie variabilă a PD-L1. Specimenele se introduc în blocuri cu grosime de 3 sau 4 mm, se fixează în formol şi se deshidratează, apoi se limpezesc într-o serie de alcooluri şi xilen, după care se introduc în parafină topită. Temperatura parafinei nu trebuie să depăşească 60 °C. Blocurile de ţesuturi FFPE cu vechime de cel puţin 5 ani pot conduce la pierderea imunoreactivităţii proteinei PD-L1.

Specimenele de ţesut se taie în secţiuni de 4-5 µm. După secţionare, ţesuturile se montează pe lame Fisherbrand Superfrost Plus sau pe lame pentru microscop Dako FLEX IHC (Cod K8020), apoi se introduc într-un cuptor la 58 ± 2 °C, timp de o oră. Pentru menţinerea antigenicităţii, după ce sunt montate pe lame, secţiunile de ţesut se ţin la întuneric la 2-8 °C (de preferat) sau la temperatura camerei de maximum 25 °C şi se colorează în termen de 6 luni de la secţionare. Lamele se depozitează şi se manevrează la temperaturi de maximum 25 °C în orice moment după montare, pentru a se asigura integritatea şi antigenicitatea ţesuturilor.

Utilizarea analizei PD-L1 IHC 22C3 pharmDx pe ţesuturi decalcifiate nu a fost validată şi nu este recomandată.

Pregătirea reactivului Următorii reactivi se pregătesc înainte de colorare:

EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, 50x Pregătiţi o cantitate suficientă de 1x Target Retrieval Solution, Low pH diluând Target Retrieval Solution, Low pH, 50x în raport 1:50 utilizând apă distilată sau deionizată (apă de calitatea unui reactiv); pH-ul soluţiei 1x Target Retrieval Solution trebuie să fie de 6,1 ± 0,2. Dacă pH-ul soluţiei 1x Target Retrieval Solution este mai mic de 5,9, rezultatele generate pot fi eronate. Cu o sticluţă de 30 ml de Target Retrieval Solution, Low pH, 50x, diluată în raport 1:50 se obţin 1,5 l de 1x reactiv, suficient pentru umplerea unei cuve PT Link care tratează până la 24 de lame la o utilizare. Aruncaţi 1x Target Retrieval Solution după trei utilizări şi nu o utilizaţi după 5 zile de la diluare.

Dacă este necesară mai multă soluţie, EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, 50x este disponibilă cu codul K8005.

P03928RO_03/SK00621-2/2016.11 p. 4/14

EnVision FLEX Wash Buffer, 20x Pregătiţi o cantitate suficientă de soluţie tampon de spălare diluând Wash Buffer 20x în raport 1:20 utilizând apă distilată sau deionizată (apă de calitatea unui reactiv) pentru etapele de spălare. Depozitaţi soluţia 1x neutilizată la 2–8 ºC timp de maximum o lună. Aruncaţi soluţia tampon dacă are un aspect tulbure. Pentru mai multe informaţii, consultaţi ghidul de utilizare a instrumentului Autostainer Link 48.

Soluţia EnVision FLEX Wash Buffer, 20x este disponibilă cu codul K8007.

DAB+ Substrate-Chromogen Solution Această soluţie se amestecă bine înainte de utilizare. Niciun precipitat care se formează în soluţie nu afectează calitatea colorării. Pentru a prepara DAB+ Substrate-Chromogen Solution, adăugaţi 1 picătură de Liquid DAB+ Chromogen per ml de DAB+ Substrate Buffer şi amestecaţi. Soluţia substrat-cromogen preparată este stabilă timp de 5 zile dacă este depozitată la întuneric, la 2–8 C. Observaţii importante:

Dacă utilizaţi o sticluţă întreagă de DAB+ Substrate Buffer, adăugaţi 9 picături de DAB+ chromogen. Deşi eticheta specifică 7,2 ml, acesta este volumul utilizabil şi nu include „volumul mort” din sticlă.

Culoarea soluţiei Liquid DAB+ Chromogen din sticlă poate varia de la transparent la maro levănţică. Acest lucru nu afectează performanţele produsului. Diluaţi conform indicaţiilor de mai sus. Adăugarea unei cantităţi prea mari de Liquid DAB+ Chromogen în DAB+ Substrate Buffer conduce la deteriorarea semnalului pozitiv.

Procedura de colorare cu soluţia Autostainer Link 48 Observaţii procedurale Înainte de folosire, utilizatorul trebuie să citească aceste instrucţiuni cu atenţie şi să se familiarizeze cu toate componentele şi instrumentele (consultaţi secţiunea Precauţii). Toţi reactivii trebuie să fie aduşi la temperatura camerei (20-25 °C) înainte de imunocolorare. De asemenea, toate incubaţiile trebuie să se efectueze la temperatura camerei. Nu lăsaţi secţiunile de ţesut să se usuce în timpul procedurii de colorare. Secţiunile de ţesut uscate pot prezenta o coloraţie nespecifică intensă. Toate etapele necesare şi duratele de incubare pentru colorare sunt preprogramate în software-ul Dako Link. Pentru mai multe informaţii despre protocoalele de programare şi despre încărcarea lamelor şi a reactivilor, consultaţi ghidurile de utilizare ale instrumentelor Autostainer Link 48 şi PT Link. Notă: Reactivii şi instrucţiunile furnizate cu acest sistem au fost concepute pentru performanţe maxime atunci când sunt utilizate cu reactivii şi cu materialele recomandate. Rediluarea reactivilor sau modificarea duratelor de incubare sau a temperaturilor poate genera rezultate eronate sau neconcordante. Protocolul de colorare Selectaţi protocolul de colorare PD-L1 IHC 22C3 pharmDx din opţiunile meniului derulant din Dako Link. Toate etapele necesare şi duratele de incubare pentru colorare sunt preprogramate în Autostainer Link 48. Dacă protocoalele corespunzătoare pentru PD-L1 IHC 22C3 pharmDx nu se găsesc pe serverul dvs., contactaţi reprezentantul tehnic de service pentru a primi protocoalele. Pasul 1: Procedura de deparafinare, rehidratare şi recuperare ţintă (3 în 1)

Pentru mai multe detalii, consultaţi Ghidul de utilizare PT Link.

Setaţi PT Link (Cod PT100/PT101) Preheat (Preîncălzire) şi Cool (Răcire) la 65 °C. Setaţi Heat (Încălzire) la 97 °C, pentru 20 de minute. ►Umpleţi cuvele PT Link cu 1,5 l per cuvă cu 1x soluţie de lucru Target Retrieval Solution, Low pH, pentru a acoperi secţiunile de ţesut. ►Preîncălziţi Target Retrieval Solution la 65 °C. ►Scufundaţi stativele Autostainer cu secţiuni de ţesut FFPE montate în Target Retrieval Solution, Low pH, (1x soluţie de lucru)

preîncălzită în cuva PT Link. Incubaţi timp de 20 de minute la 97 °C. ►După ce se finalizează incubarea în soluţie de recuperare ţintă şi temperatura scade la 65 °C, scoateţi fiecare stativ Autostainer cu

lame din cuva PT Link şi imediat aşezaţi stativul Autostainer cu lame într-o cuvă (ex. PT Link Rinse Station, Cod PT109) cu Wash Buffer (Cod K8007) la temperatura camerei, diluată.

►Incubaţi lamele în Wash Buffer la temperatura camerei, diluată, timp de 5 minute. Pasul 2: Procedura de colorare După procedura de deparafinare, rehidratare şi recuperare ţintă (3 în 1), stativele Autostainer cu lame se aşează în Autostainer Link 48. Instrumentul realizează procesul de colorare aplicând reactivul corespunzător, monitorizând durata de incubare şi limpezind lamelele între reactivi. Duratele de incubare sunt preprogramate în software-ul Dako Link. Pasul 3: Contracolorare Lamele se contracolorează timp de 5 minute cu Hematoxylin (Link) (Cod K8008). Durata de incubare în Hematoxylin este preprogramată în protocol. Pasul 4: Montare Sunt necesare medii de montare neapoase permanente. Notă: Este posibil ca lamele colorate să se decoloreze uşor, în funcţie de câţiva factori, printre care, fără limitare la, contracolorare, materiale şi metode de montare şi condiţii de depozitare a lamelor. Pentru a reduce la minimum decolorarea, depozitaţi lamele în întuneric, la temperatura camerei (20-25 °C).

P03928RO_03/SK00621-2/2016.11 p. 5/14

Controlul calităţii Reactivilor din PD-L1 IHC 22C3 pharmDx le-a fost controlată calitatea prin imunohistochimie, utilizându-se procedurile de recuperare ţintă şi de colorare descrise mai sus. Abaterea de la procedurile recomandate pentru fixarea, procesarea şi introducerea ţesuturilor în laboratorul utilizatorului poate produce variaţii însemnate în rezultate. Fiecare ciclu de colorare trebuie să includă controale calitative. Aceste controale calitative sunt indicate în Tabelul 1 şi includ: un specimen de ţesut de la pacient colorat cu hematoxilină şi eozină (HE), ţesuturi de control pozitiv şi negativ furnizate de un laborator şi o lamă pentru linii celulare de control furnizată de Dako (5). Pentru informaţii suplimentare, în S.U.A. consultaţi regulile de control al calităţii din Programul de acreditare pentru imunohistochimie al Colegiului American al Patologilor (College of American Pathologists - CAP) şi CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry (Asigurarea calităţii pentru imunocitochimie), directivă aprobată (5, 6, 7). Verificarea analizei Înainte de prima utilizare a unui sistem de colorare într-o procedură de diagnosticare, utilizatorul trebuie să verifice performanţa analizei, testând-o pe o serie de ţesuturi furnizate de un laborator cu caracteristici de performanţă IHC demonstrate, care reprezintă ţesuturi pozitive şi negative demonstrate. Consultaţi procedurile de control al calităţii menţionate secţiunea de mai sus referitoare la controlul calităţii. Aceste proceduri de control al calităţii trebuie să se repete pentru fiecare lot nou de anticorpi sau de fiecare dată când se produce o modificare în parametrii analizei. Opţiunile de soluţionare a posibilelor probleme, cauzele problemelor şi acţiunile corective sugerate sunt indicate în Tabelul 10. Interpretarea evaluării - NSCLC Toate celulele tumorale viabile de pe toată lama trebuie să fie evaluate şi incluse în stabilirea evaluării PD-L1. Pentru ca specimenul să fie considerat adecvat pentru evaluarea PD-L1, trebuie să fie prezente cel puţin 100 de celule tumorale viabile pe lama colorată PD-L1. Pentru evaluarea cu succes a specimenelor colorate cu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, este esenţial să se evalueze celulele adecvate, să se identifice locaţia celulară adecvată şi să se interpreteze corect intensitatea colorării. Evaluarea lamelor trebuie să fie efectuată de către un patolog, cu ajutorul unui microscop optic. Pentru interpretarea colorării imunohistochimice şi a evaluării, este necesar un obiectiv cu mărire de 10-40x. Orice colorare membranoasă perceptibilă a celulelor tumorale trebuie să fie inclusă în evaluare. Se evaluează colorarea membranoasă parţială sau completă a celulelor (≥ 1+), care este percepută diferit de colorarea citoplasmică. Colorarea citoplasmică se consideră colorare nespecifică şi se exclude din evaluarea intensităţii colorării. Celulele normale şi celulele imune asociate tumorii, cum ar fi limfocitele infiltrante sau macrofagele, nu trebuie să fie incluse în evaluarea pentru determinarea pozitivităţii PD-L1. Specimenele de tumoare colorate cu NCR trebuie să prezinte colorare specifică 0 şi colorare de fundal ≤ 1+. Scorul de proporţie tumorală (TPS) este procentul de celule tumorale viabile care indică colorarea parţială sau completă a membranei (≥ 1+). Specimenul trebuie să fie considerat PD-L1 pozitiv dacă TPS ≥ 1% din celulele tumorale viabile prezintă colorare membranoasă de orice intensitate (adică ≥ 1+). Pentru fiecare ciclu de colorare, lamele trebuie să fie examinate în ordinea indicată în Tabelul 1, pentru a se stabili validitatea ciclului de colorare şi pentru a se permite evaluarea colorării probei de ţesut. Pentru mai multe indicaţii, consultaţi Manualul de interpretare PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Recomandări suplimentare pentru interpretarea colorării cu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx 1. Pentru verificarea colorării membranei celulare, utilizaţi un obiectiv cu mărire 10–40x. 2. Diverse elemente neţintă, cum ar fi celulele imune asociate tumorii (adică macrofage) şi celulele stromale, pot, de asemenea, să se

coloreze pozitiv pentru PD-L1, însă acest lucru nu trebuie să fie inclus în evaluare. Tabelul 1. Ordine recomandată pentru evaluarea lamelor

Specimene Motivaţie Cerinţe 1. HE (furnizate de laborator)

Mai întâi se evaluează colorarea cu hematoxilină şi cu eozină (HE) a specimenului de ţesut, pentru a se evalua histologia ţesutului şi calitatea conservării.

PD-L1 IHC 22C3 pharmDx şi colorarea HE trebuie să se efectueze pe secţiuni în serie din acelaşi bloc de parafină al specimenului. Pentru ca specimenul să fie considerat adecvat pentru evaluarea PD-L1, trebuie să fie prezente cel puţin 100 de celule tumorale viabile. Specimenele de ţesut trebuie să fie intacte şi bine conservate şi trebuie să confirme indicaţia tumorală.

2. Lamă pentru linii celulare de control (furnizată de Dako)

Trebuie să se examineze lama pentru linii celulare de control colorată cu anticorpul primar PD-L1 din PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, pentru a se confirma că toţi reactivii funcţionează corespunzător. Lama pentru linii celulare de control conţine suspensia de linii celulare pozitivă la PD-L1 şi suspensia de linii celulare negativă la PD-L1.

În fiecare ciclu de colorare, trebuie să se coloreze o lamă pentru linii celulare de control cu anticorpul primar împotriva PD-L1. Criterii de acceptare pentru NCI-H226 (linie celulară de control PD-L1 pozitiv): Colorare membranoasă la ≥ 70% din celule la o intensitate medie a

colorării ≥ 2+. Colorare nespecifică la o intensitate < 1+. Criterii de acceptare pentru MCF-7 (linie celulară de control PD-L1 negativ): Fără colorare specifică. Colorare nespecifică la o intensitate < 1+. Reţineţi că ocazional se poate

observa colorarea câtorva celule din suspensia de celule MCF-7. Se aplică următoarele criterii de acceptare: prezenţa a ≤ 10 din totalul de celule cu colorare distinctă a membranei plasmatice sau colorarea citoplasmică cu intensitate ≥ 1+ în limitele suspensiei celulare MCF-7 este acceptabilă.

Dacă oricare dintre liniile celulare de control nu îndeplineşte aceste criterii, toate rezultatele obţinute cu specimenele pacientului trebuie să fie considerate nevalide.

P03928RO_03/SK00621-2/2016.11 p. 6/14

3. Lame pentru ţesut de control pozitiv (furnizate de laborator)

Următoarele trebuie să fie examinate lamele pentru ţesut de control pozitiv colorate atât cu anticorpul primar PD-L1, cât şi cu reactivul de control negativ. Cu aceste lame se verifică dacă metoda de fixare şi procesul de recuperare a epitopilor sunt eficiente. Controalele pozitive cunoscute trebuie să se utilizeze numai pentru monitorizarea performanţelor corecte ale ţesuturilor procesate şi ale reactivilor de testare, NU ca ajutor la stabilirea unui diagnostic clar pentru probele pacientului.

Controalele trebuie să fie specimene de biopsie/chirurgicale din aceeaşi indicaţie tumorală ca specimenul pacientului, fixate, procesate şi introduse cât mai repede posibil în acelaşi mod ca proba(ele) pacientului. Utilizaţi specimene intacte pentru interpretarea rezultatelor colorării, întrucât celulele necrotice sau degenerate se colorează adesea nespecific. Ţesuturile selectate ca ţesuturi de control pozitiv trebuie să prezinte colorare pozitivă slabă spre moderată la colorarea cu anticorpul PD-L1, pentru a ajuta la detectarea variaţiilor minore ale sensibilităţii analizei. În fiecare ciclu de colorare trebuie să se includă câte două lame pentru ţesut de control pozitiv. Lamă colorată cu anticorpul împotriva PD-L1: Trebuie să se observe prezenţa colorării maro a membranei plasmatice. Colorarea nespecifică trebuie să fie ≤ 1+. Lamă colorată cu reactiv de control negativ: Fără colorare membranoasă. Colorarea nespecifică trebuie să fie ≤ 1+. În cazul în care controalele pozitive de ţesut nu demonstrează o colorare pozitivă corespunzătoare, rezultatele obţinute cu specimenele test trebuie să fie considerate nevalide.

4. Lame pentru ţesut de control negativ (furnizate de laborator)

Următoarele trebuie să fie verificate lamele pentru țesut de control negativ (despre care s-a dovedit că sunt negative la PD-L1) colorate atât cu anticorpul primar împotriva PD-L1, cât şi cu reactiv de control negativ, pentru a se verifica specificitatea etichetării antigenului ţintă de anticorpul primar. Alternativ, porţiuni negative ale ţesutului de control pozitiv pot servi drept ţesut de control negativ, însă acest lucru trebuie să fie verificat de către utilizator.

Controalele trebuie să fie specimene de biopsie/chirurgicale din aceeaşi indicaţie tumorală ca specimenul pacientului, fixate, procesate şi introduse cât mai repede posibil în acelaşi mod ca proba(ele) pacientului. În fiecare ciclu de colorare trebuie să se includă câte două lame pentru ţesut de control negativ. Lamă colorată cu anticorpul împotriva PD-L1: Fără colorarea membranei celulelor tumorale. Colorarea nespecifică trebuie să fie ≤ 1+. Lamă colorată cu reactiv de control negativ: Fără colorare membranoasă. Colorarea nespecifică trebuie să fie ≤ 1+. În cazul în care apare colorare specifică a membranei celulare în lamele cu ţesut de control negativ, rezultatele obţinute cu specimenul pacientului trebuie să fie considerate nevalide.

5. Lama cu ţesutul pacientului colorată cu reactiv de control negativ

Se examinează specimenele pacientului colorate cu reactiv de control negativ din PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Reactivul de control negativ se foloseşte în locul anticorpului primar şi ajută la interpretarea colorării specifice la locul antigenului.

Absenţa colorării membranei celulare verifică etichetarea specifică a antigenului ţintă de anticorpul primar. Colorarea nespecifică trebuie să fie ≤ 1+.

6. Lama cu ţesutul pacientului colorată cu anticorp primar PD-L1

Ultima dată se examinează întreaga lamă a specimenelor pacientului colorate cu anticorpul primar PD-L1 din PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Pentru informaţii specifice cu privire la imunoreactivitatea PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, consultaţi secţiunile Rezumat şi explicaţie, Limitări şi Caracteristici de performanţă.

Trebuie să se evalueze intensitatea colorării pozitive în contextul oricărei colorări de fundal nespecifice observate pe lama cu reactiv de control negativ a pacientului din acelaşi ciclu. Ca în cazul oricărui alt test imunohistochimic, un rezultat negativ înseamnă că antigenul nu a fost detectat, nu neapărat că antigenul a fost absent în celulele/ţesuturile analizate. Toate celulele tumorale viabile de pe toată lama pacientului colorată cu anticorpii PD-L1 trebuie să fie evaluate şi incluse în evaluarea punctării PD-L1. Pentru ca specimenul să fie considerat adecvat pentru evaluarea PD-L1, trebuie să fie prezente cel puţin 100 de celule tumorale viabile.

Limitări generale 1. Imunohistochimia este un proces de diagnosticare în mai mulţi paşi, care presupune formare specializată în selectarea reactivilor

adecvaţi, selectarea, fixarea şi procesarea ţesuturilor, pregătirea lamei pentru imonuhistochimie şi interpretarea rezultatelor colorării.

2. Colorarea ţesutului depinde de manipularea şi de procesarea ţesutului înainte de colorare. Fixarea, congelarea, decongelarea, spălarea, uscarea, încălzirea sau secţionarea necorespunzătoare şi contaminarea cu alte ţesuturi sau lichide pot produce artefacte, captarea anticorpilor sau rezultate fals negative. Rezultatele inconsecvente pot fi cauzate de variaţiile metodelor de fixare şi de introducere sau de neregularităţile din interiorul ţesutului.

3. Contracolorarea excesivă sau incompletă poate afecta interpretarea corectă a rezultatelor. 4. Interpretarea clinică a oricărei coloraţii pozitive sau a absenţei acesteia trebuie să se evalueze în contextul prezentării clinice, al

morfologiei şi al altor criterii histopatologice. Interpretarea clinică a oricărei coloraţii sau a absenţei acesteia trebuie să fie completată cu studii morfologice şi controale adecvate, precum şi cu alte teste de diagnosticare. Interpretarea preparatului colorat este responsabilitatea unui patolog calificat, familiarizat cu anticorpi, cu reactivi și cu metodele utilizate. Colorarea trebuie să fie efectuată într-un laborator autorizat certificat sub supravegherea unui patolog, care este responsabil pentru examinarea lamelor colorate și pentru asigurarea caracterului adecvat al controalelor pozitive și negative.

5. Ţesuturile prelevate de la persoane infestate cu virusul hepatitei B şi care conţin antigeni de la suprafaţa virusului hepatitei B (HBsAg) pot prezenta coloraţie nespecifică cu peroxidază din hrean (7).

P03928RO_03/SK00621-2/2016.11 p. 7/14

6. Reactivii pot prezenta reacţii neaşteptate la tipuri de ţesuturi netestate în prealabil. Posibilitatea apariţiei reacţiilor neaşteptate chiar şi la tipurile de ţesut testate nu poate fi eliminată complet, din cauza variabilităţii expresiei antigenice din neoplasme sau a altor ţesuturi patologice. În cazul reacţiilor neaşteptate, contactaţi Serviciul de asistenţă tehnică Dako cu documente.

7. Se pot observa rezultate fals pozitive din cauza legării neimunologice a proteinelor sau a produselor de reacţie din substrat. Acestea pot fi cauzate şi de activitatea pseudoperoxidazei (eritrocite) şi de activitatea peroxidazei endogene (citocrom C) (7).

8. Reactivii şi instrucţiunile furnizate cu acest sistem au fost concepute pentru performanţe maxime. Rediluarea reactivilor sau modificarea duratelor de incubare sau a temperaturilor poate genera rezultate eronate sau neconcordante.

Limitări specifice produsului 1. Rezultatele fals negative pot fi cauzate de degradarea în timp a antigenului din ţesut. Specimenele trebuie să fie colorate în termen

de şase luni de la montarea ţesuturilor pe lame, atunci când acestea sunt depozitate în întuneric la 2–8 °C (de preferat) sau la temperatura camerei de maximum 25 °C.

2. Pentru rezultate optime şi reproductibile, proteina PD-L1 necesită pretratare cu recuperare ţintă atunci când ţesuturile sunt fixate în mod obişnuit (fixate în formol cu soluţie tampon neutră) şi introduse în parafină.

3. Nu înlocuiţi reactivii din loturi cu numere diferite ale acestui produs sau din kituri de la alţi producători. Excepţie face numai EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low pH, 50x care, dacă este necesară, este disponibilă cu codul K8005.

4. Liniile celulare de control colorate trebuie să se utilizeze numai pentru validarea ciclului de colorare şi nu trebuie să fie utilizate pentru evaluarea reacţiei de colorare în secţiunile de ţesut.

5. Utilizarea PD-L1 IHC 22C3 pharmDx pe ţesuturi cu alţi agenţi de fixare în afară de formol nu a fost omologată. 6. Utilizarea PD-L1 IHC 22C3 pharmDx pentru aspiraţie cu ac fin nu a fost omologată. Evaluarea performanţelor clinice Beneficiul clinic al analizei PD-L1 IHC 22C3 pharmDx a fost investigat în cadrul unui studiu clinic multicentru, randomizat, în regim deschis realizat pentru evaluarea siguranţei şi eficacităţii medicamentului KEYTRUDA la pacienţii cu NSCLC în stadiu avansat (9). Pacienţii au prezentat PD-L1 pozitiv în cadrul unei analize de studiu clinic (CTA) şi au înregistrat o evoluţie a bolii după tratamentul prin chimioterapie care includea platină. La pacienţii cu aberaţii genomice tumorale pe gena EGFR sau ALK, boala a prezentat evoluţie cu tratamentul aprobat de FDA pentru aceste aberaţii, înainte de a li se administra KEYTRUDA. Pacienţii au fost selectaţi aleatoriu (1:1:1) pentru a li se administra 2 mg/kg (n=344) sau 10 mg/kg (n=346) de KEYTRUDA o dată la 3 săptămâni sau 75 mg/m2 de docetaxel o dată la 3 săptămâni (n=343). Starea tumorii a fost evaluată la fiecare 9 săptămâni. Principalele puncte de excludere pe baza eficacităţii au fost supravieţuirea globală (OS) şi rata de supravieţuire fără progresie (PFS) conform criteriilor de evaluare a răspunsului pe tumori solide versiunea 1.1 (RECIST 1.1) pe baza evaluării oarbe independente a radiologilor. Pe baza CTA, 1.033 de pacienţi cu NSCLC au fost selectaţi aleatoriu în studiu. Pentru evaluarea utilităţii clinice a analizei PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, au fost testate retrospectiv probe arhivate din cadrul unui studiu clinic într-un laborator de referinţă din S.U.A. cu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Dintre cei 1.033 de pacienţi, ţesuturi tumorale de la 529 de pacienţi au fost testate retrospectiv cu testul PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Specimenele de la 413 de pacienţi au prezentat expresie PD-L1 pozitivă (≥ 1% din celulele tumorale viabile prezentând colorare membranoasă de orice intensitate), iar probele de la 94 pacienţi au prezentat expresie PD-L1 negativă (< 1% din celulele tumorale viabile prezentând colorare membranoasă de orice intensitate). Dintre aceşti 413 pacienţi cu expresie PD-L1 pozitivă, specimenele de la 163 de pacienţi au prezentat expresie PD-L1 accentuată ((≥ 50% din celulele tumorale viabile au prezentat colorare membranoasă la orice intensitate). Nivelul de acord dintre CTA şi PD-L1 IHC 22C3 pharmDx este ilustrat în Tabelul 2. Tabelul 2: Acordul CTA vs. PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

Nivelurile de acord PD-L1 Limită de diagnosticare

Acord procentual negativ (interval de încredere (IÎ) 95%)

Acord procentual pozitiv (interval de încredere (IÎ) 95%)

CTA vs. PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

TPS 1% 94,5% [91,4%-96,6%] 80,0% [76,9%-82,8%] TPS 50% 98,3% [97,1%-99,0%] 73,2% [67,9%-77,9%]

La pacienţii selectaţi aleatoriu cu rezultat pozitiv la analiza PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, caracteristicile demografice şi alte caracteristici de la nivelul de referinţă au fost bine echilibrate între cele două grupuri de tratament. Vârsta medie a fost de 63 de ani (44% de 65 de ani sau mai în vârstă). Majoritatea pacienţilor au fost albi (77%) şi de sex masculin (58%); scorul performanţei ECOG de referinţă a fost 0 (29%) sau 1 (71%). Şaptezeci şi opt la sută (78%) dintre pacienţi au fost foşti fumători sau fumători activi. Douăzeci şi doi la sută (22%) dintre pacienţi au avut histologie scuamoasă şi 69% au avut histologie nescuamoasă. Caracteristicile de la nivelul de referinţă şi cele demografice au fost, de asemenea, bine echilibrate între grupul tratat cu pembrolizumab şi cel tratat cu docetaxel în studiul clinic global. Rezultatele de eficacitate sunt prezentate în rezumat în Tabelul 3. KEYTRUDA a prezentat beneficiu clinic durabil la pacienţii cu NSCLC cu expresie pozitivă a proteinei PD-L1 cu TPS 1%, care a fost amplificat la pacienţii cu expresie accentuată a proteinei PD-L1 cu TPS 50%, stabilit cu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Magnitudinea beneficiului a fost comparabilă cu cea a studiului clinic global. Tabelul 3 conține rezumatul unităţilor de evaluare cheie la populaţia generală cu expresie PD-L1 pozitivă (TPS 1%) şi la subsetul cu expresie PD-L1 accentuată pozitivă (TPS 50%) pentru studiul clinic global (PD-L1 pozitiv prin CTA) şi la populaţia cu expresie pozitivă stabilită cu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx. Curba Kaplan-Meier pentru OS (TPS 1%, stabilit cu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx) este ilustrată în Figura 1.

P03928RO_03/SK00621-2/2016.11 p. 8/14

Tabelul 3: Răspunsul la KEYTRUDA la pacienţii cu NSCLC trataţi anterior: Pacienţii cu expresie pozitivă la studiul clinic global şi la analiza PD-L1 IHC 22C3 pharmDx: PD-L1 TPS 1% şi TPS 50%

Punct de excludere

KEYTRUDA 2 mg/kg o dată la 3 săptămâni

KEYTRUDA 10 mg/kg o dată la 3 săptămâni

Docetaxel 75 mg/m2 o dată la 3 săptămâni

Studiu clinic PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

Studiu clinic PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

Studiu clinic PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

TPS 1%

Număr de pacienţi 344 140 346 142 343 131 OS Decese (%) 172 (50%) 59 (42%) 156 (45%) 59 (42%) 193 (56%) 67 (51%) Raport de risc* (IÎ 95%)

0,71 (0,58, 0,88)

0,54 (0,37, 0,78)

0,61 (0,49, 0,75)

0,57 (0,39, 0,82)

--- ---

Valoare p† < 0,001 < 0,001 < 0,001 0,00115 --- --- Medie în luni (IÎ 95%)

10,4 (9,4, 11,9)

11,8 (9,6, NA)

12,7 (10,0, 17,3)

12,0 (8,7, NA)

8,5 (7,5, 9,8)

7,5 (6,3, 9,9)

PFS‡ Evenimente (%) 266 (77%) 97 (63%) 255 (74%) 103 (73%) 257 (75%) 94 (72%) Raport de risc* (IÎ 95%)

0,88 (0,73, 1,04)

0,68 (0,50, 0,92)

0,79 (0,66, 0,94)

0,79 (0,59, 1,06)

--- ---

Valoare p† 0,068 0,00578 0,005 0,05767 --- --- Medie în luni (IÎ 95%)

3,9 (3,1, 4,1)

4,9 (4,1, 6,2)

4,0 (2,6, 4,3)

4,0 (2,2, 4,6)

4,0 (3,1, 4,2)

3,8 (2,2, 4,2)

Rată generală de răspuns‡

ORR %§ (IÎ 95%)

18% (14, 23)

24% (17, 32)

18% (15, 23)

20% (14, 28)

9% (7, 13)

5% (2, 11)

TPS 50%

Număr de pacienţi 139 56 151 60 152 47 OS Decese (%) 58 (42%) 18 (32%) 60 (40%) 19 (32%) 86 (57%) 25 (53%) Raport de risc* (IÎ 95%)

0,54 (0,38, 0,77)

0,45 (0,24, 0,84)

0,50 (0,36, 0,70)

0,29 (0,15 0,56)

--- ---

Valoare p† < 0,001 0,00541 < 0,001 < 0,001 --- --- Medie în luni (IÎ 95%)

14,9 (10,4, NA)

Nu s-a atins (9,3; NA)

17,3 (11,8, NA)

Nu s-a atins (8,3; NA)

8,2 (6,4, 10,7)

7,2 (4,4, 8,3)

PFS‡ Evenimente (%) 89 (64%) 33 (59%) 97 (64%) 34 (57%) 118 (78%) 33 (70%) Raport de risc* (IÎ 95%)

0,58 (0,43, 0,77)

0,47 (0,28, 0,80)

0,59 (0,45, 0,78)

0,41 (0,24, 0,70)

--- ---

Valoare p† < 0,001 0,00221 < 0,001 < 0,001 --- --- Medie în luni (IÎ 95%)

5,2 (4,0, 6,5)

5,9 (4,2, 9,0)

5,2 (4,1, 8,1)

4,8 (2,8, NA)

4,1 (3,6, 4,3)

3,9 (2,0, 4,3)

Rată generală de răspuns‡

ORR %§ (IÎ 95%)

30% (23, 39)

37% (25, 52)

29% (22, 37)

28% (18, 41)

8% (4, 13)

4% (1, 15)

* Raport de risc (KEYTRUDA în comparaţie cu docetaxel) pe baza modelului riscurilor proporţionale clasificate al lui Cox † Pe baza unui test de rang logaritmic stratificat ‡ Evaluat prin BICR cu RECIST 1.1 § Toate răspunsurile au fost răspunsuri parţiale ¶ Pe baza pacienţilor cu cel mai bun răspuns general ca răspuns complet sau parţial confirmat

P03928RO_03/SK00621-2/2016.11 p. 9/14

Figura 1: Curba Keplen-Meier de supravieţuire globală după grupul de tratament (TPS 1% cu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, Populaţia cu intenţie de tratare)

Au fost realizate analize de robusteţe suplimentare pentru a se evalua posibilul impact al lipsei datelor de la pacienţii cu rezultat pozitiv la testul PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, dar care este posibil să fi avut rezultat negativ la CTA. Pacienţii cu astfel de rezultate la test fac parte din populaţia căreia îi este destinată/cu intenţie de diagnosticare (ITD) cu analiza PD-L1 IHC 22C3 pharmDx; totuşi, au fost excluşi din studiul clinic din cauza rezultatelor negative la screeningul pentru CTA. Pentru compensarea acestor date lipsă, a fost efectuată o analiză a sensibilităţii pentru a se înţelege intervalul plauzibil al raportului de risc (HR) estimat pe baza PD-L1 IHC 22C3 pharmDx din subpopulaţiile cu TPS 1% şi TPS 50% într-un cadru ITD pentru verificarea corespondenţei cu HR observat pe baza înscrierii în CTA. Rezultatele analizei de sensibilitate HR au arătat că HR estimate sunt robuste la orice presupusă atenuare a efectului tratamentului în cadrul ITD.

Timp în luni n la risc

Docetaxel 75 mg/m2 Q3W

MK – 3475 2 mg/kg Q3W

MK – 3475 10 mg/kg Q3W

Docetaxel 75 mg/m2 Q3W MK – 3475 2 mg/kg Q3W MK – 3475 10 mg/kg Q3W

Sup

ravi

eţui

re g

loba

lă (

%)

P03928RO_03/SK00621-2/2016.11 p. 10/14

Evaluarea performanţelor neclinice Sensibilitate/specificitate analitică Sensibilitatea analitică a PD-L1 IHC 22C3 pharmDx a fost testată pe 127 de cazuri unice de specimene FFPE cu carcinom pulmonar nonmicrocelular (NSCLC) în stadiile I–IV, utilizându-se un lot de producţie fabricat. Evaluarea expresiei PD-L1 a prezentat colorare pe o gamă de 0–100% celule tumorale pozitive şi intensitate a colorării de 0–3. Ţesuturi normale: Tabelul 4 conţine un rezumat al imunoreactivităţii anticorpului monoclonal de şoarece clonă 22C3 împotriva PD-L1, pe grupul de ţesuturi normale recomandat. Colorarea membranei plasmatice a fost observată la celulele imunitare şi la celulele cu origine epitelială. Colorarea citoplasmică a fost remarcată la anumite tipuri de celule, dar nu a fost înregistrată ca şi colorare pozitivă. Toate ţesuturile au fost fixate cu formol şi introduse în parafină şi colorate cu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, conform instrucţiunilor din acest prospect. Nu au fost observate rezultate neaşteptate la tipurile de celule sau de ţesut testate. Colorarea observată a fost în concordanţă cu raportările din literatura de specialitate pentru expresia PD-L1 IHC în ţesuturile normale (10, 11). Tabelul 4: Rezumatul reactivităţii ţesuturilor normale cu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx

Tip de ţesut (# testat)

Colorarea pozitivă a membranei plasmatice: Elemente de ţesut

Colorare citoplasmică pozitivă: Elemente de ţesut

Colorare nespecifică

Adrenal (3) 0/3 1/3 celule medulare 0/3 Amigdală (3) 3/3 epiteliu cript

2/3 centru germinal (macrofage) 0/3 0/3

Celule mezoteliale (2) 0/2 0/2 0/2 Col uterin (3) 1/3 epiteliu 0/3 0/3 Colon (3) 2/3 macrofage 0/3 0/3 Creier mare (3) 0/3 0/3 0/3 Creier mic (3) 0/3 0/3 0/3 Esofag (3) 0/3 0/3 0/3 Ficat (3) 1/3 macrofage

1/3 hepatocite 0/3 0/3

Glandă salivară (3) 0/3 0/3 0/3 Intestin subţire (3) 0/3 0/3 0/3 Mamar (3) 0/3 0/3 0/3 Măduvă osoasă (3) 3/3 megacariocite 3/3 megacariocite 0/3 Mușchi cardiac (3) 0/3 0/3 0/3 Mușchi scheletic (3) 0/2 0/2 0/2 Nerv periferic (3) 0/3 1/3 ţesut conjunctiv/vase 0/3 Ovar (3) 0/3 0/3 0/3 Pancreas (3) 0/3 0/3 0/3 Pancreas (3) 3/3 epiteliu medular 0/3 0/3 Paratiroidă (3) 1/3 epiteliu glandular 0/3 0/3 Piele (3) 0/3 0/3 0/3 Pituitară (3) 1/3 hipofiză anterioară

1/3 hipofiză posterioară 1/3 hipofiză anterioară 1/3 hipofiză posterioară

0/3

Plămân (3) 3/3 macrofage alveolare 0/3 0/3 Prostată (2) 2/2 epiteliu 0/2 0/2 Rinichi (3) 1/3 epiteliu tubular 0/3 0/3 Splină (3) 2/3 macrofage 0/3 0/3 Stomac (3) 2/3 limfocite

1/3 glande gastrice 1/3 glande gastrice 0/3

Testicul (3) 0/3 0/3 0/3 Tiroidă (3) 0/3 0/3 0/3 Uter (3) 0/3 0/3 0/3

Ţesuturi neoplastice: Tabelul 5 conţine un rezumat al imunoreactivităţii anticorpului monoclonal de şoarece clonă 22C3 împotriva PD-L1 pe un grup de ţesuturi neoplastice. Colorarea membranei plasmatice a fost observată la celulele imunitare şi la celulele cu origine epitelială. Colorarea citoplasmică a fost remarcată la anumite tipuri de celule, dar nu a fost înregistrată ca şi colorare pozitivă. Toate ţesuturile au fost fixate cu formol şi introduse în parafină şi colorate cu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, conform instrucţiunilor din acest prospect. Nu au fost observate rezultate neaşteptate la specimenele tumorale testate. Colorarea observată a fost în concordanţă cu raportările din literatura de specialitate pentru expresia PD-L1 IHC în ţesuturile neoplazice (10-13). Tabelul 5: Rezumatul reactivităţii ţesuturilor neoplastice cu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx Tip de tumoare Localizare PD-L1 pozitiv/total N=159

Adenocarcinom

Apendice 0/1 Cap şi gât, palatul dur 0/1 Col uterin, tip endocervical 0/1 Colon 0/5 Colon, metastatic la ficat 0/1 Colon, mucinos 0/1 Esofag 0/1 GI, metastatic la plămân 0/1 Glandă salivară/parotidă 0/2 Intestin subţire 0/2 Ovar 0/1 Ovar, endometrioid 0/1 Ovar, mucinos 0/1 Ovar, seros 0/1

P03928RO_03/SK00621-2/2016.11 p. 11/14

Tip de tumoare Localizare PD-L1 pozitiv/total N=159 Pancreas 0/2 Pancreas, ductal 0/3 Plămân 1/4 Prostată 0/5 Rect 0/4 Sân, DCIS 0/2 Sân, ductal invaziv 0/7 Sân, metastatic ductal invaziv la nod limfatic 0/1 Stomac 0/6 Stomac, mucinos 0/1 Tiroidă, folicular 0/1 Tiroidă, folicular-papilar 0/1 Tiroidă, papilar 0/3 Uter, celulă curată 0/1 Uter, endometriu 0/3 Vezică urinară 1/5

Astrocitom Creier mare 0/3 Carcinom Nazofaringian, NPC 0/1

Carcinom cu celule scuamoase

Cap şi gât 0/2 Carcinom de celulă scuamoasă metastatic esofagian la nod limfatic

0/1

Col uterin 2/5 Esofag 0/7 Piele 0/2 Plămân 1/2 Uter 0/1

Carcinom cu inel cu sigiliu Carcinom cu inel cu sigiliu metastatic de colon la ovar

0/1

Colon 0/1 Carcinom de celulă bazală Piele 0/1 Carcinom de celulă mică Plămân 0/1 Carcinom de celulă renală Celulă curată Rinichi 0/6 Papilar Rinichi 0/1

Carcinom de celulă tranziţională Rinichi 0/1 Vezică 0/6

Carcinom embrionar Testicul 0/1 Carcinom hepatocelular Ficat 0/5 Carcinom medular Tiroidă 0/1 Carcinom suprarenal Adrenal 0/1 Condrosarcom Os 0/1 Cordom Cavitate pelviană 0/1 Ependimom Creier 0/1 Feocromocitom Adrenal 0/1 Glioblastom Creier 0/1 Hepatoblastom Ficat 0/1

Leiomiosarcom Ţesut moale, perete toracic 0/1 Vezică 0/1

Limfom Celulă B difuză Nod limfatic 0/4 Celulă mare anaplastică Nod limfatic 0/1 Hodgkin Nod limfatic 2/2 Non-Hodgkin Nod limfatic 1/1 Meduloblastom Creier 0/1

Melanom Cavitate nazală 0/1 Rect 0/1

Meningiom Creier 0/2 Mezoteliom Peritoneu 0/1 Neuroblastom Retroperitoneu 0/1 Neurofibrom Ţesut moale, regiune lombară 0/1 Osteosarcom Os 0/2

Rabdomiosarcom Prostată 0/1 Retroperitoneu 0/1 Ţesut moale, embrionar 0/1

Sarcom sinovial Cavitate pelviană 0/1

Seminom Testicul 0/2

Spermatocitom Testicul 0/2 Timom Mediastin 1/1 Tumoare a celulelor insulare Pancreas 0/1 Tumoare neuroectodermală primitivă (PNET)

Retroperitoneu 0/1

Ţesuturi interstiţiale Colon 0/1 Intestin subţire 0/1 Rect 0/1

P03928RO_03/SK00621-2/2016.11 p. 12/14

Repetabilitate/Reproductibilitate externă Repetabilitatea şi reproductibilitatea analizei PD-L1 IHC 22C3 pharmDx au fost evaluate la Dako şi în alte trei centre de testare externe. Datele de performanţă sunt indicate în Tabelele 6-9. Pentru studiile de repetabilitate efectuate la Dako, acordul procentual negativ (NPA), acordul procentual pozitiv (PPA) şi acordul general (OA) au fost identificate pentru limitele de diagnosticare ≥ 1% şi ≥ 50% indicate în Tabelul 6 şi Tabelul 7. Deoarece studiile de repetabilitate au generat un acord de 100%, intervalele de încredere au fost calculate utilizându-se metoda Scorului Wilson, pe baza numărului de comparaţii pe perechi independente. Pentru studiile de reproductibilitate externă, acordul procentual negativ mediu (ANA), acordul procentual pozitiv mediu (APA) şi acordul procentual general (OA) au fost identificate pentru limitele de diagnosticare ≥ 1% şi ≥ 50% indicate în Tabelul 8 şi Tabelul 9. Au fost calculate acordurile medii, deoarece nu există nicio referinţă naturală în parametrii de reproductibilitate, cum ar fi centrul şi observatorul. Intervalele de încredere pentru acordurile medii au fost calculate cu ajutorul metodei centile de reeşantionare (bootstrap). (Reţineţi că studiile de repetabilitate nu au fost analizate cu ajutorul intervalelor de încredere de la reeşantionare (bootstrap), deoarece valorile menţionate mai sus nu se pot calcula pe baza unor date cu discordanţă zero.) Tabelul 6: Repetabilitatea analizei PD-L1 IHC 22C3 pharmDx testate într-un singur centru (≥ 1%)

Studiu de repetabilitate Prag de

diagnosticare Structura studiului Acord procentual (IÎ 95%) Interinstrument

≥ 1% Fiecare dintre cele 16 specimene cu NSCLC (8 cu PD-L1-negativ şi 8 cu PD-L1-pozitiv) cu un interval al expresiei IHC a PD-L1 a fost testat pe fiecare dintre cele şase instrumente Autostainer Link 48.

NPA 100% (91,2-100%) PPA 100% (91,2-100%) OA 100% (95,4-100%)

Interoperator

≥ 1% Fiecare dintre cele 16 specimene cu NSCLC (8 cu PD-L1-negativ şi 8 cu PD-L1-pozitiv) cu un interval al expresiei IHC a PD-L1 a fost testat cu şase analişti pe un instrument Autostainer Link 48.

NPA 100% (91,0-100%) PPA 100% (91,2-100%) OA 100% (95,4-100%)

Interzi

≥ 1% Fiecare dintre cele 16 specimene cu NSCLC (8 cu PD-L1-negativ şi 8 cu PD-L1-pozitiv) cu un interval al expresiei IHC a PD-L1 a fost testat în şase zile neconsecutive pe instrumentul Autostainer Link 48.

NPA 100% (91,2-100%) PPA 100% (91,2-100%) OA 100% (95,4-100%)

Interlot ≥ 1% Fiecare dintre cele 16 specimene cu NSCLC (8 cu PD-L1-negativ şi 8 cu PD-L1-pozitiv) cu un interval al expresiei IHC a PD-L1 a fost testat cu trei replicări şi cu fiecare dintre cele trei loturi de reactiv pe instrumentul Autostainer Link 48.

NPA 98,6% (96,0-100%) PPA 98,6% (95,7-100%) OA 98,6% (95,8-100%)

Intraciclu ≥ 1% Fiecare dintre cele 16 specimene cu NSCLC (8 cu PD-L1-negativ şi 8 cu PD-L1-pozitiv) cu un interval al expresiei IHC a PD-L1 a fost testat cu şase replicări în cadrul unui ciclu pe instrumentul Autostainer Link 48.

NPA 100% (91,2-100%) PPA 100% (91,2-100%) OA 100% (95,4-100%)

Intrazi ≥ 1% Fiecare dintre cele 16 specimene cu NSCLC (8 cu PD-L1-negativ şi 8 cu PD-L1-pozitiv) cu un interval al expresiei IHC a PD-L1 a fost testat în două cicluri într-o singură zi, cu repetare după trei zile, pe instrumentul Autostainer Link 48.

NPA 100% (91,0-100%) PPA 100% (91,2-100%) OA 100% (95,4-100%)

NPA= Negative Percent Agreement (Acord procentual negativ); PPA= Positive Percent Agreement (Acord procentual pozitiv); OA=Overall Agreement (Acord general) Tabelul 7: Repetabilitatea analizei PD-L1 IHC 22C3 pharmDx testate într-un singur centru (≥ 50%)

Studiu de repetabilitate Prag de

diagnosticare Structura studiului Acord procentual (IÎ 95%) Interinstrument

≥ 50% Fiecare dintre cele 16 specimene cu NSCLC (10 cu PD-L1-negativ şi 6 cu PD-L1-pozitiv) cu un interval al expresiei IHC a PD-L1 a fost testat pe fiecare dintre cele şase instrumente Autostainer Link 48.

NPA 100% (92,9-100%) PPA 100% (88,6-100%) OA 100% (95,4-100%)

Interoperator

≥ 50% Fiecare dintre cele 16 specimene cu NSCLC (10 cu PD-L1-negativ şi 6 cu PD-L1-pozitiv) cu un interval al expresiei IHC a PD-L1 a fost testat cu şase analişti pe un instrument Autostainer Link 48.

NPA 100% (92,7-100%) PPA 100% (88,6-100%) OA 100% (95,4-100%)

Interzi

≥ 50% Fiecare dintre cele 16 specimene cu NSCLC (10 cu PD-L1-negativ şi 6 cu PD-L1-pozitiv) cu un interval al expresiei IHC a PD-L1 a fost testat în şase zile neconsecutive pe instrumentul Autostainer Link 48.

NPA 100% (92,9-100%) PPA 100% (88,6-100%) OA 100% (95,4-100%)

Interlot ≥ 50% Fiecare dintre cele 16 specimene cu NSCLC (8 cu PD-L1-negativ şi 8 cu PD-L1-pozitiv) cu un interval al expresiei IHC a PD-L1 a fost testat cu trei replicări şi cu fiecare dintre cele trei loturi de reactiv pe instrumentul Autostainer Link 48.

NPA 100% (92,6-100%) PPA 100% (92,6-100%) OA 100% (96,2-100%)

Intraciclu ≥ 50% Fiecare dintre cele 16 specimene cu NSCLC (10 cu PD-L1-negativ şi 6 cu PD-L1-pozitiv) cu un interval al expresiei IHC a PD-L1 a fost testat cu şase replicări în cadrul unui ciclu pe instrumentul Autostainer Link 48.

NPA 100% (92,9-100%) PPA 100% (88,6-100%) OA 100% (95,4-100%)

Intrazi ≥ 50% Fiecare dintre cele 16 specimene cu NSCLC (10 cu PD-L1-negativ şi 6 cu PD-L1-pozitiv) cu un interval al expresiei IHC a PD-L1 a fost testat în două cicluri într-o singură zi, cu repetare după trei zile, pe instrumentul Autostainer Link 48.

NPA 100% (88,3-100%) PPA 100% (82,4-100%) OA 100% (92,4-100%)

NPA= Negative Percent Agreement (Acord procentual negativ); PPA= Positive Percent Agreement (Acord procentual pozitiv); OA=Overall Agreement (Acord general)

P03928RO_03/SK00621-2/2016.11 p. 13/14

Tabelul 8: Reproductibilitatea analizei PD-L1 IHC 22C3 pharmDx testate în trei centre externe (≥ 1%) Studiu de

reproductibilitate Prag de

diagnosticare Structura studiului Acord procentual (IÎ 95%) Intercentru ≥ 1% Fiecare dintre cele 36 de specimene cu NSCLC

(16 cu PD-L1-negativ şi 20 cu PD-L1-pozitiv) cu un interval al expresiei IHC a PD-L1 a fost testat în cinci zile neconsecutive. A fost efectuată analiza intercentru în trei centre, pe un total de 2.700 de comparaţii pe perechi.

ANA 94,8% (90,3-98,4%) APA 95,5% (91,2-98,7%) OA 95,2% (90,8-98,6%)

Intracentru ≥ 1% Fiecare dintre cele 36 de specimene cu NSCLC (16 cu PD-L1-negativ şi 20 cu PD-L1-pozitiv) cu un interval al expresiei IHC a PD-L1 a fost testat în cinci zile neconsecutive în fiecare dintre cele trei centre de studiu. A fost efectuată analiza intracentru în trei centre, pe un total de 1.080 de comparaţii pe perechi.

ANA 96,2% (94,1-97,5%) APA 96,7% (95,0-97,9%) OA 96,5% (95,2-97,4%)

Interobservator ≥ 1% Evaluarea a 62 de specimene cu NSCLC (28 cu PD-L1-negativ şi 34 cu PD-L1-pozitiv) cu un interval al expresiei IHC a PD-L1, colorate cu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, a fost efectuată de trei patologi, câte unu în fiecare din cele trei centre de studiu, în trei zile neconsecutive. A fost efectuată analiza interobservator în trei centre pe un total de 1.674 de comparaţii pe perechi.

ANA 85,8% (79,3-91,8%) APA 88,2% (82,2-93,3%) OA 87,1% (81,0-92,6%)

Intraobservator ≥ 1% Evaluarea a 62 de specimene cu NSCLC (28 cu PD-L1-negativ şi 34 cu PD-L1-pozitiv) cu un interval al expresiei IHC a PD-L1, colorate cu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, a fost efectuată de trei patologi, câte unu în fiecare din cele trei centre de studiu, în trei zile neconsecutive. A fost efectuată analiza intraobservator în trei centre pe un total de 558 de comparaţii pe perechi.

ANA 93,7% (90,0-96,1%) APA 94,8% (91,6-96,7%) OA 94,3% (92,0-95,9%)

ANA= Average Negative Agreement (Acord procentual negativ mediu); APA= Average Positive Agreement (Acord procentual pozitiv mediu); OA=Overall Agreement (Acord general) Tabelul 9: Reproductibilitatea analizei PD-L1 IHC 22C3 pharmDx testate în trei centre externe (≥ 50%)

Studiu de reproductibilitate

Prag de diagnosticare Structura studiului Acord procentual (IÎ 95%)

Intercentru ≥ 50% Fiecare dintre cele 36 de specimene cu NSCLC (21 cu PD-L1-negativ şi 15 cu PD-L1-pozitiv) cu un interval al expresiei IHC a PD-L1 a fost testat în cinci zile neconsecutive. A fost efectuată analiza intercentru în trei centre, pe un total de 2.700 de comparaţii pe perechi.

ANA 90,3% (84,4-95,2%) APA 85,2% (75,6-92,9%) OA 88,3% (81,4-94,3%)

Intracentru ≥ 50% Fiecare dintre cele 36 de specimene cu NSCLC (21 cu PD-L1-negativ şi 15 cu PD-L1-pozitiv) cu un interval al expresiei IHC a PD-L1 a fost testat în cinci zile neconsecutive în fiecare dintre cele trei centre de studiu. A fost efectuată analiza intracentru în trei centre, pe un total de 1.080 de comparaţii pe perechi.

ANA 91,9% (88,8-94,8%) APA 87,6% (82,5-92,2%) OA 90,2% (86,3-93,7%)

Interobservator ≥ 50% Evaluarea a 62 de specimene cu NSCLC (30 cu PD-L1-negativ şi 32 cu PD-L1-pozitiv) cu un interval al expresiei IHC a PD-L1, colorate cu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, a fost efectuată de trei patologi, câte unu în fiecare din cele trei centre de studiu, în trei zile neconsecutive. A fost efectuată analiza interobservator în trei centre pe un total de 1.674 de comparaţii pe perechi.

ANA 92,6% (87,8-96,7%) APA 92,8% (88,1-96,8%) OA 92,7% (88,1-96,8%)

Intraobservator ≥ 50% Evaluarea a 62 de specimene cu NSCLC (30 cu PD-L1-negativ şi 32 cu PD-L1-pozitiv) cu un interval al expresiei IHC a PD-L1, colorate cu PD-L1 IHC 22C3 pharmDx, a fost efectuată de trei patologi, câte unu în fiecare din cele trei centre de studiu, în trei zile neconsecutive. A fost efectuată analiza intraobservator în trei centre pe un total de 558 de comparaţii pe perechi.

ANA 96,4% (94,0-98,5%) APA 96,5% (94,3-98,6%) OA 96,4% (94,3-98,6%)

ANA= Average Negative Agreement (Acord procentual negativ mediu); APA= Average Positive Agreement (Acord procentual pozitiv mediu); OA=Overall Agreement (Acord general)

P03928RO_03/SK00621-2/2016.11 p. 14/14

Depanare Tabelul 10: Depanare Problemă Cauză posibilă Acţiune sugerată 1. Lamele nu se colorează 1a. Eroare de programare.

1a. Verificaţi dacă a fost selectat programul PD-L1 IHC 22C3 pharmDx pentru programarea lamelor.

1b. Lipsă de reacţie cu DAB+ Substrate-Chromogen Solution (DAB)

1b. Verificaţi dacă DAB+ Substrate-Chromogen Solution a fost preparată corect.

1c. Azidă de sodiu în soluţia tampon de spălare.

1c. Utilizaţi numai Dako Wash Buffer (Cod K8007).

1d. Lama de control s-a degradat 1d. Verificaţi data de expirare a kitului şi condiţiile de depozitare a kitului la exteriorul ambalajului.

2a. Lamele cu specimen prezintă coloraţie slabă.

2a. A fost utilizată o metodă de fixare necorespunzătoare.

2a. Asiguraţi-vă că se utilizează numai agenţi şi metode de fixare aprobate.

2b. Lamele cu specimen sau linia celulară pozitivă de pe lama de control furnizată de Dako prezintă coloraţie slabă.

2b. Demascare antigenică inadecvată. 2b. Verificaţi dacă procedura de pretratare 3 în 1 a fost realizată corect.

3. Coloraţie de fundal excesivă a lamelor.

3a. Parafina a fost îndepărtată incomplet.

3a. Verificaţi dacă procedura de pretratare 3 în 1 a fost realizată corect.

3b. Lamele s-au uscat în timp ce au fost încărcate în Autostainer Link 48.

3b. Asiguraţi-vă că lamele rămân udate cu soluţie tampon în timpul încărcării şi înainte de începerea ciclului.

3c. Legare nespecifică a reactivilor la secţiunea de ţesut

3c. Verificaţi dacă specimenul s-a fixat corect şi/sau dacă este prezentă necroză.

4. Ţesutul s-a dezlipit de pe lame. 4. Se utilizează lame de microscop greşite.

4. Utilizaţi Dako FLEX IHC Microscope Slides (Cod K8020) sau lame încărcate (cum ar fi Fisherbrand Superfrost Plus).

5. Colorare specifică excesiv de puternică.

5a. A fost utilizată o metodă de fixare necorespunzătoare.

5a. Asiguraţi-vă că se utilizează numai agenţi şi metode de fixare aprobate.

5b. S-a utilizat o soluţie tampon de spălare necorespunzătoare.

5b. Utilizaţi numai Dako Wash Buffer (Cod K8007).

6. Target Retrieval Solution are un aspect tulbure când se încălzeşte.

6. Target Retrieval Solution capătă un aspect tulbure când se încălzeşte.

6. Acest lucru este normal şi nu afectează colorarea.

NOTĂ: Dacă problema nu poate fi atribuită niciuneia dintre cauzele de mai sus sau dacă acţiunea corectivă sugerată nu rezolvă problema, vă rugăm să contactaţi Serviciul de asistenţă tehnică Dako. Informaţii suplimentare despre tehnicile de colorare şi despre prepararea specimenelor se pot găsi în Ghidul de formare Dako: Immunohistochemical Staining Methods (Metode de colorare Imunohistochimică) (5) (disponibil de la Dako). Referinţe 1. Keytruda® package insert. 2. R. Phelps, et al., Journal of Cellular Biochemistry Supplement (1996) 24:32-91. 3. Department of Health, Education and Welfare, National Institutes for Occupational Safety and Health, Rockville, MD. “Procedures

for the decontamination of plumbing systems containing copper and/or lead azides.” DHHS (NIOSH) Publ. No. 78-127, Current 13. August 16, 1976.

4. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline – Third Edition. CLSI document M29-A3 [ISBN 1-56238-567-4]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087 – 1898 USA, 2000.

5. Taylor CR and Rudbeck L. Education Guide: Immunohistochemical Staining Methods. Sixth Edition. Dako, Carpinteria, California; 2013.

6. Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCCLS). Quality assurance for Immunocytochemistry; Approved guideline. CLSI document MM4-A (1-56238-396-5) CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA; 1999.

7. Omata M, Liew C-T, Ashcavai M, Peters RL. Nonimmunologic binding of horseradish peroxidase to hepatitis B s surface antigen: a possible source of error in immunohistochemistry. Am J Clin Path 1980; 73:626.

8. Garon EB, Rizvi NA, Hui R, Leighl N, Balmanoukian AS, Eder JP, et al. Pembrolizumab for the treatment of non-small-cell lung cancer. New Eng J Med 2015; 372:2018-28.

9. Herbst RS, et al. Pembrolizumab versus docetaxel for previously treated, PD-L1-positive, advanced non-small-cell lung cancer (KEYNOTE-010): a randomised controlled trial. The Lancet online 2015 Dec 19.

10. Okazaki T, Honjo T. PD-1 and PD-1 ligands: from discovery to clinical application. International Immunol 2007(19); 7:813. 11. Brown JA, Dorfman DM, Ma F-R, Sullivan EL, Munoz O, Wood CR, et al. Blockade of Programmed Death-1 Ligands on Dendritic

Cells Enhances T Cell Activation and Cytokine Production. J Immunol 2003; 170:1257. 12. Cooper WA, Tran T, Vilain RE, Madore J, Seliger CI, Kohonen-Cornish M, et al. PD-L1 expression is a favorable prognostic factor

in early stage non-small cell carcinoma. Lung Cancer 2015; 89:181. 13. Chen B, Chapuy B, Ouyang J et al. PD-L1 Expression Is Characteristic of a Subset of Aggressive B-cell Lymphomas and Virus-

Associated Malignancies. Clin Cancer Res 2013; 19:3462-3473.

Cod de lot

Dispozitiv medical pentru diagnostic in vitro

PT0020/ Rev C

Dako North America, Inc.6392 Via RealCarpinteria, California 93013 USA

Tel 805 566 6655Fax 805 566 6688Technical Support 800 424 0021Customer Service 800 235 5763

Dako Denmark A/SProduktionsvej 42DK-2600 Glostrup Denmark

Tel +45 4485 9500Fax +45 4485 9595

www.dako.com

Ediţia 11/16