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Patologia Infecção HPV
Hugo SousaBScH Microbiology
MSc OncologyPhD Biomedical Sciences
MD Student_________________________________________Serviço Virologia – Lab Biologia Molecular
Grupo Oncologia MolecularIPO Porto FG EPE
+Características Gerais
+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Vírus com distribuição ubíqua Independentemente do género, idade, etnia ou localização
geográfica
Vírus epitelio-mucosotrópico Infecta células epiteliais e mucosas
Características Gerais
+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Descritos quase 200 tipos de HPV
Características Gerais
+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Família Papillomaviridae
Estrutura icosaédrica ( 55nm)
Características Gerais
+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Vírus de DNA cadeia dupla Genoma com 8000pb positivo
2 genes estruturais (L1 e L2)
7 ou 8 genes precoces (E1 a E8)
Características Gerais
+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)Características Gerais
GENE FUNCTION
E1 DNA-dependent ATPase, ATP dependent helicasE;Allow unwinding of the viral genome and act as an elongation factor for DNA replication.
E2 Responsible for recognition and binding of origin of replication. Exists in two forms: full length (transcriptional transactivator) and truncated (transcriptional repressor). The ratio of these found in the heterotrimeric complex formed before complexing with E1 regulates transcription of viral genome.
E3 ????
E4 Late Expression: C terminal binds intermediate filament, allowing release of virus-like particles. Also involved in transformation of host cell by deregulation of host cell mitogenic signalling pathway.
E5 Obstruction of growth suppression mechanisms: e.g EGF receptor; activation of mitogenic signalling pathways via transcription factors: c-Jun and c-Fos (important in ubiquitin pathway degradation of p53 complex by E6). Inactivation of p21 (p53 induced expression halts cell cycle until DNA is proof-read for mutations).
E6 Transformation of host cell by binding p53 tumour suppressor protein.
E7 Transforming protein, binds to pRB/p107.
E8 ?????
+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Baixo-Risco: HPV6, 11, 13, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 e 89
Alto-Risco HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 e 59 Provável Alto-risco: HPV26, 53, 66, 68, 73 e 82
Risco Indeterminado
HPV30, 32, 34, 62, 67, 69, 71, 74, 83, 84, 85, 87, 90 e 91
Características Gerais
+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)Características Gerais
HPV-associated diseases HPV types
Skin warts 1,2,3,4,7,10,26,27,28,29,41,48,57,60,63,65,75,76,77,78
Epidermodysplasia verruciformis benign lesions 3,5,8,9,12,14,15,17,19,20,21,22,23,24,25,36,47,49,50
Epidermodysplasia verruciformis squamous cell carcinoma5,8,14,17,20,47
Periungual squamous cell carcinoma 16,34,35
Laryngeal papillomas 6,11
Oral focal epithelial hyperplasia 13,32
Squamous cell carcinoma (tonsil) 16,33
Anogenital warts 6,11,40,42,43,44,54,55,74
Low-grade anogenital intraepithelial neoplasia 6,11,16,18,30,31,33,34,35,39,40,45,51,52,56,57,58,59,61,64,66,67,68,70,71,72,73,74
High-grade anogenital intraepithelial neoplasia 16,18,31,33,34,35,39,45,51,52,56,58,59,68
Squamous cell carcinoma (cervix mostly) 16,18,31,33,35,39,45,51,52,56,58,59,68
Adenocarcinoma (cervix mostly) 16,18
+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Baixo-Risco: HPV6, 11, 13, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 e 89 Provocam aparecimento de papilomas/verrugas…
Características Gerais
+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Baixo-Risco: HPV6, 11, 13, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 e 89 Provocam aparecimento de papilomas/verrugas…
Características Gerais
+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Baixo-Risco: HPV6, 11, 13, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 e 89 Provocam aparecimento de papilomas/verrugas…
Características Gerais
+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Alto-Risco HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 e 59 Desenvolvimento de lesões baixo/alto grau e cancro
Características Gerais
+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)Características Gerais
Yearly Incidence Counts of HPV-Associated Cancers in the United States, 2003–2007
+Infecção
+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)Infecção
Infecção Basal
Activação Replicação viral E1, E2, E4, E5
Amplificação Carga viral 10 1000 cópias/célula
Maturação vírus 1-3 semanas
Desenvolvimento de lesão Semanas Meses
+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)Infecção
Infecção Basal
Activação Replicação viral E1, E2, E4, E5
Amplificação Carga viral 10 1000 cópias/célula
Maturação vírus 1-3 semanas
Desenvolvimento de lesão Semanas Meses
+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)Infecção
+ Mecanismo de Carcinogénese
+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Major Events
Escape à Resposta Imunológica
Integração DNA viral no DNA do hospedeiro
Imortalização celular
Instabilidade genómica
Mecanismo de Carcinogénese
+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)Mecanismo de Carcinogénese
+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)Mecanismo de Carcinogénese
+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)
Integração Viral
DNA Episomal: expressão de E2 regula a expressão de E6 e E7
DNA integrado: perda de E2 permite expressão desregulada de E6 e E7
Promove Inibição replicação viral Instabilidade genética
Confere vantagem selectiva para a proliferação de células
Ocorre na maioria dos casos de HSIL
Podem co-existir formas episomais com integradas
Mecanismo de Carcinogénese
+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)Mecanismo de Carcinogénese
+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)Mecanismo de Carcinogénese – E6
Moody and Laimonis, 2010
+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)Mecanismo de Carcinogénese – E7
Moody and Laimonis, 2010
+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)Mecanismo de Carcinogénese
+ Vírus do Papiloma Humano (HPV)Mecanismo de Carcinogénese
+
CANCRO COLO DO ÚTERO
+Cancro do Colo do Útero
+Cancro do Colo do ÚteroDistribuição Mundial
+Cancro do Colo do ÚteroDistribuição Mundial
+Cancro do Colo do Útero
4ª neoplasia na mulher
Neoplasia urogenital
Alta taxas: Incidência 16 / 100 000 Mortalidade 6 / 100 000
Em Portugal
+Cancro do Colo do Útero
1842 – A culpa era da profissão…
1901 – A culpa era da religião…
60s – A culpa era da circuncisão…
70s – A culpa era dos Herpes…
Etiologia
+Cancro do Colo do Útero
1980’s – Associação com HPV
Infecção por HPV é um factor necessário mas não suficiente odds ratio: 60 (95% C.I. 49-73
Etiologia
Prof. Harald Zur Hausen (Nobel da Medicina 2008)
+Cancro do Colo do ÚteroPatologia
Desenvolvimento de Lesões Precursoras que podem evoluir para Cancro
Infecção Ca Colo Útero6 meses 3 anos 6 anos 10 anos
+Cancro do Colo do ÚteroPatologia
Colo Útero Normal Normal
His
tolo
gia
Cito
logi
a
+Cancro do Colo do ÚteroPatologia
CIN 1
His
tolo
gia
Cito
logi
a
+Cancro do Colo do ÚteroPatologia
CIN 2
His
tolo
gia
Cito
logi
a
+Cancro do Colo do ÚteroPatologia
CIN 3
His
tolo
gia
Cito
logi
a
+Cancro do Colo do ÚteroPatologia
Carcinoma In Situ
His
tolo
gia
Cito
logi
a
+Cancro do Colo do ÚteroPatologia
Carcinoma Invasor
His
tolo
gia
Cito
logi
a
+Cancro do Colo do ÚteroPatologia
Carcinoma Invasor
+
Métodos de Diagnóstico
+Diagnóstico Infecção HPVMétodos
Métodos Indirectos Colposcopia Teste Papanicolau… Serologia….
Métodos Directos Polimerase Chain Reaction (PCR) Restriction Fragment Lenght Position (RFLP) Reverse Transcriptase – PCR (RT- PCR) Real-Time PCR Sequenciação Captura Híbrida Southern Blot Hibridização em tiras CHIPS
Amplificação
Hibridização
+Diagnóstico Infecção HPVMétodos
+Diagnóstico Indirecto
+Diagnóstico Indirecto
Teste do Papanicolau Detecta células com alterações
Colposcopia, Papanicolau…
+Diagnóstico Indirecto
Teste do Papanicolau Detecta células com alterações
Colposcopia, Papanicolau…
Alterações celulares
Normal
+Técnicas Amplificação
+Técnicas Amplificação
Amplificação de um fragmento de DNA especifico;
Amplificação através de ciclos repetidos que vão permitir
obter milhões de cópias do fragmento pretendido;
Fragmento pretendido está localizado entre duas regiões de
DNA de sequência conhecida;
PCR Assays
Região Alvo
5’ – (…) ATGCGTATCGATCGATATCGATAAGCTAGCTAGGCTA (…) – 3’
3’ – (…) TACGCATAGCTAGCTATAGCTATTCGATCGATCCGAT (…) – 5’
+Técnicas Amplificação
Small portion of genome targeted Allows testing of samples with poor quality DNA Small changes in virus (variants or integration) may give false
negative results
Consensus assays Generally target L1 region Type(s) determined by type specific hybridization, restriction
digestion or sequencing
Type specific assays Generally target E6/E7 region
PCR Assays
+Técnicas AmplificaçãoPCR Assays
+Técnicas Amplificação
Fig. 1. Outline of the HPV-DNA genome, presented in a linear form. The position of the early (E), late (L) genes and the untranslated region (UTR) is indicated, as well as the positions of the four most widely used primer sets CPI/II (Tieben et al., 1993), MY09/11 (Hildesheim et al., 1994), GP5+/6+ (Jacobs et al., 1997), SPF10 (Kleter et al., 1998) and Roche Amplicor HPV assay with their respective amplimer sizes (the precise location of the primers, used in the Roche assay is unknown). The 291 bp fragment used for formal classification of HPV genotypes (Chan et al., 1995; de Villiers et al., 2004) is shown in the L1 region.
PCR Assays
+Técnicas Amplificação
Primers MY09: 5´- CGT CCM ARR GGA WAC TGA TC – 3´ MY11: 5`-GCM CAG GGW CAT AAY AAT GG- 3
São primers degenerados e usam nucleótidos modificados: M = A ou C R = A ou G W = A ou T Y = C ou T
Fragmento de 449pb
PCR Assays
+Técnicas Amplificação
RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
Análise de polimorfismos (mutações pontuais funcionais);
Variação no tamanho de fragmentos de DNA provocada pela actividade diferencial de enzimas de restrição (cortam o DNA numa sequência específica)
Presença de polimorfismo Perda ou ganho de local de restrição Variação no tamanho de fragmentos de DNA.
Genotipagem
5’ – (…) ACTGA (…) – 3’
3’ – (…) TGACT (…) – 5’
+Técnicas AmplificaçãoGenotipagem
+Técnicas AmplificaçãoGenotipagem
Baixo-Risco
HPV6, 11, 13, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 e 89
Alto-Risco
HPV16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58 e 5
Provável Alto-risco
HPV26, 53, 66, 68, 73 e 82
Risco Indeterminado
HPV30, 32, 34, 62, 67, 69, 71, 74, 83, 84, 85, 87, 90 e 91
+Técnicas AmplificaçãoGenotipagem
+Técnicas de Hibridização
+Técnicas de Hibridização
Alvo – DNA ou RNA
Utilização de sondas específicas
Possibilidade de diferenciação entre subtipos de vírus
Técnicas Captura Híbrida Hibridização em tiras Southern Blotting CHIPS
+Técnicas de Hibridização
Principio da técnicaHibridização de Ácidos NucleicosAmplificação sinal por QuimioluminescênciaMétodo semiquantitativo
MétodoHibridização amostras positivas com sondas específicasComplexo Sonda-Amostra é capturado por anticorpos de uma microplacaReacção com anticorpo secundário conjudado com FAAdição de reagente e detecção por quimioluminescência
Captura Híbrida
+Técnicas de HibridizaçãoCaptura Híbrida
45 minutesat 65ºC
60 minutesat 65ºC
60 minutesagitação
30 minutes
15 minutes
+Técnicas de HibridizaçãoSouthern Blot
+Técnicas de HibridizaçãoHibridização em Tiras
+Técnicas de HibridizaçãoCHIPs
Tubos ou lâminas com sondas específicas para cada subtipo;
Tipagem de vírus: HPV, HCV, HIV
+Técnicas de HibridizaçãoCHIPs
+Técnicas de HibridizaçãoCHIPs
56
18
16
66
+
Casos Clínicos
+Caso Clínico #1
História Clínica 37 anos Sexo feminino Divorciada 2 filhos Bom estado geral
Queixas principais Escorrências esbranquiçadas Dor durante acto sexual
Exame ginecológico Colo uterino com zona
vermelha peri-orificial extensa
+Caso Clínico #1
História Clínica 37 anos Sexo feminino Divorciada 2 filhos Bom estado geral
Queixas principais Escorrências esbranquiçadas Dor durante acto sexual
Exame ginecológico Colo uterino com zona
vermelha peri-orificial extensa
Diagnósticos Diferenciais Candidíase Herpes Genital Lesão/Cancro do Colo do
Útero
Suspeitas Vírus do Papiloma Humano Candida Albicans Herpes simplex 1/2
+Caso Clínico #1
Citologia Células atípicas Lesão baixo grau
Raspagens Colo do Útero HPV Alto-Risco Positivo Herpes Simplex 2 Positivo
Biópsia Colo do Útero CIN 2
Cito
logi
aH
isto
logi
a
+Caso Clínico #2
História Clínica 8 anos Sexo masculino
Sinais e Sintomas Voz ciciada Rouquidão Odinofagia (dor à
deglutição) “Respiração rude”
+Caso Clínico #2
Diagnósticos Diferenciais Asma Infecção respiratória Cancro da Laringe Papilomatose Laríngea
Suspeitas Respiratory Syncicial Virus Cytomegalovirus Influenza virus Human Papillomavirus
História Clínica 8 anos Sexo masculino
Sinais e Sintomas Voz ciciada Rouquidão Odinofagia (dor à
deglutição) “Respiração rude”
+Caso Clínico #2
Sangue – Biologia Molecular DNA CMV neg DNA RSV neg RNA InfA, B, C neg DNA HPV neg
Biópsia Lesao
papilomatosa/verrucosa HPV positivo
Diagnóstico:Papilomatose laríngea
Human Papillomavirus (HPV)
+
Prevenção
Como se pode prevenir?
Castidade!?!?!?
Abstinência sexual !?!?!?
Monogamia !?!?!?
Como se pode prevenir?
Uso de PreservativoÉ a medida mais eficaz para prevenir DST e travar a sua disseminação, mas não confere protecção absoluta para a infecção por HPV…
Exames ginecológicos regulares
Precauções com parceiros e comportamentos de risco
Como se pode prevenir?
Teste do Papanicolau... Rastreioo Detecta células com alterações
30
2/3 anosCitologia
Citologia + HPV
< 3
0 a
nos
18 21 30
3/3 anos
AnualInício actividade
sexual
3
0 a
nos
3 anos
Como se pode prevenir?
Vacinas profiláticas oferecem grandes promessas no futuro…
Merck® (Gardasil™)Vacina tetravalente (HPV6, 11, 16 e 18)
Glaxo SmithKline® (Cervarix™)Vacina bivalente (16 e 18)
Como se pode prevenir?
Vacinas profiláticas em Portugal
•Vacina integrada no Programa Nacional de Vacinação
(Despacho n.º 8378/2008, de 20 de Março)
Merck® (Gardasil™)
Vacina tetravalente (HPV6, 11, 16 e 18)
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Patologia Infecção HPV
Hugo SousaBScH Microbiology
MSc OncologyPhD Biomedical Sciences
MD Student_________________________________________Serviço Virologia – Lab Biologia Molecular
Grupo Oncologia MolecularIPO Porto FG EPE