Papel de Dreissena polymorpha (mejill³n cebra ) como ... como reservorio de microorganismos potencialmente

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  • Papel de Dreissena polymorpha Papel de Dreissena polymorpha como reservorio de microorganismos

    potencialmente patgenos y metales en el ecosistema de la cuenca del Ebro y su riesgo para la

    salud y el medio ambiente

    Benito M., Goi P., Ormad M.P., Mosteo R., Valero P., Fernndez M.T.,

    polymorpha (mejilln cebra) polymorpha (mejilln cebra) reservorio de microorganismos

    potencialmente patgenos y metales en el ecosistema de la cuenca del Ebro y su riesgo para la

    salud y el medio ambiente

    M.P., Mosteo R., Valero P., Fernndez M.T., Cieloszyk J.

  • INTRODUCCININTRODUCCIN

    Ciclo reproductivo Dreissena polymorpha (Palau et al., 2004)

    o Gran capacidad reproductora y colonizadora.

    o Primera deteccin Espaa en 2001.

    Archivo fotogrfico www.chebro.es

    o Primera deteccin Espaa en 2001.

    GRAVES PROBLEMAS MEDIOAMBIENTALES Y

    ECONMICOSMapa de aguas afectadas por la presencia de

    Mayo 2014 (Fuente: CHE)

    o Morfologa caracterstica.o Capacidad filtradora 1-2,5 l/da (15 a 40 m).

    GRAN CAPACIDAD GRAN CAPACIDAD BIOACUMULADORA

    Mapa de aguas afectadas por la presencia de Dreissena polymorpha en la cuenca del Ebro.

    Mayo 2014 (Fuente: CHE)

  • Investigar la posible acumulacin de

    fecal en mejillones cebra.

    OBJETIVOSOBJETIVOS

    OBJETIVO PRINCIPALfecal en mejillones cebra.

    Identificar las Amebas de Vida Libre (AVL)

    aguas superficiales y acumuladas en

    Bacterias resistentes a la depredacin

    OBJETIVO PRINCIPAL

    Estudiar el posible papel de Dreissena polymorpha como

    Analizar la posible acumulacin de metales

    Dreissena polymorpha como bioindicador

    bacterias indicadoras de contaminacin

    OBJETIVO PRINCIPAL

    (AVL) y otros protozoos presentes en las

    Dreissena polymorpha, as como de las

    de las AVL (ARB).

    OBJETIVO PRINCIPAL

    Avanzar en el estudio sobre la integracin del mejilln cebra en los

    metales en D. polymorpha.

    integracin del mejilln cebra en los ecosistemas

  • METODOLOGA EXPERIMENTALMETODOLOGA EXPERIMENTAL

    Puntos de muestreo:

    o Embalse Flix: 20 de marzo de 2014

    o Embalse de La Sotonera: 22 de marzo de 2014

    o Embalse de Sobrn(*): 5 de mayo de o Embalse de Sobrn : 5 de mayo de

    o Acequia de Rimer: 6 de junio de 2014

    Anlisis de metales:

    Condiciones:

    T= -40C

    P= 10-1 bar

    24 horas

    Condiciones:

    T= -40C

    P= 10-1 bar

    24 horas

    Liofilizacin

    (*)Muerte ejemplares

    Mapa de aguas afectadas por la presencia de Dreissena polymorpha

    24 horas 24 horas

    Ionizacin en Plasma de Acoplamiento Inductivo- Espectrometra de Masas

    22 de marzo de 2014

    5 de mayo de 20145 de mayo de 2014

    6 de junio de 2014

    Dreissena polymorpha en la cuenca del Ebro. Mayo 2014 (Fuente: CHE)

    Ionizacin en Plasma de Acoplamiento Espectrometra de Masas

  • METODOLOGA EXPERIMENTALMETODOLOGA EXPERIMENTAL

    Tratamiento previo

    Preparacin del extracto

    Anlisis bacteriolgico (metodologa bacteriana en aguas):

    - E. Coli

    - Salmonella spp.

    Anlisis secuencias: Blast/ BioEdit

    - Salmonella spp.

    - Enterococcus spp.

    - Clostridium perfringens

    Anlisis de protozoos (microscopa y tcnicas de Biologa Molecular):- AVL y ARB

    - Giardia duodenalis

    - Cryptosporidium spp. (Tincin de

    Aislamiento y cultivo de AVL

    Preparacin del extracto

    Anlisis bacteriolgico (metodologa bacteriana en aguas):

    Electroforesis: Gel agarosa al 1,5%

    Clostridium perfringens.

    Anlisis de protozoos (microscopa y tcnicas de Biologa Molecular):

    spp. (Tincin de Ziehl-Neelsen modificada)

    PCR

  • METODOLOGA EXPERIMENTALMETODOLOGA EXPERIMENTAL

    Protozoo Regin diana Cebadores

    Amebas de Vida Libre

    ASA.S1 JDP1/ JDP2

    18S rADN regin conservada FLA F/ FLA R

    ITS/5.8S gen ribosomalITS 1/ ITS

    Fw1

    18S rADN regin conservada EUK F/ EUK R

    Cryptosporidium spp. (*) SSU rARN

    SSU 1/ SSU 2

    SSU 3/ SSU4

    Giardia duodenalis(*) tpi

    AL3543/ AL3546

    AL3544/ AL3545

    ARB(**) CebadoresLegionella

    pneumophila

    Mip-Leg-F 186/ Mip-Leg-R 186

    N-Mip-Leg-F 186/ SN-Mip-Leg-R 186

    Cianobacterias McyD-dir/ McyD-revCianobacterias txicas

    McyD-dir/ McyD-rev

    N-McyD-dir/ N-McyD-rev

    Mycobacterium spp.Hsp65-dir/ Hsp65-rev

    N-Hsp65-dir/ N-Hsp65-rev

    Pseudomonas spp.R16S-dir/ R16S-rev

    N-R16S-dir/ N-R16S-rev

    (*) Nested PCR

    (**) Pentaplex nested PCR

    Cebadores Tamao (pb) ReferenciaJDP1/ JDP2 500 Schroeder et al., 2001

    FLA F/ FLA R 800-150 Tsvekova et al. 2004

    ITS 1/ ITS 2

    Fw1/ Fw2(*)400-453 Pelandakis et al. 2002

    EUK F/ EUK R Variable Robert P. Hirt et al., 1997

    SSU 1/ SSU 2 1325Xiao et al., 1999

    SSU 3/ SSU4 826-864

    AL3543/ AL3546 605Sulaiman et al., 2003

    AL3544/ AL3545 530

    Tamao (pb) ReferenciaR 186 186 (Roch and Maurin, 2005)

    R 186 112 (Calvo L. et al., 2013)

    282(Calvo L. et al., 2013)

    282(Calvo L. et al., 2013)

    194

    354(Calvo L. et al., 2013)

    300

    962(Calvo L. et al., 2013)

    476

  • RESULTADOS (Bacterias)RESULTADOS (Bacterias)EMBALSE DE SOBRN

    Clostridium

    perfringens

    Escherichia

    coli

    Agua natural (UFC/100mL) 1,96E+04 2,31E+04

    D. polymorpha (UFC/g mejilln) 2,58E+04 8,36E+02

    UFC/g. mejilln/ UFC/g agua 131,6 3,6

    ACEQUIA DE RIMERACEQUIA DE RIMERClostridium

    perfringens

    Escherichia

    coli

    Agua natural (UFC/100mL) 4,72E+02 5,90E+03

    D. polymorpha (UFC/g mejilln) 5,73E+02 2,34E+02

    UFC/g. mejilln/ UFC/g agua 121,4 4,0

    EMBALSE DE FLIX

    Clostridium

    perfringens

    Escherichia

    coli

    Agua natural (UFC/100mL) - -

    Silverman et al., 1995; Vathanodorn et al., 1997; Abadas et al., 2013.

    Agua natural (UFC/100mL) - -

    D. polymorpha (UFC/g mejilln) 1,45E+02 5,22E+03

    Relacin concentracin bacteriana agua/mejilln marcada por:

    tamao y metabolizacin de bacterias

    Todas las bacteriaso R= 0,5509

    Sin E. colio R= 0,9999

    EMBALSE DE SOBRNEscherichia Enterococcus

    spp.Salmonella

    spp.

    9,00E+02 2,98E+04

    2,27E+02 5,11E+04

    25,2 171,5

    ACEQUIA DE RIMERTodas las bacteriaso R= 0,1441

    Sin E. colio R= 0,7541

    ACEQUIA DE RIMEREscherichia Enterococcus

    spp.Salmonella

    spp.

    3,40E+01 8,85E+01

    7,02E+01 4,01E+02

    206,5 453,1

    EMBALSE DE FLIX

    Escherichia Enterococcus

    spp.Salmonella

    spp.

    - -

    et al., 1997; Abadas et al., 2013.

    - -

    2,23E+01 4,47E+02

    INDICADOR SEMI-CUANTITATIVO

    Relacin concentracin bacteriana agua/mejilln marcada por:

    tamao y metabolizacin de bacterias

  • RESULTADOS (Bacterias)RESULTADOS (Bacterias)EMBALSE DE SOBRN

    Clostridium

    perfringens

    Escherichia

    coli

    Agua natural (UFC/100mL) 1,96E+04 2,31E+04

    D. polymorpha (UFC/g mejilln) 2,58E+04 8,36E+02

    UFC/g. mejilln/ UFC/g agua 131,6 3,6

    ACEQUIA DE RIMERACEQUIA DE RIMERClostridium

    perfringens

    Escherichia

    coli

    Agua natural (UFC/100mL) 4,72E+02 5,90E+03

    D. polymorpha (UFC/g mejilln) 5,73E+02 2,34E+02

    UFC/g. mejilln/ UFC/g agua 121,4 4,0

    EMBALSE DE FLIX

    Clostridium

    perfringens

    Escherichia

    coli

    Agua natural (UFC/100mL) - -

    Bacterias Sobrn (Laboratorio de Microbiologa del H.C.U. Lozano

    o Citrobacter braakii. o Stenotrophomonas maltophilia. (Corsaro et al., 2013)o Pseudomonas spp.

    Agua natural (UFC/100mL) - -

    D. polymorpha (UFC/g mejilln) 1,45E+02 5,22E+03

    Todas las bacteriaso R= 0,5509

    Sin E. colio R= 0,9999

    EMBALSE DE SOBRNEscherichia Enterococcus

    spp.Salmonella

    spp.

    9,00E+02 2,98E+04

    2,27E+02 5,11E+04

    25,2 171,5

    ACEQUIA DE RIMERTodas las bacteriaso R= 0,1441

    Sin E. colio R= 0,7541

    ACEQUIA DE RIMEREscherichia Enterococcus

    spp.Salmonella

    spp.

    3,40E+01 8,85E+01

    7,02E+01 4,01E+02

    206,5 453,1

    EMBALSE DE FLIX

    Escherichia Enterococcus

    spp.Salmonella

    spp.

    - -

    Bacterias Sobrn (Laboratorio de Microbiologa del H.C.U. Lozano Blesa de Zaragoza, sistema API)

    et al., 2013)

    - -

    2,23E+01 4,47E+02

  • RESULTADOS (Protozoos y ARB)RESULTADOS (Protozoos y ARB)

    Anlisis por PCR: 20 MUESTRAS (AVL aisladas y directos)

    Se consigue el aislamiento de AVL en el 85,5% de las muestras iniciales.

    Trofozoto Cercomonadida y forma flagelar de

    Naegleria spp.

    Trofozoto de Cercomonadida

    Trofozoto de Naegleria spp. 100X

    o 12 positivas (65%)o 10 identificadas (55%)

    Se consigue el aislamiento de AVL en el 85,5% de las muestras iniciales.

    10%10%

    40%

    40%

    AVL identificadas

    Acanthamoeba spp.

    Hartmannella spp.

    Naegleria spp.

    Huang et al., 2010; Kao et al., 2014; Garca et al., 2013

    33,33% Agua42,85% D. polymorpha

    40%Naegleria spp.

    Otras amebas

  • RESULTADOS (Protozoos y ARB)RESULTADOS (Protozoos y ARB)

    Anlisis por PCR: 20 MUESTRAS (AVL aisladas y directos)

    Se consigue el aislamiento de AVL en el 85,5% de las muestras iniciales.

    Doble implicacino AMBIENTALo SANITARIA

    Se detectan ARB en el 50% de las Amebas de Vida Libre aisladas.

    o Legionella spp. en el 50% de las AVL.Pseudomonas spp. en el 40% de las AVL.o Pseudomonas spp. en el 40% de las AVL.

    MEJILLN CEBRA

    AVL

    Garca et al. 2013; Sharma et al., 2013et al.; Dini et al., 200

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