Papel de Dreissena polymorpha (mejillón cebra ) como ... · como reservorio de microorganismos potencialmente patógenos y metales en el ... o Embalse Flix: 20 de marzo de 2014 o

Papel de Dreissena polymorpha Papel de Dreissena polymorpha

como reservorio de microorganismos potencialmente patógenos y metales en el

ecosistema de la cuenca del Ebro y su riesgo para la salud y el medio ambiente

Benito M., Goñi P., Ormad M.P., Mosteo R., Valero P., Fernández M.T.,

polymorpha (mejillón cebra) polymorpha (mejillón cebra) reservorio de microorganismos

potencialmente patógenos y metales en el ecosistema de la cuenca del Ebro y su riesgo para la

salud y el medio ambiente

M.P., Mosteo R., Valero P., Fernández M.T., Cieloszyk J.

INTRODUCCIÓNINTRODUCCIÓN

Ciclo reproductivo Dreissena polymorpha (Palau et al., 2004)

o Gran capacidad reproductora y

colonizadora.

o Primera detección España en 2001.

Archivo fotográfico www.chebro.es

o Primera detección España en 2001.

GRAVES PROBLEMAS MEDIOAMBIENTALES Y

ECONÓMICOSMapa de aguas afectadas por la presencia de

Mayo 2014 (Fuente: CHE)

o Morfología característica.

o Capacidad filtradora 1-2,5 l/día (15 a 40 µm).

GRAN CAPACIDAD GRAN CAPACIDAD BIOACUMULADORA

Mapa de aguas afectadas por la presencia de Dreissena polymorpha en la cuenca del Ebro.

Mayo 2014 (Fuente: CHE)

Investigar la posible acumulación de

fecal en mejillones cebra.

OBJETIVOSOBJETIVOS

OBJETIVO PRINCIPALfecal en mejillones cebra.

Identificar las Amebas de Vida Libre (AVL)

aguas superficiales y acumuladas en

Bacterias resistentes a la depredación

OBJETIVO PRINCIPAL

Estudiar el posible papel de Dreissena polymorpha como

Analizar la posible acumulación de metales

Dreissena polymorpha como bioindicador

bacterias indicadoras de contaminación

OBJETIVO PRINCIPAL

(AVL) y otros protozoos presentes en las

Dreissena polymorpha, así como de las

de las AVL (ARB).

OBJETIVO PRINCIPAL

Avanzar en el estudio sobre la integración del mejillón cebra en los

metales en D. polymorpha.

integración del mejillón cebra en los ecosistemas

METODOLOGÍA EXPERIMENTALMETODOLOGÍA EXPERIMENTAL

Puntos de muestreo:

o Embalse Flix: 20 de marzo de 2014

o Embalse de La Sotonera: 22 de marzo de 2014

o Embalse de Sobrón(*): 5 de mayo de o Embalse de Sobrón : 5 de mayo de

o Acequia de Rimer: 6 de junio de 2014

Análisis de metales:

• Condiciones:

• Tª= -40ºC

• P= 10-1 bar

• 24 horas

• Condiciones:

• Tª= -40ºC

• P= 10-1 bar

• 24 horas

Liofilización

(*)Muerte ejemplares

Mapa de aguas afectadas por la presencia de Dreissena polymorpha

• 24 horas• 24 horas

Ionización en Plasma de Acoplamiento Inductivo- Espectrometría de Masas

22 de marzo de 2014

5 de mayo de 20145 de mayo de 2014

6 de junio de 2014

Dreissena polymorpha en la cuenca del Ebro. Mayo 2014 (Fuente: CHE)

Ionización en Plasma de Acoplamiento Espectrometría de Masas


Tratamiento previo

Preparación del extracto

Análisis bacteriológico (metodología bacteriana en aguas):

- E. Coli

- Salmonella spp.

Análisis secuencias: Blast/ BioEdit

- Salmonella spp.

- Enterococcus spp.

- Clostridium perfringens

Análisis de protozoos (microscopía y técnicas de Biología Molecular):- AVL y ARB

- Giardia duodenalis

- Cryptosporidium spp. (Tinción de

Aislamiento y cultivo de AVL

Preparación del extracto

Análisis bacteriológico (metodología bacteriana en aguas):

Electroforesis: Gel agarosa al 1,5%

Clostridium perfringens.

Análisis de protozoos (microscopía y técnicas de Biología Molecular):

spp. (Tinción de Ziehl-Neelsen modificada)

PCR


Protozoo Región diana Cebadores

Amebas de Vida Libre

ASA.S1 JDP1/ JDP2

18S rADN región conservada FLA F/ FLA R

ITS/5.8S gen ribosomalITS 1/ ITS

Fw1

18S rADN región conservada EUK F/ EUK R

Cryptosporidium spp. (*) SSU rARN

SSU 1/ SSU 2

SSU 3/ SSU4

Giardia duodenalis(*) tpi

AL3543/ AL3546

AL3544/ AL3545

ARB(**) CebadoresLegionella

pneumophila

Mip-Leg-F 186/ Mip-Leg-R 186

N-Mip-Leg-F 186/ SN-Mip-Leg-R 186

Cianobacterias McyD-dir/ McyD-revCianobacterias tóxicas

McyD-dir/ McyD-rev

N-McyD-dir/ N-McyD-rev

Mycobacterium spp.Hsp65-dir/ Hsp65-rev

N-Hsp65-dir/ N-Hsp65-rev

Pseudomonas spp.R16S-dir/ R16S-rev

N-R16S-dir/ N-R16S-rev

(*) Nested PCR

(**) Pentaplex nested PCR

Cebadores Tamaño (pb) ReferenciaJDP1/ JDP2 500 Schroeder et al., 2001

FLA F/ FLA R 800-150 Tsvekova et al. 2004

ITS 1/ ITS 2

Fw1/ Fw2(*) 400-453 Pelandakis et al. 2002

EUK F/ EUK R Variable Robert P. Hirt et al., 1997

SSU 1/ SSU 2 1325Xiao et al., 1999

SSU 3/ SSU4 826-864

AL3543/ AL3546 605Sulaiman et al., 2003

AL3544/ AL3545 530

Tamaño (pb) ReferenciaR 186 186 (Roch and Maurin, 2005)

R 186 112 (Calvo L. et al., 2013)

282(Calvo L. et al., 2013)

282(Calvo L. et al., 2013)

194

354(Calvo L. et al., 2013)

300

962(Calvo L. et al., 2013)

476

RESULTADOS (Bacterias)RESULTADOS (Bacterias)EMBALSE DE SOBRÓN

Clostridium

perfringens

Escherichia

coli

Agua natural (UFC/100mL) 1,96E+04 2,31E+04

D. polymorpha (UFC/g mejillón) 2,58E+04 8,36E+02

UFC/g. mejillón/ UFC/g agua 131,6 3,6

ACEQUIA DE RIMERACEQUIA DE RIMERClostridium

perfringens

Escherichia

coli




EMBALSE DE FLIX

Clostridium

perfringens

Escherichia

coli

Agua natural (UFC/100mL) - -

Silverman et al., 1995; Vathanodorn et al., 1997; Abadías et al., 2013.



Relación concentración bacteriana agua/mejillón marcada por:

tamaño y metabolización de bacterias

Todas las bacteriaso R= 0,5509

Sin E. coli

o R= 0,9999

EMBALSE DE SOBRÓNEscherichia Enterococcus

spp.Salmonella

spp.

9,00E+02 2,98E+04

2,27E+02 5,11E+04

25,2 171,5

ACEQUIA DE RIMERTodas las bacteriaso R= 0,1441

Sin E. coli

o R= 0,7541

ACEQUIA DE RIMEREscherichia Enterococcus

spp.Salmonella

spp.

3,40E+01 8,85E+01

7,02E+01 4,01E+02

206,5 453,1

EMBALSE DE FLIX

Escherichia Enterococcus

spp.

Salmonella

spp.

- -

et al., 1997; Abadías et al., 2013.

- -

2,23E+01 4,47E+02

INDICADOR SEMI-CUANTITATIVO

Relación concentración bacteriana agua/mejillón marcada por:

tamaño y metabolización de bacterias

RESULTADOS (Bacterias)RESULTADOS (Bacterias)EMBALSE DE SOBRÓN

Clostridium

perfringens

Escherichia

coli




ACEQUIA DE RIMERACEQUIA DE RIMERClostridium

perfringens

Escherichia

coli




EMBALSE DE FLIX

Clostridium

perfringens

Escherichia

coli


Bacterias Sobrón (Laboratorio de Microbiología del H.C.U. Lozano

o Citrobacter braakii.

o Stenotrophomonas maltophilia. (Corsaro et al., 2013)

o Pseudomonas spp.



Todas las bacteriaso R= 0,5509

Sin E. coli

o R= 0,9999

EMBALSE DE SOBRÓNEscherichia Enterococcus

spp.Salmonella

spp.

9,00E+02 2,98E+04

2,27E+02 5,11E+04

25,2 171,5

ACEQUIA DE RIMERTodas las bacteriaso R= 0,1441

Sin E. coli

o R= 0,7541

ACEQUIA DE RIMEREscherichia Enterococcus

spp.Salmonella

spp.

3,40E+01 8,85E+01

7,02E+01 4,01E+02

206,5 453,1

EMBALSE DE FLIX

Escherichia Enterococcus

spp.

Salmonella

spp.

- -

Bacterias Sobrón (Laboratorio de Microbiología del H.C.U. Lozano Blesa de Zaragoza, sistema API)

et al., 2013)

- -

2,23E+01 4,47E+02

RESULTADOS (Protozoos y ARB)RESULTADOS (Protozoos y ARB)

Análisis por PCR: 20 MUESTRAS

(AVL aisladas y directos)

� Se consigue el aislamiento de AVL en el 85,5% de las muestras iniciales.

Trofozoíto Cercomonadida y forma flagelar de

Naegleria spp.

Trofozoíto de Cercomonadida

Trofozoíto de Naegleria spp. 100X

o 12 positivas (65%)o 10 identificadas (55%)

Se consigue el aislamiento de AVL en el 85,5% de las muestras iniciales.

10%10%

40%

40%

AVL identificadas

Acanthamoeba spp.

Hartmannella spp.

Naegleria spp.

Huang et al., 2010; Kao et al., 2014; García et al., 2013

•33,33% Agua

•42,85% D. polymorpha

40%Naegleria spp.

Otras amebas

RESULTADOS (Protozoos y ARB)RESULTADOS (Protozoos y ARB)

Análisis por PCR: 20 MUESTRAS

(AVL aisladas y directos)

� Se consigue el aislamiento de AVL en el 85,5% de las muestras iniciales.

Doble implicacióno AMBIENTALo SANITARIA

� Se detectan ARB en el 50% de las Amebas de Vida Libre aisladas.

o Legionella spp. en el 50% de las AVL.

Pseudomonas spp. en el 40% de las AVL.o Pseudomonas spp. en el 40% de las AVL.

MEJILLÓN CEBRA

AVL

García et al. 2013; Sharma et al., 2013et al.; Dini et al., 2000;

o 12 positivas (65%)o 10 identificadas (55%)

Se consigue el aislamiento de AVL en el 85,5% de las muestras iniciales.

• Identificación de distintos géneros

• Acumulación de protozoos (AVL)

Se detectan ARB en el 50% de las Amebas de Vida Libre aisladas.

spp. en el 40% de las AVL.spp. en el 40% de las AVL.

AVL ARB

“Caballo de Troya”

et al., 2013et al.; Dini et al., 2000; Abedkhojasteh, 2013; Por et al., 2009

RESULTADOS (Metales)RESULTADOS (Metales)

MetalLa Sotonera Flix Sobrón Caspe

µg/g µg/g µg/g µg/g

RD 60-2011 SUSTANCIAS PRIORITARIAS Y PREFERENTESCr 67,26 4,65 3,38 2,68

Se <MCD <MCD <MCD <MCD

Ni 18,64 8,70 5,85 7,16

Cu 13,37 13,06 8,09 7,17Cu 13,37 13,06 8,09 7,17

Zn 97,49 110,50 98,38 117,73

As 3,91 4,13 6,59 7,50Cd 0,62 0,64 2,51 1,28

Hg <MCD 0,10 0,15 <MCD

Pb 0,58 1,78 0,19 0,45

OTROS RESULTADOS SIGNIFICATIVOSAl 833,07 1447,86 100,19 151,98

Mn 40,19 72,89 16,43 41,39

Fe 952,19 1287,81 353,08 461,34

0,17Sb <MCD 0,17 0,03 0,04

Cs 0,24 0,35 0,05 0,06

Th 0,21 0,35 0,04 0,06

Total 66 metales analizados

RIESGO PARA EL ECOSISTEMA Y LA SALUD

MCD

µg/g

2011 SUSTANCIAS PRIORITARIAS Y PREFERENTES2,68 0,07

<MCD 3,25

7,16 0,48

7,17 0,37

No existen valores de

referencia en D. polymorpha

Resultado significativamente

superior: DISCORDANTE7,17 0,37

117,73 1,04

7,50 1,21

1,28 0,03

<MCD 0,08

0,45 0,06

151,98 8,76

41,39 0,09

461,34 34,24

superior: DISCORDANTE

La Sotonera y Flix

AGUA CONTAMINADA(Camusso et al., 2000; Faria et al., 2009;

Bourgeault et al., 2011)

0,04 0,01

0,06 0,01

0,06 0,01Sobrón y Caspe

AGUA NO CONTAMINADA (Camusso et al., 2000; Alcaraz et

al., 2010; Gundacker, 1998)RIESGO PARA EL ECOSISTEMA Y LA SALUD

RESULTADOS (Metales)RESULTADOS (Metales)

RIESGO PARA EL ECOSISTEMA Y LA SALUD

No existen valores de

referencia en D. polymorpha

Resultado significativamente

superior: DISCORDANTE

Sobrón y Caspe

AGUA NO CONTAMINADA (Camusso et al., 2000; Alcaraz et

La Sotonera y Flix

AGUA CONTAMINADA(Camusso et al., 2000; Faria et al., 2009;

Bourgeault et al., 2011)

(Camusso et al., 2000; Alcaraz et

al., 2010; Gundacker, 1998)

Se cumplen los límites :

o RD 60-2011

o Orden de 11 de mayo de 1988 RIESGO PARA EL ECOSISTEMA Y LA SALUD

CONCLUSIONESCONCLUSIONES

1. Se demuestra la acumulación de bacterias en

factores como tamaño y metabolización, convirtiéndolo

calidad microbiológica del agua.

2. Se evidencia la capacidad del mejillón cebra para

Cryptosporidium spp. ni Giardia duodenalis pero

simultáneamente en una misma muestra.

3. El 50% AVL aisladas presentan en su interior

protegiéndolas de desinfectantes comunes, permitiendo

4. Correspondencia entre los metales de mayor concentración

obtenida en D. polymorpha. Por lo que puede resultar

biota.

obtenida en D. polymorpha. Por lo que puede resultar

biota.

5. Destacar su utilidad para analizar el estado ecológico

permanece en el sustrato al que se fija almacenando

el interior del mejillón cebra, determinada por

convirtiéndolo en un bioindicador semi-cuantitativo de

para la acumulación de protozoos. No se detecta ni

pero sí se identifican diferentes géneros de AVL

interior Legionella spp. y el 40% Pseudomonas spp.

permitiendo incluso que se reproduzcan en su interior.

concentración por la actividad desarrollada y la

resultar útil como indicador de calidad del agua enresultar útil como indicador de calidad del agua en

ecológico de una localización concreta, ya que

almacenando microorganismos y contaminantes del agua.

AGRADECIMIENTOSAGRADECIMIENTOS

• Universidad de Zaragoza. Proyecto deecológico de las masas de agua medianteecológico de las masas de agua mediantebiológico (JIUZ2013-TEC-14)”.

• TRAGSA Empresa de Transformación Agraria,

• Confederación Hidrográfica del Ebro.• Confederación Hidrográfica del Ebro.

de Investigación “Evaluación del estadomediante el uso del mejillón cebra como indicadormediante el uso del mejillón cebra como indicador

Agraria, S.A.

GRACIAS POR SU ATENCIÓNGRACIAS POR SU ATENCIÓNProyecto de Investigación “Evaluación del estado ecológico de las masas de agua mediante el

uso del mejillón cebra como indicador biológico (JIUZ2013

POR SU ATENCIÓNPOR SU ATENCIÓNProyecto de Investigación “Evaluación del estado ecológico de las masas de agua mediante el

uso del mejillón cebra como indicador biológico (JIUZ2013-TEC-14)”

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Papel de Dreissena polymorpha (mejillón cebra ) como ... · como reservorio de microorganismos potencialmente patógenos y metales en el ... o Embalse Flix: 20 de marzo de 2014 o