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1
Papel da proteína tirosina fosfatase BceD na interação
com Burkholderia e células epiteliais
Micaela Sintra Torrado
Dissertação para a obtenção do grau de Mestre
Bioengenharia e Nanossistemas
Orientadores: Professora Doutora Leonilde de Fátima Morais Moreira
Doutora Ana Sofia de Jesus Ferreira
Júri:
Presidente: Professor Doutor Luís Joaquim Pina da Fonseca
Orientador: Professora Doutora Leonilde de Fátima Morais Moreira
Vogais: Doutora Dalila Madeira Nascimento Mil-Homens
Dezembro de 2014
i
Agradecimentos
Para chegar até aqui, muitas foram as pessoas que me apoiaram nos momentos mais
difíceis desta etapa.
Quero agradecer à minha orientadora Professora Doutora Leonilde Moreira e co-
oriendadora Doutora Ana Sofia Ferreira pela oportunidade de permitir a minha integração na
sua equipa, assim como toda a disponibilidade demonstrada para me ajudar e orientar.
Quero igualmente agradecer a todos os colegas do BSRG que sempre se prontificaram
para me auxiliar e pelos inúmeros conhecimentos que me foram transmitindo ao logo do
projeto, principalmente às Doutoras Inês Silva e Dalila Mil-Homens e aos Doutores Nuno
Bernardes e Mário Santos.
A todos os meus amigos e colegas de curso por estarem sempre ao meu lado durante
esta fase, pelo seu companheirismo, força e apoio em todos os momentos.
Por último, porque sozinha não chegaria a esta etapa da minha vida, quero agradecer à
minha família por todo o apoio incondicional, pela amizade, paciência e ajuda na superação de
todos os obstáculos que apareceram ao longo desta caminhada.
O meu MUITO OBRIGADA a todos.
ii
Resumo
O complexo Burkholderia cepacia (Bcc) engloba presentemente 18 espécies de
bactérias Gram-negativas, associadas a infeções respiratórias, geralmente crónicas, em
doentes com fibrose quística (FQ). Estas infeções respiratórias causadas por bactérias
pertencentes ao Bcc provocam uma diminuição da função pulmonar e uma redução do tempo
espectável de vida do doente, sendo consistentemente identificadas como fatores de risco.
Apesar de já se terem caracterizado muitos fatores de virulência em Bcc, os mecanismos
moleculares empregues por estas bactérias na interação com o hospedeiro ainda são
grandemente desconhecidos. Por exemplo, pouco se sabe sobre um possível efeito de
proteínas bacterianas com atividade de tirosina fosfatase na alteração de vias de sinalização
do hospedeiro. Como tal, o objetivo deste estudo foi determinar se as propriedades de adesão
a superfícies abióticas (biofilme) ou bióticas (células epiteliais de pulmão CFBE41o-) estão
dependentes da atividade da proteína tirosina fosfatase BceD de Burkholderia contaminans
IST408. Para tal, introduziram-se mutações em aminoácidos conservados correspondentes a
regiões catalíticas de BceD e avaliou-se a sua atividade como fosfatase. Os resultados obtidos
indicaram que as alterações dos resíduos C9A, D119A, R15E e Y128F de BceD resultaram na
perda de atividade enzimática. Por sua vez, a introdução destas mutações em BceD não
alterou capacidade de formação de biofilmes de B. contaminans, mas afetou a capacidade de
adesão a células CFBE41o-. Estes resultados deixam em aberto a possibilidade de BceD, e em
particular a sua atividade como tirosina fosfatase, poder direta ou indiretamente contribuir para
os mecanismos de interação bactéria-hospedeiro.
Palavras-chave: Proteína tirosina fosfatase, Burkholderia contaminans, fibrose quística,
biofilmes, células epiteliais de pulmão
iii
Abstract
The Burkholderia cepacia complex (Bcc) includes presently 18 species of Gram-
negative bacteria generally associated to chronic respiratory infections in patients with cystic
fibrosis (CF). These respiratory infections caused by bacteria belonging to the Bcc cause a
decrease in lung function and a reduced lifetime of the patient being consistently identified as
risk factors. While many Bcc virulence factors have been characterized, the molecular
mechanisms used by these bacteria in the interaction with the host are still largely unknown. For
example, little is known about a possible effect of bacterial protein tyrosine phosphatases
activity in the signaling pathways of the host. As such, the aim of this study was to determine
whether the properties of adhesion to abiotic (biofilm) or biotic (lung epithelial cells CFBE41o-)
surfaces of Burkholderia contaminans IST408 are dependent on BceD protein tyrosine
phosphatase activity. To do this, mutations were introduced into BceD regions corresponding to
catalytic conserved amino acids and evaluated their activity as a phosphatase. The results
indicated that the changes of C9A, D119A, R15E and Y128F of BceD resulted in loss of
enzyme activity. In turn, the introduction of these mutations in BceD did not alter the ability of B.
contaminans to form biofilms, but it affected its ability to adhere to cells CFBE41o-. These
results leave open the possibility of BceD, and in particular its activity as a tyrosine
phosphatase, direct or indirectly contribute to the mechanisms of bacteria-host interaction.
Keywords: Protein tyrosine phosphatase, Burkholderia contaminans, cystic fibrosis, biofilms,
lung epithelial cells
iv
Índice
Agradecimentos.............................................................................................................................. i
Resumo .......................................................................................................................................... ii
Abstract ......................................................................................................................................... iii
Índice ............................................................................................................................................. iv
Índice de Figuras ........................................................................................................................... vi
Índice de tabelas .......................................................................................................................... vii
Abreviaturas e Siglas .................................................................................................................. viii
1. Introdução .............................................................................................................................. 1
1.1. Burkholderia cepacia ..................................................................................................... 1
1.2. Exopolissacárido ........................................................................................................... 2
1.3. Fosforilação de proteínas em bactérias ........................................................................ 4
1.3.1. Fosfotirosina fosfatases bacterianas ..................................................................... 5
1.4. Biofilmes ........................................................................................................................ 7
1.5. Modelos para estudo de infeção ................................................................................... 8
1.6. Objetivo da tese ............................................................................................................. 8
2. Materiais e métodos ............................................................................................................ 10
2.1. Material biológico e condições de crescimento ........................................................... 10
2.1.1. Estirpes bacterianas, plasmídeos e oligonucleótidos ......................................... 10
2.1.2. Armazenamento e condições de crescimento bacteriano .................................. 11
2.2. Técnicas de manipulação de DNA .............................................................................. 12
2.2.1. Extração de DNA ................................................................................................. 12
2.2.2. Amplificação de DNA por PCR ............................................................................ 12
2.2.3. Electroforese em gel de agarose ........................................................................ 12
2.2.4. Mutagénese dirigida em resíduos conservados da proteína BceD .................... 13
2.3. Introdução de DNA recombinante em células ............................................................. 13
2.3.1. Células eletrocompetentes .................................................................................. 13
2.3.2. Electrotransformação de estirpes de Burkholderia ............................................. 14
2.3.3. Conjugação triparental para transferência de plasmídeos .................................. 14
2.4. Técnicas de manipulação de proteínas ...................................................................... 14
v
2.4.1. Sobre-expressão de proteínas recombinantes ................................................... 14
2.4.2. Purificação das proteínas His6-BceD através de cromatografia por afinidade ... 15
2.4.3. Análise de proteínas por electroforese ................................................................ 15
2.4.3.1. Electroforese em géis de poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS-
PAGE)………... ................................................................................................................ 15
2.5. Ensaios enzimáticos .................................................................................................... 16
2.6. Formação de biofilmes ................................................................................................ 16
2.7. Linhas celulares e cultura de células .......................................................................... 17
2.8. Ensaios de adesão e invasão ..................................................................................... 17
3. Resultados ........................................................................................................................... 18
3.1. Mutagénese dirigida em resíduos conservados de BceD ........................................... 18
3.2. Sobre-expressão da proteína recombinante His6-BceD e seus variantes .................. 19
3.3. Purificação das proteínas His6-BceD e variantes através de cromatografia de
afinidade .................................................................................................................................. 20
3.4. Ensaios enzimáticos .................................................................................................... 21
3.5. Importância da atividade de fosfatase de BceD na adesão a superfícies bióticas e
abióticas .................................................................................................................................. 22
3.5.1 Ensaio de formação de biofilmes ............................................................................ 24
3.5.2. Ensaios de adesão e invasão de células epiteliais ................................................. 24
Discussão dos resultados ........................................................................................................... 27
Bibliografia ................................................................................................................................... 29
vi
Índice de Figuras
Figura 1 – Estrutura da unidade heptassacarídica repetitiva do exopolissacárido cepaciano. .... 3
Figura 2 – Organização genética do agrupamento de genes bce envolvidos na produção do
exopolissacárido em Burkholderia cepacia.. ................................................................................. 3
Figura 3 - Alinhamento da proteína BceD de B. cepacia com PTPs de baixo peso molecular de
procariotas confirmada experimentalmente. ............................................................................... 18
Figura 4 - Gel de proteínas SDS-PAGE representativo da sobre-expressão da proteínas
recombinantes His6-BceD. .......................................................................................................... 19
Figura 5 - Purificação da proteína His6-BceDC9A ......................................................................... 20
Figura 6 – Retas para a determinação da velocidade de hidrólise de PNPP por Hi6-BceD na
presença de concentrações crescentes de substrato. ................................................................ 21
Figura 7 - Atividade de fosfatase de His6-BceD pura na presença de PNPP e representação de
Lineweaver-Burk para determinação das constantes cinéticas .................................................. 22
Figura 8 -Separação electroforética em gel de agarose de DNA plasmídico correspondente à
conjugação triparental. ................................................................................................................ 23
Figura 9 –Tamanho do biofilme formado pelas estirpes indicadas após 48 horas de indução em
meio S, sem agitação, a 30°C. .................................................................................................... 24
Figura 10 – Adesão de Burkholderia contaminans IST408 e mutante bceD::Tp a células
CFBE410- obtidas por microscopia de fluorescência (A). Em B mostra-se a % de adesão das
bactérias a células epiteliais determinado pela contagem de CFUs. ......................................... 25
vii
Índice de tabelas
Tabela 1 - Fosfotirosina fosfatases envolvidas em processos de virulência através da interação
com proteínas da célula hospedeira ............................................................................................. 6
Tabela 2 - Estirpes bacterianas utilizadas neste estudo ............................................................. 10
Tabela 3 - Plasmídeos utilizados neste estudo ........................................................................... 10
Tabela 4 – Oligonucleótidos utilizados para a mutagénese dirigida por recurso a PCR. ........... 11
viii
Abreviaturas e Siglas
ABC – cassete de ligação a ATP
ATP – Adenosina trifosfato
Bcc – Complexo Burkholderia cepacia
CFTR – Regulador de condutância transmembranar de fibrose quística
CFU – Unidades formadoras de colónias
DNA – Ácido desoxirribonucleico
dNTP – Desoxirribonucleotídeo fosfatado
DO – Densidade óptica
EPS – Exopolissacárido
FBS – Soro fetal de bovino
FQ – Fibrose quística
IPTG – Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
LB – Meio de cultura Luria-Bertani
LMW-PTP – Proteína fosfotirosina fosfatase de baixa massa molecular
MEM – Meio essencial mínimo com sais Earle
MOI – Multiplicidade de infeção
PBS – Solução salina tamponada com fosfato
PCR – Reação em cadeia da polimerase
PHP – Fosfatase polimerase-histidinol
PNP – p-nitrofenol
PNPP – p-nitrofenol fosfato
PTP – Proteína fosfotirosina fosfatase
Rpm – Rotações por minuto
SDS-PAGE – Dodecil-sulfato de sódio (SDS) de poliacrilamida (PAGE)
1
1. Introdução
1.1. Burkholderia cepacia
O género Burkholderia engloba mais de 80 espécies de bactérias Gram-negativas em
forma de bastonete. A espécie Pseudomonas cepacia, atualmente denominada Burkholderia
cepacia, está inserida num complexo composto por 18 espécies relacionadas entre si com o
nome de Complexo Burkholderia cepacia (do inglês Burkholderia cepacia complex, Bcc). Esta
espécie foi descrita pela primeira vez em 1950 por Walter Burkholder como sendo um agente
fitopatogénico, associado ao apodrecimento das cebolas. Contudo, as espécies pertencentes
ao Bcc são comuns no meio ambiente (água, solo e rizosfera de plantas), em humanos.
Existem várias espécies do Bcc que desenvolvem interações benéficas com os seus
hospedeiros como a produção de compostos antimicrobianos, a colonização de raízes de
plantas e fixação de azoto e a utilização de uma variedade de compostos de carbono e outras
que são patogénicas oportunistas em humanos causando graves infeções respiratórias em
pacientes com fibrose quística (FQ) e em indivíduos imunocomprometidos (Coenye e
Vandamme, 2003; Vandamme e Dawyndt, 2011).
A fibrose quística, descrita pela primeira vez em 1936, é a doença hereditária
autossómica recessiva fatal mais comum na população caucasiana, com uma incidência de
aproximadamente 1 em cada 2500 nascimentos (Wallis, 1997). É causada por uma mutação no
braço longo do cromossoma 7, na região 3, banda 1 (7q31), que codifica para uma proteína
transmembranar transportadora de iões Cl- pertencente à superfamília ABC (“ATP-binding-
cassete”) denominada regulador de condutância transmembranar de fibrose quística (do inglês
Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator, CFTR). Mutações neste gene
conduzem ao muco pulmonar mais espesso característico da doença e insuficiência
progressiva da função respiratória (Nussbaum et al., 2001; Rommens et al., 1989). Desde as
primeiras descrições da doença na década de 40 que é reconhecida a elevada suscetibilidade
dos doentes com FQ às infeções pulmonares. Estes doentes são muitas das vezes colonizados
por uma série de microrganismos que agravam o estado do paciente. O pulmão é um dos
principais órgãos afetados em doentes com FQ. As secreções são desidratadas, o que dificulta
a limpeza mucociliar e os elevados teores de cloreto de sódio levam à inativação de proteínas
relacionadas com a resposta imunológica, formando-se deste modo um ambiente favorável à
colonização de microrganismos e, consequentemente, ao aumento da suscetibilidade a
infeções respiratórias (Govan e Deretic, 1996).
Apesar de cerca de 50-60% dos pacientes com fibrose quística serem colonizados por
Pseudomonas aeruginosa, um outro agente infecioso muito temido é Bcc, com uma taxa de
incidência entre 4-8%, devido à sua resistência à maioria dos antibióticos de uso clínico e à sua
associação com a deterioração rápida e fatal das funções pulmonares, acompanhada de
septicémia, situação clinicamente conhecida pelo nome "síndrome da cepacia”. As infeções
2
provocadas por microrganismos pertencentes ao Bcc em doentes com FQ podem variar desde
a eliminação espontânea das bactérias, à colonização assintomática e declínio gradual do
estado do doente, até ao “síndrome da cepacia” (Isles et al., 1984).
1.2. Exopolissacárido
A identificação dos fatores de virulência envolvidos na patogenicidade das bactérias do
complexo Bcc é uma das áreas de investigação da maior importância. Entre esses fatores de
virulência encontram-se enzimas extracelulares como as lipases, estruturas da superfície de
bactérias como o exopolissacárido, vários tipos de sideróforos para a captura de ferro, vários
sistemas de secreção de proteínas do tipo I, II, III, IV, V e VI e vários sistemas de deteção de
quorum sensing, entre eles as proteínas homólogas a LuxIR (Ferreira et al., 2013; Leitão et al.,
2010).
Os polissacáridos extracelulares ou exopolissacáridos (EPS) são polímeros de açúcar
de alto peso molecular sintetizados e segregados por muitos microrganismos. A produção de
exopolissacárido tem um papel muito importante na adaptação de bactérias a diferentes
condições de stresse, estando envolvido na criação de relações de simbiose e patogenicidade
com os hospedeiros, na interação com péptidos antimicrobianos, na persistência no pulmão de
doentes FQ e em vários modelos de infeção, na formação de biofilmes, na quimiotaxia dos
neutrófilos e, na capacidade de sequestrar espécies reativas de oxigénio, havendo nestes dois
últimos uma ação direta e fundamental na defesa pulmonar do hospedeiro (Herasimenka et al.,
2005; Cunha et al., 2004; Zlosnik et al., 2008; Conway et al., 2004; Sousa et al., 2007; Bylund
et al., 2006). Apesar de já se terem identificado pelo menos sete tipos diferentes de
exopolissacáridos produzidos por espécies do género Burkholderia, o mais comum é o
cepaciano, sendo constituído por uma unidade heptassacarídica repetitiva acetilada formada
pelos monossacáridos D-glucose, D-ramnose, D-manose, D-galactose e ácido D-glucurónico
na proporção de 1:1:1:3:1 (Figura 1). Nas condições experimentais usadas, o cepaciano é o
único exopolissacárido produzido por Burkholderia contaminans IST408 (anteriormente
designada Burkholderia cepacia), estirpe estudada ao longo deste trabalho (Ferreira et al.,
2011). A importância da produção de EPS por Burkholderia em interações patogénicas foi
estudada in vitro e in vivo. A formação de EPS em Bcc é especialmente importante na adesão
a superfícies, na resistência a péptidos antimicrobianos, na interferência com o sistema
imunitário inato e na contribuição para formação de biofilmes (Ferreira et al., 2013; Conway et
al., 2004; Ferreira et al., 2007).
3
Figura 1 – Estrutura da unidade heptassacarídica repetitiva do exopolissacárido cepaciano. Glc, glucose; Gal, galactose; GlcA, ácido glucurónico; Man, manose; Rha, ramnose. Adaptado de Cerantola et al. (1999), Cescutti et al. (2000).
Os genes necessários para a biossíntese do cepaciano compreendem o agrupamento
de genes bce-I e bce-II (Figura 2). O primeiro agrupamento de genes (bce-I) é composto por 11
genes de bceA a bceK. Os genes bceA e bceC codificam proteínas presumivelmente
envolvidas na biossíntese de nucleótidos ativados de açúcar; os genes bceB, bceG, bceH,
bceJ e bceK codificam para possíveis glicosiltransferases; já os restantes genes (bceD, bceE,
bceF e bceI) codificam para proteínas possivelmente envolvidas no processo de polimerização
e excreção do exopolissacárido. Relativamente ao segundo agrupamento de genes (bce-II) é
composto por 9 genes de bceM a bceU. Os genes bceM, bceN e bceT codificam proteínas
presumivelmente envolvidas na biossíntese de nucleótidos ativados de açúcar; os genes bceO,
bceS e bceU codificam para possíveis aciltransferases; o gene bceR codifica para uma
possível glicosiltransferase bifuncional; o gene bceQ codifica para uma proteína possivelmente
envolvida no processo de polimerização e excreção do exopolissacárido; e, finalmente, o gene
bceP tem função desconhecida (Figura 2) (Ferreira et al., 2011).
Figura 2 – Organização genética do agrupamento de genes bce envolvidos na produção do exopolissacárido em estirpes do complexo Burkholderia cepacia. Adaptado de Ferreira et al. (2011).
4
O gene estudado neste projeto, bceD, está envolvido no processo de polimerização e
excreção do exopolissacárido e codifica para uma proteína com atividade de fosfotirosina
fosfatase que remove o grupo fosfato dos resíduos de tirosina fosforilados. O envolvimento
desta proteína na regulação da biossíntese do exopolissacárido cepaciano deverá ser por
modificações pós-tradução de algumas enzimas necessárias para a produção deste polímero,
nomeadamente da tirosina cinase BceF. Estudos realizados revelam que a interrupção do gene
bceD mostra apenas uma redução de cerca de 25% do cepaciano produzido, mas este
polímero parece ter viscosidade mais baixa do que o EPS nativo e possivelmente uma massa
molecular inferior (Ferreira et al., 2007).
1.3. Fosforilação de proteínas em bactérias
A fosforilação de proteínas é uma das modificações pós-tradução mais importantes e
está envolvida na regulação de uma grande variedade de processos fisiológicos. Ainda que em
eucariotas a fosforilação de resíduos de tirosina, serina e treonina fosse bem conhecida, só no
final da década de 1970 foi demonstrada a presença de aminoácidos fosforilados em proteínas
bacterianas (Ge e Shan, 2011; Grangeasse et al., 2012; Kobir et al., 2011; Grangeasse ey al.,
2007). Inicialmente pensava-se que em procariotas apenas existia fosforilação nos resíduos de
ácido aspártico, uma característica importante dos sistemas de transdução do sinal de dois
componentes. No entanto, em 1970 observou-se a existência de fosforilação em resíduos de
serina e de treonina em bactérias e em meados da década de 80, a fosforilação de resíduos de
tirosina em bactérias foi finalmente demonstrada. A fosforilação de resíduos de serina, de
treonina e de tirosina é importante no mecanismo do controlo dinâmico de diversos processos
celulares em bactérias, incluindo a biossíntese de polissacáridos, o metabolismo de DNA, a
divisão celular, e a resistência a compostos antimicrobianos. A fosforilação de proteínas, ou
seja, a adição de grupos fosfatos nestas é realizada por proteínas denominadas cinases e a
desfosforilação de proteínas, ou seja, a remoção de grupos fosfato nestas é concretizada por
proteínas denominadas fosfatases (Grangeasse et al., 2007; Kiley e Stanley-Wall, 2010;
Aoyama et al., 2003; Zhang, 2005).
Um dos exemplos mais bem estudados da fosforilação/desfosforilação de resíduos de
tirosina em bactérias está relacionado com a produção de polissacáridos, mas além destes, a
fosforilação por proteínas tirosina cinase está também relacionada com muitos outros
processos celulares, como a produção de cápsula, o crescimento, a migração, a exportação
flagelina, a adaptação a condições de stresse e a produção de metabolitos secundários
(Whitmore e Lamont, 2012; Guan e Dixon, 1993). Enquanto as proteínas tirosina cinase (BY-
kinases) já são estudadas desde a década de 80, as primeiras purificações de fosfotirosina
fosfatases foram realizadas em 1988 e a primeira clonagem de um gene em 1990. Por este
5
motivo, as tirosina cinases bacterianas, estão hoje em dia mais bem caracterizadas e
compreendidas que as fosfotirosina fosfatases (Isles et al., 1984; Cozzone et al., 2004).
1.3.1. Fosfotirosina fosfatases bacterianas
As proteínas fosfotirosina fosfatases (do inglês protein tyrosine phosphatase, PTP) são
uma família de enzimas responsáveis pela hidrólise do grupo fosfato ligado a resíduos de
tirosina em proteínas. São caracterizadas por possuírem um domínio altamente conservado
com uma sequência consenso no local catalítico característico desta família
([I/V]HCXAGXXR[S/T]G), onde X é qualquer aminoácido. Os resíduos de cisteína e de arginina
são essenciais para a catálise enzimática (Aoyama et al., 2003).
Com base na função, estrutura e sequência, as proteínas com atividade de fosfotirosina
fosfatase podem ser agrupadas em três famílias principais: (i) proteínas fosfotirosina fosfatase
(PTP) semelhantes às eucarióticas e proteínas fosfatase com dupla especificidade; (ii)
fosfatases polimerase-histidinol (PHP), geralmente presentes em bactérias Gram-positivas; e
(iii) proteínas fosfotirosina fosfatase de baixa massa molecular (LMW-PTP) compostas por
enzimas acídicas também presentes em organismos eucariotas. Estas famílias apresentam
regiões de consenso na sequência de aminoácidos, principalmente do centro ativo
(Grangeasse et al., 2007; Aoyama et al., 2003; Cozzone et al., 2004; Whitmore e Lamont,
2012).
Embora as fosfotirosina fosfatases bacterianas possam estar intimamente envolvidas
numa série de processos celulares, dois grandes temas tornaram-se evidentes: a participação
destas na produção de polissacárido e atuando como proteínas efetoras com o potencial de
manipulação de vias de transdução de sinal de células hospedeiras. A produção de
exopolissacárido é um determinante de virulência em muitos organismos e, portanto, a
atividade da fosfotirosina fosfatase tem aqui um papel fulcral no fluxo de informações que
controla a atividade patogénica (Ferreira et al., 2007; Grangeasse et al., 2007). Por outro lado,
existem PTPs que afetam as vias de sinalização do hospedeiro, encontrando-se algumas delas
na Tabela 1. Como exemplo, a fosfatase YopH de Yersinia, que é injetada em células epiteliais
humanas, visa proteínas de adesão focal de acolhimento, tal como p130Cas, paxilina e cinase
de adesão focal (FAK). Da mesma forma, a proteína SptP de Salmonella enterica inibe a
ativação da via de MAPK por desfosforilação da proteína Raf, quebra a distribuição dos
filamentos intermédios após a ligação de vimentina e regula a biogénese de um nicho
intracelular através da desfosforilação de VCP. A fosfatase PtpA de Mycobacterium
tuberculosis é também um dos exemplos de interação com células hospedeiras (Chao et al.,
2009). Mycobacterium tuberculosis segrega duas PTPs, ambas necessárias para a
sobrevivência intracelular em macrófagos. A proteína PtpA é excretada durante o processo de
infeção de células hospedeiras e esta proteína altera vias de sinalização eucarióticas
6
permitindo à bactéria resistir ao processo fagocítico, enquanto a PtpB tem um eventual papel
na subversão da resposta imunitária do hospedeiro (Bach et al., 2008; Wong et al., 2011; Zhou
et al., 2010; Andrade e Valvano, 2014). Também a fosfotirosina fosfatase Dpm de Burkholderia
cenocepacia está implicada no atraso da maturação de vacúolos contendo bactérias em
macrófagos (Andrade e Valvano, 2014). Contudo, a Dpm não é funcional no que respeita à sua
atividade de fosfatase. De referir ainda que, exceto para MPtpA de Mycobacterium tuberculosis
e Dpm de Burkholderia cenocepacia que são LMW-PTP’s, todas as restantes fosfotirosina
fosfatases com relevo em virulência são membros da família PTP.
Tabela 1 - Fosfotirosina fosfatases envolvidas em processos de virulência através da interação com proteínas da célula hospedeira (adaptado de Whitmore e Lamont (2012) e Andrade e Valvano (2014)).
Organismo Enzima Impacto nas células
hospedeiras Referências
Coxiella burnetii Acp Inibição de neutrófilos
humanos
Hill e Samuel,
2011
Listeria monocytogenes LipA Disrupção do citoesqueleto de
actina
Kastner et al.,
2011
Mycobacterium tuberculosis MPtpA e B Polimerização da actina em
macrófagos
Koul et al., 2000;
Cowley et al.,
2002
Salmonella typhi StpA Disrupção do citoesqueleto do
hospedeiro Arricau et al., 1997
Salmonella ‘typhimurium’ SptP Rearranjo da actina Murli et al., 2001
Yersinia pseudotuberculosis YopH Rearranjo do citoesqueleto;
inibição da fagocitose Bliska, 2000
Burkholderia cenocepacia Dpm Atraso na maturação de
fagossomas
Andrade e
Valvano, 2014
Como foi referido anteriormente, a produção de exopolissacáridos e cápsula são
considerados fatores de virulência uma vez que muitos são fracamente imunogénicos e
mascaram antigénios de superfície e recetores que seriam reconhecidos pelas células
fagocíticas do hospedeiro. Como tal, sendo a quantidade de polissacárido controlada pela
atividade de cinases/fosfatases, estas enzimas são de facto cruciais nestes mecanismos de
virulência. Em alguns casos a desfosforilação da tirosina cinase aumenta a produção de
polissacárido, como é o caso de E. coli K-12 produtora de ácido colânico (Vincent et al, 1999).
Contrariamente, em E. coli K-30 a produção de polissacárido capsular do grupo I aumenta com
o nível de fosforilação da cinase (Wugeditsh et al, 2001). Qualquer que seja a situação, pode-
se afirmar que os níveis de produção de polissacáridos estão dependentes da atividade de
tirosina cinases e fosfatases.
Para além do envolvimento direto das proteínas BceD e BceF de B. contaminans
IST408 na produção do exopolissacárido cepaciano, estas enzimas também estão envolvidas
7
noutros processos celulares. Num estudo recente onde se analisou o transcriptoma do mutante
para o gene bceF com a estirpe selvagem, ficaram evidentes grandes diferenças ao nível da
expressão de genes com 630 deles a apresentarem expressão diferencial (Ferreira et al, 2013).
A maioria dos genes com expressão diminuída estão incluídos nas categorias de resposta ao
stress, mobilidade celular, adesão e metabolismo de carbono e energia. Os genes com
expressão aumentada estão sobretudo envolvidos no metabolismo de lípidos e sinalização
intracelular. O estudo de alguns fenótipos revelou que o mutante no gene bceF é menos
resistente ao choque térmico e à radiação ultravioleta, apresenta motilidade reduzida, menor
formação de biofilmes e atenuação da virulência em Galleria mellonella (Ferreira et al, 2013).
Num estudo posterior com estes mutantes avaliaram-se várias propriedades relevantes para a
interação com células do hospedeiro, nomeadamente utilizando uma linha celular do epitélio
pulmonar de um doente com FQ. Os resultados obtidos indicaram que os mutantes para os
genes bceD e bceF de Burkholderia contaminans IST408 apresentavam níveis de adesão e
invasão às células CFB41o- inferiores aos da estirpe selvagem. Além disso, estes mutantes
apresentavam uma capacidade inferior de perturbação das ligações coesivas entre as células
do epitélio. Isto foi demonstrado através da observação de um menor fluxo de albumina
marcada em epitélio infetado com cada um dos mutantes e de um maior número das proteínas
ZO-1, claudina e ocludina, associadas à adesão entre as células (Ferreira et al, dados não
publicados).
1.4. Biofilmes
Os biofilmes são comunidades complexas de bactérias embebidas numa matriz e
aderidas a uma superfície e a sua formação é afetada pela quantidade de ferro disponível pela
síntese de exopolissacárido e pela mobilidade das bactérias (Dunne, 2002; Huber et al., 2002;
Cunha et al., 2004). A formação de biofilmes proporciona proteção aos elementos que o
constituem não só em termos nutricionais mas também em termos de alterações ambientais e
na defesa contra o hospedeiro. Estas comunidades apresentam proteção não só aos
antibióticos mas também ao sistema imunitário do hospedeiro (Dunne, 2002; Loutet e Valvano,
2010).
A formação de biofilme pelas bactérias P. aeruginosa tem sido reconhecida como um
importante problema clínico devido ao facto de as bactérias que crescem em biofilmes
apresentarem uma maior resistência aos antibióticos e mais proteção contra a resposta
imunitária do hospedeiro. Bactérias do complexo Burkholderia cepacia e P. aeruginosa
colonizam os pulmões dos doentes com FQ através de biofilmes, podendo estes serem mistos,
isto é, formados por mais do que uma espécie de bactérias (Forstner, 1993; Eaves-Pyles et al.,
2001).
8
Embora se conheçam vários determinantes moleculares envolvidos na formação de
biofilmes, muitos há ainda por descobrir. Por exemplo, só muito recentemente foi evidenciada a
relevância de proteínas tirosina fosfatases na formação de biofilmes em Pseudomonas
aeruginosa, Streptococcus gordonii e Porphyromonas gingivalis. A tirosina fosfatase TpbA de
Pseudomonas aeruginosa foi identificada como um regulador negativo da expressão do operão
pel que leva à síntese de um polissacárido componente da matriz extracelular do biofilme. Esta
proteína regula ainda a lise celular por forma a controlar a quantidade de DNA extracelular
usado na maturação do biofilme (Ueda e Wood, 2009; Ueda e Wood, 2010). De entre os
organismos que colonizam a cavidade bocal, as bactérias Porphyromonas gingivalis e
Streptococcus gordonii formam biofilmes conjuntos que são regulados pela tirosina fosfatase
de baixa massa molecular Ltp1 de Porphyromonas gingivalis. Foi demonstrado que esta
proteína funciona como um regulador negativo da produção de exopolissacárido e
consequentemente da formação de biofilme (Maeda et al, 2008). Relativamente à proteína
BceD de Burkholderia contaminans IST408, esta parece ter relevância na formação de
biofilmes uma vez que o mutante para o gene bceD apresenta menor formação de biofilme que
a estirpe selvagem (Ferreira et al, 2007).
1.5. Modelos para estudo de infeção
Uma variedade de modelos de infeção in vivo têm vindo a ser desenvolvidos com vista
a investigar quer mecanismos conservados quer mecanismos específicos de patogenicidade
no hospedeiro. Modelos biológicos como: Galleria mellonella e Caenorhabditis elegans,
embriões de peixe-zebra, ratinhos, porcos e linhas celulares eucarióticas são alguns exemplos
de modelos de infeção utilizados no estudo de fatores de virulência de bactérias do Bcc e na
resposta imunitária do hospedeiro (Leitão et al., 2010).
Neste trabalho serão utilizadas linhas celulares de epitélio pulmonar humano
CFBE41o- como modelo biológico. As linhas celulares de epitélio pulmonar humano CFBE41o-
são homozigóticas para a mutação delta F508 no gene CFTR.
1.6. Objetivo da tese
Estudos recentes sobre a relevância da proteína BceD na interação da bactéria com
células epiteliais de pulmão de um doente com FQ revelaram que na sua ausência, a bactéria
apresenta um menor grau de adesão e invasão (Ferreira et al, não publicado). Adicionalmente,
a estirpe mutante para bceD apresentou menor capacidade de quebrar as junções entre
células epiteliais crescidas em monocamada, sendo pois um indicativo de que fenómenos de
9
fosforilação/desfosforilação são importantes no processo de interação bactéria-hospedeiro.
Assim sendo, o objetivo deste trabalho é compreender a forma como a proteína BceD está
envolvida em processos de adesão/invasão de células epiteliais. Para isso é necessário obter-
se variantes de His6-BceD que apresentem mutações no centro ativo e determinar
experimentalmente se perderam a atividade fosfatase. Depois pretende-se expressar o gene
bceD nativo e variantes sem atividade de fosfatase no mutante bceD e determinar se os níveis
de adesão/invasão de células epiteliais e da formação de biofilmes são dependentes dessa
mesma atividade de tirosina fosfatase.
10
2. Materiais e métodos
2.1. Material biológico e condições de crescimento
2.1.1. Estirpes bacterianas, plasmídeos e oligonucleótidos
Várias estirpes bacterianas foram utilizadas neste trabalho e estão listadas na Tabela
2. As estirpes de Burkholderia foram usadas para o estudo da produção de biofilmes e de EPS
ou de outras características fenotípicas. As estirpes de E. coli foram utilizadas como células
hospedeiras para experiências de clonagem ou usadas para a purificação de proteínas de
fusão com uma cauda de histidinas.
Tabela 2 - Estirpes bacterianas utilizadas neste estudo.
Estirpe Genótipo e Características Relevantes Referências
Burkholderia contaminans IST408
Isolado clínico Richau et al., 2000
IST408 bceD::tpR
Derivada de B. contaminans IST408 com interrupção do gene bceD por uma cassete
tpR
Ferreira et al., 2007
E. coli XL1-Blue recA1 lac [F’ proAB lacl
qZ∆M15 Tn10(Tet
R)]
thi Bullock et al., 1987
E. coli SureTM
E14- (mcrA), D(mcrCB-hsdSMR-mrr)171, endA1, supE44, thi-1, gyrA96, relA1, lac, recB, recJ, sbsC, umuC:Tn5 (KM
R), uvrC,
(F’ proAB, lacIqZαM15 Tn10 (tet
R))
Stratagene
Abreviaturas: tpR, trimetoprim; tet
R, tetraciclina
A Tabela 3 mostra a lista de plasmídeos utilizados neste estudo e as características
mais relevantes de cada um.
Tabela 3 - Plasmídeos utilizados neste estudo
Plasmídeos Descrição Fonte
pWH844 Derivativo de pQE9, lacIq, Ap
R
Schirmer et al.,
1997
pBBR1MCS Vetor de clonagem de vasta gama de hospedeiros, Cm
R
Kovach et al., 1994
pRK2013 Vetor mobilizável, ColE1 tra (RK2)+, Km
R Figurski et al., 1979
pLM211-1 Derivado do pWH844 contendo o gene bceD Ferreira et al., 2007
pSF1305-1 Derivado do plasmídeo pLM211-1 expressando
His6-BceDC9A Este trabalho
pSF1305-4 Derivado do plasmídeo pLM211-1 expressando
His6-BceDY128F Este trabalho
pSF1305-5 Derivado do plasmídeo pLM211-1 expressando Este trabalho
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His6-BceDD119A
pSF1311-1 Derivado do plasmídeo pLM211-1 expressando
His6-BceDR15E Este trabalho
pLM136-2 Derivado do plasmídeo pBBR1MCS contendo o
promotor do operão bce e o gene bceD, CmR
Ferreira et al., não
publicado
pSF1311-2 Derivado do plasmídeo pLM136-2 expressando
BceDY128F Este trabalho
pSF1311-5 Derivado do plasmídeo pLM136-2 expressando
BceDC9A Este trabalho
pSF1311-6 Derivado do plasmídeo pLM136-2 expressando
BceDD119A Este trabalho
pSF1312-1 Derivado do plasmídeo pLM136-2 expressando
BceDR15E Este trabalho
Abreviaturas: ApR, ampicilina; Cm
R, cloranfenicol; Km
R, canamicina.
A lista de oligonucleótidos usados na amplificação de bceD, para efetuar mutagénese
dirigida está representada na Tabela 4.
Tabela 4 – Oligonucleótidos utilizados para a mutagénese dirigida por recurso a PCR.
Nome dos iniciadores Sequência
BceDY128F up CCGAGGCCGATTTCCGCGAGAGCTACTC
BceDY128F low GAGTAGCTCTCGCGGAAATCGGCCTCGG
BceDD119A up GGGGCCGAGATTGCCGCCCCGCACGGCGGCC
BceDD119A low GGCCGCCGTGCGGGGCGGCAATCTCGGCCCC
BceDC9A up AACATCCTGATCGTCGCCCACGCGAACGTCTGC
BceDC9A low GCAGACGTTCGCGTGGGCGACGATCAGGATGAA
BceDR15E up CACGCGAACGTCTGCGAGAGCCCGGCAGCGGAA
BceDR15E low TTCCGCTGCCGGGCTCTCGCAGACGTTCGCGTG
2.1.2. Armazenamento e condições de crescimento bacteriano
Para realizar o armazenamento a longo prazo, as culturas bacterianas foram mantidas
congeladas a -80°C em 40% (v/v) de glicerol. As culturas frescas foram obtidas a partir de parte
do material congelado, por inoculação em meio sólido durante a noite. As estipes de
Burkholderia cresceram em meio sólido adequado a 30°C e as estirpes de E. coli a 37°C. As
estirpes de Burkholderia foram mantidas em meio LB (Lennox broth, 20 g/L) suplementado com
concentrações apropriadas de antibiótico: 100 µg/ml de trimetoprim e 100 µg/ml de
cloranfenicol e as de E. coli em meio LB suplementado com 150 µg/ml de ampicilina. As
culturas líquidas foram preparadas transferindo uma colónia isolada de Burkholderia ou E. coli
para meio líquido LB e incubaram-se durante a noite a 30ºC ou 37ºC com agitação orbital.
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2.2. Técnicas de manipulação de DNA
2.2.1. Extração de DNA
O DNA plasmídico foi extraído de estirpes hospedeiras de E. coli crescidas em meio LB
suplementado com antibióticos apropriados por um kit de minipreps (Zymo research), seguindo
as instruções de preparação. Os fragmentos de DNA utilizados em processos de clonagem
foram purificados em géis de agarose com um kit de extração de gel QIAquick, de acordo com
as instruções apresentadas por este. As concentrações das soluções de DNA plasmídico foram
determinadas utilizando um espectrofotómetro ND-1000 (NanoDrop).
2.2.2. Amplificação de DNA por PCR
As condições gerais utilizadas para a realização de amplificação de DNA por PCR
foram: 100 ng do DNA molde, 1 U de Taq polimerase (Thermo Science), 0,4 µM de cada primer
e 200 µM de dNTPs. As concentrações de MgSO4 e enhancer foram otimizados em cada caso.
As reações de amplificação foram realizadas no termociclador Bio-Rad C1000. A temperatura
de ligação dos iniciadores e os tempos de extensão também foram otimizados para cada
conjunto de iniciadores e fragmentos de DNA. As condições gerais de PCR foram: as amostras
foram submetidas a uma desnaturação inicial de 2 minutos a 95°C, seguido de 30 ciclos de três
passos: desnaturação a 95°C durante 45 s, hibridação dos iniciadores a uma temperatura de
ligação otimizada durante 30 s e extensão das cadeias a 68°C durante o tempo, calculado
como 1 min por kb do produto esperado. Após os 30 ciclos, as amostras foram submetidas a
uma extensão final a 68°C durante 8 minutos e armazenada a 4°C.
2.2.3. Electroforese em gel de agarose
O procedimento de electroforese em gel de agarose foi adaptado a partir de Sambrook
et al. (2001), utilizando-se 0,8% (p/v) de agarose em tampão TAE 1X a 110 V. De modo a
preparar as amostras antes da eletroforese, foram adicionados 2 µL de tampão de amostra a
cada amostra de 20 µL. O marcador de pesos moleculares utilizado como padrão foi o 1 kb de
DNA ladder (Invitrogen). Depois da electroforese, o gel foi corado numa solução de GelRed e o
DNA foi visualizado sob luz UV utilizando o sistema Gel DOC e o software Quantity One.
13
2.2.4. Mutagénese dirigida em resíduos conservados da proteína BceD
A mutação específica de aminoácidos da proteína His6-BceD e BceD foi conseguida in
vitro usando o método de mutagénese dirigida QuikChange®. Os oligonucleótidos
complementares foram desenhados contendo o codão desejado modificado. Os iniciadores
foram desenhados para promover a troca de uma tirosina por uma fenilalanina na posição 128
(Y128F), de um ácido aspártico por uma alanina na posição 119 (D119A), de uma cisteína por
uma alanina na posição 9 (C9A) e de uma arginina por um ácido glutâmico na posição 15
(R15E). A mistura de PCR foi feita utilizando 5 µL do tampão de reação 10X concentrado, 25
ng de DNA, 1.5 µL de cada iniciador, 1 µL de dNTPs, 3 µL de DMSO e 1 µL de enzima turbo
polimerase (Pfu Ultra polymerase) para um volume final de 50 µL. As condições de PCR
usadas para promover a mudança do codão foram: 95ºC durante 2 minutos para promover a
desnaturação do DNA, 18 ciclos de 3 passos que consiste em 95ºC durante 50 segundos, 60ºC
durante 50 segundos e 68ºC durante 6 minutos, seguido de 1 ciclo a 68ºC durante 10 minutos
e 1 ciclo a 4ºC durante 5 minutos.
Depois da amplificação por PCR, os produtos de reação foram digeridos com a
endonuclease DpnI durante 1 hora a 37ºC, enzima essa que reconhece apenas DNA metilado,
promovendo a sua hidrólise. Após isto o DNA modificado é inserido em E. coli XL1-Blue
através de electrotransformação. A confirmação das mutações foi efetuada por sequenciação
de DNA.
2.3. Introdução de DNA recombinante em células
2.3.1. Células eletrocompetentes
As células eletrocompetentes de E. coli ou de B. contaminans foram preparadas
através da inoculação de 100 ml de meio LB com uma densidade ótica inicial de 0,2. As células
cresceram a 30ºC (B. contaminans) ou a 37ºC (E. coli), com agitação orbital até alcançarem
uma densidade ótica de 0.8. Após essa etapa, as culturas foram centrifugadas a 8000 rpm a
4ºC durante 15 minutos e posteriormente o sedimento foi lavado com água estéril gelada 3
vezes. No último passo de lavagem utilizou-se 4 ml de glicerol 10% (v/v) sob as mesmas
condições de centrifugação. O sedimento celular foi ressuspenso em 2 ml de glicerol 10% (v/v),
fizeram-se alíquotas de 110 µL e colocou-se no congelador a -80ºC.
14
2.3.2. Electrotransformação de estirpes de Burkholderia
Cerca de 15 µL de DNA plasmídico previamente preparados de clones de E. coli foram
misturados numa alíquota de células eletrocompetentes para B. contaminans IST408. Esta
mistura foi então transferida para uma cuvete de electrotransformação onde foi aplicado um
choque elétrico com uma voltagem de 2,5 kV. Depois do pulso elétrico, as células foram
incubadas em 900 µL de meio LB líquido durante a noite a 30ºC, após o qual as células foram
plaqueadas em meio seletivo apropriado.
2.3.3. Conjugação triparental para transferência de plasmídeos
A conjugação triparental foi utilizada para transferir plasmídeos de interesse de E. coli
para estirpes de Burkholderia. A estirpe dadora e a estirpe ajudante de E. coli cresceram
durante a noite a 37ºC em 30 ml de LB suplementado com antibióticos apropriados. As estirpes
recetoras de Burkholderia cresceram durante a noite a 30ºC em 30 ml de LB. Foram colocados
0,4 ml de cada estirpe em tubos de microcentrífuga diferentes e posteriormente foram
centrifugadas e lavadas com NaCl 0,9% (v/v) duas vezes e ressuspendidas em solução salina.
Juntou-se a cultura das 3 bactérias e centrifugou-se durante 5 minutos a baixa rotação. O
sedimento celular foi ressuspenso em 80 µl de NaCl 0,9% (v/v) e colocados num filtro inserido
previamente numa placa com LB sólido. Depois da incubação durante a noite a 30ºC, a
camada de bactérias que cresceu na superfície do filtro é ressuspendida em 1 ml de NaCl 0,9%
(v/v). Foram feitas diluições sucessivas apropriadas e plaquearam-se estas em placas de LB
sólido com concentrações apropriadas de antibiótico.
2.4. Técnicas de manipulação de proteínas
2.4.1. Sobre-expressão de proteínas recombinantes
As células E. coli Sure que albergam o plasmídeo pWH844 com o gene de interesse
clonado foram cultivadas em meio LB com ampicilina, com agitação de 250 rpm a 37°C, até se
obter uma densidade ótica aproximada a 0,6. A indução foi iniciada pela adição de 0,1 mM de
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) à cultura seguido de incubação durante 4 horas
para ocorrer a expressão da proteína. As células foram recolhidas através da centrifugação a
8000 rpm durante 10 minutos a 4ºC. O sobrenadante foi descartado e o sedimento celular foi
ressuspendido com 5 ml de tampão PBS 1X e congeladas a -80ºC até serem utilizadas.
15
2.4.2. Purificação das proteínas His6-BceD através de cromatografia
por afinidade
A proteína recombinante His6-BceD foi purificada a partir da lise de células de E. coli
por lise enzimática com auxílio do protocolo descrito de seguida. Após super-expressão,
centrifugou-se o sedimento celular ressuspendido no tampão PBS 1X durante 10 minutos a
8000 rpm a 4ºC. De seguida, por cada 200 mL de células, adicionou-se 1 ml de lisozima (20
µg/ml) e 15 ml de tampão de lise [25% (w/v) de sacarose, 50 mM Tris-Base, 100 mM NaCl a
pH=7,4], ressuspendeu-se o sedimento e colocou-se em gelo durante 25 minutos.
Posteriormente, adicionou-se 0,01 % (v/v) de Triton X-100 1% e misturou-se bem até a solução
ficar viscosa. Incubou-se a solução durante 15 min a 37ºC e finalmente adicionou-se 25 µL de
RNAse A (10 µg/ml) e 50 µL de DNAse I (4 µg/mL), misturou-se bem e incubou-se durante 20
minutos a 37ºC. Após a remoção dos restos celulares por centrifugação a 10.000 x g durante
20 min a 4°C, a proteína His6-BceD foi purificada por cromatografia de afinidade, que foi pré-
carregada com iões Ni2+
, devido à afinidade existente entre o níquel e a cauda de histidinas
presente na proteína His6-BceD. Foi utilizado um gradiente de concentração de imidazole para
eluir a proteína, com uma concentração a variar entre os 100 e os 300 mM de modo a se obter
a proteína purificada, uma vez que o imidazole tem maior afinidade para o níquel do que as
histidinas. Foram recolhidas 5 alíquotas de 1 ml de cada concentração de imidazole
adicionados à coluna para serem separadas por electroforese em gel de poliacrilamida em
condições desnaturantes.
2.4.3. Análise de proteínas por electroforese
2.4.3.1. Electroforese em géis de poliacrilamida em condições
desnaturantes (SDS-PAGE)
O sistema de gel descontínuo descrito por Laemmli (1970) foi usado para separar
proteínas em géis de poliacrilamida. Estes géis são compostos por dois géis diferentes: o gel
de corrida, que contém 12,5% de poliacrilamida e que permite que as proteínas sejam
separadas de acordo com o seu peso molecular; e o gel de resolução, contendo 4% de
poliacrilamida, onde as proteínas são inseridas. Após polimerização, o gel é imerso num
tampão de corrida com uma concentração 1X. Antes de serem aplicadas no gel, as amostras
são ressuspensas no tampão de aplicação incubadas durante 5 minutos a 100ºC e colocadas
em gelo até arrefecerem. A separação das proteínas é conseguida através da aplicação de um
campo elétrico com uma voltagem de 150 V durante aproximadamente 1 hora.
Após separação, os géis de acrilamida foram corados através da imersão destes numa
solução corante de azul coomassie durante cerca de 20 minutos. Durante a incubação, os géis
são agitados gentilmente para que o corante se espalhe uniformemente sobre o gel. Depois de
16
estarem corados, estes são lavados com água destilada e submetidos a uma solução
descorante.
2.5. Ensaios enzimáticos
A atividade fosfatase é determinada baseando-se num acompanhamento contínuo,
através de um espectrofotómetro a 405 nm, de p-nitrofenol (PNP) formado a partir do p-
nitrofenol fosfato (PNPP) a 37ºC. A mistura de reação contém 100 mM de tampão citrato de
sódio a pH 6,5, 1 mM de EDTA, β-mercaptoetanol a 0,1% (v/v) e concentrações variadas de
PNPP de 0 a 40 mM, num volume total de 1 ml. A concentração de PNP formada foi estimada
através do uso de um coeficiente de extinção molar de 18000 M-1
cm-1
. Todas as reações são
iniciadas pela adição de proteína purificada. Uma unidade da atividade da enzima foi definida
como a quantidade de enzima que catalisa a formação de 1 µmol de PNP por minuto sob as
condições do ensaio.
2.6. Formação de biofilmes
Os ensaios de formação de biofilmes foram baseados no método descrito por Cunha et
al., (2004). Foram preparadas culturas líquidas em meio LB de diferentes estirpes de B.
contaminans IST408 com os antibióticos apropriados e foram colocadas a crescer durante a
noite com agitação de 250 rpm a 37°C. As culturas foram subsequentemente diluídas em meio
S para uma densidade ótica de 0,1 a 640 nm, e 200 µl dessa suspensão de células foi utilizada
para inocular os poços de uma placa de 96 poços. Os poços contendo meio de crescimento S
esterilizado foram utilizados como controlos negativos na extremidade da placa. As placas
foram incubadas a 30°C durante 48 h sem agitação e o biofilme formado foi quantificado. Os
meios de cultura e as células bacterianas não ligadas foram removidas dos poços por lavagem
cuidadosa com NaCl a 0,9% (três vezes, 200 µL em cada lavagem) com o auxílio de uma
pipeta. As bactérias aderentes foram coradas com 200 µl de uma solução de violeta de cristal a
1% (p/v) durante 15 minutos à temperatura ambiente e de seguida realizaram-se três lavagens
suaves com 200 µL de NaCl a 0,9%. O corante que ficou nos poços foi solubilizado em 200 µL
de etanol a 95% e o biofilme foi quantificado pela medição da absorvância da solução a 590
nm, utilizando um leitor de microplacas. Os resultados são os valores médios para pelo menos
cinco repetições de três experiências independentes.
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2.7. Linhas celulares e cultura de células
Neste trabalho foram utilizadas linhas celulares de epitélio pulmonar de um doente com
fibrose quística denominadas CFBE41o-, homozigóticas para a mutação delta F508 do gene
CFTR. As linhas celulares foram mantidas em frascos revestidos com fibronectina em Meio
Essencial Mínimo com sais Earle (MEM, do inglês Minimum Essential Medium) suplementado
com 10% de soro fetal de bovino (FBS), L-Glutamina 0,292 g/L e Penicilina/Streptomicina 100
U/ml, a 37ºC em atmosfera húmida com 5% de CO2.
2.8. Ensaios de adesão e invasão
Os ensaios de adesão e invasão foram realizados em células epiteliais pulmonares
CFBE41o- usando uma adaptação do método descrito por Martin e Mohr (2000). As células
foram inicialmente crescidas em placas de 24 poços (4x105 células/poço) em meio MEM
suplementado com FBS e L-Glutamina, sem antibióticos, durante 24h a 37ºC numa atmosfera
húmida contendo aproximadamente 5% de CO2. Após 24h foram lavadas com PBS e mantidas
com meio MEM não suplementado. As estirpes bacterianas foram crescidas segundo as
condições acima referenciadas no máximo de 24h, tendo sido utilizada uma multiplicidade de
infeção de 10 células bacterianas para cada célula epitelial (MOI de 10:1). Para os ensaios de
adesão, as células já infetadas, foram incubadas a 37ºC numa atmosfera com 5% de CO2
durante 30 minutos de forma a proporcionar a adesão das bactérias às células. Findo o tempo
de adesão as células foram lavadas 3 vezes com PBS e lisadas com tampão de lise (10 mM
EDTA, 0,25% Triton X-100 e PBS) durante 20 minutos à temperatura ambiente. As células
aderidas foram quantificadas através do plaqueamento de diluições sucessivas do lisado. Os
resultados foram expressos por percentagem de adesão sendo estes corrigidos com base na
quantidade inicial de bactérias utilizadas para a infeção.
Nos ensaios de invasão as células foram igualmente infetadas com uma MOI de 10:1 e
com uma MOI de 50:1. No entanto, a fim de proporcionar a internalização das bactérias nas
células epiteliais, o tempo de incubação foi de 2h a 37ºC com 5% de CO2. Após o tempo de
incubação as células foram lavadas três vezes com PBS e, adicionou-se uma solução de
ciprofloxacina (2 mg/ml) deixando-se incubar por mais 2h nas mesmas condições, a fim de
eliminar todas as bactérias que não tenham sido internalizadas. Após este tempo, 100 µL do
sobrenadante foram plaqueados para verificar a eficácia dos antibióticos na morte bacteriana.
Por último as células epiteliais foram novamente lavadas três vezes com PBS e lisadas com
tampão de lise, 20 minutos à temperatura ambiente. A quantidade de células bacterianas com
capacidade invasiva foi determinada através do plaqueamento de diluições sucessivas do
lisado obtido.
18
3. Resultados
3.1. Mutagénese dirigida em resíduos conservados de BceD
A proteína BceD de B. contaminans IST408 foi previamente demonstrada como sendo
uma fosfatase uma vez que foi capaz de hidrolisar o substrato artificial PNPP e de desfosforilar
resíduos de tirosina fosforilados da cinase BceF (Ferreira et al, 2007). O alinhamento de
aminoácidos de BceD com outras LMW-PTPs evidencia a conservação do motivo CX4CR,
característico desta família (Figura 3).
Figura 3 - Alinhamento da proteína BceD de B. contaminans com PTPs de baixo peso molecular de procariotas confirmadas experimentalmente. Acinetobacter johnsonii (Aj) Ptp, Acinetobacter lowffii (Al) Wzb, Ralstonia solanacearum (Rs) EpsP, Salmonella enterica serotipo Typhimurium (St) Wzb, Escherichia coli (Ec) Wzb e Erwinia amylovora (Ea) AmsI. O X indica qualquer aminoácido. Os asteriscos indicam os resíduos de aminoácidos que são idênticos em todas as proteínas, um ou dois pontos indicam substituições semi-conservadas ou conservadas, respetivamente (adaptado de Ferreira et al. (2007)).
Para estudar a importância de alguns resíduos conservados de BceD, nomeadamente
resíduos pertencentes ao centro ativo (alteração do ácido aspártico na posição 119 por alanina,
da cisteína na posição 9 por alanina e da arginina na posição 15 por ácido glutâmico) e uma
tirosina altamente conservada na posição 128 por uma fenilalanina, na atividade da proteína
BceD, foi usada a técnica de mutagénese dirigida. Esta técnica consiste em mudar nucleótidos
específicos na sequência de DNA que codifica para a PTP de modo a promover a alteração
específica do resíduo pretendido. Neste trabalho o plasmídeo pLM211-1, contendo o gene
bceD, foi mutado de acordo com a técnica descrita anteriormente, após se ter efetuado
algumas otimizações, tendo-se obtido os plasmídeos: pSF1305-1, pSF1305-4, pSF1305-5 e o
pSF1311-1, codificando respetivamente as proteínas His6-BceDC9A, His6-BceDY128F, His6-
BceDD119A e His6-BceDR15E. As mutações pretendidas foram confirmadas através de
sequenciação de Sanger.
19
3.2. Sobre-expressão da proteína recombinante His6-BceD e
seus variantes
Após alterações de alguns codões do gene bceD por mutagénese dirigida, e de estes
plasmídeos variantes terem sido introduzidos em E. coli, realizou-se a sobre-expressão das
diferentes proteínas utilizando o protocolo descrito nos métodos. Foram tiradas frações da
cultura de células antes (tempo zero) e 4 horas depois (tempo 4) de ser adicionado o IPTG, de
modo a se poderem separar as proteínas num gel SDS-PAGE. Como se pode verificar através
da Figura 4, existem bandas muito intensas nos poços 3, 5, 7, 9 e 10 que evidenciam que
houve um aumento da quantidade da proteína recombinante com cerca de 18 kDa, o que era
pretendido. Os poços 2, 4, 6 e 8 representam os extratos proteicos totais da estirpe contendo o
plasmídeo para a expressão das proteínas His6-BceD, His6-BceDC9A, His6-BceDY128F e His6-
BceDD119A no tempo zero, respetivamente; os poços 3, 5, 7, 9 e 10 representam os extratos
proteicos totais da estirpe contendo o plasmídeo para a expressão das proteínas His6-BceD,
His6-BceDC9A, His6-BceDY128F, His6-BceDD119A e His6-BceDR15E, respetivamente, após 4 horas de
indução.
Figura 4 - Gel de proteínas SDS-PAGE representativo da sobre-expressão das proteínas recombinantes His6-BceD antes e após a indução (poços 2 e 3, respetivamente); da proteína His6-BceDC9A antes e após a indução (poços 4 e 5); da proteína His6-BceDY128F antes e após a indução (poços 6 e 7); da proteína His6-BceDD119A antes e após a indução (poços 8 e 9); e da proteína His6-BceDR15E após a indução (poço 10). O poço 1 representa o padrão de proteínas.
20
3.3. Purificação das proteínas His6-BceD e variantes através
de cromatografia de afinidade
Foi realizada a purificação das diferentes proteínas recombinantes que foram
anteriormente sobre-expressas, utilizando o protocolo descrito nos métodos. Recolheram-se
frações da coluna de cromatografia quando a proteína foi aplicada e quando foi eluida com
imidazole a diferentes concentrações. Depois separaram-se as frações proteicas num gel de
eletroforese SDS-PAGE, do qual a Figura 5 é representativa. Esta figura mostra o resultado da
purificação da proteína recombinante His6-BceDC9A com 18 kDa, onde se pode constatar o seu
grau de pureza em todas as frações eluídas, principalmente nas 2ª, 3ª e 4ª frações eluidas com
uma concentração de 200 mM de imidazole.
É de salientar que foram realizadas várias otimizações no protocolo da purificação
destas proteínas de modo a se obter o resultado pretendido. Inicialmente eram lisadas as
células através do método de sonicação e posteriormente estas foram lisadas através de
métodos enzimáticos uma vez que se obteve maior concentração de proteína livre. Também foi
otimizado o método de aplicação das diferentes concentrações de imidazole na coluna de
cromatografia: inicialmente era utilizado um equipamento que automaticamente colocava
diferentes concentrações de imidazole na coluna de cromatografia e posteriormente as
diferentes concentrações foram aplicadas à coluna manualmente. Estas duas alterações a um
protocolo já existente permitiram obter um maior rendimento da proteína pura.
Figura 5 - Purificação da proteína His6-BceDC9A em que o poço 5 corresponde ao padrão de proteínas. Os poços 1, 2, 3, e 4 correspondem ao conteúdo correspondente à concentração de imidazole de 200 mM nos 2º, 3, 4º e 5º ml recolhidos da coluna, respetivamente; os poços 6, 7 8, 9 e 10 correspondem ao conteúdo correspondente à concentração de imidazole de 300 mM nos 1º, 2º, 3º, 4º e 5.º ml recolhidos da coluna, respetivamente.
21
3.4. Ensaios enzimáticos
Para determinar a atividade de fosfatase de cada proteína recombinante, tanto da
nativa como das que continham alterações em diferentes resíduos, foram realizados ensaios
enzimáticos. A atividade fosfatase da proteína His6-BceD e das suas variantes foi testada
quanto à sua capacidade para clivar o substrato artificial PNPP. A Figura 6 representa os
valores de absorvância ao longo do tempo para algumas concentrações de PNPP e para a
proteína His6-BceD.
Figura 6 – Retas para a determinação da velocidade de hidrólise de PNPP por His6-BceD na presença de concentrações crescentes de substrato.
A proteína de fusão nativa purificada foi capaz de hidrolisar eficientemente este
substrato sintético a um valor de pH de 6,5, valor este testado em trabalhos anteriores como
sendo o pH ótimo de atividade desta proteína (Ferreira et al., 2007). Na Figura 7A está
representa a atividade de fosfatase de His6-BceD na presença de concentrações crescentes de
PNPP e determinados os parâmetros cinéticos Km e Vmax (Figura 7B). De acordo com os
valores obtidos, a velocidade máxima é de 0,16 µmol min-1
mg-1
para uma constante de
Michaelis-Menten de 0,61 mM.
y = 9E-07x - 0,0007 R² = 0,0704
y = 6E-05x + 0,0005 R² = 0,9975
y = 9E-05x - 0,0006 R² = 0,9986
y = 0,0001x - 0,0005 R² = 0,999
y = 0,0001x - 0,0015 R² = 0,999
-0,005
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
50 100 150 200
Ab
sovâ
nci
a 4
05
nm
Tempo (s)
0 mM
0,625 mM
1,25 mM
2,5 mM
5 mM
22
Figura 7 - Atividade de fosfatase de His6-BceD pura na presença de PNPP (A) e representação de Lineweaver-Burk para determinação das constantes cinéticas (B).
Após confirmação da atividade de His6-BceD usaram-se as mesmas condições para
avaliar a atividade de todas as restantes variantes de BceD. Os dados obtidos indicaram que
nenhuma delas apresentou qualquer atividade de fosfatase, confirmando assim a importância
dos resíduos de aminoácidos originais como cruciais para a atividade desta enzima.
3.5. Importância da atividade de fosfatase de BceD na adesão
a superfícies bióticas e abióticas
Para determinar se o envolvimento da proteína BceD em determinados fenótipos está
dependente a sua atividade como fosfotirosina fosfatase, optou-se por complementar o
mutante Burkholderia contaminans bceD::TpR com o gene bceD nativo e variantes a partir do
plasmídeo replicativo pBBR1MCS. Para tal foi necessário usar uma construção já existente no
laboratório que contém o promotor do operão bce e o gene bceD e que se denomina pLM136-
23
2. Assim, por mutagénese dirigida foram construídos os plasmídeos pSF1311-2, pSF311-5,
pSF311-6 e pSF312-1 expressando BceDY128F, BceDC9A, BceDD119A e BceDR15E, respetivamente.
Após sequenciação do gene bceD em cada um destes plasmídeos e confirmação da presença
da respetiva mutação, estes plasmídeos foram mobilizados para estirpes de Burkholderia
contaminans por conjugação triparental. Assim, foram introduzidos o vetor vazios (pBBR1MCS)
e o plasmídeo com o gene bceD (pLM211-1) na estirpe selvagem (IST408) e na estirpe mutada
no gene bceD (IST408 bceD::Tp). Foram também introduzidos no mutante todos os plasmídeos
com o gene bceD contendo cada uma das mutações nos aminoácidos conservados estudados
neste trabalho. No final da experiência foi necessário escolher as colónias corretas e verificar,
através de electroforese em gel de agarose, se realmente as estirpes continham o plasmídeo
que se pretendia introduzir. Na Figura 8 podem observar-se diferentes tamanhos de
plasmídeos: os poços 2 e 3 correspondem à estirpe IST408+pLM136-2; os poços 4, 5 e 6
correspondem à estirpe IST408+pBBR1MCS; os poços 7, 8 e 9 correspondem ao mutante
bceD::Tp+pLM136-2; os poços 10, 11 e 12 correspondem ao mutante bceD::Tp+pBBR1MCS.
Concluindo, as bandas que contêm um maior peso molecular correspondem às colónias que
continham o plasmídeo pLM136-2 e as que possuem menor peso molecular correspondem às
que apenas continham o vetor pBBR1MCS vazio. Seguindo o mesmo procedimento,
introduziram-se os plasmídeos com os variantes de bceD no mutante bceD::Tp (resultados não
apresentados).
Figura 8 - Separação electroforética em gel de agarose de DNA plasmídico correspondente à conjugação triparental. O poço 1 corresponde ao padrão de pesos moleculares; os poços 2 e 3 correspondem ao IST408+pLM136-2; os poços 4, 5 e 6 correspondem ao IST408+pBBR1MCS; os poços 7, 8 e 9 correspondem ao IST408 bceD::Tp+pLM136-2; os poços 10, 11 e 12 correspondem ao IST408 bceD::Tp+pBBR1MCS
24
3.5.1 Ensaio de formação de biofilmes
A formação de biofilme contribui para a proteção das bactérias contra o sistema
imunitário do hospedeiro e maior resistência a compostos tóxicos como antibióticos. Para
avaliar a formação de biofilme efetuou-se um ensaio quantitativo utilizando violeta de cristal.
Neste ensaio, o tamanho do biofilme formado por cada estirpe em estudo foi quantificado
através do crescimento das bactérias em 96 poços, em meio S, e estas foram incubadas a
30ºC durante 48 h antes da quantificação por recurso a violeta de cristal.
Os resultados obtidos são apresentados na Figura 9, que mostram que nas condições
testadas, a única estirpe que fez menor biofilme é o mutante bceD::Tp contendo o vetor
pBBR1MCS vazio. Todas as restantes estirpes expressando a proteína BceD nativa ou
variantes apresentam níveis superiores de formação de biofilme. Este resultado sugere que a
proteína BceD é importante para a formação do biofilme, mas que esta influência não depende
da sua atividade como fosfatase.
Figura 9 – Tamanho do biofilme formado pelas estirpes indicadas após 48 horas de indução em meio S, sem agitação, a 30°C.
3.5.2. Ensaios de adesão e invasão de células epiteliais
Resultados anteriores demonstraram que o mutante para o gene bceD de B.
contaminans IST408 apresenta níveis de adesão a células CFBE41o- inferiores aos
observados pela estirpe selvagem. Tal resultado está evidenciado na Figura 10A onde se
00,20,40,60,8
11,21,4
Bio
film
e 5
90
nm
*
25
podem ver imagens obtidas num microscópio de fluorescência, mostrando bactérias que
expressam a proteína fluorescente DsRed (Ferreira et al, resultados não publicados).
Neste trabalho, para se avaliar in vitro a capacidade de adesão de diferentes estirpes
estudadas, foi utilizada a mesma linha celular mostrada na Figura 10A. Os ensaios foram
efetuados com base na diferença das contagens de CFUs antes e após a infeção da
monocamada de células. Os resultados obtidos encontram-se representados na Figura 10B e
mostram que as estirpes que expressam a proteína BceD nativa apresentam maiores níveis de
adesão. Pelo contrário, o mutante bceD::Tp complementado com o vetor vazio ou as variantes
BceDC9A, BceDD119A e BceDR15E apresentam menores valores de adesão. O mutante
complementado com a variante BceDY128F apresenta um comportamento intermédio, não sendo
possível concluir com elevado grau de certeza quanto à sua importância. Este conjunto de
resultados parece sugerir que a máxima adesão de B. contaminans IST408 estará dependente
da atividade de fosfotirosina fosfatase de BceD.
Figura 10 – Adesão de Burkholderia contaminans IST408 e mutante bceD::Tp a células CFBE41o- obtidas por microscopia de fluorescência (A). As bactérias encontram-se marcadas pela proteína DsRed e as células epiteliais mostram a localização da proteína E-caderina após imunodeteção com um anticorpo marcado com Alexa488 (Ferreira et al, não publicado). Em B mostra-se a % de adesão das bactérias a células epiteliais determinado pela contagem de CFUs.
*
26
De seguida, efetuaram-se estudos de invasão das várias estirpes às células CFBE41o-.
Pese embora o facto de se terem testado MOI de 10 (10 células bacterianas) : (1 célula
epitelial) e 50, não foi possível obter qualquer CFU para as estirpes analisadas.
27
Discussão dos resultados
Apesar de já se terem identificado vários determinantes de virulência em estirpes do
complexo Burkholderia cepacia, é necessário identificar quais os genes que, em última análise,
regulam a expressão desses fatores de virulência. Neste trabalho examinou-se a atividade
enzimática e função biológica da fosfotirosina fosfatase BceD de Burkholderia contaminans
IST408. Esta proteína, cuja atividade de fosfatase já foi previamente demonstrada (Ferreira et
al, 2007), apresenta resíduos conservados no motivo CX4CR e DPY que correspondem a
regiões catalíticas. Como tal, três das mutações aqui estudadas corresponderam a resíduos
catalíticos, nomeadamente C9, D119 e R15. O resíduo de tirosina Y128 não está descrito como
importante na catálise, mas encontra-se conservado noutras fosfatases e como tal foi também
incluído neste estudo. De acordo com o previsto, a alteração nos resíduos C9, D119 e R15
resultaram em proteínas variantes de BceD sem atividade como fosfatase. Interessantemente,
a alteração do resíduo de tirosina na posição 128 também resultou na eliminação da atividade
catalítica de BceD. Duas razões que podem explicar este facto são o estar diretamente
implicado na catálise ou de esta alteração levar a uma mudança conformacional significativa
que impede o normal funcionamento da enzima.
Relativamente aos parâmetros cinéticos obtidos para a proteína BceD, estes valores
são inferiores aos obtidos anteriormente. Assim, neste trabalho obteve-se um Km de 0,61 mM e
um Vmax de 0,16 µmol min-1
mg-1
enquanto na publicação de Ferreira et al (2007) se obteve um
Km de 3,7 mM e um Vmax de 8,8 µmol min-1
mg-1
. Esta discrepância pode dever-se a uma
eventual perda de atividade no processo de lise celular enzimática ao invés da utilização de
ultrassons efetuada anteriormente.
Como foi referido anteriormente, as proteínas fosfotirosina fosfatases TpbA e Ltp1 de
Pseudomonas aeruginosa e Porphyromonas gingivalis, respetivamente, estão direta ou
indiretamente envolvidas na síntese de polissacáridos importantes para a matriz dos biofilmes
(Ueda et al, 2009; Maeda et al, 2008). Também em Burkholderia contaminans IST408 foi
demonstrado que a mutação no gene bceD leva à diminuição de 25% na produção de
exopolissacárido e a uma menor formação de biofilmes (Ferreira et al, 2007). Neste trabalho
confirmou-se que o mutante bceD::Tp produz menos biofilme, mas o envolvimento desta
proteína não parece estar dependente da atividade de fosfotirosina fosfatase uma vez que o
biofilme formado pelos variantes de BceD é semelhante à estirpe selvagem. Enquanto a razão
para estas observações não é compreendida, será interessante quantificar os níveis de
polissacárido produzido pelas várias estirpes e inferir se apenas a atividade fosfatase é
importante ou também se possíveis mecanismos de interação proteína-proteína podem
também estar envolvidos.
28
A ligação das bactérias às células epiteliais do pulmão é o primeiro passo para a
colonização deste órgão por estirpes de Bcc. Para avaliar a influência que o gene bceD poderá
ter na colonização foi expresso o gene bceD nativo e os variantes sem atividade de fosfatase
no mutante bceD e determinou-se se os níveis de adesão/invasão de células epiteliais são
dependentes da atividade fosfatase. Os resultados obtidos confirmam que a ausência do gene
bceD leva a uma menor adesão às células epiteliais. No que se refere às mutações nos
resíduos do centro ativo (C9A, D119A e R15E), verifica-se que também apresentam níveis de
adesão inferiores à estirpe selvagem, sugerindo que a atividade de fosfatase de BceD contribui
para o fenómeno de adesão. O resultado obtido para a estirpe contendo BceDY128F, apesar de
não apresentar atividade de fosfatase, tem um nível de adesão equivalente à estirpe selvagem,
o que não está de acordo com os resultados obtidos nas outras variantes mutadas de BceD.
Mais repetições desta experiência terão de ser efetuadas quer no que diz respeito à adesão e
confirmação da atividade enzimática.
Uma última questão que ficou em aberto é se a proteína BceD é excretada, atuando
diretamente sobre as células epiteliais, ou se o seu efeito é indireto, atuando sobre outras
moléculas efetoras de Burkholderia. De facto, proteínas da família PTP e LMW-PTP que se
conhece que interferirem em vias de sinalização do hospedeiro, como é o caso da YopH de
Yersinia pseudotuberculosis (Black et al, 1998), StpP de Salmonella ‘typhimurium’ (Lin et al,
2003) ou PtpA e PtpB de Mycobacterium tuberculosis (Koul et al, 2000) são todas elas
translocadas para células do hospedeiro. Num trabalho recente, Andrade e Valvano (2014)
avaliaram a excreção de 4 LMW-PTPs de Burkholderia cenocepacia, tendo concluído que
apenas a proteína Dpm era excretada. Ou seja, nas condições testadas por estes autores, a
proteína homóloga a BceD de Burkholderia contaminans IST408 não era excretada. Apesar
deste resultado, não podemos excluir que o possa ser na presença de células epiteliais
CFBE41o-. Se efetivamente BceD não for excretada, terá então de se investigar a sua
participação noutros processos celulares que favoreçam a adesão a superfícies bióticas como
é o caso das células epiteliais.
Em conclusão, este estudo demonstrou que a atividade de fosfatase de BceD de
Burkholderia contaminans IST408 requer a integridade dos motivos conservados que
correspondem às regiões catalíticas e que esta atividade não parece ter influência na formação
de biofilmes, mas é necessária para o processo de adesão a células epiteliais de pulmão
CFBE41o-.
29
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