Embed Size (px)
DESCRIPTION
genetičko injženjerstvo
Citation preview
OSNOVE KLONIRANJA GENA
- Restrikcijske endonukleaze- Vektori za kloniranje stranih DNA fragmenata- Metode sekvencioniranja DNA- Metode sekvencioniranja proteina- Lančana reakcija polimeraze (PCR)- Bioinformatika
TEMELJNE SPOZNAJE
Godina Autori Spoznaja
1944 – AVERY, MACLEOD, McCARTY transformirajući princip je DNA1950 – CHARGRAF 4 baze u DNA,
stalan odnos pojedinih purinskih i pirimidinskih baza
1951 – SANGER sekvencioniranje peptida, insulin1952 – HERSHEY i CHASE DNA odgovorna za nasljeđivanje1953 – WATSON i CRICK DNA je dvostruka zavojnica1958 – CRICK adaptor molekule, (tRNA)1961 – JACOB i MONOD regulacijska jedinica, operon - BRENNER mRNA - CRICK i sur. tri baze su jedan kod
- NIRENBERG i MATTHEL poliU kodira polifenilalanin1964 – YANOFSKY i sur. kolinearnost genetičkog koda1965 – BRENNER i sur. besmisleni kodoni, «stop»1970 – MANDEL i HIGA kompetencija, transformacija st.
- ARBER, SMITH, NATHANS restrikcijski enzimi1972 – BERG i sur. ugradnja strane DNA, spajanje frag.
- MERTZ i DAVIS T4 DNA ligaza1973 – COHEN i sur. konstrukcija funkcionalnog plazmida1976 – MANIATIS i sur. kloniranje eukariotskih gena
Prvi pravilnik o radu s rekombinantnom DNA
1977 – SANGER i sur. sekvencioniranje DNA
- MAXAM i GILBERT sekvencioniranje DNA1978 – CHANG i sur. eskspresija
eukariotskog gena u bak., DHFR-aza
- CREA, HIROSE, ITAKURA sinteza oligonukleotida
1980 – COHEN i BOYER patent za kloniranje gena
1983 – van MONTAGU i sur. Ti-plazmid za transformaciju biljnih st
1. TEMELJNE METODE
- Izolacija i analiza proteinao SDS-PAGEo kromatografske metodeo 2D gel elektroforezao koimunoprecipitacijao mikrosekvencioniranje (Edmanova odgradnja)o MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation
Time-of-Flight)www.sciencemag.org/feature/plus/sfg/resources/res_proteomics.shtml
o proteinski čipovi i mikroarrayio Western transfer
- Izolacija i analiza DNAo ekstrakcija fenolomo precipitacija etanolom/NaAco elektroforeza u gelu agarozeo ekstrakcija DNA fragmenata iz gela agaroze
o Southern transfer
- Izolacija i analiza RNAo ekstrakcija fenolom/GnSCno gradijenti gustoće Cs/Cl-ethidium bromideo elektroforeza u denaturirajućim uvjetima
(formamid/formaldehid)o Northern transfer
2. RESTRIKCIJSKE ENDONUKLEAZE
- Tri tipa restrikcijsko modifikacijskih enzima (na osnovi broja podjedinica, potrebe za kofaktorima i tipom cijepanja DNA molekula)
o Tip I – najsloženiji, sastoje se od tri tipa podjedinica i trebaju Mg2+, ATP i S-adenozinmetionin za cijepanje DNA. Njihova mjesta prepoznavanja su složena, a cijepanje se vrši na nespecifičnim mjestima 400 do 7000 pb od mjesta prepoznavanja.
o Tip III – nešto manje složen, sastoji se od dva tipa podjedinica, trebaju Mg2+, ATP, a S-adenozinmetionin stimulira enzimatsku aktivnost ali nije neophodan. Cijepanje DNA se odvija nešto dalje od mjesta prepoznavanja 25-27 pb.
o Tip II – najjednostavniji, samo jedna podjedinica. Cijepanje DNA na specifičnim mjestima unutar ili neposredno pokraj mjesta prepoznavanja. Godine1973. ustanovljena je nomenklatura za njihovo obilježavanje. Troslovna kratica organizma iz kojeg potječu, dodatno slovo koje obilježava soj ili serotip i rimski broj koji označava slijed otkrivanja ili identifikacije. HindIII – Haemophilus influenzae, BamHI – Bacillus amylolyquefaciens. Većina enzima
iz ove skupine prepoznaje sljedove od 4-6 nukleotida, ali pronađeni su i enzimi koji prepoznaju 7 ili 8 baza. Sljedovi nukleotida koji se prepoznaju najčešće su palindromi.
Klasa A Klasa C Klasa B
5'-GAATTC-3' EcoRI 5'-GGCC-3' HaeIII 5'-GCGC-3' HhaI3'-CTTAAG-5' 3'-CCGG-5' 3'-CGCG-5'
Izoshizomeri – su restrikcijske endonukleaze koje prepoznaju isti slijed, ali cijepaju DNA na drugom mjestu (unutar restrikcijskog mjesta).
5'-CCCGGG-3' SmaI 5'-CCCGGG-3' XmaI 3'-GGGCCC-5' 3'-GGGCCC-5'
Grupa 1: endonukleaze koje cijepaju definirane (nedegenerirane) sljedove. U ovu skupinu spadaju klasa A i B.
Grupa 2: endonukleaze koje cijepaju isprekidane palindrome.
CACNNNGTG
Grupa 3: endonukleaze koje prepoznaju degenerirane sljedove
CCA/TGG
Grupa 4: endonukleaze koje prepoznaju nepalindromske sljedove
Cijepaju DNA dalje od mjesta prepoznavanja.
- RFLP – Restriction Fragment Length Polymorphism - Odabir endonukleaza - Dvostruke digestije - Cijepanje DNA na završetcima
3. Enzimi za modifikaciju i obilježavanje DNA i RNA
- Klenow fragment DNA polimeraze I iz E. Coli
o Jedan polipeptid dobiven proteolizom DNA polimeraze I.Enzim ima 3' – 5' egzonukleaznu aktivnost ali ne posjeduje 5' - 3' egzonukleaznu aktivnost.
o Klenow fragment koristi se uglavnom za ispunjavanje 3' uvučenih krajeva ili za njihovo obilježavanje.
- Alkalna fosfataza CIP (calf intestine phospatase)
o Uklanjanje 5'-fosfata s DNA ili RNA prije obiljažavanja s 32P ili da se sprijeći neželjena intramolekularna ligacija vektora ili RNA.
- T4 polinukleotid kinaza
o Obilježavanje 5'-krajeva s 32PKatalizira prijenos -fosfata s ATP na 5'-hidroksi kraj DNA ili RNA. Substrat mora biti defosforiliran s alkalnom fosfatazom. Moguće je i obiljažavanje zamjenom fosfata.
o T4 polinukleotid kinaza posjeduje i 3'-fosfataznu aktivnost. Ako se substrat inkubira pri niskom pH i u odsustvu ATP ili ADP, 3'-fosfati bit će uklonjeni s DNA ili RNA molekula bez izmjene 5' krajeva.
- Egzonukleaze
o Nukleaza Bal 31Iz soja Alteromonas espejiana. DNA egzonukleazna aktivnost koja progresivno i bidirekcionalno uklanja mononukleotide s oba lanca linearne DNA. Koristi se za mapiranje restrikcijskih fragmenata i za kontrolirano uklanjanje sekvenci s DNA krajeva. Enzim je jako ovisan o slijedu nukleotida i brzina kraćenja jako varira.
o Egzonukleaza IIIKatalizira otpuštanje mononukleotida s 3' kraja DNA lanca. Enzim je i DNA 3'-fosfataza. Enzim napada jednolančani lom, ali neće rezati niti jednolančanu DNA niti dvolančanu DNA s 5' uvučenim krajem. Egzo III u kombinaciji s S1 nukleazom može kontrolirano kratit dvolančane DNA.
o egzonukleazaEnzim degradira dvostruku DNA s 5' kraja (bilo uvučenog ili izduženog) 100 puta brže od jednolančane DNA. Enzim ne može započeti digestiju DNA dupleksa na lomu ili procijepu.
o T4 DNA polymerazaU odsustvu deoksiribonukleozid trifosfata 3' egzonukleazena aktivnost T4 polimeraze može se koristiti za zasijecanje linearnog DNA dupleksa. DNA se može ispuniti dodavanjem deoksiribonukleozid trifosfata. Konačna DNA je dvolančana i nezasiječena.
- DNaza I
o DNaza I iz pankreasa ima endonukleaznu aktivnost i katalizira hidrolizu dvolančane i jednolančane DNA. DNaza I koristi se za stvaranje jednolančanih lomova kao npr. za pripremanje substrata za nick translaciju. Nick translacija koristi svojstvo DNA polimeraze I iz E. coli da dodaje nukleotide na 3'-hidroksi završetka s istodobnim uklanjanjem nukleotida s pokrajnjeg 5'-fosforilnog završetka.
- S1 nukleaza / Mung bean nukleaza
o Ima 5' - 3' egzonuleaznu aktivnost. Uklanja nukleotide s 5'-izduženog kraja. Može poslužiti za stvaranje tupih DNA krajeva.
4. Ligacija DNA molekula
- Godine 1967. znanstvanici iz nekoliko laboratorija gotovo su istovremeno objavili pronalazak DNA ligaze. Ovaj enzim katalizira stvaranje fosfodiesterske veze između 3'-hidroksi grupe na jednoj strani lanca s 5'-fosforilnim završetkom na drugoj strani lanca. Za ovu je rekciju potrebna energija. Kod bakterija to je NAD+, a u životinjskim stanicama i bakteriofagima izvor energije je ATP. Proces spajanja je neophodan za normalnu sintezu DNA, popravak oštečene DNA i splicing DNA lanaca prilikom genetičke rekombinacije. DNA ligaza ne može spojiti dvije molekule jednolančane DNA. Bakterijska ligaza stvara fosfodiesterske veze samo ako postoji nekoliko parova baza pokraj mjesta spajanja. Ligaza iz bakteriofaga T4 može spojiti dva tupa kraja dvolančanih DNA – ovo svojstvo iskorišteno je u genetičkom inženjerstvu.
- Mnogi faktori utjeću na efikasnost ligacije, ali najvažniji je da li su DNA krajevi «tupi» ili «ljepljivi». Dužina izduženog kraja također je važna. Svako zagađenje s fosfatazama, endonukleazama, ili eksonukleazama prilikom cijepanja DNA (ili ligacije) može značajno smanjiti sposobnost stvorenih završetaka da se povežu.
- Važan je odabir restrikcijake endonukleaze!!! Neki enzimi (npr. BstNI) stvaraju na završetcima produžetke od samo jedne baze. Ovakve krajeve mnogo je teže povezati ligazom. Enzimi poput Taq polimeraze ostavljaju na 3´ završetcima jednolančne A krajeve.
- Zbog svojstva grupe 3 endonukleaza da cijepaju DNA daleko od mjesta prepoznavanja ili da prepoznju degenerirane sljedove, obično nije moguće ligirati nastale fragmente. U ovom slučaju najjednostavnije je modificirati završetke i onda ih ligirati. Moguće je ligirati i adaptore na stvorene tupe krajeve
5. Lančana reakcija polimeraze (PCR)
- Tehnika je revolucionirala genetičko inženjerstvo u trenutku kada je iz organizma Thermus aquaticus izolirana DNA polimeraza otporna na visoku temperaturu.
- PCR tehnika bazira se na tri jednostavna koraka neophodna za sintezu DNA, a to su:
-1. Denaturacija DNA matrice na dva jedinstvena lanca.
Lanci molekule DNA drže se zajedno slabim nekovalentnim vezama (vodikovim) i mogu se lako odvojiti zagrijavanjem. Ovako odvojeni lanci mogu se ponovo povezati ako se temperatura spusti neznatno ispod Tm. Naglo spuštanje temperature termodinamički je nepovoljno, pa neće doći do ponovog spajanja lanaca.
A=T G≡C
≈2˚C ≈4˚C
2. Sljepljivanje (annealing) klica na svaki originalni lanac
3. Sinteza novog DNA lanca počevši od klica
- Ovaj slijed reakcija može se napraviti sa svakom DNA polimerazom, ali da bi se uspjelo načiniti više od jedne sinteze potrebno je ponovno denaturirati lance zagrijavanjem.
- Jedan od najvažnijih preduvjeta za uspješano izvođenje lančane reakcije polimeraze je pravilan izbor klica (oligonukleotida). Važno je pritom voditi računa da klice stvaraju stabilan dupleks s lancem matricom. Isto je tako važno da obje klice imaju podjednaku Tm. Klice nesmiju biti komplementarne na svojim 3' krajevima jer to može dovesti do stvaranja njihovih dimera i do znatnog smanjenja prinosa. Treba voditi računa o broju AT i GC parova baza. Najbolje je da klica na 3'-kraju završava s nekoliko GC parova baza jer će to doprinjeti boljem sparivanju. Treba paziti i da se slijed nukleotida u oligonukleotidu ne ponavlja nigdje drugdje u matrici. Moguće je i tako dizajnirati klice da one stvaraju neko mjesto za cijepanje restrikcijskim endonukleazama.
- Što je potrebno za PCR?
DNA matrica
Klice
dNTP
Taq polimeraza
Pufer s Mg2+ ionima
6. Vektori za molekularno kloniranje
Osnovni tipovi vektora: insercijski i zamijenski
- DNAo je temperirani bakteriofag E. coli. Viralna DNA je
linearna i dvolančana (48502 pb) s 12 pb jednolančanim komplementarnim 5'-krajevima (COS krajevi).
o Nakon ulaska kromosoma u bakterijsku stanicu on se cirkularizira spajanjem krajeva. U litičkom putu eksprimirani su geni koji kodiraju za proteine replikacije, lize i proteina viriona. Replicirani kromosom se reže i pakira u glave faga. U lizogenom putu, ekspresija gena faga je zakočena, a kružni se kromosom integrira u bakterijski kromosom rekombinacijom.
o Može se pakirati samo točno određena količina DNA. Fragmenti koji se mogu klonirati ne prelaze 20 kbp.
- Jednolančani DNA vektori
o X174 je prvi otkriveni bakteriofag s jednolančanom kružnom DNA. DNA X174 duga je 5386 pb. DNA lanac koji se pakira u virion naziva se «plus» lanac. DNA faga replicira se kao dvostruka zavojnica.
Prednosti
o Laka transfekcija bakterija putem F-pilusa.o Veličina viralne čestice ovisi o količini DNA – može se
pakirati 6x više DNA od količine u divljem tipu.o Jednolančana DNA pogodna je za sekvencioniranje.
- Plazmidi
o Plazmidi su ekstrakromosomalni DNA elementi koji kod bakterija nose gene s nekim dodatnim svojstvima.
o Najviše se koriste u molekularnoj biologiji. Postoje tzv. «high copy» i «low copy» plazmidi.
o pBR322jedan od najčešće korištenih E. coli vektora. Dužina mu je 4361 pb i sadrži:1) replikon rep zadužen za replikaciju plazmida2) gen rop služi za smanjivanje broja kopija3) gen bla kodira -laktamazu i omogučuje
rezistenciju na ampicilin4) gen tet kodira protein za rezistenciju na tetraciklin
o pBluescriptvrlo popularan vektor. Dužina mu je 2961 pb. Dizajniran je za kloniranje DNA, dideoksi DNA sekvencioniranje, in vitro mutagenezu, i in vitro transkripciju.Najvažnije svojstvo ovog vektora je postojanje lacZ gena, točnije njegovog 5'-kraja koji kodira za N-terminalni dio -galaktozidaze u kojeg je dodana tzv. «MCS» regija. MCS regija ne prekida okvir čitanja. Vektor se koristi s bakterijskim stanicama koje kodiraju C-terminalni dio -galaktozidaze. Svaki za sebe, niti N-terminalni, niti C-terminalni dio nisu aktivni, ali kada su zajedno mogu stvoriti aktivni enzim. Ovaj tip komplementacije naziva se -komplementacija. Lac bakterije koje nastaju -komplementacijom mogu se jednostavno raspoznati jer stvaraju plave kolonije u prisustvu kromogenog substrata 5-bromo-4-kloro-3-indolyl--D-galaktizida (X-gal). Međutim, insercija stranog DNA fragmenta u
MCS mjesto gotovo uvijek dovodi do stvaranja N-terminalnog dijela koji nije u stanju -komplementirati.Za ekspresiju s lacZ promotora potreban je induktor IPTG (isopropylthio--D-galaktozid).
o Umjetni kromosomi
BAC – bacterial artificial chromosome
Zasniva se na E. coli single-copy plazmidnom F faktoru. U njega je moguće kloniranje DNA fragmenata večih od 300 kbp. Revolucionirao je kloniranje čitavih genoma.
Klonirana DNA je stabilna i nakon 100 generacija uzastopnog rasta.
YAC – yeast artificial chromosome
Shuttle plazmidi koji se mogu replicirati i u E. coli i u kvascu. Plazmid sadrži gen za selekciju i MCS, origin of replication tipa ARS (autonomous replicating sequence), centromernu regiju i telomere. U njih se može uklonirati još više nego u BAC.
7. Metode unosa strane DNA
Biološke metode
- Transformacija
o Otkriče DNA kao osnove transformacije (pretvorbe) pneumokoka bilo je glavni doprinos u spoznaji nukleinskih kiselina kao osnovnog nasljednog materijala.
o Fred Griffith je ustanovio da se sojevi pneumokoka R i S razlikuju u obliku kolonija i virulenciji.
o MacLeod i Avery su dodali temperaturom ubijene S stanice živim R stanicama i ustanovio rast S kolonija. Te su S kolonije bile virulentne.
o DNA izolirana iz temperaturom ubijenih S stanica može također uzrokovati isti efekat.
o Pretvorba organizama jednog fenotipa u drugi inkubacijom s «neživim» materijalom naziva se transformacija.
- Transfekcija
o Eksperimenti s tobamovirusima su pokazali da i RNA može nositi nasljednu informaciju.
o Postoji nekolioko sojeva virusa mozaika duhana (TMV) koji uzrokuju točno određene simptome infekcije.
o Čestice TMV mogu se razdvojiti na RNA i proteinske komponente. RNA i proteini mogu se ponovo pomiješati i stvoriti infektivne virusne čestice. Moguće je stvoriti i miješane čestice, s RNA od jednog soja i proteinima od drugog soja. Simptomi infekcije odgovarati će onom soju iz koje je potekla RNA.
o Postupak unosa genetičke informacije u stanice uz pomoć uklapanja nukleinskih kiselina u virusne ili fagne omotaće naziva se transfekcija.
- T-DNA transformacija
o T-DNA Ti plazmida bakterije Agrobacterium tumefaciens može se koristiti za unos stranih gena u biljke.
o Čitav Ti plazmid je prevelik za laku manipulaciju in vitro.
o Geni za sintezu hormona i opina nisu neophodni za integraciju DNA u jezgru. Potrebni su samo vir geni koji se nalaze izvan T-DNA na Ti plazmidu.
o Binarni vektori – repliciraju se i u E. coli i u A. tumefaciens. Prvo se umnože u E. coli, a onda se transformiraju u A. tumefaciens soj koji sadrži pomočni plazmid s vir funkcijama.
o Rutinski se mogu transformirati dikotiledone, a tek je nedavno postalo moguće transformirati monokotiledone.
o Mjesta integracije T-DNA u genom su slučajna.
- Transpozoni___________________________________
- Prioni
o Ne prenosi se svaka nasljedna informacija uz pomoć DNA ili RNA.
o Mnoge spore neurobiološke bolesti (scrapie, bovine spongiform encephalopathy BSE, Creutzfeld-Jakobov sindrom) su međusobno srodna infektivna oboljenja.
o Infektivno svojstvo izolirano je iz mozgova zaraženih životinja i nazvano PRION. Prion se sastoji od jednog proteina, PrSc, od 26 kDa koji ne sadrži nukleinske kiseline. PrSC je identičan normalnom proteinu iz mozga PrP.
o Infekciju izaziva samo injiciranje PrSC u normalnog miša.
o Injiciranje PrSC u miša koji ne proizvodi PrP protein ne dovodi do oboljenja.
o «Genetička» informacija koja uzrokuje oboljenje prenosi se proteinom PrSC. PrSC mora prenjeti informaciju na PrP da bi se stvorilo više PrSC.
__________________________________
Fizičke metode
- Elektroporacija
o Osnovni princip je zatvaranje strujnog kruga.o Mogu se transformirati ljudske stanice, stanice
kvasca, protoplasti i bakterije.
- Mikroinjiciranje
o Stanica se pričvrsti laganim vakuumon, a finom se iglom u jezgru direktno ubrizga DNA.
- Mikroprecipitacija
o Standardna metoda za integraciju gena u jezgrinu DNA kultiviranih stanica sisavaca.
o DNA gena koji se unosi i DNA selekcijskog markera se otope u fosfatnom puferu.
o Otopina kalcijevog klorida se polako dodaje na DNA u otopini. Stvara se vrlo fini precipitat kalcijevog fosfata na kojem je absorbirana DNA.
o Otopina se kratko inkubira sa stanicama u kulturi. Započinje se sa selekcijom.
o Metoda se može koristiti za stvaranje transgeničnih organizama ako su ciljane stanice stem stanice.
- Biolistika
o Bombardiranje tkiva mikroprojektilima. Sitne čestice metala na kojima je precipitirana DNA.
o Perticle gun ili Gene gun
- Liposomi
o Liposomi su vezikuli lipidnih dvosloja koji nastaju hidratacijom lipida u vodenoj otopini. Ako je pri tom prisutna DNA onda ona postaje inkorporirana u liposome.
o Liposomi interagiraju sa stanicama bez stanične stijenke. Sadržaj liposoma se prenosi u stanicu uz pomoć mehanizama fuzije i endocitoze.
o Može se koristiti za transformaciju stanica kvasca i za biljne stanice, ako se od njih naprave sferoplasti ili protoplasti.
o Varijacija je fuzija stanica – nastaju somatski hibridi.
8. Sekvencioniranje DNA
- Metoda kemijskog cijepanja
o Razvijena od strane Allana Maxama i Waltera Gilberta.
o DNA je obilježena na jednoj strani lanca s 32P. Za obilježavanje na 5'-završetku koristi se polinukleotid kinaza. Označena DNA se zatim diferencijalno cijepa na mjestu svakog pojedinog nukleotida. Uvjeti su tako odabrani da dolazi do prosječno jednog cijepanja po lancu. Svaka reakcija odvija se u posebnoj tubi. Purini se oštečuju uz pomoć dimetilsulfata koji metilira guanin na N-7 i adenin na N-3. Glikozidna veza metiliranog purina lako se cijepa zagrijavanjem pri neutralnom pH, tako nastaje šečer bez baze. Onda se reze šečerna osnovica zagrijavanjem u alkalnim uvjetima. Pirimidini se cijepaju s hidrazinom, a šečerna osnovica s piperidinom. U reakcijskoj smjesi za svaki pojedini nukleotid svaki polomljeni lanac stvara radioaktivni fragment koji se nastavlja od 32P oznake do položaja određene baze u lancu. Tako nastaje smjesa lanaca različite duljine. Sekvenca:
5'-32P-GCTACGTA-3'stvorit će fragmente
rezano na A: 32P-GCT32P-GCTACGT
rezano na G: 32P-GCTACrezano na C: 32P-G
32P-GCTArezano na T: 32P-GC
32P-GCTACG
Fragmenti se onda razlučuju elektroforezom u PAA gelu.
- Metoda kontroliranog prekida replikacije (Sangerova dideoksi metoda)
o Metodu je razvio Frederick Sanger i suradnici.o DNA polimeraza I se koristi za kopiranje određenog
slijeda jednolančane DNA. Kao klica koristi se kratak oligonukleotid. Osim radioaktivno obilježena sva četiri deoksi-ribonukleozid trifosfata, smjesa sadrži i 2',3'-dideoxy analog jednog od njih. Ugradnja ovog analoga blokira daljnju sintezu novog lanca jer ne postoji 3'-hidroksilni završetak potreban za stvaranje sljedeće fosfodiesterske veze.Tako se stvaraju fragmenti različitih duljina. Njih se ponovo razlučuje u PAA gelu.
9. Konstrukcija DNA biblioteka (osnove)
- Biblioteka malih genoma
o Prokariotski ili genomi organela.o Neki restrikcijski enzimi cijepaju npr. kloroplastnu
DNA rijetko (PstI, SalI, SmaI), a neki često (BamHI, EcoRI, HindIII)
o Cilj je stvoriti banku DNA fragmenata koja će sadržavati potpuni genom
o Metoda «shot gun» kloniranja u plazmidne vektore. Može se koristiti i metoda direkcijskog kloniranja u fagne vektore.
o Važno je da se fragmenti preklapaju.
- Biblioteka velikih genoma
o Koriste se BAC ili YAC vektorio Najmanji potrebni broj neovisnih rekombinanata, npr.
u genomu od 2,8 x 106 kb. To ovisi o enzimu s kojim cijepamo DNA, ako koristimo enzim koji reže DNA na
fragmente od 4 kb onda moramo imati najmanje 2,8 x 106 : 4 = 700 000 neovisnih rekombinanata.
- cDNA biblioteke
o veličina inserta 0-7,2 kbpo većinom u vektorimao izolacija mRNA 3' poliadenilacija (oligo dT celuloza)o sinteza cDNA i reverzna transkripcijao ligiranje adaptor molekula i fosforiliranje T4
polnukleotid kinazom.
EcoRI BamHI KpnI NcoIHO- AA TTC GAG GAT CCG GGT ACC ATG G
G CTC CTA GGC CCA TGG TAC C -OH
o gt10 je insercijski vektor u kojeg se strana cDNA klonira u određenom smijeru. Koriste se mjesta NotI i SalI na poveznicama (linkerima). Oba enzima režu DNA sisavaca ili biljaka rijetko pa postoji mala vjerojatnost da će cDNA klon biti porezan.
o Pakiranje u glave bakteriofaga i transfekcija. Vektor sadrži na temperaturu osjetljiv represor s kojim je moguće kontrolirati replikaciju bakteriofaga.
o Selekcija rekombinanata hibridizacijom plaža (plaques). Titar faga i pfu.
o Frakcionirane cDNA bibliotekeo mRNA se frakcionira po veličini u gelu agaroze, eluira
i onda se iz nje sintetizira cDNA.
o Imobilizirane cDNA bibliotekeo mRNA imobilizirana na paramagnetske čestice. Može
se koristiti u kombinaciji s PCR tehnikom.
o Diferencijalne cDNA bibliotekeo mRNA se izolira iz organizma nakon izlaganja nekim
posebnim uvjetima (npr. temperaturni stres, svjetlosni stres...). Može se koristiti u kombinaciji s mikro i makro arrayima. (Što je to?)
10. Ekspresija stranih gena u E. coli
- Plazmidni vektori pET tipa
o Za ekspresiju kloniranih nizova potrebno je imati promotorski niz kojeg prepoznaje RNA polimeraza domaćina, te kao što je slučaj kod E. coli, odgovarajući Shine-Dalgarnov niz.
o Problemi kod ekspresije – rekombinantni protein može biti toksičan za stanicu, bakterija može brzo razgraditi novosintetizirani protein, može ga modificirati ili čak mutirati strani DNA fragment.
