78
Raport ştiinţific Contract 17PED/2017 Utilizarea eficientă a glicerolului brut de biodiesel în producţia de acid lactic BioFIT PN-III-P2-2.1-PED-2016-1237 - Etapa 2 - REZUMAT La finalul acestei etape este prezentat un raport care prezinta rezultate legate de optimizarea cantităților de substrat fermentescibil (glucoza, ca substrat model, respectiv glicerol crud), derularea proceselor de fermentație cu cele mai bune rezultate (obținute în etapa anterioară) în bioreactoare cu capacitate de 5L în vederea îmbunătățirii cantității de acid lactic, precum și caracterizarea procesului prin HPLC și FTIR, dar și evoluția enzimelor ADH și LDH pe perioada fermentațiilor. Totodată sunt prezentate caracteristicile morfologice a fungului Rhizopus oryzae pe perioada fermentaţiei. Modelarea matematica a rezultatelor împreună cu diseminarea rezultatelor sunt prezentate in cadrul acestui raport. Gradul de realizare al activităților este de 100%. Activitate 2.1 Derularea fermentatiilor in bioreactor de 5L 1. Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil În cadrul acestei activitati s-a urmărit optimizarea cantităților de substrat în vederea obțineri unei cantități mai mari de acid lactic. Astfel, s-a testat capacitatea lui R. oryzae de a metaboliza glicerolul, folosindu-se cantități cuprinse între 40 și 100 g/L. Cele mai bune rezultate (aflate in urma analizelor HPLC) au fost transpuse la scara de bioreactor, fermentațiile realizându-se cu ajutorului unui bioreactor de 5 L. 1.1 Obținerea inoculului În prezentul studiu, ca microorganism a fost folosit Rhizopus oryzae NRRL 395. Acestă tulpină a fost achiziționată de la ATCC. Într-o primă fază, fungul a fost activat prin pasare pe un mediu lichid (un bulion cu extract din cartofi- Potato Dextrose Broth- PDB) și incubare la 30 timp de 72 h. După această perioadă, pentru a putea fi păstrat, din mediul lichid a fost pasat prin tehnica de însămânțare prin inundare, pe un mediu solid (un agar cu extract din cartofi- Potato Dextrose Agar- PDA) și reincubat în aceleași condiții pentru dezvoltarea miceliilor și a sporilor.

Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

  • Upload
    others

  • View
    4

  • Download
    0

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Raport ştiinţific

Contract 17PED/2017

Utilizarea eficientă a glicerolului brut de biodiesel în producţia de acid lactic

BioFIT

PN-III-P2-2.1-PED-2016-1237

- Etapa 2 -

REZUMAT

La finalul acestei etape este prezentat un raport care prezinta rezultate legate de optimizarea

cantităților de substrat fermentescibil (glucoza, ca substrat model, respectiv glicerol crud), derularea

proceselor de fermentație cu cele mai bune rezultate (obținute în etapa anterioară) în bioreactoare cu

capacitate de 5L în vederea îmbunătățirii cantității de acid lactic, precum și caracterizarea procesului prin

HPLC și FTIR, dar și evoluția enzimelor ADH și LDH pe perioada fermentațiilor. Totodată sunt

prezentate caracteristicile morfologice a fungului Rhizopus oryzae pe perioada fermentaţiei. Modelarea

matematica a rezultatelor împreună cu diseminarea rezultatelor sunt prezentate in cadrul acestui raport.

Gradul de realizare al activităților este de 100%.

Activitate 2.1 Derularea fermentatiilor in bioreactor de 5L

1. Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

În cadrul acestei activitati s-a urmărit optimizarea cantităților de substrat în vederea obțineri unei

cantități mai mari de acid lactic. Astfel, s-a testat capacitatea lui R. oryzae de a metaboliza glicerolul,

folosindu-se cantități cuprinse între 40 și 100 g/L. Cele mai bune rezultate (aflate in urma analizelor

HPLC) au fost transpuse la scara de bioreactor, fermentațiile realizându-se cu ajutorului unui bioreactor

de 5 L.

1.1 Obținerea inoculului

În prezentul studiu, ca microorganism a fost folosit Rhizopus oryzae NRRL 395. Acestă tulpină

a fost achiziționată de la ATCC. Într-o primă fază, fungul a fost activat prin pasare pe un mediu lichid

(un bulion cu extract din cartofi- Potato Dextrose Broth- PDB) și incubare la 30 ℃ timp de 72 h. După

această perioadă, pentru a putea fi păstrat, din mediul lichid a fost pasat prin tehnica de însămânțare prin

inundare, pe un mediu solid (un agar cu extract din cartofi- Potato Dextrose Agar- PDA) și reincubat în

aceleași condiții pentru dezvoltarea miceliilor și a sporilor.

Page 2: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

1.1.1 Cultivarea lui Rhizopus oryzae și obținerea sporilor.

Pentru obținerea sporilor, microorganismul a fost cultivat pe mai multe plăci Petri conținând

mediu solid (PDA). După 72 de ore de incubare, sporii au fost recoltați în condiții sterile prin adăugare

de ser fiziologic steril (soluție NaCl 0,09%) și desprindere cu ajutorul unor sfere de sticlă sterile (figura

1.1.2.1).

Suspensia de spori a fost colectată într-un recipient steril pentru a asigura o omogenizare completă

(figura 1.1.2.2). Această suspensie a fost utilizată pentru formarea unui inocul de concentrație cunoscută.

Figura 1.1.2.1 Figura 1.1.2.2

Concentrația a fost stabilită prin măsurarea densității optice cu ajutorul unui nanodrop ND1000

(figura 1.1.2.3), utilizând metoda McFarland, optimizată.

Figura 1.1.2.3 Nanodrop ND 1000

În vederea verificării numărului de spori, măsurarea densității optice a fost dublată de numărarea

sporilor utilizând un microscop cu obiectiv 100x și un hemocitometru (figura 1.1.2.4)

Figura 1.1.2.4 Hemocitometru și vederea microscopică a gradațiilor

Page 3: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Pentru fermentațiile derulate, s-a stabilit o concentrație a sporilor în soluția de ser fiziologic steril

de 7,44x108 ufc mL-1, folosită mai departe ca inocul pentru pornirea fermentațiilor. Pentru a atinge

această concentrație s-a calculat matematic factorul de diluție pentru a stabili părțile exacte de ser

fiziologic și de suspensie ce trebuie amestecate.

La fermentațiile derulate s-a utilizat același inocul, omogen, divizat în 4 părți, astfel:

a. o parte a fost folosit direct, fermentații denumite în continuare SNN (fermentații cu spori

neimobilizați și neactivați)

b. al doilea volum a fost supus unui proces de activare (SNA- spori neimobilizați și activați), proces

descris la secțiunea 1.1.4

c. al treilea volum a fost imobilizat într-un amestec de PVA-alginat și transformat în sfere de

CryoPVAG’s (SIN – spori imibolizați și neactivați), proces descris la secțiunea 1.1.3

d. A patra parte a fost de-asemenea imobilizată în aceleași condiții, iar sferele de CryoPVAG’s au

fost supuse procesului de activare, la fel ca și în cazul sporilor liberi (SIA- spori imobilizați și

activați).

1.1.2 Imobilizarea sporilor și formarea sferelor de cryogel (CryoPVAG’s)

Pentru imobilizarea sporilor s-a utilizat o soluție de polivinil alcool (denumit în continuare PVA),

cu o concentrație de 8%, la care s-a adăugat 1% alginat față de volumul final de soluție (exemplu: la 40

mL de soluție de PVA se adaugă 0,4 g alginat de sodiu). Soluția astfel obținută s-a autoclavat la 121 ℃

timp de 30 de minute. Volumul necesar al soluției de PVA-alginat a fost stabilit în urma încercărilor de

laborator, încercări care au avut ca scop principal determinarea pierderilor în urma procesului de

imobilizare și formare a sferelor de CryoPVAG’s. Încercările anterioare au demonstrat că pierderile

variază între 30-35% față de numărul inițial de spori.

Sferele de PVA-alginat, au fost obținute parcurgând mai multe etape, descrise mai jos:

- O primă etapă a constat în amestecarea sporilor cu soluției de PVA-alginat, autoclavată și răcită

în prealabil, astfel: suspensia de spori obținută anterior (9x107 ufc mL-1 ) a fost adăugată în soluția

de PVA-alginat în raport de 10% față de aceasta, obținându-se o concentrație de 1,3x107 ufc mL-

1 în întreaga masă de soluție (figura 1.1.3.1).

Page 4: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Figura 1.1.3.1 Amestec soluție PVA-alginat cu spori de R.oryzae

- A doua etapă a constat în formarea sferelor de PVA-alginat, în interiorul cărora au fost imobilizați

sporii. Sferele au fost obținute cu ajutorul unui microîncapsulator (figura 1.1.3.2), prin picurarea

amestecului într-o soluție de clorură de calciu sterilă cu o concentrație de 0,5 M L-1. Sferele astfel

obținute au fost menținute în suspensie prin agitare continuă timp de 30 de minute pentru întărirea

alginatului și formarea structurii (figura 1.1.3.3)

Figura 1.1.3.2 Microîncapsulatorul utilizat Figura 1.1.3.3 Sferele de PVA obținute

- În cadrul celei de-a treia etape s-au separat sferele obșinute și s-au supus procesului de obținere a

sferelor de cryogel (CryoPVAG’s). Procesul a constat în supunerea sferelor la 3 etape consecutive

de îngheț (la -27 ℃)-dezgheț (temperatura camerei, 25℃). Modificările survenite în urma acestui

proces sunt ilustrate în figura 1.1.3.4, fiind vizibile datorită adaosului de albastru de metilen

(soluțe 1%) care pune în evidență formarea porilor.

Page 5: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Sferele de CryoPVAG’s au fost divizate astfel încât o parte să fie utilizate pentru inocularea

fermentațiilor SIN, iar cealaltă parte să treacă printr-un proces de activare și să fie folosite drept inocul

pentru fermentațiile SIA

Toate etapele mai sus menționate s-au realizat în condiții de sterilitate maximă pentru evitarea

eventualelor contaminări ce ar fi putut apărea datorită manipulărilor.

Sfere de PVA

Momentul 0

Sferă PVA momentul 0 Sfere după prima etapă de

congelare

Sfere după etapa 2 de congelare Sfere după etapa 3 de congelare

Figura 1.1.3.4 Evoluția sferelor pe durata procesului de obținere a CryoPVAG’s

Sferele de CryoPVAG’s au fost divizate astfel încât o parte să fie utilizate pentru inocularea

fermentațiilor SIN, iar cealaltă parte să treacă printr-un proces de activare și să fie folosite drept inocul

pentru fermentațiile SIA

Toate etapele mai sus menționate s-au realizat în condiții de sterilitate maximă pentru evitarea

eventualelor contaminări ce ar fi putut apărea datorită manipulărilor.

1.1.3 Activarea sporilor si a sferelor de CryoPVAG’s

În vederea îmbunătățirii randamentului de producție și reducerii timpului de lag (timpul în care

microorganismul trece din starea de spori în stare vegetativă și se obișnuiește cu noul mediu) din faza de

Page 6: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

dezvoltare a microorganismelor, atât sporii cât si sferele de CryoPVAG’s au fost supuse unui proces de

activare (în cazul fermentațiilor SNA și SIA). Mediul utilizat (format din: 50 g L-1 glucoză și 5 g L-1 yeast

extract) a fost autoclavat la 121 ℃ timp de 15 minute și răcit la temperatura camerei. Atât sferele de

CryoPVAG’s cât și volumul de suspensie de spori (identic cu cel utilizat la secțiunea 1.1.1 litera a) au

fost supuse procesului de activare la 34 ℃ timp de 48 h, timp în care microorganismul a trecut din stare

de spori în stare vegetativă (figura 1.1.4.1)

Figura 1.1.4.1 Activarea sferelor de CryoPVAG’s (imaginea din partea stângă) și a sporilor

(imaginea din partea dreaptă)

1.1.4 Separarea sporilor și a sferelor de CryoPVAG’s activate

Separarea celulelor vegetative libere și a sferelor de CryoPVAG’s s-a făcut prin centrifugare la

2500 rpm timp de 10 minute, la 25 ℃. Peletul obținut în ambele cazuri a fost spălat cu o soluție de ser

fiziologic steril pentru îndepărtarea excesului de mediu de activare. După recentrifugare, peletele

obținute în ambele cazuri au fost transferate în condiții sterile în flask-uri care conțineau mediile de

fermentație.

1.2 Fermentațiile propriu-zise – faza de flask

Toate cele 4 tipuri de fermentații (SNN, SNA, SIN și SIA) au fost derulate pe 2 medii diferite (un

mediu martor, la care a fost utilizată ca și sursă de carbon glucoza și un mediu la care glicerolul brut a

constituit sursa de carbon a microorganismului). Mediul martor a fost alcătuit din: 0,092 g L-1CaCl2 x

2H2O, 4 g L-1 MgSO4 x 7H2O, 6 g L-1 KH2PO4, 16 g L-1 (NH4)2SO4 și glucoză (50, 60, 70, 80, 90 și 100)

g L-1, iar mediul cu glicerol brut a fost format din 0,092 g L-1CaCl2 x 2H2O, 4 g L-1 MgSO4 x 7H2O, 6 g

L-1 KH2PO4, 16 g L-1 (NH4)2SO4 și glicerol brut (40, 50, 60, 70, 80, 90 și 100 g L-1). pH-ul mediului în

ambele cazuri a fost ajustat la 6, folosind o soluție de hidroxid de sodiu 20%. Mediile au fost autoclavate

la 121℃ timp de 15 minute.

Page 7: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

După inoculare, toate cele 4 tipuri de fermentații au fost incubate la 30 ℃ timp de 168 de ore,

fiind menținute într-o continuă agitare la 200 rpm cu ajutorul unui shaker orbital (figura 1.1.6.1 ).

Figura 1.1.6.1 Fermentațiile derulate în flask

Pentru monitorizarea acumulării acidului lactic,a epuizării substratului fermentescibil dar și

pentru activitatea enzimatică (ADH și LDH) s-au recoltat probe odată la 24 ore, începând cu momentul

0 (imediat după inoculare).

Petru a imbunătății producția de acid lactic, mediilor de fermentație li s-a adăugat un inhibitor

(2,2,2 trifluoroetanol), substanță care acționează ca un blocator enzimatic a căii de producere a alcolului

etilic, în favoarea acidului lactic. Astfel, toate variantele experimentale descrise mai sus au fost reluate,

iar în mediu s-a adăugat inhibitorul într-o concentrație de 1 mM în volumul final de mediu (cantitatea a

fost stabilită în urma unor incercări prealabile). Primele fermentații desfășurate fără inhibitor au fost

considerate martor pentru fermentațiile cu inhibior.

Activitate 2.2. Caracterizarea procesului HPLC si FTIR

1.3 Determinarea acidului lactic și a gradului de epuizare a substratului (glucoză)

Epuizarea glucozei din mediul de fermentatie pe perioada procesului a fost determinată cu

ajutorul unui kit enzimatic, printr-o metodă spectrofotometrică. Această metodă are la baza reacția dintre

glucoza și ATP, cu formarea unui compus intermediar, care va reacționa cu NADP+ cu formarea unui

compus care absoarbe la o lungime de undă de 334 nm. Astfel, absorbanța obținută a fost introdusă într-

Page 8: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

o formulă de calcul, cu ajutorul căreia s-a determinat concentrația de glucoză. Pentru verificarea

corectitudinii rezultatelor, s-a folosit o soluție stoc de glucoza (prezentă în kit).

Pentru identificarea și cuantificarea acidului lactic rezultat în urma procesului de fermentaţie s-a

utilizat metoda HPLC dezvoltată pe sistemul HPLC Agilent seria 1200, dotat cu degazor pentru solvenţi,

pompe quaternare, detector DAD cuplat cu detector de masă, termostat pentru coloană și injector

automat, Agilent Tehnologies, USA.

Separarea acidului lactic s-a realizat pe coloana cromatografică cu faza inversă Acclaim OA 5

µm, 4x150 mm Dionex care a fost eluată timp de 10 min, cu o soluţie de fosfat monosodic (NaH2PO4)

de concentraţie 50mM și pH=2.8, la un debit de 0.5 ml/min și temperatura T=200C. Cromatogramele s-

au înregistrat la lungimea de unda λ=210 nm.

Pentru exeplificarea evoluției acumulării acidului lactic, cromatogranele aferente probelor

recoltate în zilele 1, 3, 5 și 7 sunt prezentate în figura 1.3.2, 1.3.3 și 1.3.4

Identificarea acidului lactic din probele recoltate s-a efectuat prin compararea timpului de retenţie

al standardului de acid lactic de la firma Fluka, Germania (Figura 1.3.1) cu timpul de retenţie al peak-

ului generat .

0 2 4 6 80

500

1000

1500

2000

2500

3000

Abso

rban

ta (m

AU)

Timp de retentie(min)

L-La

ctic

aci

d

Fig. 1.3.1 Cromatograma standardului de acid lactic; tR = 3.15 min

Page 9: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

0 1 2 3 4 5 60

500

1000

1500

2000

2500

3000

Abso

rban

ce (m

AU)

Retention time (min)

L-La

ctic

aci

d

Ziua 1

0 1 2 3 4 5 60

500

1000

1500

2000

2500

3000

Abso

rban

ce (m

AU)

Retention time (min)

L-La

ctic

aci

d

Ziua 3

0 1 2 3 4 5 60

500

1000

1500

2000

2500

3000

Abso

rban

ce (m

AU)

Retention time (min)

L-La

ctic

aci

d

Ziua 5

0 1 2 3 4 5 6

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

Abso

rban

ce (m

AU)

Retention time (min)

L-La

ctic

aci

d

Ziua 7

Fig. 1.3.2 Cromatogramele probelor de fermentaţie cu spori R. oryzae neimobilizaţi, neactivaţi în

mediu cu glucoza G14 (glucoza concentratie 80g/L)

0 1 2 3 4 5 60

200

400

600

800

1000

Abso

rban

ce (m

AU)

Retention time (min)

L-La

ctic

aci

d

Ziua 1

0 1 2 3 4 5 6

0

200

400

600

800

1000

Abso

rban

ce (m

AU)

Retention time (min))

L-La

ctic

aci

d

Ziua 3

Page 10: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

0 1 2 3 4 5 60

200

400

600

800

1000Ab

sorb

ance

(mAU

)

Retention time (min)

L-La

ctic

aci

d

Ziua 5

0 1 2 3 4 5 60

200

400

600

800

1000

Abso

rban

ce (m

AU)

Retention time (min)

L-La

ctic

aci

d

Ziua 7

Figura 1.3.3 Cromatogramele probelor de fermentaţie cu spori R. oryzae neimobilizaţi, neactivaţi în

mediu cu glicerol CG15 (glicerol concentratie 80g/L)

0 1 2 3 4 5 60

200

400

600

800

1000

Abso

rban

ce (m

AU)

Retention time (min)

L-La

ctic

aci

d

Ziua 1

0 1 2 3 4 5 60

200

400

600

800

1000Ab

sorb

ance

(min

)

Retention time (min)

L-La

ctic

aci

d

Ziua 3

0 1 2 3 4 5 60

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

Abso

rban

ce (m

AU)

Retention time

Ziua 5

L-La

ctic

aci

d

0 1 2 3 4 5 60

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

Abso

rban

ce (m

AU)

Retention time (min)

Ziua 7

L-La

ctic

aci

d

Figura1.3.4 Cromatogramele probelor de fermentaţie cu spori R. oryzae neimobilizaţi, neactivaţi în

mediu cu glicerol CG55 (glicerol concentratie 80g/L)

Page 11: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Cantitatea de acid lactic a fost calculată pentru zilele de fermentaţie 1, 3 ,5 și 7, în două medii de

cultură diferite (glucoză și glicerol), pentru variantele procesului de fermentaţie, utilizând curba de

calibrare prezentată în figura 1.3.5, cu ecuaţia y=1555.9x + 302.33, R2 = 0.9938 .

Figura 1.3.5 Reprezentarea grafică a curbei de calibrare

Codificarea probelor s-a făcut astfel:

G- substrat de glucoza

CG – substrat de glicerol

L- acid lactic

Prima cifră din cod înseamnă forma în care s-au utilizat sporii:

- 1 și 5 - spori neimobilizați și neactivați;

- 2 și 6 spori neimobilizați și activați;

- 3 și 7 spori imobilizați și neactivați;

- 4 și 8 spori imobilizați și activați;

5,6,7 și 8 reprezintă fermentațiile la care s-a adăugat 2,2,2 trifluoroetanol ca și inhibitor.

Calibration curve of L-Lactic acid

y = 1555.9x + 302.33R2 = 0.9938

0

2000

4000

6000

8000

10000

12000

14000

16000

18000

0 2 4 6 8 10 12

Concentration (g/L)

Are

a (m

AU

)

Page 12: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

A doua cifră din cod se referă la cantitatea de substrat utilizată (tabelul 1.3.1)

A doua cifră din

cod

Concentratia glucoză (g/L)

Concentratia glicerol crud (g/L)

1 50 40 2 60 50 3 70 60 4 80 70 5 90 80 6 100 90 7 - 100

Tabelul 1.3.1 Concentrația substratului utilizat

A treia cifră reprezintă momentul recoltării probei și variază între 0 (momentul 0, imediat după

inoculare) și 7 (ultima zi de fermentație, după 168 de derulare)

Pentru o mai bună comparație a gradului de epuizare a glucozei și a acumulării acidului lactic,

aceste rezultate au fost reprezentate grafic, fiind prezentate în cele ce urmează:

Figura 1.3.6 Reprezentarea grafică în cazul sporilor neimobilizați și neactivați

În figura 1.3.6 este prezentat graficul evoluției acumulării acidului lactic și a consumului de

substrat (glucoză) în cazul fermentațiilor derulate în flask, folosind ca inocul sporii lui R.oryzae sub

formă libera, neîncapsulați și neactivați. De asemenea, în cadrul acestor fermentații nu s-a folosit

Page 13: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

inhibitor. Se poate observa că, cantitatea de glucoză nu a influențat considerabil cantitatea de acid lactic

format, rezultatele fiind relativ apropiate. Cele mai bune rezultate (aproximativ 28 g L-1 acid lactic),

pentru acest set de fermentații, s-au obținut la o concentrație de 80 g L-1 glucoză.

Figura 1.3.7 Reprezentarea grafică în cazul sporilor neimobilizați și neactivați cu inhibitor

În cazul utilizării lui R. oryzae sub aceeași formă (spori neîncapsulați și neactivați), dar cu adaos

de inhibitor (2,2,2 trifluoroetanol), rezulatele se modifică puțin. Se poate observa (în reprezentarea

grafică din figura 1.3.7) că producția de acid lactic este mai mare după primele 24 de ore de fermentație,

decât în cazul fermentațiilor derulate în aceleași condiții, dar fără inhibitor. Prin adaosul de inhibitor s-a

observat că R.oryzae valorifică mai bine concentrații mai mari de glucoză, reușind să aibă un maxim de

producție la o concentrație de 100 g L-1. Totodată, consumul de substrat a fost îmbunătățit în cazul tuturor

concentrațiilor utilizate.

Pentru a reduce perioada de timp în care sporii germinează în forma vegetativă și încep producția

de acid lactic, aceștia au fost supuși unui proces de activare (vezi secțiunea 1.1.3 Activarea sporilor si a

sferelor de CryoPVAG’s). Deși procesul de activare nu a dus la cantități mult mai mari de acid lactic (la

finalul fermentației), s-a constatat că producția de acid lactic a avut loc mai repede în cadrul

fermentațiilor, făcând astfel posibila scurtarea procesului. Și în acest caz, cele mai bune rezultate s-au

obținut la o concentrație de 100 g L-1 glucoză, maximul de producție fiind atins după 96 de ore de

Page 14: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

fermentație. Aceste rezultate sunt prezentate în reprezentarea grafică din figura 1.3.8. De asemenea,

activarea sporilor a dus la un consum mai mare al substratului, raportat cu cel din cazul fermentațiilor

derulate cu spori neactivați și neimobilizați.

Figura 1.3.8 Reprezentarea grafică în cazul sporilor neimobilizați și activați

Dacă în cazul fermentațiilor derulate cu spori activați și neimobilizați, dar fără inhibitor,

rezultatele cele mai bune s-au înregistrat la o concentrație de 100 g L-1, la adăugarea inhibitorului cele

mai bune rezultate s-au obținut la o concentrație de 60 g L-1, după o perioadă de 120 de ore (figura 1.3.9).

Și în acest caz, adaosul de inhibitor a dus la o mai bună valorificare a substratului de carbon și la un start

mai rapid al producției de acid lactic, comparativ cu fermentațiile similare, dar fără inhibitor.

Pentru facilitarea recoltării mediului epuizat în cazul fermentațiilor continue și semicontinue,

sporii au fost supuși unui proces de imobilizare (vezi secțiunea 1.1.2 Imobilizarea sporilor și formarea

sferelor de cryogel (CryoPVAG’s)). Acești spori imobilizați au fost folosiți ca inocul pentru derularea

următoarelor procese. Într-o primă etapă sporii imobilizați au fost utilizați ca atare ( spori imobilizați și

neactivați), rezultatele fermentațiilor fiind prezentate în figura 1.3.10. Se poate observa că prin

imobilizare, producția de acid lactic a scăzut în cazul fermentațiilor discontinue. Cele mai bune rezultate

s-au obținut la o concentrație de 50 g L-1 glucoză, producția având o creștere rapidă în primele 72 de ore,

după care, cantitatea de acid lactic acumulată a fost tot mai mică.

Page 15: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Figura 1.3.9 Reprezentarea grafică în cazul sporilor neimobilizați și activați cu inhibitor

Figura 1.3.10 Reprezentarea grafică în cazul sporilor imobilizați și neactivați

Page 16: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

De data aceasta, prin adaosul de inhibitor (2,2,2 trifluoroetanol) nu s-a îmbunătățit considerabil

producția de acid lactic și nici consumul de glucoză (figura 1.3.11). Cele mi bune rezultate s-au obținut,

la fel ca în cazul fermentațiilor derulate cu spori imobilizați și neactivați, la o concentrație de 50 g L-1. În

urma analizelor, la finalul fermentației, din cele 50 de grame de glucoza, în mediu au mai rămas

disponibile doar 19 g.

Figura 1.3.11 Reprezentarea grafică în cazul sporilor imobilizați și neactivați cu inhibitor

Pentru a vedea dacă prin activarea sporilor imobilizați se poate îmbunătății producția de acid

lactic, sferele de CryoPVAG’s au fost supuse unui proces de activare timp de 48 de ore. Față de

fermentațiile derulate cu spori imobilizați și neactivați, după activarea sferelor, producția de acid lactic a

fost îmbunătățită, obținându-se rezultate apropiate în cazul utilizării a 90 și 100 g L-1 drept sursă de carbon

(figura 1.3.12). Și în acest caz, activarea a dus la acumularea mai rapidă a acidului lactic în primele 72

de ore ale procesului. Totodată a fost îmbunătățit și consumul de glucoză.

Adaosul de inhibitor în mediu la începutul fermentațiilor derulate cu spori imobilizați și activați

a dus la creșterea cantității de acid lactic, obținându-se aproximativ 20 g L-1 acid lactic, la o concentrație

a substratului de 100 g L-1 glucoză (figura 1.3.13). În acest caz, consumul de glucoză din mediu a fost

aproape similar ca și în cadrul fermentațiilor derulate cu spori imobilizați și activați, dar fără inhibitor.

Page 17: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Figura 1.3.12 Reprezentarea grafică în cazul sporilor imobilizați și activați

Figura 1.3.13 Reprezentarea grafică în cazul sporilor imobilizați și activați cu inhibitor

Page 18: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

În continuare sunt prezentate tabelar rezultatele obținute (cantitatea de acid lactic, exprimată în g

L-1) în urma fermentațiilor pe substrat de glicerol crud la diferite concentrații, utilizând aceleași forme

ale lui R.oryzae NRRL 395 ca și în cazul fermentațiilor pe glucoză (spori neimobilizați și neactivați, spori

neimobilizați și activați, spori imobilizați și neactivați, respectiv spori imobilizați și activați, cu sau fără

inhibitor).

Tabel 1.3.2 Cantitatea de acid lactic obţinută (g L-1) utilizând spori de R. oryzae (neimobilizați și

neactivați) în mediu fără inhibitor

Concentraţia de glicerol crud

Ziua 1 Ziua 3 Ziua 5 Ziua 7

40 g L-1 0.261 0.380 0.931 2.338

50 g L-1 0.447 1.065 2.656 5.427

60 g L-1 0.283 0.613 1.927 4.516

70 g L-1 0.345 0.708 2.398 5.968

80 g L-1 0.257 0.875 3.174 7.421

90 g L-1 0.323 0.648 1.744 2.706

100 g L-1 0.421 0.891 2.814 6.790

Tabel 1.3.3 Cantitatea de acid lactic obţinută (g L-1) utilizând spori de R. oryzae (neimobilizați și

neactivați) în mediu cu inhibitor

Concentraţia de glicerol crud

Ziua 1 Ziua 3 Ziua 5 Ziua 7

40 g L-1 0.378 0.689 1.946 4.714

50 g L-1 0.292 0.578 1.621 4.958

60 g L-1 0.432 3.306 7.682 7.368

70 g L-1 0.423 1.895 5.562 10.091

80 g L-1 0.503 3.613 10.697 15.559

90 g L-1 0.587 1.348 3.863 4.307

100 g L-1 0.482 3.543 10.671 18.088

Page 19: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Corelând datele prezentate în tabelele 1.3.2 și 1.3.3, putem observa că în cazul utilizării sporilor

de R.oryzae în formă neimobilizată și neactivată, prin adaosul de inhibitor s-a reușit creșterea cantității

de acid lactic, obținându-se o cantitate maximă de 7,4 g L-1 pentru mediile fără inhibitor și 18,08 g L-1

pentru mediile în care s-a adăugat inhibitor.

Tabel 1.3.4 Cantitatea de acid lactic obţinută (g L-1) utilizând spori de R. oryzae (neimobilizați și

activați) în mediu fără inhibitor

Concentraţia de glicerol crud

Ziua 1 Ziua 3 Ziua 5 Ziua 7

40 g L-1 1.177 1.956 2.598 2.934

50 g L-1 1.115 1.900 2.658 2.966

60 g L-1 1.036 1.811 2.610 2.750

70 g L-1 1.059 1.853 2.350 2.393

80 g L-1 1.225 1.974 2.830 3.372

90 g L-1 1.114 1.158 1.836 2.396

100 g L-1 1.134 1.890 2.699 3.162

Tabel 1.3.5 Cantitatea de acid lactic obţinută (g L-1) utilizând spori de R. oryzae (neimobilizați și

activați) în mediu cu inhibitor

Concentraţia de glicerol crud

Ziua 1 Ziua 3 Ziua 5 Ziua 7

40 g L-1 1.069 2.740 3.809 4.409

50 g L-1 1.065 2.342 2.754 3.242

60 g L-1 1.182 1.640 2.503 2.973

70 g L-1 1.138 1.349 1.794 2.179

80 g L-1 1.075 1.553 2.064 2.733

90 g L-1 1.073 1.600 2.265 2.823

100 g L-1 1.139 1.511 2.081 2.738

Dacă în cazul utilizării substratului de glucoză, după procesul de activare producția de acid lactic

a crescut, în cazul fermentațiilor la care s-a utilizat glicerolul crud ca sursă de carbon, rezultatele sunt

Page 20: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

mai mici (3,1 g L-1 pentru mediile fără inhibitor și 4.4 g L-1 pentru mediile cu inhibitor, tabelul 1.3.4 și

1.3.5). Acest fenomen este datorat, cel mai probabil, schimbării bruște a sursei de carbon, deoarece

creșterea lui R.oryzae pentru obținerea sporilor și activarea acestora se face pe medii cu glucoză, iar

fermentațiile pe medii care conțin doar glicerol. La această trecere este necesară o schimbare bruscă a

echipamentului enzimatic, care este dotat într-un anume fel pentru metabolizarea glucozei și în alt fel

pentru metabolizarea glicerolului.

Tabel 1.3.6 Cantitatea de acid lactic obţinută (g L-1) utilizând spori de R. oryzae (imobilizați și

neactivați) în mediu fără inhibitor

Concentraţia de glicerol crud

Ziua 1 Ziua 3 Ziua 5 Ziua 7

40 g L-1 0.348 0.790 1.965 1.896

50 g L-1 0.307 0.856 1.553 2.303

60 g L-1 0.333 0.728 1.893 1.889

70 g L-1 0.344 0.756 2.080 2.081

80 g L-1 0.317 0.829 1.916 1.909

90 g L-1 0.296 0.722 2.006 1.966

100 g L-1 0.365 1.252 2.006 2.370

Tabel 1.3.7 Cantitatea de acid lactic obţinută (g L-1) utilizând spori de R. oryzae (imobilizați și

neactivați) în mediu cu inhibitor

Concentraţia de glicerol crud

Ziua 1 Ziua 3 Ziua 5 Ziua 7

40 g L-1 0.410 0.685 1.128 1.409

50 g L-1 0.365 0.629 1.175 1.438

60 g L-1 0.140 0.637 1.147 1.127

70 g L-1 0.262 0.583 1.226 1.431

80 g L-1 0.330 0.741 1.319 1.594

90 g L-1 0.187 0.606 1.839 2.833

100 g L-1 0.347 0.838 1.887 2.180

Page 21: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Așa cum și în cazul fermentațiilor cu spori imobilizați și neactivați pe substrat de glucoză s-au

obținut cantități mai mici de acid lactic, și la fermentațiile pe substrat de glicerol se păstrează același

trend (tabelele 1.3.6 șu 1.3.7). Cantitatea cea mai mare de acid lactic (2.8 g L-1) a fost obținută utilizând

o concentrație de 90 g L-1 glicerol. Adaosul de inhibitor nu a produs o creștere foarte mare a cantității de

acid lactic, așa cum ar fi fost de așteptat.

Tabel 1.3.8 Cantitatea de acid lactic obţinută (g L-1) utilizând spori de R. oryzae (imobilizați și

activați) în mediu fără inhibitor

Concentraţia de glicerol crud

Ziua 1 Ziua 3 Ziua 5 Ziua 7

40 g L-1 1.360 2.417 2.909 3.419

50 g L-1 1.615 2.601 3.283 3.636

60 g L-1 0.911 2.020 3.162 3.523

70 g L-1 0.715 1.743 2.409 2.844

80 g L-1 1.698 3.032 3.647 3.794

90 g L-1 1.447 2.274 3.353 3.761

100 g L-1 1.655 2.938 3.512 4.197

Tabel 1.3.9 Cantitatea de acid lactic obţinută (g L-1) utilizând spori de R. oryzae (neimobilizați și

activați) în mediu fără inhibitor

Concentraţia de glicerol crud

Ziua 1 Ziua 3 Ziua 5 Ziua 7

40 g L-1 0.711 1.144 1.691 1.722

50 g L-1 0.699 1.207 1.869 2.258

60 g L-1 0.723 1.493 1.731 2.244

70 g L-1 0.670 1.101 1.734 1.872

80 g L-1 0.686 0.990 2.193 2.371

90 g L-1 0.673 1.087 1.696 2.242

100 g L-1 0.642 1.082 1.760 2.341

Page 22: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

În ceea ce privește sporii imobilizați și activați, procesul de activare a dus la obținerea unei

cantități aproape duble de acid lactic pe mediile fără inhibitor (tabelul 1.3.8), față de fermentațiile la care

s-au utilizat spori imobilizați și neactivați. Și în acest caz, adaosul de inhibitor a dus la scăderea producției

de acid lactic în cazul fermentațiilor cu spori imobilizați și activați (tabelul 1.3.9).

În urma acestor încercări, primele concluzii sunt:

- Consumul de glucoză nu a fost complet, deoarece cantitatea de acid lactic acumulată în mediu a

dus la scăderea pH-ului, creând condiții improprii pentru R. oryzae. Chiar dacă literatura de

specialitate îl încadrează în categoria microorganismelor rezistente la mediu acid, acesta având un

optim de pH de 6, nu este capabil să deruleze procese fermentative la un pH de aproximativ 3 (a se

vedea tabelul 1.4.1 din cadrul secțiunii 1.4 Monitorizarea pH-ului)

- Raportându-ne la aceeași unitate de timp (aceeași durată a procesului de fermentație), sporii

imobilizați reușesc să producă mai puțin acid lactic, deoarece germinarea acestora și transformarea în

formă vegetativă este puțin îngreunată. Sporii încapsulați ajung la sursa de hrană doar datorită

porozității materialului în care sunt imobilizați, transferul de nutrienți făcându-se inițial doar prin

difuzie, proces care se încheie în momentul în care formele vegetative reușesc să penetreze sfera și să

ajungă în contact direct cu mediul de fermentație.

- Activarea poate deveni un proces cheie în creșterea randamentului de acid lactic, deoarece reduce

durata de fermentație și mărește capacitatea lui R. oryzae de a sintetiza acidul lactic, raportându-ne la

aceeași unitate de timp (primele 72 h)

- Rezultatele mai slabe pe mediile cu glicerol crud pot fi datorate, pe deoparte impurităților

(metanol, săruri, săpunuri) conținute de glicerol crud, impurități care inhibă dezvoltarea lui R.oryzae,

iar pe de altă parte, trecerii bruște de pe medii cu glucoza (mediu de creștere, mediu de activare) pe

mediile cu glicerol. Cercetări viitoare vor avea în vedere adăugarea unei cantități mici de glucoză în

mediile cu glicerol pentru favorizarea trecerii și asigurarea unei cantități minime de hrană până în

momentul în care microorganismul își restructurează echipamentul enzimatic. De asemenea un motiv

pentru care în mediile cu glicerol la care s-a adăugat și inhibitorul ar putea fi constituit de faptul că,

prin blocarea unei căi metabolice, întreg metabolismul este dat peste cap (vezi figura 1.3.14).Toți

acești factori au influențat într-o oarecare măsură producția de acid lactic pe mediile cu glicerol.

Page 23: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Figura 1.3.14 Comparație între 2 fermentații pe substrat de glicerol (70 g L -1), cu inhibitor (stânga,

flask erlenmeyer) și fără inhibitor (dreapta, flask tip sticlă)

1.4 Monitorizarea pH-ului

pH-ul este unul dintre cei mai importanți factori de mediu care interferează în creșterea și secreția

compușilor de interes de către microorganisme. În cadrul fermentațiilor derulate în flask, unde pH-ul nu

poate fi controlat, prin producția de compuși secundari, acesta se modifică (crește sau scade, în funcție

de natura chimică a acestor compuși), creând astfel condiții improprii pentru dezvoltare și producție. În

cazul nostru, prin acumularea acidului lactic (compusul de interes) în mediu, pH-ul scade și astfel se

creează condiții nefavorabile pentru R.oryzae. Cu un optim de pH la valoarea de 6 (valoare care a fost

ajustată la începutul fermentațiilor cu ajutorul unei soluții de NaOH 10%), acesta își reduce activitatea

dacă pH -ul scade mult sub limita lui optimă. Astfel, prin măsurarea pH-ului la finalul fermentațiilor

(rezultate prezentate în tabelul 1.4.1) s-a constatat că, valoarea acestuia a ajuns sub pragul de 3 la multe

dintre fermentații.

Deoarece productivitatea a fost mai scăzută în cazul mediilor cu glicerol (posibilele cauze au fost

explicate mai sus) și pH-ul a înregistrat valori mai mari, cea mai mică valoare fiind înregistrată în cazul

fermentației derulate cu spori neimobilizați și ne activați, pe un mediu cu 100 g L-1 glicerol și cu adaos

de inhibitor.

Page 24: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Tabelul 1.4.1 Valorile pH-ului la finalul fermentațiilor

Activitate 2.2. Caracterizarea procesului HPLC si FTIR

1.5 Înregistrarea spectrelor FTIR

1.5.1 Dozarea acidului lactic

Înregistrarea spectrelor de absorbţie în infraroșu s-a făcut direct prin utilizarea

spectrofotometrului Shimadzu IR Prestige -21 cu accesoriu HATR (Horizontal Attenuated Total

Reflectance). Spectrele au fost înregistrate pe domeniul de lungimi de unda 650-4000 cm -1 și au fost

Cod proba

pH final Cod probă

pH final Cod probă

pH final Cod probă

pH final

G 1.1 2.66 G 5.1 2.78 CG 1.1 5.52 CG 5.1 4.64 G 1.2 2.68 G 5.2 2.74 CG 1.2 4.77 CG 5.2 4.64 G 1.3 2.63 G 5.3 2.71 CG 1.3 5.04 CG 5.3 4.59 G 1.4 2.64 G 5.4 2.7 CG 1.4 4.98 CG 5.4 5.02 G 1.5 2.64 G 5.5 2.72 CG 1.5 4.94 CG 5.5 4.7 G 1.6 2.59 G 5.6 2.73 CG 1.6 4.07 CG 5.6 4.92 G 2.1 3.02 G 6.1 2.83 CG 1.7 5.25 CG 5.7 2.95 G 2.2 2.7 G 6.2 2.77 CG 2.1 4.9 CG 6.1 4.81 G 2.3 2.92 G 6.3 2.88 CG 2.2 5.03 CG 6.2 4.94 G 2.4 2.95 G 6.4 2.91 CG 2.3 5.21 CG 6.3 4.87 G 2.5 2.81 G 6.5 2.84 CG 2.4 5.17 CG 6.4 4.23 G 2.6 2.94 G 6.6 2.82 CG 2.5 5.02 CG 6.5 4.9 G 3.1 2.87 G 7.1 2.77 CG 2.6 4.95 CG 6.6 4.84 G 3.2 2.23 G 7.2 2.8 CG 2.7 5.06 CG 6.7 4.77 G 3.3 2.9 G 7.3 2.84 CG 3.1 4.88 CG 7.1 4.8 G 3.4 2.84 G 7.4 2.83 CG 3.2 4.96 CG 7.2 4.84 G 3.5 2.88 G 7.5 2.85 CG 3.3 4.92 CG 7.3 4.83 G 3.6 2.86 G 7.6 2.72 CG 3.4 5.02 CG 7.4 4.85 G 4.1 2.82 G 8.1 2.79 CG 3.5 5.04 CG 7.5 4.72 G 4.2 2.81 G 8.2 2.78 CG 3.6 5.01 CG 7.6 4.79 G 4.3 2.77 G 8.3 2.77 CG 3.7 4.92 CG 7.7 4.78 G 4.4 2.82 G 8.4 2.76 CG 4.1 4.72 CG 8.1 4.77 G 4.5 2.8 G 8.5 2.81 CG 4.2 4.79 CG 8.2 4.76 G 4.6 2.85 G 8.6 2.82 CG 4.3 4.78 CG 8.3 4.88

CG 4.4 4.77 CG 8.4 4.91 CG 4.5 4.76 CG 8.5 4.84 CG 4.6 4.81 CG 8.6 4.82 CG 4.7 4.96 CG 8.7 4.89

Page 25: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

identificate benzile de absorbție caracteristice tipului de legături și grupărilor funcționale (exprimate în

cm-1).

Probele analizate au fost aplicate direct pe accesoriu orizontal de diamant de tip ATR (Attenuated

Total reflectance) cu o singura reflexie de la PIKE, dupa care s-au inregistrat spectrele de absorbție in

infraroșu prin utilizarea spectrofotometrului Shimadzu IR Prestige -21 fata de apa ca background.

Spectrele au fost înregistrate pe domeniul de lungimi de unda 600-4000 cm -1, la o rezoluție de 4

cm-1, și 64 scanări pentru un spectru.

Cristalul ATR a fost curățat cu apă pentru îndepărtarea reziduurilor dintre măsurători

1800 1600 1400 1200 10000.00

0.02

0.04

Abso

rban

ce (a

.u.)

Wavenumber (cm-1)

ziua 0 ziua 7

1033

1633

1800 1600 1400 1200 10000.0

0.1

1109 1043

Abso

rban

ce (a

.u.)

Wavenumber (cm-1)

ziua 0 ziua 7)

1633

993

Figura 1.5.1.1 Spectrele FTIR suprapuse pentru

probele în mediu cu glucoză pe domeniul

900- 1800 cm-1

Figura 1.5.1.2 Spectrele FTIR suprapuse pentru

probele în mediu cu glicerol pe domeniul

900- 1800 cm-1

1.5.2 Dozarea glicerolului

Pentru dozarea consumului de glicerol din mediile de fermentație s-a încercat optimizarea unei

metode ne invazive (FTIR), care poate oferii informații clare într-un timp foarte scurt.

Înregistrarea spectrelor de absorbție în infraroșu s-a făcut prin utilizarea spectrofotometrului

Shimadzu IR Prestige -21 cu accesoriu HATR (Horizontal Attenuated Total Reflectance) . Spectrele au

fost înregistrate pe domeniul de lungimi de unda 650-4000 cm -1 si s-au identificat benzile de absorbție

caracteristice tipului de legături și grupărilor funcționale (exprimate in cm-1).

Page 26: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Probele analizate au fost aplicate direct pe accesoriu orizontal de diamant de tip ATR (Attenuated

Total reflectance) cu o singura reflexie de la PIKE, după care s-au înregistrat spectrele de absorbție in

infraroșu prin utilizarea spectrofotometrului Shimadzu IR Prestige -21 fata de apa ca background.

Spectrele au fost înregistrate pe domeniul de lungimi de unda 600-4000 cm-1, la o rezoluție de 16

cm-1, și 64 scanări pentru un spectru.

Cristalul ATR a fost curățat cu apa pentru îndepărtarea reziduurilor dintre măsurători.

3000 2500 2000 1500 10000,0

0,1

0,2

0,3

0,4

2931

2877

1651

1411

1334

1211

1103

1033

918

848

Abso

rbanc

e (a.u

.)

Wavenumber (cm-1)

Figura 1.5.2.1 Spectrul FT-IR al glicerolului (standard) pe domeniul 700-3300 cm-1

Probele colectate zilnic au fost centrifugate , 10 uL de proba au fost aplicați pe ATR , evaporați

pentru îndepărtarea apei și înregistrat spectrul FTIR pentru fiecare. Glicerina utilizata a fost de puritate

99 %, spectrul FTIR fiind prezentat in figura 1.5.2.1.

Vârfurile majore ale vibrațiilor din spectrul FT-IR al glicerinei sunt: atribuite întinderii OH (~

3300 cm-1), întinderea CH (~ 2900 cm-1), îndoirea CH (1500-1200 cm-1) si C-O de întindere (1200-900

cm-1).

În spectrele FT-IR ale probelor , glicerina contribuie la vârfurile distincte observate de-a lungul

domeniului analizat. Spectrele probelor sunt dominate de pik-uri datorate apei si glicerinei. Banda la

3300 cm-1 se datorează modurilor de întindere din OH-ul apei si a glicerinei, prin evaporare banda de

la 1650 cm-1 care de asemenea se datorează in principal vibrației de îndoire a OH-ului din apa este

Page 27: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

atenuata prin evaporare.

Semnalele de la 2931 si 2877 cm-1 se datorează modurilor vibrațiunile de întindere CH ale

glicerinei, în timp ce vârfurile dintre 1500-1200 cm-1 se datorează modurilor de îndoire CH, la 1200-900

cm-1 C-O de întindere glicerina. Picurile de glicerină din probe au fost confirmate prin rularea spectrului

de glicerină pura care este prezentat în figura 1.5.2.1.

Atribuirea spectrelor FT-IR ale probelor si glicerinei sunt prezentate în tabelul 1.5.2.1, pozițiile

pik-urilor sunt indicate in cm-1.

Probe Glicerina Atribuiri vibrații

3305 3230 OH întindere

2931 2931 CH2 întindere antisym

2877 2877 CH2 întindere sym

1651 - OH îndoire

1420 1411 CH2 îndoire

1314 1326 CH2 excitație

1210 1210 CCC, COC întindere

1090 1101 C–O întindere

1033 1033 C–O întindere

- 995 COH întindere

925 918 COH întindere

856 848 –OC2H4

Tabelul 1.5.2.1 Atribuirea spectrelor FT-IR ale probelor si glicerinei pure

Spectrele în infraroșu ale probelor cu sporii imobilizați si activați in mediu de glicerol (ziua 0 si

ziua 7) si cel al glicerinei sunt prezentate in figura 1.5.2.2. Concentrația de glicerol este de 10%.

Page 28: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

3500 3000 2500 2000 1500 10000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

918-9

2584

8-856

995

1033

1101

1090

1420

1411

1651

2931 2877

3305

Abso

rbanc

e (a.u

.)

wavenumber (cm-1)

Glicerina PG _ziua_0 PG _ziua_8

3230

Figura 1.5.2.2 Spectrele FT-IR suprapuse pentru glicerina si probele in mediu cu glicerol ziua 0 si 7

pe domeniul 700-3300 cm-1

1500 10000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

995

1651

1420Abso

rbanc

e (a.u

.)

Wavenumber (cm-1)

PG4_1_0 PG4_1_8

1090

Figura 1.5.2.3 .Spectrele suprapuse ale probelor cu sporii imobilizați si activați in mediu de glicerol cu

concentrația 4% (ziua 0 si ziua 7)

Page 29: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

1600 1400 1200 1000 800

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

995

1090

1420

1651

Abso

rban

ce (a

.u.)

Wavenumber(cm-1)

PG4_7_0PG4_7_8

Fig.1.5.2.4 .Spectrele suprapuse ale probelor cu sporii imobilizați si activați in mediu de glicerol cu

concentrația 10% (ziua 0 si ziua 7)

Observarea cu atenție a spectrelor din figurile 1.5.2.2, 1.5.2.3 și 1.5.2.4 a relevat absorbții la 995

cm-1 în spectrul glicerinei si al probei in ziua 0 si o atenuare a pik-ului pe măsura ce concentrația în

glicerol scade, odată cu consumarea acestuia (ziua a 7-a). Vârful de la 995 cm-1 scade liniar pe măsura

ce concentrația in glicerol scade . De asemenea pik-ul de la 1101 cm-1 prezent in glicerina se deplasează

in probe la 1090 cm-1 si se aplatizează pe măsura ce se consuma glicerolul. La probele cu concentrația

4% este vizibil un ușor umăr al pik-ului , neputând fi marcat.

Un alt indiciu pentru scăderea concentrației in glicerol este creșterea intensității de absorbție de

la 1651 cm-1 ,care lipsește în glicerina.

Conc.glicerol % Ziua

995 cm-1

1092 cm-1

1420 cm-1

1651 cm-1

4 0 0,3296 - 0,036678 0,011310

4 8 0,2991 - 0,027513 0,040369

10 0 0,2520 0,2745 0,119948 0,021489

10 8 0,2221 0,2510 0,113629 0,032529

Page 30: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Deoarece mediul analizat este unul apos, absorbția legăturii -OH din apa , la 1651 cm-1 este foarte

puternica. Astfel probele au fost evaporate pentru o mai bună identificare. După evaporare pe măsura ce

concentrația în glicerol scade ,intensitatea pik-uli creste. De la ziua 0 la ziua 7 se observă o ușoară creștere

a intensității la 1651 cm-1 ceea ce indica consumarea glicerolului.

3500 3000 2500 2000 1500 1000

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

1090

3300

2931

2877

1651

1420

1033

925

Abso

rban

ce (a

.u.)

Wavenumber (cm-1)

PG4_1_0 PG4_7_0

856

995

Figura 1.5.2.5 Spectrele suprapuse ale probelor cu sporii imobilizați si activați in mediu de glicerol cu

concentrația 4% si 10% , ziua 0

3500 3000 2500 2000 1500 10000.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

3300

2931

2877

1651

1420

1100

1033

925

856Ab

sorba

nce (

a.u.)

Wavenumber (cm-1)

PG4_1_8 PG4_7_8

995

Figura 1.5.2.6 Spectrele suprapuse ale probelor cu sporii imobilizați si activați in mediu de glicerol cu

concentrația 4% si 10% , ziua 7)

Page 31: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Ca și concluzie , pe măsura ce concentrația de glicerol scade, valoarea intensității la 1651 cm-1

crește și scade valoarea intensității la 1420 cm-1.

Spectroscopia FTIR a fost utila in analizarea structurii glicerolului si a transformării produsului

în timpul fermentației fungide. Spectrele in infraroșu ale glicerolului crud si ale probelor de la sfârșitul

procesului procesului de fermentare din încercarea cu glicerol crud 40 g L-1 si 100 g L-1, au fost arătate

în figurile 1.5.2.2, 1.5.2.3, 1.5.2.4, respectiv 1.5.2.5.

Deși tehnica FTIR nu este la fel de sensibila ca alte tehnici analitice, cum ar fi spectrometria de

masa, cromatografia lichidă de înaltă presiune ,are avantajul de a fi rapida si potrivita pentru screening-

ul inițial al probelor.

În cazul nostru deoarece diferențele pe parcursul celor 7 zile de fermentații nu au fost mari,

acestea nu au putut fi observate bine , exceptând prima si ultima zi de fermentație când a fost vizibila o

ușoara modificare care nu a putut fi cuantificată.

La o concentrație a glicerinei ,mai mica de 10 % semnalul nu mai scade liniar cu concentrația

ceea ce împiedica cuantificarea dinamicii consumului de glicerol. Mediul apos este în continuare

principala problema în analizarea anumitor parametrii, iar prin evaporarea apei din probe probabilitatea

pierderii cantitative este foarte mare. Cu toate acestea evaluarea rapida a glicerolului este posibilă și utila.

2.1 Derularea fermentațiilor propriu-zise bioreactoare cu capacitate de 5 L

După optimizarea cantităților de substrat, etapă realizată la scară de flask si descrisă anterior, cele

mai bune rezultate din cadrul fiecărui grup de fermentații au fost transpuse la nivel de bioreactor. Pentru

aceasta s-a utilizat un bioreactor dotat cu un vas cu o capacitate de 5 L (figura 2.1.1). Încercările au fost

făcute pe un volum de 3 L de mediu.

Cultivarea în bioreactor oferă avantajul monitorizării constante și menținerii pH-ului la un nivel

prestabilit și optim pentru R.oryzae. Astfel au fost utilizate aceleași forme ale lui Rhyzopus ( spori

neimobilizați și neactivați, spori neimobilizați și activați, spori imobilizați și neactivați, respectiv spori

imobilizați și activați, cu sau fără inhibitor), însă pentru fiecare s-a ales cantitatea optimă de substrat

(glicerol sau glucoză) care a dat cele mai bune rezultate, rezultând 16 fermentații: 8 pe substrat de glucoză

și 8 pe substrat de glicerol.

Pregătirea mediului de fermentație și obținerea inoculului s-a realizat conform descrierii de la

secțiunea 1.1, respectiv 1.2. Procesul fermentativ a fost derulat tot pe durata a 168 ore (7 zile), la o

Page 32: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

temperatură de 30 °C și o viteză de rotație a axului la 200 rpm. Pe durata procesului au fost recoltate

probe pentru monitorizarea cantității de acid lactic, activității enzimelor ADH și LDH, cât și pentru

determinarea gradului de epuizare a substratului.

Figura 2.1.1 Proces derulat la scară de bioreactor (volum maxim 5 L, volum utilizat 3 L)

2.2 Analiza acidului lactic- HPLC

Evoluția acumulării acidului lactic a fost urmărită și în cazul fermentațiilor derulate în bioreactor.

Astfel, probele recoltate (odată la 24 ore) au fost supuse unor analize HPLC (metodă descrisă la secțiunea

1.3).

Așa cum ne așteptam, prin controlarea pH-ului și menținerea acestuia la un nivel constant, s-a

reușit îmbunătățirea cantității de acid lactic. Astfel, cele mai bune rezultate s-au obținut prin utilizarea

sporilor de R.oryzae sub formă neimobilizată și activată. Rezultatele sunt prezentate în figura 2.2.1.

Acestea reprezintă rezultatele în urma derulării fermentațiilor pe mediile cu glucoză ca sursă de

carbon cu și fără inhibitor. Maximul de producție a fost atins după 72 de ore de fermentație (aproximativ

62 g L -1 acid lactic), după care, cantitatea de acid lactic a început să scadă (posibila cauză ar fi că

microorganismul îl degradează pentru a face rost de energie în vederea desfășurării proceselor

metabolice). Concentrația inițială a substratului a fost de 60 g L-1, ajungând la finalul fermentației la

aproximativ 3g L-1.

Page 33: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Între fermentațiile derulate cu spori imobilizați și activați și cele cu spori neimobilizați și

neactivați nu s-au remarcat diferențe majore, diferența cea mai vizibilă fiind momentul în care se atinge

maximul de producție (96 de ore pentru sporii imobilizați și activați și 120 ore pentru sporii neactivați și

neimobilizați).

Figura 2.2.1 Reprezentarea grafică a rezultatelor obținute în cazul fermentațiilor pe substrat de

glucoză, fără inhibitor

Prin adaosul de inhibitor, s-a reușit îmbunătățirea cantității de acid lactic produs în fermentațiile

pe substrat de glucoză, obținându-se o cantitate de aproximativ 73 g L-1 la o concentrație inițială a sursei

de carbon de 100 g L-1 (figura 2.3.3).

Page 34: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Figura 2.2.2 Reprezentarea grafică a rezultatelor obținute în cazul fermentațiilor pe substrat de

glucoză, cu inhibitor.

În cele ce urmează, sunt prezentate rezultatele obținute în cadrul fermentațiilor derulate pe

mediile cu glicerol ca sursă de carbon.

În cazul mediilor fără inhibitor, s-a reușit obținerea unei cantități de acid lactic de 36.4 g L-1,

folosindu-se o concentrație de 80 g L -1 de glicerol crud și spori de Rhyzopus oryzae neimobilizați și

neactivați

Tabel 2.2.1 Cantitatea de acid lactic obţinută (g L-1) fără inhibitor

Forma microorganismului

Concentraţia de substrat

Ziua 1 Ziua 3 Ziua 5 Ziua 7

SNN 80g L-1 4.360 19.417 36.909 36.419

SNA 80 g L-1 5.423 21.130 32,263 35.66

SIN 100 g L-1 4.91 21.020 33.62 33.523

SIA 100 g L-1 3.15 11.73 34.49 32.84

Page 35: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

În ceea ce privește fermentațiile pe substrat de glicerol crud și în prezență de inhibitor, doar 2

fermentații au înregistrat o creștere a cantității de acid lactic: una derulată la o concentrație de 80 g L-1

acid lactic, cu ajutorul sporilor neimobilizați și neactivați, iar cea de-a doua derulată la aceeași

concentrație de substrat, dar inoculată cu spori neimobilizați și activați. Astfel în primul caz s-au obținut

43.19 g L-1 acid lactic, în timp ce în cel de-al doilea caz s-au obținut 39.26 g L -1.

Comparând rezultatele prezentate în tabelul 2.2.1 și 2.2.2 putem concluziona că, în cazul

glicerolului, inhibitorul nu întotdeauna are un efect pozitiv în creșterea cantității de acid lactic produs.

2.3 Analiza enzimelor ADH (alcool dehidrogenază) și LDH (lactat dehidrogenază)

LDH-ul este enzima responsabilă de conversia reversibilă a lactatului în acid piruvic, deoarece

aceasta transformă reversibil NAD+ în NADH. Activitatea enzimei LDH în cadrul reacției bidirecționale

este monitorizată spectrofotometric prin măsurarea fie a creșterii NADH-ului la 340 nm produsă în urma

reacției lactat-piruvat (L-P), fie prin scăderea NADH-ului la aceeași lungime de undă produsă în urma

reacției inverse, piruvat-lactat (P-L).

Aceasta determinare s-a realizat urmând două etape principale cu ajutorul unui kit special

achiziționat de la SigmaAldrich..

În urma analizelor probelor recoltate din fermentațiile derulate în bioreactor pe substrat de

glucoză, utilizând toate cele 4 forme ale lui R.oryzae și reprezentării grafice a acestora (figura 2.3.1) se

poate constata că, producția de acid lactic este în directă legătură cu activitatea lactat dehidrogenazei.

Cea mai intensă activitate a fost înregistrată în cazul fermentațiilor derulate cu spori neimobilizați și

activați, în prezență de inhibitor. Așa cum era de așteptat, prin adaosul de inhibitor a fost potențată

activitatea acestei enzime. Se observă totodată o scădere a activității acestei enzime după primele 72 de

Tabel 2.2.2 Cantitatea de acid lactic obţinută (g L-1) cu inhibitor

Forma microorganismului

Concentraţia de substrat

Ziua 1 Ziua 3 Ziua 5 Ziua 7

SNN 80g L-1 6.963 22.47 42.09 43.19

SNA 80 g L-1 6.43 19.32 38,93 39.26

SIN 100 g L-1 4.189 18.369 26.96 27.23

SIA 100 g L-1 2.563 9.321 29.85 28.84

Page 36: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

ore de fermentație în cazul celor derulate cu spori neimobilizați și activați. Acest lucru se poate datora

scăderii cantității de substrat, fapt ce duce la scăderea metabolismului microbian.

Figura 2.3.1 Evoluția LDH în cazul fermentațiilor derulate în bioreactor, pe substrat de glucoză cu și

fără inhibitor (▲- cu inhibitor, ●-fără inhibitor)

În ceea ce privește fermentațiile derulate pe mediu cu substrat de glicerol crud, așa cum adaosul

de inhibitor nu a dus la creșteri foarte mari ale producției de acid lactic, nici activitatea lactat

dehidrogenazei nu a fost potențată. Se poate observa o creștere continuă a cantității de LDH pe întreaga

perioadă a fermentației, cu o creștere rapidă în primele 72 de ore, urmată de o creștere lentă până la

finalul procesului fermentativ (figura 2.3.2). Dacă în cazul fermentațiilor derulate cu spori neimobilizați

(activați și neactivați) adaosul de inhibitor a potențat activitatea lactat dehidrogenazei, în cazul sporilor

imobilizați în sfere de cryogel și activați sau nu, adaosul de inhibitor a dus la scăderea cantității de enzimă

secretată de către R.oryzae. Maximul de activitate s-a înregistrat în cazul fermentației derulate cu spori

neimobilizați și activați (cu adaos de inhibitor), urmat de fermentația derulată cu aceeași formă a lui

Rhyzopus oryzae, dar fără adaos de 2,2,2 trifluoroetanol ca inhibitor.

Page 37: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Figura 2.3.2 Evoluția LDH în cazul fermentațiilor derulate în bioreactor, pe substrat de glicerol crud cu

și fără inhibitor (▲- cu inhibitor, ●-fără inhibitor)

Alcool dehidrogenazele (ADH) sunt un grup de enzime care facilitează interconversia între

alcooli și aldehide sau cetone, prin reducerea nicotinamid-adenin-dinucleotidei (NAD + la NADH).

NADH-ul prezintă o absorbție UV puternică, în timp ce forma sa oxidată nu prezintă practic nici

o absorbție la lungimea de undă specifică. Prin urmare, dacă se începe cu un amestec de etanol, NAD+ și

o enzimă în soluție tampon, reacția va continua până când se ajunge la o stare de echilibru. Reacția poate

fi urmată de măsurarea creșterii absorbției soluției, prin formarea NADH.

Activitatea alcool dehidrogenazei a fost determinată, ca și în cazul LDH-ului, cu ajutorul unui kit

special achiziționat de la SigmaAldrich.

În urma analizelor, s-a observat o activitate mai intensa a alcool dehidrogenazei decât a lactat

dehidrogenazei în cazul tuturor fermentațiilor derulate, atât pe substrat de glicerol cât și pe substrat de

glucoză (figura 2.3.3 și figura 2.3.4).

În cazul fermentațiilor derulate pe substrat de glucoză, utilizând toate cele 4 forme ale lui R.oryzae

cu și fără adaos de inhibitor (rezultate prezentate în graficul din figura 2.3.3), cea mai intensă activitate

a alcool dehidrogenazei a fost înregistrată în cazul fermentațiilor derulate cu spori neimobilizați și

Page 38: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

activați. Adaosul de 2,2,2 trifluoroetanol a dus la scăderea activității alcool dehidrogenazei (așa cum era

de așteptat) în cazul tuturor fermentațiilor derulate pe substrat de glucoză.

Figura 2.3.3 Evoluția ADH în cazul fermentațiilor derulate în bioreactor, pe substrat de glucoză cu și

fără inhibitor (▲- cu inhibitor, ●-fără inhibitor)

Evoluția alcool dehidrogenazei în cazul fermentațiilor pe medii cu substrat de glicerol (cu și fără

inhibitor) este diferită față de cea a lactat dehidrogenazei analizată din aceleași fermentații. Dacă în cazul

lactat dehidrogenazei, aceasta are o creștere până la finalul proceselor fermentative, în cazul alcool

dehidrogenazei, aceasta înregistrează un maxim (a se vedea reprezentarea grafică din figura 2.3.4), după

care urmează o perioadă de scădere. Conform acestei reprezentări grafice, prin adaosul de inhibitor s-a

diminuat activitatea alcool dehidrogenazei.

Page 39: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Figura 2.3.4 Evoluția ADH în cazul fermentațiilor derulate în bioreactor, pe substrat de glicerol crud

cu și fără inhibitor (▲- cu inhibitor, ●-fără inhibitor)

Activitate 2.3. Caracterizarea morfologica a lui R. oryzae pe perioada fermentatiei

Ȋn cazul caracterizării morfologice s-au realizat frotiuri atât cu spori de R.oryzae neȋncapsulați cȃt

şi cu spori ȋncapsulați ȋn CryoPVAG’s, care au fost analizate ulterior la microscop. Ȋn timpul fermentației

s-a observat morfologia sporangiilor cu sporangiospori şi a sporangioforilor. Ȋn timpul germinării

sporangiosporii se dezvoltă ȋn celule vegetative cu structură şi morfologie diferită. Ȋn ceea ce priveşte

dezvoltarea fungului pe mediul solid, aceasta s-a realizat neuniform formȃnd astfel structuri greu de

diferențiat datorită formării ȋn abundență a sporangioforilor. Pentru o bună evidențiere a morfologiei

sporilor, preparatele microscopice au fost colorate utilizȃnd o soluție de albastru de metilen 1%. (Figura

3).

Page 40: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Figura 3.1 Captură preparat microscopic R.oryzae NRRL 395

3.1. Morfologia sporilor de R.oryzae neȋncapsulați

Structura morfologică a hifelor ȋmpreună cu cea a sporangiilor cu sporangiospori este prezentată

ȋn figurile 3.1.1 A și 3.1.1 B. ȋn care se poate observa forma sferică a sporangiosporilor dislocați din

sporangii, aceştia fiind transparenți. Ȋn figura 3.1.1 B se disting sporangii ȋn care s-au format din

abundență sporangiosporii. Sporangioforii se prezintă sub formă tubulară, ramificată, formând la capăt,

ȋn timpul creşterii, un sporangiu cu sporangiospori. Ȋn cazul fermentației sporilor neimobilizați de

R.oryzae ȋn miedul cu glicerol, dezvoltarea biomasei a fost mai accentuată față de cea ȋn mediul cu

glucoză. Acest lucru poate fi explicat prin faptul că microorganismului îi este mai ușor să sintetizeze

piruvat din glicerol, unitate de bază în metabolismul microbian.

3.1.1 A 3.1.1 B

Figura 3.1.1 Captură preparat microscopic R.oryzae

Page 41: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

La cultivarea în bioreactor, după primele ore de fermentație, sporii au germinat în forma

vegetativă. În urma proceselor de multiplicare și dezvoltare, hifele lui R.oryzae au format o rețea

complexă. Această rețea este prezentată în figura 3.1.2

Figura 3.1.2 Rețeaua de hife formată în bioreactor până la finalul fermentației

În cazul sporilor neîncapsulați, această rețea s-a legat și de paletele agitatorului

bioreactorului. Turația de 200 rpm a dus la ruperea acestei rețele, la finalul fermentațiilor în mediu

găsindu-se doar bucăți.

3.2. Morfologia sporilor de R. oryzae ȋncapsulați ȋn CryoPVAG

Ȋn cazul sporilor ȋncapsulați ȋn CryoPVAG s-a observat o dezvoltare mai întârziată a acestora

decât în cazul sporilor liberi. Morfologia lor este prezentată ȋn figura 3.2.1 atȃt ȋn interiorul sferelor de

CryoPVAG’s (figura 3.2.1 A) cȃt şi la exteriorul acestora (figura 3.2.1 B). Dezvoltarea sporilor înafara

sferelor de CryoPVAG s-a realizat în timpul etapei de germinare, formȃndu-se sporangiofori care s-au

ramificat abundent. Creşterea sporilor ȋn interiorul sferelor a fost neuniformă, iar dezvoltarea acestora a

fost mai accentuată ȋnafara sferelor, ȋn timpul germinării. De asemenea s-a observat o dezvoltare mai

accentuată a sporilor ȋn fermentația ȋn mediul cu glicerol față de cel cu glucoză.

Page 42: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

3.2.1 A 3.2.1 B

Figura 3.2.1 Captură preparat microscopic R.oryzae

În cazul fermentațiilor derulate în bioreactor cu spori imobilizați (activați și neactivați), după

primele zile de fermentație, rețeaua formată a fost mult mai compactă (figurile 3.2.2 A și 3.2.2 B).

Distrugerea lor datorită paletelor agitatorului a fost mult mai redusă, la finalul fermentațiilor acestea

putând fi îndepărtate fără nici o problemă. Mediul separat a fost congelat pentru teste.

A B

Figura 3.2.2 Biomasa formată în procesele fermentative derulate cu spori imobilizați (activați și

neactivați)

Procesul de activare nu a avut o influență majoră asupra morfologiei lui R.oryzae în cadrul

proceselor derulate în bioreactor, la finalul fermentației fiind greu de diferențiat formațiunile rezultate

din spori imobilizați și neactivați de cele formate din spori imobilizați și activați.

Page 43: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Activitate 2.5. Optimizarea procesului prin utilizarea optimizarii de particule swarm inspirate din

Nature

1. Model matematic în funcție de timp pentru cantitatea de acid lactic in probele fermentate cu spori R. oryzae neimobilizati, neactivati in mediu cu glucoza 50g/l. (y=cantitatea de acid lactic, t = timp)

Modelul matematic pătratic:

y = 2.4511+ 6.4397×t -0.4438×t2

[R2 statistic, F-statistic, p-value, estimate of the error variance] =[ 0.9480, 355.2298, 0.0000 , 2.1142]

Modelul matematic de ordin fracționar:

1 2 3 4 5 6 75

10

15

20

25

30

Time [days]

Lact

ic a

cid

[g/l]

Page 44: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Y= 1.6805+ 7.2197×t0.95 -0.5387×t1.9

[R2 statistic, F-statistic, p-value, estimate of the error variance] =[ 0.9500, 370.8366, 0.0000, 2.0297]

1 2 3 4 5 6 75

10

15

20

25

30

Time [days]

Lact

ic a

cid

[g/l]

Page 45: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

2. Model matematic în funcție de timp pentru cantitatea de acid lactic in probele fermentate cu spori R. oryzae neimobilizati, neactivati in mediu cu glucoza 80g/l. (y=cantitatea de acid lactic, t = timp)

Modelul matematic pătratic:

Y=7.3845+6.2533×t -0.5235×t2

[R2 statistic, F-statistic, p-value, estimate of the error variance] =[0.9516 383.7981 0.0000 1.1135]

Modelul matematic de ordin fracționar:

Y= 6.7027+6.9583×t0.95 -0.6045×t1.92

1 2 3 4 5 6 710

12

14

16

18

20

22

24

26

28

Time [days]

Lact

ic a

cid

[g/l]

1 2 3 4 5 6 710

12

14

16

18

20

22

24

26

28

Time [days]

Lact

ic a

cid

[g/l]

Page 46: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

[R2 statistic, F-statistic, p-value, estimate of the error variance] =[0.9523, 389.4480, 0.0000, 1.0981]

Page 47: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

3. Model matematic în funcție de timp și cantitatea de glucoză în mediu pentru cantitatea de acid lactic in probele fermentate cu spori R. oryzae neimobilizati, neactivati (y=cantitatea de acid lactic, x1 = timp, x2 = cantitatea de glucoză în mediu)

Linear regression model:

y ~ 1 + x1*x2 + x1^2 + x2^2

Estimated Coefficients:

Estimate SE tStat pValue

___________ _________ ___________ __________

x1 6.2533 0.32019 19.53 9.1083e-32

x2 0.27692 0.023844 11.614 1.1085e-18

x1:x2 -2.2033e-17 0.0028601 -7.7038e-15 1

x1^2 -0.52351 0.033025 -15.852 4.1545e-26

x2^2 -0.0023076 0.0002815 -8.1975 3.8971e-12

Number of observations: 84, Error degrees of freedom: 79

Root Mean Squared Error: 1.05

R-squared: 0.952, Adjusted R-Squared 0.949

F-statistic vs. constant model: 389, p-value = 4.17e-51

Graficul punctelor pârghie (leverage plot):

Page 48: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Identificarea valorile aberante, realizată prin analiza reziduurilor standardizate, nu identifică valori

extreme în spaţiul y.

Graficul distanțelor Cook, adică a măsurii influenţei celei de a i-a observaţii asupra tuturor valorilor

prognozate:

Page 49: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Conform acestui rezultat s-au eliminate măsurătorile cu numărul 15, 57, 42, 84, rezultate deasupra liniei

admise. Graficul de probabilitate pare a fi rezonabil de drept, ceea ce înseamnă o potrivire rezonabilă a

reziduurilor distribuite în mod normal.

Page 50: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Reprezentarea 3D a rezultatelor modelului pătratic în comparație cu datele experimentale:

0 24 6 8 40 50 60 70 80

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

Glucose [g/l]Time [days]

Lact

ic a

cid

[g/l]

Page 51: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Cel mai bun rezultat s-a obținut cu modelul de ordin fracționar, de forma

Y=10.4422 x10.88+ 0.3190 x20.88-1.9772 x11.5-0.0149x21.5, având

[R2 statistic, F-statistic, p-value, estimate of the error variance] =[0.9531, 401.6456, 1.22e-51, 1.0657]

Reprezentarea 3D a rezultatelor modelului de ordin fracționar în comparație cu datele experimentale:

0 24 6 8 40 50 60 70 80

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

Glucose [g/l]Time [days]

Lact

ic a

cid

[g/l]

Page 52: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

1. Model matematic în funcție de timp pentru cantitatea de acid lactic in probele fermentate cu spori R. oryzae neimobilizati, activati in mediu cu glucoza 60g/l. (y=cantitatea de acid lactic, t = timp)

Modelul matematic pătratic:

y = 8.4393+ 5.4108×t -0.5016×t2

[R2 statistic, F-statistic, p-value, estimate of the error variance] =[ 0.5638, 25.2034, 0.0000, 9.0259]

Modelul matematic de ordin fracționar:

1 2 3 4 5 6 710

12

14

16

18

20

22

24

26

28

Time [days]

Lact

ic a

cid

[g/l]

Page 53: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Y= 2.3565 + 13.5865×t -3.6680×t1.8+ 0.2017×t2.8

[R2 statistic, F-statistic, p-value, estimate of the error variance] =[ 0.5958 18.6733 0.0000 8.5831]

1 2 3 4 5 6 710

12

14

16

18

20

22

24

26

28

Time [days]

Lact

ic a

cid

[g/l]

Page 54: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

2. Model matematic în funcție de timp pentru cantitatea de acid lactic in probele fermentate cu spori R. oryzae neimobilizati, activati in mediu cu glucoza 100g/l. (y=cantitatea de acid lactic, t = timp)

Modelul matematic pătratic:

y = 7.1025+ 5.4750×t -0.4718×t2

[R2 statistic, F-statistic, p-value, estimate of the error variance] =[ 0.8057,80.8814, 1.32e-14, 3.6968]

Modelul matematic de ordin fracționar:

1 2 3 4 5 6 710

12

14

16

18

20

22

24

26

28

Time [days]

Lact

ic a

cid

[g/l]

Page 55: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Y= 4.6709 + 9.1003×t -2.0172×t1.7+ 0.0225×t3.1

[R2 statistic, F-statistic, p-value, estimate of the error variance] =[ 0.8106, 54.196, 8.49e-14, 3.7000]

3. Model matematic în funcție de timp și cantitatea de glucoză în mediu pentru cantitatea de acid lactic in probele fermentate cu spori R. oryzae neimobilizati, activati (y=cantitatea de acid lactic, x1 = timp, x2 = cantitatea de glucoză în mediu)

Linear regression model:

y ~ 1 + x1*x2 + x1^2 + x2^2

Estimated Coefficients:

Estimate SE tStat pValue

__________ _________ _______ __________

x1 4.837 0.84669 5.7128 1.9374e-07

x2 0.25524 0.045884 5.5628 3.5951e-07

x1:x2 0.0075738 0.0068377 1.1077 0.27141

x1^2 -0.48673 0.078955 -6.1647 2.9086e-08

x2^2 -0.0018601 0.00044895 -4.1432 8.6172e-05

Number of observations: 84, Error degrees of freedom: 79

Root Mean Squared Error: 2.51

1 2 3 4 5 6 710

12

14

16

18

20

22

24

26

28

Time [days]

Lact

ic a

cid

[g/l]

Page 56: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

R-squared: 0.681, Adjusted R-Squared 0.664

F-statistic vs. constant model: 42.1, p-value = 7.38e-19

Graficul punctelor pârghie (leverage plot):

Identificarea valorile aberante, realizată prin analiza reziduurilor standardizate, nu identifică valori

extreme în spaţiul y.

Graficul distanțelor Cook, adică a măsurii influenţei celei de a i-a observaţii asupra tuturor valorilor

prognozate:

Page 57: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Conform acestui rezultat s-au eliminate măsurătorile cu numărul 10, 14, 56, 80, 84, rezultate deasupra

liniei admise. Graficul de probabilitate pare a fi rezonabil de drept, ceea ce înseamnă o potrivire

rezonabilă a reziduurilor distribuite în mod normal.

Page 58: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Reprezentarea 3D a rezultatelor modelului pătratic în comparație cu datele experimentale:

Page 59: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Cel mai bun rezultat s-a obținut cu modelul de ordin fracționar, de forma

Y=12.0946 x10.7+ 0.0076x1x2-1.2064x1

1.9+0.0002x22.5+0.0559x1

3,

[R2 statistic, F-statistic, p-value, estimate of the error variance] =[ 0.6958 ,35.6830 , 7.89e-19, 6.0607]

Reprezentarea 3D a rezultatelor modelului de ordin fracționar în comparație cu datele experimentale:

0 24 6 8 40 50 60 70 80

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

Glucose [g/l]Time [days]

Lact

ic a

cid

[g/l]

Page 60: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

4. Model matematic în funcție de timp pentru cantitatea de acid lactic in probele fermentate cu spori

R. oryzae neimobilizati, neactivati in mediu cu glicerol pur 40g/l. (y=cantitatea de acid lactic, t = timp)

Modelul matematic pătratic:

0 24 6 8 60 70 80 90 100

10

12

14

16

18

20

22

24

26

28

Glucose [g/l]Time [days]

Lact

ic a

cid

[g/l]

1 2 3 4 5 6 70

1

2

3

4

5

6

7

8

Time [days]

Lact

ic a

cid

[g/l]

Page 61: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

y = 0.6860-0.4721×t +0.1566×t2

[R2 statistic, F-statistic, p-value, estimate of the error variance] =[ 0.7827 82.8507 5.64e-16 0.8078]

Modelul matematic de ordin fracționar:

Y= 0.6798-0.4317×t0.8 +0.0867×t1.9+0.0227×t2.5

[R2 statistic, F-statistic, p-value, estimate of the error variance] =[ 0.7827 54.0318 5.86e-15 0.8258]

1 2 3 4 5 6 70

1

2

3

4

5

6

7

8

Time [days]

Lact

ic a

cid

[g/l]

Page 62: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

5. Model matematic în funcție de timp pentru cantitatea de acid lactic in probele fermentate cu spori R. oryzae neimobilizati, neactivati in mediu cu glicerol pur 80g/l. (y=cantitatea de acid lactic, t = timp)

Modelul matematic pătratic:

y = -0.7776-+0.7544×t +0.1082×t2

[R2 statistic, F-statistic, p-value, estimate of the error variance] =[ 0.5224 25.1593 4.15e-08 10.3561]

Modelul matematic de ordin fracționar:

1 2 3 4 5 6 70

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Time [days]

Lact

ic a

cid

[g/l]

Page 63: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Y= 1.9815-2.2268×t0.8 +0.7523×t1.9-0.0136×t3.5

[R2 statistic, F-statistic, p-value, estimate of the error variance] =[ 0.5296 16.8905 1.71e-07 10.4262]

6. Model matematic în funcție de timp și cantitatea de glicerol pur în mediu pentru cantitatea de acid lactic in probele fermentate cu spori R. oryzae neimobilizati, neactivati (y=cantitatea de acid lactic, x1 = timp, x2 = cantitatea de glucoză în mediu)

1 2 3 4 5 6 70

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Time [days]

Lact

ic a

cid

[g/l]

Page 64: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

În vederea obținerii unor modele matematice mai precise, s-a apelat la intelegință artificială. Folosind

Toolboxul ”Neural Network Toolbox” din Matlab® s-a implementat o rețea neuronală cu un număr

diferit de straturi și neuroni. Astfel, modelul matematic rezultat pentru modelul cu 4 straturi, fiecare

cu câte 30 de neuroni în mediu cu glucoza este:

0 24 6 8 40 50 60 70 80

0

5

10

15

20

Glucose [g/l]Time [days]

Lact

ic a

cid

[g/l]

Page 65: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Modelul cu 3 straturi a câte 45 de neuroni fiecare:

Page 66: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Dacă numărul de neuroni este prea mare (în cazul de față 3 straturi a câte 50 de neuroni), ne putem aștepta

la un efect de "supraevaluare" așa cum se arată în figura de mai jos:

Pentru modelul experimentului în mediu cu glicerol pur s-au utilizat 3 straturi cu 65 de neuroni:

Page 67: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Cel mai bun model obținut s-a realizat cu 3 straturi a câte 70 de neuroni:

Validarea modelelor s-a realizat cu cel de al doilea set de experimente, rezultând o suprapunere bună,

așa cum dovedesc graficele de mai jos:

Page 68: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Cantitatea de acid lactic in probele fermentate cu spori R. oryzae neimobilizati, neactivati in mediu cu

glucoza G1, exprimata in g/l.

Cantitatea de acid lactic in probele fermentate cu spori R. oryzae neimobilizati, neactivati cu inhibitor in

mediu cu glucoza G5, exprimata in g/l.

Page 69: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Cantitatea de acid lactic in probele fermentate cu spori R. oryzae neimobilizati, activati in mediu cu

glucoza G2, exprimata in g/l.

Page 70: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Cantitatea de acid lactic in probele fermentate cu spori R. Oryzae neimobilizati, activati cu inhibitor in

mediu cu glucoza G6, exprimata in g/l.

Page 71: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Cantitatea de acid lactic in probele fermentate cu spori R. oryzae neimobilizati, neactivati in mediu cu

glicerol pur PG1, exprimata in g/l.

Page 72: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Cantitatea de acid lactic in probele fermentate cu spori R. oryzae neimobilizati, neactivati cu inhibitor in

mediu cu glicerol pur PG5, exprimata in g/l.

Page 73: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Cantitatea de acid lactic in probele fermentate cu spori R. Oryzae neimobilizati, activati in mediu cu

glicerol pur PG2, exprimata in g/l.

Page 74: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Cantitatea de acid lactic in probele fermentate cu spori R. oryzae neimobilizati, activati cu inhibitor in

mediu cu glicerol pur PG6, exprimata in g/l.

Page 75: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

În vederea optimizării proceselor, s-a creat o aplicație în care se poate determina un model matematic

folosind rețelele neuronale, iar cu modelul determinat se pot simula pentru numărul dorit de zile și pentru

o concentrație dorită de mediu de activare cantitatea de produs de acid lactic prezis.

Interfața grafică aferentă:

Page 76: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Se selectează numărul de straturi și de neuroni dorit, introducând cifrele dorite în căsuțele intitulate

”Number of neurons” și ”Number of Layers”. Aplicația poate instrui rețeaua neuronală folosind una

dintre metodele Levenberg-Marquadt, BFGS Quasi-Newton, gradient conjugat înclinat, gradient

conjugat Fletcher-Powell și gradient conjugat Polak Ribiere, fiecare metodă având avantaje și

dezavantaje, motiv pentru care utilizatorul poate selecta metoda potrivită datelor specifice sau poate alege

determinarea modelului cu fiecare metodă și ulterior, prin analiza rezultatelor obținute, să decidă care

model este cel potrivit. După alegerea metodei se apasă butonul ”Start training”. Modelul stabilit poate

fi folosit în predicție unor rezultatele în alte condiții de experiment. Concentrația folosită în condițiile de

mediu se trec în căsuța din dreapta sus, iar numărul de zile pentru care se dorește estimarea rezultatului

în căsuța intitulată ”Insert number of days to simulate”. Se apasă butonul de ”Simulate”, iar în fereastra

de jos apare evoluția prezisă, cum se prezintă ca și exemplu în figura de mai jos:

Page 77: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Activitatile 2.4., 2.6 Diseminarea rezultatelor

1. Membrii echipei de cercetare au organizat sesiunea specială “ Modern control methodologies and modeling techniques” la Conferinţa Internaţională IEEE Automation, Quality, Testing and Robotics-2018, Cluj-Napoca, Romania (conferinţă indexată ISI PRO). http://aqtr.ro/program/aqtr_2018_program.pdf

2. Lucrarea intitulată ”Mathematical Models of the L-lactic Acid Production Using Crude Glycerol”

este sub recenzie la 22nd International Conference on System Theory, Control and Computing. 10 - 12 October 2018. Sinaia – Romania

3. Lucrarea intitulată: “Modeling Tool in Biochemical Industry. Case Study: The L-lactic Acid

Production Using Crude Glycerol” este sub recenzie la revista Journal of Cheminformatics (Q1)

Page 78: Optimizarea cantităților de substrat fermentescibil

Concluzii:

Prin derularea proceselor fermentative în bioreactoare (unde se poate controla și menține pH-ul

la o valoare optimă) s-a reușit creșterea cantității de acid lactic produs de R.oryzae NRRL 395. Totodată

acest lucru a dus la o valorificare mai bună a substratului fermentescibil, făcând procesul mult mai

eficient din punct de vedere economic.

Prin adaosul de inhibitor s-a reușit îmbunătățirea productivității în majoritatea fermentațiilor.

Deoarece metabolismul bacterian este foarte complex, prin adăugarea unei substanțe ca blocator al unei

căi metabolice (a alcool dehidrogenazei în cazul nostru) s-a observat o modificare a întregului

metabolism (în ceea ce privește morfologia și cinetica de dezvoltare a lui R.oryzae de-a lungul tuturor

fermentațiilor).

Deși prin imobilizare s-a înregistrat o scădere a productivității (raportată la aceeași perioadă de

fermentație), ea (imobilizarea) s-a dovedit de ajutor în cazul fermentațiilor semicontinue și continue,

deoarece a favorizat eliminarea mediului epuizat de substrat și îmbogățit cu acid lactic.

De asemenea, procesul de activare la care au fost supuși sporii liberi și sporii imobilizați a dus la

o productivitate mai mare în unitatea de timp. În timpul activării sporii trec în forma vegetativă, fiind

gata să intre în procesul fermentativ, reducându-se astfel perioada de fermentație.