Aix-Marseille Universit

Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Sant

Thse de Doctorat dUniversit

Mention Microbiologie

Clment AUSSIGNARGUES

Optimisation du mtabolisme nergtique

du soufre chez la bactrie hyperthermophile

Aquifex aeolicus

Soutenue le 17 Dcembre 2012 devant le jury:

Pr. Frdric BARRAS

Dr. Laurent COURNAC

Dr. Bruno FRANZETTI

Dr. Marie-Thrse GIUDICI-ORTICONI

Dr. Anne GODFROY

Dr. Marianne ILBERT

Laboratoire de Bionergtique et Ingnierie des Protines

Centre National de la Recherche Scientifique

Aix-Marseille Universit

Ecole Doctorale des Sciences de la Vie et de la Sant

Thse de Doctorat dUniversit

Mention Microbiologie

Clment AUSSIGNARGUES

Optimisation du mtabolisme nergtique

du soufre chez la bactrie hyperthermophile

Aquifex aeolicus

Soutenue le 17 Dcembre 2012 devant le jury:

Pr. Frdric BARRAS

Dr. Laurent COURNAC

Dr. Bruno FRANZETTI

Dr. Marie-Thrse GIUDICI-ORTICONI

Dr. Anne GODFROY

Dr. Marianne ILBERT

Laboratoire de Bionergtique et Ingnierie des Protines

Centre National de la Recherche Scientifique

Sommaire

Sommaire

IInnttrroodduuccttiioonn 22

Chapitre I- Mtabolismes nergtiques du soufre 4

I) Le soufre, un lment essentiel aux multiples facettes 6

II) Le soufre utilis comme compos nergtique 9

A) Oxydation des composs du soufre 10

1. Oxydation du sulfure dhydrogne H2S 10

a) La Sulfure Quinone Oxydorductase (SQR) 10

b) La flavocytochrome c sulfure dshydrognase (FCSD) 13

2. Oxydation du thiosulfate (S2O32-

) 14

a) Thiosulfate : accepteur oxydorductase (TAOR) 14

b) Le systme Sox 16

3. Oxydation du sulfite (SO32-

) 20

a) Sulfite : accepteur oxydorductase (SAOR) 21

b) Voie de lAPS 23

4. Oxydation du soufre stock dans les globules 26

B) La rduction du soufre : soufre/polysulfure rductase 29

C) Un cas particulier : la dismutation du soufre (SOR) 33

1. Ractions catalyses 34

2. Structure et architecture 34

a) Le monomre 34

Sommaire

b) La protine entire 36

3. Vue gnrale du fonctionnement de la SOR 38

III) Complexit des mtabolismes nergtiques du soufre : quelques exemples 39

A) Les arches thermoacidophiles : Acidianus ambivalens 39

B) Les bactries sulfureuses phototrophes 41

C) Les bactries acidophiles et msophiles du genre Acidithiobacillus 43

IV) Rflexions sur les modles des mtabolismes nergtique du soufre 46

Chapitre II- Les rhodanses 48

I) Caractristiques des rhodanses 51

A) Organisation en domaines 51

B) Squence protique 55

C) Site actif 56

D) Structure tridimensionnelle 57

E) Catalyse et mcanisme catalytique 60

II) Fonction des rhodanses 62

A) Les protines domaine rhodanse associ 62

Sommaire

B) Rhodanses un ou plusieurs domaines 65

1. Chez les eucaryotes 66

2. Chez les procaryotes 67

III) Vue densemble de la superfamille des rhodanses 69

Chapitre III- Aquifex aeolicus 72

I) Les Aquificales 74

II) Prsentation de notre modle dtude : Aquifex aeolicus 78

A) Morphologie, motilit et adhrence 79

B) Gnome 80

C) Physiologie 81

III) Mtabolisme nergtique du soufre chez Aquifex aeolicus 83

A) Voie H2S/O2 83

B) Voie H2/S 86

C) La SOR 88

D) Les rhodanses 89

E) NADH dshydrognase (complexe I) 90

Sommaire

F) Vision globale du mtabolisme nergtique du soufre chez

Aquifex aeolicus 92

Chapitre IV- Objectifs du travail 94

MMaattrriieell eett mmtthhooddeess 9988

I) Culture bactrienne 100

A) Aquifex aeolicus 100

B) Escherichia coli 101

II) Obtention du matriel biologique 102

A) Aquifex aeolicus 102

1. Fractionnement cellulaire 102

2. Solubilisation des protines membranaires 103

3. Globules de soufre 104

B) Escherichia coli 104

III) Mthodes de purification des protines 105

A) Chromatographie dadsorption 105

Sommaire

B) Chromatographies dchange dions 105

1. Chromatographie basse pression 105

2. Chromatographie haute pression 105

C) Chromatographie dexclusion 106

D) Protocoles de purification 106

1. La SQR 106

2. Supercomplexe hydrognase/soufre rductase 106

3. La SOR et Aq-477 107

IV) Techniques danalyses biochimiques 111

A) Dosage protique 111

B) Electrophorse sur gel dacrylamide 111

1. Condition dnaturante : Tris-glycine SDS-PAGE 111

2. Condition native : Tris-glycine PAGE 111

3. Gel Bleu Natif 112

4. Gels Bleu Natif pores larges (BNPL) 113

5. Transfert sur membrane 113

C) Techniques de rvlation aprs lectrophorse 114

1. Colorations 114

Sommaire

2. Immunodtection 115

3. Dtection dactivits enzymatiques 116

a) Activit Sulfure Quinone Rductase 116

b) Activit hydrognase 116

c) Activit cytochrome c oxydase 117

d) Activit NADH-dshydrognase (complexe I) 118

e) Activit thiosulfate : cyanure soufre transfrase (rhodanse) 118

V) Mesures dactivits enzymatiques au spectrophotomtre 119

A) Transfert dlectrons de lhydrognase la soufre rductase 119

B) Activit Soufre Oxygnase Rductase (SOR) 121

C) Activit thiosulfate : cyanure soufre transfrase (rhodanse) 121

VI) Etude dintractions protine-protine 122

A) La rsonance plasmonique de surface (BIAcore) 122

1. Principe de fonctionnement 122

2. Interface utilise 123

3. Fixation du ligand et mesure de linteraction 123

B) Pontage covalent in vitro 124

C) Gel retard 124

VII) Analyses protomiques 125

Sommaire

A. Identification des protines par squenage N-terminal 125

B. Identification des protines par spectromtrie de masse 125

1) Maldi-TOF 126

2) Trappe ions 126

3) Orbitrap 126

C. Analyse de protines entires par spectromtrie de masse 127

VIII) Microscopies 127

A) Microscopie optique 127

B) Microscopie lectronique 127

IX) Analyses in silico 128

A) Recherches de protines homologues et alignements multiples de

squences 128

B) Prdiction de localisation et de structure secondaire 128

C) Modlisations 129

RRssuullttaattss eett ddiissccuussssiioonn 113300

Chapitre I- Mtabolisme nergtique du soufre chez

Aquifex aeolicus 132

Sommaire

I) Une rhodanse au cur du trafic 134

II) Une source potentielle de substrat: les globules de soufre 138

A) Influence des conditions de culture 138

B) Tentative disolation des globules de soufre 141

III) Mtabolisme nergtique du soufre chez Aquifex aeolicus : un nouveau

Modle 143

A) Identification de systmes potentiellement impliqus dans le mtabolisme

nergtique du soufre chez Aquifex aeolicus 144

1. Oxydation du thiosulfate 144

2. Oxydation de lH2S 146

3. Oxydation du soufre 149

4. Oxydation du sulfite 150

a) Voie de lAPS 150

b) Aq_979 150

B) Construction dun modle du mtabolisme nergtique du soufre chez Aquifex

aeolicus 153

Chapitre II- Recherche dun niveau dorganisation suprieure dans

larchitecture des voies respiratoires chez Aquifex aeolicus 155

I) Introduction : Organisation des complexes protiques membranaires 157

Sommaire

II) Dveloppement et optimisation de gels natifs pour la visualisation de

mgacomplexes 163

III) Prparation et optimisation des chantillons pour la dtection de

mgacomplexes 166

IV) Dveloppement des gels natifs larges pores pour la visualisation des

mgacomplexes 169

V) Impact des conditions de culture sur la prsence des superdifices 174

VI) Discussion 176

Chapitre III- Mise en vidence dun nanocompartiment protique et de sa

ferritine atypique chez la bactrie hyperthermophile

Aquifex aeolicus 178

CCoonncclluussiioonnss eett ppeerrssppeeccttiivveess 119977

RRffrreenncceess bbiibblliiooggrraapphhiiqquueess 220033

Introduction

1

Introduction

2

IINNTTRROODDUUCCTTIIOONN

Introduction

3

Introduction

4

Chapitre I

Mtabolismes nergtiques

du soufre

Introduction

5

Introduction

6

Mtabolismes nergtiques du soufre

I) Le soufre, un lment essentiel aux multiples facettes

Le soufre, lment connu depuis lAntiquit, a depuis toujours intress les hommes.

Il tait connu pour loigner la vermine selon Homre, utilis dans la prparation de la

poudre canons par les chinois au XIe sicle et toujours utilis dans divers processus

industriels (dont la vulcanisation du caoutchouc) de nos jours.

Le soufre a galement un impact environnemental trs important, justifiant les

nombreuses tudes qui lui sont consacres : le dioxyde de soufre par exemple, rejet dans

latmosphre par la combustion du ptrole et du charbon ou lors druptions volcaniques, se

combine avec leau dans les nuages pour donner de lacide sulfurique. Ce dernier est

notamment responsable des tristement clbres pluies acides, mais il a galement un effet

refroidissant sur la partie infrieure de latmosphre terrestre en rflchissant le rayonnement

solaire. Cest ainsi quune diminution de la temprature de 0,5C a t mesure en 1992 aprs

lruption du Pinatubo en 1991. Linjection de particules de soufre dans latmosphre comme

solution durgence au rchauffement climatique a galement t discute dans la communaut

scientifique, notamment par le prix Nobel de chimie Paul Crutzen (Crutzen, 2006).

La chimie du soufre, tant organique que minrale, est trs riche, puisquon le retrouve

des degrs doxydation varis selon les lments avec lesquels il est combin. Ainsi, le

soufre du sulfure dhydrogne (H2S) est son plus bas degr doxydation (-2), alors que celui

du sulfate (SO42-

) est +6 (Table 1 formes du soufre). Cette large gamme dtats doxydation

place le soufre au centre dun ventail de ractions doxydorduction : la thorie du monde

fer-soufre propose ainsi limplication de composs du type sulfure de fer (FeS, Fe2S) comme

permettant la formation des premires molcules organiques lorigine de la Vie (Drr et al.,

2003; Wachtershauser, 2000).

Introduction

7

Composs Formule Etat doxydation

Sulfate SO42-

+ 6

Sulfite SO32-

+ 4

Dioxyde de soufre SO2 + 4

Ttrathionate S4O62-

+ 2,5 (0 pour les soufres internes , + 5

pour les deux soufres externes )

Thiosulfate S2O32-

+ 2

Soufre lmentaire S0, S8 0

Polysulfure -S-S(n)-S

-

0 pour les soufres internes , - 1 pour

les deux soufres externes

Pyrite FeS2 - 1

Monosulfure de fer FeS - 2

Sulfure dhydrogne H2S - 2

Tableau 1. Degrs doxydation des composs soufrs. Ltat doxydation de latome est celui de latome de

soufre de la molcule. S8 reprsente le cyclo-octasoufre.

Lincorporation du soufre dans des biomolcules telles que les protines, les

vitamines, les cofacteurs est connue depuis bien longtemps, ce qui en fait une brique

fondamentale, lun des lments essentiels de la Vie au mme titre que le carbone, loxygne,

lazote ou lhydrogne.

Enfin, cest cette versatilit du soufre du point de vue redox qui explique son

utilisation des fins bionergtiques par les micro-organismes. En effet, des bactries et des

arches qui utilisent le soufre comme base de leur mtabolisme nergtique colonisent des

environnements riches en molcules soufres, quelles soient sous forme de solide (soufre

Introduction

8

lmentaire), de gaz (sulfure dhydrogne) ou dissoutes dans leau (thiosulfate, polysulfures)

(Figure 1).

Figure 1. Reprsentation de certaines formes du soufre. A, le cyclo-octasoufre S8 est un solide quasiment

insoluble (19-30 nM 25C, 478 nM 80C ; (Kamyshny, 2009)) ; B, le ttrathionate S4O62- (loxygne est

reprsent en rouge, le soufre en jaune) est soluble tout comme C, polysulfure S(n)2-.

Lensemble des recherches sur le soufre, quels que soient leurs domaines dtudes,

pointent toutes vers lexistence dun vritable cycle biogochimique du soufre, faisant

intervenir des ractions abiotiques aussi bien que des micro-organismes qui y jouent un rle

absolument prpondrant (Figure 2). Les mtabolismes nergtiques quils mettent en jeu sont

trs diversifis, et cette varit trouve son reflet dans le grand nombre de protines qui les

constitue. Les parties suivantes seront essentiellement consacres la description des

enzymes jouant un rle prpondrant dans le mtabolisme nergtique du soufre des micro-

organismes. Nous replacerons ensuite ces enzymes dans le contexte global du mtabolisme

dorganismes modles, dont ltude a permis de mieux comprendre ces processus

nergtiques.

Introduction

9

Figure 2. Reprsentation schmatise du cycle du soufre dans la nature (ressource internet)

II) Le soufre utilis comme compos nergtique

Comme nous lavons vu, le soufre peut tout aussi bien tre incorpor dans les

biomolcules quutilis en tant que ressource nergtique par les micro-organismes. Dans

cette perspective, il faut distinguer les processus doxydation (donneur dlectrons) et de

rduction (accepteur dlectrons) du soufre. Ce dernier cas a t extensivement tudi chez les

bactries sulfato-rductrices qui couplent des chanes respiratoires anarobies la synthse

dATP, en utilisant le sulfate comme accepteur terminal dlectrons (Barton and Fauque,

2009; Muyzer and Stams, 2008). A linverse, de nombreux micro-organismes extraient les

lectrons des composs rduits du soufre qui sont alors le point de dpart de leurs chanes

respiratoires. Nous allons tout dabord nous intresser ces derniers.

Introduction

10

A) Oxydation des composs du soufre

Les composs rduits du soufre offrent des degrs doxydation variant entre -2 pour

lH2S et +4 pour le sulfite. Dans le cadre de leur mtabolisme nergtique, les micro-

organismes ont dvelopp des enzymes, ou des systmes enzymatiques oxydant

spcifiquement une forme donne du soufre auxquels nous allons maintenant nous intresser.

1. Oxydation du sulfure dhydrogne H2S

Le sulfure dhydrogne a t dcouvert en 1777 par Carl Wilhelm Scheele. Il est

considr comme un vritable poison cause de sa grande ractivit vis--vis des ponts

disulfures ou des centres mtalliques par exemple mais aussi pour les organismes arobies

chez lesquels il interfre avec la phosphorylation oxydative par raction avec loxygne.

Paradoxalement, ce gaz est absolument indispensable bien des gards : il a t identifi

comme un gazotransmetteur chez les eucaryotes (Wang, 2002), et est utilis par nombre

de micro-organismes comme donneur dlectrons pour leurs chanes respiratoires grce

deux enzymes principalement, la Sulfure Quinone Oxydorductase (SQR) dune part, et la

flavocytochrome c sulfure dshydrognase dautre part.

a) La Sulfure Quinone Oxydorductase (SQR)

La SQR fait partie de la grande famille des disulfure rductases flavine : cest une

flavoprotine denviron 50 kDa retrouve dans toutes les branches du vivant, mis--part les

plantes (Shahak and Hauska, 2008). Elle catalyse la rduction dun pool de quinones grce

loxydation de lH2S en chane de soufre. La nature du produit soufr est dailleurs discute

dans la littrature : certaines tudes chez Rhodobacter capsulatus lidentifient comme tant du

polysulfure (Griesbeck et al., 2002) alors que la rsolution rcente de la structure de la SQR

dAquifex aeolicus suggre plutt un cyclo-octasoufre (Marcia et al., 2009). Ainsi le terme de

polysoufre est employ pour faire rfrence cette chane de soufre dont la nature exacte

nest gnralement pas dfinie (Cherney et al., 2010).

Lutilisation dun pool de quinones comme accepteur dlectrons implique

ncessairement une localisation membranaire de la protine. Il a t montr que la SQR est

Introduction

11

une protine monotopique lie un seul ct de la membrane et que cet ancrage peu profond

(seulement 12 ) est d deux hlices amphipathiques (Marcia et al., 2009). De plus,

lorientation priplasmique de la SQR a t dmontre chez Rhodobacter capsulatus bien

quaucun peptide signal nait t dtect dans la squence N-terminale de la protine. En

revanche, les 38 acides amins en C-terminal sont ncessaires sa translocation (Schutz et al.,

1997) (Schutz et al., 1999).

Les membres de la famille des disulfure rductases sont principalement retrouvs sous

forme dimrique, mais dans le cas de la SQR, la question nest pas rsolue de manire claire.

En effet, si elle a bien t cristallise sous forme de dimre chez Acidithiobacillus

ferrooxidans et Acidianus ambivalens (Brito et al., 2009; Cherney et al., 2010), on la retrouve

trimrique chez Aquifex aeolicus, que ce soit au cours de sa cristallisation ou lors dtudes

biochimiques (Marcia et al., 2009; Marcia et al., 2010), et monomrique en solution chez

Acidianus ambivalens (Brito et al., 2009).

La protine elle-mme est compose de deux domaines similaires prsentant un

repliement de type Rossmann : le domaine N-terminal est celui qui lie le cofacteur FAD. Ce

dernier constitue avec trois rsidus cystine le site catalytique de lenzyme. De manire

intressante, la liaison du FAD la protine est covalente mais labile chez Aquifex aeolicus et

Acidianus ambivalens, mais pas chez Acidithiobacillus ferrooxidans. Ceci est mettre en

rapport avec la nature hyperthermophile des deux premires espces chez lesquelles la liaison

covalente pourrait intervenir dans laugmentation de la stabilit et de la conformation native

de la protine, comme cela a t propos auparavant pour dautres flavoprotines (Nandigama

and Edmondson, 2000). Le site de liaison des quinones est une cavit proche du FAD et du

contact protine-membrane, accessible travers un canal hydrophobe (Figure 3).

Introduction

12

Figure 3. Structure tridimensionnelle du monomre de la SQR dAquifex aeolicus (PDB 3HYW). La

quinone est reprsente en bleu, et le FAD en jaune.

La rduction du pool de quinones se fait via le cofacteur FAD. En effet, ce dernier

est le relai lectronique qui va dans un premier temps capter les lectrons issus de loxydation

des sulfures avant de les transfrer aux quinones. Il faut noter quoxydation des sulfures et

rduction des quinones sont spars dans lespace puisquayant lieu de part et dautre du

FAD.

Le rle des SQR est assez vari suivant les espces. En effet, son implication, tant

chez les micro-organismes que dans les mitochondries, a t par exemple dmontre dans la

dtoxification de lH2S (Shahak and Hauska, 2008), la tolrance aux mtaux lourds (Vande

Weghe and Ow, 2001) et probablement la signalisation (en contrlant les concentrations du

neurotransmetteur H2S chez les mammifres). Lune de ses fonctions les plus importantes

concerne cependant les processus bionergtiques : rcemment dcouvert dans la

mitochondrie (Yong and Searcy, 2001), ce rle avait dj t propos et dmontr ds les

annes 1990, notamment chez les bactries photosynthtiques utilisant lH2S comme donneur

dlectrons (Shahak et al., 1992) (Reinartz et al., 1998).

Introduction

13

b) La flavocytochrome c sulfure dshydrognase (FCSD)

La raction catalyse in vitro par la FCSD nest pas sans rappeler celle ralise par la

SQR : lH2S est oxyd en une chane de soufre, et les lectrons issus de cette raction sont

transfrs un accepteur. Dans le cas de la SQR, il sagit dun pool de quinones, alors que

des cytochromes de type c jouent ce rle pour la FCSD. Ces derniers peuvent leur tour

transfrer ces lectrons une cytochrome c oxydase ou un centre ractionnel

photosynthtique suivant les organismes (Brune, 1995a). La nature de laccepteur dlectrons

est en accord avec la localisation de lenzyme, la FCSD tant le plus souvent soluble et

priplasmique. Cependant, des cas de FCSD ancres dans la membrane cytoplasmique par un

peptide signal non-cliv ont galement t rapports (Kostanjevecki et al., 2000; Vert et al.,

2002).

Cette protine est en ralit constitue de deux sous-units distinctes : FccB est une

flavoprotine au repliement trs similaire celui des SQR de 40-47 kDa qui lie lH2S, et FccA

est un cytochrome de type c. Ce dernier peut comporter un seul ou deux hmes c, pour une

masse molculaire de 10 et 21 kDa respectivement. Par exemple, FccA dAllochromatium

vinosum et de Termochromatium tepidum (dont les structures sont connues) possdent deux

hmes (Chen et al., 1994; Hirano et al., 2012) (Figure 4).

Figure 4. Structure de la flavocytochrome c sulfure dshydrognase (FCSD) dAllochromatium vinosum.

FccA est reprsente en bleu, et FccB en gris. Les cofacteurs sont reprsents sous forme de btonnets, le FAD

est en jaune et les hmes de type c sont en rouge. Lidentifiant PDB est 1FCD.

Introduction

14

Le rle in vivo de cette protine nest pas vraiment clair : sil ne fait aucun doute sur la

raction quelle catalyse, des souches mutantes dAllochromatium vinosum dficientes en

FCSD, cultives en prsence dH2S, prsentent un phnotype identique celui de la souche

sauvage, que ce soit au niveau de la croissance ou des taux doxydation de lH2S (Reinartz et

al., 1998). Ceci indique la prsence dun systme alternatif qui ralise lessentiel de

loxydation de lH2S, probablement la SQR. Il a en revanche t propos que la FCSD soit

plus avantageuse dans certaines conditions de croissance non encore identifies, par exemple

dans le cas de concentrations en H2S bien plus faibles que celles couramment utilises en

laboratoire (Brune, 1995a).

2. Oxydation du thiosulfate (S2O32-

)

Le thiosulfate est une molcule stable et abondante dans lenvironnement, et peut tre

rduit ou oxyd par nombre de micro-organismes. Deux voies principales doxydation du

thiosulfate sont prdominantes : la condensation oxydative de deux molcules de thiosulfate

en ttrathionate (S4O62-

) par les thiosulfate : accepteur oxydorductases (thiosulfate

dshydrognase, EC 1.8.2.2), et loxydation complte en sulfate en plusieurs tapes par le

systme Sox (Sulfur Oxidizing system).

a) Thiosulfate : accepteur oxydorductase (TAOR)

La formation de ttrathionate partir de thiosulfate est bien documente chez des

bactries utilisant le thiosulfate comme substrat supplmentaire (mais pas unique), telles que

les Pseudomonas et les Halomonas (Sorokin et al., 1999), ainsi que chez Allochromatium

vinosum, lune des rares bactries phototrophes sulfureuses possder un tel systme. Chez

cette dernire, la protine TsdA oxyde le thiosulfate en ttrathionate avec le ferricyanure

comme accepteur artificiel dlectrons. Cest un monomre de 25,8 kDa, prsent dans le

priplasme, et contenant deux hmes de type c (Denkmann et al., 2012; Hensen et al., 2006).

Elle est assez semblable la thiosulfate dshydrognase dAcidithiobacillus thiooxidans, un

cytochrome de type c de 27,9 kDa (Nakamura et al., 2001). Cependant, la plupart des autres

protines de cette famille sont assez diffrentes les unes des autres, ce qui a t interprt

comme une volution convergente plutt que divergente (Visser et al., 1996).

Introduction

15

Chez Acidianus ambivalens, une thiosulfate : quinone oxydorductase (TQOR)

membranaire a t caractrise (Mller et al., 2004). Ce complexe est compos de quatre

protines : deux copies de la sous-unit DoxA (28 kDa), et deux copies de la sous-unit DoxD

(16 kDa) (Figure 5). Ni lune ni lautre ne comporte de cofacteur, mais des quinones ont t

retrouves lies de manire non-covalente au complexe purifi. Ainsi, le pool de quinones

est identifi comme laccepteur physiologique des lectrons issus de loxydation du

thiosulfate en ttrathionate. Cette dcouverte a son importance, puisque cet accepteur est

diffrent de ce qui avait t caractris jusque l chez les autres organismes (ferricyanure ou

cytochrome c), rvlant ainsi un tout nouveau mcanisme nergtique doxydation du

thiosulfate. Il faut noter que DoxA et DoxD avaient tout dabord t identifies comme des

sous-units faisant partie de la quinol : oxygne oxydorductase (cytochrome aa3) au cours de

sa purification (Purschke et al., 1997). Les travaux mens en 2004 par Mller et

collaborateurs (Mller et al., 2004) montrent ainsi quil sagit en fait de deux complexes

indpendants, mais fonctionnant en synergie, puisque la rduction de loxygne a t mesure

sur des membranes quand le thiosulfate tait ajout au test. Pour la premire fois, il avait ainsi

t montr une nouvelle voie bionergtique associant loxydation du thiosulfate et la

rduction du pool de quinones par la TQOR, la rduction de loxygne par loxydase

terminale (Figure 5).

Figure 5. Modle de la TQOR (DoxAD) dAcidianus ambivalens et lien avec la rduction de loxygne

(DoxBC) (Mller et al., 2004). CQ et CQH2 reprsentent respectivement la caldariella quinone oxyde et rduite.

a, hme de type a ; a3, hme de type a3 ; CuB, centre cuivre B.

Introduction

16

Le devenir du ttrathionate ainsi form nest pas clair. Il a t propos que le

ttrathionate soit rduit chimiquement en prsence dH2S pour donner du thiosulfate et du

soufre lmentaire (Kletzin et al., 2004) (Figure 6), une raction possible in vitro qui est de

plus favorise haute temprature (Xu et al., 1998) (Xu et al., 2000) comme cest le cas chez

larche hyperthermophile Acidianus ambivalens. A noter toutefois quune ttrathionate

hydrolase a t isole partir du pseudo-priplasme dAcidianus ambivalens cultive sur

ttrathionate, protine absente lorsque les cellules sont cultives sur soufre. Cette protine

nest donc pas le partenaire de recyclage du ttrathionate produit par la TQOR (Protze et

al., 2011).

Figure 6. Cycle hypothtique thiosulfate / ttrathionate (Kletzin et al., 2004). Le thiosulfate est oxyd en

ttrathionate par la TQO (=TQOR), et le ttrathionate ragit chimiquement avec lH2S pour donner du soufre

lmentaire S et du thiosulfate.

b) Le systme Sox

Le systme Sox priplasmique (aussi appel TOMES pour Thiosulfate Oxidation

MultiEnzymes System) est constitu de plusieurs enzymes, et est responsable de loxydation

du thiosulfate en sulfate, un cytochrome c jouant le rle daccepteur dlectrons. Il a t isol

pour la premire fois chez Paracoccus versutus (Lu et al., 1985) et Paracoccus pantotrophus

(Friedrich et al., 2001; Rother et al., 2001). Chez cette dernire, il est essentiel loxydation

in vivo du thiosulfate, et catalyse in vitro la rduction de cytochrome de type c couple

loxydation du thiosulfate, du sulfure, du sulfite et du soufre lmentaire.

Quinze gnes codant pour des protines Sox, organiss en groupe, sont retrouvs chez

Paracoccus pantotrophus. Lactivit de ce systme repose sur le produit de sept gnes codant

pour quatre protines priplasmiques (SoxAX, SoxB, SoxYZ et SoxCD) reprsentant le cur

du systme. Si SoxY et SoxZ ne possdent pas de cofacteurs, SoxX comporte un hme de

Introduction

17

type c, SoxA en compte deux (dont un est redox-inactif et lautre directement impliqu dans

la catalyse) (Reijerse et al., 2007), de mme que SoxD, alors que SoxC est une

molybdoprotine (Quentmeier et al., 2000). Enfin, SoxB est monomrique et contient un

centre binuclaire manganse (Epel et al., 2005). Un modle de mcanisme catalytique a t

propos (Friedrich et al., 2001) dans lequel le complexe SoxYZ peut tre vu comme une

plateforme liant le soufre sur lequel les autres acteurs vont agir (Figure 7). En effet, SoxY

possde une cystine conserve (Quentmeier and Friedrich, 2001) sur laquelle SoxAX fixe

une molcule de thiosulfate, puis SoxB ralise le clivage hydrolytique du groupement

sulfonate (-SO3) du thiosulfate en librant une molcule de sulfate (SO4). Sox(CD)2 agit

ensuite comme une soufre dshydrognase en oxydant le dernier atome de soufre encore li

SoxYZ, le transformant en un nouveau groupement sulfonate. SoxB libre alors une dernire

molcule de sulfate, rgnrant ainsi SoxYZ en sa forme de dpart. La participation de

SoxYZ toutes les tapes de loxydation du thiosulfate en fait un pivot du systme Sox : sa

cystine, situe sur un bras flexible, permet aux intermdiaires soufrs daccder aux sites

actifs des autres partenaires du systme (Sauv et al., 2007).

Figure 7. Mcanisme catalytique du systme Sox (Kappler and Maher, 2012). SoxYZ est reprsent par les

formes gomtriques (rond et triangle). Le soufre de la cystine de SoxY est galement reprsent.

Introduction

18

Le rle des autres protines du systme Sox de Paracoccus pantotrophus nest pas

clairement tabli, et seule lappartenance une famille protique, ou un phnotype obtenu

aprs mutation du gne considr, ont pu tre tablis. On sait notamment que les protines

SoxR (rpresseur de la famille ArsR) et SoxS (thiordoxine) sont impliques dans la

rgulation du systme Sox (Rother et al., 2005). La protine membranaire SoxV et la

thiordoxine priplasmique SoxW interviendraient dans une tape de rduction ncessaire la

pleine activit in vivo du systme (Bardischewsky et al., 2006a), et SoxF est une flavoprotine

monomrique possdant une activit sulfure dshydrognase (Quentmeier et al., 2004) dont

linactivation entraine une diminution de lactivit doxydation du thiosulfate in vivo

(Bardischewsky et al., 2006b).

Le systme Sox a t dcouvert chez de nombreux autres organismes, et certaines

diffrences majeures ont t mises en vidence, notamment sur la prsence des protines

accessoires . Par exemple, une nouvelle protine SoxK a t montre comme liant et

stabilisant le complexe SoxAX (Ogawa et al., 2008). SoxA justement ne contient quun seul

hme chez de nombreuses espces dont Allochromatium vinosum, Chlorobaculum tepidum ou

Starkeya novella. Le nombre dhme(s) de SoxA, la prsence ou non de SoxK et la taille de

SoxX ont permis une classification en quatre types phylogntiquement relis du complexe

SoxAX (Kappler and Maher, 2012). A noter galement quun centre cuivre (II)

mononuclaire potentiellement impliqu dans la catalyse a t dcouvert dans le complexe

SoxAX de Starkeya novella, une caractristique qui pourrait tre partage par le mme

complexe dautres organismes (Kappler et al., 2008).

La principale divergence concerne cependant les constituants du cur ractionnel,

puisquun nombre consquent dorganismes ne possdent pas le complexe SoxCD. Cette

absence est corrle la prsence de globules de soufre, gnralement dans le priplasme des

bactries, comme intermdiaire de loxydation du thiosulfate (Hensen et al., 2006) (Frigaard

and Dahl, 2008). Un modle de mcanisme de ce systme Sox tronqu a galement t

propos. La liaison du thiosulfate SoxYZ par SoxAX est identique, de mme que la

libration dun sulfate par SoxB. Cependant, latome de soufre restant du thiosulfate ne peut

pas tre oxyd plus avant, et il est probablement transfr en ltat aux globules de soufre en

croissance par un mcanisme encore inconnu. Alternativement, il peut rester li sur la cystine

de SoxY, et un nouveau cycle catalytique recommence avec la fixation dune nouvelle

molcule de thiosulfate sur ce soufre au lieu de la cystine. La rptition de ces cycles produit

ainsi une chane de soufre dont le devenir est probablement l encore la formation des

Introduction

19

globules de soufre (Kappler and Maher, 2012) (Figure 8). La faon dont cet atome ou cette

chane de soufre est retire de SoxY nest pas connue, mais limplication de la protine SoxL,

appartenant la superfamille des rhodanses, a t rcemment propose dans ce processus de

recyclage de SoxY (Bagchi, 2012; Welte et al., 2009). Un des lments en faveur du lien entre

loxydation du thiosulfate par le systme Sox et la formation des globules de soufre comme

intermdiaires a t fourni par ltude dune souche mutante dAllochromatium vinosum,

altre dans sa capacit produire des globules de soufre (souche dficiente pour les protines

denveloppe des globules) (Prange et al., 2004). La culture de cette souche sur thiosulfate est

alors rendue impossible.

Figure 8. Mcanisme catalytique du systme Sox tronqu (Kappler and Maher, 2012). En labsence de

SoxCD, un atome de soufre reste li sur SoxY, et SoxAX y fixe une nouvelle molcule de thiosulfate. La

rptition de plusieurs de ces cycles entraine la production dune chaine de soufre.

Finalement, les mcanismes catalytiques proposs expliquent galement la capacit du

systme Sox oxyder in vitro dautres composs comme les sulfures, le sulfite ou le soufre

Introduction

20

lmentaire (Sauv et al., 2007) (Figure 9). Cependant, il est encore difficile aujourdhui de

prciser si ce comportement in vitro est le reflet dun fonctionnement in vivo du systme Sox.

Figure 9. Mcanisme catalytique propos du systme Sox avec des substrats alternatifs (Kappler and

Maher, 2012). A, mcanisme avec les sulfures, et B, mcanisme avec le sulfite.

3. Oxydation du sulfite (SO32-

)

Tout comme lH2S, le sulfite est la fois un poison est un lment trs important pour

les organismes ayant un mtabolisme nergtique bas sur le soufre. Cest un compos trs

ractif capable de ragir avec des biomolcules telles que les protines et lADN ; ses

proprits antimicrobiennes sont dailleurs bien connues et mises profit comme agent de

conservation dans lindustrie agro-alimentaire, notamment dans les vins (codes europens

E220-228). Mais il est galement produit de manire endogne, par exemple au cours de

loxydation de composs soufrs en sulfate, et reprsente ainsi une tape intermdiaire de ce

type de mtabolisme. Loxydation des sulfites des fins bionergtiques se fait selon deux

voies principales chez les micro-organismes : la premire est une voie directe et met en jeu

une sulfite : accepteur oxydorductase, et la seconde est une voie indirecte utilisant lAMP,

avec ladnosine-5-phosphosulfate (adnylylsulfate ou APS) comme intermdiaire

ractionnel (Figure 10).

Introduction

21

Figure 10. Les deux voies doxydation du sulfite en sulfate (Kappler and Dahl, 2001). La voie de gauche est la

voie directe mettant en jeu une SAOR, la voie de droite est celle de lAPS, ou voie indirecte impliquant une APS

rductase ainsi quune ATP sulfurylase ou lAPAT.

a) Sulfite: accepteur oxydorductase (SAOR)

Ce type denzyme fait partie de la grande famille des sulfites oxydases, des protines

molybdne reprsentes dans toutes les branches de la vie, qui oxydent le sulfite en sulfate

(Kappler, 2011). Les sulfite oxydases sont impliques dans divers processus comme la

dgradation des organosulfonates (Denger et al., 2008), la rsistance de bactries pathognes

au systme immunitaire (Myers and Kelly, 2005), la dtoxification du sulfite ou son

utilisation des fins bionergtiques.

Lun des systmes les mieux connus chez les bactries est le complexe priplasmique

SorAB de Starkeya novella, compos dune sous-unit molybdne de 40 kDa et dune petite

sous-unit de type cytochrome c de 9 kDa (Figure 11) (Kappler and Bailey, 2005; Kappler et

al., 2000). Cette organisation htrodimrique, ainsi que le mode daction de cette enzyme,

rappelle clairement les FCSD : en effet, le sulfite est oxyd au niveau de la sous-unit

molybdne, et les lectrons sont transfrs lhme de la petite sous-unit puis un autre

cytochrome c de la bactrie. Un systme analogue a t montr dans le priplasme de la

bactrie thermophile Thermus thermophilus (Figure 12), bien que le fonctionnement en

Introduction

22

complexe des deux protines nait pas t montr (Robin et al., 2011). De plus, la plus petite

des sous-units possde deux hmes au lieu dun seul.

Figure 11. Structure de la sulfite : cytochrome c oxydorductase de Starkeya novella. SorA est reprsente

en gris, et SorB en bleu. Le cofacteur molybdne (molybdoptrine, en violet) et lhme de type c (en rouge)

sont reprsents sous formes de btonnets. Lidentifiant PDB est 2BPB.

Figure 12. Modle de loxydation du sulfite chez Thermus thermophilus (Robin et al., 2011). La SAOR

oxyde le sulfite en sulfate et transfre les deux lectrons librs son partenaire, le cytochrome c550, lequel va

ensuite les transfrer au cytochrome c552. Ces lectrons vont permettre de rduire laccepteur terminal,

loxygne, via les oxydases terminales de type ba3 ou caa3. La voie classique complexe bc1-cytochrome c552-

oxydases terminales est galement reprsente.

Introduction

23

Une activit SAOR a galement t dtecte dans les membranes dAcidianus

ambivalens et Acidianus tengchongensis (Chen et al., 2005; Zimmermann et al., 1999), mais

lenzyme responsable na pas t purifie. Cette localisation membranaire suggre un pool

de quinones comme accepteur dlectrons, mais lactivit na pu tre mesure quen prsence

de ferricyanure (utilis pour mimer lhme des cytochromes), la catalyse nayant pas eu lieu

en prsence de quinones. Aucun cytochrome de type c nayant t dtect chez les

Sulfolobales dont font partie les Acidianus (Laska et al., 2003; Schfer et al., 1996), les

auteurs envisagent la possibilit dun biais exprimental pour expliquer labsence dactivit

quinone-dpendante.. Cependant, des rsultats non-publis mais voqus dans une revue

(Kletzin et al., 2004) prsentent la dcylubiquinone comme accepteur artificiel dlectrons.

Il faut enfin noter que loxydation directe in vitro du sulfite par la cytochrome c

oxydase de type aa3 (oxydase terminale) dAciditiobacillus ferrooxidans a rcemment t

rapporte (Sugio et al., 2010).

b) Voie de lAPS

Cette voie qualifie dindirecte est nergtique par la production dATP quelle gnre

partir du sulfite. La premire tape de cette voie de lAPS est ralise par une APS rductase

(ou adnylylsulfate rductase, EC 1.8.99.2) qui consomme le sulfite et lAMP pour donner de

lAPS (Figure 13 raction 1). La seconde partie est plus variable, deux systmes tant

retrouvs suivant les organismes. Chez Allochromatium vinosum par exemple, une ATP

sulfurylase (ou ATP : sulfate adnylyltransfrase, EC 2.7.7.4) utilise lAPS et un pyrosphate

(PPi) pour gnrer de lATP et du sulfate (Figure 13 raction 2), alors que chez Acidianus

ambivalens, deux tapes sont ncessaires pour gnrer de lATP (Zimmermann et al., 1999).

Une adnylylsulfate : phosphate adnylyltransfrase (APAT, anciennement ADP sulfurylase)

produit de lADP et du sulfate partir dAPS et de phosphate (Figure 13 raction 3), puis

ladnylate kinase convertit deux molcules dADP en ATP et AMP (Figure 13 raction 4).

Introduction

24

Figure 13. Ractions catalyses par les diffrentes enzymes de la voie indirecte de lAPS. Les structures de

lAMP, de lAPS, de lADP et de lATP sont montres, et la partie qui va subir des modifications est encadre en

rouge. La premire tape est toujours catalyse par lAPS rductase, alors que la suite de la voie dpend des

organismes. Une premire possibilit nimplique quune seule enzyme (ATP sulfurylase) et une seule raction

qui gnre de lATP et du sulfate ; dans lautre cas, laction combine de lAPAT et de ladnylate kinase mne

au mme rsultat.

Les acteurs de cette voie ont pu tre caractriss chez certains organismes : lATP

sulfurylase de la bactrie symbiote du ver marin Riftia pachyptila est un homodimre de 90

kDa environ (Beynon et al., 2001), alors que celle dAllochromatium vinosum a t isole

sous forme dun monomre de 45 kDa (Frigaard and Dahl, 2008). LAPAT de Thiobacillus

denitrificans est, elle, un homodimre compos de sous-units de 41,4 kDa. Concernant

lAPS rductase la forme physiologique est un htrodimre constitu dune sous-unit AprA

de 70-80 kDa liant un FAD et dune sous-unit AprB de 18- 23 kDa liant deux centres [4Fe-

4S] (Fritz et al., 2000; Hipp et al., 1997; Speich et al., 1994). Un mcanisme catalytique a

galement t propos dans lequel le sulfite forme un complexe avec le FAD, puis la raction

Introduction

25

avec lAMP a lieu pour donner de lAPS, les deux lectrons tant transfrs via la flavine aux

centres fer-soufre.

Ces ractions ont lieu dans le cytoplasme : APAT et ATP sulfurylase sont clairement

solubles et localises dans le cytoplasme (Brser et al., 2000; Brune, 1995a), alors que lAPS

rductase peut tre soit soluble et localise dans le cytoplasme soit lie la membrane (et

oriente vers le cytoplasme). On retrouve en effet chez Allochromatium vinosum un opron

constitu des gnes sat (ATP sulfurylase) et aprMBA (APS rductase), o AprM serait une

ancre membranaire putative non caractrise (Frigaard and Dahl, 2008). Chez dautres

bactries ne possdant pas AprM, telles que Chlorobaculum tepidum, on retrouve les gnes

codant pour lATP sulfurylase et lAPS rductase clustriss avec ceux codant pour un

complexe membranaire nomm Qmo (Quinone-interacting membrane-bound oxidoreductase).

Ce complexe est compos de trois sous-units, QmoABC, avec QmoA et QmoB

cytoplasmiques, et QmoC membranaire. Il aurait notamment pour rle de capter les lectrons

produits pendant loxydation du sulfite par lAPS rductase, et de les insrer dans les chanes

respiratoires via le pool de quinones (Pires et al., 2003; Rodriguez et al., 2011) (Figure

14). Il a donc t propos que la protine AprM joue le mme rle que le complexe Qmo chez

les bactries o elle est prsente (Frigaard and Dahl, 2008).

Figure 14. Modle de la voie de lAPS chez Chlorobaculum tepidum impliquant le complexe membranaire

Qmo (Rodriguez et al, 2011). Les lectrons issus de loxydation du sulfite sont capts par le complexe Qmo et

transfrs au pool de quinones. MK, mnaquinone ; ApsBA, APS rductase ; Sat, ATP sulfurylase ; b, hme

de type b ; FeS, centre [4Fe-4S] ; FAD, site de fixation du cofacteur FAD ; 4C, motif cystine conserv.

Introduction

26

4. Oxydation du soufre stock dans les globules

Comme il a t dit prcdemment, loxydation du thiosulfate par un systme Sox ne

possdant pas la soufre dshydrognase SoxCD conduit lapparition de globules de soufre

comme intermdiaires ractionnels (Chapitre I, II.A.2.b). Dautres situations, comme par

exemple loxydation de lH2S par les bactries phototrophes sulfureuses, conduisent

galement la formation de ces globules de soufre (Figure 15). Le mcanisme de stockage de

ce soufre de manire transitoire, dans le priplasme ou lextrieur des cellules, est encore

mal dcrit. En revanche, la faon dont il est ensuite utilis est mieux connue et repose

notamment sur un systme nomm Dsr pour Dissimilatory Sulfite Reductase (Dahl et al.,

2005; Holkenbrink et al., 2011; Pott and Dahl, 1998). Chez les organismes sulfato-rducteurs,

o le systme Dsr a tout dabord t dcrit, cette voie catalyse la rduction du sulfite en H2S

au cours de la dernire tape de la respiration du sulfate (Matias et al., 2005). Mais chez les

bactries phototrophes produisant des globules de soufre, telle quAllochromatium vinosum, la

voie fonctionne en sens inverse, le soufre lmentaire des globules tant oxyd en sulfite.

Figure 15. Bactries sulfureuses phototrophes prsentant des globules de soufre (Frigaard and Dahl, 2008)

(Frigaard et Dahl, 2008). A, Thiocapsa sp. et ses globules intracellulaires (zones claires) vue au microscope

optique. B, globules de soufre lextrieur de Chlorobium phaeovibrioides. C, globules intracellulaires

(priplasmiques) de Thiocystis violaceae. D, globule de soufre chez Thiocapsa roseopersicina dont lenveloppe

protique est bien visible. Le traitement des cellules pour la microscopie lectronique (C et D) a provoqu la

disparition du soufre, le globule est ainsi vu comme un trou dans la bactrie.

Introduction

27

Chez Allochromatium vinosum, un groupe de quinze gnes, dsigns

dsrABEFHCMKLJOPNRS, code pour les protines de ce systme pour lesquelles un rle

prcis na pas encore t clairement tabli. Lun des composants majeurs est le complexe

cytoplasmique DsrAB, constitu de deux sous-units A et deux sous-units B, qui catalyse

loxydation du soufre issu des globules en sulfite. Le groupement prosthtique de ce

complexe a t identifi comme un siroamide-[4Fe-4S], le siroamide tant une forme

modifie (amide) du sirohme dont la structure est assez proche de celles des hmes

classiques. DsrN a t propose comme une enzyme de maturation catalysant lamidation

glutamine-dpendante du sirohme (Lubbe et al., 2006). La fusion des gnes dsrN et dsrR

chez une bactrie chimiotrophe oxydant le soufre, endosymbiote de Calyptogena magnifica

(Newton et al., 2007), a permis denvisager que DsrR soit galement implique dans la

biosynthse du sirohme. Cependant, des tudes plus rcentes suggrent plutt un rle

essentiel de cette protine dans la rgulation post transcriptionnelle du systme Dsr (Grimm et

al., 2010). DsrC est une petite protine cytoplasmique possdant des rsidus cystine trs

conservs en position C-terminale. DsrEFH est un complexe cytoplasmique de 75 kDa de la

forme 222 possdant galement des cystines conserves (Dahl et al., 2005). Enfin, un

complexe DsrMKJOP transmembranaire et transporteur dlectrons est absolument requis

pour loxydation du soufre prsent dans les globules (Sander et al., 2006). Il est compos de la

protine membranaire DsrM comportant deux hmes b, dune seconde protine membranaire

DsrP, de la protine cytoplasmique fer-soufre DsrK, et des protines priplasmiques DsrJ et

DsrO qui sont respectivement un cytochrome c trihmique et une protine centre fer-soufre

(Grein et al., 2010a; Grein et al., 2010b). Enfin, DsrS est cytoplasmique mais sans fonction

attribue. Le rle de DsrL nest pas non plus clairement tabli : cest une flavoprotine

cytoplasmique centre fer-soufre possdant une activit NADH : accepteur oxydorductase.

Son importance a pourtant t dmontre par linhibition complte de loxydation des

globules de soufre provoque par la dltion du gne dsrL (Lubbe et al., 2006).

Le mcanisme par lequel le soufre stock dans les globules est oxyd par le systme

Dsr est encore mal compris. On ignore notamment par quel moyen ce soufre

extracytoplasmique est transport dans le cytoplasme pour y tre utilis. Un premier modle a

t propos dans lequel il est pris en charge sous la forme dun persulfure par un transporteur

de type glutathion amide afin de traverser la membrane interne, puis il est libr par DsrL

sous forme de sulfure dhydrogne grce aux lectrons fournis par le NADH. Ce sulfure serait

finalement oxyd par DsrAB, les lectrons tant transfrs au pool de quinones via le

Introduction

28

complexe DsrMKJOP (Frigaard and Dahl, 2008). Cependant, les tudes menes ces dernires

annes ont permis de brosser un tableau un peu diffrent, mais nanmoins plus prcis et plus

complet du mcanisme mis en jeu par le systme Dsr. Il a ainsi t montr chez

Allochromatium vinosum que le complexe soluble DsrEFH tait capable dinteragir avec

DsrC, et que la cystine 78 de DsrE tait essentielle cette interaction (Dahl et al., 2008). Une

autre interaction entre DsrK et DsrC a galement t dvoile, et la rduction par DsrK dun

pont disulfure form par les cystines 100 et 111 de DsrC a t propose (Grein et al., 2010a).

Un transfert de soufre de DsrEFH vers DsrC a finalement t dmontr ; lensemble de ces

rsultats a permis de proposer un nouveau mcanisme catalytique pour le systme Dsr (Figure

16) (Stockdreher et al., 2012).

Figure 16. Modle du mcanisme catalytique du systme Dsr chez Allochromatium vinosum (Stockdreher et

al., 2012). Le mcanisme est dcrit dans le texte. S reprsente les globules de soufre lmentaire

priplasmiques, RSH et RSSH reprsente le compos navette hypothtique charg du transport du soufre du

priplasme au cytoplasme, dans sa forme native et persulfure. DsrEFH ne sont reprsentes que par EFH pour

des questions de lisibilit.

Introduction

29

Le transport du soufre dans le cytoplasme se fait par un mcanisme encore inconnu, il

est transfr au complexe DsrEFH sur la cystine 78 de DsrE sous forme de persulfure

probablement via une protine non-identifie. Latome de soufre est alors transfr sur la

cystine 111 de DsrC (la cystine devient persulfure), puis DsrAB vient oxyder ce soufre li

en un groupement sulfonate (-SO3-), librant ainsi six lectrons. Le sulfonate fix sur DsrC est

libr sous forme de sulfite par la cration dun pont disulfure intramolculaire (cystines 100

et 111 de DsrC). Linteraction de DsrC avec le complexe DsrMKJOP, et plus particulirement

avec DsrK, va permettre la rduction de ce pont disulfure grce aux lectrons fournis par le

complexe, probablement partir de quinones. Dans ce processus, DsrEFH et DsrC agissent

comme un systme-relai pour le soufre, DsrAB est le catalyseur de loxydation, et le

complexe membranaire DsrMKJOP permet de rgnrer DsrC sous sa forme de dpart.

Linterrogation principale sur ce systme est maintenant de comprendre comment le

soufre stock dans les globules est transport dans le cytoplasme et transfr DsrEFH. Il

avait t propos laction dun compos de type glutathion amide, mais il a t montr que ni

DsrEFH ni DsrC ntaient capables de lier du soufre partir de composs de faible poids

molculaire comme le thiosulfate ou le glutathion. Lintervention dune autre protine liant le

soufre, ventuellement partir dun glutathion amide, et interagissant avec DsrEFH afin de

transfrer son substrat est envisage ; cette interaction pourrait tre mdie par la cystine 20

de DsrH, puisquil a t montr quelle est essentielle loxydation du soufre contenu dans

les globules par le systme Dsr.

B) La rduction du soufre : soufre/polysulfure rductase

De nombreux organismes sont capables de crotre en utilisant lhydrogne et le soufre

lmentaire ou le polysulfure (deux types de chanes de soufre, Figure 1) respectivement

comme donneur et comme accepteur dlectrons. Cette activit doxydation de lhydrogne et

de rduction du soufre lmentaire (ou du polysulfure) en H2S peut tre porte par une seule

enzyme, comme cest le cas des sulfhydrognases solubles de Pyrococcus furiosus par

exemple (Ma et al., 1993; Ma et al., 2000). Cependant, le cas gnral implique plutt la

prsence de deux enzymes membranaires (constitues de plusieurs sous-units) travaillant de

concert, une hydrognase et une soufre (ou polysulfure) rductase.

Introduction

30

Chez les arches, deux types dorganisation ont t dvoils : Acidianus ambivalens

prsente ainsi deux enzymes physiquement spares mais relies par des quinones (Laska et

al., 2003), alors que chez lhyperthermophile Pyrodictium abyssi, cette voie se retrouve sous

la forme dun supercomplexe (Dirmeier et al., 1998), c'est--dire lassociation stable et

fonctionnelle de deux complexes (ici le complexe hydrognase et le complexe soufre

rductase). Dans ce dernier cas, le supercomplexe membranaire, dune masse molculaire de

520 kDa, est compos de neuf sous-units diffrentes, parmi lesquelles une hydrognase

nickel-fer, la soufre rductase, et des hmes de type b et c. De manire intressante, aucune

quinone na t retrouve dans le supercomplexe purifi, et lactivit H2 : soufre

oxydorductase in vitro nen ncessite pas non plus. Le squenage N-terminal des sous-

units de 82 et de 24 kDa montre des similarits avec les sous-units SreA et SreB de la

soufre rductase dAcidianus ambivalens, laquelle fait partie des molybdoenzymes de la

famille des DMSO rductases : il en a donc t conclu que la soufre rductase de Pyrodictium

abyssi est galement une molybdoenzyme de cette famille, bien que ni molybdne, ni

tungstne (qui le remplace souvent chez les arches) nont t retrouvs dans le

supercomplexe. Les auteurs proposent que ces mtaux soient perdus durant les tapes de

purification, mais, le fait quune activit soufre rductase soit observe vient contredire cette

hypothse.

Dans le cas dAcidianus ambivalens, la soufre rductase purifie partir des

membranes solubilises rduit le soufre lmentaire en prsence dune hydrognase co-

purifie, et de quinones ou de cytochrome c comme transporteurs dlectrons in vitro.

Labsence de cytochrome c chez cet organisme a conduit proposer les quinones comme

navette lectronique physiologique. Les deux enzymes peuvent tre spares par des tapes de

purification supplmentaires, mais lactivit de la soufre rductase est alors perdue, alors que

celle de lhydrognase est conserve. Les deux enzymes ont une mme masse denviron 250

kDa ; lanalyse des complexes purifis ainsi que des groupes de gnes codant pour ces

protines ont montr quelles sont constitues de plusieurs sous-units : SreA et SreB

prsentent des similarits de squence avec la sous-unit catalytique et celle centres [4Fe-

4S] respectivement des molybdoprotines de la famille des DMSO rductases (Figure 17).

De plus, SreA contient en N-terminal un motif twin arginine , indiquant son export vers le

priplasme. SreC est lancre membranaire du complexe, et SreD est une polyferrdoxine

putative contenant 26 cystines, dont le rle nest pas identifi au sein du complexe. Il existe

Introduction

31

galement une protine SreE qui serait une protine chaperon spcifique implique dans

linsertion du cofacteur molybdne dans la sous-unit SreA.

Figure 17. Modle de la voie anarobie hydrogne-soufre chez Acidianus ambivalens ( gauche) et

Wolinella succinogenes ( droite) (Laska et al., 2003). Sre et Psr sont les soufre et polysulfure rductases, Hyn

reprsente lhydrognase, SQ et MK symbolisent les quinones. Les cofacteurs de chaque sous-unit sont

reprsents.

Concernant lhydrognase, elle est code par un groupe de douze gnes incluant les

sous-units nickel-fer catalytique et centre fer-soufre, ainsi que certaines des protines de

maturation ddies ce systme. L encore, une ancre membranaire ainsi quun motif twin

arginine prsent dans la squence de la sous-unit fer-soufre placent lhydrognase dans la

membrane avec une orientation priplasmique (Figure 17). On a donc deux enzymes spares

mais relies par des quinones, constitues de plusieurs sous-units, ancres dans la membrane

et orientes vers le priplasme. Cette organisation est trs clairement identique celle de la

voie hydrogne-polysulfure caractrise chez la bactrie msophile Wolinella succinogenes,

associant loxydation de lhydrogne la rduction du polysulfure via des quinones, bien que

certaines sous-units additionnelles soient prsentes pour chaque enzyme dAcidianus

ambivalens (Figure 17) (Dietrich and Klimmek, 2002) (Laska et al., 2003).

Introduction

32

Le polysulfure peut galement servir daccepteur terminal dlectrons lors de la

croissance anarobie de la bactrie Thermus thermophilus. Sa rduction en H2S est assure

par une polysulfure rductase utilisant les quinones rduites comme donneurs dlectrons, et

dont la structure tridimensionnelle a rcemment t dtermine (Jormakka et al., 2008)

(Figure 18). Lenzyme elle-mme est compose de trois sous-units (PsrABC), dont une ancre

membranaire (PsrC) portant le site de fixation des quinones et permettant la dimrisation du

complexe, une sous-unit quatre centres [4Fe-4S] (PsrB) et une sous-unit catalytique

(PsrA) portant un centre [4Fe-4S] align avec ceux de PsrB en plus dun cofacteur

molybdne (bis-MGD). Comme dans le cas des autres molybdoenzymes de la famille des

DMSO rductases, ce site catalytique nest donc pas expos en surface de la protine mais

enfoui au fond dune cavit en forme dentonnoir dont lentre est tapisse de rsidus

basiques pouvant interagir avec le polysulfure anionique.

Figure 18. Structure de la polysulfure rductase de Thermus thermophilus (Jormakka et al., 2008). Le

cofacteur molybdne (bis-MGD) est reprsent en sphres oranges, le molybdne est une sphre noire. Les

centres [4Fe-4S] sont reprsentes par des sphres jaunes et rouges, et lanalogue de quinone est en sphres

noires. La distance entre les centres redox est indique droite de ces derniers en . Larc rouge reprsente la

cavit en entonnoir de la sous-unit catalytique PsrA. Lidentifiant PDB est 2VPZ.

Introduction

33

C) Un cas particulier : la dismutation du soufre (SOR)

En 1989, Kletzin publie chez larche thermoacidophile Desulfurolobus ambivalens

(renomme depuis Acidianus ambivalens) la purification partir du cytoplasme dune enzyme

responsable de la dismutation oxygne-dpendante du soufre lmentaire en sulfite,

thiosulfate et sulfure dhydrogne. Cette raction ncessite imprativement de loxygne,

mais aucun cofacteur externe ou donneur dlectrons nest requis. La protine, portant la

fois lactivit doxydation et de rduction du soufre, est ainsi baptise SOR pour Soufre

Oxygnase Rductase (Kletzin, 1989). Depuis, plusieurs SOR ont t dtectes dans les

gnomes, certaines ont galement t caractrises biochimiquement et/ou structuralement,

rvlant ainsi que cette protine nest pas lapanage des organismes hyperthermophiles

comme cela tait suppos auparavant (Figure 19) (Veith et al., 2012).

Figure 19. Arbre phylogntique des squences de SOR disponibles dans GenBank (daprs (Veith et al.,

2012)). Le squences soulignes indiquent quune activit SOR a t dmontre dans lextrait cellulaire, en gras

sont reprsentes les SOR caractrises biochimiquement, celles soulignes deux fois ont t cristallises et leur

structure dtermine. La temprature optimale de croissance de lorganisme est symbolise par le code couleur :

rouge, > 70C ; orange, 51 70C ; vert, 40 50C ; bleu, environ 30C ; noir, inconnue. Uncult, organisme non

cultiv ; Ferropl, Ferroplasma ; Sulfob, Sulfobacillus ; Desulfom, Desulfomicrobium ; Acidithiob,

Acidithiobacillus ; Halothiob, Halothiobacillus.

Introduction

34

1. Ractions catalyses

En fait, lactivit de la SOR peut tre vue comme deux ractions diffrentes, mais que

lon ne peut pas sparer :

Oxygnase : S + O2 +H2O HSO3- + H

+

Dismutation : 3S + 3H2O 2H2S + HSO3- + H

+

SOR : 4S + 3H2O + O2 2H2S + 2HSO3- + 2H

+

Cependant, il nest toujours pas certain que le thiosulfate soit vritablement un produit

direct de la SOR, puisquen effet, une raction non-enzymatique entre le sulfite et le soufre

lmentaire en excs a lieu haute temprature, avec le thiosulfate comme produit. De

manire pratique, il est difficile de dterminer avec prcision le devenir des produits de la

raction in vitro : outre la formation du thiosulfate dj mentionne, une oxydation rapide et

non-enzymatique de lH2S par loxygne a galement lieu (Veith et al., 2011).

2. Structure et architecture

Si la raction catalyse par la SOR nest dj pas vraiment conventionnelle, son

organisation architecturale est quant elle tout fait remarquable. A lheure actuelle, seules

deux structures de SOR sont disponibles : la premire provient dAcidianus ambivalens

(Urich et al., 2006), et la seconde dAcidianus tengchongensis (Li et al., 2008b). Ces deux

structures sont extrmement proches, et montrent que la forme physiologique de la SOR est

une sphre creuse de 24 sous-units identiques (icosattramre) denviron 845 kDa pour un

diamtre extrieur de 15 nm.

a) Le monomre

Concernant le monomre, il sagit dune structure constitue dun tonneau (lui-

mme form par huit brins antiparallles) partiellement entour de neuf hlices , pour un

poids molculaire de 35 kDa. De manire intressante, il peut tre partag en deux moitis

peu prs gales pseudo-symtriques. Chaque moiti de la protine prsente une topologie

qui rappelle le motif ()2 des ferrdoxines (Figure 20). La prsence de deux domaines

Introduction

35

similaires au sein dune protine, dont les squences sont gnralement peu conserves, est

rvlatrice dune duplication suivie dune fusion dun mme gne ancestral. Les ferrdoxines

en sont dailleurs lexemple de rfrence (Dayhoff et al., 1983).

Figure 20. Le monomre de la SOR rsulte dun vnement de duplication/fusion dun gne ancestral

(Urich et al., 2006). A, structure du monomre de la SOR, montrant laxe de symtrie partageant la protine en

deux domaines similaires. B, schma de la topologie en ()2 des ferrdoxines. Les triangles reprsentent les

brins et les cercles des hlices . Lunit () N-terminale est en jaune, celle en C-terminal est en vert. C,

topologie de la SOR, la lgende est identique B. On remarque la ressemblance entre chaque moiti de la

SOR et avec les ferrdoxines.

Chaque monomre comporte une poche catalytique enfouie (Figure 21), constitue de

trois cystines (Cys31, Cys101 et Cys104, numrotation identique pour les deux espces

dAcidianus) et dun atome de fer non-hmique de bas potentiel (Urich et al., 2004). Les trois

cystines sont importantes pour lactivit : dans le cas dAcidianus ambivalens, seule la

cystine 31 est absolument essentielle, une activit rsiduelle tant dtecte lorsque lune des

autres cystines est mute (Urich et al., 2005). En revanche, les trois cystines semblent

indispensables chez Acidianus tengchongensis (Chen et al., 2005). De plus, la cystine 31 est

retrouve sous forme persulfure dans la structure cristallographique de la SOR dAcidianus

ambivalens, alors quil sagit dune cystine normale dans le cas dAcidianus

tengchongensis. Cette cystine est probablement le site de fixation du substrat soufr.

Introduction

36

Figure 21. Site catalytique dun monomre de la SOR dAcidianus Tengchongensis (Li et al., 2008b). Les

deux couleurs correspondent simplement la superposition des structures obtenues avec deux cristaux diffrents.

Les acides amins importants sont montrs sous forme de btonnets, latome de fer est reprsent par une grosse

sphre, et la molcule deau par une petite sphre.

La sphre de coordination de latome de fer comprend deux histidines et un acide

glutamique runis dans un motif H-X3-H-X23-E, ainsi que deux molcules deau dans le cas

dAcidianus ambivalens (une seule pour Acidianus tengchongensis). Cette diffrence rsulte

probablement de conditions de cristallisation diffrentes, et ces deux structures sont donc

certainement deux tats diffrents de la SOR, ne constituant donc pas une divergence de

caractristiques entre les deux protines. La position de cette molcule deau perdue a t

propose comme site de liaison de loxygne au fer au cours de la catalyse (Li et al., 2008b;

Urich et al., 2006). Ce mme fer jouerait le rle dactivateur de loxygne.

b) La protine entire

Cest lorganisation architecturale globale de la SOR qui en fait une protine aussi

singulire et intressante. En effet, la sphre creuse forme par les 24 sous-units est un

vritable nanocompartiment protique dans lequel les mouvements des substrats et des

produits sont troitement contrls (Figure 22).

Introduction

37

La premire chose noter est que les 24 sites actifs sont isols du milieu extrieur,

profondment enfouis dans chaque monomre et accessibles uniquement partir de la cavit

centrale de la sphre via un canal troit. La poche catalytique est ainsi ferme par deux

mthionines et une phnylalanine dont les chanes secondaires sont assez flexibles pour

permettre lentre du substrat (Urich et al., 2006) (Veith et al., 2011).

Figure 22. Cheminement du substrat et des produits dans la SOR (daprs (Li et al., 2008b) et (Veith et al.,

2011)). Le substrat entre (flche jaune pleine) dans la SOR via une des chemines quatre monomres (A) et

rentre dans un des sites catalytiques en passant par le pore dun monomre (entour en jaune). Les produits

(flche jaune en pointills) ressortent par ce mme pore et sont finalement vacus de la SOR par un canal

constitu de trois monomres (B). A et B, les canaux sont vus de face.

Ceci pose la question de la voie dentre du substrat lintrieur de la sphre.

Lexamen de la surface de la SOR montre lexistence de six protubrances, chacune

constitue par quatre monomres indpendants. Ces six protubrances forment chacune une

Introduction

38

sorte de chemine reliant le milieu extrieur la cavit centrale (Figure 22). La surface

interne de ces chemines est uniquement constitue de rsidus phnylalanine et valine, ce qui

la rend hautement hydrophobe. Cette caractristique est en accord avec la nature hydrophobe

du substrat soufr, ce qui fait de ces chemines un point daccs parfaitement plausible

lintrieur de la sphre. Dun point de vue fonctionnel, on peut les interprter comme des

sortes de filtres substrats qui prviendraient ainsi loxydation de composs indsirables

(Urich et al., 2006) (Veith et al., 2011).

Une fois le substrat entr dans lenzyme et transform dans la poche catalytique, les

produits de la raction empruntent un dernier canal pour sortir de la SOR. Ce canal troit est

form par trois monomres distincts, la forme physiologique de la protine possde donc huit

de ces canaux de sortie (Figure 22). Un argument en faveur de cette fonction concerne la

charge de leur surface intrieure : des rsidus srine et arginine confre un caractre

hydrophile et une charge globale positive tout fait en adquation avec la nature des produits

(Li et al., 2008b; Veith et al., 2011).

Ces donnes structurales ont galement permis dmettre une hypothse quant la

nature vritable du substrat. Le test in vitro est en effet ralis avec de la fleur de soufre, c'est-

-dire le cyclo-octasoufre insoluble. Les modlisations ont montr que celui-ci est trop

volumineux pour passer par la chemine dentre ou pntrer dans la poche catalytique sans

subir dimportantes modifications structurales. Le polysulfure, linaire et soluble, est en

revanche un bien meilleur candidat (Urich et al., 2006).

3. Vue gnrale du fonctionnement de la SOR

Les lments disponibles en matire darchitecture et de catalyse permettent de

proposer un ordre squentiel du fonctionnement de la SOR. En premier lieu, le soufre, sous

forme linaire, passe dans la cavit centrale de la protine via une des six chemines

hydrophobes formes par quatre monomres. Ensuite, il pntre dans la poche catalytique

enfouie dans chaque monomre via un nouveau canal de ce mme monomre. Il se lie

covalemment la cystine 31 (persulfure chez Acidianus ambivalens) et saligne par rapport

latome de fer non-hmique liant loxygne. La premire raction (oxygnase) a alors lieu,

suivie de la dismutation du soufre dans laquelle les cystines 101 et 104 jouent probablement

un rle (en plus de stabiliser le substrat). Les produits sortent finalement de la poche

Introduction

39

catalytique puis de la SOR en empruntant lun des huit canaux hydrophiles chargs

positivement forms par trois monomres (Figure 22).

III) Complexit des mtabolismes nergtiques du soufre :

quelques exemples

Les organismes capables doxyder le soufre ne prsentent gnralement pas quun seul

type de protines correspondant un compos soufr donn, mais plutt un ensemble de voies

leur permettant de prendre en charge diffrents composs capts directement dans le milieu ou

produits comme intermdiaires ractionnels. Parmi ces organismes, certains ont t trs

largement tudis, et si de nombreuses questions attendent encore une rponse, des modles

de leur mtabolisme nergtique bas sur le soufre ont toutefois pu tre labors.

A) Les arches thermoacidophiles : Acidianus ambivalens

Acidianus ambivalens est une arche de lordre des Sulfolobales : comme tous les

membres de ce groupe, elle se dveloppe haute temprature (optimum : 72-86C) et pH

trs bas (optimum : 2,5) (Fuchs et al., 1996). On la retrouve dans des environnements

dorigine volcanique de types solfatares, sources chaudes, chemines hydrothermales

caractrises entre autre par leur forte teneur en composs soufrs, notamment en soufre

lmentaire et sulfure dhydrogne. Il est donc logique que le mtabolisme nergtique de ces

organismes soit essentiellement bas sur le soufre.

De nombreuses tudes ont port sur le mtabolisme nergtique dAcidianus

ambivalens, et un modle assez dtaill de son fonctionnement a ainsi pu tre propos

(Kletzin et al., 2004) (Figure 23).

Introduction

40

Figure 23. Modle du mtabolisme nergtique du soufre en condition arobie chez Acidianus ambivalens

((Kletzin et al., 2004) et (Brito et al., 2009)). CQ, caldariella quinone ; SAOR, sulfite : accepteur oxydorductase

; TQO, thiosulfate : quinone oxydorductase ; SQR, sulfure : quinone oxydorductase ; SOR, soufre oxygnase

rductase.

Cette arche est capable de crotre dans deux types de conditions dans lesquelles le

soufre va tre soit oxyd, soit rduit. En condition anarobie, lhydrogne et le soufre

lmentaire servent respectivement de donneur et daccepteur dlectrons. La voie mise en

place, mettant en jeu une hydrognase et une soufre rductase membranaires orientes vers le

pseudo-priplasme et relies par un pool de quinones, a t prcdemment dcrite ( Figure

17). Le produit final de cette chane respiratoire est le sulfure dhydrogne (Laska et al.,

2003). Une seconde condition de croissance, arobie, repose sur loxydation oxygne-

dpendante du soufre lmentaire, avec lacide sulfurique (H2SO4) comme produit final du

mtabolisme (Kletzin et al., 2004). Il a t montr par les diffrentes tudes que la SOR est

lenzyme-cl de ce mtabolisme nergtique, en ralisant la premire tape de loxydation du

soufre lmentaire (Figure 23). Si elle ne fournit aucun potentiel nergtique (pas de

libration dlectron ou de phosphorylation de substrat), elle permet toutefois de transformer

Introduction

41

le soufre en espces pouvant tre oxydes par dautres enzymes au travers de ractions

mettant en jeu des quinones. Ainsi, lH2S est oxyd par la SQR en chane de soufre (laquelle

peut de nouveau tre utilise comme substrat par la SOR), le sulfite est utilis soit par la

SAOR membranaire et directement oxyd en sulfate (lacide sulfurique H2SO4 est la forme

protone de lion sulfate SO42-

), soit par la voie de lAPS au travers des enzymes

cytoplasmiques APS rductase, APAT et adnylate kinase pour donner de lATP et du sulfate.

Enfin, le thiosulfate est oxyd en ttrathionate par la TQOR, ce ttrathionate pouvant tre re-

rduit par lH2S en thiosulfate, lH2S devenant du soufre lmentaire. Le pool de quinones

rduit par la SQR, la SAOR et la TQOR est finalement utilis par une quinol : oxygne

oxydorductase pour rduire lO2 en H2O, qui fait donc le lien entre les mtabolismes du

soufre et de loxygne.

Finalement, ce qui ressort de ce modle, cest une vritable mise profit des diffrents

degrs doxydation du soufre, avec des enzymes dont la localisation, membranaire ou

cytoplasmique, et la spcificit de substrat permettent de tirer parti au mieux de chaque tape

de transformation du soufre, optimisant ainsi ce type de mtabolisme nergtique.

B) Les bactries sulfureuses phototrophes

Cette famille regroupant les bactries sulfureuses vertes et pourpres ralise une

photosynthse dite anoxygnique, et utilise des composs autres que leau, notamment des

composs rduits du soufre comme lH2S ou le thiosulfate comme donneurs dlectrons. On

les retrouve dans les tendues deau douce ou saumtre, les environnements marins et dautres

habitats combinant la prsence de lumire et de source de soufre rduit labsence

doxygne. Leur importance cologique est considrable, puisquelles permettent de roxyder

lH2S issu de la rduction des sulfates par les organismes sulfato-rducteurs, et contribuent

ainsi de faon majeure au cycle du soufre (Figure 2). De plus, la photosynthse dont elles sont

capables permet une fixation du carbone atmosphrique en carbone organique utilisable par

dautres organismes. On comprend donc pourquoi tant dtudes visant dchiffrer le

mtabolisme nergtique quelles dploient leur sont consacres.

Le modle actuel du mtabolisme nergtique du soufre des bactries sulfureuses

phototrophes est prsent Figure 24 ; y sont intgres toutes les voies dcouvertes ce jour

chez lensemble de ces bactries. Il est donc possible quaucun de ces organismes ne

Introduction

42

possdent toutes ces enzymes (Frigaard and Dahl, 2008; Gregersen et al., 2011; Sakurai et al.,

2010).

Figure 24. Modle du mtabolisme nergtique du soufre chez les bactries sulfureuses phototrophes

(Frigaard and Dahl, 2008). Pour le nom des enzymes, se reporter au texte. MK, quinones ; CycA, cytochrome c ;

R-SH, R-S-SH, HSn- diffrentes intermdiaires du soufre.

Dans le cas o lH2S est le substrat primaire, on constate que deux enzymes, la SQR

membranaire et la FCSD priplasmique, ont la capacit de loxyder en chanes de soufre

(polysulfures) en transfrant les lectrons aux quinones ou un cytochrome. Ces chanes de

soufre vont alors tre transitoirement incorpores en tant quintermdiaire ractionnel aux

globules de soufre en formation (Gregersen et al., 2011) dposs dans le priplasme ou

lextrieur des cellules suivant les organismes. Mais ces globules de soufre sont galement

forms dune autre manire. En effet, le thiosulfate est galement un substrat classique de

nombreuses bactries sulfureuses phototrophes : celui-ci est oxyd par le systme Sox, soit

Introduction

43

compltement lorsque SoxCD est prsent (le thiosulfate est alors directement transform en

sulfate) soit de manire incomplte lorsque SoxCD est absent. Dans ce dernier cas, une seule

molcule de sulfate est libre, et le soufre restant est incorpor par un mcanisme inconnu

dans les globules de soufre.

La faon dont ce soufre ltat doxydation 0 est ensuite mobilis partir des globules

reste encore peu comprise : il a t propos dans ce processus le rle de petites molcules

organiques telles que les glutathions, mais plus de preuves exprimentales sont ncessaires

pour valider cette hypothse. Une fois transport dans le cytoplasme, le soufre est oxyd en

sulfite par le systme Dsr. Ce sulfite est finalement pris en charge par la voie de lAPS pour

gnrer de lATP et du sulfate dans le cytoplasme. Un complexe membranaire orient vers le

cytoplasme, nomm PSRLC3 (pour polysulfide-reductase-like complex 3), homologue la

polysulfure rductase de Wolinella succinogenes, a galement t propos dans un rle

doxydation du sulfite en sulfate. Cette hypothse a t formule aprs avoir constat que chez

les organismes o il a t dtect au niveau gnomique, les gnes codant pour ce complexe

putatif taient situs directement en amont du groupe de gnes codant pour le systme Dsr. De

plus, son orientation cytoplasmique est en accord avec la production dans le mme

compartiment de sulfite par Dsr. Cependant, aucune preuve biochimique de cette activit na

pour linstant t rapporte, cette voie reste donc compltement hypothtique. Enfin, lanalyse

dune souche dficiente en SoxY dAllochromatium vinosum a montr une diminution

importante de la capacit de la bactrie oxyder le sulfite ; par ailleurs, le systme Sox est

connu pour oxyder le sulfite in vitro. Ceci en fait un bon candidat pour raliser une oxydation

priplasmique du sulfite aprs son transport partir du cytoplasme. Cette question du devenir

du sulfite chez les bactries sulfureuses phototrophes reste donc ouverte.

C) Les bactries acidophiles et msophiles du genre

Acidithiobacillus

Les bactries du genre Acidithiobacillus sont des gamma-protobactries vivant des

pH trs bas (1,5-2,5) et qui sont frquemment retrouves dans des environnements de type

drainage minier acide. Elles sont capables doxyder le fer (II), la pyrite (FeS2) ainsi que les

composs rduits du soufre pour produire de lnergie. Cette particularit de solubiliser des

mtaux solides comme la pyrite est dun grand intrt biotechnologique, dans les processus de

Introduction

44

biolixiviation notamment. Le mtabolisme nergtique du soufre de ces bactries est tudi

chez plusieurs reprsentants du genre comme Acidithiobacillus ferrooxidans et

Acidithiobacillus caldus. Si ces deux bactries font partie du mme genre, elles prsentent

nanmoins quelques diffrences intressantes au niveau des enzymes mises en uvre pour

oxyder les composs du soufre.

Un modle de ce mtabolisme chez Acidithiobacillus ferrooxidans a t propos en

2009 (Figure 25) (Quatrini et al., 2009) dans lequel il existe un couplage entre oxydation du

soufre et rduction de loxygne.

Figure 25. Modle du mtabolisme nergtique du soufre chez Acidithiobacillus ferrooxidans (Quatrini et

al., 2009). Pour le nom des enzymes et les ractions quelles catalysent, se reporter au texte.

Il y est ainsi montr lexistence dune SQR oxydant lH2S, un cycle de recyclage entre

une TQOR (TQR dans le schma) oxydant le thiosulfate en ttrathionate, et une ttrathionate

hydrolase (TetH) qui le retransforme en thiosulfate. Loxydation de ces composs du soufre

par la SQR et la TQOR est couple la rduction du pool de quinones, lesquelles vont

Introduction

45

finalement tre utilises par les oxydases terminales pour rduire loxygne, ou par le

complexe I pour gnrer le pouvoir rducteur. Cependant, ces voies nexpliquent pas

loxydation du soufre lmentaire observe lors de croissance dans ces conditions de culture.

Les auteurs ont ainsi propos limplication dans cette activit dune nouvelle enzyme

cytoplasmique, potentiellement lie la membrane, appele htrodisulfure rductase

(HdrABC). Chez les arches mthanognes, ce complexe rduit lhtrodisulfure CoB-CoM

(CoBS-SCoM), rgnrant chacun des cofacteurs pour une utilisation ultrieure dans la

mthanognse. Les auteurs proposent que chez Acidithiobacillus ferrooxidans et dautres

organismes oxydant le soufre, lhtrodisulfure rductase fonctionnerait lenvers, et

oxyderait un intermdiaire disulfure (issu de linternalisation du soufre) en sulfite. Cet

intermdiaire pourrait tre de type glutathion-persulfure, comme ce qui a pu tre propos chez

les bactries phototrophes. La prsence des gnes codant pour des protines impliques dans

le transfert de soufre dans , lopron codant pour ce complexe, supporte cette proposition.

Cependant, cette hypothse ne repose sur aucune donne exprimentale, hormis la

surexpression de lopron lors dune croissance sur soufre lmentaire qui suggre

effectivement une implication dans ce mtabolisme. Le sulfite produit par cette enzyme doit

tre ensuite oxyd par un autre systme, que les auteurs proposent tre celui de la voie de

lAPS, puisquen effet, un gne codant pour lATP sulfurylase (Sat, dernire tape de la voie)

est prsent dans le gnome de la bactrie. Cependant, la premire enzyme combinant lAMP

et le sulfite en APS (APS rductase) na pas t retrouve ; une nouvelle voie doxydation du

sulfite encore non identifie doit probablement tre prsente. Il faut se rappeler toutefois que

chez une autre souche dAcidithiobacillus ferrooxidans, la cytochrome c oxydase de type aa3

est capable in vitro doxyder le sulfite en sulfate (Sugio et al., 2010); ces rsultats mriteraient

dtre vrifis in vivo.

Chez Acidithiobacillus caldus (Figure 26) (Mangold et al., 2011), outre les systmes

dj dcrits chez Acidithiobacillus ferrooxidans, il existe galement une SOR cytoplasmique

qui offrirait une voie doxydation/rduction du soufre lmentaire, en un schma qui

rappellerait celui prsent chez Acidianus ambivalens. Un systme Sox tronqu est aussi

identifi au niveau du gnome ; en revanche, malgr la prsence de lATP sulfurylase, lAPS

rductase est toujours manquante.

Introduction

46

Figure 26. Modle du mtabolisme nergtique du soufre chez Acidithiobacillus caldus (daprs (Mangold

et al., 2011)). ISCs dsigne les composs inorganiques du soufre, Omp40 est une porine de la membrane externe.

IV) Rflexions sur les modles des mtabolismes nergtiques du

soufre

Les quelques exemples prsents ici pointent la complexit de tels systmes. Btir de

tels modles nest pas chose aise, et plusieurs facteurs rendent cette tche ardue. La

multiplicit des enzymes, adaptes un type particulier de compos soufr, associe une

absence de donnes cintiques et dtudes sur les conditions dexpression en fonction des

conditions exprimentales est videmment un premier point. Mais cest aussi la diversit et la

redondance de tels systmes, entres diffrents organismes ou parfois dans le mme, qui pose

le plus de question. Par exemple, Acidithiobacillus caldus possde la fois une TQOR et un

systme Sox tronqu, tous deux situs dans le priplasme et ddis loxydation du

thiosulfate ; Acidianus ambivalens peut oxyder le sulfite par une SAOR membranaire ou la

voie de lAPS dans le cytoplasme. Un lment de rponse repose peut-tre sur la localisation

Introduction

47

de ces systmes : leur prsence dans les diffrents compartiments cellulaires permettrait

dapporter un lment de rgulation et de favoriser une voie plutt quune autre. De plus, les

produits finaux ne sont pas forcment identiques : le produit de la TQOR est le ttrathionate

qui peut tre utilis par la ttrathionate hydrolase qui elle-mme rgnre le thiosulfate, alors

que le systme Sox produit directement du sulfate et ventuellement du soufre lmentaire

dans le cas de labsence de SoxCD. Ce recyclage des composs du soufre est particulirement

visible chez Acidianus ambivalens o lon assiste un vritable cycle entre la SQR qui

produit une chane de soufre partir dH2S, laquelle peut-tre utilise par la SOR qui va

donner entre autre de lH2S.

Cette apparente complexit et la difficult de dcrypter ces mtabolismes refltent en

ralit la formidable capacit dadaptation des micro-organismes leur environnement, et les

stratgies doptimisation quils ont mis en place afin dexploiter au maximum la chimie toute

particulire du soufre au travers de chacune des formes quil peut prendre. Il ne faut pas y voir

un enchevtrement de substrats, de produits et denzymes, mais plutt des rseaux

mtaboliques hautement performants, organiss et structurs autour dun objectif defficacit

maximale dans des environnements dont les conditions physico-chimiques peuvent trs

brusquement varier. Ainsi, pour ces organismes, prsenter un mtabolisme nergtique

polyvalent, ne reposant pas sur un seul type de compos soufr, mais bien capable dutiliser

un large ventail de substrats, est finalement un gage de survie.

Ceci nous amne une dernire piste de rflexion : comment tudier ces

mtabolismes ? La rponse est trs certainement quil ny a pas une seule technique qui doit

prvaloir sur les autres, mais que lalliance des tudes biochimiques in vitro, des prdictions

in silico bases sur les tudes gnomiques et des observations de comportements in vivo des

organismes dans diffrents contextes gntiques ou conditions de culture semble finalement

tre la cl de la comprhension de ces systmes.

Introduction

48

Chapitre II

Les rhodanses

Introduction

49

Introduction

50

Les rhodanses

La dcouverte de la premire rhodanse a t faite en 1933 par Lang, lorsquil a isol

une enzyme de mammifres capable dajouter un atome de soufre au cyanure pour le

transformer en une forme bien moins nocive pour les cellules, le thiocyanate (Lang, 1933). Le

nom de rhodanse a alors t propos partir du nom allemand du thiocyanate (rhodanide) et

du suffixe ese qui dsigne le produit dune enzyme. Si ce terme est aujourdhui encore

couramment employ pour parler de ces protines, la nomenclature officielle les dfinit

comme des thiosulfate : cyanure soufre transfrases (E.C 2.8.1.1) sur la base de leur activit in

vitro.

Quatre-vingt annes de recherches sur ces enzymes ont permis den apprendre bien

davantage et de mettre en vidence un repliement tridimensionnel ubiquitaire de type

rhodanse prsent au sein de nombreuses protines appartenant aux trois domaines de la

Vie. Ainsi, aux protines constitues uniquement d