____

Agronomski fakultet Sveuilita u Zagrebu Zavod za oplemenjivanje bilja, genetiku, biometriku i eksperimentiranje

Mr. sc. Ale Vokurka

INTERNA SKRIPTA

vjebe za kolegij

OPLEMENJIVANJE VOAKA I VINOVE LOZEVoditelj kolegija: prof. dr. Ivan Peji

Napomena: skripta je nerecenzirana i nelektorirana, i kao takva slui iskljuivo za internu upotrebu prilikom spremanja ispita

svibanj 2006.

Pojam fenotipa, genotipa i svojstva u oplemenjivanju voaka i vinove lozeGenotip je cjelokupna naslijedna osnova koju organizam dobiva od roditelja. To je suma svih genetikih informacija (gena). Genotip odreuje razvojni put organizma, ali se pri tome ne ostvaruju sve njegove mogunosti i potencijali. Fenotip je skup svih svojstava organizma koja nastaju zajednikim djelovanjem genotipa i okoline u kojoj se organizam razvija, tj. organizam kakav se ispoljava u stvarnosti (Slika 1. i 2.).

F=G+E

Slika 1: Razliite sorte jabuka su rezultat razliite genetske konstitucije

Slika 2: Razliit fenotipski izgled ploda i lista smokve

Svojstvo je odreena karakteristika fenotipa (komponenta fenotipa) koja je (kao i fenotp u cjelini) uvjetovana genetikim iniocima i iniocima okoline u kojoj se organizam razvija. Prema broju gena koji kontroliraju pojedina svojstva, razlikujemo kvalitativna i kvantitativna svojstva.

2

Kvalitativna (alternativna) svojstva upravljana su sa jednim ili s nekoliko dominantnih ili recesivnih gena (major geni) snanog djelovanja i pod malim su utjecajem okolinskih imbenika. Kvalitativna svojstva, budui da su pod niskim utjecajem okolinskih faktora, esto se koriste kao deskriptori za ocjenjivanje i opisivanje germplazme, npr. boja i oblik cvjetova, plodova i listova. Kvantitativna (metrika) svojstva upravljana su veim brojem gena sa vie genskih lokusa od kojih svaki daje doprinos u ekspresiji promatranog svojstva. Ovi geni najee imaju aditivni efekt i stvaraju razliite interakcijske odnose u upravljanju tim svojstvom. Fenotip svojstva koje je pod kontrolom ovakvih gena je suma njihovih pojedinanih utjecaja i pod velikim je utjecajem okolinskih imbenika (tj. takva svojstva variraju pod okolinskim utjecajem znatno vie nego kvantitativna svojstva). Mnoga svojstva zanimljiva za voarstvo i vinogradarstvo su kvantitativna: otpornost prema bolestima, otpornost na nepovoljne okolinske utjecaje (sua, nepovoljna temperatura u pojedinim fenofazama), sadraj aromatskih i nutritivnih tvari u plodu, sadraj eera i kiselina kod vinove loze, visina prinosa i dr. Cilj oplemenjivanja je stvoriti sortu (kultivar) tono odreenog svojstva ili odreenih svojstava koja su poboljana u odnosu na postojee sorte, i kojima se rjeavaju odreeni problemi vezani za proizvodnju, trgovaki plasman i potroake preferencije. Svrha oplemenjivanja rjeavanje problema koji su povezani s proizvodnjom odreenog kultivara u odreenim uvjetima.

Pet osnovnih koraka oplemenjivakog programa

Objasnit emo pet osnovnih koraka oplemenjivakog programa u sluajevima kad se kao sustav oplemenjivanja koristi planska hibridizacija (krianje). 1) Identifikacija problema

Identifikacija problema se uvijek provodi uz konzultacije sa strunjacima iz prakse i sa strunjacima iz drugih podruja agronomskih znanosti (strunjaci za pomologiju, zatitu bilja, fiziologiju, ishranu, mehanizaciju, marketing i dr.). Osobe zaposlene u praksi i proizvoai odreenih voarskih kultura mogu ukazati na odreeni problem, a strunjaci iz pojedinih znanstvenih grana mogu pomoi oplemenjivaima u provoenju oplemenjivakog programa ovisno o specifinosti problema kojeg je potrebno rjeiti oplemenjivanjem.

3

2)

Odreivanje ciljeva oplemenjivanja

Ciljevi oplemenjivanja mora se zasnivati na stvarnim problemima i mora biti postavljen realno Potrebno je postaviti prioritete ciljeva vezanih za pojedinu vrstu i za pojedino proizvodno podruje. Nije mogue dobiti 100% idealnu sortu jer realnost sorte (a da ona bude to idealnije) ovisi o mogunosti nezavisnog kombiniranja svojstava (gena) i nainu naslijeivanja tih svojstva. U kombinacijskom oplemenjivanju (krianjima) esto se koriste postojee kvalitetne sorte jer one ve imaju nakupljena poeljna svojstva (tzv. blokove gena) koja elimo prenijeti na potomstvo. Veliina potomstva u krianjima ovisi o nainu naslijeivanja gena koji upravljaju pojedinim svojstvima. 3) Planska hibridizacija (krianje)

U planskoj hibridizaciji najvanije je odabrati najbolje roditeljske kombinacije u skladu sa ciljem oplemenjivanja. Potrebno je dobro poznavati svojstva roditeljskih biljaka. Roditelji moraju biti bezvirusni (nezaraeni najvanijim virusima), naroito majinska biljka jer je prijenos virusa na plod vrlo izgledan. Krianja je potrebno izvesti tehniki pravilno, a tu je osim rutine samog postupka (sakupljanje polena, emaskulacija, krianje, izolacija) neophodna i dobra organizacija koja omoguuje provedbu krianja u kratkom vremenskom roku dok traje cvatnja. Planirana veliina populacije potomstava za daljnji rad odreuje broj krianja koji je potrebno uiniti, a taj broj mora biti i vei jer sva krianja ne zavre uspjeno. 4.) Postupci sa sjemenom

Postupci sa sjemenom odnose se na njegovo ienje od ostatka ploda i uvanje, ali je najvaniji postupak stratifikacije kojim se skrauje dormantnost sjemena i omoguuje njegovo bre klijanje. 4) Ispitivanje i selekcija potomstava

Ispitivanje i selekcija potomstava iz krianja je viegodinji postupak u kojem se provodi evaluacija svih vanih gospodarskih svojstava. Poetna populacija je relativno velika, ali selekcijski postupak je rigorozan tako da se veliina populacije smanjuje. Na kraju ostaje samo nekoliko najboljih krianaca koji se vegetativno razmnoe i dalje ispituju u poljskim pokusima.

Najvanija svojstva u oplemenjivanju voaka i vinove lozeUrod i prinos po jedinici povrine - vano je svojstvo ali nije primarno u oplemenjivanju voaka i vinove loze, budui da je visina prinosa (kvantiteta) obrnuto proporcionalna kvaliteti plodova. Primjer za to je vinova loza: visok prinos najee znai nizak sadraj eera i lo omjer eera i kiselina to su glavni parametri kvalitete. Otpornost na bolesti i tetnike - selekcijom otpornih sorti i klonova smanjuje se potreba primjene kemijskih sredstava ime se smanjuje koliina rezidua u plodovima, biljnim ostacima i tlu, uva se

4

prirodna ravnotea i korisna entomofauna, i ujedno se smanjuju trokovi proizvodnje. Ovo svojstvo moe imati jaku marketinku primjenu jer se proizvod moe plasirati kao tzv. ''ekoloku uzgojen''. Otpornost na povremene ili stalne stresne utjecaje okoline - niske ili visoke temperature, nedostatak vlage, prevelika vlanost tla, salinitet tla i sl. Svojstva iz ove grupe dobivaju na sve veoj vanosti zbog globalnog poveanja potreba za hranom, a i zbog toga to se urbanizacijom gube poljoprivredne povrine zbog kojih se proizvodnja mora izmjestiti u podruja s posebnim uvjetima tla i klime gdje su okolinski stresovi stalna prijetnja sigurnosti proizvodnje. Prilagodba posebnim uvjetima klime moe se postii indirektno koritenjem podloga adaptiranih na takve uvjete. Na slici 3. prikazan je uzgoj jabuke u sjevernim krajevima gdje niska (izrazito slabo bujna) podloga omoguuje prezimljavanje rodnih izboja pod snijegom. Ovakve podloge kreirane za posebnu svrhu takoer su dobivene oplemenjivanjem i selekcijom.

Slika 3. Jabuka uzgojena na vrlo patuljastoj podlozi zbog prilagodbe uzgoja u ekstremnim uvjetima

Kvaliteta ploda - oblik, veliina i boja ploda, tekstura i boja mesa, omjer kiselina i eera, prehrambena vrijednost. U zadnje vrijeme se sve vie istie bogatstvo pojedinih sorata vitaminima, mineralima i antioksidansima. Mogunost mehanizirane berbe - naroito vano za maslinu, vinovu lozu, vinju, tj. plodove koji su namjenjeni industrijskoj preradi (Slika 4. i 5.). Mogunost mehanizirane berbe ovisi o vrstoi i teksturi mesa ploda koja mora biti otporna na udarce i mehanika oteenja.

Slika 4. Strojno branje maslina (Izvor: www. froc.com.au)

Slika 5. Strojno branje groa (Izvor: www.pacificpalate.com) 5

Opisivanje pojedinih svojstava u oplemenjivanju i selekciji voaka i vinove loze

Osnovna pitanja su kako pristupiti opisu pojedinih svojstva sa ciljem dobivanja vjerodostojnog opisa sorata (genotipova, klonova) koje elimo analizirati. Vano je odrediti metodiku i nain prikupljanja podataka, a podatke treba prikupljati u za to odgovarajuem vremenu, ovisno o razvojnom stadiju voke ili trsa. Prouavanje genotipa je posredno i uvijek se provodi preko fenotipa, bilo da se radi o prouavanju i opisivanju biljnog genetskog materijala koji e se koristiti za hibridizaciju (ulaznog materijala), materijala koji je rezultat hibridizacije (izlaznog materijala), ili materijala unutar kojeg se provodi klonska selekcija. U postupku pronalaenja genetskog materijala koji bi se mogao iskoristiti u stvaranju novih sorata potrebno je utvrditi razliku izmeu negenetske varijabilnosti i varijabilnosti koja je proizlazi iz genetske konstitucije i koja je naslijedna. Svrha pravilnog pristupa i organizacije kod uzimanja podataka za analizu i opis pojedinih svojstava jest izbjagavanje negenetske varijabilnosti, odnosno njeno svoenje na najmanju moguu mjeru. Negenetska varijabilnost je varijabilnost koja je vidljiva na fenotipskom izgledu, ali je uzrokovana biotskim i abiotskim faktorima koji nisu genetske prirode, tj. ne proizlaze iz genetske konstitucije promatrane jedinke (stabla ili trsa). imbenici negenetske varijabilnosti su: 1. Virusi i viroidi, i ope zdravstveno stanje esto mijenjaju izgled voke, trsa ili ploda. Ovisno o vrsti virusa zaraena jedinka ima poveanu ili smanjenu bujnost (razlika u vigoru), moe imati razliit oblik ili veliinu ploda (Slika 6. i 7.), kvaliteta plodova je najee smanjena (sastav eera, kiselina, nutritivnih tvari), a voka ili trs je osjetljivija na napade drugih bolesti. Prisutnost virusa ponekad, kada to omoguuju ekoloke prilike, moe biti izraena na listu ili cijelom trsu(Slika 8. i 9.), no najee su virusi latentni i nevidljivi (za njihovu detekciju postoje biotehnoloke metode: ELISA test, indeksiranje).

Slika 6. Plod trenje zaraene virusom Little Cherry Virus (LChV) i usporedba sa zdravom (Izvor: www.bocu.ac.at)

Slika 7. Plod i list trenje zaraene virusom Cherry Twisted Leaf Virus (ChTLV) (Izvor: www.bocu.ac.at)

6

Slika 8. List v. loze zaraene virusom Grapevine Fanleaf Virus (GrFV) (Izvor: www.agf.gov.ca)

Slika 9. Trs v. loze (Pinot crni) zaraen virusom Grapevine Leafroll Virus (GrLV) (Izvor: www.winegrapes.temu.edu)

2. Podloga na koju je cijepljena plemka sorte ima utjecaj na bujnost i vigor, ali i na vrijeme ulaska voke ili trsa u pojedine fenofaze. 3. Ishranjenost voke ili trsa u ekstremnim prilikama manifestira se kroz simptome vidljive na listu ili plodu koji su specifini za svako pojedino hranivo. Kod uobiajenih sluajeva pomanjkanje hraniva vidi se kroz smanjenu bujnost, veliinu i kvalitetu plodova. 4. Poloaj - mikroreljef i mikroklima stvaraju razlike (modifikacije) u pojedinim svojstvima, npr. znatno vii sadraj eera u grou uzgojenom na junim ekspozicijama u usporedbi sa manje povoljnim ekspozicijama. Procjena jednog genotipa preko njegovog fenotipa svodi se na opaanje svojstava veeg broja jedinki (klonova) kroz vei broj mjerenja (u vie navrata kroz viegodinje pokuse) na vie lokacija. Veim brojem mjerenja kroz vrijeme i prostor smanjuje se utjecaj okoline na statistiki opravdanu razinu, ime se poveava sigurnost i vjerodostojnost istraivanja. Opaanja na razini fenotipa ukljuuju: fenotipska opaanja kojima se prate razvojne faze tijekom vegetacijske sezone (npr. kretanje vegetacije, poetak cvatnje, puna zrioba i dr.), opaanja morfolokih svojstava (npr. postojanje dlaica na listu, oblik lista, oblik ploda, postojanje krilca na grozdu i dr.), mjerenja kvantitativnih svojstava (npr. udio eera i kiselina u plodovima, udio vitamina, antocijana, masa ploda, randman ploda, duina peteljke i dr.), opaanja otpornosti i tolerancije na bolesti i tetnike, opaanja koja se odnose na okolinske stresove (npr. otpornost i tolarancija na izmrzavanje u fazi mirovanja, otpornost na mraz u vrijeme kretanja vegetacije i cvatnje, otpornost na suu).

Zbog dugotrajnosti procesa oplemenjivanja voaka i vinove loze (viegodinje kulture) samo paljivo odabran i analiziran genotip moe posluiti kao poetni materijal za kreiranje novih kultivara i podloga.

7

Primjeri u opisivanju pojedinih svojstava

Cvatnja Cvatnja je fenofaza koja ima svoj poetak, vrhunac i kraj, i odvija se po odreenoj vremenskoj dinamici (Slika 10.). Kao vremenske referentne toke biljee se datumi: poetka cvatnje kada je otvoreno najmanje otprilike 10% cvjetova pune cvatnje kada je otvoreno otprilike 50% cvjetova kraja cvatnje kada je otvoreno do 100% cvjetova

Zapaanje se moe izvesti brojanjem ili vizualnom procjenom na temelju iskustva, a kod procjenjivanja je bitno da procjenu vri uvijek ista osoba kako bi se izbjegla eventualna razlika u opaanju izmeu dvije ili vie osoba. U irem kontekstu, fenofaza cvatnje se prati od samog kretanja (bubrenja) generativnih pupove do zametanja plodova.

Slika 10. Fenofaze u cvatnji jabuke (Izvor: www.vegedge.umn.edu)

Procjena tolerantnosti na niske temperature Tolerantnost na smrzavanje voaka i vinove loze ovisi o razvojnoj fazi, a voke su najosjetljivije u vrijeme kretanja vegetacije i cvatnje (kasni proljetni mrazevi) (Slike 11a, b i c). Zapaanja se vre na vegetativnim i generativnim pupovima i izbojima, a u opisu oteenja obino se koriste ocjene "izmrzao", "djelomino otporan" i "otporan.8

Kritine temperature u vrijeme kretanja vegetacije pri kojima izmrzavaju vegetativni i generativni pupovi u otvaranju, kao i mladi tek zametnuti plodovi su za veinu vonih vrsta -2 do -3 C, no tete ovise i o trajanju izloenosti niskim temperaturama.

a

b

c

Slika 11 a, b i c: Prikaz teta od izmrzavanja kod jabuke: djelomino izmrznuta gronja (a) u kojoj je stradao glavni, sredinji cvijet; potpuno uniteni cvjetovi (b) i tete od mraza na razvijenom plodu kao poslijedica smrzavanja tek zametnutih plodova (c). (Izvor: www.vegedge.umn.edu)

tete od niskih temperatura su mogue i u vrijeme potpunog mirovanja vegetacije (tijekom zime), a zapaanja se izvode samo za neuobiajeno hladnih zima kad minimalna temperatura padne ispod -15 C to ovisi o vrsti. U takvim kritinim uvjetima prvenstveno stradavaju jednogodinji izboji. Procjena tolerantnosti na niske temperature kod izniklih sjemenjaka (u sklopu oplemenjivakih programa kojima je cilj otpornost na niske temperature) mogue je provesti i u klima-komorama s mogunou regulacije temperature. U komore se mogu na odreeno vrijeme smjestiti i biljni dijelovi (npr. granu u fazi cvatnje) kako bi se dobio uvid u tolerantnost. Oplemenjivaki programi mogu ii u smjeru vremenskog pomicanja fenofaza (kasnije kretanje vegetacije, kasniji poetak cvatnje) ime se posredno izbjegava opasnost od niskih temparatura ova metoda je primjenjiva kod selekcije sjemenjaka oraha (vrsta koje esto strada od izmrzavanja). Kod nekih genotipova oraha postoje lateralni generativni pupovi koji kasnije ulaze u cvatnju ime izbjegavaju periode kritine niske temperature, pa oplemenjivanje moe ii i u smjeru selekcije takvih genotipova.

Procjena otpornosti i tolerantnosti na bolesti Postoje razliite skale za ocjenjivanje stupnja zaraenosti (npr. V. inaequalis - Slika 12. i 13., E. amylovora) nakon prirodne ili umjetne infekcije. Skale zaraenost se obino kreu u rasponu od 0-10, ili se zaraenost izraava u postotcima to je primjenjivo prilikom ocjenjivanja zaraene povrine lista.

9

Slika 12. Infekcija V. inaequalis na listu (Izvor: www.uky.edu; www.plante-doktor.dk)

Slika 13. Infekcija V. inaequalis na plodu (Izvor: www.uky.edu; www.plante-doktor.dk)

Veliina i oblik ploda Veliina plodova (Slika 14.) izravno utjee na njihovo svrstavanje u kategorije prilikom plasmana na trite. Plodovi jabuka koji imaju manje od 60 mm u promjeru nisu pogodni za stolnu upotrebu (takvi plodovi mogu proi samo za industrijsku upotrebu), a za stolnu upotrebu nisu najpogodniji niti suvie krupni plodovi. Promjer ploda se mjeri po horizontalnoj osi ploda. Plod moe biti razliitog oblika (Slika 15., 16. i 17.), plosnat, vie ili manje ovalan, izduen (breskva), a ta karakteristika se opisuje omjerom visine i promjera ploda i izraava se u postotku. Na primjeru jabuke, ako je vrijednost manja od 65%, plod se smatra plosnatim, a ako je vrijednost oko 100% plod je izduen.

Slika 14. Razlike u obliku i veliini plodova masline

Slika 15. Razlike u izduenosti plodova

10

Slika 16. Razlike u obliku i veliini plodova avokada

Slika 17. Razlike u obliku plodova vinje i trenje (Izvor: www.ipgri.cgiar.org)

Randman ploda, jezgre ili mota Randman je vano svojstvo a predstavlja iskoristivi dio plodova voaka i vinove loze. Kod vinove loze pod randmanom se smatra udio bobica u odnosu na peteljkovinu, ili udio mota u odnosu na ukupnu masu groa. Kod kotiavog voa mjeri se randman (masa) mesa u odnosu na kotice, a kod lupinastog voa randman jezgre. Randman se uvijek izraava u postotcima. Kod oraha randman jezgre mora biti vei od 45%, to znai da od ukupne mase plodova na iskoristivi dio (jezgru) otpada 45%. Najbolje sorte oraha imaju randman jezgre oko 50%.

Opa kvaliteta ploda Opa kvaliteta ploda sa stanovita potroaa moe se ocijeniti degustacijom koju prati anketa, a u anketama se ocjenjuju svojstva koja su zanimljiva potroaima: izgled ploda (privlaan oblik, boja), miris i okus ploda, aroma i sklad okusa. Ankete obino imaju nekoliko postavljenih pitanja (ne smiju biti preopirne), a est pristup je i rangiranje plodova (potencijalnih sorata) u kategoriji pojedinih svojstava. Pitanja su, npr: ocjenite aromu ploda (a ocjene su od 1-3 ili 1-5) rangirajte ponuene plodove prema jaini arome (pri emu su plodovi oznaeni brojevima) od najboljeg do najloijeg

Degustacije plodova u kojima sudjeluju potroai su obino povezane uz izlobe (npr. ''Dani jagoda'' u Zagrebu ili ''Dani treanja'' u Lovranu).

11

Zakljuak Oplemenjivaki materijal za uvrtavanje u oplemenjivake programe (ulazni materijal za krianja) ili oplemenjivaki materijal koji je rezultat krianja ili klonske selekcije (koji ima potencijal sortnog ili klonskog priznavanja) moe se izdvojiti samo na temelju tono opisanih i analiziranih svojstava. Izboru materijala treba pristupiti vrlo rigorozno, jer raditi sa manjim brojem kvalitetnih potencijalnih genotipova je puno jednostavnije, uinkovitije i financijski povoljnije. Materijal moe biti vrhunski u pogledu pojedinih svojstava (npr. kvaliteta ploda ili adaptabilnost na nepovoljne uvjete klime i tla), ali ako je izrazito nepovoljan u drugim gospodarski vanim svojstvima (npr. osjetljiv na bolesti) on se odmah eliminira iz daljnjeg selekcijskog postupka. Eventualno, takav materijal se moe sauvati u kolekcijskim nasadima kao izvor gena povoljnih svojstava za budue oplemenjivake programe. Stvaranje sorte kod voaka i vinove loze je dugotrajan rad koji od postavljanja oplemenjivakog programa sa tono definiranim ciljevima, preko uzgoja krianaca i njihove selekcije u mikro i makropokusima, pa sve do administrativnog priznavanja sorte, moe potrajati vie od deset, pa i 15 godina. Nakon dugogodinjeg oplemenjivakog rada potreban je kvalitetan marketing da sorta bude prihvaena na tritu (Slika 18.). Kao primjer kvalitetnog marketinga moe se spomenuti sorta jabuke Pink Lady (Slika 19.) (dobivena selekcijom krianaca sorata Zlatni delies i Lady Williams), s tim da marketing mora biti utemeljen na vrhunskim svojstvima nove sorte (www.pinkladyapples.co.uk, www.pinkladyeurope.com).

, uz sva zakonski zatiena Za sortu Pink Lady osmiljen je poseban zatitni znak (logo): oplemenjivaka prava (intelektualno vlasnitvo). Ova sorta se na tritu tretira kao jaka robna marka i postie cijene nekoliko puta vee u odnosu na uobiajene sorte.

Slika 18. Prikaz sorte avokada sa naglaskom na svojstva koja imaju snagu privlaenja kupca (Izvor: www.unc.edu)

Slika 19. Pink Lady (Izvor: www.pinkladyusa.com)

12

Hibridizacija u funkciji oplemenjivanja voaka i vinove loze

Umjetnom hibridizacijom (krianjem) nastoji se proizvesti genetska varijabilnost u cilju dobivanja novih sorata voaka i vinove loze koje bi imale poboljana svojstva. Dobivanje genetske varijabilnosti na ovaj nain nije ''stihijsko'' i ''sluajno'', nego se planskim izborom roditeljskih parova nastoje obuhvatiti najvanija svojstva koja elimo u novonastaloj sorti. Kod provedbe umjetne hibridizacije postoje stanovite posebnosti koje razlikuju rad sa samooplodnim i stranooplodnim vrstama i sortama koje treba imati u vidu prilikom oplemenjivakog rada, to e biti objanjeno u daljnjem tekstu. Prilikom objanjavanja tehnika krianja potrebno je krenuti od fenofaze cvatnje i grae generativnog organa za razmnoavanje cvijeta.

Cvatnja, samooplodnja i stranooplodnja Cvijet (Slika 20.) je organ za spolno (generativno) razmnoavanje kod kritosjemenjaa. Razvija se iz cvjetnih (generativnih) pupova koji nastaju u prethodnoj vegetacijskoj sezoni. Dva su osnovna elementa cvijeta koja sudjeluju u generativnom razvoju:1. 2.

Tuak ili GINECEJ (enski dio cvijeta) Pranici ili ANDRECEJ (muki dio cvijeta)

Slika 20. shematski prikaz grae cvijeta Izvor: www.apsnet.org/education/IllustratedGlossary/PhotosN-R/pistil.htm

13

TUAK (eng. pistil) se sastoji od tri osnovna dijela: njuka tuka (eng. stigma), vrat tuka (eng. style) i plodnica (eng. ovule). PRANICI (eng. anther) - osnovni dio pranika su polenovnice koje se nalaze na vrhovima dugih filamenata. Polenovnice se sastoje od dvije polutke (lat. thecae), a unutar svake se nalaze po dvije tzv. polenove vreice u kojima se razvija polen. Osim pranika i tuka, cvijet se sastoji i od drugih vanih dijelova koji imaju svoju bioloku funkciju, a to su: Vjeni (corolla) koji se sastoji od latica (sepala), a pri dnu latica nalaze se lijezde nektarije koje izluuju nektar koji je mamac za insekte i ima funkciju u anemofilnom opraivanju (prirodno opraivanje kukcima) Lapovi - poredani su u aku (calix)

-

Smjetaj cvjetova na biljkama Najee su cvjetovi dvospolni, tj. sadre muke i enske elemente (tuak i pranike), i tada govorimo o hermafroditnim (dvospolnim, monoklini ili jednoloni) cvjetovima. Postoje i jednospolni (diklini ili dvoloni) cvjetovi, a vrste koje imaju takve cvjetove mogu biti: monoecijske: ako su enski i muki cvjetovi odvojeni na istoj biljci, kao to je sluaj kod oraha, lijeske i pitomog kestena (Slika 21. i 22.) kod kojih je muki cvijet u obliku rese koja daje velike koliine polena i oprauje se vjetrom (anemofilno) diecijske: postojanje biljaka koje nose odvojeno enske i muke cvjetove (tada se govori o enskim i mukim biljaka), kao kod kivija (Slika 23. i 24.) (Actinidia sv.) kod kojeg su enski i muki cvjetovi vrlo slini, ali enski imaju kratke nerazvijene filamente koji nemaju svoju funkciju.

-

Odvojenost spolova (monoecijske i diecijske biljke) jedan je od mehanizama koji u prirodi omoguuje stranooplodnju, a stranooplodnja osigurava genetsku varijabilnost u F1 generaciji.

Slika 21. Muki cvat - resa kod pitomog kestena (Castanea sativa) Izvor: www.kuleuven-kortrijk.be

Slika 22. enski cvijet kod pitomog kestena (Castanea sativa) Izvor: www.kuleuven-kortrijk.be 14

Slika 23. enski cvijet kivija (Actinidia sp.) Izvor: www.cornhillnursery.com

Slika 24. enski cvijet kivija (Actinidia sp.) Izvor: www.cornhillnursery.com

Samooplodnja i stranooplodnja Samooplodnja (autofertilitet) je sposobnost sorte da nakon opraivanja vlastitim polenom, tj. polenom sa istog stabla ili s bilo kojeg drugog stabla iste sorte (istog genotipa) zametne plod koji e imati razvijene sjemenke s embrijem. Autofertilitet je kod voaka rijetka pojava, a javlja se kod breskve, marelice, maline, ogrozda i ribiza. Veina ostalih vonih vrsta i vinove loza su autosterilne, to znai da je za pravilan razvoj ploda i embrija potrebna sorta razliitog genotipa i drugaije genetske konstitucije (sorta opraiva). Autofertilitet je u pravilu iskljuen kod jabuke, kruke, oraha, badema i smokve i starih tradicionalnih sorata trenje (one su autosterilne i stranooplodne), dok su sorte ljive i vinje autofertilne do odreenog stupnja i samo za neke sorte je potreban opraiva. Oplemenjivanjem je mogue unijeti gen za autofertilnost, a primjer su sorta jabuka Cox's Orange i novije sorte treanja Lapins, Stella, Sweetheart.

Mehanizmi stranooplodnje Stranooplodnja je u prirodi potrebna zbog osiguravanja genetske varijabilnosti i lakeg prilagoavanja razliitim okolinskim utjecajima. Stranooplodnja uzrokuje veu genetsku osnovu za prirodnu selekciju u procesu evolucije. Postoje razliiti mehanizmi kojima je u prirodi osigurana stranooplodnja.1.

Morfoloki Dvodomne biljke kod kojih su muki cvjetovi odvojeni od enskih: orah, lijeska, pitomi kesten, kivi. Stranooplodnja, najee vjetrom i insektima, osigurana je fizikom odvojenosti mukih i enskih cvjetova

15

2.

Dihogamija Dihogamija je svojstvo koje se odnosi na dinamiku sazrijevanja tuka i pranika, kod kojeg ta dva osnovna dijela cvijeta sazrijevaju u razliito vrijeme. Vremenskom odvojenou osigurava se stranooplodnja

Protaginija - sazrijevanje tuka prije sazrijavanja pranika - takav cvijet prima polen drugih genotipova ili sorata koje koji je zreo u isto vrijeme Protandrija - sazrijevanje pranika prije sazrijevanja tuka - polen tog cvijeta sluiza opraivanje cvjetova drugih genotipova.3.

Fizioloko-genetski Mehanizam stranooplodnje je postojanje multiplih S alela koji uzrokuje gametofitsku i sporofitsku inkompatibilnost.

U daljnjem tekstu emo objasniti gametofitsku i sporofitsku inkompatibilnost (varijante fizioloko-genetske inkompatibilnosti) i djelovanje S alela. Gametofitska inkompatibilnost (Slika 25.) je genetsko svojstvo kontrolirano jednim lokusom (S-lokus) s vie razliitih alela (S-alela) koji se mogu nalaziti na tom lokusu u haploidnom tkivu polena. Do oplodnje moe doi jedino u sluaju kada je S alel u haploidnom genomu polena razliit od bilo kojeg S alela u diploidnom genomu tkiva njuke tuka. Postojanje S alela svojstveno je kotiavim vrstama: trenja, ljiva, bajam. Geni na S lokusu su odgovorni za nastanak posebnih RNAza (enzimi koji razgrauju RNA) iz skupine S-glikoproteina. Svojstvo samooplodnosti nastaje mutacijom gena koji kontroliraju sintezu RNAza i one gube svoju aktivnost.

Slika 25. Shema gametofitske inkompatibilnosti (Izvor: www.sccs.swarthmore.edu)

Mehanizam sporofitske inkompatibilnosti je sloeniji (Slika 26.), a uzrokuje ju diploidno tkivo sporofitske generacije prije nastanka haploidnog polena tj. prije mejoze. U tom diploidnom tkivu (npr. S1S2) se stvaraju posebni proteini (SCR1 i SCR2) koji bivaju, budui da nastaju prije16

trenutka mejoze, inkorporirani u ovoj oba haploidna polenova zrnca, i u S1, ali i u S2. U ovom sluaju S2 polen ne moe proklijati na njuki tuka koja ima S1S3 genotip, i to upravo zato to S2 polen sadri ne samo SCR2 protein, negi i SCR1 koji je identian proteinu u vratu tuka i koji spreava razvoj polenove mjeinice.

Slika 26. Shema sporofitske inkompatibilnosti (Izvor: www.sccs.swarthmore.edu)

est morfoloki marker za sporofitsku inkompatibilnosti jest heterostilija. Heterostilija sama po sebi nije uzrok samoinkompatibilnosti, ali je vezano svojstvo koje uvijek ide zajedno sa svojstvom samoinkompatibilnosti. Sve autofertilne sorte mogu, osim sa polenom vlastitog genotipa, biti oploene i polenom drugih sorata (to je vano u nastanku sorata), ali i kod samoinkompatibilnostii uvijek nalazimo manji stupanj autofertilnosti, to je uglavnom zanemarivo.

Samooplodnja u voarskoj praksi Samooplodnja je poeljna u voarskoj praksi jer: omoguuje podizanje vonjaka samo sa jednom sortom, to omoguuje smanjivanje manipulativnih i organizacijskih trokova kod sadnje i eksploatacije vonjaka opraivanje, a time i prirod, manje ovisi o vremenskim prilikama u vrijeme cvatnje vremenske prilike se mogu u kratkom periodu cvatnje znatno pogorati to onemoguuje let insekata (kia, vjetar) samooplodnja se praktino koristi u selekciji i proizvodnji generativnih podloga (npr. vinogradarska breskva kao generativna podloga), a oplemenjivaki postupci sa samooplodnim vrstama i sortama su drugaiji jer kod provedbe umjetne hibridizacije zahtijevaju emaskulacija.

17

Kod izbora opraivaa nije potrebno samo paziti da sorta opraiva ima genetski kompatibilan polen, nego i na vrijeme cvatnje koje mora biti podjednaka kod sorte opraivaa i glavnih sorata u vonjaku (Slika 27.). Fenofaza poetka i zavretka cvatnje je genetski uvjetovano svojstvo jer kao to postoje sorte ranijeg ili kasnijeg dozrijevanja, tako postoje i sorte koje ranije ili kasnije cvatu, samo to interval cvatnje nije toliko irok kao interval zriobe. Kod stranooplodnih voaka preporuljivo je locirati konice blizu vonjaka ime se znatno poveava sigurnost proizvodnje (Slika 28.).

Slika 27. Grafikon prikazuje vremensko preklapanje cvatnje pojedinih sorata jabuka prema kojem je mogue iskombinirati opraivae

Slika 28. Organizirano dopremanje pela u vrijeme fenofaze cvatnje znatno poveava uinkovitost oplodnje (Foto: A. Vokurka)

Tehniki koraci u provedbi planske hibridizacije postupci sa polenom: sakupljanje i uvanje izolacija cvjetova emaskulacija cvjetova (kod samooplodnih (autofertilnih) vrsta sorata voaka, kod v. loze) nanoenje polena na njuku tuka (plansko opraivanje) postupci sa sjemenom dobivenim planskom hibridizacijom

Postupci sa polenom Sa ciljem kvalitetne provedbe umjetnog opraivanja potrebno je na vrijeme sakupiti polen sorte koja ima ulogu oinske sorte. To je ujedno i sorta koja ima pojedina svojstva koja prema oplemenjivakom programu elimo imati i u novoj sorti, a nazivamu ju oinska sorta.

18

Veina vonih vrsta ima vrlo kratak period cvatnje od svega nekoliko dana do najvie dva tjedna, to ovisi o vrsti (genetski je uvjetovano svojstvo) i okolinskim uvjetim (koje u znatnoj mjeri utjeu na ekspresiju tog svojstva). Neuobiajeno toplo vrijeme sa snienom vlagom zraka moe skratiti vrijeme cvatnje na dva do tri dana, i zato je vano da oplemenjiva koji izvodi umjetnu hibridizaciju raspolae tehnikama koje bi mu omoguile izvoenje to veeg broja planskih krianja u to kraem vremenskom periodu. Kako bi se kratko vrijeme u kojem se moe provesti hibridizacija to uinkovitije iskoristilo, uputno je imati ranije pripremljenu zalihu sakupljenog polena za koritenje u oplemenjivakim programima. Do polena koji sadre gene odreenih svojstava mogue je doi i meunarodnom razmjenom, odnosno razmjenom izmeu razliitih institucija koje se bave oplemenjivanjem. Sakupljanje polena kod jezgriavog i kotiavog voa Polen se najee sakuplja tako da se odreu grane na sorti (ili genotipu) kojeg elimo koristiti kao oinskog i to u vrijeme samog kretanja vegetacije, u fazi bubrenja pupova. Odrezane grane se dre u zatvorenom prostoru (laboratoriju ili stakleniku), u posudi sa vodom, na temperaturi od 20 - 25 C, to je temperatura iznad one u prirodi. Na takvoj povienoj temperaturi dolazi do breg, isforsiranog kretanja vegetacije. Grane moraju biti odrezane pod kutom od 45 jer se tako omoguuje bolje uzimanje vode. Kod jezgriavog voa (jabuka, kruka, dunja) svaka 3-4 dana preporuljivo je obnoviti rez i zamijeniti vodu. Kotiavo voe stvara veu koliinu smolastih tvari, pa je rez obnavljanje reza potrebno provoditi svaki dan. Mogue je odrezati i potpuno dormantne grane, no za forsiranje razvoja cvata kod takvih grana potrebno je i dva tjedna. Ako se uzmu grane koje su u fazi bubrenja cvijetova, za njihovo forsiranje potrebno je tek nekoliko dana. Nakon isforsirane cvatnje cvjetovi se beru, najbolje tijekom fenofaze balona (Slika 29.). Uklone se latice cvijetova i pomou ianog sita (promjer oka 1,5 - 2 mm2) odvoje se antere. Antere koje prou kroz sito sakupe se na bijelom papiru ili u plitkim papirnim kutijama. Zatim ih je potrebno osuiti pri temp. od 20 - 25C, za to moe posluiti i laboratorijski termostat (inkubator), tj. ureaj koji zadrava eljenu temparaturu kroz traeni vremenski period. Na toj temparaturi polenovnice (antere) se isue, otvore se i oslobode polen koji takvim postupkom zadrava visok stupanj viabilnosti. Polen je mogue osloboditi i suenjem antera na sobnoj temperaturi, za to je potrebno 24 - 36 sati.

Slika 29. Cvat jabuke (gronja). Strelicom su oznaeni cvjetovi u fazi balona kakvi se uzimaju za sakupljanje polena. Izvor: www.netstate.com

19

uvanje polena Polen se stavlja u plastine ''tubice'' (Slika 30.) (npr. Eppendorf tubice) ili papirne vreice. Polen se kratkotrajno, do nekoliko tjedana, moe uvati u desikatoru (uz anhidrirani CaSO4) (Slika 31.) na temperaturi hladnjaka od +4C (desikator se smjeta u hladnjak). Pri temperaturi od -20C polen se moe uvati nekoliko godina bez znaajnog gubitka vijabilnosti. U cjelokupnom postupku sakupljanja, uvanja i rada sa polenom potrebno je biti sistematian, paljivo voditi biljeke i paziti da se polen razliitih genotipove ne pomijea, tj. da ne doe do kontaminacije razliitim polenom.

Slika 30. Plastine ''tubice'' u kojima je mogue drati sakupljen polen. Izvor: www.spexcsp.com

Slika 31. Desikator Izvor: www. ecs.umass.edu

Planska hibridizacija voaka Provedba planske hibridizacije zahtijeva ne samo poznavanje biologije (fiziologije cvatnje i grae cvijeta), nego i razumijevanje niza ekolokih imbenika koji djeluju na vrijeme, duinu i dinamiku cvatnje. Za izvoenje svih postupaka u planskoj hibridizaciji (sakupljanje polena, emaskulacija, izolacija cvijeta, umjetno opraivanje) potrebno je pravilno odrediti vrijeme u kojem se svaka pojedina operacija izvodi. Vrijeme izvoenja ovih postupaka odreuje se prvenstveno na temelju biologije cvatnje. Emaskulacija i izolacija cvijetova su osnovni postupci kojima se spreava dolazak (prirodno donoenje) polena sa biljaka koje nisu predviene u planskoj hibridizaciji. Izolacijom se spreava alogamno krianje, tj. dolazak polena nepoznatog porijekla na cvijet biljke koje je planom oplemenjivanja odreena da bude majinska. Izolacija cvjetova se provodi neposredno pred otvaranje cvijetova. Ako u vrijeme izolacije pokoji cvijet bude otvoren, potrebno ga je ukloniti jer nam nije poznato da li je ve alogamno opraen polenom nepoznatog porijekla koji je do cvijeta doao anemofilno (vjetrom) ili entomofilno (insektima).20

Za izolaciju se koriste papirnate vreice razliitih veliina koje je mogue lako privrstiti na granu voke sa cvijetom (Slika 32. i 33.). Papirnate vreice su prozrane, kroz njih prodire toliko svjetla koliko je potrebno za razvoj zametnutih plodova, a na jih se grafitnom olovkom mogu zabiljeiti podaci o krianju (Slika 34.).

Slika 32. Izolacijske vreice mogu se spojnicama privrstiti na granu voke (Foto: A. Vokurka)

Slika 33. Izolacijske vreice mogu stajati na stablu nekoliko tjedana (Foto: A. Vokurka)

Slika 34. Na izolacijske vreice mogu se grafitnom olovkom napisati podaci o broju izoliranih cvjetova i krianju (Foto: A. Vokurka)

Emaskulacijom (Slika 39.-40.) se spreava oplodnja cvijeta majinske biljke vlastitim polenom (samooplodnja) tako da se pravovremeno odstrane pranici (ili samo antere). Emaskulacija je nuna kod autofertilnih sorata voaka i kod vinove loze. Emaskulaciju je mogue izvesti: odstranjivanjem antera (polenovnica) ili cijelih pranika: eljem, odnosno malim karama ili pincetom. Ovaj pristup zahtjeva brzinu jer postupak treba provesti u kratkom vremenskom roku kada su svjetovi ve otvoreni, ali prije otvaranja (pucanja) samih antera.21

Pri vrlo toplim i suhim vremenskim prilikama antere pucaju vrlo brzo, pa je i rok za provedbu emaskulacije vrlo kratak. odstranjivanjem latica i pranika: karicama ili pincetom, ili jednostavno prstima. Koristi se kad su cvjetovi neposredno pred otvaranjem, a da bi se uklonili pranici potrebno je prije toga ukloniti i latice.

Pri emaskulaciji potrebno je odstraniti nedovoljno razvijene cvjetove i cvjetove koji su ve otvoreni, ime se ujedno postie i prorijeivanje cvatova. Nakon emaskulacije samooplodnih cvjetova potrebno ih je izolirati jer samooplodni cvjetovi se takoer mogu oploditi i polenom koji dolazi sa strane. Meutim, ako se prilikom emaskulacije odstranjuju i latice, tada izolacija nije nuna jer cvjet bez latice ne moe privui insekte - ali je ipak preporuljiva zbog zatite cvijeta.

Slika 39. - 40. Prikaz emaskulacije cvijeta jabuke (Foto: A. Vokurka i studenti gen. 2005./06.)

22

Cvat kod jabuka i kruaka (gronja), trenje i vinje (titac) svakako je pred provoenje izolacije odnosno emaskulacije samooplodnih sorata potrebno prorijediti. Za uspjeniju hibridizaciju odabiru se jae razvijeni cvjetovi, a to su uglavnom cvjetovi koji se nalaze na sredinjem dijelu cvata.

Umjetno opraivanje Umjetnom opraivanju pristupa se nakon to se prema planu hibridizacije obave sve pripremne radnje. Pripremne radnje kod samooplodnih , odnosno stranooplodnih voaka ukljuuju slijedee: Samooplodne voke: Emaskulirani cvjetovi (i eventualno izolirani ako prilikom emaskulacije nisu odstranjene latice, i ako cvjet elimo dodatno zatititi). Stranooplodne voke: Izolacija cvjetova kako bi se sprijeio dolaz polena nepoznatog porijekla. Umjetnom opraivanju pristupa se nekoliko dana nakon to je izvedena emaskulacija i izolacija, budui da je obje radnje potrebno obaviti 2-3 dana prije potpunog otvaranja cvijeta i vremena kad njuka tuka postaje spremna za prihvat polena. Polen se na njuku tuka moe nanijeti finim tankim kistom, staklenim tapiem, pumpicom, ili jednostavno prstom. Osim gore spomenutih radnji na cvjetovima majinskih biljaka, potrebno je na vrijeme imati sakupljen i pripremljen polen. Iznimno, polen se na njuku tuka majinske biljke moe nanijeti i izravno sa pranika oinske biljke, tj. izravno sa ubranih cvjetova oinske biljke. Uvjet za takav pristup je istovremenost sazrijevanja polena i njuke tuka kod oba genotipa koje je potrebno iskriati, tj. istovremenost fenofaza cvatnje. Praktine vjebe A: Provjera stupnja samooplodnje Stupanj samooplodnje moe se jednostavno provjeriti metodom izolacije cvjetova prema slijedeem postupku: prije cvatnje izolira se 100 (200 ili 300) cvjetova pergament vreicama kako bi se sprijeilo alogamno opraivanje polenom nepoznatog porijekla i osiguralo opraivanje tuka polenom istog cvijeta prilikom izoliranja cvjetova odstrane se slabije razvijeni cvjetovi i cvjetovi koji su ve otvoreni precizno se izbroji koliko je cvjetova pod svakom vreicom i i taj broj se zapie na vreicu obinom grafitnom olovkom (jer je grafitna olovka najpostojanija na kii i sunevu svjetlu) zametnuti plodovi mogu se opaziti kroz 15-20 dana, a vreice moemo skinuti kad na stablu vie nema cvjetova zametnuti plodovi se pobroje, a stupanj samooplodnje se izraava kao postotak od ukupno izoliranih cvjetova prije izolacije

-

-

23

B: Utvrivanje najboljeg opraivaa

Za ovu vjebu potrebno je imati unaprijed prikupljen polen sorata (npr. jabuke, ljive ili trenje) za koje se pretpostavlja da bi bili dobri opraivai nekoj stranooplodnoj sorti. Postupak je identian kao i kod planske hibridizacije prema utvrenom oplemenjivakom planu. izolacija cvjetova neposredno pred otvaranje, s tim da se uklone cvjetovi koji su otvoreni jer za njih postoji vjerojatnost da su ve opraeni emaskulacija nije potrebna jer utvrivanje najboljih opraivaa ima smisla samo za stranoplodne sorte kod kojih spreavanje samooplodnje emaskulacijom nije potrebno nekoliko dana nakon postavljanja izolacije, u trenutku kad njuka tuka postane ''zrela'' za primanje polena, papirna izolacija se skine polen koji je unaprijed pripremljen nanosi se kistom, staklenim tapiem, pumpicom ili prstom na njuku tuka ovako opraen cvijet ponovno se zatiti papirnom vreicom za izolaciju

24

Dormantnost i stratifikacija sjemenaDormantnost je jedan od najvanijih faktora koji utjeu na uspjeh klijanja sjemena i u proizvodnji krianaca je potrebno razumjeti fizioloke mehanizme koji djeluju na njeno trajanje. Dormantnost je svojstvo sjemena da neko vrijeme nakon zriobe miruje - privremena nesposobnost klijanja u periodu jarovizacije (vernalizacije). Ovaj period se jo naziva period naknadnog dozrijevanja sjemena (afterripening). Dormantnost je fizioloki mehanizam prilagodbe razvijen kod biljaka umjerenog klimatskog podruja kako bi u ranijim stadijima razvitka izbjegle nepovoljne prilike tijekom kasne jeseni, zime i ranog proljea.Dormantnost ima ulogu prevencije klijanja u nepovoljnim zimskim uvjetima to omoguuje preivljavanje potomstva.

Priroda dormantnosti nije u potpunosti razjanjena - ranije se smatralo da je glavni uzrok dormantnosti vrst endokarp (kod kotiavog voa - Prunoideae) (Slika 41 ), to je samo djelomino tono. Tvrd endokarp samo donekle usporava klijanje, jer oteava upijanje vlage i disanje, a glavni uzrok dormantnosti je kemijsko-fizioloke prirode.

Slika 41: Graa ploda kotiavog voa (Izvor: http://waynesword.palomar.edu)

Unutar sjemena nalaze se specifine tvari koje inhibiraju klijanje (koje se zajedniki nazivaju dormeni), a pod utjecajem niskih temperatura te se tvari postupno razgrauju. Dvije vrste dormantnosti: primarna i sekundarna.

25

Primarna dormantnost je dormantnost prisutna u zrelom sjemenu u trenutku ubiranja ploda (kad je plod fizioloki zreo). To je endogena dormantnost, koju uzrokuju kemijski inioci koji se nalaze u samom sjemenu dormeni - kemijske tvari koje se nalaze u integumentima sjemenog zametka (iz kojeg nastaje zatitni omota sjemena), ali ih ima i u samom embriju. Sjeme kojemu je dormantnost u primarnoj fazi ne moe proklijati kad bi se i nalo u uvjetima pogodnim za klijanje (temperatura, vlaga, tlo) zato to su dormeni fiziki prisutni u sjemenu (nisu se jo razgradili pod utjecajem niskih temperatura). Dormeni spreavaju klijanje, ali se pod utjecajem niskih temperatura tijekom zimskog perioda razgrauju to omoguuje klijanje sjemena nakon to temperature porastu. Tvari koje uzrokuju dormantnost su po kemijskom sastavu vrlo raznolike, a produkt su fiziolokih i biokemijskih reakcija metabolizma: derivati benzojeve kiseline: ABA, salicilna i cimetna kiselina, kumarin, apscisinska kiselina i dr. Sekundarna dormantnost je dormantnost koja onemoguuje klijanje i nakon razgradnje dormena, a uzrokovana je nepovoljnim ekolokim uvjetima kao to su previsoka ili preniska temperatura, ili nedostatak vlage u tlu. U ovakvim uvjetime sjeme ne moe proklijati unato tome to su dormeni (primarna dormantnost) ve razgraeni utjecajem niskih temperatura. im ekoloki uvjeti za klijanje sjemena postanu povoljni, a nakon to sjeme proe stadij vernalizacije (jarovizacije) ili stratifikaciju, sjeme moe proklijati. Vernalizacija (jarovizacija): je period u kojem je sjeme dormantno i tijekom kojeg postupno dolazi do gubitka dormantnosti u prirodnom okruenju. Stratifikacija: je biotehniki postupak kojim se skrauje period dormantnosti i pospjeuje bre i ujednaenije klijanje sjemena za potrebe rasadniarske proizvodnje (npr. generativnih podloga breskve) ili oplemenjivanja voaka Metode stratifikacije uvanje sjemena na suhom i hladnom mjestu. uvanje sjemena na vlanom i hladnom mjestu - ova metoda se najvie koristi jer je uinkovita i jednostavna. Sastoji se od naizmjeninog slaganja redova vlanog pijeska ili piljevine i redova sjemena u plastine ili drvene sanduke koji se ostavljaju stajati od nekoliko tjedana do nekoliko mjeseci uz povremeno polijevanje. Natapanje sjemena u kemijskim razrijeenim otopinama (tiourea, KNO3, polietilen glikol, sumporna kiselina, natrijev hidroksid, aceton, etanol) Mehaniko razbijanje tvrdog endokarpa Mehaniko struganje i grebenje sjemena - skarifikacija Kratko potapanje sjemena u kipuoj vodi odvajanje embrija od ostatka sjemenke

26

U praksi se koristi metoda dranja sjemena na hladnom i vlanom mjestu, i eventualno skarifikacija (za to su konstruirani posebni ureaji), dok ostale metode imaju ogranienu i uglavnom eksperimentalnu primjenu. Niske temperature mogu imati razliit efekt ovisno o tome koliko sjeme upije vlage. Svi postupci kod kojih nije ukljuena niska temperatura ne mogu zamijeniti djelovanje niskih temperatura na sjeme, ve samo donekle omoguuje klijanje. Praksa je pokazala da sjeme nakon perioda od 2-3 godine ima bolju klijavost nego sjeme koje je prolo kroz proces stratifikacije i koje je posijano idue vegetacijske sezone, ali u proizvodnji se ne moe ekati. Kod temperature od 0-10 C, prirodno mirovanje sjemena pojedinih vrsta traje od 36 do 180 dana, ali pojedine sjemenke i znatno dulje. Prema razliitim literaturnim navodima, prirodno trajanje dormantnosti sjemena pojedinih vrsta je varijabilno, a ovisi i o genotipu (genetski je uvjetovano svojstvo): Jabuka Kruka Trenja Vinja ljiva bistr. Breskva 76 - 120 dana 74 - 119 dana 90 - 143 dana 180 dana 100 - 149 dana 70 - 117 dana

Stratifikacija sjemena Prunoidea Tijekom stratifikacije simuliraju se prirodni uvjeti kojima je sjeme inae izloeno u prirodi preko zime. Optimalna temperatura za stratifikaciju Prunoidea je u interval izmeu 3 i 5 C, u trajanju od nekoliko mjeseci. Prema nekim autorima ovu temperaturu treba u nekoliko intervala izmjenjivati sa viom temperaturom zbog uspostave ravnotee izmeu rasta korjenia i hipokotila (na niim temperaturama korijen puno bre raste od hipokotila). Osim toga, topli intervali omoguuju slabije razvijenim embrijima da se u potpunosti razviju. Stratifikacija sjemena Pomoidea Dormantnost je u Pomoidea zbog nepostojanja tvrdog endokarpa neto slabije izraena nego kod kotiavog voa, pa su i postupci za njeno uklanjanje blai. Dormantnost svjeeg sjemena jabuka i kruaka se gubi ukoliko ga podvrgnemo hladnoj stratifikaciji na 3-5 C u trajanju od 6 mjeseci. Za sjeme izdvojeno iz potpuno zrelih ili ak natrulih jabuka dovoljan je krai period stratifikacije nego za sjeme iz plodova nieg stupnja zrelosti. Kod kruaka je ustanovljena jaa dormantnost sorata koje su porijeklom iz klimata sa hladnijim zimama, dok stratifikacija sorti iz toplijeg klimata traje krae i odvija se pri neto viim temperaturama, to je logina pojava jer dormantnost i slui za spreavanje klijanja tijekom zime. Dormantnost se kod sjemena jabuke moe prekinuti uklanjanjem ovojnice sjemena a da se sjeme ne podvrgne hladnoj stratifikaciji. Biljke iznikle iz takvog sjemena pokazuju patuljast ili rozetast rast, sa kratkim internodijima - nakon nekoliko mjeseci poprimaju normalan rast. Za veinu sorata kruaka i jabuka skidanje ovojnice nije dovoljno za prekid dormantnosti - ono moe samo skratiti dormantnost.

27

Da bi se postigla klijavost od 50% na 25 C, prema nekim literaturnim navodima cijelo sjeme jabuke trai 65 dana hladne stratifikacije na 3-5 C, a oguljeno samo 30 dana. Kemijska sredstva za uklanjanje dormantnosti kod jabuke i kruke nisu dala dobar rezultat. Teko je rei koji je optimalni period za hladnu stratifikaciju kod Pomoidea zbog velike genetske varijabilnosti u duljini dormantnosti.

28

Planska hibridizacija kod vinove loze

Kod vinove loze se tradicionalne tehnike oplemenjivanja takoer temelje na saznanjima o razvoju i morfolokoj grai cvijeta, oplodnji i klijanju sjemena. Posebnost vinove loze je postojanje tri osnovne vrste cvijeta.1.) Dvospolni (hermafroditni) cvijet (Slika 42. i 43.) ima razvijene pranike i tuak i

samooplodan je. Ovakav cvijet je najei kod vinove loze.

Slika 42. Dvospolni cvijet vinove loze (Izvor: www. nysaes.cornell.edu)

Slika 43. Cvat vinove loze (grozd) (Izvor: www. nysaes.cornell.edu)

2.) Pistilarni cvijet - funkcionalno enski cvijet. Filamenti pranika su nerazvijeni i svinuti su prema dolje. Polen takvih cvjetova se morfoloki razlikuje od normalnog polena (nema poru i brazdu po kojoj polen puca prilikom klijanja na njuci tuka). Sorte sa ovakvim cvjetovima zahtijevaju drugu sortu opraivaa, a primjer su neke nae autohtone sorte: Grk i Mukat rua. 3.) Staminalni cvijet (Slika 44.) - morfoloki i funkcionalno muki cvijet kod kojega do zastoja u razvoju tuka dolazi u razliitim fazama nastanka embrionske vree (megasporogeneze). Kod nekih genotipova embrionska vrea se uobiajeno razvija samo to je upola manja, ali se ne razviju ostali dijelovi tuka potrebni za oplodnju.

Slika 44. Staminalni cvijet koji nema razvijen tuak (Izvor: www.nysaes.cornell.edu)

29

Primjena citokinina na reguliranje cvatnje: Dodatak citokinina u ranim fazama nastanka embrionske vree moe promjeniti ravnoteu inhibitora (kod staminalnih cvjetova), tako da se tuak ipak moe normalno razviti, to moe imati praktinu primjenu u oplemenjivanju. Primjena citokinina kod pistilarnih cvjetova da bi se dobili hermafroditni, ne daje rezultate. Dinamika cvatnje vinove loze Cvatnja (otvaranje cvjetova) je najintenzivnije izmeu 6 i 11 sati prije podne, a popodne samo sporadino. Emaskulacija i kontrolirana hibridizacija (praktina vjeba): Postupak je prikazan na slikama 45. - 48. 1. emaskulacija: prije otvaranja cvjetova otkinuti pincetom kapicu i pranike na 20-30 cvjetova po grozdu, a ostale ukloniti (prorijeivanje cvata) 2. izolirati grozdove emaskulirane cvatove (cvatove majke) 3. ekati 1-2 dana za oplodnju kako bi tuak bio zreo za primanje polena 4. opraivanje nanoenjem prethodno sakupljenog polena kistom ili prstima

Slika 45. Skidanje kapica i emaskulacija Izvor: www.nysaes.cornell.edu

Slika 46. Nanoenje polena kistom Izvor: www. www.nysaes.cornell.edu

Slika 47. Izgled grozda (cvat) kojem su uklonjene polenovnice. (Izvor: www.nysaes.cornell.edu)

Slika 48. Polen se moe nanositi i izravno sa cvijeta oinske biljke Izvor: www. www.nysaes.cornell.edu

30

O krianjima vinove loze moe se vie saznati na: www.nysaes.cornell.edu/hort/faculty/reisch/breeding/crossing1.html Skraivanje juvenilnog stadija kod vinove loze Juvenilni stadij je vremenski period koji poinje nicanjem sjemenjaka iz sjemena, a zavrava zametanjem prvih generativnih (cvjetnih) pupova i uolaskom u rod. Upravo juvenilni stadij je najvaniji imbenik dugotrajnosti u oplemenjivanuju voaka i vinove loze, i cilj je skratiti ga na najmanju moguu mjeru prilikom ispitivanja sjemenjaka. Juvenilni period kod vinove loze traje od 3 - 6 godina, a moe se skratiti na razliite naine. 1. U uvjetima staklenika uz rezidbu koja stimulira nastanak rodnih pupova. 2. Okuliranje - uzimanje pupova i plemki juvenilnih biljaka i njihovo okuliranje na trsove koje su u fazi rodnosti 3. Primjena citokinina - na vegetativni vrh biljke krianca uzgojene u loncu djeluje se citokininima to dovodi do nastanka fertilnih cvatova, na mjestima gdje bi se inae razvile vitice. Na taj nain mogue je dobiti cvjetove ve 4 tjedna nakon klijanja sjemena.

Somatske mutacije i klonska selekcija vinove loze Prirodne i inducirane mutacije su vaan izvor varijabilnosti kod vinove loze. Prirodni mutanti su rezultat promjene u genimu stanica meristemskog tkiva iz kojih zapoinje razvoj organa (vidljive mutacije) - pojava novog svojstva ili poboljanje postojeeg svojstva esto je razultat pozitivne mutacije. Klonske sorte su sorte nastale kao vegetativni potomci jednog genotipa. Takve sorte, pogotovo ako su ve dugo u uzgoju (stotinu i vie godina) i ako su rasprostranjene na irem geografskom podruju nakupile su veliku koliinu mutacija (vidljivih ili latentnih). Takve sorte su somatski heterogene i dobar su izvor genetske varijabilnosti unutar kojeg se moe provoditi klonska selekcija.

Slika 49. Pinot crni

Slika 50. Pinot sivi

31

Mutacije se najvidljivije kao promjene u boji bobica, razlike u obliku lista, obraslosti dlaica, promjeni veliine ploda, i ovakve mutacije je lako uoiti unutar polazne populacije. Grupa sorata Pinot (Bijeli, Sivi, Crni) (Slika 49. i 50.), kao i neki besjemeni mutanti koji su zanimljivi kod stolnog groa, nastali su uoavanjem prirodnih mutacija unutar postojeih populacija. Postoje i mutacije koje imaju utjecaj na fenoloka svojstva (npr. ranija ili kasnija zrioba) ili svojstva koja utjeu na kvalitetu (sadraj eera i kiselina, visina prinosa). Promjene u ovakvim svojstvima tee se uoavaju, ali ih je mogue zapaziti redovitim promatranjem fenofaza ili mjerenjima (kemijske analize mota, vaganje). Ponekad male fenotipske razlike sline klonskim proizlaze i od djelovanja virusa i viroida ali i zbog djelovanja abiotskih faktora. Ovo je negenetska varijabilnost koju treba razlikovati od genetske naslijedne varijabilnosti.

Ocjenjivanje svojstava i odabir potencijalnih klonova za priznavanje provodi se po razraenim shemama klonske selekcije tijekom koje se veina poetno odabranih kandidata eliminira. Nova ili poboljana svojstva moraju imati ekonomsku vanost - u poetnim koracima klonske selekcije izabiru se superiorni "potencijalni klonovi", a nakon viegodinjeg ocjenjivanja njihovih svojstava eventualno se pristupa proceduri administrativnog priznavanja klona i putanju u proizvodnju. Tijekom klonske selekcije potrebno je eliminirati materijal koji je zaraen virusima i virusima slinim organizmima, jer klonovi koji e se priznati i uvrstiti u rasadniarsku proizvodnju kao matini trsovi moraju biti bezvirusni (virus free). Unutar populacija koje su se tradicionalno razmnoavale cijepljenjem plemki uzetih iz proizvodnih vinograda (a ne od matinih trsova koji su rezultat klonske selekcije), osim trsova sa pozitivnim mutacijama postoje i trsovi zaraeni virusima kakve je potrebno eliminirati. Eliminacija takvih genotipova provodi se sanitarnom selekcijom, koja je uz genetsku selekciju jednakovana komponenta klonske selekcije. Ako meu genotipovima koji imaju neka dobra gospodarska svojstva ima onih koji su zaraeni virusima, moe se pristupiti biotehnolokim metodama njihova ozdravljivanja (termoterapija, kultura tkiva). Ove metode su ponekad skupe, pa dobra gospodarska svojstva i potencijal genotipa mora opravdati njihovu primjenu. Ozdravljivanju nekom od biotehnolokih metoda moe se pristupiti i u sluaju ouvanja starih sorata koje su na granici izumiranja, to je est sluaj kod hrvatskih autohtonih sorata.

Genetska selekcija Klonska selekcija Sanitarna selekcija

Odabir genotipova pozitivnih svojstava

Eliminacija genotipova zaraenih virusima, ili njihovo ozdravljivanje

32

Lista svojstava za opis vrsta Vitis i sorata Vitis vinifera - lista deskriptora Meunarodna organizacija za vinovu lozu i vino (OIV) napravila je standardizirani popis svojstava i ocjenjivanja tih svojstava sa ciljem da se osigura jedinstvo u ocjenjivanju i izbjegne subjektivnost. Svako svojstvo je oznaeno kodom (brojem) i za svako svojstvo postoje razine ekspresije koje se oznaavaju brojevima od 1 do 9 (u nekim sluajevima i 10). Za svako svojstvo je tono definirano vrijeme opaanja tj. razvojni stadij u kojem se vri opaanje, to je od iznimne vanosti za pravilnu provedbu ocjenjivanja. Za svaku razinu ekspresije se kao primjer navodi sorta ili vrsta koja se odlikuje upravo tom razinom ekspresije, a pojedina morfoloka svojstva i njihova razliita ekspresija prikazani su crteom. Promatranje svojstava obavlja se vizualno ili drugim osjetilima (miris, okus), a kvantitativna svojstva se mjere i svrstavaju u razrede prema razini ekspresije. Svojstva kao to su otpornost na bolesti i tetnike, visina prinosa, udio eera u motu potrebno je pratiti kroz vie godina. Popisom je obuhvaeno 128 morfolokih i kvalitativnih svojstava koja se u praksi najee sva ne koriste, nego postoje minimalne liste koje odreuju svojstva obavezna za odreeni cilj. Za kolekcioniranje germplazme i osnivanje ''banaka gena'' postoji minimalna lista od 21 svojstva (tzv. primarni deskriptori).

33

Primjena molekularnih tehnika u detekciji mutacija i identifikaciji sorata

Molekularne tehnike u detekciji mutacija i identifikaciji sorata zasnivaju se na analizi DNA, a osnovni uvjet za DNA analizu je postojanje kvalitetna DNA, tj. izolirane (ekstrahirane) na nain da se analiza moe provesti na najbolji mogui nain. to znai kvalitetna DNA ? to manje primjesa koje oneiuju (polifenoli, polisaharidi) to manji stupanj razlomljenosti DNA to vea koncentracija DNA

Kvaliteta DNA varira ovisno o - vrsti s kojom se radi metodi ekstrakcije (postoje razne modifikacije) stanju uzorka (nain uzimanja i uvanja, starost uzorka)

Uzorke DNA za rutinsku analizu najbolje je uzimati poetkom vegetacije kada je list jo mlad. U stanicama mladog lista vakuole su jo male i u njima nema puno nakupljenih sekundarnih produkata metabolizma (polifenoli, polisaharidi) koji oneiuju uzorak i oteavaju optimizaciju PCR reakcije. Uzorci se sakupljaju tako da se ubere list (nekoliko mladih listova) i stavi izmeu filter papira u obinu plavu papirnatu kuvertu. Koverte je potrebno oznaiti kodom uzorka i imenom sorte, a potrebno je napisati datum sakupljanja. Nekoliko takvih kuverti stavlja se u PVC vreicu i u prijenosni hladnjak u kojem uzorci mogu stajati nekoliko sati do dolaska u laboratorij. Uzorci mogu stajati i nekoliko dana u hladnjaku na temperaturi od +4C. U laboratoriju se uzorci odlau u zamrziva s temperaturom od -80C (Slika 51.) u kojem se mogu uvati i vie godina, odnosno do trenutka izolacije. Ovako niska temperatura spreeva degradaciju DNA.

34

Princip izolacije DNA

Priprema za izolaciju nakon sakupljanja i uvanja uzoraka moe se odvijati na dva naina:

Liofilizacija Sakupljanje uzoraka i uvanje na -80C

Mljevenje suhog lista

Protokol izolacije

Tretiranje tekuim duikom

Usitnjavanje smrznutog tkiva

Protokol izolacije

Suenje lisnog tkiva odvija se u vakuumu u ureaju koji se zove liofilizator (Slika 52.), a traje od jednog do nekoliko dana. Suenje u vakuumu spreava degradaciju DNA ime se postie visoka koncentracija uzorka DNA nakon izolacije. Suhi uzorak se samelje u fini prah (Slika 53.) koji se inkubira u izolacijskom puferu, ovisno o daljnjem protokolu izolacije. Drugi nain pripreme uzoraka je njihovo tretiranje tekuim duikom koji prilikom isparavanja ima temperaturu od -196C na kojoj se tkivo trenutno smrzne i mogue ga je lagano zdrobiti.

Slika 51. uvanje uzoraka lista Slika 52. Liofilizator na temp. od -80C (Foto: S. Bolari) (Foto: S. Bolari)

Slika 53. Ureaj za mljevenje suhog lista (Foto: S. Bolari)

35

Osnovni princip izolacije DNA (Slila 54.): 1. inkubacija u izolacijskom puferu (deterent - CTAB, DTAB i dr.) (Slika 55.) 2. odvajanje DNA od ostalih komponenti (proteini, RNA, polifenoli i polisaharidi) 3. daljnje ispiranje DNA u alkoholu 4. resuspendiranje u puferu i provjera istoe i koncentracije DNA 5. uvanje uzorka DNA na -20 C

Slika 54: Osnovni princip izolacije DNA

Slika 55. Inkubacija uzoraka u izolacijskom puferu (Foto: S. Bolari)

36

Uvod u molekularne markereMolekularni markeri: proteini, enzimi ili dijelovi kromosoma (fragmenti DNA) koji su specifini za neki genotip i imaju specifinu mobilnost u elektrinom polju. Jo 1970ih godina su se razvile tehnologije molekularnih markera koje se baziraju na proteinima i na DNA, ali bez njenog umnaanja u lananoj reakciji polimeraze (PCR - Polymerase Chain Reaction).

Ne zasnivaju se na PCR-u Molekularni markeri Zasnivaju se na PCR-u

Proteinski markeri: izoenzimi DNA markeri: RFLP

Svi su DNA markeri: RAPD, SSR, ISSR i dr.

Izoenzimi: Izolacija proteina (ne DNA) Elektroforeza proteina - razdvajanje proteina prema veliini u elektrinom polju Ova metoda se naputa jer postoje nove metode zasnovane na PCR-u koje su jednostavnije, informativnije i preciznije

RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Potrebna je vea koliina DNA (jer nema PCR amplifikacije) koja se tretira DNA endonukleazama koje cijepaju lanac DNA Elektroforezom se u gelu razdvajaju fragmenti - dobiva se neprekidan razmaz koji sam po sebi ne nosi korisnu informaciju U gelu se u postupku southern blot oznauju pojedini fragmenti, i to pomou specifinih radioaktivno oznaenih proba koje se lijepe na njima komplementarne fragmente u gelu Tako oznaen gel se vizualizira radiogramski - rendgenska slika

37

PCR - Polimerase Chain Reaction (Lanana reakcija polimeraze)

Ovaj postupak je oznaio revoluciju u molekularnoj biologiji i drugim znanostima koje primjenjuju metode molekularne biologije. Bit lanane reakcije polimeraze je umnaanje fragmenata DNA koje se odvija geometrijskom progresijom (1 - 2 - 4 - 16 - 256 itd.), ime se poveava broj lanaca DNA razliite duine koji se nakon razdvajanja u elektrinom polju (elektroforeza) mogu vizualizirati (UV svjetlo nakon bojanja posebnim bojama ili radiogramski). PCR se sastoji od tri osnovne faze:1. 2. 3.

denaturacija: razdvajanje dvostrukog lanca DNA na 94 C ime se omoguuje nalijeganja oligonukleotidnog primera nalijeganje oligonukleotidnih poetnica ili primera (annealing) pri temp. od 50-68 C na njima komplementarna mjesta na DNA. amplifikacija ili elongacija (amplification / extension) pri 72 C pri emu dolazi do produljenja (elongacije) novonastalog lanca ugradnjom deoksinukleotida (graevne jedinice za DNA)

PCR reakciju (Slika 56.)je potrebno optimizirati ovisno o biljnoj vrsti, kvaliteti DNA, sustavu molekularnih markera i poetnicama koje se koriste. Svaki od ovih koraka trajke od 30 do 120 sekundi, a ciklus se ponavlja 20 - 40 puta. Reakcija se odvija u aparatu tzv. thermocycleru (Slika 57.) kojeg je mogue programirati i koji omoguuje brzu izmjenu temperatura pojedinih koraka.

Slika 56: Shematski prikaz PCR reakcije. (1) Denaturacija na 94-96C (2) Nalijeganje oligonukleotidnih poetnica (3) Produljenje lanca na 72C (P=Taq polimer.). (4) Zavretak prvog ciklusa. Dva novonastala lanca DNA slue kao kalup za slijedei ciklus udvostruujui koliinu novonastale DNA (Izvor: www.wikipedia.org)

38

Komponente koje su sastavni dio PCR reakcije: 1.) DNA - slui kao ''kalup'' na osnovu kojeg u reakciji nastaju novi fragmenti koji se kasnije razdvajaju u elektrinom polju u procesu elektroforeze. 2.) Deoksinukleotidi (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) koji su ''graevne jedinice'' koje slue za nastanak novog lanca (dueg ili kraeg fragmenta) 3.) Poetnice (primeri) - oligonukleotidni lanci tzv. klice (prema Stryerovom udbeniku za biokemiju) duine 10 - 25 baza. Primeri nalijezu na osnovni lanac i amplifikacija DNA ide smjerom 3' 1' Primeri, da bi mogli nalijegati na osnovnu DNA, moraju biti u tom segmentu od 10 - 25 baza homologni osnovnom lancu. 4.) Taq polimeraza (ita se ''Tag'') - enzim ijim djelovanjem, uz prisustvo svih ostalih komponenti nastaju novi fragmenti. Enzim podnosi temperature i do 98C, a izoliran je iz bakterije Thermus aquaticus koja obitava u toplim izvorima podzemnih voda (nacionalni park Yellowstone) 5.) MgCl2 - magnezijev ion ima ulogu kofaktora bez kojeg polimeraza ne moe raditi 6.) Pufer - pufer ima odreeni kemijski sastav koji osigurava optimalan pH pod kojim se odvija cijela reakcija 7.) BSA - bovine serum albumine ima ulogu pojaivaa reakcije, no nije neophodan u reakciji Sve ove komponente su komercijalno dostupne, neke su vrlo skupe (Taq polimeraza), osim DNA koju je potrebno analizirati i koju prethodno treba izolirati iz uzorka svjeeg ili liofiliziranog lisnog tkiva.

Slika 57. Ureaj za umnaanje DNA (Thermal cycler) (Izvor: www.wikipedia.org)

Slika 58. Sustav za elektroforezu ''Gibco'' (Foto: A. Vokurka)

39

RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) Kod ove metode umnaamo (amplificiramo) fragmente DNA, i to randomizirano, ''napamet'', i nije nam unaprijed poznato koliko emo fragmenata dobiti, koje su oni duine..., i da li emo ih uope dobiti. Kod razliitih uzoraka (genotipova) dolazi do amplifikacije DNA na razliitim mjestima pri emu nastaju fragmenti razliitih duina koji u elektroforezi prevaljuju razliite putove. Ovo je primjer slike koja nastaje primjenom RAPDa, a slina je i za ISSR i AFLP Manja koliina DNA se amplificira PCR reakcijom Poetnice su nespecifine, sluajno odabrane, to znai da amplificiraju nepoznatu regiju DNA Elektroforeza produkata na agaroznom gelu (Slika 58.) Bojanje gela u ethidium bromidu, vizualizacija fregmenata preko UV transiluminatora (Slika 59. i 60.) i oitavanje fotogrefije (Slika 61.).

Slika 59. Namjetanje agaroznog gela na UV transiluminator (Foto: A. Vokurka)

Slika 60. Priprema za fotografiranje Polaroid kamerom (Foto: A. Vokurka)

*

*

*

*

*

Slika 61 Izgled gela sa RAPD markerima nakon elektroforeze, bojanja i osvjetljivanja UV svjetlom. Zvjezdicama su oznaeni genotipovi koji imaju pojedine specifine markere

40

SSR (Simple Sequence Repeats) Ovom metodom se amplificira tzv. mikrosatelitska DNA . Primjer mikrosatelitske DNA jest npr AGAGAGAGAGAGAGAG... ili ATATATAT... n puta, pri emu je n=50 - 150, to se oznaava kao (AG)n ili (AT)n. Mikrosatelitska regija ima 100 do 300 baza. Za pojedine mikrosatelite potrebno je unaprijed dizajnirati poetnice koji e nalijegati neposredno uz mikrosatelit i omoguiti amplifikaciju samog mikrosatelita. Dizajniranje poetnica je poseban postupak koji se zasniva na odreivanju slijeda baza u DNA (sekvencioniranje). ACTCGGGCTTTTAATGGCATATATATATAT... Poetnica: TGAGCCCGAAAATTACCG Mikrosatelitska regija kod diploidnih organizama moe biti istovjetna na oba kromosoma (AA ili aa = dominantni ili recesivni homozigot), ili razliita (heterozigot = na jednom kromosomu A to predstavlja dui lanac, a na drugom kromosomu a, ili krai lanac). Varijabilnost se detektira na osnovu duine mikrosatelita: sorte se razlikuju u broju parova mikrosatelitskih baza, a mogu biti heterozigoti ili homozigoti - pomou ove injenice mogue je dokazivanje oinstva Na donjoj shemi vide se tri uzorka, prvi je dominantni homozigot (AA), zatim heterozigot (Aa), i zadnji je recesivni homozigot (aa). U elektroforezi kraci lanac (142 baze) prevaljuje dui put u el. polju, dok dui lanac (144 baze) u istom vremenu prevaljuje krai put. Heterozigot (Aa) sadri oba lanca, dui i krai, to se vidi na gelu nakon razdvajanja fragmenata. Manja koliina izolirane DNA se amplificira u PCRu Poetnice su specifine, amplificiraju regiju mikrosatelita Elektroforeza produkata na poliakrilamidnom gelu, ili na sintetskom Spreadex gelu Bojanje gela Sybr-gold ili Sybr-green bojama i vizualizacija fregmenata preko UV transiluminatora

SSR regija

AA - homozigot Aa - heterozigot aa - homozigot

144/144 144/142 142/142

Slika 62: Analiza mikrosatelita (SSR) i princip odreivanja roditeljskih veza

Smjer u el. polju

A A __ __ a a __ __

144 bp A 142 bp a

41

ISSR (Inter Simple Sequence Repeats) U metodi se koriste primeri koji nalijeu na mikrosatelitsku regiju, dakle za razliku od mikrosatelita, ne amplificiraju se mikrosateliti, nego regije DNA izmeu mikrosatelita, dok mikrosatelitska regija slui kao ''sidro'' za primer. Dobiva se slika slina RAPDu.

AFLP (Amplified Fragment Length Polimorphism) Ova metoda je neto zahtjevnija jer se izolirana DNA prvo tretira restrikcijskim enzimima (MseI i EcoRI su najei) - nastaje itav niz fragmenata nepoznatih slijedova na ije krajeve se ''nakae'' adapteri poznatog slijeda. Adapteri su potrebni jer je njihov slijed poznat, a svrha im je da se na osnovu adaptera u reakciji koriste homologni primeri koji na njih nalijegnu, i od kojih dalje kree amplifikacija pojedinih fragmenata. Zahtjeva DNA velike istoe i nefragmentiranu DNA se prvo tretira restrikcijskim endonukleazama, npr. MseI i EcoRI, ali postoje i druge Pomou specijalnih adaptera amplificira se zona neposredno uz podruje djelovanja endonukleaze tako da poetnice prepoznaju adapter Vertikalna elektroforeza u poliakrilamidnom gelu Poetnice su oznaene radioaktivno (radiogramska vizualizacija), ili se poliakrilamidni gel boji u srebrnom nitratu

Da li fragmenti (''crtice'' ili markeri) nastali u PCRu predstavljaju i pojedina svojstva? Odgovor je i DA i NE, ali ipak najee ne. Naime, svojstva ili fenotip kao rezultat djelovanja okoline i gena je rezultat samo jednog malenog dijela genoma koji predstavlja gene i koji se transkribira u proteine. Najvei dio genoma ne predstavlja gene, nego ima neku drugu funkciju, za sada nepoznatu (to je evolucijski zaostatak DNA, i mogue je da takva DNA koja se ne transkribira ima ulogu u npr. strukturi kromosoma i dijeljenju stanica). Ipak, jedna ''crtica'' u gelu moe predstavljati svojstvo u sluajevima kad se amplificirana regija nalazi u zoni dijela DNA koji predstavlja gen, ili ako je dovoljno blizu njega tako da crossingoverom ne dolazi do razdvajanja (vezana svojstva). Takvi markeri su iznimno vani u oplemenjivanju bilja, naroito u viegodinjih vrsta, jer omoguuju bri oplemenjivaki rad i bre izdvajanje pojedinih genotipova samo na osnovu DNA analize.

Zato su ipak vani i ostali fragmenti koji nuno ne predstavljaju svojstva? Vani su zbog toga to slue kao ''osobna karte'' ili ''fingerprint'' svakog pojedinog genotipa na osnovu kojih se obavlja identifikacija sorata - vano je u kontroli sadnog materijala i u rasadniarstvu. Mogu posluiti i u oplemenjivake svrhe za procjenu genetskih slinosti i razliitosti pojedinih populacija, to moe biti vano prilikom odabira roditelja. Molekularni markeri se koriste i za stvaranje genskih mapa.

42

Ograda: Nekoliko fotografija kojima nije naveden izvor ili su djelo autora, ili izvor zbog tehnikih razloga nije bilo mogue navesti, a da pri tome nije bila namjera otetiti niija prava. Skripta nije raena zbog komercijalne dobiti, a koristit e se samo za edukacijske svrhe. Disclaimer: Several photographs which do not have quoted its source are author's own work or, due to technical reasons, the quotation of its source was not possible, with no intention to harm any rights. The manuscript was not written for commercial gain and will be used only for educational purposes.

43