Slide 1

Struktura i funkcija nukleinskih kiselina

Sve poznate pojave i procesi biolokog naslijeivanja poivaju na osobinama strukture nukleinskih kiselina

To su sloene organske tvari velikih lananih molekula polimerne makromolekule- sastavljene od funkcionalnih jedinica koje se nazivaju nukleotidi

Nukleinske kiseline su zapravo polinukleotidi i u jednom molekulu moe ih biti na desetine hiljada i vie

Iz navedenog razloga, nukleinske kiseline spadaju u kategoriju najkrupnijih biolokih makromolekulaSastav nukleotidaAzotna baza (purinske i pirimidinske baze)Pentoza (petougljini eer)Fosfatna grupa

Struktura DNA

DNA ATG---C

Vodonine veze

Povezivanje nukleotida unutar jednog DNA lanca

Fosfatna grupa jednog nukleotida vee se za 3, ugljikov atom eera drugog nukleotida, tzv. fosfodiestarskim vezama

1

RNA struktura

RNA

Nukleotidi povezani u jednostruki polinukleotidni lanac

Tri vrste (informaciona, transportna, ribosomska)

Informaciona je prepis naslijedne poruke iz gena i prijenos iste na mjesto ostvarivanja (ribosomi)

Transportna doprema gradivne elemente (aminokiseline) za proteine na mjesto njihove sinteze

Iako nije dovoljno razjanjena, uloga ribozomalne RNA je povezivanje informacione i transportne RNA

Prema sastavu nukleotida,odnosno grai i funkciji polimera koje oni tvore, razlikujemo dva tipa nukleinskih kiselinaDezoksiribonukleinska kiselina (DNK)Ribonukleinska kiselina (RNA) Osnovne razlike u grai i funkciji nukleinskih kiselina Osobine DNARNAHemijski sastav (heterocikline azotne baze i eer)Purini: PirimidiniAdenin CitozinGuanin Timin*dezoksiriboza Purini: PirimidiniAdenin CitozinGuanin Uracil*ribozaProstorna struktura molekulaDvojni spiralni lanac nukleotidaJednostruki lanac nukleotidaBroj nukleotida u molekuli15.000-30.00020-6000Funkcija Pohranjivanje i naslijeivanje genetike informacijeUglavnom realizacija genetike informacije Lokacija u elijiUglavnom hromosomi (jedro)Uglavnom citoplazma DNADNA je primarni genetiki materijal, ona je nosilac genetike informacije (gena) u sveukupnom ivom svijetu

Stalnost ukupne koliine DNA po jednoj eliji je jedna od osnovnih genetikih karakteristika svake vrste organizma

Tri osnovne bioloke funkcije DNA

Autokataliza(replikacija)Heterokataliza (kontrola procesa metabolizma proizvodnja drugih supstanci)Mutabilnost (promjenljivost)

Replikacija DNA

Zasniva se na autokatalitikoj sposobnosti samoponavljanja, tj. kontroli produkcije sopstvenih kopija

Podjela dvolanane molekule na dva polulanca odigrava se u toku elijske diobe, a novonastali lanci od slobodnih nukleotida grade komplementarni polinukleotidni lanac

Svaki potomaki molekul DNA sastoji od jednog izvornog, roditrljskog lanca i jednog novosintetiziranog, komplementarnog lancaDNA replikacija

5 GGA TAT G 33 CCT ATA C 5Replikacija DNASinteza DNA odvija se u smjeru 5 3

Replikacija DNAZaostajui (tromi) lanac sintetizira se u kratkimOkazakijevim fragmentima

DNA replikacija

Replikacija DNA odigrava se pod dejstvom specifinih enzima DNA polimeraza, helikaza, SBB proteinatopoizomeraza..... a zapoinje djelovanjem RNA primazeKod prokariota replikacija se deava u roku od 20-30 min, a kod eukariota u proseku traje oko 8h. Duina trajanja replikacije kod eukariota zavisi od veliine molekula DNK.

Razdvajanje lanaca DNK i formiranje replikativne viljuke

DNA helikaze -Proteini (heksamerni enzimi) koji hodaju po DNA - Da bi se ostvarilo raskidanje vodoninih veza izmeu lanaca DNA potrebna je energija koja se dobija iz hidrolize ATPa, pri emu dio te energije helikaze koriste da klize po molekulu DNA, u smjeru sinteze DNA, 5-3 smjeru, raskidajui vodonine veze. Ovi proteini se zato nazivaju maina na ATP pogon.

Da bi se sprijeilo ponovno uspostavljanje vodoninih veza, iza helikaze se postavljaju SSB proteini koji omoguavaju da se dva DNA lanca dre otvorenim

SSB proteini (single-stranded DNA binding)-proteiniVezivanje je nezavisno od sekvence DNAElektrostatike interakcije sa fosfatnim vezama

DNA topomerazeOsnovna funkcija smanjenje tenzije uvrtanja u dvolananom dijelu DNA usled otvaranja replikativne viljuke

Geni-

Funkcionalni dijelovi molekule DNA, veliine od nekoliko stotina do nekoliko hiljada nukleotidnih parova

Lanci ljudske DNA sadre ukupno oko tri milijarde nukleotidnih parova

Svaki ljudski gen prosjeno sadri oko 1000 nukleotidnih parova

Dokazano je da dugi djelovi lancaDNA kod svih organizama nisu genetiki aktivni

Takoe, mnoge cjeline genetike ifre se ponavljaju

Pretpostavlja se da svega oko 30000 gena determinie osobine ovjeka, to je oko 2% genetskog potencijala ovjeka

Svojstvo svakog gena jeste da uvijek zauzima isto mjesto u lancu DNA (genski lokus)

Dio DNA (gen) koji zauzima taj lokus moe biti istovjetan kod svih pripadnika iste vrste, ili se moe javiti u dvije ili vie varijanti, koje se oznaavaju kao aleli

Aleli se meusobno mogu razlikovati po jednom ili vie parova azotnih baza(ili tipleta), od ega zavisi priroda i opseg njihovih funkcionalnih razlikaAko gen ima dvije varijante, rije je o alelnom paruTri ili vie varijanti istog gena oznaavaju se kao multipli aleli

Bez obzira u koliko se varijanti (alelnih oblika) javlja, jedan gen uvijek kontrolita istu osobinu ili grupu osobina

Svako od nas, za svaku naslijednu osobinu (izuzimajui spolno vezanu) nosi po dva alela, od kojih jedan potie od oca a drugi od majke

Kombinacije dva alela: AA, aa,-homozigoti i Aa-hetrozigoti

Dominantnost, recisivnostGenotip -genski sastav naslijednog materijala odreenog ivog organizma

Fenotip -sveukupnost onoga to se moe uoiti i zakljuiti o nekoj individui- izuzimajui njenu genetsku supstancu

Genetiki kodCode- ifra, klju, skup ugovorenih znakova tajne porukeElementarna jedinica genetikog koda je jedna od etiri azotne bazeU sastavu prirodnih proteina je 20. razliitih aminokiselina

Njihov raspored ne moe biti odreen jednom bazom ve sa vie njih.

Kombinovanjem po dvije od etiri mogue baze (4 na kvadrat 16) nije dovoljno za kodiraanje 20 aminokiselina

Najmanji broj baza koji moe zadovoljiti taj kriterij je tri baze (triplet) (64 mogua tripleta), viak od 44 ovakve kombinacije znai da je mogue da jednu aminokiselinu odreuje vie tripleta

Nauno je dokazano da trolani slijed-triplet slova genetikog koda predstavlja jednu rije genetike poruke, kojom se daje nalog za ugradnju jedne aminokiseline u proteinsku molekulu

.

Genetiku informaciju DNA upuuje na mjesto sinteze bjelanevina preko svog primarnog produkta-informacione RNA (iRNA)

Prenos genetike informacije i njegova realizacija odvijaju se udvije veoma sloene etape:

TranskripcijuTranslacijuTranskripcija

Predstavlja sintezu RNA lanca koji predstavlja jedan polulanac od DNA dvostrukog heliksa

Novonastali lanac RNA je identian jednom od polulanaca DNA (kodirajui lanac), a komplementaran je drugom DNA lancu koji predstavlja matricu za njegovu sintezu (matrini lanac DNA)

Postupak sinteze, transkripcija poinje vezivanjem enzima RNA polimeraze za poseban region DNA (promotor)-inicijacija

Otvaranje DNA lanca na mjestu gdje se vezala polimeraza

Pomjeranje RNA polimeraze du lanca DNA i nastajanje rastueg iRNA lanca (formiranje RNA-DNA hibrida)

Simultano, sa pomjeranjem RNA polimeraze, dio lanca iRNA iza enzima se oslobaa hibridne veze sa DNA

Osoboeni dio DNA lanca se se vee za svoj drugi, partnerski lanac DNA (nema nikakvih promjena u DNA lancu)RNA polimeraza dolazi do dijela DNA sekvence koji se zove terminator, koji obavjetava polimerazu da treba da stane sa pomjeranjem i prekine dalju sintezu iRNA

Sinteza iRNA se odvija u 5----3 pravcu

Kodirajue sekvence (egzogeni, egzon)Nekodirajue sekvence (introni)

Prepoznavanje matrice razdvajanje tog dijela DNAInicijacija-sinteza prvih nukleotidnih veza u RNA

Elongacija faza u kojoj se RNK polimeraza pomjera du DNA lanca pravei lanac RNA

Terminacija proces prepoznavanja tzv. stop kodova (formiranje fosfodiestarskih veza koje omoguuju razdvajanje transkripcijskog kompleksa)

Promotr odreene duine baznih jedinica daje signal za transkripciju

Mutacija promotora (up; down ) moe stimulirati, odnosno koiti proces transkripcije

Proces terminacije ukljuuje i druge proteine (alternativne polimeraze) koje stupaju u interakciju sa glavnom polimerazom

Obino je trminalni kraj transkripcije bogat G-C bazama iza koje slijedi odreena duina iRNA lanca sa uracil bazama (prokariote)Kod eukariota dolazi do presijecanja transkripta.Na 5 kraj iRNA dodaje se cap(G)-uz pomo guanilil- transferaze, a na 3 kraju dolazi do dodavanja poli(A)-binding proteina ivotni vijek bakterijske iRNA je nekoliko minuta iz razloga to se kompletan proces transkripcije i translacije odvija na jednom mjestu, odnosno sukcesivno se izvode procesi sinteze iRNA, prevoenje iste od strane ribosoma i njena degradacija

ivotni vijek eukariotske iRNA je mnogo dui od 4 do 24 sata. Razlog tome je znatno vea duina iRNA lanca, struktura iRNA lanca(egzon-intron)

RNA polimezara spada u grupu holoenzima (kompletan enzim), tj sastavljen je od velikog broja subjedinica odgovornih za svaku fazu sinteze iRNA

Prerada(obrada) primarnog transkripta

Proces transformiranja hetronuklearne RNK u efektivnu matricu za sintezu odgovarajueg proteina

Primarni transkript-neposredni produkt transkripcije

Preraeni transkript nastaje isijecanjem i povezivanjem isjeenih dijelova primarne iRNA i nastanak efektivne iRNA (mRNA)

5 kraj mRNA (5 capa) zatien od egzonukleaza, ona je odgovorna za afinitet mRNA prema ribosomima, njenim uklanjanjem otpoinje proces translacije i ubrzane degradacije mRNA (ime prestaje vezivanje ribosoma za istu)

.

Na 3 kraju iRNA prolazi kroz proces poliadenilacije dejstvom enzima poliadenilat polimeraze, koji prvobitno cijepa primarni transkript na 11-30baza od sekvence prema 3 kraju, a potom katalizuje polimerizaciju 20-250 adenozina

Funkcija poli(A) nije u potpunosti razjanjena, ali se zna da stabilizuje mRNA, da igra ulogu u obradi primarnog transktripta i transportu mRNA u citoplazmu

Zahvaljujui poli (A) repu, mRNA se mogu lako izolovati u istom stanju, proputanjem kroz kolonu nainjenu od poli (T) vezanog za vrsti matriks

Introni nemaju funkciju kodiranja i mutacije unutar introna ne utiu na naslijedni materijal. Izuzetak ine po dva nukleotida na krajevima introna koji predstavljaju signal uza isjecanje (5 kraj GU par-donor, 3 kraj AG par-akceptor)

etiri klase introna (I, II, III i IV)

Razliiti kofaktori kod I i II grupe iniciraju rekcije OH grupa guanozidnog, odnosno adenozidnog nukleotida formiranjem sa 5, 3 fosfatom petlji koje oslobaaju intron iz iRNA i stvaraju kovalentne veze izmeu egzona

U pitanju su visokoenergetske reakcije odvijaju se bez pomoi specifinih proteinaIII i IV grupa introna za formiranje lasa koje isjeca introne je regulisana pomou specifinih proteina

III grupa introna spada u grupu najveih introna, a IV grupa introna je karakteristina za tRNA i isjecaju ih specifine endonukleaze

Energija potrebna za formiranje primarnog transkripta, preraenog transkripta je ogromna. Razlog postojanja introna je slijedei:Prisustvo introna titi genetiki materijal od oteenja indukovanim hemijskim spojevima i zraenjemOsigurava genetiku fleksibilnost elije

Translacija i postranslacijske metodeSinteza proteina je dirigovana od strane genetikog materijala

Proteini su polimerni organski spojevi i imaju dvije kljune bioloke funkcije:Jedan su od najbitnijih gradivnih sastojaka organizmaNjihovi specijalni oblici-enzimi imaju sposobnost biokatalizatora metabolikih procesa

Osobenosti strukture i bioloke aktivnosti proteina odreene su vrstom, brojem i rasporedom aminokiselina

Ponovljivost istovjetnih procesa metabolizma u nizu pokoljenja ivih organizama i specifinog sastava strukturnih proteina zasnovana je na stalnosti strukture enzimskih supstanci

Nakon zavretka transkripcije i obrade transkripta jednolanana iRNA naputa jedro i prelazi u citoplazmu, gdje se procesuira i gdje se odvija proces translacije

Translacija je sloeniji proces i od replikacije i od transkripcije jer se odvija koordinacijom vie stotina raznih molekula

Proteini se sintetiziraju od amino kraja prema karboksilnom kraju, postupnim dodavanjem aminokiselina na karboksilni, rastui kraj lanca

Sinteza proteina se odvija u tri faze: inicijacija, elongacija i terminacija

Inicijacija vezivanje inicijalne tRNA na startni signal u iRNA

Elongacija vezivanje aminoacil tRNA na mjesto na ribosomu(nazivno mjesto A- aminokiselinsko) pri emu nastaje dipeptid, koji se zatim premjeta sa mjesta A na mjesto P, dok druga molekula tRNA naputa ribosom

Terminacija- RNA polimeraza pronalazi stop signal u molekuli iRNA to izaziva otputanje sintetiziranog polipeptidnog lanca sa ribosoma

Proces: specifini triplet kopiranog lanca DNA (kod) ----komplementarni triplet iRNA (kodon)----njemu komplementarni triplet tRNA(antikodon) koji na drugom kraju molekule nosi odgovarajuu aminokiselinuKompletan opisani proces se sprovodi uz uee enzima specifinih proteina, koje su i same proizvod djelovanja odgovarajuih genaSlijed djelovanja enzima:Kataliza razdvajanja DNA polulanca-drugi katalizira sintezu iRNA-trei vezivanje aminokiselina za tRNA, etvti spajanje aminokiselina u polipeptidni lanac

PosttranslacijaNakon translacije proteini su podvrgnuti razliitim hemijskim, fizikim i drugim promjenama

Veina proteina, nakon translacije, uz pomo tzv.signalnih peptida vezanih na N-kraju odlazi do specifinih mjesta ili organela u eliji

Da bi se sprijeila proteolitika razgradnja nastalih proteina od strane elije za sintetizirane proteine se veu ubikinon proteini, koji slue kao protektori

Sa druge strane novosintetizirani protein na mjestu djelovanja izloen je djelovanju razliitih regulatora koji ga modificiraju a u svrhu izvrenja odreene funkcije Drugim rijeima, dolazi do hidrolize amino kraja proteina (deformilaze), odstranjivanja jende ili vie aminokiselina (amminopeptidaze), oksidacije( cisteinski ostatci-stvaranje disulfidnih veza), hidroksilacija bonih ogranaka prolinskih i lizinskih dijelova, povezivanje eera na bonim ograncima asparagina, serina i treonina pri imu nastaju glikoproteini,fosfoliranje proteina,hidrolitiko cijepanje veeg proteina na manje proteine(proinsulin u insulin), ....Regulacija funkcije gena Ostvarivanje samo povremenih i samo karakteristinih ivotnih procesa u tkivima i elijama odreeno je veoma sloenim i uravnoteenim sistemom podeavanja (regulacije) djelovanja genetikog materijala

U ovim procesima, ponovno, proteini maju izuzetan znaaj a njihova sinteza je u direktnoj su nadlenosti DNA

Biokatalizatori (enzimski proteini) kontroliraju esencijalne metbolitike procese i njihova aktivnost se nuno odvija na razini transkripcije i translacijePrincip regulacije

Stimulacija sinteze enzima (pozitvna kontrola) ili represija (negativna kontrola) transkripcije operona, tj formiranje iRNA po matrici DNA. Pri tom se kontroliraju sva etiri stepena procesa sinteze proteina ) (i, e, t, re)

Kontrola sinteze proteina pri translaciji, tj. formiranje polipeptidnih lanaca po upustvima iRNA

Postsintetika kontrola enzimskih procesa

Primjer regulacije funkcije gena (Escherichia coli)

Hromosom E.c. je cirkularna DNA koja kodira sintezu nekoliko hiljada proteina

Sinteza konstitucionih proteina je permanentna bez obzira na endogene uslove

Sinteza funkcionalnih proteina je povremena i inducirana intracelularnim agensima odreene koncentracije

Kao i svi ivi sistemi i bakterije su izloene promjenjivim uslovima, to izaziva potrebu svrsihodnog reguliranja sinteze potrebnih enzima za nesmetano odvijanje ivotnih funkcija (sistem elije i aktuelne okolnosti)U odreenim uslovima sintetizira se enzim koji katalizira stvaranje odreenog proteina

Nakon okonane katalize postaje suvian, ukoliko na neki nain nije ponovno inducirana njegova sinteza

U promjenjenim uslovima iznenada se stvara potreba za sintezom nekog drugoog enzima

Evolucijskim balansiranjem organizam je stvorio mehanizam neophodne fleksibilnosti procesa dinamike u ekspresiji pojedinih gena

Kompletna regulacija ekspresije gena kod bakterija odvija se na nivou transkripcije

Kontrola i regulacija transkripcije Bakterijski laktozni operon, poznavanje procesa sinteze serije enzima koji su ukljueni u razgradnju laktoze kod E.cTri strukturna gena kodiraju sintezu enzima za biokatalizu razlaganje laktoze(lacZ, lacY,lacA) (transkripcijska jedinica-lac operon)Regulatorni gen ispred promotora inducira sintezu monocistronske iRNA koja sintetizira protein represor lac operona, koji se vee za operator i blokira pristup RNKpolimerazi, proces zaustavljen-negativna kontrola

Proces:Kada je u eliji prisutna glukoza, prisutan je i njen izomer, alolaktozaRepresor ima tendenciju vezivanja sa alolaktozom, ime oslobaa operator i omoguava funkciju operona (derepresija ili pozitivna kontrola)Odsustvo alolaktoze uslovljava slobodne represore koji se veu na svoja mjesta u operatoru operona (represija) (znai u eliskom mediju nema glukoze koju je potrebno protolitiki obraditi i ovaj dio genskog seta se blokira)

Aktivatori su opozit represorima,vezivanjem za promotor(35 i 10 nukleotida od startnog tripleta koji aktiviraju), olakavaju djelovanje RNA polimeraza Njihova aktivnost uslovljena prisustvom/odsustvom induktora Regulacije ekspresije gena na nivou translacije iRNA koja je dospjela do mjesta djelovanja ne mora inducirati sintezu karakteristinog proteina

iRNA na 5 kraju sadri niz nukleotida komplementaran 3 kraju rRNA . To je lokacija vezanja male ribosomske subjedinice

Ukoliko je taj niz maskiran, nee doi do sinteze proteina Promjenljivost naslijednog materijala je genetika osnova sveukupne bioloke raznolikosti u vremenu i prostoru, posmatrajui ivi svijet u cjelini i svaku vrstu ivih bia posebnoMutacije-kvalitativne i kvantitattivne promjene genetikog materijalaGenskeNastaju izmjenom u hemijskoj strukturi funkcionalne sekvence DNA. Novonastale izmjene(aleli) mogu biti dominantni, recisivni ili bez interakcije sa postojeim genima istog lokusa. Nastaju izmjenom jednog ili vie nukleotida u genu(spontano ili inducirano)Hromosomske Odnose se na numerike i strukturne promjene u pojedinim parovima homologa u hromozomskoj garnituri(nulosomija, monosomija, trisomija,polisomija-numerike)

Strukturne hromosomske mutacije predstavljaju nedostatak jednog dijela hromosoma(delecija, deficija) ili se odreeni hromosom javlja u dvostrukoj koliini(duplikacija) crossing over genomske mutacije Poslijedica izmjene normalnog diploidnog broja hromosoma (2n), tj za jedan ili vie haploidnih setova hromosoma (euploidija: haploidija, triploidija, poliploidija

Plazmatske mutacijeEkstranuklearne mutacije odigravaju se u citplazmatskim nosiocima genetskog materijala (mitohondrijalan i plastidna DNA)

Reparacija oteenih molekula DNAOsnovni princip naslijea kroz generacije jeste stalnost genetike informacije, odnosno ouvanje primarne strukture DNA

Promjene u DNA mogu biti: spontane i inducirane

Genske mutacije nastaju kao rezultat:Zamjene jednog para nukleotida drugim-supstitucijaGubitka jednog ili vie parova-delecijaDodavanje jednog ili vie parova nukleotida-insercijaEkspanzije (najee) trinukleotida-dinamika mutacija

Od vrste mutacije i mjesta na kom se odigrala mutacija zavisi efekat iste kod potomaka

Tihe mutacije-promjene na genomskom dijelu DNA koji nije odgovoran za naslijedne informacije

Korisne mutacije-jaanje biodiverziteta (otpornost na odreene uslove)

Letalne mutacije- ne prenose se na potomke ali izazivaju naruavanje bioloke ravnotee organizma

Broj oteenja uzrokovanih fizikim i henijskim faktorima vanjske sredine u jednoj eliji sisara iznosi i do vie hiljada tokom 24 asa

Zahvaljujui reparativnim mehanizmima samo 0,1%greaka se fiksira u genom i postanu permanentne

Intervencije popravke greaka:

Reverzna reparacija -enzimska reakcija restauracije normalne strukture bez prekidanja kontinuiteta eerno-fosfatne osnove

Reparacija uklanjanjem oteenja isijecanjem i zamjenom modificiranih baza

Postreplikativne popravke-Toleriranje oteenja-nije pravi reparacijski sistem ve nain na koji elija prevazilazi tetnost promjena u naslijednom materijalu (nastavlja normalan rast i razvie)

Reparacija nesparenih nukleotida (nisu spareni po principu komplementarnosti), (mismatched ), protein ukljuen u mehanizam popravke vri inspekciju komplementarnosti naspramnih lanaca DNA i na licu mjesta (in situ) isjeca pogreno spojenu bazu i ukljuuje odgovarajuu Reparacija isjecanjem baza isjecanje modificiranih baza egzonukleazama , a potom popunjavanje tog mjesta djelovanjem polimeraza i ligaza. Proces zapoinje reagovanjem specifinih glikozidaza koje su u stanju da prepoznaju neodgovarajue baze u strukturi DNA

Reparacija isjecanjem nukleotida

Stvaranje ciklinih dimera izmeu susjednih baza (ciklobutanski dimeri) koji ometaju konformaciju DNA a samim tim i proces replikacije ili ekspresije gena. Reparacija se postie isjecanjem dimera i nekoliko susjednih baza od strane restrikcijskih endonukleaza, polimeraza i ligaza

Direktna reparacija- bez uea dosad navedenih invazivnih enzima, ve djelovanjem fotoliaze katalizira se reverzna reakcija monomerizacije Kada su mehanizmi reparacije nedovoljni kod veih oteenja, zapoinje serija odbrambenih sintetskih procesa poznata kao SOS odgovor.SOS proteini blokiraju velika oteenja, odnosno replikacija je blokirana dok se ne popravi oteenje dejstvom specifinih enzima

Apoptoza-programirana smrt elije koja se ne moe reparirati, da bi se izbjegle patoloke promjene u njenoj okolini

Kada su mehanizmi reparacije nedovoljni kod veih oteenja, zapoinje serija odbrambenih sintetskih procesa poznata kao SOS odgovor.SOS proteini blokiraju velika oteenja, odnosno replikacija je blokirani dok se ne popravi oteenje dejstvom specifinih enzima

Apoptoza-programirana smrt elije koja se ne moe reparirati, da bi se izbjegle patoloke promjene u njenoj okolini

Dominantnost-recisivnost homozigoti i heterozigoti imaju imaju svojstven genotip. Kombinacijom dominantnog i recisivnog alela fenotipski se ispoljava osobina samo dominantnog alela, dok osobina recisivnog alela ostaje prikrivena i moe se ispoljiti u slijedeoj generaciji spajanjem recisivnih alela u homozigot

Penetrabilnost (probojnost-relativna uestalost ispoljavanja nekog gena kod individua istog genotipa) i ekspresivnost (izraajnost-intezitet ispoljavanja nekog gena) gena uveliko oteavaju detekciju pirode interakcije gena

Epigenetika isti genotip u razliitim fazama ravoja ima iroke heterogene efekte, regulisane aktivnostima pojedinih genskih lokusa i njihovih funkcionalnih cjelina- unutranjim faktorima (epigenetiki faktori) Genetiko ininjerstvo

Formiranje novih kombinacija naslijednog materijala insercijom molekula nukleinske kiseline producirane van elije, u najirem smislu te rijei, unutar virusa, bakterijskog plazmida ili bilo kog drugog vektorskog sistema koji omoguava njenu inkorporaciju u organizam domaina, u kom se ona prirodno ne javlja, ali u kom je sposobna da se dalje propagira

Osnovna klasifikacija genetikog ininjerstva

Gensko ininjerstvo-direktna manipulacija ciljanim segmentima DNA molekule , tj. genima ili njihovim djelovaanjem

Hromosomsko ininjerstvo manipulacija genskim kompleksima koji ine grupu vezanih gena ili itav hromosom

Genomsko ininjerstvo-manipuliranje ukupnim setom gena jednog ivog sistem, tj.genoma

Gensko ininjerstvo

Odnosi se na manipuliranje osnovnim jedinicama naslijednog materijala-genima

Osnovni cilj ovog nivoa genetikog ininjerstva jeste introdukcija specifinog gena, dijela strane DNA molekule u eliju domaina , ali na taj nain da se pri replikaciji naslijednog materijala elije osigura i simultana replikacija introdukovanog segmenta

Prilikom kontinuirane diobe elija domaina dolazi do umnoavanja naslijednog materijala, koji u ovom sluaju sadri ciljani segment, koji slui za dalje istraivanje i manipulacijuUopteni postupci

Identifikacija gena od interesa

Ciljana upotreba restriktaza

Izbor odgovarajueg nosaa (vektora)

Povezivanje dva strana dijela DNA isjeeni dio DNA i vektor upotrebom ligaza (rekombinantna DNA)

Prenos rekombinantne DNA iz epruvete u eliju domaina koja e obezbjediti enzime za replikaciju DNASelekcija i identifikacija elija koje sadre rek DNA

Hromosomsko ininjerstvo

Manipuliranje krupnijim dijelovima naslijednog materijala, odnosno vei nivo genskog ininjerstva koje obuhvata izolaciju, transfer i inkorporaciju hromosoma ili njegovih dijelova

Ovo ininjerstvo takoe podrazumijeva konstrukciju vjetakih hromosoma, kada se zahtjeva transfer veih, organiziranih dijelova naslijedne tnari

Kako se prenosi hromosom (vea jedinica) mogue je prvi nivo uspjenosti vizuelno, mikroskopski ispitatiPrijenos fragmenata hromosoma ili hromosoma vri se odgovarajuim tehnikama koje omoguuju fragmentiranje hromosoma

Fizike tehnike-disekcija fragmenta ili cijelih hromosomaHemijske tehnike-djelovanje razliitih enzimima (restriktaze) koje fragmentiraju hromosom

Kod ovog tipa genetikog ininjerstava veoma bitnu ulogu igraju enzimi restriktaze, ali oni enzimi koji se veu za manji broj lokacija u ispitivanom genomu (rijei restrikcijski sajtovi), pa se dobija manji broj duih restrikcijskih fragmenta

Transfer itavih hromosoma metodama koje omoguuju inkorporaciju donorskog hromosoma u eliju domaina, a da pri tom njegova funkcionalnost ne bude naruena

Konstrukcija novog hromosoma , pri emu se prikupe i analiziraju molekulski sastojci hromosoma i poveu u nadmolekulsku strukturu koja omoguava obavljanje osnovnih biolokih funkcija. Koristi se i kao vektor za prenos veih dijelova DNAGenomsko ininjerstvoPodrazumjeva manipulaciju kompletnim, ukupnim garniturama naslijednog materijalaKloniranje somatskih genomaKloniranje haploidnih genomaSomatska hibridizacija (fuzija protoplasta)Indukovanje poliploidije i haploidije

Princip: izolira se jedro iz ciljane somatske elije i inokulira u se u enukleiranu jajnu eliju. Takva elija se zatim inkorporira u tru individuu (Dolly)

Fuzija protoplasta-spajanje elija

(spontano, u sluaju virusne invazije)

Kreirani agensi koji iniciraju spajanje elija

Monoklonska antitjela nastaju fuzijom posebnih bjelih krvnih zrnaca i kultiviranih elija raka, na taj nain nastaju besmrtne elije sposobne da proizvode traeno antitjeloEnzimiVektoriPovezivanje DNA fragmenataSelekcija transformataPCRSekvenciranje DNA fragmenataMarkeriTransfer gena u elije domainaEnzimi

Za manipulacije naslijednim materijalom neophodno je poznavanjealata za genetike konstrukcije (isjecanje i spajanje) molekula nukleinskih kiselina, odnosno enzima

Enzimi koji se danas koriste za genetike manipulacije uglavnom su dobijeni purifikacijom iz raznih organizama i danas su lako komercijalno dostupni

Restrikcijski enzimi molekularne makaze koje sijeku moliekulu DNA na tano odreenom mjestu Restrikcijski enzimi sijeku nukleinske kiseline na unutranjim pozicijama, a ne sa krajeva i stoga se jo i nazivaju endonukleaze

Presijecanjem molekule DNA sa endonukleazama dobijaju se fragmenti sa poznatim restrikcijskim mjestom, pa ih je mogue spajati sa sekvencama koje imaju komplementarna restrikcijska mjesta (isjeene istim enzimom)

Upotreba enzima u restrikcijskim reakcijama

Odgovarajua koliina enzima se doda na ciljanu DNA u puferu i rekcija se inkubira na 37C

Enzimska aktivnost se izraava u jedinicama-a jednaka je koliini enzima koja isjee 1g DNK, za jedan sat, na 37C

Specifinost enzima se ispoljava u njegovom mjestu djelovanja, pa mogu producirati : tupe i ljepljive krajeve

Restrikcijski fragmenti nastali djelovanjem istog enzima mogu se slijepiti bez obzira na njihovo porijeklo

Smith, Wilcox i Kelley (1968) g.su izolirali i deifrovali prvu sekvencu specifinih restrikcijskih enzima

Navedeni fenomen zasniva se na prirodno-modifikacijskoj metodi sistema ivih organizama, kao odbrambeni mehanizam protiv unesene strane DNA

Restrikcijski sistem se sastoji od dvije komponente:

Restrikcijske endonukleacije (prepoznaju kratke nukleotidne sekvence i sijeku DNA na oba lanca)

Metilaze (modificiraju DNA dodajui metilnu grupu odreenim bazama koje predstavljaju mjesto prepoznavanja restrikcijske endonukleaze. U metiliranom stanju sekvence DNA postaju nepristupane djelovanju restrikcijskih enzima)

Hemijsko djelovanje-metilacija-hemijski modifikovana DNA79Do danas je poznato oko 117 mjestospecifinih metilaza i oko 1.500 restriktaza, od kojih je 150 u komercijanoj upotrebi

Tipovi restrikcijskih enzima

Svi restrikcijski enzimi se klasificiraju na osnovu sekvence koju prepoznaju (recognition site ) i mjesta na kojem sijeku DNA (restiction site)

Tip I restriktazaRestriktaze sa strogo specifinim mjestom prepoznavanja, ali im je mjesto isjecanja sluajno i nespecifino (u blizini mjesta prepoznavanja, ali nije strogo odreeno)

Ovaj tip restriktaza se zbog navedenih osobina ne moe koristiti u genetikoj manipulaciji

Sastoje se od tri subjedinice (jedinica za prepoznavanje specifine sekvence, jedeinice za modifikacije i restrikcijske jedinice)

Optimalna aktivnost ovih enzima zahtjeva prisustvo kofaktora(Mg 2+ jona, ATP i S-adenozilmetionina)

Tip II restriktazaRestriktaze koje prepoznaju ciljanu sekvencu na dvolananoj DNA molekuli i sijeku je unutar ili u neposrednoj blizini te sekvenceFragmenti koji nastaju nakon djelovanja ovih enzima imaju simetrine sekvence i definirane su duine

Endonukleaze tipa II sastoje se od jednog polipeptida, koji je obino homodimer

Svoju optimalnu aktivnost postiu uz prisustvo Mg++ jona, kao kofaktora

Ovaj tip enzima se najvie koristi u svrhu genetike manipulacije

Priblino 1/3 bakterijskih vrsta ima endonukleaze tipa IIRestrikcijski enzimi tipa II prepoznaju i sijeku DNA molekulu unutar sekvence od etiri, pet, est ili sedam nukleotida

Sekvence se istovjetno itaju i sa 5 i 3-kraja , dakle palindromske su

Primjer: restriktaza EcoRI djeluje kao dimer i prepoznaje sekvencu od samo est baznih parova 5-G A A T T C-3 ---- 5-G-OH + P-A A T TC-33-C T T A A G-5 3-C T T T A-P HO-G-5Nastajanje 5 ljepljivih krajeva

Primjer: Za razliku od restriktaza EcoRI neki drugi enzimi (PstI) produkuje 3 ljepljive krajeve

5-C T G C A G-3 ---- 5-C T G C A-OH + P-G-33-G A C G T C-5 3-G-P HO-A C G T C-5

Nastajanje 3 ljepljivih krajeva

Restriktaze koje sijeku dvostruki DNA lanac u osi simetrije prave fragmente sa tupim krajevima (HaeII)

Restrikcijski enzimi koji potiu iz razliitih organizama , a prepoznaju ista restrikcijska mjesta nazivaju se izomere

SmaI XmaI

Dva razliita enzima (HpaII i MpsI), koja cijepaju istu sekvencu molekulu DNA (CCGG), nee isto reagirati ako je sekvenca na C-bazi metilirana. Naime HpaII je nee sjei, dok je MpsI indiferentan prema metilaciji i sijee sekvencu

Tip III endonukleaza

Rijetki enzimi , koji se ne koriste u genetikoj manipulaciji

Restrikcijska mjesta su nespecifina

Ovaj tip endokluase se sastoji od dvije subjedinice:M-subjedinica koja je odgovorna za prepoznavanje i modifikaciju specifinog mjestaR-subjedinica koja kontroliza nukleaznu aktivnost

Optimalna aktivnost ovih subjedinica uz prisustvo Mg++ jona, ATP i SAMNavedeni enzimi koji se koriste za genetiku manipulaciju se nakon to obave svoju ulogu trebaju se ukloniti iz elije domaina kako ne bi sprijeili efikasnost transformacije stranom DNA

Svi restrikcijski enzimi za svoju optimalnu aktivnost zahtijevaju prisustvo Mg++ jona, obino u koncentraciji 10 mM, dok su pH vrijednost i koncentracija NaCLl razliite za razliite enzime

Dijelovi isjeene DNA molekule (restrikcijskim enzimima). Mogu se na osnovu veliine separirati agaroznom ili poliakrilamidnom gel elektroforezom .

Prolaskom elektrinog naboja kroz gel, naelektrisani fragmenti se kreu razliitom brzinom kroz gel, koja prvendtveno zavisi od njihove molekulske teineNomenklatura enzima Sistem oznaavanja restrikcijskih i modifikacijskih enzima prema prijedlogu Smith-a i Nathans-a(1973)

Naziv enzima je skraenica koja se dobije koritenjem prvog slova roda i prva dva slova bakterije iz koje je izolovan (Escherichia coli=Eco),

Ako je iz jednog soja bakterija izolovano vie restrikcijskih enzima onda se na ve dodjeljeno ime dodaje i rimski broj, I,II,III,... ItdPored ovoga svi restrikcijski enzimi imaju oznaku R, a modifikacijski M (MHinIII)

Restrikcijsko-modifikacijski sistem igra slinu ulogu kao imuni sistem, jer in vivo razlikuje svoju od tue DNAEnzimi koji modificiraju DNA

Degradiraju nukleinske kiseline kidajui fosfodiestarsku vezu koja nukleotide odrava zajedno

Posebna kategorija enzima (egzonukleaze)

Djeluju na terminalne dijelove sekvenci Najpoznatije (Bal31), DNAzal, Sl nukleaza)

DNA polimeraze

Enzimi kojikatalizuju sintezu kopija molekula DNA i koriste se u genetikim manipulacijama

Pri njihovom opisivanju koriste se termini DNA ili RNA polimeraza u zavisnosti od tipa nukleinske kiseline koju koriste za matricu

Reverzna transkriptaza je RNA zavisna DNA polimeraza

Enzimi koji modificiraju krajeve molekula DNA

Aklakna fosfatazaPolinukleotidna kinazaTerminalna transferaza

Djeluju na krajeve molekula DNA i omoguuju njene vane funkcije

Fosfataze i kinaze uestvuju u procesima dodavanja ili uzimanja jedne fosfatne grupe

Terminalna fosfataza neprekidno dodaje nukleotide na slobodni 3 kraj (poliadenilni repovi)

DNA ligaze

Vani celularni enzimi jer repariraju unitene fosfodiestarske veze, koje se deavaju sluajno ili kao efekat rekombinacije ili replikacije

In vitro se vrlo esto koriste za popravljanje eerno-fosfatne kime DNA, iji diskontinuitet je veoma est pri spajanju fragmenata razliitog porijekla

Vektori

Prenosioci genetikog materijala u procesu kloniranja

Plazmidni vektori

Plazmidi su krune, dvolanane molekule DNA

Plazmidi su genetiki homogeni, konstantne monomerne veliine i imaju sposobnost repliciranja nezavisno od hromosoma

Ako su oba lanca intaktni krug , onda su to kovalentni zatvoreni krugovi , ili CCC DNA.

Ako je samo jedan lanac intaktan, tada su molekuli opisani kao otvoreni krugovi OC DNA

Zbog drugaije strukturne konfiguracije CCC i OC plazmidna DNA spariraju se na agaroznom elektroforeznom gelu

Dodavanje etidij bromida, koji se interkalarno vezuje za spiraliziranu plazmidnu DNA , dolazi njenog odmotavanja

Plazmidi mogu biti kategorizirani u dva glavna tipa u zavisnosti od toga da li nose set transfer gena (tra geni) koji omoguavaju bakterijsku konjugacijuKonjugativniNekonjugativniPodjela na osnovu broja kopija u eliji:Viekopijski (oputeni, relaksirani) plazmidiOgranien broj kopija(nerelaksirani) plazmidi

Konjugativni plazmidi imaju veu molekulsku teinu i predstavljeni su sa jednom do tri kopije po hromosomu, dok nekonjugativni imaju manju molekulsku teinu i vie kopija po hromosomu

Izolacija plazmida iz elijeNajee se izolira kompletna DNA iz elija, a zatim separiraju hromosomska od plazmidne DNA primjenom agarozne gel-elektroforezeBroj plazmida Fotografisanjem gela i skeniranjem negativa , gustoa plazmidne DNA u odnosu na hromosomsku DNA je mjera broja kopija plazmida

Alternativne metode: HPLC , kvantifikacija plazmidne DNAMjerenje produkata plazmidskih kodirajuih gena, ime se procjenjuje broj kopija plazmida

Plazmidna inkompatibilnost-odsustvo mogunosti koegzistencije dva razliita plazmida u istoj eliji domainaPurifikacija plazmidne DNA

Koriste se razliite metode purifikacije, ali za svaku od njih najosjetljivija faza je liza elija. Naime, idealan sluaj bi bio kada bi se elija otetila taman toliko da plazmidna DNA pobjegne iz elije, bez vee kontaminacije sa hromosomskom DNA

Najpopularniji metod ekstrakcije i purifikacije plazmida uveli su Birnboim i Doly

Ovaj metod se zasniva na injenici da je pH oblast denaturacije linearne DNA uzak (12-12,5), ali ne i cirkularne DNA

Opis metodaelije se tretiraju lizozimima radi slabljenja eliskog zida

Procesiranje liziranja sa NaOH i NaDS

Hromosomska DNA osta je u formi velike molekulske mase ali denaturisana

Neutralizacija kiselim Naacetatom i, renaturacija hromosomske DNA i(agregati u vidu nerastvorljive mree)

DNA koprecipitira i uklanja se centrifugiranjem

Ako je pH strogo kontroliran, cirkularna DNA ostaje resolubirana u nativnom stanju

Plazmidna DNA se precipitira koncentrovanim etanolom i odvoji

Ako je potrebno, plazmidna DNA s purificira gel-filtracijomPoeljna svojstva plazmida

Mala molekulska teina (laka manipulacija, otporan na degradaciju, obino vie kopija, manje anse za vei broj supstratskih mjesta)

Sposobnost lakog prijenosa selektivnih osobina na eliju domaina Jedno restrikcijsko mjesto za veliki broj endonukleaza

Nakon ubaenog dijela strane DNA u vektor, nastala himerna molekula treba biti prenijeta u pogodnog recipijenta

Da bi se mogla pratiti uspjenost transformacije, himerne molekule trebaju imati neki lako mjerljivi fenotip.

Obino je to rezultat gena (rezistentnost na neke antibiotike koji je na vektoru, ili gen na ubaenoj sekvenci DNA)Bez obzira na metod insrecije, samo neke elije e preuzeti plazmidnu DNA i treba ih izdvojiti od ostalih

Uobiajena strategija je da se u plazmid ugradi gen koji je neophodan eliji domainu za rast u odreenim uslovima (prisustvo antibiotika)

Samo elije koje su transformirane pomou rekombinantnog plazmida, posjeduju gen koji je rezistentan na odreeni antibiotik i mogu rasti u prisustvu antibiotika

Takav gen se zove selektibilni markerOrigin-gen odgovoran za poetak replikacije (propagacija plazmida u elijama i odravanje na nivou 10 do 20 kopija poeliji)Dva gena odgovorna za rezistenciju za razliite antibiotike (omoguavaju identifikaciju elija koje sadre intaktni plazmid i elija koje sadre rekombinantnu verziju plazmida)Razliite restrikcijske endonukleaze prepoznaju nekoliko jedinstvenih sekvenci i prepoznaju mjesto gdje e plazmid biti isjeen radi insercije strane DNA

pBR322

Ako se strana DNA ubaci na PstI restrikcijsko mjesto,element odgovoran za rezistenciju na ampicilin e se razgraditi i inaktivirati, a element odgovoran za rezistenciju sa tetraciklinom e ostati intaktan

Nakon transformacija elija E.coli, sve elije koje su preuzele plazmid e rasti na agar podlozi koja sadri tetraciklin

Pojedinane kolonije sa agar ploa se prenose na dvije dodatne ploe; jedna ploa u podlozi sadri tetraciklin +ampicilin, a druga ploa podlogu koja sadri samo tetraciklin (kontrolna ploa)

elije koje rastu u prisustvu tetraciklina, a ne u prisustvu i tetraciklina i ampicilina sadre rekombinantni plazmid109Derivati plazmidaRedizajniranje jednostavnih plazmida u svrhu specijalnih istraivanja

Zbog velikog ometanja normalne fiziologije elije , neki geni ne mogu biti klonirani u vektore sa velikim brojem kopija. Takvi vektori su -fagi

Plazmidi, najee upotrebljivani klonirajui vektori-ispoljili su se kao neadekvatni za kloniranje veih fragmenata DNA, posebno za kreiranje banaka gena organizama sa veim genomima

Za ove potrebe koriste se bakteriofagi i kozmidi, a u poslijednje vrijeme i YAC-kvaev vjetaki hromosom

BakteriofagiNezavisno ih je otkrilo vie autora u razdoblju od 1915 do 1917 godine

Bakteriofagi (fagi) su virusi bakterija i ovisni su o domainu. To su virusi koji inficiraju bakterije

Njihov genetiki materijal ini RNA ili DNA

Mogu imati jednostavan litiki ciklus ili striktno reguliran ciklus koji ukljuuje integraciju u domaina i transpoziciju (proces ugradnje transpozibilnih DNA fragmenata u genom domaina)

Bakteriofagi nemaju eliski zid, to znai da su osjetljivi na jonsku koncentraciju svojih domaina, na deterdente, kemikalije,...

Litiki ciklus.aktivacija replikacije virusa i unitavanje elijeLizogeni ciklus- insercija u genom-represija gena domaina111Osmotski ok izaziva pucanje glave faga i oslobaanje njegovog hromosoma DNA faga moe se prepraviti tako da poslui kao vektor za kloniranje

-bakteriofagiiroko prouavan i dobro poznat virus kojem je domain E.coliHranjivi medij za -bakteriofag mora sadravati MgSO4 i MgCl2 jer je Mg++ neophodan za stabilnost bekteriofaga

DNA -faga je linearna molekula, ija je sekvenca u potpunosti odreena. Na svakom kraju -faga se nalaze kratke jednolanane sekvence od 12 nukleotida(kohezivni krajevi), koji izgrauju tzv.cos mjesto, koje omoguava izgradnju cirkularne strukture DNA nakon injektiranja u eliju domaina

Adsorpcija faga na receptore maltoze u elijiPenetracija ugraivanje faga u eliju Lizogena faza-DNA faga se integrira u genom i replicira zajedno sa bakterijskom DNA i ostaje tako ugraena dok se nesteknu uslovi za litiku fazuLitika faza-obilna produkcija partikula faga koja dovodi do lize elije

ivotni ciklus -faga odvija se slijedeim etapama:

Geni koji se nalaze na lijevoj strani linearne mape -faga kodiraju poteine repa i glave, partikule faga

Geni centralnog regiona uestvuju u rekombinaciji i lizogenezi faga

Veliki dio centraknog regiona nije neophodan za rast faga i slui kao mjesto za inserciju strane DNA

Sa desne strane se nalaze regulatorni geni i geni za otpornost, geni za sintezu DNA, geni zadueni za lizuKozmidni vektoriVektori koji imaju veliki kapacitet ugradnje strane DNAKozmidi formiraju kolonijeMCS-multiple cloning siteU plazmid ugraena cos mjesta(najee dva) iz bakteriofagaCos mjesta ograniavaju velike fragmente DNA upakovane u fagKozmidi se cirkulariziraju pomou cos mjesta, a nakon infekcije elija domaina repliciraju kao plazmidi

Problemi kod insercije kozmida

Nastanak klonova koji sadre inae odvojene DNA fragmente, aligacijom formiraju jedan povezan insert

Meusobna ligacija samih vektora , tako da nastale rekombinante postaju nestabilne

Jednolanani DNA vektori-filamentozni kolifagiGraeni od cirkularne jednolanane DNA molekule i inficiraju samo sojeve enterobakterija koje imaju F(sex) muki sojAdsorpcija filamentoznih faga vri se preko F-zavretaka, ali taan ulazak faga u eliju nije poznat.

Ulaskom u eliju jednolanana DNA biva konvertirana u dvolananu DNA, koja se brzo multiplicira (oko 100 kopija po eliji)

Ovaj tip vektora pogodan za sekvenciranje DNA fragmenata

Povezivanje DNA fragmenata

Fragmenti Dna nastali djelovanjem restrikcijskih enzima povezuju se ligazama u svrhu stvaranja rekombinantne DNA

DNA ligaze katalizuju formiranje fosfodietarskih veza izmeu 5 fosfatnog kraja jednog i 3 -hidroksilnog kraja drugog fragmentaTri metode za spajanje DNA fragmenta in vitro

Ljepljivim krajevima pomou DNA ligazeTupim krajevima uz biokatalitiku ulogu DNA ligazeSintezom jednolananih repova na 3 krajevima DNA fragmenta

Njee koritene ligaze su iz E.coli i T4 fag. Imaju isti sistem katalize ali su im neophodni razliiti kofaktori (ATP i NAD+)

DNA ligaza moe povezati i tupe krajeve pomou linkera linker molekuleLinkeri su obino sintetizirani desetonukleotidni fragmenti DNA, koji sadre restrikcijsko mjesto za jedan ili vie restrikcijskih enzima

Linkeri se prvo veu za tupe krajeve fragmenata a onda tretiraju restrikcijskim enzimima da bi se stvorili fragmenti sa ljepljivim krajevima

Dobijeni fragmenti se mogu inkorporirati u eljeni vektor koji je prethodno otvoren istim restrikcijskim enzimom

Vrlo esto se koriste dvojni linkeri, koji se dodaju na suprotne krajeve molekule DNA, isjeeni razliitim restrikcijskim enzimima, kako bi se sprijeio proces cirkuliranja, bilo fragmenta koji se inserciraju (kada su dugaki) bilo vektoraAdapteri-sintetizirani linkeri koji se veu na stranu DNA, apotom ligiraju u vektor

Homopolimerni tailing (repovi)

Povezivanje fragmenata dodavanjem oligoadenin sekvenci na 3 kraj jedne grupe DNA molekula i oligotimin sekvenci na 3 kraj druge grupe.

Ovako formirani A-T repovi mogu formirati mijeani ciklini dupleks

Najee se 10-40istih nastavaka nukleotida dodaju na krajeve fragmenata DNA