NUCLEOTIDE SI ACIZI NUCLEICI

Teme abordate1. Baze azotate, nucleozide, nucleotide – caracteristici structurale, funcţii biologice2. Acizi nucleici: tipuri, roluri biologice3. Nucleoproteine4. Metode moderne de studiu al aciyilor nucleici

Baze azotate, nucleozide, nucleotide Izolate iniţial de către anatomistul F. Miescher (1868) din puroiul extirpat chirurgical,

nucleinele, denumite ulterior nucleoproteine, sunt heteroproteine alcătuite dintr-o componentă proteică bazică şi o grupă prostetică cu conţinut ridicat de acid fosforic, denumită acid nucleic. În funcţie de acidul conţinut, se deosebesc ribonucleoproteine, ce conţin ARN (acid ribonucleic) şi dezoxiribonucleoproteine ce conţin ADN (acid dezoxiribonucleic).

Importanţa deosebită a acizilor nucleici din nucleoproteine constă în rolul fundamental de înmagazinare a informaţiei genetice şi de transcrierea acesteia în secvenţa de aminoacizi din structura proteinelor.

Acizii nucleici sunt polinucleotide. Prin hidroliză acidă, bazică sau enzimatică, acizii nucleici se degradează punând în libertate următoarele componente comune sau diferite:

a) baze azotate purinice sau pirimidinice;b) pentoze: D-riboză sau D–dezoxiriboză;c) resturi de acid fosforic.Baze azotate Bazele azotate din acizii nucleici derivă de la heterociclurile de bază ale purinei (baze

purinice) şi pirimidinei (baze pirimidinice).

Au caracter bazic. Au proprietatea de a absorbi în UV la λ═260 nm (cea mai mare absorbţie o au bazele purinice), pe baza intensităţii absorbţiei putând identifica şi doza spectrofotometric bazele azotate şi compuşii ce le conţin.

Bazele purinice sunt adenina şi guanina (denumirea acesteia derivând de la cuvântul guano ═ excrementele unor păsări), care se găsesc şi în ADN şi în ARN.

Bazele pirimidinice sunt citozina, uracilul şi timina. Citozina se găseşte şi în ADN şi în ARN, uracilul în ARN, iar timina în ADN şi bază minoră în unele tipuri de ARN (tARN)

1

Baze minore. În afară de aceste baze azotate, considerate baze majore, în acizii nucleici se găsesc în proporţie redusă aproximativ 30 de baze minore, între care: pseudouracil, 5-metil-citozină, 5-hidroxi-uracil, 7-metil-guanină etc.

NucleozideNucleozidele sunt N-glicozide ale bazelor azotate cu o pentoză: D-riboza sau

D-deoxiriboza, în forma β. Nucleozidele din acizii nucleici sunt: adenozina, guanozina, citidina, uridina în ARN, respectiv deoxiadenozina, deoxiguanozina, deoxicitidina şi deoxitimidina (timidina) în ADN.

Structura unor nucleozide Nucleozide libere. Pe lângă nucleozidele ce intră în structura acizilor nucleici, unele

ribonucleozide se găsesc şi sub formă liberă, de exemplu S-adenozil metionina, important donor de grupe metil pentru procesele de metilare ce se desfăşoară în organism.

NucleotideNucleotidele se formează prin legarea unui rest fosfat la grupa –OH din poziţia 3 ’ sau 5’ a

pentozei. Datorită resturilor fosforice, nucleotidele au caracter acid.Nucleotidele din ARN sunt: acid adenilic (acid adenozin 5’-monofosforic, AMP), acid

guanilic (acid guanozin 5’-monofosforic, GMP), acid citidilic (acid citidin 5’-monofosforic, CMP), acid uridilic (acid uridin 5’-monofosforic, UMP).

Nucleotidele din ADN sunt: acid deoxiadenilic (acid deoxiadenozin 5’-monofosforic, dAMP), acid deoxiguanilic (acid deoxiguanozin 5’-monofosforic, dGMP), acid deoxicitidilic (acid deoxicitidin 5’-monofosforic, dCMP), acidul timidilic (acid timidin 5’-monofosforic, dTMP).

Structura unor nucleotide Mononucleotidele îndeplinesc şi alte roluri biologice pe lângă acela de a fi componente

structurale ale acizilor nucleici. a. Nucleotide ciclice. Prin legarea resturilor fosforice la două grupe –OH în poziţiile 3’ şi

5’ şi deshidratarea acestora cu ciclizare rezultă nucleotide ciclice libere. Cele mai importante sunt: acidul 3’, 5’- adenozin-monofosforic ciclic (3’, 5’ – AMPc) şi acidul 3’,5’ – guanozin-monofosforic ciclic (3’, 5’ – GMPc), importanţi mesageri secunzi ai hormonilor.

2

b. Intră în structura unor coenzime (coenzima A, FAD, NAD+),c. Funcţionează ca şi intermediari în metabolismul nucleotidelor purinice (IMP-

acidul inozilic, ce conţine ca bază azotată hipoxantina), d. Participă la procese importante, de exemplu cele ce funcţionează ca donori de grupe –

SO3H în procesele biochimice de sulfatare: de exemplu acidul 3’-fosfoadenozin-5’–fosfosulfuric (PAPS).

e. Nucleozid polifosfaţii sunt nucleotide rezultate prin ataşarea a două resturi fosfat (nucleozid difosfaţi), respectiv trei resturi fosfat (nucleozid trifosfaţi) la grupa –OH din poziţia 5’ a pentozei.

Nucleozid polifosfaţii există liberi îndeplinind în celule funcţii biologice diferite:a) intermediari metabolici: inozin difosfat (IDP), inozin trifosfat (ITP);b) compuşi bogaţi în energie (compuşi macroergici): adenozin trifosfat (ATP), guanozin

trifosfat (GTP), uridin trifosfat (UTP), citidin trifosfat (CTP);Prin legarea mononucleotidelor rezultă oligonucleotide (care conţin mai puţin de 50

mononucleotide) sau polinucleotide.Acizii nucleiciAcizii nucleici sunt polinucleotide în care mononucleotidele sunt unite prin legături

fosfodiesterice între grupa –OH din poziţia 3’ a unei pentoze şi grupa –OH din 5’ a pentozei din mononucleotidul următor. Legăturile 3’-5’-3’-5’- … înlănţuie nucleotidele într-o secvenţă liniară reprezentând “coloana vertebrală” a acizilor nucleici.

Au caracter acid şi sunt legaţi de proteine bazice şi, rareori, neutre. Acizii nucleici se diferenţiază prin: lungimea lanţului; pentoza conţinută; natura bazelor azotate şi ordinea în care acestea se succed (Tabel 1).

Tabel 1 Diferenţe între ADN şi ARNADN ARN

Baze azotate A, G, T, C A, G, U, CPentoza Deoxiriboza Riboza Catena Dublu catenar Monocatenar cu regiuni dublu catenare

rezultate prin plierea în ac de păr sau sub formă de trifoi

Baze complementare

Localizare Nucleu (majoritar) ARN ribozomal (ARNr) – ribozomiARN de transfer (ARNt) – citoplasmăARN mesager (ARNm) – citoplasmă

Orientare 5’–3’ 5’–3’Scriere convenţională 5’pdB1pdB2pdB33’

dB1dB2dB3

5’pB1pB2pB33’B1B2B3

Hidroliză bazică Nu Da

Structura acizilor nucleiciOdată cu cercetările lui O.Avery, C.Mc Leod şi M.Mc Carthy (1943), care au demonstrat

că ADN pur extras din pneumococii virulenţi determină transformarea suşei nevirulente în pneumococi virulenţi, s-a stabilit că ADN este molecula eredităţii, informaţia genetică fiind înscrisă în secvenţa variabilă a nucleotidelor din acizii nucleici. Dezvoltarea caracterelor morfologice şi funcţionale ale unei celule se realizează după programul înscris în ADN.

Acizii nucleici prezintă o structură primară asemănătoare (vezi figura).

3

Acidul dezoxiribonucleic este o biomacromoleculă rezultată prin condensarea deoxiribonucleotidelor. Folosind metoda difracţiei razelor X, R.Franklin şi M.Wilkins au arătat că ADN produce un model de difracţie ce caracterizează o elice.

Prin analiza cromatografică a ADN izolat de la mai multe specii, Chargraff a stabilit o relaţie cantitativă între bazele azotate, concentraţiile nucleotidelor cu adenină şi timină, precum şi cele ale nucleotidelor cu guanină şi citozină, fiind egale:

Pe baza datelor existente, J. Watson şi F.Crick, în 1953, au postulat structura tridimensională a ADN, modelul ADN dublu helix. Descoperirea structurii tridimensionale a ADN a fost un eveniment de răsunet în cercetarea ştiinţifică care a deschis drumul dezvoltării cercetărilor de biochimie, biologie celulară, genetică.

Structura secundara a ADN – modelul ADN dublu helix

4

Caracteristicile modelului structurii tridimensionale a ADN: Molecula de ADN are două lanţuri care se înfăşoară în direcţii opuse, antiparalel, în

jurul unui ax imaginar. Modelul poate fi comparat cu o “scară în spirală” în care unităţile de deoxiriboză şi fosfat sunt îndreptate spre exterior şi reprezintă “balustradele”, iar bazele azotate spre interior, constituind “ treptele”, perpendiculare pe axul imaginar (vezi figura);

ADN are unităţi cu dimensiuni identice: diametrul helixului – 20Ǻ; distanţa între bazele adiacente - 3,4 Ǻ; pasul elicei (unitatea de structură helicală) se repetă după aprox.10 resturi de nucleotide;

bazele din cele două catene se unesc prin legături de hidrogen după o anumită regulă de complementaritate;

Modelul propus de Watson şi Crick furnizează elemente pentru explicarea capacităţii ADN de a funcţiona ca moleculă ce stochează şi transmite informaţia înscrisă în secvenţa de baze, prin autoreplicarea semiconservativă a ADN sintetizându-se două catene ce păstrează caracteristicile ADN parental.

ADN este o moleculă flexibilă, fiind posibilă rotaţia în jurul scheletului format din pentozele unite prin fosfat. Fluctuaţiile termice pot determina îndoirea, întinderea şi desperecherea (melting) catenelor ceea ce permite apariţia unor structuri diferite de cea propusă de Watson şi Crick, care mai este cunoscută şi sub numele de forma ADN-B.

Aceasta este forma cea mai stabilă comparativ cu celelalte variante structurale descrise, formele ADN-A şi ADN-Z (Tabel).

Tabel Caracteristicile formelor structurale ale ADN

Caracteristica ADN A ADN B ADN Z

Sensul elicei

Diametrul elicei

Perechi de baze /spiră

Lungimea fiecărei baze

Rotaţia bazelor

Legătura glicozidică

(conformaţie)

Spre dreapta

26 Ǻ

11

2,6 Ǻ

20o

Anti

Spre dreapta

20 Ǻ

10,5

3,4 Ǻ

6o

Anti

Spre dreapta

18 Ǻ

12

3,7 Ǻ

7o

Anti - pirimidine

Syn - purine

Se presupune că forma Z intervine în reglarea expresiei unor gene sau în recombinarea genetică, în timp ce existenţa formei A în celule nu este confirmată.

În structura ADN există anumite secvenţe simetrice caracterizate prin ordinea inversă a nucleotidelor (inverted repeats) pe cele două catene complementare (palindroame) sau pe aceeaşi catenă (secvenţe în oglindă).

Secvenţe particulare din ADN (după Nelson D.L. şi Cox M.M., 2000)

5

Dimensiunea moleculei de ADN se exprimă ca număr de perechi de baze conţinute (de exemplu, cromozomul de la E.coli are 4,72 x 103 kpb).

Catenele ADN pot fi liniare sau circulare (bacterii, bacteriofagi).Cromozomii singulari de la procariote sunt de fapt molecule de ADN circular,

conţinând puţine proteine. Cromozomii eucariotelor sunt reprezentaţi de molecule liniare de ADN care înconjoară un miez proteic format din patru tipuri diferite de histone: H1, H2A, H3, H4, asociate într-un octamer formând nucleozomi.

Replicarea ADN determină pregătirea celulelor pentru diviziune. Între două diviziuni, celulele parcurg un ciclu celular constituit din două faze: interfaza

(cu perioadele G1, S, G2) şi mitoza, diviziunea celulară. Multe celule intră într-o perioadă, G0, în care ies din G1, devin celule liniştite care desfăşoară activitate specifică. În cancer, celulele se divid haotic, ciclul celular fiind perturbat.

6

Transformările neezimatice ale nucleotidelor. Mutaţii. Bazele azotate din nucleotide şi polinucleotide pot suferi diverse alterări structurale neezimatice: Dezaminarea bazelor azotate, în special a citozinei. Resturile de uracil rezultate din

dezaminarea acesteia sunt reparate prin excizie; Hidroliza legăturii N-glicozidice din nucleotidele purinice şi, mai rar din cele pirimidinice,

mai ales pentru ADN; Formarea dimerilor de timină sub acţiunea radiaţiilor UV şi fragmentarea bazelor purinice

sub acţiunea radiaţiilor ionizante (aproximativ 10% din mutaţiile ADN); Dezaminarea provocată de diverse noxe industriale (nitriţi, nitraţi, nitrozamine, bisulfiţi); Alchilarea guaninei (cu dimetilnitrozamină); Degradarea ADN sub acţiunea speciilor reactive ale oxigenului (radical superoxid, hidroxil, peroxid de hidrogen) este reprezentată de oxidări ale bazelor purinice, ruperea catenelor ADN (apare în stresul oxidativ, depăşirea capacităţii organismului de a se opune acţiunii acestor specii prin sistemele antioxidante enzimatice şi neenzimatice de care dispune).

Deşi se produc cu viteze reduse, acestea au efecte nedorite asupra materialului genetic al celulei conducând la apariţia mutaţiilor. Celulele sunt dotate cu diferite sisteme de a repara eventualele mutaţii. Perpetuarea acestor alterări este responsabilă de dezvoltarea unor celule anormale (în diferitele forme de cancer), de viteza cu care organismul îmbătrâneşte.

Acizii ribonucleici sunt biomacromolecule rezultate prin condensarea ribonucleotidelor şi reprezintă materialul genetic al unor virusuri mici (ribovirusuri: gripal, virusul mozaicului tutunului, HIV, hepatita C), în celelalte organisme intervin în transmiterea informaţiei genetice.

Utilizarea informatiei genetice

Acizii ribonucleici au un conţinut în baze azotate ce nu respectă relaţia lui Chargraff, sunt, în general, monocatenari. La unele tipuri de ARN catena se poate plia faţă de ea însăşi, prezentând regiuni dublu catenare ce expulzează în exterior zonele monocatenare sub forma unui ac de păr sau frunze de trifoi.

7

Cantitatea de ARN variază de la o celulă la alta şi chiar în aceeaşi celulă, în funcţie de intensitatea proceselor de biosinteză proteică la un anumit moment.

Tipuri de ARN. După rolul îndeplinit în procesul de biosinteză proteică, se deosebesc mai multe tipuri de ARN.

ARNt (de transfer, solubil, ARNs) reprezintă 5–15% din ARN total. Sunt molecule mici, de aproximativ 90 nucleotide, care leagă specific fiecare din cei 20 de aminoacizi proteinogeni şi îi transportă la locul sintezei proteice.

Indiferent de tipul de ARNt, capetele 5’ şi 3’ sunt identice. La capătul 3’ se leagă aminoacizii. ARNt poate fi reprezentat asemănător unei frunze de trifoi.

La capătul buclei inferioare se găseşte secvenţa anticodon, braţul DHU (care conţine în cantitate mare dihidrouracil) este implicat în legarea aminoacil-ARNt-sintetazei, iar prin braţul TΨC (care are cantitate mare de timină, pseudouracil) se realizează legarea complexului aminoacil-ARNt la ribozomi.

ARNm (mesager, informaţional, ARNi) reprezintă 2-4% din ARN celular. Sunt molecule monocatenare, liniare, de lungime variabilă ce se sintetizează în nucleu pe matriţă ADN (prin transcriere), apoi iese în citoplasmă unde va fi matriţa pentru sinteza unui polipeptid cu o secvenţă specifică de aminoacizi (prin translaţie). Este heterogen ca mărime în funcţie de lungimea polipeptidului pe care îl codifică. Are o viaţă foarte scurtă, la bacterii de 2-3 minute, iar la eucariote de câteva ore, fiind degradat de ribonucleaze.

La procariote, ARNm conţine informaţia pentru sinteza unei singure proteine sau a mai multor polipeptide (frecvent trei lanţuri) implicate în acelaşi proces metabolic.

Structura tridimensională a ARNt ARNr (ARN ribozomal) este reprezentat de molecule flexibile, heterogene ca formă şi

mărime, ce se clasifică în funcţie de constanta de sedimentare. Sunt conţinuţi în ribozomi, particule ribonucleoproteice descrise de G.E. Palade, cu constante de sedimentare diferite: 70S la procariote, 80S la eucariote.

Ribozomii se pot disocia în două subunităţi de dimensiuni diferite:- la procariote: subunitatea mare 50S, subunitatea mică 30S;- la eucariote: subunitatea mare 60S, subunitatea mică 40S.

Subunităţile conţin ARNr diferiţi: 18S în subunitatea mică, 28S, 5S, 8S în subunitatea mare de la eucariote.

Ribozomii constituie sediul biosintezei proteice. H. Noller şi colab. au dovedit prin studii recente participarea ARNr cu rol de catalizator în sinteza legăturilor peptidice, reacţia catalizată de peptidil transferază necesitând prezenţa unor subunităţi ribozomale 50S lipsite de proteine, denumite ribozime. Acest tip de ARN satisface câteva caracteristici ale

8

enzimelor: are substrat specific, măreşte viteza reacţiei enzimatice şi iese nemodificat din reacţie.

Recent a fost caracterizat un ARN nuclear de dimensiuni reduse (snARN) care se găseşte mai ales în nucleul celulelor eucariote. Formează complexe stabile cu proteine specifice, denumite ribonucleoproteine nucleare mici. Au dimensiunea 10S, reprezintă între 1-10% din ribozomi şi au rol în prelucrarea ARN mesager matur exportat în citoplasma celulelor eucariote.

Importanţa medicală a analogilor de sinteză ai bazelor azotate si nucleozidelor Unele medicamente, datorită asemănării structurale cu bazele azotate sau nucleozidele, îşi

bazează acţiunea pe influenţarea procesului di sinteză a acizilor nucleici. Se cunosc baze de sinteză folosite ca medicamente antitiroidiene (tiouracil, 5-metil-

tiouracil) sau ca antimetaboliţi în tratamentul unor neoplasme de sân, colon (5-fluor-uracil), leucemiei (6-mercapto-purina, 6-tio-guanina), gutei (alopurinol, analog structural al hipoxantinei, intermediar în metabolizarea bazelor purinice)

Unele nucleozide de sinteză au acţiune antivirală sau antitumorală (azidotimidina (zidovudina), arabinozil citozina etc, fiind folosite în tratamentul infecţiei cu HIV, al unor forme de cancer.

Datorită caracterului acid al acizilor nucleici, aceştia interacţionează in vivo cu proteine cu caracter bazic formând nucleoproteine. Interacţiunea se realizează prin legături ionice între grupele fosfat din acizii nucleici şi grupele –NH3

+ ale aminoacizilor bazici din structura proteinelor.

Proteinele din structura nucleoproteidelor se numesc protamine şi histone.Protaminele se caracterizează prin următoarele:

a) sunt proteine cu masă moleculară mică ( Mr 5 kD);b) conţin 35–55% arginină, ceea ce le conferă caracter bazic;c) nu conţin aminoacizi aromatici şi cu sulf;d) sunt legate de ADN din nucleu, raportul ADN/proteină fiind specific pentru diferite specii;e) sunt rezistente la acţiunea pepsinei, deoarece aceasta necesită aminoacizi aromatici pentru a-şi exercita atacul.

Histonele sunt prezente la toate animalele, absente la bacterii şi au următoarele caracteristici: a) masa moleculară cuprinsă între 8,4–22 kD;b) caracter bazic, datorat unui conţinut crescut de lisină şi arginină;c) sunt solubile în acizi, nedializabile şi hidrolizează sub acţiunea pepsinei;d) se găsesc în raport fix cu ADN nuclear (un mol histonă la un segment de ADN de 25 perechi de baze azotate);

În nucleoproteine, proporţia acizilor nucleici este diferită.

9

10