northen Blots

7/30/2019 northen Blots

1/25

NORTHEN BLOTS

Tri Novia Kumalasari

20112508059


2/25

History/Background

Spawned naming of related techniques:

Southern blot

(DNA)

Northern blot

(RNA)

Western blot

(Protein)

Eastern blot

(Pasca translasi protein


3/25

Blot adalah suatu teknikmemindahkan bagian protein

yang telah dipisahkan, RNA

atau DNA dari gel ke lembarantipis atau matriks membran

agar.

Sumber: http://id.shvoong.com/t

ags/northern-blot/#ixzz2EJ9TtAnA
http://id.shvoong.com/tags/northern-blot/http://id.shvoong.com/tags/northern-blot/http://id.shvoong.com/tags/northern-blot/http://id.shvoong.com/tags/northern-blot/http://id.shvoong.com/tags/northern-blot/http://id.shvoong.com/tags/northern-blot/http://id.shvoong.com/tags/northern-blot/


4/25

Northern blottingbertujuan mendeteksi

sequences RNA,

disebut Northern karena RNA dianggap

merupakan bayangan berlawanan dari

DNA.

Northern blottingjuga dapat dilakukanoleh prosedurpolymerase chain reaction(PCR) dengan memakai ensim reversetranscriptase


5/25

Northern Blotting digunakan dalam riset

biologi molekular untuk:

- pendeteksian mRNA ukuran catatan

- studi RNA penurunan(pangkat,derajad)

- studi RNA dapat mendeteksi sebagai

alternatif menyambung - studi RNA umur-paruh

- studi untuk memindahkan kemungkinan

RNA dan cistron translasi.

- sering digunakan untukmengkonfirmasikan dan memeriksa

transgenik binatang


6/25

Tahapan :

Tahap pertama prosedur tersebut adalah

migrasi molekul asam nukleat pada gel

agarosa.

. Ekstraksi RNA dipisahkan dengan

menggunakan elektrophoresis

Pita-pita untai tunggal RNA, kemudian

dipindahkan ke membran nilon atau

nitroselulosa seperti halnya pada

hibridisasi koloni.


7/25

Begitu asam nukleat dipindahkan ke

membran, tahap-tahap selanjutnya pada

kedua prosedur skrining tersebut sama,

yaitu fiksasi asam nukleat pada membran,

hibridisasidengan pelacak, pencucian sisa

pelacak, dan deteksi fragmen yang

mengalami hibridisasi menggunakan

autoradiografi.


8/25

Di antara tahap-tahap tersebut kondisi hibridisasi

merupakan faktor yang paling memerlukan perhatian.

Jika antara pelacak dan sekuenstarget terdapat homologi yang

sangat tinggi (mendekati atau sama dengan 100%), makadapat

diberlakukan kondisi hibridisasi yang ketat, yaitu

dengan suhu hibridisasi tinggi

dan konsentrasi garam rendah pada bufer hibridisasi.

Sebaliknya, jika sekuens pelacak tidak terlalu homolog dengan

sekuens target, maka ketetatan kondisi hibridisasi harus

diturunkan sampai pada tingkatan yang memungkinkan

terbentuknya hibrid-hibrid yangkurang sempurna.

Namun, jika keketatannya diturunkan terlalu banyak, fragmenpelacak

mungkin akan berikatan dengan sekuens-sekuens lain yang

tidak spesifik.


9/25

Northen Blotting


10/25

Penggambaran

Teknik NorthenBlotting


11/25

Capsella rubella ? copies of gene X

extract

RNA

Example Looking for Gene X


12/25

Step 1. Restriction Enzyme Digestion


13/25

Step 2. Gel Electrophoresis

_+


14/25

Step 4. Transfer RNA to Membrane

Two methods for transferring RNA to a

membrane

capillary

electrophoretic


15/25

Step 5. Making a Probe

Arabidopsis thaliana 2 copies of gene X


16/25

Step 6. Pre-hybridization

Prehybridization buffers

mengandung blocking reagents

t


17/25

Step 7. Hybridization


18/25

Step 8. Washes


19/25

Step 9. Anti-DIG


20/25

Step 10. Washes


21/25

Step 11.


22/25

Step 12. Detection

Detesi sesuai tujuan

melakuan Northen

blotting

Beberapa hal yang


23/25

Beberapa hal yangmembedakan dengan Southernblotting adalah

: (1) RNA jauh lebih rentan terhadapdegradasi dibanding DNA, oleh karenaitu elektroforesis dilakukan dalam buferyang mengandung zat kimia yang

bersifat melindungi (biasanyaformaldehid),

(2) RNA sudah berupa untai tunggaldan membutuhkan kondisi denaturasi

yang lebih ringan


24/25

(3) RNA biasanya berukuran tertentusehingga tidak memelukan digestienzim untuk memperoleh pola pita.Kedua prosedur sangat mirip karena

setelah elektroforesis RNA jugaditransfer ke membran melalui difusikapilaritas. Biasanya sinarUVdigunakan untuk mengikat

(crosslink) RNA pada membransehingga tidak bergerak (imobilisasi).


25/25

Terima Kasih

Documents

northen Blots