Navodila in delovni zvezek za vaje Mikrobiološka analiza

Barbara Jeršek

2013

MIKROBIOLOŠKA ANALIZANAVODILA IN DELOVNI ZVEZEK ZA

LABORATORIJSKE VAJE

MIKROBIOLOŠKA ANALIZA. NAVODILA IN DELOVNI ZVEZEK ZA LABORATORIJSKE VAJE

I

MIKROBIOLOŠKA ANALIZANAVODILA IN DELOVNI ZVEZEK ZALABORATORIJSKE VAJE

Barbara JeršekNavodila in delovni zvezek za vaje pri predmetuMikrobiološka analiza

Izdajatelj:Univerza v LjubljaniBiotehniška fakultetaOddelek za živilstvo

CI - Kataložni zapis o publikacijiCIP - Kataložni zapis o publikacijiNarodna in univerzitetna knjižnica, Ljubljana

579.67.08(075.8)(076.5)

JERŠEK, BarbaraMikrobiološka analiza [Elektronski vir] : navodila in delovni zvezek za laboratorijske vaje /

Barbara Jeršek. - El. knjiga. - Ljubljana : Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, 2013

ISBN 978-961-6908-02-3 (pdf)

267204864

Ljubljana, maj 2013

Vse pravice pridržane. Noben del te publikacije se ne sme reproducirati ali uporabiti na kakršenkolidrug način (grafični, elektronski ali mehanski, vključno s fotokopiranjem, snemanjem ali prenosom vbaze podatkov) brez pisnega soglasja nosilca avtorskih pravic.


II

KAZALO VSEBINE

1 UVOD .........................................................................................................................................1

1.1 PRIPRAVA VZORCA ZA MIKROBIOLOŠKO ANALIZO .....................................................................1

1.1.1 IZGLED VZORCA ...........................................................................................................................................1

1.1.2 TAJANJE.........................................................................................................................................................1

1.1.3 HOMOGENIZIRANJE .....................................................................................................................................2

1.1.4 TEHTANJE......................................................................................................................................................2

1.1.5 PRIPRVA OSNOVNE (MATIČNE) RAZTOPINE.............................................................................................2

1.1.6 PRIPRVA RAZREDČITEV VZORCA ..............................................................................................................2

1.2 SPLOŠEN POTEK KVALITATIVNE MIKROBIOLOŠKE PREISKAVE................................................3

1.2.1 OBOGATITEV.................................................................................................................................................3

1.2.2 IZOLACIJA......................................................................................................................................................3

1.2.3 POTRDITEV / IDENTIFIKACIJA .....................................................................................................................3

1.3 SPLOŠEN POTEK KVANTITATIVNE MIKROBIOLOŠKE PREISKAVE .............................................3

1.3.1 PRIPRAVA RAZREDČITEV VZORCA............................................................................................................3

1.3.2 IZOLACIJA......................................................................................................................................................3

1.3.3 KVANTIFIKACIJA ...........................................................................................................................................4

1.3.4 POTRDITEV / IDENTIFIKACIJA .....................................................................................................................5

2 INDIKATORSKE SKUPINE MIKROORGANIZMOV ....................................................................6

2.1 SKUPNO ŠTEVILO MIKROORGANIZMOV ........................................................................................6

2.1.1 AEROBNI MEZOFILNI MIKROORGANIZMI ...................................................................................................6

2.1.2 KVASOVKE IN PLESNI ..................................................................................................................................6

2.1.3 ŠTEVILO ENTEROBAKTERIJ ........................................................................................................................7

2.1.4 KOLIFORMNE BAKTERIJE............................................................................................................................8

2.1.5 BAKTERIJE VRSTE Escherichia coli ..............................................................................................................8

3 PATOGENE BAKTERIJE..........................................................................................................10

3.1 BAKTERIJE RODU Salmonella ........................................................................................................ 10

3.1.1 DOLOČANJA BAKTERIJ RODU Salmonella ................................................................................................10

3.2 BAKTERIJE RODU Campylobacter .................................................................................................. 13

3.2.1 DOLOČANJE BAKTERIJ RODU Campylobacter..........................................................................................13

3.3 BAKTERIJE VRSTE Staphylococcus aureus ................................................................................... 15

3.3.1 DOLOČANJE BAKTERIJ VRSTE Staphylococcus aureus ...........................................................................16

3.4 BAKTERIJE VRSTE Listeria monocytogenes................................................................................... 17

3.4.1 DOLOČANJE BAKTERIJ VRSTE Listeria monocytogenes ..........................................................................18

4 KVARLJIVCI ŽIVIL....................................................................................................................20

4.1 HALOFILNI IN OZMOFILNI MIKROORGANIZMI ............................................................................. 20

4.1.1 DOLOČANJE HALOFILNIH BAKTERIJ ........................................................................................................21

4.1.2 DOLOČANJE OZMOTOLERANTNIH KVASOVK IN KSEROFILNIH PLESNI ..............................................21

4.2 MLEČNOKISLINSKE BAKTERIJE.................................................................................................... 22


III

4.2.1 DOLOČANJE MLEČNOKISLINSKIH BAKTERIJ ..........................................................................................24

4.3 SPOROGENE BAKTERIJE............................................................................................................... 25

4.3.1 AEROBNE SPOROGENE BAKTERIJE ........................................................................................................27

4.3.1.1 DOLOČANJE SKUPNEGA ŠTEVILA AEROBNIH SPOROGENIH BAKTERIJ ...................................27

4.3.2 ANAEROBNE SPOROGENE BAKTERIJE ...................................................................................................27

4.3.2.1 DOLOČANJE SKUPNEGA ŠTEVILA ANAEROBNIH SPOROGENIH BAKTERIJ ..............................28

4.3.3 TEHNOLOŠKI KVARLJIVCI..........................................................................................................................28

4.3.3.1 DOLOČANJE TEHNOLOŠKIH KVARLJIVCEV...................................................................................29

4.3.3.1.1 PSIHROFILNI AEROBNI KVARLJIVCI ........................................................................................29

4.3.3.1.2 MEZOFILNI AEROBNI KVARLJIVCI............................................................................................29

4.3.3.1.3 LIPOLITIČNI MIKROORGANIZMI ................................................................................................29

4.3.3.1.4 AEROBNE SPOROGENE BAKTERIJE .......................................................................................29

4.3.3.1.5 ANAEROBNE SPOROGENE BAKTERIJE ..................................................................................29

4.3.3.1.6 TERMOFILNE SPOROGENE BAKTERIJE..................................................................................29

4.3.3.1.7 TERMOFILNE ANAEROBNE SPOROGENE BAKTERIJE ..........................................................30

4.3.3.1.8 PROTEOLITIČNE ANAEROBNE SPOROGENE BAKTERIJE.....................................................30

4.3.4 BAKTERIJE VRSTE Bacillus cereus.............................................................................................................30

4.3.4.1 DOLOČANJE BAKTERIJ VRSTE Bacillus cereus...............................................................................30

4.3.5 BAKTERIJE RODU Alicyclobacillus ..............................................................................................................31

4.3.5.1 DOLOČANJE BAKTERIJ RODU Alicyclobacillus ................................................................................32

4.3.6 BAKTERIJE RODU Clostridium ....................................................................................................................33

4.3.6.1 DOLOČANJE BAKTERIJ VRSTE Clostridium perfringens ..................................................................33

5 RAZLIČNOST MIKROBNIH IZOLATOV....................................................................................36

5.1 RAZLIKOVANJE IZOLATOV BAKTERIJ VRSTE L. monocytogenes Z rep-PCR ............................ 36

5.1.1 TIPIZACIJA IZOLATOV BAKTERIJ VRSTE L. monocytogenes z rep-PCR..................................................37

5.1.1.1 PRIPRAVA DNK IZOLATOV BAKTERIJ VRSTE L. monocytogenes ..................................................37

5.1.1.2 IZVEDBA rep-PCR ..............................................................................................................................38

5.1.1.3 VREDNOTENJE REZULTATOV rep-PCR ..........................................................................................39

6 LABORATORIJSKI DNEVNIK...................................................................................................40

7 RAZPORED IN IZVEDBA LABORATORIJSKIH VAJ ................................................................41

8 I. vaja – INDIKATORSKE SKUPINE MIKROORGANIZMOV.....................................................42

9 II. vaja – PATOGENE BAKTERIJE ...........................................................................................44

10 III. vaja – OZMOFILNE KVASOVKE, KSEROFILNE PLESNI....................................................47

11 IV. vaja – MLEČNOKISLINSKE BAKTERIJE ............................................................................49

12 V. vaja – SPOROGENE BAKTERIJE........................................................................................51


IV

13 VI. vaja – TEHNOLOŠKI KVARLJIVCI......................................................................................53

14 VII. vaja – TIPIZACIJA ..............................................................................................................55

15 NAVODILA ZA VARNO DELO ..................................................................................................57

16 VIRI...........................................................................................................................................58


1

1 UVOD

Mikrobiološka analiza je širok in kompleksen pojem, ki zajema več različnih področij od vzorčenja,priprave vzorca za analizo, do izvedbe same analize in vrednotenja rezultatov. Vzorci zamikrobiološko analizo so lahko zelo različni vse od okoljskih vzorcev, humanega materiala, vzorcevživil in krme, farmacevtskih vzorcev, živalskih vzorcev, ipd. Pri laboratorijskih vajah bodo analiziranivzorci različnih živil in različni okoljski vzorci.

Ustreznost in stanje vzorca, ki ga sprejmemo na analizo, sta bistvenega pomena, saj v primeru, daso bili vzorci nepravilno zbrani, ali da je bilo rokovanje z vzorci neustrezno, ali da ni bil odvzetreprezentativen vzorec za vzorčeni lot, bodo laboratorijski izvidi brez pravega pomena. Zato je privzorčenju potrebno uporabljati uveljavljene postopke, ki omogočajo na relativno majhnem vzorcu zaanalizo, ustrezno interpretacijo na serijo ali lot. Pomen reprezentativnega vzorca je toliko večji obdejstvu, da so patogeni in toksini normalno neenakomerno porazdeljeni ali pa so prisotni v nizkihkoncentracijah. Število enot, ki sestavljajo reprezentativni vzorec, je določeno za mnoga živila gledena statistične plane vzorčenja. Sestava in narava vsake vzorčne enote vzorca vpliva na homogenostin enotnost skupne mase vzorca. Vzorčenje je različno tudi glede na to, ali je živilo trdno, pol-trdno,viskozno ali tekoče (6.International Commission on Microbiological Specifications for Foods, 1986).Kadar je le mogoče, se predloži vzorce v laboratorij v zaprti originalni embalaži. Če gre za proizvodev razsutem stanju ali v posodah, ki so prevelike za oddajo v laboratorij, je potrebna aseptičnatehnika vzorčenja v sterilno embalažo s sterilnimi pripomočki. Od vzorčenja do začetkamikrobiološke analize ne sme preteči več kot 36 ur in medtem morajo biti vzorci hranjeni pri 0 – 4 oCoziroma zmrznjeni, če gre za zmrznjena živila.

1.1 PRIPRAVA VZORCA ZA MIKROBIOLOŠKO ANALIZO

1.1.1 IZGLED VZORCA

Preden začnemo mikrobiološko analizo, ugotovimo stanje embalaže, podatke o vzorcu, ki sonapisani na deklaraciji ali embalaži in morebitna odstopanja od značilnih lastnosti. V laboratorijskidnevnik zapišemo datum prevzema vzorca, postopek vzorčenja, naročnikovo ime in naslov terlastnosti vzorca.

Vzorce za mikrobiološko analizo pripravljamo vedno aseptično, da preprečimo kontaminacijovzorcev iz okolja. Na primer pri embaliranih živilih embalažo obrišemo s 70 % etanolom in v primerih,ko je embalaža steklo ali kovina, jo ožgemo s plamenom. Embalažo odpremo aseptično s sterilnimpriborom (na primer: odpirač za pločevinke, nož, škarje) in vzorec vzamemo s sterilnim priborom (naprimer: žlica, pipeta).

1.1.2 TAJANJE

Vzorec se taja v originalni embalaži v kateri je bil sprejet v laboratorij; v primeru da to ni izvedljivo,se uporabi sterilna posoda. Uporabimo aseptično tehniko dela. Običajno je mogoče vzorec odmrznitipri 2-5 ° C v 18 h. Če želimo hitro odmrzovanje, lahko vzorec temperiramo v vodni kopeli na manjkot 45 ° C za največ 15 min. Vzorec nato skupaj z odpuščeno tekočino homogeniziramo.


2

1.1.3 HOMOGENIZIRANJE

Da bi zagotovili kar najbolj enakomerno porazdelitev mikroorganizmov uporabimo homogenizacijovzorca. Homogeniziramo celoten vzorec ali najmanj 100 g oziroma 50 g odvisno od vrste vzorca invrste mikrobiološke preiskave. Za homogenizacijo uporabimo električno mešalo ali gnetilnik inaseptično tehniko dela.

1.1.4 TEHTANJE

Glede na vrsto mikrobiološke preiskave aseptično tehtamo določeno maso homogeniziranegavzorca z natančnostjo ± 0,1 g.

1.1.5 PRIPRVA OSNOVNE (MATIČNE) RAZTOPINE

Za kvantitativne mikrobiološke preiskave pripravimo osnovno ali matično raztopino. Pripravimo jozato, da zagotovimo čim bolj enakomerno razporeditev mikroorganizmov v preiskovani količini živila.Odtehtamo preiskovano maso ali odmerimo volumen živila v sterilno čašo ali plastično vrečko,dodamo devetkratno količino topila in suspenzijo homogeniziramo (ISO 6887-1: 1999(E)). Matičnaraztopina pomeni 10-kratno razredčitev živila. Če ni posebnih predpisov, je najmanjša količinapreiskovanega živila 10 g (ml) oziroma 20 g (ml). 10 g (ml) vzorca aseptično dodamo 90 ml topila(oziroma 20 g (ml) dodamo 180 ml topila). Tako dobimo osnovno 10-kratno razredčitev (R = 10-1).Vzorec homogeniziramo z gnetilnikom ali mešalom. V nekaterih primerih se 50 g (ml) vzorca doda450 ml topila.

Kot topilo lahko uporabimo peptonsko vodo, puferirano peptonsko vodo (ISO 6887-1: (1999)),fosfatni pufer ali fiziološko raztopino (Downes in Ito, 2001). Pri živilih z visokim deležem maščob, naprimer pri surovem maslu, smetani, sirih, sladoledu, uporabimo namesto fiziološke raztopine 2 %raztopino natrijevega citrata, ki jo segrejemo na 45 oC. Kislim živilom, na primer sadnemu soku,sirupu, osvežilnim pijačam, najprej izmerimo pH, nato pa 100 ml vzorca nevtraliziramo z 0,1 Nraztopino KOH. Matično raztopino pripravimo iz nevtraliziranega vzorca.

1.1.6 PRIPRVA RAZREDČITEV VZORCA

Naslednjo 10-kratno razredčitev vzorca pripravimo tako, da določen volumen osnovne razredčitve (1ml) dodamo v devetkraten volumen topila (9 ml). Tako dobimo 100-kratno razredčitev vzorca (R =10-2). Razredčevanje ponavljamo tolikokrat, da dobimo ustrezno razredčitev vzorca, ki je odvisna odštevila mikroorganizmov. Z razredčitvami živila se zmanjšuje količina preiskovanega vzorca in številomikroorganizmov v enoti volumna. Za pripravo razredčitev vzorca uporabimo enako topilo kot zapripravo matične raztopine. Čas od priprave matične raztopine do mikrobiološke preiskave naj ne bodaljši od 45 minut. Razredčitve naj bodo pripravljene v prvih 30-ih minutah.


3

1.2 SPLOŠEN POTEK KVALITATIVNE MIKROBIOLOŠKE PREISKAVE

S kvalitativno mikrobiološko preiskavo določamo prisotnost oziroma odsotnost določenihmikroorganizmov v določeni masi (volumnu) vzorca.

1.2.1 OBOGATITEV

Obogatitev uporabimo takrat, ko predvidevamo zelo nizko kontaminacijo, ali kadar preiskujemovečjo maso (na primer preiskava 25 g ali 50 g živila na salmonele) ali kadar predvidevamo, da somikrobne celice poškodovane. Za obogatitev uporabimo neselektivna ali selektivna tekoča gojišča.Namen obogatitve je namnožitev preiskovanih mikroorganizmov do koncentracije, ki je višja odobčutljivosti uporabljene metode za izolacijo. Za obogatitev se uporablja tako ne-selektivna kot tudiselektivna gojišča. Homogeniziran vzorec živila v obogatitvenem gojišču inkubiramo določen čas pridoločeni temperaturi.

1.2.2 IZOLACIJA

Obogatitveno suspenzijo po inkubaciji prenesemo s cepilno zanko na ustrezna selektivna gojišča, kijih izberemo glede na vrsto mikrobiološke preiskave. Gojišča inkubiramo določen čas pri določenitemperaturi. Po inkubaciji opazujemo rast značilnih kolonij.

1.2.3 POTRDITEV / IDENTIFIKACIJA

Značilne kolonije preiskujemo z biokemijskimi in serološkimi testi in tako potrdimo rezultate izolacijeoziroma identificiramo mikroorganizme.

1.3 SPLOŠEN POTEK KVANTITATIVNE MIKROBIOLOŠKEPREISKAVE

S kvantitativno mikrobiološko preiskavo določamo število določenih mikroorganizmov v določenimasi (volumnu) vzorca.

1.3.1 PRIPRAVA RAZREDČITEV VZORCA

Razredčitve vzorca pripravljamo iz matične raztopine (glej 1.2.).

1.3.2 IZOLACIJARazredčitve vzorca cepimo na/v ustrezno trdno ali tekoče gojišče. Po inkubaciji izolacijskega gojiščapri določeni temperaturi po določenem času rezultate kvantificiramo. Primeri:

Če za izolacijo uporabimo trdno vnaprej v petrijevko (2r = 90 mm) razlito gojišče, potem nanjcepimo 0,1 ml razredčitve vzorca in ga s sterilno stekleno palčko enakomerno nanesemo povsej površini.

Če za izolacijo nimamo vnaprej razlitega trdnega gojišča, cepimo 1 ml razredčitve vzorca vsterilno prazno petrijevko. Trdno gojišče raztopimo, ohladimo na 45 oC v vodni kopeli in vpetrijevko z vzorcem dodamo 15 ml gojišča. Vzorec z gojiščem takoj premešamo »3x gor-dol,3xlevo-desno«.


4

Če za izolacijo uporabimo tekoče gojišče v epruvetah (metoda najbolj verjetnega števila, MPN),cepimo razredčitve vzorca v tekoče gojišče. Število razredčitev in število uporabljenih epruvet zgojiščem je odvisno od metode MPN.

1.3.3 KVANTIFIKACIJA

Po inkubaciji trdnega izolacijskega gojišča, preštejemo značilne kolonije v tistih petrijevkah, kjer jezrastlo števno število kolonij (splošno velja, da je števna plošča za bakterije 15 – 300 kolonij, števnaplošča za plesni 15 – 150 kolonij). Pri izračunu števila mikroorganizmov v 1 g ali 1 ml vzorca (cfu/g,cfu/ml) upoštevamo povprečno število kolonij in razredčitev.

Primeri:

Če imamo števne plošče-gojišča pri več razredčitvah vzorca, izračunamo številomikroorganizmov po naslednji formuli:

Če imamo števne plošče-gojišča le pri eni razredčitvi vzorca, izračunamo številomikroorganizmov po naslednji formuli:

Če so plošče-gojišča pri vseh razredčitvah neštevne, podamo rezultat kot oceno številamikroorganizmov, ki jo izračunamo po naslednji formuli:

V primeru tekočih gojišč uporabimo ustrezne tabele MPN in določimo najbolj verjetno številomikroorganizmov.

N število mikroorganizmov v vzorcu (cfu/ml, cfu/g)C vsota vseh kolonij na števnih ploščahn1 število petrijevk-gojišč pri prvi razredčitvi vzorcan2 število petrijevk-gojišč pri drugi razredčitvi vzorcaR prva razredčitev vzorca, pri kateri smo prešteli kolonije

N število mikroorganizmov v vzorcu (cfu/ml, cfu/g)np povprečno število kolonijR razredčitev vzorca, pri kateri smo prešteli kolonije

N* < 1/RN* ocena števila mikroorganizmov v vzorcu (cfu/ml, cfu/g)

R najmanjša razredčitev vzorca z naštevnimi ploščami


5

1.3.4 POTRDITEV / IDENTIFIKACIJA

Značilne kolonije preiskujemo z biokemijskimi (in serološkimi testi) in tako potrdimo rezultateizolacije oziroma identificiramo mikroorganizme.


6

2 INDIKATORSKE SKUPINE MIKROORGANIZMOV

2.1 SKUPNO ŠTEVILO MIKROORGANIZMOV

Skupno število živih oziroma za reprodukcijo sposobnih mikroorganizmov določimo z metodo štetjakolonij na trdih gojiščih (angl. plate count) ali v primerih, ko pričakujemo nizko številomikroorganizmov, z metodo najverjetnejšega števila mikroorganizmov (angl. MPN, most probablenumber). V različnih vzorcih so lahko zelo različni mikroorganizmi, ki se razlikujejo glede na njihovodnos do kisika, temperaturo rasti, čas, ki je potreben za rast, zahteve po hranilih, ipd. Zato je zelopomembno kako in kakšne okoljske parametre izberemo za tako preiskavo, saj v nobenem primerune moremo določiti vseh mikroorganizmov. Štetje kolonij na trdih gojiščih in MPN sta metodi skaterima ocenimo število mikroorganizmov kot delež mikrobne populacije, ki se lahko razmnožuje pridanih razmerah inkubacije. Rast kolonij ali motnost tekočega gojišča pomeni razmnoževanjemikroorganizmov v izbranih razmerah inkubacije in ne nujno v razmerah, ki so značilne za vzorec.To je posebej pomembno pri vzorcih kot so procesirana živila, ki vsebujejo poškodovane aliinhibirane mikroorganizme.

Na splošno velja, da čim bolj je sestava gojišča zapletena, več različnih mikroorganizmov bo rastlona/v gojišču. Tako na primer na ploščah s gojiščem PC (angl. plate count agar), ki vsebuje glukozo,zraste več kolonij, kot na ploščah s gojiščem NA (angl. nutrient agar, hraniljivi agar). Določitev številaživih mikroorganizmov pri temperaturah inkubacije 25 - 30o C je lahko indikator higiene živilskegaobrata ali pri temperaturah inkubacije 30 - 37o C indikator potencialnega zdravstvenega tveganja.Zato da so rezultati preiskav dobljeni v različnih laboratorijih primerljivi, moramo uporabljati določenemetode, za katere so vnaprej določeni postopki dela.

2.1.1 AEROBNI MEZOFILNI MIKROORGANIZMIŠtevilo aerobnih mezofilnih mikroorganizmov pomeni število bakterij, kvasovk in plesni v vzorcu, kijih določimo po predpisanem postopku. Po ISO 4833 (1991) določimo mikroorganizme v živilu tako,da v dve sterilni petrijevki odpipetiramo po 1 ml tekočega živila ali po 1 ml matične raztopine živila aliustrezne razredčitve živila. V petrijevke nato dodamo po 15 ml gojišča PC (angl. plate count agar), kismo ga predhodno stopili in ohladili na 45 oC, ter inokulum previdno umešamo. Ko se gojišče strdi,petrijevke obrnemo in jih 72 ur inkubiramo pri 30 oC. Rezultate kvantificiramo po postopku opisanemv 1.3.3.

2.1.2 KVASOVKE IN PLESNIŠtevilo kvasovk in plesni v vzorcu določimo po standardu ISO 7954 (1987) tako, da v dve sterilnipetrijevki odpipetiramo po 1 ml tekočega živila ali po 1 ml matične raztopine živila ali ustreznerazredčitve živila. V petrijevke dodamo po 15 ml gojišča YEDC (angl. yeast extract-dextrose-cloramphenicol-agar), ki smo ga predhodno stopili in ohladili na 45 oC, ter inokulum previdnoumešamo. Ko se gojišče strdi, petrijevke obrnemo in jih 5 dni inkubiramo pri 25 oC. Kolonije štejemopo treh, štirih in petih dneh inkubacije. Upoštevamo plošče, na katerih je zraslo manj kot 150 kolonijin izračunamo število kvasovk in plesni kvantificiramo po postopku opisanem v 1.3.3.. Namestogojišča YECD se uporablja tudi druga gojišča, kot so OGY (angl. oxytetracycline glucose yeastextract agar), DRBC (dichloran rose bengal chloramphenicol agar) (Downes in Ito, 2001). Če gledena morfološke lastnosti kolonije ne moremo določiti ali so kolonije gliv ali kolonije bakterij, naredimo


7

iz preiskovane kolonije mikroskopski preparat in glede na mikromorfološke lastnosti določimo vrstomikroorganizma (Vaje pri predmetu Živilska mikrobiologija).

2.1.3 ŠTEVILO ENTEROBAKTERIJ

Enterobacteriaceae so družina bakterij (Citrobacter, Enterobacter, Erwinia, Escherichia, Hafnia,Klebsiella, Kluyvera, Proteus, Salmonella, Serratia, Shigella, Yersinia), ki rastejo v prisotnosti žolčnihsoli in tvorijo kislino iz glukoze (gojišče VRBG z 1 % dodatkom glukoze) (Harrigan, 1988).

Število bakterij družine Enterobacteriaceae se določi pri vzorcih, pri katerih pričakujemo 10 – 100cfu/g (ml) ali več z metodo štetja kolonij na trdem gojišču. Pripravi se decimalne razredčitve vzorcain se jih cepi (po 1 ml) v prazno petrijevko in vmeša s (15 ml) stopljenim, na 45 oC ohlajenimgojiščem VRBG (vijolično redeči žolčni agar z glukozo). Ko se gojišče strdi, ga prelijemo s (5 ml)stopljenim, na 45 oC ohlajenim gojiščem VRBG, da preprečimo rast kolonij na površini. Gojiščainkubiramo na 35 oC oz. 37 oC. V nekaterih primerih se inkubira tudi pri 30 oC. Za določitev številaenterobakterij se upošteva tista gojišča VRBG kjer zraste do 150 kolonij po postopku opisanem v1.3.3. Značilne kolonije so temno rdeče barve z temno rdečim sijem. Za potrditev pet naključnoizbranih kolonij precepimo na NA (hranljivi agar) in inkubiramo 24 ur pri 35 oC ali 37 oC. Natoizvedemo oksidazni test (enterobakterije so oksidaza-negativne) in test fermentacija glukoze(enterobakterije izkoriščajo glukozo).

Po standardu ISO 21528-1 (2004) za določitev števila bakterij družine Enterobacteriaceae v vzorcihkjer pričakujemo nizko število uporabimo metodo MPN. Pripravimo decimalne razredčitve vzorca inaseptično cepimo:

3x po 10 ml nerazredčenega vzorca, če je tekočina ali 3x 10ml MR, če je vzorec trden v 10 mlgojišča BBGBG dvojne koncentracije (puferiran briljantno zeleni glukozni bujon z žolčem),

3x 1ml nerazredčenega vzorca, če je tekočina ali 3x 1ml MR, če je vzorec trden v 10 ml gojiščaBBGBG enojne koncentracije,

3x 1ml razredčenega vzorca 10-1, če je tekočina ali 3x 1ml 10-2, če je vzorec trden v 10 mlgojišča BBGBG enojne koncentracije.

Epruvete inkubiramo 24 ur pri 35 oC ali 37 oC. Če so v gojiščih dodane Durhamove cevke in če poinkubaciji dodamo indikator, lahko določimo glede na tvorbo plina in kisline domnevno pozitivnerezultate. Iz vsake pozitivne epruvete naredimo potrditev tako, da precepimo 3 cepilne zankesuspenzije na trdno gojišče VRBGA. Gojišča inkubiramo 24 ur pri 35 oC ali 37 oC. Značilne kolonijeso temno rdeče barve z temno rdečim sijem.

Izračun MPN Enterobacteriaceae:

Preštejemo pozitivne reakcije pri vsaki razredčitvi Iz tabele MPN določimo indeks MPN, glede na število pozitivnih rezultatov v vsakem gojišču V primeru, da je bil vzorec tekoče živilo, dobimo število bakterij tako, da indeks MPN delimo z

10, v primeru, da je bil vzorec trden, pa je indeks MPN enak številu bakterij v 1 g živila

Pet naključno izbranih kolonij precepimo na NA (hranljivi agar), inkubiramo 24 ur pri 35 oC ali 37 oCin izvedemo potrditev kot je opisano pri metodi štetja kolonij na trdem gojišču.

.


8

2.1.4 KOLIFORMNE BAKTERIJE

Koliformne bakterije so gramnegativne bakterije, ki rastejo v prisotnosti žolčnih soli ali drugihekvivalentnih selektivnih dodatkov, in tvorijo kislino in plin iz laktoze pri 35 oC ali 37 oC (Harrigan,1998). Fekalne koliformne bakterije so gramnegativne bakterije, ki rastejo v prisotnosti žolčnih soli alidrugih ekvivalentnih selektivnih dodatkov, in tvorijo kislino in plin iz laktoze pri 44 - 45,5 oC.

Število koliformnih bakterij se določi z metodo štetja kolonij na trdih gojiščih pri vzorcih pri katerihpričakujemo 10 – 100 cfu/g (ml) ali več koliformnih bakterij v g (ml) živila tako, da se pripravidecimalne razredčitve vzorca in se jih cepi (po 1 ml) v prazno petrijevko in vmeša s (15 ml)stopljenim, na 45 oC ohlajenim gojiščem VRBL (vijolično rdeči žolčni agar z laktozo) (ISO 21528-2,2004). Ko se gojišče strdi, ga prelijemo s (5 ml) stopljenim, na 45 oC ohlajenim gojiščem VRBL, dapreprečimo rast kolonij na površini. Gojišča se inkubira pri 35 oC oz. 37 oC. V nekaterih primerih seinkubira tudi pri 30 oC. Značilne kolonije za koliformne bakterije so velike 0,5 mm ali več, so temnordeče barve in imajo cono precipitiranih žolčnih soli. Za določitev števila koliformnih bakterij seupošteva tista gojišča VRBL kjer zraste do 150 kolonij po postopku opisanem v 1.3.3.

Pri vzorcih pri katerih pričakujemo nizko število koliformnih bakterij le-to določimo z metodo MPN.Po standardu ISO 4831 (1991) za določitev števila koliformnih bakterij pripravimo decimalnerazredčitve vzorca živila in aseptično cepimo:

3x po 10 ml nerazredčenega vzorca, če je tekočina ali 3x 10 ml MR, če je vzorec trden v 10 mlgojišča LSTB dvojne koncentracije (lauril sufat triptozni bujon),

3x 1 ml nerazredčenega vzorca, če je tekočina ali 3x 1 ml MR, če je vzorec trden v 10 ml gojiščaLSTB enojne koncentracije,

3x 1 ml razredčenega vzorca 10-1, če je tekočina ali 3x 1ml 10-2, če je vzorec trden v 10 mlgojišča LSTB enojne koncentracije.

Epruvete inkubiramo 24 ur pri 35 oC ali 37 oC. Pozitivna reakcija je plin v Durhamovi cevki. Če plinapo 24 urah ni, podaljšamo inkubacijo še za 24 ur. Iz epruvet s pozitivnim rezultatom nato naredimopotrditev tako, da precepimo eno cepilno zanko v BZLŽB (briljantno zeleni laktozni bujon z žolčem),ki ga inkubiramo 24 do 48 ur pri 30 oC ali 35 oC. Pozitivna reakcija je plin v Durhamovi cevki in tvorbakisline (rumena barva gojišča). Izračun MPN koliformnih bakterij:

Preštejemo pozitivne reakcije v gojiščih LSTB pri vsaki razredčitvi Iz tabele MPN določimo indeks MPN, glede na število pozitivnih rezultatov v vsakem gojišču V primeru, da je bil vzorec tekoče živilo dobimo število bakterij tako, da indeks MPN delimo z 10,

v primeru, da je bil vzorec trden, pa je indeks MPN enak številu bakterij v 1 g živila.

2.1.5 BAKTERIJE VRSTE Escherichia coli

Bakterije vrste Escherichia coli so tiste bakterije, ki poleg lastnosti koliformnih bakterij, dajonaslednje rezultate testa IMViC + + - - (indol, metil rdeče, Voges-Proskauer, citrat). Prisotnostenterobakterij, koliformnih bakterij ali bakterij vrste E. coli v živilu je indikator ene ali več spodnjihtrditev:

Začetna koncentracija bakterij je bila tako visoka, da jih toplotna obdelava ni uničila oz. da senjihovo število ni zmanjšalo pod mejo občutljivosti metode

Razmere po toplotni obdelavi živila so bile ugodne za razvoj preživelih bakterij Naknadna kontaminacija toplotno obdelanega živila


9

Število bakterij vrste E. coli se določi z metodo štetja kolonij na trdih gojiščih pri vzorcih pri katerihpričakujemo 10 – 100 cfu/g (ml) ali več koliformnih bakterij v g (ml) živila tako, da se pripravidecimalne razredčitve vzorca in se jih cepi (po 1 ml) v prazno petrijevko in vmeša s (15 ml)stopljenim, na 45 oC ohlajenim gojiščem VRBL (vijolično redeči žolčni agar z laktozo) in gojiščainkubira 24 - 48 ur pri 44 oC. Bakterije vrste E. coli tvorijo temno rdeče kolonije s škrlatno rdečimcentrom - zaradi obarjanja žolčnih soli pri nizki pH vrednosti, 2 - 3 mm v premeru. Rastejo tudi drugekoliformne bakterije (na primer Enterobacter aerogenes tvorijo temno rdeče kolonije). Vzorec oz.decimalne razredčitve lahko cepimo tudi na selektivno gojišče EMB (Eosin methylene blue lactoseagar). Sestavine medija omogočajo ločevanje rodov Escherichia in Enterobacter (fermentiratalaktozo in saharozo) od drugih enterobakterij. Inkubacija 24 – 48 ur pri 44 oC. Bakterije vrste E. colitvorijo vijoličaste kolonije s temnejšim centrom in zelenkastim kovinskim sijajem. Pri fermentacijivrednost pH zaradi nastalih kislin zelo pade, pri nizki pH vrednosti pride do nastanka amidne vezimed eozinom in metilenskim modrilom, kar se odraža v kovinskem sijaju kolonij. Enterobacteraerogenes: rdeče kolonije s temnim centrom, okoli prozorna cona. Pri razgradnji sladkorjev se tvorimalo kislin, razgradnja teče do acetoina, ni tako velikega padca vrednosti pH. Salmonella in Shigellatvorijo brezbarvne ali roza kolonije (ne fermentirajo laktoze in saharoze).

Bakterije vrste E. coli potrdimo oziroma identificiramo s testom IMViC in mikroskopskim preparatompo Gramu. Značilne kolonije iz selektivnega gojišča precepimo najprej na neselektivno gojišče NA inpo 24 urni inkubaciji na 37 oC v ustrezna gojišča za test IMViC.

Pri vzorcih pri katerih pričakujemo nizko število bakterij vrste E. coli le-to določimo z metodo MPN.Po standardu ISO 7251 (1993) za določitev števila bakterij E. coli pripravimo decimalne razredčitvevzorca živila in aseptično cepimo:

3x po 10 ml nerazredčenega vzorca, če je tekočina ali 3x 10 ml MR, če je vzorec trden v 10 mlgojišča LSB dvojne koncentracije (lauril sufatni bujon),

3x 1ml nerazredčenega vzorca, če je tekočina ali 3x 1ml MR, če je vzorec trden v 10 ml gojiščaLSB enojne koncentracije,

3x 1ml razredčenega vzorca 10-1, če je tekočina ali 3x 1ml 10-2, če je vzorec trden v 10 mlgojišča LSB enojne koncentracije.

Epruvete inkubiramo 24 ur pri 37 oC. Pozitivna reakcija je plin v Durhamovi cevki. Če plina po 24urah ni, podaljšamo inkubacijo še za 24 ur. Iz epruvet s pozitivnim rezultatom in iz tistih gojišč vkaterih opazimo motnost nato naredimo potrditev tako, da precepimo eno cepilno zanko v bujon EC,ki ga inkubiramo 24 do 48 ur pri 44 oC. Pozitivna reakcija je plin v Durhamovi cevki. Iz vsakeepruvete s pozitivnim rezultatom precepimo eno cepilno zanko v peptonsko vodo, ki vsebujetriptofan. Inkubacija 48 ur pri 44 oC. Po inkubaciji dodamo Kovacsev reagent in rdeča barva pomenitvorbo indola, ki je značilna za bakterije vrste E. coli .

Izračun MPN Escherichia coli:

Preštejemo pozitivne reakcije v gojiščih LSB pri vsaki razredčitvi Iz tabele MPN določimo indeks MPN, glede na število pozitivnih rezultatov v vsakem gojišču V primeru, da je bil vzorec tekoče živilo, dobimo število bakterij tako, da indeks MPN delimo z

10, v primeru, da je bil vzorec trden, pa je indeks MPN enak številu bakterij v 1 g živila.


10

3 PATOGENE BAKTERIJE

Patogenih bakterij v živilih ne sme biti - varna oziroma zdravstveno ustrezna živila ne smejovsebovati mikroorganizmov ali parazitov oziroma njihovih razvojnih oblik ali izločkov, ki lahkoškodljivo vplivajo na zdravje ljudi (ZZUZIS, 2000, 2002; ZdZPZ, 2004).

3.1 BAKTERIJE RODU Salmonella

Salmonele spadajo v družino Enterobacteriaceae, so gramnegativne, fakultativno anaerobne,nesporogene palčke z respiratornim in fermentativnim tipom metabolizma. Glukozo razgrajujejo dokisline in plina, ne fermentirajo laktoze, fermentirajo jo le nekateri serovari. Vsi serovari salmonelspadajo v dve vrsti: Salmonella bongori (manj kot 10 serovarov in so zelo redki) in Salmonellaenterica (nad 2500 serovarov). Razdelitev v serovare temelji na Kauffmann - White-jevi shemi: Oantigeni (somatski), H antigeni (flagelarni) in K antigeni (kapsularni).

Epidemiološko jih delimo v tri skupine:

• inficirajo le človeka: S. Typhi, S. Paratyphi A in S. Paratyphi C; tifus in paratifus sta najresnejšiobolenji, ki ju povzročajo salmonele z najvišjo stopnjo umrljivosti,

• serovari prilagojeni gostitelju: S. Gallinarum - perutnina, S. Dublin - govedo, S. Abortus-equi -konji, S. Abortus-ovis - ovce, S. Coleraesuis - prašiči; človek se lahko okuži s hrano, nekateriserovari so patogeni za ljudi in žival,

• neprilagojeni serovari: V to skupino spada večina serovarov prisotnih v živilih in so patogeni zaljudi in živali.

Primarni izvor salmonel je prebavni trakt ljudi in mnogih živali (domače živali, plazilci, ptice, občasnoinsekti). Včasih so prisotne tudi v drugih delih telesa. Organizem jih izloča preko blata, od tu palahko preko različnih prenašalcev pridejo v vodo in živila. Pogost vir salmonel je živalska krma(kostna in ribja moka). Prisotnost v živilih: kakav, kokosova moka (dehidrirana živila), solatni prelivi,jajca, majoneza, meso (zlasti perutnina) in izdelki, mleko (neprekuhano - S. Dublin; kaže na slabohigieno molže),... Najpogosteje prisotna serovara v živilih sta S. Enteritidis in S. Typhimurium..

Razmere za rast: Optimalna vrednost pH za rast je med 6,6 in 8,2, pod vrednostjo pH 4,0 in nad 9,0ne rastejo. Minimalna vrednost pH za rast je odvisna od vrste kisline, ki jo uporabimo za zniževanjepH. Aeracija pozitivno vpliva na rast pri nizki vrednosti pH. Optimalna temperatura za rast je 37 oC,pod približno 7 oC in nad 45 oC se ne razmnožujejo. NaCl in nitrat zavirata rast, tako deluje razsolicaz 9 % NaCl baktericidno, nitrat ima največji inhibitorni učinek ob nizki vrednosti pH.

3.1.1 DOLOČANJA BAKTERIJ RODU SalmonellaOBOGATITEV

Za določanje bakterij rodu Salmonella po standardu ISO 6579 (2002) se uporablja dve obogatitvi,najprej neselektivno v gojišču BPW (puferirana peptonska voda), nato pa selektivno v dvehobogatitvenih gojiščih: bujon RVS (bujon Rappaport-Vassiliadis s sojo) in bujon MKTTn (Muller


11

Kaufmann tetrationatni bujon z novobiocinom). Določeno maso živila v kateri iščemo salmonele (25g oziroma 50 g ali ml) zatehtamo v sterilno posodo ali vrečko in dodamo 9x-no količino ne-selektivnega obogatitvenega gojišča BPW (225 ml oziroma 450 ml), homogeniziramo in inkubiramo18 ur pri 37 oC. Po inkubaciji suspenzijo homogeniziramo in:

• 0,1 ml suspenzije prenesemo v selektivno gojišče RVS (10 ml) ter inkubiramo 24 ur pri 41,5 oC

• 1 ml prenesemo v drugo selektivno gojišče MKTTn (10 ml) ter inkubiramo 24 ur pri 37 oC.

IZOLACIJA

Po inkubaciji obogatitveno gojišče dobro premešamo in suspenzijo s cepilno zanko precepimo(izolacija) na selektivna gojišča:

• po standardu ISO 6579 (1993) so to BZA (briliantno zeleni agar), SS (Salmonella-Shigella agar)in BS (bizmut sulfitni agar)

• po standardu ISO 6579 (2002) sta to XLD (ksiloza lizin deoksiholatni agar) in drugo gojišče poizbiri.

Plošče s cepljenimi gojišči inkubiramo 24 ur pri 37 oC.

Gojišče SS: V gojišču SS imajo inhibitorni učinek na grampozitivne bakterije in nekatere nepatogeneenterobakterije natrijev citrat, žolčne kisline in briljantno zeleno. Gojišče vsebuje laktozo, indikatorspremembe pH vrednosti je nevtralno rdeče. Salmonele in druge bakterije, ki ne izkoriščajo laktoze,tvorijo motne, prozorne, brezbarvne kolonije. Izolacija salmonel temelji tudi na njihovi sposobnostitvorbe H2S. Izvor žvepla v gojišču je Na-tiosulfat. Indikator tvorbe H2S je železov citrat.

Značilna rast kolonij na SS: Salmonella: prozorne, sluzaste z temnim črnim centrom ali brez njega,podobne kolonije tvorijo tudi nekatere vrste rodu Proteus; črn center kolonij nastane zaradi nastankaželezovega sulfida; Shigella: prozorne ali rahlo rožnate, lahko nepravilnih oblik; Enterobakterije, kifermentirajo laktozo: rožnate.

Gojišče BS: Izolacija salmonel temelji na njihovi sposobnosti tvorbe H2S. Izvor žvepla sobeljakovinske komponente, indikator tvorbe H2S pa je železov sulfat. Rast bakterij vrste E. coli innekaterih drugih koliformnih bakterij je inhibirana zaradi dodanega bizmutovega sulfita, amonijevegacitrata in briljantno zelenega.

Značilna rast kolonij na BS: Salmonella: črne, s kovinskim sijajem, pojavlja se cona črno obarvanegaagarja; Proteus: rjave do rjavočrne; E. coli: inhibirana.

Gojišče BZA: Izolacija bakterij temelji na sposobnosti fermentacije laktoze, saharoze, razgradnjibeljakovin. Indikatorja spremembe pH sta briljantno zeleno in fenol rdeče. Briljantno zeleno inhibirarast nepatogenih enterobakterij in vrst rodu Shigella.

Značilna rast kolonij na BZA: Salmonella in nekatere druge vrste, ki ne fermentirajo laktoze: rdečevijolične, podobno se obarva tudi gojišče okoli kolonij (S. Typhi in S. Paratyphi ne rasteta); Proteus:rožnate, sluzaste, 2 - 3 mm v premeru, gojišče okoli kolonij se obarva rdeče zaradi bazične reakcije;sproščanja amonijevih spojin, ki nastanejo pri razgradnji beljakovin; E. coli: rumene do rumenozelene, podobno se obarva tudi gojišče okoli kolonij zaradi fermentacije laktoze pade pH; briljantnozeleno prehaja v rumeno barvo.


12

Gojišče XLD: Izolacija bakterij temelji na sposobnosti fermentacije laktoze, saharoze in ksiloze, narazgradnji beljakovin oz. amino kisline lizin. Indikator spremembe pH je fenol rdeče, izvor žvepla vgojišču je Na-tiosulfat, indikator tvorbe H2S je železov citrat.

Značilna rast kolonij na XLD: Salmonella: ker ne izkoriščajo laktoze in saharoze ne tvorijo kislin,dekarboksilirajo pa lizin, kar povzroči alkalno reakcijo in indikator fenol rdeče se obarva rdeče:kolonije so zato temno rdeče in v primeru, da tvorijo H2S, imajo črn center. Shigella: temno rdečekolonije, Proteus: nekateri sevi tvorijo tudi rdeče kolonije ali rdeče kolonije s črnim centrom.

IDENTIFIKACIJA / POTRDITEV

Kolonije, značilne za salmonele (do 5 značilnih kolonij), precepimo iz selektivnih gojišč naneselektivno gojišče NA in plošče inkubiramo 24 ur pri 37 oC. Nato naredimo biokemijsko (trojnisladkor, hidroliza uree, dekarboksilacija lizina, β-galaktozidazna reakcija, reakcija VP, tvorba indola)in serološko potrditev (Aglutinacijskemu serumu za salmonele primešamo kulturo s cepilno zanko,opazimo pozitivno reakcijo - kosmičenje v predhodno bistri tekočini zaradi vezave specifičnihprotiteles z antigeni salmonel) (ISO 6579, 2002). Za skrajšano biokemijsko identifikacijo naredimonaslednje teste:

• Kliglerjev dvojni sladkor: cepimo vbod in po površini trdnega poševnega gojišča• Tekoče gojišče z glukozo: cepimo 1 cepilno zanko• Tekoče gojišče z laktozo: cepimo eno cepilno zanko• Urea: cepimo po površini poševnega gojišča• KCN: cepimo eno cepilno zanko v tekoče gojišče in dobro premešamo• Fenilalanin: cepimo eno cepilno zanko po površini trdnega poševnega gojišča• IMViCTeste inkubiramo 24 ur pri 37oC in nato odčitamo rezultate.

Kliglerjev dvojni sladkor: To je diferencialno gojišče, ki omogoča identifikacijo vrst družineEnterobacteriaceae na osnovi izkoriščanja glukoze (v gojišču je 0,1%) in laktoze (v gojišču je 1%),tvorbe plina in tvorbe vodikovega sulfida. Na-tiosulfat je izvor žvepla, Fe-sulfat pa indikator tvorbeH2S.

Značilna rast in reakcije po 24 do 48 urah pri 37 oC: S. Typhi: rumeno dno, rdeča poševna ploskev,ni tvorbe plina; Salmonella: rumeno dno, rdeča poševna ploskev, zaradi tvorbe H2S gojišče počrni,tvorba plina; Shigela spp.: rumeno dno, redča poševna ploskev, ni plina oz. H2S; Proteus: rumenodno, rdeča poševna ploskev, tvorba plina (gojišče razpoka), nekatere vrste tvorijo H2S.

Tabela 1: Rezultati biokemijskih testov za identifikacijo bakterij rodu Salmonella

Rod/ Test Glu Lakt Urea KCN Fenilalanin Indol MR VP CitratSalmonella + - - -(+) - - + - +Proteus + - + + + +/- + +/- +/-

Legenda: +: večina sevov pozitivnih, -: večina sevov; +/- reakcija odvisna od vrste

Mikroskopiranje: Iz neselektivnega gojišča NA vzporedno z izvedbo biokemijskih testov naredimomikroskopski preparat po Gramu (Vaje pri predmetu Živilska mikrobiologija).


13

3.2 BAKTERIJE RODU Campylobacter

Bakterije rodu Campylobacter so gramnegativne spiralno zavite palčke, ki se normalno nahajajo vprebavnem traktu domačih in divjih živali. Prenos kampilobaktrov na človeka je lahko po fekalno-oralni poti, z direktnim stikom z izločki obolelih živali, z uživanjem kontaminiranih živil (pogosto v/napiščančjem mesu, surovem mleku, vodi). Povzročajo lahko različna obolenja pri ljudeh in živalih,najpogosteje gastrenteritidis. Predvsem bakterije vrste Camp. jejuni in v manjši meri Camp. coli so vzadnjih 10-ih letih najpogostejši povzročitelji črevesnih okužb pri ljudeh. Večinoma ljudje okrevajo v5-7 dneh brez zdravljenja.

Rod Campylobacter obsega 16 vrst in med njimi so termofilne vrste Camp. jejuni, Camp. coli, Camp.lari in Camp. upsaliensis najpogosteje povezane z obolenji pri ljudeh. Bakterije rodu Campylobacterso mikroaerofilne (3-5 % O2), najbolje rastejo pri 37 oC do 42 oC, so oksidaza- in katalaza-pozitivne,ne izkoriščajo pa sladkorjev (On, 2005).

3.2.1 DOLOČANJE BAKTERIJ RODU CampylobacterOBOGATITEV

Za določitev bakterij rodu Campylobacter po standardu SIST EN ISO 10272-1: 2006 (2006) se kotobogatitveno gojišče uporablja gojišče Bolton. Določeni masi homogeniziranega živila dodamo 9x-nokoličino gojišča Bolton, vsebino homogeniziramo in 4-6 ur inkubiramo mikroaerofilno pri 37 oC, natopa 44±4 ur pri 41,5 oC.

IZOLACIJA

Po inkubaciji obogatitveno suspenzijo cepimo na dve selektivni gojišči: mCCD (modificiranodeoksiholatno gojišče) in drugo gojišče po izbiri (selektivna gojišča Skirrow, Karmali ali Preston).Gojišča 44±4 ur inkubiramo v mikroaerofilni atmosferi pri 41,5 oC.

Značilna rast bakterij rodu Campylobacter na gojišču mCCD: sive, nizke, vodene kolonije pogosto skovinskim sijajem, ki se pogosto razširjajo po površini gojišča. Na gojišču Preston: nizke sive kolonijez ne-izrazitim robom.


Značilne kolonije za bakterije rodu Campylobacter (vsaj 1 oziroma do 5) precepimo na ne-selektivno gojišče Kolumbija z dodatkom krvi in gojišče 24 - 48 ur inkubiramo v mikroaerofilniatmosferi pri 41,5 oC.

Potrditev bakterij rodu Campylobacter:

• 1 kolonijo z gojišča Kolumbija precepimo v tekoče gojišče Brucella za opazovanje morfološkihlastnosti in določanje gibljivosti

• Rast pri 25 oC v mikroaerofilnih razmerah: kolonijo z gojišča Kolumbija precepimo na svežegojišče Kolumbija in 44±4 ur mikroaerofilno inkubiramo pri 25 oC.

• Rast pri 41,5 oC v aerobnih razmerah: kolonijo z gojišča Kolumbija precepimo na sveže gojiščeKolumbija in 44±4 ur aerobno inkubiramo pri 41,5 oC.


14

• Določanje oksidaze: s plastično cepilno zanko naredimo oksidazni test

Značilni rezultati za bakterije rodu Campylobacter so: majhne zavite palčke, gibljive, ne rastejomikroaerofilno pri 25 oC in aerobno pri 41,5 oC in so oksidaza-pozitivne.

Identifikacija termofilnih vrst rodu Campylobacter:

• Katalazni test izvedemo s kolonijo z gojišča Kolumbija

• Določitev občutljivosti na nalidiksično kislino in cefalotin: pripravimo suspenzijo celic v bujonuBrucell (McFarland 0,5), jo 1/10 razredčimo z enakim gojiščem in nato prelijemo 2 ml na gojiščeMueller Hinton s 5 % dodatkom krvi. Po 5 min tekočino odlijemo in gojišče sušimo 10 min pri 37oC. Nato na gojišče dodamo diske z nalidiksično kislino in cefalotinom ter 22-24 ur inkubiramomikroaerofilno pri 37 oC. Če po inkubaciji rastejo kolonije tako, da so v kontaktu z diskom pomenida je izolat odporen na določen antibiotik; če pa okoli diskov opazimo kakršno koli cono lahkorezultat interpretiramo kot izolat občutljiv na določen antibiotik.

• Hidroliza hipurata: s cepilno zanko prenesemo kolonijo z gojišča Kolumbija v 0,4 ml raztopinenatrijevega hipurata, dobro premešamo in 2 uri inkubiramo pri 37 oC v vodni kopeli (ali 4 ure pri37 oC v inkubatorju). Nato dodamo 0,2 ml ninhidrin-reagenta in inkubiramo 10 min pri 37 oC.Pozitivna reakcija je temno vijolično obarvanje vsebine.

• Hidroliza indoksil acetata: kolonijo z gojišča Kolumbija prenesemo na disk, ki vsebuje indoksilacetat in dodamo kapljico vode. Če je reakcija pozitivna, se vsebina v 5 – 10 min obarvatemnomodro.

Tabela 2: Rezultati testov za identifikacijo termofilnih vrst rodu Campylobacter

Test / Vrsta Camp. jejuni Camp. coli Camp. lari Camp. upsaliensisKatalaza + + + - ali rahlo +Nalidiksičnakislina

Sa Sa R/Sb S

Cefalotin R R R SHidrolizahipurata

+ - - -

Hidrolizaindoksil acetata

+ + - +

Legenda: a: poznana je povečana odpornost; b: sevi so lahko občutljivi ali odporni


15

3.3 BAKTERIJE VRSTE Staphylococcus aureus

Stafilokoki so grampozitivni, nesporogeni koki, pojavljajo se posamezno, v parih, v obliki grozdov.So fakultativno anaerobni, običajno katalaza pozitivni mikroorganizmi. Predstavniki tega rodusintetizirajo številne enterotoksine, ki povzročajo gastroenteritis. Poleg enterotoksinov lahkosintetizirajo še koagulazo, DNazo (termostabilno, termolabilno), katalazo, lecitinazo, hemolizine. Pričloveku so primarni izvor stafilokokov nosna votlina, gnojne rane, vneto grlo, lahko so na koži, vočeh, prebavnem traktu. Od tod prehajajo v zrak, prah, na obleko in druga mesta, od koder lahkopreidejo v živila. Stafilokoki so možni povzročitelji mastitisa, zato je takšno mleko vir okužbe. V živilihživalskega izvora in tudi v drugih toplotno neobdelanih živilih so pogosto prisotni vsaj v nizkemštevilu. Najpogosteje prisotna vrsta v živilih je vrsta S. aureus. Optimalna temperatura za rastbakterij vrste S. aureus je med 30 in 37 oC (35 in 40 oC), vendar se lahko razmnožujejo vtemperaturnem območju med 7 oC in 48 oC, enterotoksine pa sintetizirajo med 10 oC in 46 oC(optimalna temperatura za sintezo je med 40 oC in 45 oC). Bakterije vrste S. aureus dobro rastejotudi ob prisotnosti NaCl (med 7 in 10 %, nekateri sevi tudi pri 20 %). Maksimalna koncentracija soli,pri kateri bakterije vrste S. aureus še rastejo, je odvisna od pH, aw, temperature in Eh. Optimalnavrednost pH za rast je med 6 in 7. Minimalna vrednost aw je 0,86, ob ostalih idealnih razmerah je šenekoliko nižja.

Sinteza enterotoksinov: Enterotoksini so kemijsko enostavni proteini. Toplotno so bolj stabilni kotcelice bakterij vrste S. aureus. Do največje sinteze enterotoksinov pride običajno pri optimalnihrazmerah za rast, lahko pa so razmere takšne, da celice enterotoksinov sploh ne sintetizirajo.Velikost populacije, pri kateri se tvori tolikšna količina enterotoksinov, ki povzroča gastroenteritis (1ng / g živila), je običajno nad 105 celic S. aureus /g živila. Stafilokokni toksin je lahko toplotnoobstojen in tudi po 30 min segrevanju na 100 oC ne izgubi svoje aktivnosti. Zato odsotnost bakterijvrste Staphylococcus aureus še ne pomeni, da v živilu ni toksina (Vaje pri predmetu Toksikologija inkontaminacija živil).

V živilih določamo bakterije vrste S. aureus, ker:

• lahko potrdimo, da so bile te bakterije vzrok za okužbo z živili

• lahko določimo, če je bilo živilo ali sestavina živila potencialni vir enterotoksigenih stafilokokov

• poiščemo naknadno kontaminacijo živila, ki je običajno posledica človekovega rokovanja zživilom po na primer toplotni obdelavi ali pa posledica neustreznih higienskih razmer v okolju,kjer so hranjena živila. Ta naknadna kontaminacija je še posebej nevarna, ker živilo po toplotniobdelavi ne vsebuje več (ali vsaj veliko manj) kompetativnih mikroorganizmov in tako imajostafilokoki veliko boljše razmere za rast v živilu.

Živila, ki so najpogosteje povezana z zastrupitvami s stafilokoknimi toksini, so meso (govedina,svinjina, perutnina) in mesni izdelki (klobase, salame, hrenovke), solate (ki vsebujejo meso,perutnino, krompir), s kremami polnjeni slaščičarski izdelki in mlečni izdelki (siri). Ker so stafilokokipogosto normalno prisotni na surovih živilih (predvsem živila živalskega izvora), je toliko boljpomembno ločevanje čistih in ne-čistih poti ter dosledno ločevanje dela in poti surovih in žeobdelanih živil (Downes in Ito, 2001).


16

3.3.1 DOLOČANJE BAKTERIJ VRSTE Staphylococcus aureusOBOGATITEV

Če določamo bakterije vrste S. aureus v večji količini vzorca ali če iščemo te bakterije v živilih kjerso prisotni v zelo nizki koncentraciji (ponavadi so to živila po toplotni ali drugi obdelavi) uporabimomanj selektivno obogatitev živila v slanem bujonu (TSB z 20% NaCl), ki nudi stafilokokom okrepitev.Če določamo bakterije vrste S. aureus v surovih živilih ali v še neobdelanih živilih v katerihpričakujemo veliko koncentracijo drugih mikroorganizmov uporabimo selektivno obogatitev živila vbujonu Giolitti & Cantoni (Downes in Ito, 2001; Harrigan, 1998). Določeno količino vzorca zatehtamov 9x-ni volumen obogatitvenega bujona, homogeniziramo in suspenzijo inkubiramo 24 ur pri 35 oC ali37 oC.

IZOLACIJA

Če določamo bakterije vrste S. aureus po obogatitvi, naredimo izolacijo po končani obogatitvi naselektivno gojišče. Če določamo bakterije vrste S. aureus kvantitativno, potem pripravimo matičnoraztopino in ustrezne razredčitve. Na selektivno gojišče cepimo po 0,1 ml MR ali ustreznihrazredčitev. Po standardu SIST EN ISO 6888-2 (1999) se za izolacijo koagulaza pozitivnihstafilokokov uporablja gojišče Baird – Parker (BP), ki ga po izolaciji inkubiramo 24 – 48 ur pri 35 oCali 37 oC. Gojišče BP je selektivno gojišče za izolacijo koagulaza pozitivnih stafilokokov iz hrane.Vsebuje K-telurit, glicin in litijev klorid, ki inhibirajo rast drugih bakterij, piruvat pa spodbuja raststafilokokov, in 20 % jajčnega rumenjaka.

Značilna rast kolonij:

S. aureus: Okrogle, črne (zaradi redukcije telurita), gladke, svetleče, konveksne kolonije 2-3 mm vpremeru (kadar je na gojišču malo kolonij), običajno z ozkim belim (motnim) robom, gojišče okolikolonij je prozorno. Zaradi delovanja različnih encimov na lipoproteine jajčnega rumenjaka, pride donastanka različno topnih produktov - motne, prozorne cone okoli kolonij.

S. epidermidis: tvori črne kolonije (se ne svetijo), gojišče okoli kolonij je le redko prozorno.

Nekateri vrste streptokokov, korinebakterij in mikrokokov prav tako tvorijo črne kolonije, vendar breznastanka prozornih con okoli kolonij.


Kolonije značilne za stafilokoke precepimo v ne-selektivno tekoče gojišče BHI (angl. brain heartinfusion broth), homogeniziramo in inkubiramo 24 ur pri 37 oC ter jih nato potrdimo kot koagulazapozitivne stafilokoke z naslednjimi testi:

• Koagulacija krvne plazme: V sterilno epruveto odpipetiramo 0,3 ml krvne plazme (običajnoplazma kuncev), dodamo 0,1 ml namnožene kulture iz BHI, premešamo in inkubiramo pri 37 oC.Koagulacijo krvne plazme opazujemo po 4, 6 in 24 urah. Koagulaza katalizira pretvorbofibrinogena v fibrin in reakcija je pozitivna takrat, ko je več kot ¾ začetnega volumna v epruvetikot strdek. Tako določimo koagulaza pozitivne stafilokoke.

• Hemoliza na krvnem agarju (KA): Značilno kolonijo iz BP cepimo na KA, inkubiramo 24 ur pri 37oC. Bakterije vrste S. aureus tvorijo rumeno bele kolonije z izrazito β-hemolizo.


17

• Mikroskopiranje: Iz ne-selektivnega gojišča NA vzporedno z potrditvenimi testi naredimomikroskopski preparat po Gramu

3.4 BAKTERIJE VRSTE Listeria monocytogenes

Bakterije vrste L. monocytogenes so grampozitivne, nesporogene palčke, dolge 1 - 2 µm in široke0,5 µm, včasih se pojavljajo kot koki ali diplokoki. Po 3 do 5 dneh inkubacije se razvijejo dolgepalčke velikosti 6 - 20 µm, ki se pogosto po Gramu obarvajo negativno. Bakterije vrste L.monocytogenes rastejo v širokem temperaturnem območju od 3 oC do 45 oC, optimum je med 30 oCin 37 oC. Razmnožujejo se v aerobnih in mikroaerofilnih razmerah pri vrednostih pH vse do 9,6. Rastbakterij je ustavljena ali močno inhibirana v anaerobnih razmerah in pri pH manjših od 5,6.

Bakterije vrste L. monocytogenes so v naravi zelo razširjene. Izolirali so jih iz različnih virov, naprimer: iz razpadajoče vegetacije, zemlje, živalskega blata, odpadne vode, krme v silosih, vode.Približno 5 - 10 % ljudi ima bakterije L. monocytogenes v prebavnem traktu. Posledica ubikvitarnenarave bakterij vrste L. monocytogenes je njihova pogosta prisotnost v človekovi prehranjevalniverigi. Izmed vseh nesporogenih bakterij so najbolj odporne proti različnim vplivom okolja. Prisotnostbakterij vrste L. monocytogenes v mnogih živilih je predvsem posledica navzkrižne kontaminacijekončnih izdelkov. Ker bakterije lahko rastejo pri nizkih temperaturah hlajenja in so relativno odporneproti višjim koncentracijam soli, so živila ugodno okolje za njihov razvoj. Najbolj pogosto se bakterijevrste L. monocytogenes nahajajo v naslednjih živilih: mleko, mehki siri, sladoled, pred-pripravljena inohlajena živila, surovo meso, pred-pripravljena perutnina, pašteta, surova zelenjava, solate, ribe, ribjiizdelki, sendviči in riž.

V rodu Listeria so za človeka in/ali živali patogene tri vrste, L. monocytogenes, L. ivanovii in L.seeligeri. Primeri okužbe z bakterijami vrste L. seeligeri so bili zelo redki tako pri živalih kot priljudeh. Prav tako so bili redki primeri okužbe ljudi z bakterijami vrste L. ivanovii. Večino posameznihprimerov in epidemij listerioze pri ljudeh povzročijo bakterije vrste L. monocytogenes.

Glavni vir listerij je hrana, kontaminirana z bakterijami vrste L. monocytogenes. Podatki oposameznih primerih in množičnih izbruhih listerioze so pokazali, da je bila incidenca listerioze zelonizka, kljub dejstvu, da so se bakterije vrste L. monocytogenes pogosto pojavljale v različnih živilih.Ne glede na dejstvo, da je humana listerioza redka bolezen, pa je smrtnost zelo visoka, med 20 in50 %. Pri ljudeh je listerioza oportunistična okužba. Bolezen se najbolj pogosto pojavi pri tistihljudeh, ki so že zboleli za neko drugo boleznijo, pri ljudeh starejših od 65 let, pri nosečnicah, pri šenerojenih otrocih ali pri dojenčkih. Zelo nevarna je za bolnike z levkemijo ali drugimi malignimitvorbami, za tiste, ki se zdravijo s kortikosteroidi ali s sevanjem, za ljudi z aidsom, za alkoholike, zaljudi s sladkorno boleznijo in za ljudi s protetičnimi srčnimi zaklopkami. Klinična znamenja listeriozeso zelo različna. Glede na prevladujoče klinične simptome razlikujejo pri listeriozi devet različnihoblik.


18

3.4.1 DOLOČANJE BAKTERIJ VRSTE Listeria monocytogenesOBOGATITEV

Primarna obogatitev :

Listerije so v živilih lahko v nizkem številu ob tem, da je skupno število bakterij zelo veliko. Zato jepotrebna selektivna obogatitev. Ker je pomembno, da določimo tudi poškodovane celice bakterijvrste L. monocytogenes, uporabimo primarno pol-selektivno obogatitev v gojišču s polovičnokoncentracijo selektivnih sestavin - gojišče Half Fraser (ISO 11290-1, 1996). Gojišče vsebujepolovični koncentraciji akriflavina in nalidiksinske kisline. Količino živila, v kateri iščemo bakterijevrste L. monocytogenes, zatehtamo v 9x-ni volumen obogatitvenega gojišča Half Fraser insuspenzijo homogeniziramo. Obogatitveno gojišče inkubiramo 24 ur pri 30 oC.

Sekundarna obogatitev:

Desetino ml primarnega obogatitvenega gojišča cepljenega z živilom po inkubaciji prenesemo v 10ml selektivnega tekočega obogatitvenega gojišča Fraser, ki ima celotno koncentracijo selektivnihsestavin. Inkubiramo 48 ur pri 35 oC ali 37 oC.

IZOLACIJA

Za izolacijo uporabimo dve selektivni gojišči ALOA in drugo po izbiri (ISO 11290-1, 1996/DAM1:2004). Izolacijo listerij izvedemo iz primarnega in iz sekundarnega obogatitvenega gojišča scepilno zanko.

Značilna rast na gojišču ALOA: bakterije vrst L. monocytogenes in L. ivanovii tvorijo modre kolonijez motno prosojno cono, medtem ko so kolonije drugih listerij modre brez cone ali bele (Vaje pripredmetu Higiena živil).


Potrditev rodu Listeria:

Za potrditev vzamemo iz vsake plošče s selektivnim gojiščem po 5 značilnih kolonij, jih precepimo naneselektivno gojišče TSAYE (triptični soja agar s kvasnim ekstraktom), inkubiramo 24 ur pri 37 oC.Za listerije so značilne brezbarvne, konveksne, 1 do 2 mm velike kolonije. Na teh kolonijah naredimoteste:

• Katalaza: Eno kolonijo zmešamo na objektnem stekelcu v kapljico vodikovega peroksida. Če setakoj pojavijo mehurčki, je reakcija pozitivna.

• Barvanje mikroskopskega preparata po Gramu

• Gibljivost: Kolonijo iz plošče TSYEA precepimo v tekoče gojišče TSYEB. Inkubiramo 8 do 24 ur,dokler gojišče ni motno, pri 25 oC. Gibljivost opazujemo na mikroskopskem preparatu. Kotalternativo se lahko uporablja gojišče za opazovanje gibljivosti v katerega cepimo značilnokolonijo iz plošče TSYEA s cepilno iglo. Po 48 urni inkubaciji pri 25 oC opazujemo rast okolivboda.

Listerije so katalaza-pozitivne, grampozitivne, gibljive palčke.


19

Potrditev bakterij vrste L. monocytogenes:

• Hemoliza: Kolonijo iz plošče TSYEA precepimo na gojišče krvni agar z ovčjo krvjo. Za negativnokontrolo uporabimo bakterije vrste L. innocua. Po 24 urni inkubaciji pri 35 oC ali 37 oC ima L.monocytogenes okoli kolonij prozorno cono, ki pomeni β-hemolizo.

• Izkoriščanje ramnoze in ksiloze: S cepilno zanko cepimo motno gojišče TSYEB z listerijami vtekoči gojišči, ki vsebujeta ramnozo in ksilozo. Inkubiramo pri 35 oC ali 37 oC do 5 dni. L.monocytogenes izkorišča ramnozo, ksilozo pa ne.

• Test CAMP: Na krvni agar v dveh ravnih vzporednih črtah cepimo bakterije vrst Staphylococcusaureus in Rhodococcus equi, vmes pravokotno cepimo suspenzijo iz gojišča TSYEB. Po 18 do24 urni inkubaciji pri 35 oC ali 37 oC je povečana cona hemolize na pri bakterijah vrsteStaphylococcus aureus, pri bakterijah vrste Rhodococcus equi pa ne, če je preiskovana kulturaL. monocytogenes.

• Dokončna potrditev bakterij vrste L. monocytogenes: Bakterije, ki jih določimo kot L.monocytogenes, pošljemo v referenčni laboratorij na serološko in lizogeno tipizacijo

Tabela 3: Rezultati testov za identifikacijo vrst bakterij rodu Listeria

Vrsta/ Test ksiloza ramnoza manitol ß-hemolizaL. monocytogenes - + - +L. innocua - +/- - -L. seeligeri + - - sL. welshimeri + +/- - -L. ivanovii + - - +L. grayi - - + -

Legenda: +: večina sevov pozitivnih, -: večina sevov negativnih, s: slaba


20

4 KVARLJIVCI ŽIVIL

Kvar živil, ki ga povzročijo mikroorganizmi je vzrok, da je velika količina živil neuporabna za prehranoljudi in pomeni velike ekonomske izgube. Ker potrošniki želijo čim bolj sveža živila, ki naj bi bila čimmanj obdelana in imela čim daljši rok uporabe, so kvarljivci (poleg patogenov) velik izziv živilskitehnologiji.

4.1 HALOFILNI IN OZMOFILNI MIKROORGANIZMI

Mikroorganizmi lahko rastejo v zelo različnih okoljih. Le malo mikroorganizmov lahko raste privisokem ozmotskem pritisku, ki je na primer značilen za živila, ki vsebujejo visoke koncentracije soliin sladkorja in imajo zato znižano vrednost aw (vodna aktivnost). Različni literaturni podatki opisujejote mikroorganizme neskladno; na primer nekateri avtorji uporabljajo za mikroorganizme (plesni,kvasovke in bakterije, ki rastejo pri povišani koncentraciji soli oziroma sladkorja, skupno oznakohalofili; iz praktičnega vidika so najbolj primerne definicije (Baross, 2001):

halofilni mikroorganizmi so tisti, ki za rast potrebujejo določeno minimalno koncentracijo NaCl(ali drugih anionov in kationov)

ozmofilni mikroorganizmi so tisti, ki za rastejo pri visokih koncentracijah organskih topljencev(največkrat sladkorjev); izraz ozmofilni se uporablja za kvasovke, medtem ko se izraz kserofilniuporablja za plesni

ozmofilni / kserofilni mikroorganizmi lahko rastejo tudi pri nižjih koncentracijah organskihtopljencev in zato je bolj pravilen izraz ozmotolerantni / kserotolerantni mikroorganizmi.

Vrsta mikroorganizmov, ki lahko povzroči kvar slanih živil je odvisna od koncentracije in vrste soli tervrste živila. Šibki halofili optimalno rastejo v gojiščih, ki vsebujejo med 0,5 in 3 % (ut.%) soli, zmernihalofili v gojiščih s 3 do 15 % soli in ekstremni halofili v gojiščih z 15 do 30 % soli. V tabeli 4 soprikazani nekateri primeri živil kjer lahko kvar povzročajo halofilni mikroorganizmi. Poleg halofilnihmikroorganizmov pa lahko v takih živilih najdemo tudi nekatere patogene bakterije.

Tabela 4: Halofilni kvarljivci in patogene bakterije v slanih živilih

Vrsta živila Ut. % soli Halofilni kvarljivci Patogeni

Morske ribe 1 - 4Proteolitični Pseudomonas spp.,Schewanella putrefaciens, Vibrio

spp.., Acinetobacter spp.

Vibrio parahemolyticus, V. cholerae,V. vulnificus, Cl. botulinum, Cl.

perfringens, Staphylococcus aureus

Razsoljeni mesniizdelki (šunka,pršut, salame,

klobase)

1 - 7

Halotolerantne kvasovke in plesni,Micrococcus spp., enterokoki,

Bacillus, Clostridium,mlečnokislinske bakterije

Cl. botulinum, Cl. perfringens,Listeriamonocytogenes, patogene vrste

Enterobacteriaceae

Soljene ribe

1 - 10Pseudomonas spp., Clostridium,

Micrococcus spp.Cl. botulinum, Cl. perfringens,

Staphylococcus aureus, Salmonella

20 25Halobacterium spp., Halococcusspp., nekatere vrste Micrococcus

Cl. botulinum, Listeriamonocytogenes, Staph. aureus


21

Ozmofilne kvasovke in kserofilne plesni rastejo pri nižji vrednosti aw (< 0,85), medtem koozmotolerantne kvasovke in kserotolerantne plesni lahko tudi rastejo v širšem območju vrednosti aw.Ozmofilne/ozmotolerantne kvasovke so značilni kvarljivci suhih ali koncentriranih živil, ki vsebujejovišje vsebnosti sladkorja (marmelada, med, sadni koncentrati, bomboni, ipd) ali soli. Ozmofilnekvasovke in kserofilne plesni ne pomenijo direktnega tveganja za zdravje potrošnika, ampakpovzročajo ekonomsko škodo. Največ jih sodi v rodove Zygosaccharomyces (Z. rouxii aw min 0,62 ,Z. bailii aw min 0,80), Eurotium (Aspergillus) (E. amstelodami aw min 0,70, E. chevalieri aw min 0,71),Aspergillus (A. flavus aw min 0,78, A. niger aw min 0,77), Penicillium (P. citrinum aw min 0,80Wallemia (W. sebi aw min 0,82).

4.1.1 DOLOČANJE HALOFILNIH BAKTERIJ

Za določanje halofilnih bakterij moramo matično raztopino pripraviti tako, da v fiziološko raztopinopred sterilizacijo dodamo določeno količino soli (na primer če določamo bakterije rodu Vibriododamo 3 % NaCl). Nato za izolacijo uporabimo gojišče TSA (triptični soja agar), ki mu med pripravoprav tako dodamo določeno količino soli ali gojišče HA (halofilni agar) oziroma če uporabljamoobogatitev uporabimo HB (halofilni bujon). Količina soli, ki jo dodamo v posamezno gojišče jeodvisna od skupine halofilov, ki jo želimo določiti (šibki, zmerni ali ekstremni halofili). Čas intemperatura inkubacije gojišč sta odvisna od vrste živila in skupine bakterij, ki jih določamo.

4.1.2 DOLOČANJE OZMOTOLERANTNIH KVASOVK IN KSEROFILNIH PLESNI

Pri določanju ozmofilnih gliv moramo upoštevati nižjo aw pri topilu za pripravo matične raztopine inpri gojiščih. V nasprotnem primeru so rezultati lahko napačni ali ne-natančni. Uporablja sekvalitativna preiskava predvsem takrat ko pričakujemo zelo nizko koncentracijo ozmofilnih gliv; inkvantitativna preiskava kjer uporabljamo vmešavanje vzorca in ustreznih razredčitev v gojišče alimembransko filtracijo.

Kot topilo za pripravo vzorca uporabimo 40 % ali 50 % (ut.) raztopino glukoze ali inertnega sladkorja(glukoza in fruktoza). Gojišča z znižano aw so zelo raznolika in uporabljamo jih glede na različnevrste oziroma skupine živil. Kot splošno gojišče se lahko uporabi gojišče MY40G (sladni ekstrakt,kvasni ekstrakt, 40 % glukoze) ali gojišče DG-18 (angl. Dichloran Glycerol, vsebuje 18 % glicerola,aw 0,95). Matično raztopino in ustrezne razredčitve cepimo v prazne petrijevke in dodamo 15 – 20 mlstopljenega in na 45 oC ohlajenega gojišča ter vzorec previdno vmešamo. Če uporabimomembransko filtracijo, moramo vzorec živila predhodno razredčiti v sterilni destilirani vodi in ga natofiltrirati preko membranskega filtra z velikostjo por 0,45 µm. Pri tem moramo upoštevati dejstvo, da jerazredčevanje živila v vodi za ozmofilne /kserofilne glive lahko ozmotski stres, ki jim bo preprečil alizakasnil njihovo rast na gojiščih. Filter nato aseptično prenesemo na ustrezno gojišče. Gojiščainkubiramo 5 – 7 dni pri 25 ali 30 oC Po inkubaciji preštejemo kolonije in rezultate kvantificiramo.Potrditev oziroma identifikacija posameznih gliv (vaje pri predmetu Živilska mikrobiologija, vaje pripredmetu Toksikologija in kontaminacija živil).


22

4.2 MLEČNOKISLINSKE BAKTERIJE

Mlečnokislinske bakterije (MKB) so heterogena skupina bakterij katerim je skupno, da sogrampozitivne palčke in grampozitivni koki, katalaza-negativne, nesporogene, fermentativne,fakultativno anaerobne in da tvorijo mlečno kislino kot glaven produkt fermentacije glukoze. MedMKB sodijo rodovi Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Aerococcus,Aliococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactococcus, Oenococcus, Tetragenococcus,Vagococcus in Weissella. Fenotipsko razlikovanje temelji na celični morfologiji, njihovemmetabolizmu (homofermentativne - tvorijo večinoma kot končni produkt glikolize mlečno kislino;heterofermentativne – tvorijo poleg mlečne kisline še mnogo drugih produktov kot so etanol, acetatin CO2), na vrsti produktov primarnega metabolizma različnih sladkorjev z ali brez tvorbe plinov,konfiguraciji proizvedene mlečne kisline, vsebnosti maščobnih kislin in sestavi celične stene.Pomembne lastnosti so tudi zmožnost rasti pri določeni temperaturi, odpornost na ekstremnedejavnike (na primer nizek ali visok pH; povišana koncentracija soli) in zato v splošnem ne moremopostaviti omejitev za območje rasti pri določenih vrednostih pH, aw, T in drugih parametrih, saj so lete lastnosti odvisne od rodu oziroma vrste MKB. Poleg tega so MKB lahko hkrati tehnološkopomembne bakterije in kvarljivci, na primer bakterije vrste Lactobacillus sakei so pomembnastarterska kultura v proizvodnji mesnih izdelkov, medtem ko so lahko dominantna vrsta kvarljivcev vvakuumsko pakiranih mesnih izdelkih.

Za živilo neznačilna aroma in vonj (vonj po siru, trpek, kisel vonj in včasih vonj po jetrih) so ponavadiprve spremembe povezane s kvarom svežega mesa in mesnih izdelkov, ki ga povzročajo MKB.Poleg vonja pride tudi do spremembe okusa, in tvorbe plinov. Ko na primer populacija MKB dosežepribližno 107 cfu/g na površini vakuumsko pakiranih hrenovk, začno MKB proizvajati mlečno kislinoin pri 3-4 mg/g je taka hrenovka senzorično nesprejemljiva. Hkrati pade pH (iz 6,3 na 5,8).Sprememba barve (zelenkasta) pri na primer mesnih izdelkih je posledica tvorbe H2O2, ki reagira zNO-mioglobinom in nastane zelenkasto obarvan porfirin. Poleg tega lahko MKB tvorijo tudi CO2 indruge pline, ki povzroče napihovanje embalaže, spremembo vonja in okusa. Primeri kvara, ki gapovzročajo MKB so prikazani v tabeli 3.

Določanje MKB kot kvarljivcev živil vključuje gojitvene metode in alternativne metode pri katerihdetekcija ne temelji na njihovi rasti. Omejitve klasičnih gojitvenih metod se kažejo v napačniidentifikaciji in/ali podcenjenem številu MKB in lahko vodijo do napačnega odkrivanja kvarljivcev.Rezultat gojitvene metode je namreč odvisen od mnogih dejavnikov kot so izbira gojišča, fiziološkostanje MKB, uporabljene metode identifikacije. Pomemben dejavnik so namreč sub-letalnopoškodovane celice MKB, ki na selektivnih gojiščih ne bodo zrasle in tvorile kolonij. Drug pomembendejavnik pa je stanje VBNC, saj so bakterije v živilih podvržene mnogim okoljskim vplivom in jestanje VBNC zelo verjetno. Celice v stanju VBNC so metabolično še vedno aktivne (povzročajokvar!), vendar pa ne bodo tvorile kolonij na gojišču. Pri določanju MKB je potrebno tudi upoštevativrsto živila, saj so na primer MKB pomembne starterske kulture in bodo postopki izolacije inidentifikacije MKB kot kvarljivcev na primer v sirih ali drugih fermentiranih mlečnih izdelkih vezanipredvsem na znanje o možnih MKB-kvarljivcih. Pri identifikaciji so rezultati najboljši takrat ko polegfenotipskih določimo še genotipske lastnosti.


23

Tabela 5: Primeri mlečnokislinskih bakterij kot kvarljivci živil

Skupina živila Živilo Parametri Senzoričnasprememba

Substrat/produktkvara MKB

Sveže meso

Piščančjaprsa pH>4,5;aw>0,95 Sluzavost Saharoza/

dekstran Leuconostoc

Vakuumskopakiranomeso

pH>4,5;aw>0,95,nitrit, toplotnaobdelava

Zelenkastapovršina H2O2/ porfirin Weissella viridescens

Vonj po H2S

H2S inhemoglobin/sulfmioglobin;H2S

Lactobacillus sakei,L. curvatus,

MAPpakiranopiščančjemeso

pH~6;aw>0,95 Napihovanje Glukoza / plini(CO2)

Leuconostoggasicomitatum

Toplotnoobdelanomeso

Vakuumskopakiranehrenovke

pH>4,5 Zelenkastapovršina H2O2/ porfirin Carnobacterium

viridans

Vakuumskopakiranašunka

pH~6;aw>0,95 Kiselkast vonj Glukoza / mlečnain ocetna kislina

Leuconostogcarnosum

Vakuumskopakiranimesniizdelki

pH~6;aw>0,95Lepljiva insluzastapovršina

Sladkorji / EPS Lactobacillus sakei

Zelenjava Kislekumarice pH<4,5 Napihovanje

Glukoza,jabolčna kislina/plini (CO2)

Heterofermentativnilaktobacili

Majoneznesolate

Ketchup pH<4,5;aw>0,95,pasterizacija Napihovanje Glukoza / plini

(CO2)Lactobacillusfructivorans

Solatnipreliv pH<4,5;aw>0,95 Napihovanje

Fruktoza,citronska kislina/plini (CO2), tujivonji

Lactobacillusfructivorans

Brezalkoholnepijače

Nektar pH<4,5;aw>0,98 Zakisanje, tujipriokusi

Sladkor / mlečnakislina, ocetnakislina, CO2,Diacetil

Leuconostocmesenteroides,Lactobacillusperolens, L.paracasei

Sadni sok pH<4,0;aw>0,97 Maslenaaroma Citrat / diacetil Leuconostoc,

Lactobacillus

Vino / pH<4,5;aw>0,98

Sluzavost,židkost,povečanaviskoznost

Sladkorji /EPS(glukan) Pediococcus

Maslen vonj Citrat / diacetil Oenococcus oeni

Mlečni cik

Heksoze /mlečna kislina,ocetna kislina,CO2

Pivo / pH~6;aw>0,98

Kisel okus,motnost,maslen tuj vonj

Sladkorji /diacetil, mlečnakislina

Lacobacillus brevis,L. linderi

Kisel tuj okus,židkost, tuj vonj

Sladkorji /polisaharidi Pediococcus


24

4.2.1 DOLOČANJE MLEČNOKISLINSKIH BAKTERIJIZOLACIJA

Pripravimo matično raztopino z 0,1 % peptonsko vodo (če uporabimo fosfatni pufer za pripravofiziološke raztopine, lahko poškodujemo celice MKB) in ustrezne razredčitve živila ali pa uporabimodirektno živilo. Za izolacijo MKB uporabljamo prehransko kompleksna gojišča, ki tem bakterijamomogočajo rast. Čeprav je poznanih mnogo gojišč, je najbolj pogosto uporabljeno gojišče MRS(deMan and Rogosa agar) (ISO13721,1975), ki pa je lahko delno spremenjeno glede na namenuporabe:

Gojišče MRS s plastjo gojišča APT

To gojišče se uporablja za solatne prelive in podobna živila, saj razmere v gojišču MRSomogočajo MKB, da se opomorejo, preden dodamo plast gojišča APT. Vzorcu (1 ml) vpetrijevki dodamo 15 ml stopljenega gojišča MRS in vzorec vmešamo. Po 30 min gojiščeprelijemo s plastjo gojišča APT s pH 4. Gojišča 4 dni inkubiramo pri 35 oC in identificiramoposamezne kolonije.

Zakisano gojišče MRS

To gojišče uporabljamo pri določanju kvar v zelenjavnih izdelkih. Pripravimo gojišče MRS inmu znižamo pH na 5,5 z led-ocetno kislino. Vzorcu (1 ml) v petrijevki dodamo 15 mlstopljenega gojišča MRS in vzorec vmešamo. Gojišča 3 dni anaerobno inkubiramo pri 35 oCin identificiramo posamezne kolonije.

Zakisano gojišče MRS s fruktozo

To gojišče uporabljamo za določanje bakterij vrst Lactobacillus plantarum in Lactobacillusfructivorans, saj 1 % fruktoze in pH 5,4 (znižan s HCl) favorizira njihovo rast. Vzorcu (1 ml) vpetrijevki dodamo 15 ml stopljenega gojišča MRS in vzorec vmešamo. Gojišča 5 dniinkubiramo pri 30 oC in identificiramo posamezne kolonije.

Modificirano gojišče MRS

To gojišče uporabljamo za določitev MKB v živilih rastlinskega izvora. V tem gojišču namestodi- uporabimo tri-amonijev fostat in dodatek 0,01 % TTC. Vzorcu (1 ml) v petrijevki dodamo15 ml stopljenega gojišča MRS in vzorec vmešamo. Gojišča 3 dni anaerobno inkubiramo pri30 oC in identificiramo posamezne kolonije.

Gojišče MRS-S

To gojišče se uporablja za določanje MKB v fermentiranih mesnih izdelkih. Gojišču MRS jedodana sorbična kislina, ki naj bi preprečevala rast kvasovkam. Gojišču MRS najprejznižamo pH na 5,7 s 5N HCl in nato dodamo sorbično kislino stopljeno v NaOH tako, da jekončna koncentracija 0,1 %. Vzorcu (1 ml) v petrijevki dodamo 15 ml stopljenega gojiščaMRS in vzorec vmešamo. Gojišča 5-7 dni anaerobno inkubiramo pri 20 oC in identificiramoposamezne kolonije.

Gojišče MRS z dodatkom jabolčnega soka in cikloheksimida


25

To je eno od gojišč, ki se uporablja za določanje MKB v vinu. Gojišču MRS je znižan pH na5,6 in vsebuje 20 % jabolčnega soka ter 100 mg/l cikloheksimida (antibiotik, ki prepreči rastvečini kvasovk). Vzorcu (1 ml) v petrijevki dodamo 15 ml stopljenega gojišča MRS in vzorecvmešamo. Gojišča 5 dni anaerobno inkubiramo pri 30 oC in identificiramo posameznekolonije.


Za potrditev domnevnih MKB posamezno kolonijo testiramo tako, da pripravimo barvni preparat poGramu (so grampozitivne palčke ali koki) in izvedemo katalazni test (-). Identifikacijo natonadaljujemo z biokemijskimi testi (API 50 CH) in različnimi identifikacijskimi shemami, ki vključujejorazlične teste (rast pri različnih temperaturah, tvorba plina pri fermentaciji različnih ogljikohidratov,izkoriščanje različnih virov dušika, ipd). Alternativno lahko uporabimo različne metode, ki temeljijo napreiskavah DNK (PCR, restrikcijska analiza, RFLP, RAPD, rep-PCR, ipd).

4.3 SPOROGENE BAKTERIJE

Sporogene bakterije so raznolika in zelo velika skupina mikroorganizmov od katerih jih kar precejsodi med kvarljivce živil, nekaj pa jih sodi tudi med za človeka patogene bakterije. Kot skupinakvarljivcev so sporogene bakterije ponavadi vezane na kvar toplotno obdelanih živil, saj endosporelahko preživijo relativno visoke temperature, ki se uporabljajo pri proizvodnji takih živil. Ta toplotnoobdelana živila imajo ponavadi daljši čas obstojnosti pri sobni temperaturi in so ali embalirana intoplotno tretirana v konzervah ali pa so po toplotni obdelavi aseptično polnjena v hermetično zaprtoembalažo. Pogosto so primeri kvara konzerv opisani s prisotnostjo in rastjo neškodljivih bakterij, kijih lahko določimo v takih živilih. Zelo težko pa je oziroma v nekaterih primerih celo nemogoče, da seizključi možnost, da bi katera od drugih konzerv proizvedenih v isti seriji, vsebovala patogenemikroorganizme. Zato se pojav kvara povzročenega s strani sporogenih bakterij smatra kot indikatorpotencialno veliko bolj nevarnega tveganja.

Sporogene bakterije, ki so vezane na kvar živil, so tradicionalno razvrščene v različne skupine gledena njihove lastnosti pri rasti:

• Obligatne termofilne bakterije: rastejo pri 55 oC in ne rastejo pri 37 oC

• Fakultativno termofilne bakterije: rastejo pri 55 oC in 37 oC:

o Anaerobni kvarljivci, ki ne tvorijo H2S - TAS (Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum,prej Clostridium thermosaccharolyticum): so kvarljivci živil v konzervah ali hermetično zaprtihposodah, ki jih dalj časa zadržujemo pri 30 o do 60 oC (na primer zadrževanje obrokov vrestavraciji na 60 oC). Pride do bombaže, tvorijo kislino in pline (H2 in CO2), živila imajo vonj posiru ali butirični vonj.

o Anaerobni kvarljivci, ki tvorijo H2S – H2S-tvorci (Desulfotomaculum nigrificans, prej Clostridiumnigrificans): so kvarljivci živil v konzervah ali hermetično zaprtih posodah, ki jih dalj časazadržujemo na visoki temperaturi (T>55 oC). Tvorijo močno bombažo, H2S, imajo značilen vonjpo H2S, živilo zato tudi počrni.


26

o Kislinotvorne »Flat-sour« aerobne bakterije - KFS(Bacillus coagulans): so kvarljivci živil vkonzervah ali hermetično zaprtih posodah, ki imajo že kot izdelki nizek pH (pH 4,2-4,4) naprimer paradižnik; in tudi mlečnih izdelkih z višjim pH na primer evaporirano mleko. Tvorijokislino (zato se zniža pH živil), spremeni se okus in vonj živila, tvorijo le malo plina (nibombaže ali zelo majhna)

o Ne-kislinotvorne »Flat-sour« aerobne bakterije – FS (Geobacillus stearothermophilus; prejBacillus stearothermophilus): so kvarljivci živil v konzervah ali hermetično zaprtih posodah zvišjim pH (največkrat meso, mleko, zelenjava in izdelki iz omenjenih živil); tvorijo kislino,spremeni se vonj in okus živila, tvorijo malo plina ali pa ga ne tvorijo.

• Mezofilne bakterije: rastejo v območju od 15 do 45 oC

o Proteolitične anaerobne bakterije (na primer Cl. sporogenes, Cl. putrefaciens) - PAS: sokvarljivci živil v konzervah ali hermetično zaprtih posodah in povzročijo proteolizo – razgradnjobeljakovin do neprijetno dišečih spojin (merkaptan, amoniak), ob tem povzročijo tudi močnobombažo pločevink.

o Anaerobne bakterije, ki tvorijo butirično kislino (Cl. butyricum, Cl. pasteurinum)- BAS: sokvarljivci živil v konzervah ali hermetično zaprtih posodah, ki imajo nizek pH (na primerparadižnik, koruza, hruške) in zorjenih sirov (gauda, ementalec). Tvorijo butirično kislino, zatose zniža pH teh živil, pride do močne bombaže oziroma. pri sirih do t.i. zgodnjega napihovanja.

o Fakultativno anaerobne bakterije (Bacillus circulans, Brevibacillus laterosporus, Bacilluscoagulans, ) – FAMS: so kvarljivci živil v konzervah ali hermetično zaprtih posodah, ki jih daljčasa zadržujemo na visoki temperaturi (T>55 oC) ter kvarljivci zelenjave, ki jo zadržujemo prisobni temperaturi. Povzročijo hidrolizo škroba, nekatere vrste tvorijo plin, nekatere vrste kvaraso podobne FS-kvarljivcem.

o Acidofilne fakultativno anaerobne bakterije (Alicyclobacillus acidoterrestris, Alicyclobacillusacidocaldarius, Alicyclobacillus acidiphilus ) – FAAS: so kvarljivci živil v konzervah alihermetično zaprtih posodah, ki imajo nizek pH (pH < 3,8) kot na primer sadje, sadni sokovi,koncentrati. Povzročajo značilen vonj po gvajakolu in ne tvorijo bombaže.

• Majhna skupina psihrotolerantnih bakterij: rastejo v širokem območju 0-5 oC do 20 oC

o Anaerobne bakterije (Cl. Estertheticum, Cl. Laraminese, Cl. putrefaciens) – PAN: so kvarljivcivakuumsko pakiranega, hlajenega mesa in mesnih izdelkov, razsoljena šunka. Tvorijo plin (H2),butanol, butanojska kislino, različne estere; pride do napihovanja embalaže in neprijetnihvonjav.

o Fakultativno anaerobne bakterije (Bacillus mycoides, Bacillus circulans, Bacillus mycoides) –PFANFA: so kvarljivci vakuumsko pakiranih hlajenih izdelkov in tudi mleka. Tvorijo neprijetnevonjave, včasih plin.


27

4.3.1 AEROBNE SPOROGENE BAKTERIJE

Za živila, ki so bila termično obdelana (pasterizacija), lahko naknadno kontaminacijo ugotovimo zdeležem aerobnih sporogenih bakterij – glede na skupno število bakterij oz. mikroorganizmov vživilu. Če ni naknadne kontaminacije živila, mora biti skupno število bakterij oz. mikroorganizmov inštevilo aerobnih sporogenih bakterij enako (v okviru eksperimentalne napake). V prvo skupino živilsodijo tista živila, ki glede na lastnosti ne omogočajo vzklitja bakterijskim sporam, kot so na primersušena živila, živila z nizko aw in toplotno obdelana živila, ki so takoj po toplotni obdelavi zmrznjena.Pri teh živilih pomeni enako število bakterij in sporogenih bakterij v živilu, da je bila toplotnaobdelava ustrezna oz. da ni prišlo do naknadne kontaminacije. V drugo skupino sodijo živila, ki gledena lastnosti, omogočajo vzklitje bakterijskih spor, na primer pasterizirano mleko – le to mora bitipregledano tako po polnjenju in ohladitvi, sicer spore lahko prej vzklijejo.

4.3.1.1 DOLOČANJE SKUPNEGA ŠTEVILA AEROBNIH SPOROGENIH BAKTERIJ

Število aerobnih sporogenih bakterij določimo tako, da 2x po 10 ml matične raztopine prenesemo vsterilni epruveti in ju v vodni kopeli pri temperaturi 80 oC segrevamo. V eno epruveto dodamotermometer in segrevamo toliko časa, da je temperatura v epruveti 80 oC, nato segrevamo še 1minuto. Epruveto z matično raztopino v kateri ni bilo termometra nato ohladimo pod tekočo vodo.Pripravimo 10x-ne razredčitve in v prazne sterilne petrijevke (po 1 ml) cepimo razredčitve. Vpetrijevke dodamo po 15 ml gojišča PC (angl. plate count agar), ki smo ga predhodno stopili inohladili na 45 oC, ter inokulum previdno umešamo. Ko se gojišče strdi, petrijevke obrnemo in jih 2-3dni inkubiramo pri 30 oC. Preštejemo kolonije in izračunamo število aerobnih sporogenih bakterij vživilu (Harrigan, 1998).

Število aerobnih sporogenih bakterij v 1 g / 1 ml živila lahko določimo tudi tako, da 50 ml živilazatehtamo v 450 ml fiziološke raztopine in vzorec homogeniziramo 2 min z gnetilnikom. Tristeklenice z gojiščem TGE (angl. tripton glucose extract agar) ali PC (po 100 ml v 500 ml steklenici)stopimo in ohladimo na 45 oC v vodni kopeli. V prvo steklenico dodamo 10 ml, v drugo 1 ml in v tretjo0,1 ml matične raztopine in premešamo. Vzorce damo takoj v vodno kopel na 80 oC za 30 minut.Nato steklenice z vzorci ohladimo na 45 oC in vsak vzorec razlijemo v pet sterilnih petrijevk. Vzorceinkubiramo 48 ur pri 35 oC,. Preštejemo vse kolonije. Število sporogenih bakterij (cfu/g) iz prvesteklenice je enako številu zraslih kolonij na vseh petih ploščah cepljenih iz prve steklenice. Številosporogenih bakterij (cfu/g) iz druge steklenice je enako številu zraslih kolonij na vseh petih ploščahcepljenih iz prve steklenice in pomnoženo z 10, število sporogenih bakterij (cfu/g) iz tretje stekleniceje enako številu zraslih kolonij na vseh petih ploščah cepljenih iz tretje steklenice in pomnoženo s100. Tako lahko določimo od 1 do 150.000 cfu/g (Downes in Ito, 2001).

4.3.2 ANAEROBNE SPOROGENE BAKTERIJE

Mezofilne anaerobne sporogene bakterije, ki so lahko v živilih, so grampozitivne, katalaza negativnepalčke različnih velikosti z subterminalnimi do centralnimi sporami. Čeprav se smatra, da soklostridiji striktni anaerobi, lahko nekateri sevi rastejo tudi v prisotnosti kisika (Downes in Ito, 2001).Anaerobne bakterije so zelo razširjene v naravi, predvsem v zemlji in so zato pogost kontaminantsveže zelenjave, začimb. Nekatere vrste anaerobov so tudi normalno prisotne v prebavnem traktu inizločkih živali in so zato lahko kontaminanti mleka in mesa. Nekateri anaerobi so značilni tudi za ribe,školjke in vodno okolje. Ker so mnoge mezofilne anaerobne sporogene bakterije zelo odporne protitoploti, ker lahko rastejo v atmosferi brez kisika v širokem temperaturnem območju v katerem se


28

shranjujejo živila v pločevinkah, ker lahko rastejo v drugih živilskih izdelkih (na primer v razsoljenemmesu, v kuhanih živilih, v živilih shranjenih v hladilniku, v živilih, ki so pakirana v modificiraniatmosferi ali v vakuumu), so predstavniki teh bakterij lahko pomembni kvarljivci živil saj so lahkoproteoliti ali saharoliti.

4.3.2.1 DOLOČANJE SKUPNEGA ŠTEVILA ANAEROBNIH SPOROGENIH BAKTERIJ

Če anaerobne mezofilne sporogene bakterije kvantificiramo, pripravimo matično raztopino (R = 10-

1), ki jo segrevamo v primeru, da iščemo proteolite 10-13 minut pri 80 oC, v primeru, da določamobolj občutljive spore 15-30 minut pri 60 oC in v primeru, da iščemo toplotno bolj in toplotno manjodporne spore segrevamo MR 10 minut pri 71 oC. Nato pripravimo 10x-ne razredčitve živila. Kotmetodo kvantifikacije se uporablja metoda MPN, štetje kolonij na ploščah ali štetje kolonij vepruvetah s poltrdnim gojiščem.

Za določitev števila anaerobnih mezofilnih sporogenih bakterij z metodo štetja kolonij na ploščahcepimo v prazne sterilne petrijevke po 1 ml razredčitev. V petrijevke dodamo po 15 ml gojišča TPGY(angl. tripticase peptone glucose yeast extract agar), AC (angl. acetate differential agar) ali TP(tripticase peptone agar), ki smo ga predhodno stopili in hitro ohladili na 45 oC, ter inokulum previdnoumešamo. Ko se gojišče strdi, ga prelijemo s tanko plastjo tioglikolatnega agarja in plošče 2 – 5 dniinkubiramo v anaerobnem loncu pri 30 oC do 35 oC. Preštejemo kolonije in izračunamo številoanaerobnih mezofilnih sporogenih bakterij v živilu (Downes in Ito, 2001). Slabe strani te metode sovelike razlike med paralelkami, lahko se tvorijo mehurčki plina, ki poškodujejo trdno gojišče in s temonemogočajo natančno štetje kolonij. Interpretacija rezultatov mora biti pazljiva, saj poleg klostridijevlahko zrastejo tudi nekateri sevi fakultativno anaerobnih sporogenih bakterij.

4.3.3 TEHNOLOŠKI KVARLJIVCI

Mikroorganizmi, ki povzročajo kvar živil se razlikujejo za posamezne skupine živil glede na:

notranje dejavnike: to so fizikalne, kemijske in strukturne lastnosti živila kot so na primer pH, aw,Rh, dostopne hranilne snovi, protimikrobne snovi

zunanje dejavnike: to so parametri okolja v katerem je shranjeno živilo, kot so na primertemperatura, relativna vlaga, sestava atmosfere

način(e) procesiranja živil, ki vsebujejo različne načine obdelave živil, ki vodijo do spremembznačilnih za posamezno živilo in s tem tudi do značilne mikrobne populacije

implicitne dejavnike: kot sta sinergizem in antagonizem. Sinergizem pomeni, da ena vrstamikroorganizmov s svojim metabolizmom (na primer sprememba pH, Rh) ugodno vpliva na rastdrugih mikroorganizmov, ki sicer ne bi mogla rasti v takem živilu. Antagonizem pa pomeni, daena skupina mikroorganizmov onemogoči rast drugi skupini mikroorganizmov; na primertekmovanje za esencialne hranilne snovi, tvorbo protimikrobnih snovi (bakteriocini).

Mikroorganizmi imajo več mehanizmov s katerimi se lahko hitro prilagodijo na spremenjenerazmere. Zato so raziskave in študij kvara zelo kompleksni, saj pogosto z laboratorijskimi poskusine moremo zajeti vseh dejavnikov, ki sicer vplivajo na obstojnost živila. Mikrobiološki kvar živila se


29

odraža v spremenjeni sestavi živila, spremenjenih senzoričnih lastnostih in spremenjeni biološkioziroma hranilni vrednosti živila.

4.3.3.1 DOLOČANJE TEHNOLOŠKIH KVARLJIVCEV

4.3.3.1.1 PSIHROFILNI AEROBNI KVARLJIVCIPsihrofilni aerobni kvarljivci so tisti mikroorganizmi, ki rastejo pri nizkih temperaturah hlajenja (alicelo zmrzovanja). Določimo jih enako kot aerobne mezofilne mikroorganizme (2.1.1) le, da gojišča14-28 dni inkubiramo pri 1 – 7 oC.

4.3.3.1.2 MEZOFILNI AEROBNI KVARLJIVCIV to skupino sodijo aerobni mezofilni mikroorganizmi (2.1.1) ter kvasovke in plesni (2.1.2).

4.3.3.1.3 LIPOLITIČNI MIKROORGANIZMIV to skupino sodijo mikroorganizmi, ki kvarijo živila (na primer maslo, margarina) tako, dahidrolizirajo maščobe. Določimo jih z izolacijo na gojišču Tributyrin (TBA). Izolacija temelji nasposobnosti mikroorganizmov, da izkoriščajo tributirin (glicerin tributirat), ker imajo lipaze. Matičnoraztopino in ustrezne razredčitve vzorca živila (0,1 ml) cepimo na gojišče TBA, in po 3-dnevniinkubaciji pri 30 oC so lipolitični mikroorganizmi tisti, ki tvorijo kolonije s prozorno cono.

4.3.3.1.4 AEROBNE SPOROGENE BAKTERIJE(4.1.1)

4.3.3.1.5 ANAEROBNE SPOROGENE BAKTERIJE(4.1.2)

4.3.3.1.6 TERMOFILNE SPOROGENE BAKTERIJEMed termofilnimi sporogenimi bakterijami določamo dve skupini kvarljivcev:

kislinotvorne »Flat-sour« aerobne bakterije - KFS

ne-kislinotvorne »Flat-sour« aerobne bakterije – FS

Matično raztopino segrevamo 5 min pri 100 oC. Nato 20 ml MR dodamo v 100 ml stopljenega in napribližno 50 oC ohlajenega gojišča DTA (dekstroza tripton agar) in vsebino premešamo. Vsebinonato razlijemo v 5 sterilnih petrijevk in ko se gojišče strdi, ga prelijemo z 2 % agarjem. Gojiščainkubiramo 2 dni pri 55 oC.

Gojišče DTA vsebuje glukozo in indikator spremembe pH bromkrezol vijolično in zato po inkubacijilahko določimo:

Št. KFS tako da preštejemo rumene kolonije in izračunamo N=število rumenih kolonij/2 (cfu/ml)

Št. FS tako, da preštejemo kolonije, ki niso rumene barve in izračunamo N= število ne-rumenihkolonij/2 (cfu/ml)


30

4.3.3.1.7 TERMOFILNE ANAEROBNE SPOROGENE BAKTERIJEMed termofilnimi anaerobnimi sporogenimi bakterijami določamo dve skupini kvarljivcev:

• Anaerobni kvarljivci, ki ne tvorijo H2S - TAS

• Anaerobni kvarljivci, ki tvorijo H2S – H2S-tvorci

Matično raztopino segrevamo 5 min pri 100 oC. TAS določimo enako kot sulfitreducirajoče klostridije(4.1.6), le da je anaerobna inkubacija gojišča ISA 3-5 dni pri 55 oC in po inkubaciji preštejemo belekolonije. H2S-tvorce določimo enako kot sulfitreducirajoče klostridije (4.1.6), le da je anaerobnainkubacija gojišča ISA 3-5 dni pri 55 oC in po inkubaciji preštejemo črne kolonije.

4.3.3.1.8 PROTEOLITIČNE ANAEROBNE SPOROGENE BAKTERIJEMed mezofilnimi anaerobnimi sporogenimi kvarljivci določamo PAS tako, da matično raztopinosegrevamo 5 min pri 100 oC. Nato v 10 ml na 50 oC hranljivega agarja (PC, plate count) vmešamo 1ml sterilnega mleka in nato dodamo 1 ml matične raztopine vzorca ter vsebino previdno premešamo.Ko se gojišče strdi, ga prelijemo z 2 % agarjem in inkubiramo 3 dni pri 37 oC. pozitiven rezultat soepruvete z belimi kolonijami, razpokanim gojiščem in/ali izrazito neprijetnim vonjem.

4.3.4 BAKTERIJE VRSTE Bacillus cereus

Bakterije vrste Bacillus cereus so grampozitivne, sporogene, aerobne ali fakultativno anaerobnepalčke. Običajno so prisotne v zemlji, vodi, prahu, na rastlinah. Minimalna temperatura za rast jeokoli 5 oC, maksimalna pa okoli 50 oC. Sintetizirajo lecitinazo, proteolitične encime, toplotno labilen intoplotno stabilen enterotoksin. Toplotno labilen enterotoksin (inaktivacija po 30 min pri 56 oC)sintetizirajo celice med eksponencialno fazo rasti. Emetični enterotoksin je toplotno stabilen, celicega sintetizirajo med stacionarno fazo rasti. Prisotnost bakterij vrste Bacillus cereus v nižjihkoncentracijah v mnogih živilih je normalna, ker so te bakterije normalno prisotne v okolju. Pogostoso te bakterije v živilih kot so: riž, krompir, testenine, mesne, zelenjavne jedi, mleko, pudingi, juhe.Nevarnost predstavljajo omenjena živila, kontaminirana z bakterijami vrste Bacillus cereus, ki sopuščena dalj časa na sobni temperaturi. Do zastrupitve z živili pride navadno takrat, ko sekoncentracija bakterij vrste Bacillus cereus poviša na 107 cfu/g.

4.3.4.1 DOLOČANJE BAKTERIJ VRSTE Bacillus cereusIZOLACIJA

Za kvantitativno določitev bakterij vrste Bacillus cereus pripravimo matično raztopino in ustreznerazredčitve. Na selektivno gojišče cepimo v paralelkah po 0,1 ml MR ali ustreznih razredčitev. Postandardu ISO 7932 (2004) se za izolacijo uporablja gojišče Bacillus cereus, ki ga 18 – 24 urinkubiramo pri 30 oC.

Gojišče Bacillus cereus agar (BC):


31

Gojišče BC vsebuje manitol, polimiksin B, indikator fenol rdeče ali bromtimol modro in jajčnirumenjak. Polimiksin B inhibira rast drugih bakterij, bromtimol modro je indikator izkoriščanjamanitola, z jajčnim rumenjakom pa se določa lecitinazna aktivnost.

Značilne kolonije za bakterije vrste B. cereus:

Velike kolonije s premerom okoli 5 mm in nazobčanim robom, modro zelene barve, ker nefermentirajo manitola (alkalna reakcija), kolonije so obdane z izrazito motno cono gojišča, ki je enakebarve kot kolonije, kar kaže na precipitacijo hidroliziranega lecitina in nastanek netopnegadiacilglicerola.

POTRDITEV / IDENTIFIKACIJA

Kolonije značilne za bakterije vrste Bacillus cereus potrdimo tako, da jih precepimo v tekoče gojiščeMR-VP, tekoče gojišče za redukcijo nitrata in krvni agar za ugotavljanje hemolize. Gojišča 24 urinkubiramo pri 30 oC. Odčitavanje rezultatov:

Test MR – tvorba kislin(e) iz glukoze: Gojišče MR-VP dobro premešamo in polovico prelijemo vnovo epruveto. V prvi epruveti dokažemo z indikatorjem metil rdeče tvorbo kisline iz glukoze.

Test VP – tvorba acetoina iz glukoze: V drugi epruveti iz gojišča MR-VP dokažemo tvorboacetoina z dodatkom α-naftola, raztopine KOH in kristalčki kreatinina, dobro premešamo in v eniuri nastane eozin rdeča barva.

Redukcija nitrata: V gojišče dodamo 0,2 do 0,5 ml nitritnega reagenta in v 15 min se gojiščezaradi nitrita obarva rdeče.

Krvni agar: Za bakterije vrste Bacillus cereus je značilno, da tvori velike sive kolonije z α-hemolizo.

Mikroskopiranje: Naredimo dva mikroskopska preparata, po Gramu in po Schaeffer-Fultonu (Vajepri predmetu Živilska mikrobiologija).

4.3.5 BAKTERIJE RODU Alicyclobacillus

Bakterije rodu Alicyclobacillus so grampozitivne, termofilne in acidofilne, fakultativno anaerobne,sporogene palčke, ki lahko rastejo v širokem območju pH (2 do 6) in vsebujejo ω-alicikličnemaščobne kisline kot glavne sestavine membrane. Ravno te maščobne kisline naj bi bile odgovorneza veliko odpornost bakterij rodu Alicyclobacillus proti kislim razmeram in visokim temperaturam.Spore tvorijo terminalno ali sub-terminalno. Optimalna temperatura za rast je med 42 in 60 oC,odvisno od vrste, rastejo pa vse v območju od 12 do 80 oC. Rod Alicyclobacillus vsebuje 18 vrst inmed njimi so kot kvarljivci živil najpogostejše vrste A. acidocaldarius, A. acidiphilus, A.acidoterrestris, A. cycloheptanicus in A.hesperidum. Pogosta razloga za kvar živil, ki ga povzročajobakterije rodu Alicyclobacillus, sta nesprejemljiv okus in/ali vonj do katerega pride zaradi priokusa innestabilnosti svežih predelanih ali pakiranih živil. Glavni neželeni produkti, ki jih tvorijo te bakterijeso gvajakol in halofenoli.


32

Bakterije rodu Alicyclobacillus so kot povzročitelje kvara jabolčnega soka odkrili šele leta1984. Dodanes so se te bakterije kot povzročitelji kvara pojavljale v različnih sadnih sokovih, mešanih sadnihsokovih, gaziranih sadnih pijačah, sadnih kašah, stekleničeni vodi z okusom, različnih napitkih in vkonzervah paradižnika.

4.3.5.1 DOLOČANJE BAKTERIJ RODU AlicyclobacillusOBOGATITEV

Po standardni metodi IFU se za obogatitev določeni masi živila doda 9x-no količino tekočegaobogatitvenega gojišča BAT, vsebino se premeša in 5 dni inkubira pri 45 °C.

IZOLACIJA

Če določamo bakterije direktno v vzorcu potem pripravimo matično raztopino in jo 1 uro segrevamopri 60 oC. Po inkubaciji obogatitvenega gojišča ali po segrevanju matične raztopine nacepimosuspenzijo na trdi gojišči BAT in PC (angl. plate count agar) (0,1 ml za kvantitativno določitev inizolacija s cepilno zanko za kvalitativno določitev). Gojišča inkubiramo 3-5 dni pri 45 °C.

Kadar je vzorec tekoč, lahko 100 ml predhodno segretega vzorca (ali večji volumen) filtriramo skozifilter (0,45 μm ali 0,2 μm, če iščemo spore ) in filter aseptično položimo na gojišče BAT. Gojiščeinkubiramo 3-5 dni pri 45 °C. Vse kolonije iz gojišča BAT nato precepimo na gojišče PC invzporedno na gojišče BAT. Gojišča inkubiramo 3-5 dni pri 45 °C. Bakterije rodu Alicyclobacillustvorijo na gojišču BAT beige kolonije velike od 0,5 do 3 mm z rahlo nazobčanim robom, medtem kona gojišču PC ne rastejo.


Za potrditev rodu Alicyclobacillus naredimo barvna preparata po Gramu in po Schaffer-Fultonu.Bakterije rodu Alicyclobacillus tvorijo grampozitivne palčke, ki vsebujejo spore.

Metoda različnih temperatur rasti:

Ta metoda temelji na lastnosti bakterij vrste A. acidoterrestris nižjo optimalno temperaturo rasti vprimerjavi z drugimi vrstami tega rodu. Metoda omogoča v 24 urah določitev vrst A. acidocaldarius inA. acidoterrestris, A. acidiphilus in A. hesperidum. Iz gojišča BAT precepimo kolonijo na dve novigojišči BAT in eno ploščo 24 ur inkubiramo pri 45 °C, drugo pa pri 65 °C.

rast pri 45 °C in ne pri 65 °C pomeni, da gre za vrsto A. acidoterrestris

rast pri 65°C in ne pri 45 °C pomeni, da gre za vrsto A. acidocaldarius

rast pri obeh temperaturah pomeni, da so v vzorcu bakterije obeh vrst A. acidoterrestris in A.acidocaldarius

če rasti ni pri nobeni od testiranih temperatur pomeni, da v vzorcu ni bakterij vrst A.acidoterrestris in A. acidocaldarius, ampak so v vzorcu bile prisotne druge vrste bakterij iz roduAlicyclobacillus.


33

Za identifikacijo posameznih vrst izvedemo biokemijske teste API 50 CH. Test API 50 CH jesestavljen iz 49 substratov z različnimi viri ogljika in negativne kontrole. Celice bakterij roduAlicyclobacillus nacepimo v tekoče gojišče BAM in to suspenzijo nato dodamo v test API 50 CHPloščice 24 do 48 ur inkubiramo pri 45 °C ali 65 °C. Rast bakterij in izkoriščanje sladkorjev se kaže vspremembi barve (iz modre v rumeno). Rezultate kot + in - vnesemo v podatkovno bazo, in pridoločeni verjetnosti določimo vrsto.

4.3.6 BAKTERIJE RODU Clostridium

Bakterije rodu Clostridium so grampozitivne, obligatno anaerobne sporogene palčke. Celice sepojavljajo posamezno, v parih, kratkih verižicah. Spore so centralne ali pa subterminalne. Rodvsebuje preko 100 vrst. Sulfitreducirajoči klostridiji so sposobni reducirati Na-sulfit (izvor žvepla) dovodikovega sulfida. Ta se veže z železovimi ioni (ki je lahko sestavina gojišča) v železov sulfid, ki ječrne barve (indikator prisotnosti sulfitreducirajočih klostridijev).

Bakterije vrste Clostridium perfringens so v naravi zelo razširjene. Prisotne so v prsti, vodi, prahu,prebavnem traktu ljudi in živali. So mezofilne bakterije, optimalna temperatura za rast je med 37 oCin 45 oC, minimalna okoli 20 oC in maksimalna okoli 50 oC. Rastejo v območju vrednosti pH med 5,0in 8,5. Ob prisotnosti več kot 5% NaCl je rast inhibirana.

Na podlagi sinteze enterotoksinov jih delimo v pet skupin A, B, C, D in E. V živilih je običajnoprisoten sev Cl. perfringens, ki sintetizira enterotoksin A, včasih tudi C. Enterotoksin, ki gasintetizirajo sevi tipa A, je občutljiv na toploto (inaktivacija po 10 minutnem segrevanju pri 60 oC).Celice ga običajno sintetizirajo istočasno kot tvorijo spore. Bakterije vrste Cl. perfringens v živilihobičajno ne tvorijo spor, ampak tvorijo spore potem ko pridejo v prebavni trakt. Zato se v živilih iščetako vegetativne oblike kot spore, saj se te bakterije lahko v živilu namnožijo do večjega števila inkasneje po užitju živila povzročijo okužbo ali zastrupitev.

Bakterije vrste Cl. perfringens so pogosto v mesu in mesnih izdelkih, perutnini, komercialnopripravljeni zmrznjeni hrani, sadju in zelenjavi, začimbah, ribah, školjkah, dehidriranih juhah.Nevarnost predstavljajo živila, ki so bila pripravljena dan ali več pred uživanjem. Kadar pride dozastrupitve, je v živilu več kot 100 – 1000 cfu/g bakterij vrste Cl. perfringens.

4.3.6.1 DOLOČANJE BAKTERIJ VRSTE Clostridium perfringens

IZOLACIJA

Za kvantitativno določitev vegetativnih oblik in spor bakterij vrste Cl. perfringens pripravimo matičnoraztopino in ustrezne razredčitve. Na selektivno gojišče cepimo v paralelkah po 0,1 ml MR aliustreznih razredčitev ali pa cepimo po 1 ml MR in ustrezne razredčitve v paralelkah v praznepetrijevke in umešamo s stopljenim na 47oC ohlajenim selektivnim gojiščem. Kadar določamo lespore bakterij vrste C. perfringens matično raztopino segrevamo 20 min pri 75 oC (Downes in Ito,2001), nato pripravimo razredčitve in jih cepimo kot pri določitvi vegetativnih oblik in spor.


34

Po standardu ISO 7937 (1997) se za izolacijo uporablja gojišče SICA (egg yolk free tryptosesulphite iron citrate cycloserine agar), na katerem po anaerobni inkubaciji po 24 urah pri 35 oC ali 37oC zrastejo za Cl. perfringens značilne črne kolonije (zaradi redukcije sulfita in izločanja železovegasulfida). Ker je v gojišču cikloserin, je inhibirana rast enterokokov, ki so v nekaterih živilih prisotni vvečjih koncentracijah, in lahko prerastejo kolonije klostridijev. Črne kolonije na SICA tvorijo tudi drugisulfitreducirajoči klostridiji kot so Cl. bifermentans, Cl. botulinum, Cl. paraperfringens, Cl. sardinesein Cl. sporogens.

Poleg gojišča SICA se uporablja še veliko selektivnih, diferencialnih gojišč kot so neomicin krvniagar (NKA), sulfit polimiksin sulfadiazin agar (SPS), tripton-sulfit neomicin agar (TSN), železovsulfitni agar (ISA) in drugi (Downes in Ito, 2001). Selektivnost gojišč je dosežena z dodatkomrazličnih antibiotikov, večina gojišč vsebuje tudi železo in sulfit, saj klostridiji reducirajo sulfit dosulfida in ta z železom tvori železov sulfid, ki da značilno črno barvo kolonijam klostridijev.

Rast kolonij na gojišču SPS po 24 urni anaerobni inkubaciji na 35 oC ali 37 oC:

Cl. perfringens črne kolonije

Cl. sporogens črne kolonije

Dobro rastejo tudi bakterije vrst Streptococcus faecalis in Staphylococcus aureus.

Rast kolonij v gojišču ISA po 3 do 5 dnevni anaerobni inkubaciji na 35 oC ali 37 oC:

Vsi sulfitreducirajoči klostridiji tvorijo črne kolonije, saj reducirajo Na-sulfit, pri čemer nastanevodikov sulfid, ta pa se veže z železovimi ioni (Fe-sulfid je črne barve). Anaerobne sporogenebakterije, ki ne reducirajo Na-sulfita, tvorijo bele kolonije.


Do 5 značilnih kolonij prenesemo iz selektivnega gojišča s cepilno zanko v tekoče tioglikolatnogojišče, homogeniziramo in 4 ure inkubiramo v vodni kopeli pri 44 oC ali 12-18 ur pri 35 oC ali 37 oC.Odčitavanje rezultatov:

Naredimo barvni preparat po Gramu in mikroskopiramo; za bakterije vrste Cl. perfringens soznačilne velike grampozitivne palčke, barvni preparat za spore ne delamo, ker endosporklostridiji v tem gojišču ne tvorijo.

S cepilno iglo cepimo v poltrdno gojišče za določanje gibljivosti in redukcijo nitrata, 24 urinkubiramo pri 35 oC ali 37 oC. Bakterije vrste Cl. perfringens so negibljive in rastejo le ob vbodu,rdeča ali rdeče oranžna barva pa pomeni, da reducirajo nitrat do nitita.

S cepilno zanko cepimo v gojišče z laktozo in želatino, 24 do 44 ur inkubiramo pri pri 35 oC ali37 oC. Bakterije vrste Cl. perfringens izkoriščajo laktozo (plin in kislina; barva se spremeni izrdeče v rumeno) in utekočinijo želatino.

Po 0,15 ml kulture iz tioglikolatnega gojišča precepimo v gojišči z rafinozo in salicinom, 24 urinkubiramo pri 35 oC ali 37 oC. Bakterije vrste Cl. perfringens ne fermentirajo salicina, iz rafinozepa tvorijo kislino brez plina.


35

Direktno iz selektivnega gojišča lahko značilno kolonijo prenesemo tudi na dve gojišči krvnegaagarja, ki ju 24 ur inkubiramo pri pri 35 oC ali 37 oC, eno ploščo aerobno in drugo anaerobno.Ugotovitev grampozitivnih palčk s sporami ali brez njih in hemoliza na KA, ki je bil inkubirananaerobno, ter odsotnost rasti na KA, ki je bil inkubiran aerobno, velja kot domnevno pozitivenrezultat prisotnosti sulfitreducirajočih klostridijev


36

5 RAZLIČNOST MIKROBNIH IZOLATOV

Identifikacija bakterijskih izolatov do nivoja rodu oziroma vrste je pogosto dovolj, da lahko določimokontaminacijo vzorca s patogenimi mikroorganizmi ali s kvarljivci. Velikokrat pa je potrebno mikrobneizolate grupirati še znotraj posamezne vrste – v ta namen se poslužujemo različnih načinovtipizacije. Tipizacija izolatov je tako nujna v pri ugotavljanju izvora(ov) kontaminacije, načina(ov)širjenja kontaminacije in to ne le pri epidemioloških študijah ki zajemajo tipizacijo patogenih ampaktudi pri vrednotenju kvara živil.

Klasične metode tipizacije vključujejo serotipizacijo, fagotipizacijo, določanje odpornosti izolatovproti antibiotikom, ipd., novejše molekularne metode pa temeljijo na preiskavah plazmidov in DNK(restrikcijska encimska analiza – REA, elektroforeza v pulzirajočem električnem polju – PFGE,ribotipizacija, pomnoževanje delov DNK z naključno izbranimi oligonukleotidnimi začetniki – RAPD,AFLP, rep-PCR, PCR-RFLP, ipd).

Če želimo s tipizacijo določiti podobnost oziroma različnost posameznih izolatov, mora metodatipizacije v čim večji meri izpolnjevati naslednje zahteve:

metoda naj bi bila univerzalno uporabna tako, da je mogoče z njo tipizirati čim več izolatov

metoda naj bi bila dobro ponovljiva, saj so le tako rezultati različnih laboratorijev lahko primerljivi

metoda naj bi imela čim večjo moč razlikovanja epidemiološko nesorodnih izolatov oz.omogočala določitev epidemiološko sorodne izolate

rezultati tipizacije naj bi se enostavno tolmačili

metoda tipizacije naj bi bila čim hitrejša ter cenovno in delovno ugodna.

5.1 RAZLIKOVANJE IZOLATOV BAKTERIJ VRSTE L. monocytogenesZ rep-PCR

Večino primerov in izbruhov listerioze pri ljudeh povzročijo bakterije vrste L. monocytogenes inglavna pot okužbe pri ljudeh je uživanje kontaminiranih živil. Prisotnost bakterij vrste L.monocytogenes v mnogih živilih je pogosto posledica navzkrižne kontaminacije končnih izdelkov.Rezultat določanja bakterij vrste L. monocytogenes izoliranih iz živil, iz okolja in iz kliničnih vzorcevje identifikacija izolata do vrste. Če želimo proučiti izvor, ali določiti pot širjenja izolata, ali določiti inspremljati možne rezervoarje listerij morajo preiskave vključevati dodatne metode, s katerimi selahko razlikuje seve bakterij vrste L. monocytogenes. Te raziskave temeljijo na predpostavki, da sosevi organizma, ki je povzročil kontaminacijo/okužbo sorodni, kar pomeni, da imajo sevi podobne aliidentične fenotipske in molekularne lastnosti. Zato metode uporabljene za take preiskave temeljijona določanju specifičnih proteinov ali specifičnih genov, ki so časovno stabilni, in prehajajo iz ene vdrugo generacijo. Različne metode tipizacije izolatov bakterij vrste L. monocytogenes so torej orodjeza iskanje poti širjenja bakterij in tako tudi ugotavljanja vira okužbe pri ljudeh ali kontaminacije živil.


37

Klasični metodi za tipizacijo listerij sta serotipizacija in fagotipizacija. Večina humanih kliničnih inživilskih sevov vrste L. monocytogenes sodi v serotipe 1/2a, 1/2b ali 4b. Slaba stran fagotipizacije jev tem, da vseh sevov ni mogoče tipizirati. Obe metodi imata zato omejeno vrednost in številniraziskovalci so v zadnjih dvajsetih letih uporabili različne molekularne metode, s katerimi so želelipreseči omenjene probleme. Med molekularnimi tipizacijskimi metodami imajo prednost tiste, kitemeljijo na preiskavah mikrobnega genotipa. Ker se pri bakterijah vrste L. monocytogenes plazmidipojavljajo relativno redko, se za tipizacijo teh bakterij največkrat uporabljajo preiskave kromosomskeDNK. Med molekularnimi tipizacijskimi metodami so največkrat uporabljene makrorestrikcijskaanaliza z PFGE (elektroforeza v pulzirajočem električnem polju), restrikcijska encimska analiza REAin različne metode, ki temeljijo na verižni reakciji s polimerazo (PCR).

Tipizacijsko metodo rep-PCR (angl. repetitive-sequence based-PCR) je uvedel Versalovic s sod.(1991). Z njo se pomnožujejo odseki DNK med ponavljajočimi se zaporedji REP (angl. repetitiveextragenic palindrome) in ERIC (angl. enterobacterial repetitive intergenic consensus). Velikostpomnožkov je odvisna od razporeditve ponavljajočega se zaporedja v genomu. Pri rep-PCR nastanevzorec DNK, ki kaže prisotnost ponovljivega zaporedja na določenih mestih DNK. Dobljeni vzorciDNK omogočajo razlikovanje bakterijskih vrst in sevov znotraj ene bakterijske vrste. Rep-PCR je biluporabljen za razlikovanje mnogih mikroorganizmov in tudi za tipizacijo sevov bakterij vrste L.monocytogenes. Metoda rep-PCR ima veliko moč razlikovanja sevov, dobro ponovljivost in je vprimerjavi z metodo PFGE izvedbeno enostavnejša.

5.1.1 TIPIZACIJA IZOLATOV BAKTERIJ VRSTE L. monocytogenes Z rep-PCRIZOLACIJA BAKTERIJ VRSTE L. monocytogenes (glej 3.4.1)

IDENTIFIKACIJA BAKTERIJ VRSTE L. monocytogenes (glej 3.4.1)

5.1.1.1 PRIPRAVA DNK IZOLATOV BAKTERIJ VRSTE L. monocytogenesDNK vseh izolatov (izolate označimo z arabskimi številkami) izoliramo po postopku, ki ga navajakomplet PrepMan™ Ultra sample preparation reagent (Vaje pri predmetu Toksikologija inkontaminacija živil):

1. V 1,5 ml epruveto dodamo 500 µl H20KEM in vanjo 1 kolonijo ter vsebino 30 s mešamo navrtinčnem mešalu

2. Vsebino centrifugiramo 3 min pri 13.000 x g, supernatant odstranimo

3. Dodamo 100 µl reagenta PrepMan ter vsebino 30 s mešamo na vrtinčnem mešalu

4. Vzorec segrevamo 10 min v vodni kopeli pri 95 oC

5. Vsebino centrifugiramo 3 min pri 13.000 x g

6. Supernatnat prenesemo v svežo 1,5 ml epruveto

7. Lizat do uporabe hranimo pri 4 oC (do 1 meseca)


38

5.1.1.2 IZVEDBA rep-PCRPRIPRAVA REAKCIJSKE MEŠANICE

Reakcijsko mešanico za rep-PCR pripravimo za vse vzorce skupaj (N vzorcev + 1 rezervni vzorec)in jo nato razdelimo v reakcijske epruvetke. V reakcijski mešanici je za 1 vzorec je :

• pufer PCR 10x: 2,5 µl

• MgCl2 (1,5 mM): 1,5 µl

• dNTP (200 µM): 5 µl

• oligonukleotidna začetnika

o rep1R-I (100 p mol) 1 µl

o rep2-I (100 p mol) 1 µl

• polimeraza (2U) 0,4 µl

• H2OPCR: izračunamo (skupen volumen je 25 µl, od tega je 2 µl DNK)

Reakcijsko mešanico razdelimo v epruvetke za PCR in dodamo po 2 µl pripravljene DNK

IZVEDBA rep-PCR

Epruvetke za PCR postavimo v aparat za PCR in izvedemo pomnoževanje DNK po naslednjemčasovno temperaturnem programu:

1 cikel: 95°C, 3 min;

30 ciklov: denaturacija 90°C 30 s, prileganje 40°C 1 min, pomnoževanje 72°C 1 min;

1 cikel: 72°C 8 min

PRIPRAVA AGAROZNEGA GELA IN POMNOŽKOV

Priprava 1,5 % agaroznega gela:

Zatehtajte 0,96 g agaroze ME, dodajte 60 ml pufra TEA 1x (TEA 10x 0,4 M Tris, 0,2 M ocetnakislina, 0,02 M Na2EDTA, pH 8,1), segrejte v mikrovalovni pečici do vrenja oziroma toliko časa, dapostane raztopina bistra, ohladite na 60 o C. V model za gel dodajte elektroforezni glavnik in gel vlijtev model. Počakajte 15 – 30 minut, da se gel strdi in polimerizira.

Priprava pomnožkov:

V 1,5 ml-epruvetke odpipetirajte 2 μl barvila za nanos pomnožkov (loading buffer), nato dodajte po 8μl vzorcev pomnožkov in previdno premešajte tako, da se ne tvorijo mehurčki.


39

AGAROZNA ELEKTROFOREZA

Agarozni gel postavite v elektroforezo s pufrom TEA 1x, v prvi prostorček odpipetirajte 4 μl raztopinemolekularnega označevalca, v naslednje luknjice odpipetirajte po 9,5 μl pripravljenih raztopinpomnožkov. Nanos vzorcev v gel naj bo čim hitrejši. Elektroforeza: 4 V/cm.

Barvanje agaroznega gela in dokumentiranje:

Po končani elektroforezi gel barvate z raztopino etidijevega bromida. Etidijev bromid je strupena,mutagena in teratogena kemikalija, zato se barvanje izvaja v posebnem prostoru. Obvezna jeuporaba zaščitne obleke. Po 10 minutah prenesete gel za nekaj minut v vodo in nato natransiluminator. Z UV svetlobo presvetlite gel in ga slikajte.

5.1.1.3 VREDNOTENJE REZULTATOV rep-PCRRezultati rep-PCR za posamezen sev – »fingerprint« - so vzorci dobljenih pomnožkov. Vzorceprimerjamo med seboj in določimo relativno podobnost oziroma različnost posameznega izolata.Primerjamo število pomnožkov, razporeditev pomnožkov in v primeru normalizacije DNK pred PCRtudi količino posameznega pomnožka.

GDxy = (Nx + Ny)(Nx + Ny + Nxy)Legenda:

GDxy relativna genetska podobnost sevov x in y (/)

Nx število pomnožkov seva x

Ny število pomnožkov seva y

Nxy število pomnožkov enakih pri sevih x in y


40

6 LABORATORIJSKI DNEVNIK


41

7 RAZPORED IN IZVEDBA LABORATORIJSKIH VAJ

Namen:

Pred začetkom vsake laboratorijske vaje, vpišite potek dela v spodnjo shemo.

Časovni potek eksperimentalnega dela laboratorijskih vaj:

Vaja /Datum I. vaja II. vaja III. vaja IV. vaja V. vaja VI. vaja VII. vaja

Naslovvaje

Sk. št. MO,plesni,kvasovke,koliformnebakterije

Campylobacter,Salmonella,Staphylococcusaureus

Ozmofilnekvasovke;kserofilneplesni

MKBBacillus cereusAlicyclobacillus

Tehnološkikvarljivci –sporogenebakterije

Rep-PCR L.monocytogenes

Vzorec /datum


42

8 I. VAJA – INDIKATORSKE SKUPINE MIKROORGANIZMOV

Namen:

V izbranem živilu kvantitativno določite aerobne mezofilne mikroorganizme, kvasovke in plesni,

in koliformne bakterije.

Opis vzorca:

Shema eksperimentalnega dela:


43

Rezultati:

Komentar:


44

9 II. VAJA – PATOGENE BAKTERIJE

Namen:

1. V vzorcu A določite bakterije rodu Salmonella (v 25 g: m=0, M=1, n=5, c=0)

in termotolerantne bakterije rodu Campylobacter (v 1 g: m=103, M=104, n=5, c=2)

2. V vzorcu B določite bakterije vrste Staphylococcus aureus (1 g: m=104, M=105,

n=5, c=2)

Opis vzorcev:

Shema eksperimentalnega dela določitve bakterij rodu Salmonella:


45

Shema eksperimentalnega dela določitve bakterij rodu Campylobacter:

Shema eksperimentalnega dela določitve bakterij vrste Staphylococcus aureus:


46

Rezultati:

Komentar:


47

10 III. VAJA – OZMOFILNE KVASOVKE, KSEROFILNE PLESNI

Namen:

V vzorcu določite ozmofilne kvasovke in kserofilne plesni!

Opis vzorca:



48

Rezultati:

Komentar:


49

11 IV. VAJA – MLEČNOKISLINSKE BAKTERIJE

Namen:

Določite, ali so vzrok kvara vzorca mlečnokislinske bakterije!

Opis vzorca:



50

Rezultati:

Komentar:


51

12 V. VAJA – SPOROGENE BAKTERIJE

Namen:

1. Določite v vzorcu A bakterije vrste Bacillus cereus v koncentraciji, ki bi lahko bila

vzrok zastrupitve!

2. V vzorcu B določite bakterije rodu Alicyclobacillus!

Opis vzorcev:

Shema eksperimentalnega dela za bakterije vrste Bacillus cereus:

Shema eksperimentalnega dela za bakterije rodu Alicyclobacillus:


52

Rezultati:

Komentar:


53

13 VI. VAJA – TEHNOLOŠKI KVARLJIVCI

Namen:

V vzorcu določite tehnološke kvarljivce!

Opis vzorca:



54

Rezultati:

Komentar:


55

14 VII. VAJA – TIPIZACIJA

Namen:

Določite relativno podobnost sevov bakterij vrste Listeria monocytogenes izoliranih iz

surovin, vzorcev proizvodnega okolja, embalaže, in končnega izdelka!

Opis vzorcev:



56

Rezultati:

Komentar:


57

15 NAVODILA ZA VARNO DELO

Pri izvedbi laboratorijskih vaj dosledno upoštevajta osnovna navodila varnega dela in podrobnanavodila, predstavljena pri posamezni laboratorijski vaji:

V laboratoriju vedno nosite zaščitne halje. V laboratoriju je prepovedano kajenje ter uživanje hrane in pijač. Na delovnem pultu je samo material, ki ga potrebujete za izvedbo preiskave. Okna in vrata morajo biti med eksperimentalnim delom zaprta zaradi nevarnosti

kontaminacije. Pri delu vedno uporabljate aseptično tehniko. Plinske gorilnike na začetku in ob koncu dela odpre in zapre vodja vaje oziroma tehnik. Pri delu ob plinskem gorilniku bodite pazljivi in zbrani. Če pridete do neposrednega kontakta z mikroorganizmi, to takoj sporočite vodji vaj oziroma

tehniku. Če pride do kontaminacije okolja, mesto najprej razkužite, sperete z vodo in obrišete s

papirnato brisačo. Kontaminirano steklovino in plastične nastavke za avtomatske pipete odlagajte v pripravljene

košare oziroma posode z razkužili. V smetnjak nikoli ne odvrzite smeti, ki so kontaminirane z mikroorganizmi. Mikroorganizmov ne smete odnašati iz mikrobiološkega laboratorija. Z aparati (mikroskop, pH-meter, PCR-aparat,…) ravnajte pazljivo; pazite, da bodo po

končanem delu očiščeni in ugasnjeni. Mikroskopske preparate ne mečite v smeti, ampak v pripravljene posode z razkužili. Po končanem delu pospravite delovni pult in ga razkužite. Po končanem delu razkužite roke, jih temeljito operete z vodo in milom ter posušite s

papirnato brisačo. Z zdravju škodljivimi in strupenimi snovmi delajte v digestoriju. Pri delu bodite zbrani in pazljivi.

Rezultate in opažanja zapisujte v delovni zvezek


58

16 VIRI

http://www.hc-sc.gc.ca/fn-an/res-rech/analy-meth/microbio/volume1/index-eng.php

http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualBAM/default.htm

6.International Commission on Microbiological Specifications for Foods. 1986. Microorganisms in Foods. 2.Sampling for Microbiological Analysis:Principles and Specific Applications, 2nd ed. University of TorontoPress, Toronto, Ontario, Canada.

On L. W. S. Taxonomy, phylogeny and methods for the identification of Campylobacter species. V:Campylobacter Molecular and Cellular Biology. Horizon Bioscience, Norfolk. 2005.13-41.

Downes F. P., Ito K. 2001. Compendium of methods for microbiological examination of foods. 4th edition.Washington, APHA, 659 str.

Harrigan W. F. 1998. Laboratory methods in food microbiology. 3rd edition. London, Academic Press Limited,532 str.

International standard. ISO 7954. 1987. Microbiology - General guidance for the enumeration of yeast andmoulds - Colony count technique at 25oC. 1st ed. Geneve: International Organization for Standardization, 3str.

International standard. ISO 4831. 1991. Microbiology - General guidance for enumeration of coliform - mostprobable number technique. Geneve : International Organization for Standardization, 11 str.

International standard. ISO 4833. 1991. Microbiology - General guidance for the enumeration ofmicroorganisms - Colony count technique at 30 oC. 2nd ed. Geneve: International Organization forStandardization, 4 str.

International standard. ISO 6579. 1993. Microbiology - General guidance on methods for the detection ofSalmonella. 3rd ed. Geneve: International Organization for Standardization, 1993. - IV, 16 str.

International standard. ISO 7251. 1993. Microbiology - General guidance for enumeration of presumptiveEscherichia coli - most probable number technique. 2nd ed. Geneve: International Organization forStandardization, 7 str.

International standard. ISO 7218. 1996. Microbiology of food and animal feeding stuffs - General rules formicrobiological examination. - 2nd ed., Geneve: International Organization for Standardization, 43 str.

International standard. ISO 11290-1. 1996. Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal methodfor the detection and enumeration of Listeria monocytogenes. Part 1, Detection method. 1st ed. Geneve:International Organization for Standardization, 16 str.

International standard. ISO 7937. 1997. Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method forenumeration of Clostridium perfringens : colony-count technique. - 2nd ed. - Geneve : InternationalOrganization for Standardization, 10 str.

International standard. ISO 6887-1. 1999. Microbiology of food and animal feeding stuffs - Preparation of testsamples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination. Part 1, Genearal rules forthe preparation of the initial suspension and decimal dilutions. - 1st ed. - Geneve: International Organizationfor Standardization, 5 str.

http://www.hc-sc.gc.ca/fn-an/res-rech/analy-meth/microbio/volume1/index-eng.php

http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnalyticalManualBAM


59

International standard. ISO 6579. 2002. Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method forthe detection of Salmonella spp. 4th ed. Geneve: International Organization for Standardization, 27 str.

International standard. ISO 11290-1. 2004. Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal methodfor the detection and enumeration of Listeria monocytogenes. Part 1, Detection method. Amendment 1,Modification of the isolation media and the haemolysis test, and inclusion of precision data. - Geneve:International Organization for Standardization, 13 str.

International standard. ISO 7932. 2004. Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontal method forenumeration of presumptive Bacillus cereus : colony-count technique at 30 oC. 3rd ed. Geneve: InternationalOrganization for Standardization, 8 str.

International standard. ISO 21528-1. 2004. Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontalmethods for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae. Part 1, Detection and enumeration byMPN technique with pre-enrichment. 1st ed. Geneva: International Organization for Standardization, 12 str.

International standard. ISO 21528-2. 2004. Microbiology of food and animal feeding stuffs - Horizontalmethods for the detection and enumeration of Enterobacteriaceae. Part 2, Colony-count method. 1st ed.Geneva : International Organization for Standardization, 10 str.

Jeršek B. Praktikum mikrobiološke analize: skripta in delovni zvezek za študente IV. letnika živilstva. 2008.Barbara. Ljubljana: Biotehniška fakulteta, Oddelek za živilstvo, Katedra za živilsko mikrobiologijo, 45 str.

Slovenski standard SIST EN ISO 6888-2.1999. Mikrobiologija živil in krmil. Horizontalna metoda štetjekoagulazno pozitivnih stafilikokov (Staphylococcus aureus in drugih vrst). 2.del, Tehnika uporabe agarja zzajčjo plazmo iz fibrinogenov (ISO 6888-2:1999). 1. izd., 7 str.

Slovenski standard SIST EN ISO 10272-1:2006. 2006 Mikrobiologija živil in krmil. Horizontalna metoda zaugotavljanje prisotnosti in števila Campylobacter spp. – 1. del: Metoda za ugotavljanje prisotnosti, 16 str.

Zakon o zdravstveni ustreznosti živil in izdelkov ter snovi, ki prihajajo v stik z živili (ZZUIZS). Uradni list RS52/2000; 42/2002

Zakon o spremembah in dopolnitvah določenih zakonov na področju zdravja (ZdZPZ). Uradni list RS 47/2004

Navodila in delovni zvezek za vaje Mikrobiološka analiza

Text of Navodila in delovni zvezek za vaje Mikrobiološka analiza

DELOVNI ZVEZEK IZOBRAŽEVALNEGA PROGRAMA ......1 DELOVNI ZVEZEK IZOBRAŽEVALNEGA PROGRAMA FINANČNA PISMENOST ZA ROME PREDSTAVITEV PROJEKTA FINALLY Motivacija projektnih partnerjev

Prva matematika, samostojni delovni zvezek, 1. del

Analiza delovnih zvezkov za matematiko in slovenščino v 3 ... · učbenik, v večini primerov jih dopolnjujejo tudi spletne zbirke nalog. Samostojni delovni zvezek je delovni zvezek,

Prva matematika, samostojni delovni zvezek v 2. delih

Spoznavanje okolja 2-delovni zvezek-listanje

Glasba 8, samostojni delovni zvezek po posodobljenem UN

rešitve za delovni zvezek za zgodovino za 7. razred osnovne šole

Rešitve DELOVNI ZVEZEK

Druga matematika, samostojni delovni zvezek v 2. delih

Zgodovina 6, samostojni delovni zvezek

Matematika 6, samostojni delovni zvezek, 2. del

razred: 1. Delovni zvezek risalnimi - Arnes

TS9-RESITVE Delovni Zvezek

Slovenščina 3, S slikanico na rami, delovni zvezek za jezik

J. Pečar Kako živimo v regijah Delovni zvezek 1/2017, let ...Delovni zvezek 1/2017, let. XXVI Objava in povzemanje prispevkov sta dovoljena delno ali v celoti z navedbo vira. Avtorstvo

Fit delovni zvezek

Samostojni delovni zvezek Radovednih pet 4 MA SDZ 2018 resitve 1 del.pdf · 1. del Matematika 4 Radovednih pet Samostojni delovni zvezek Rešitve Opombe v Rešitvah, napisane z zeleno

Slovenščina 9, samostojni delovni zvezek v 2 delih

Matematika 6, samostojni delovni zvezek, 1. del

S slikanico na rami 2, delovni zvezek za jezik in književnosti

DELOVNI ZVEZKI DELOVNI UČBENIKI 1. razred 2016/2017 · 2019. 7. 5. · UČBENIKI 4. razred ... HAPPY STREET 2. New Edition. Delovni zvezek za angleščino v 5. razredu devetletnega

Raziskujem preteklost 6: samostojni delovni zvezek Ostanki

Procesno računanje II (delovni zvezek)

SEZNAM UČBENIKOV, DELOVNIH ZVEZKOV IN UČNIH ...DELOVNI ZVEZEK/GRADIVO PREDMET CENA V. Manfreda Kolar, M. Urbančič Jelovšek: PRVA MATEMATIKA, 1. del, samostojni delovni zvezek

Glasba 7, samostojni delovni zvezek z rešitvami

Druzba 4, delovni zvezek

Delovni zvezek DVGW G 1020 - Zemeljski plin DZP_Strokovno srecanje DVGW_G_1020_LJ MONS 22 in...– Delovni zvezek G 1020 dopolnjuje tehnične predpise DVGW na področju zagotavljanja

Moja prva fizika 1, delovni zvezek, rešitve nalog

SMC 3 - delovni zvezek

delovni zvezek - ucilnice.arnes.si

Documents

Navodila in delovni zvezek za vaje Mikrobiološka analiza

Text of Navodila in delovni zvezek za vaje Mikrobiološka analiza