Universidade de So Paulo Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz

Investigao da microbiota endoftica onipresente em microplantas axnicas

Natalia Pimentel Esposito Polesi

Dissertao apresentada para obteno do ttulo de Mestre em Cincias. rea de concentrao: Fisiologia e Bioqumica de Plantas

Piracicaba 2010

Natalia Pimentel Esposito Polesi Engenheiro Agrnomo

Investigao da microbiota endoftica onipresente em microplantas axnicas

Orientador: Prof. Dr. MARCLIO DE ALMEIDA

Dissertao apresentada para obteno do ttulo de Mestre em Cincias. rea de concentrao: Fisiologia e Bioqumica de Plantas

Piracicaba 2010

Dados Internacionais de Catalogao na Publicao

DIVISO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAO - ESALQ/USP

Polesi, Natalia Pimentel Esposito Investigao da microbiota endoftica onipresente em microplantas axnicas / Natalia

Pimentel Esposito Polesi. - - Piracicaba, 2010. 120 p. : il.

Dissertao (Mestrado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2010. Bibliografia.

1. Cultura de tecidos vegetais 2. DNA 3. Micropropagao vegetal 4. Microrganismos endofticos 5. Plantas hospedeiras 6. Reao em cadeia por polimerase I. Ttulo

CDD 631.53 P765r

Permitida a cpia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte O autor

3

Dedico este trabalho aos meus pais Nilson e Marineusa, que sempre demonstraram o exerccio do amor e da dedicao, alm de me auxiliarem durante toda minha vida servindo de exemplo de conduta moral e profissional; aos meus irmos Marcelo e Mrcio que sempre acreditaram em mim, me apoiando e estiveram presentes mesmo distantes; minha mais nova famlia: Roberta, Ana, Cida, Chico, Valria, Junior, Gabriel, Rogrio, Elisngela e Thas que me ajudaram a diminuir as dificuldades de se estar longe da famlia abrindo suas portas e seus coraes para que pudesse ser parte de suas vidas; e como no podia deixar de ser dedico este trabalho ao meu marido Luis Fernando, que sem o qual este trabalho no teria sido possvel, que sempre esteve do meu lado com todo amor, carinho e pacincia!

4

5

AGRADECIMENTOS

A Deus pela ddiva da vida, pelas pessoas que colocou em meu caminho, pela

possibilidade de realizar um trabalho to edificante e satisfatrio, e por me auxiliar nos

momentos de dificuldade e aflio.

minha famlia por permitir que pudesse vir para Piracicaba estudar, pelo apoio

sentimental e financeiro, pelo amor dedicado a mim e por acreditar que eu pudesse

conseguir realizar meu sonho e alcanar meus objetivos, mesmo que por vezes

parecesse to distante ou impossvel de serem atingidos.

Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ/USP) e ao

Departamento de Cincias Biolgicas (LCB/ESALQ/USP) por disponibilizar suas

instalaes e equipamentos para realizao deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Marclio de Almeida, pelo voto de confiana, pelo apoio num

momento de dvida e angstia, por confiar a mim um trabalho to fascinante, pela

orientao, dedicao, amizade, pela maneira carinhosa e afetiva com que resolve os

problemas e pela alegria em trabalhar e ensinar, servindo como algum em quem eu

deva me espelhar na minha vida profissional.

Dra. Cristina Vieira de Almeida pelo carinho com que fui recebida no meu

primeiro dia de Laboratrio, pelo entusiasmo contagiante em trabalhar, pelo carinho e

afeto maternais, que auxiliaram muito na realizao do meu trabalho e por me guiar

pelo fantstico mundo dos microrganismos.

Ao Laboratrio de Cultura de Tecidos (CEBTEC) do Departamento de Cincias

Biolgicas e ao Laboratrio de Fisiologia de rvores do Departamento de Cincias

Florestais, pela concesso das microplantas utilizadas neste trabalho, aos professores

Helaine Carrer e Antonio Natal Gonalves pela cooperao e apoio, e aos Tcnicos

Antonio Francisco de Campos Amaral e Jos Roberto Romanini pela pacincia e auxlio

durante a realizao das anlises.

Profa. Dra. Siu Mui Tsai por permitir que pudesse realizar minhas anlises

moleculares no Laboratrio de Biologia Celular e Molecular do CENA, pelo carinho e

ateno com que fui recebida, auxiliada e orientada.

6

Aos Prof. Dr. Elliot Watanabe Kitajima e Francisco Andr Ossamu Tanaka por me

receberem e ensinarem as tcnicas de microscopia de varredura e de transmisso, pela

amizade e pelo auxlio no uso dos equipamentos e na captura das imagens.

Ao Prof. Dr. Joo Lcio Azevedo e aos amigos do Laboratrio de Gentica de

Microrganismos, do Departamento de Gentica da ESALQ/USP, pela colaborao e

auxlio na compreenso de diferentes tcnicas e formas de analisar os microrganismos.

Ao meu amado marido, Luis Fernando Polesi, pelo amor, carinho e pacincia

dedicados a mim, por estar sempre perto com alguma palavra amiga e de incentivo,

pela ajuda na realizao do meu trabalho e na confeco da dissertao, pelo apoio

sempre com muita disposio e compreenso nos momentos difceis, alm da

confiana depositada em mim.

Dra. Monita Fiori de Abreu Tarazi pela solidariedade, amizade, carinho e

pacincia na resoluo de minhas dvidas e pelo apoio efetivo na execuo de muitas

anlises.

equipe do Laboratrio de Biologia Celular e Molecular do CENA Accio,

Ademir, Aline, Amanda, Bianca, Bianca manauara, Caio, Camila, Chiquinho, Dani,

Elias, Enas, Ezio, Fabi, Fabio, Fernanda, Lilian, Lucas, Ludmila, Lucy, Maju, Mari,

Mariana, Marquinhos, Marcon, Medau, Milena, Othon, Renata, Rodrigo e Wagner, pela

amizade, pelo auxlio e por me ensinarem diversas tcnicas de biologia molecular

Aos Amigos do Laboratrio de Morfognese e Biologia Reprodutiva da ESALQ

Cssia, rika, Gabi, Gilvano, Heron, Katherine, Ktia, Laura, Malu, Marcela, Maysa, e

Thais, pelos momentos de alegria, descontrao e amizade que me proporcionaram,

tornando o trabalho bem mais leve e prazeroso, e pelo auxlio e pacincia em me

ensinar muitas tcnicas que utilizei neste trabalho.

Aos meus amigos Carol, Ester, Fred e David pela amizade, companheirismo,

apoio e pelos inmeros momentos de descontrao, regados a muita comida e msica,

fazendo com minha vida fosse mais alegre e divertida.

FAPESP, processo n 2008/07535-9, pela concesso da bolsa de mestrado

para realizao do projeto.

A todos que direta ou indiretamente participaram da realizao deste trabalho.

7

SUMRIO

RESUMO.......................................................................................................................... 9

ABSTRACT .................................................................................................................... 11

1 INTRODUO ........................................................................................................... 13

2 OBJETIVOS ............................................................................................................... 15

2.1 Objetivo Geral ......................................................................................................... 15

2.2 Objetivos Especficos .............................................................................................. 15

3 REVISO BIBLIOGRFICA ....................................................................................... 17

3.1 Cultura de Tecidos Vegetais ................................................................................... 17

3.2 Plantas Axnicas ..................................................................................................... 19

3.3 Microrganismos Endofticos .................................................................................... 20

3.3.1 Aplicaes na Agricultura ..................................................................................... 23

3.3.1.1 Controle Biolgico ............................................................................................. 23

3.3.1.2 Promoo de Crescimento ................................................................................ 25

3.3.1.3 Fixao Biolgica de Nitrognio ........................................................................ 27

3.3.1.4 Solubilizao de Fsforo ................................................................................... 29

3.3.2 Aplicao Farmacolgica ..................................................................................... 30

3.3.3 Implicao na Cultura de Tecidos ........................................................................ 32

3.3.4 Mtodos de Anlise .............................................................................................. 33

3.3.4.1 Anlise Histolgica da Planta Hospedeira ......................................................... 33

3.3.4.2 Isolamento ......................................................................................................... 34

3.3.4.3 Anlise Molecular ............................................................................................... 36

4 MATERIAL E MTODOS ........................................................................................... 39

4.1 Material Vegetal ...................................................................................................... 40

4.2 Microplantas ............................................................................................................ 41

4.2.1 Testes Histoqumicos ........................................................................................... 41

4.2.2 Anlises Ultraestruturais ....................................................................................... 42

4.2.2.1 Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV) ..................................................... 42

4.2.2.2 Microscopia Eletrnica de Transmisso (MET) ................................................. 42

4.2.3 Anlise Molecular ................................................................................................. 43

8

4.2.3.1 Extrao do DNA Genmico Total das Microplantas ........................................ 44

4.2.3.2. Amplificao do Gene 16S rRNA de Bacteria .................................................. 45

4.2.3.3 PCR-DGGE....................................................................................................... 46

4.2.3.4 Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante (DGGE) ............................. 46

4.2.4 Isolamento de Microrganismos Endofticos ......................................................... 47

4.2.4.1 Primeira Fase.................................................................................................... 47

4.2.4.2 Segunda Fase................................................................................................... 49

4.3 Isolados .................................................................................................................. 50

4.3.1 Extrao do DNA dos Microrganismos Isolados .................................................. 50

4.3.2 Amplificao do Gene 16S rRNA de Bacteria ...................................................... 50

4.3.3 Sequenciamento .................................................................................................. 51

5 RESULTADOS E DISCUSSO ................................................................................. 53

5.1 Microplantas ........................................................................................................... 53

5.1.1 Testes Histoqumicos ........................................................................................... 53

5.1.2 Anlise Ultraestrutural .......................................................................................... 60

5.1.2.1 Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV) ..................................................... 60

5.1.2.2 Microscopia Eletrnica de Transmisso (MET) ................................................ 67

5.1.3 Anlise Molecular ................................................................................................. 73

5.1.3.1 Extrao do DNA Genmico Total das Microplantas ........................................ 73

5.1.3.2 Amplificao do Gene 16S rRNA de Bacteria ................................................... 74

5.1.3.3 Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante (DGGE) ............................. 77

5.1.4 Isolamento ........................................................................................................... 84

5.2 Isolados .................................................................................................................. 90

5.2.1 Sequenciamento .................................................................................................. 90

5.2.1.1 Gnero Bacillus ................................................................................................. 91

5.2.1.2 Gnero Methylobacterium ................................................................................. 94

5.2.1.3 Gnero Acinetobacter ....................................................................................... 96

6 CONCLUSO ............................................................................................................ 99

REFERNCIAS ........................................................................................................... 101

9

RESUMO

Investigao da microbiota endoftica onipresente em microplantas axnicas.

A cultura de tecidos tem sido uma importante ferramenta amplamente utilizada para diversas finalidades, dentre elas a micropropagao tem merecido destaque devido rpida produo de mudas saudveis num espao fsico reduzido. Dentro deste contexto, o termo, plantas axnicas, tem sido difundido como um ideal a ser atingido nesta tcnica, havendo a busca cada vez maior de mtodos que eliminem de forma eficaz toda e qualquer contaminao que possa, eventualmente, crescer no meio de cultura. No entanto, cada vez mais se observa que a concepo de contaminao dentro da cultura de tecidos deve ser revista, assim como a de planta axnica, pois inmeros trabalhos tm mostrado, que mesmo em microplantas assintomticas consideradas axnicas, existe uma comunidade endoftica onipresente e que na sua grande maioria desempenha papel fundamental no estabelecimento, desenvolvimento e aclimatizao das culturas, sendo, portanto, microrganismos benficos que devem ser conservados no cultivo in vitro. Dessa forma, o presente trabalho teve como principal objetivo investigar a microbiota endoftica presente em diversas espcies de microplantas assintomticas consideradas axnicas, independente de seu protocolo de cultivo in vitro, local, mtodo de micropropagao e manipulao. Para tal, foram utilizadas microplantas assintomticas, em fase de multiplicao por mais de um ano, provenientes de trs laboratrios diferentes, submetidas caracterizao por meio de testes histoqumicos, anlises ultraestruturais, a isolamento em diferentes meios de cultura por dois mtodos (triturao e fragmentao), anlises moleculares utilizando a extrao do DNA genmico total e PCR-DGGE, alm da extrao e sequenciamento do DNA dos isolados obtidos. Os resultados obtidos pelo isolamento, testes moleculares e anlises ultraestruturais, evidenciaram a presena de uma comunidade endoftica, colonizando os tecidos de diferentes espcies de microplantas, provenientes de trs laboratrios distintos. Dessa forma, conclui-se que a inexistncia de plantas axnicas deve ser considerada, futuramente, como um aspecto positivo dentro da cultura de tecidos, uma vez que, essa comunidade endoftica pode atribuir caractersticas de interesse agronmico s diferentes espcies vegetais.

Palavras-chave: Microplantas; Axnicas; Endofticos; Onipresena; DNA; PCR-DGGE

10

11

ABSTRACT

Investigation of ubiquitous endophytic microbiota in "axenic" microplants.

Tissue culture has been an important tool widely used for various purposes, among them the micropropagation has been highlighted due to the rapid production of healthy seedlings in a small space. Within this context, the term axenic plant has been distributed as an ideal to be achieved in this technique, which the search based on numerous methods that effectively eliminate any contamination that may eventually grow into the culture medium. However, it is seen that the conception of contamination in tissue culture should be reviewed as well as axenic plants, because several studies have shown that even in asymptomatic microplants considered axenic, there is an ubiquitous and that the endophytic community mostly plays a fundamental role in the establishment, development and acclimatization of cultures, therefore, beneficial microorganisms that should be preserved in vitro. Thus, this study aimed to investigate the endophytic microbiota present in several species of micro asymptomatic considered "axenic" regardless of their protocol for in vitro culture, location, method of micropropagation and manipulation. For this purpose, were used asymptomatic microplants in multiplication stage by more than one year, from three different laboratories, and were submitted to characterization by histochemistry tests, ultrastructural analysis, isolation in different culture medium by two methods (grinding and fragmentation), molecular analyses using the extraction of total genomic DNA and PCR-DGGE, in addition to extracting and sequencing the DNA of the isolates obtained. The results obtained by the isolation, molecular and ultrastructural analysis, showed the presence of an endophytic community colonizing the tissues of different species of microplants, from three different laboratories. Thus, it was concluded that the inexistence of axenic plants should be considered in future as a positive aspect in the tissue culture, since this endophytic community can give agronomical traits to different crop species. Keywords: Microplants; Axenic; Endophytic; Ubiquitously; DNA; PCR-DGGE

12

13

1 INTRODUO

A cultura de tecidos vegetais amplamente utilizada com diversas finalidades,

dentre elas a micropropagao tem merecido destaque devido rpida produo de

mudas saudveis num espao fsico reduzido (ALVARES; CALDAS, 2002; DONATO et

al., 2005; LIMA; MORAES, 2006). Inmeros fatores determinam o sucesso da cultura de

tecidos, no entanto, o mais importante deles a contaminao microbiana, sendo a

razo de muitos estudos. A contaminao dos explantes , indubitavelmente, o mais

severo transtorno para a tcnica de micropropagao de plantas por ser um dos

principais responsveis por perdas severas em biofbricas e laboratrios de pesquisa

(DANTAS; OLIVEIRA; CMARA, 2002; DONATO et al., 2005).

Na tcnica in vitro a contaminao dos tecidos devida presena de

microrganismos epifticos, oportunistas ou patognicos, que podem penetrar nos

tecidos atravs de fendas na epiderme, pelos estmatos, ou ainda por microleses,

causando no meio de cultivo, severa contaminao. A contaminao microbiana pode,

tambm, estar associada a uma desinfestao ineficiente da superfcie do explante, ou

ao manuseio incorreto durante a subcultura (LONDE et al., 2007; PANICKER et al.,

2007).

A microplanta denominada axnica aquela cultivada em condies asspticas

e que durante todo o seu desenvolvimento no se constata a presena de nenhum

microrganismo. Entretanto, esporadicamente, aps um perodo de estresse mecnico,

fsico ou nutricional, observa-se o crescimento de pequenas colnias de

microrganismos no meio de cultura ou sobre as microplantas, at ento assintomticas

(ALMEIDA; YARA; ALMEIDA, 2005; THOMAS; PRAKASH, 2004; THOMAS;

PRABHAKARA; PITCHAIMUTHU, 2006; THOMAS et al., 2008).

Como explicar, ento, que microplantas assintomticas e axnicas possam

apresentar em seu interior algum tipo de microrganismo? Tal questionamento tem sido

o foco de muitas pesquisas que sugerem que esses microrganismos sejam endofticos,

fato esse extensivamente estudado em plantas cultivadas in vivo, mas at ento

desconhecidos no cultivo in vitro.

Recentes observaes comprovam a existncia de endofticos em culturas in

vitro consideradas axnicas (ABREU-TARAZI et al., 2010; ALMEIDA; YARA; ALMEIDA,

14

2005; ALMEIDA et al., 2009; THOMAS et al., 2008). Dessa forma, o que se acreditava

ser contaminao, frequentemente atribuda a uma m desinfestao, pode ser na

realidade o crescimento de endofticos presentes no interior da planta, no eliminados

pelos desinfetantes utilizados (PANICKER et al., 2007). Na maioria das vezes, esses

microrganismos no se manifestam de forma visvel e nem crescem no meio de cultura,

sendo observados somente em anlises microscpicas das plantas micropropagadas,

contradizendo, portanto, a suposio de que estas plantas so isentas de

microrganismos (BARROW; OSUNA-AVILA; REYES-VERA, 2004).

A presena desses endfitos no necessariamente afeta negativamente o

desenvolvimento das microplantas, inferindo-se inclusive, tratarse de uma associao

neutra ou benfica. At o final da dcada de 70 desconheciam-se os efeitos benficos

ou malficos dos microrganismos endofticos. No entanto, estudos posteriores

revelaram propriedades de interesse, como a proteo contra predadores e patgenos.

Atualmente, outras propriedades importantes lhes so atribudas, como o aumento da

resistncia a condies de estresse, alteraes de propriedades fisiolgicas, produo

de fitormnios, toxinas, frmacos e compostos de interesse biotecnolgico, como

enzimas (AZEVEDO et al., 2000; STAMFORD et al., 2001, 2002; STROBEL, 2003;

SUTO et al., 2002; THOMAS; KUMARI, 2010). Sob este ponto de vista, segundo

Pamphile e Azevedo (2002), os produtores devem levar em considerao no somente

as vantagens e atribuies genticas das plantas, mas tambm os endfitos que ela

abriga, podendo contribuir para um aumento nas caractersticas de interesse

agronmico.

Dessa forma, o conceito de planta axnica deve ser revisto e aprimorado, de

modo que seja considerada a existncia de uma microbiota endoftica nas microplantas.

Sendo assim, torna-se evidente a necessidade de estudos aprofundados para melhor

compreender essa associao de maneira a contestar o paradigma de que plantas

cultivadas sob condies asspticas, sejam caracterizadas como axnicas, inferindo-se

que existe uma microbiota onipresente em todas as espcies vegetais. Por essas

razes, este estudo se fundamentou nas seguintes hipteses: 1 existe semelhana na

microbiota endoftica entre laboratrios distintos? e 2 h semelhana entre a

microbiota endoftica de diferentes espcies de microplantas?

15

2 OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Investigar a microbiota endoftica em diversas espcies de microplantas

assintomticas consideradas axnicas, independente de seu protocolo de cultivo in

vitro, local e mtodo de micropropagao.

2.2 Objetivos Especficos

a) Caracterizar e comparar as diferentes espcies de microplantas por meio de testes

histoqumicos;

b) Confirmar a presena da microbiota endoftica de microplantas axnicas cultivadas

em diferentes laboratrios, por meio de isolamento e anlises ultraestruturais;

c) Caracterizar molecularmente a microbiota endoftica, por meio da extrao de DNA

genmico total de microplantas e mtodos de PCR-DGGE, bem como a extrao do

DNA de microrganismos isolados e sequenciamento parcial.

16

17

3 REVISO BIBLIOGRFICA

3.1 Cultura de Tecidos Vegetais

O cultivo de plantas in vitro ou cultura de tecidos vegetais pode ser definido como

o cultivo, em ambiente artificial sob condies asspticas e controladas, de clulas

vegetais isoladas, ou tecidos ou rgos, que podem dar origem a plantas inteiras,

diretamente do explante ou indiretamente atravs de calos. Trata-se de uma

biotecnologia, que compreende vrios mtodos de propagao vegetal em laboratrio

e, atualmente, vem sendo amplamente utilizada como ferramenta para o estudo do

metabolismo, fisiologia, desenvolvimento e reproduo de plantas com propriedades

desejveis, tais como resistncia a pragas e acmulo de substncias ativas de

interesse comercial (GEORGE, 1996; LAKSHMANA et al., 2005; TORRES; CALDAS;

FERREIRA, 1998).

A cultura de tecidos vegetais tem atrado a ateno dos pesquisadores desde o

incio do sculo XX, Haberlandt, em 1902, foi o primeiro a cultivar clulas de tecidos

somticos de vrias espcies de plantas em soluo nutritiva (TORRES; CALDAS;

FERREIRA, 1998). Com a redescoberta dos princpios bsicos de segregao de

Mendel no incio do sculo XX, ocorreu paralelamente o desenvolvimento de estudos

genticos de animais e plantas, verificando-se concomitantemente um progresso

considervel nas tcnicas de cultivo in vitro de clulas e tecidos de plantas (FERREIRA;

CALDAS; PEREIRA, 1998).

As tcnicas de cultura de tecidos tm sido empregadas de diferentes formas no

desenvolvimento de cultivares superiores de plantas, sendo utilizadas em uma ou outra

etapa do melhoramento, como alternativa em suas diferentes fases, ou como soluo

nica, contribuindo em maior ou menor escala de acordo com os objetivos e com as

caractersticas biolgicas da espcie-alvo (CHENGALRAYAN; ABOUZID; GALLO-

MEAGHER, 2005; FERREIRA; CALDAS; PEREIRA, 1998; ULISSES et al., 2000). Alm

dos aspectos do melhoramento gentico das plantas, a cultura de tecidos

amplamente utilizada na propagao vegetativa in vitro ou micropropagao, sendo a

aplicao mais prtica e de maior impacto da cultura de tecidos, que tem como principal

18

objetivo a acelerao dos mtodos convencionais de propagao vegetativa (DONATO

et al., 2005; LIMA; MORAES, 2006).

A micropropagao se tornou a sada para o cultivo de muitas plantas que

possuem limitaes na propagao sexuada, alm da alta taxa de multiplicao e

qualidade em comparao aos mtodos tradicionais (LIMA; MORAES, 2006;

NIETSCHE et al., 2006). As principais vantagens das plantas propagadas in vitro

(microplantas) so: a rapidez com que se obtm um grande nmero de mudas em

instalaes reduzidas, e a obteno de plantas livres de doenas e pragas, o que reduz

a disperso de organismos fitoparasitas (ALVARES; CALDAS, 2002; DAMASCO et al.,

1996; LIMA; MORAES, 2006). Plantas micropropagadas, quando comparadas s

plantas oriundas de propagao convencional, sobrevivem mais no campo, crescem

mais rapidamente nos primeiros estdios de desenvolvimento, possuem maior

precocidade, florescendo at quatro meses antes, alm de apresentarem uniformidade

de produo, proporcionando colheitas superiores (ALVARES; CALDAS, 2002).

Inmeros so os fatores que influenciam a multiplicao in vitro, tais como, a taxa

de multiplicao, altura das plantas, presena e intensidade de estiolamento, forma,

colorao e tamanho das folhas, formao de calos, desenvolvimento de razes, perdas

por contaminao microbiana, oxidao e eficincia da aclimatao (LIMA; MORAES,

2006). Por essa razo, h um grande requerimento de cuidados que vo desde o

estabelecimento destas plantas in vitro at a manuteno delas, durante os meses de

desenvolvimento. (NISHIMURA et al., 2002). Dentre eles, o fator mais determinante

para o sucesso ou no do cultivo in vitro a contaminao microbiana, constituindo-se

como uma ameaa sria cultura de tecidos, admitida por todos os pesquisadores, que

discutem protocolos mais eficientes, mas raramente informam ou mencionam em suas

publicaes cientficas maneiras mais eficientes de control-la (KAMOUN; LEPOIVRE;

BOXUS, 1998; PANICKER et al., 2007).

Dessa forma, o aprimoramento constante dos processos de multiplicao in vitro

e o controle de qualidade das mudas, aliado reduo de custos, tm sido essenciais

para a sua aceitao no mercado (DAZ et al., 2009; NIETSCHE et al., 2006).

19

3.2 Plantas Axnicas

As principais exigncias para um protocolo de micropropagao vivel incluem a

formulao de meios de cultura simples, poucos procedimentos nas fases de produo,

taxas consistentes de propagao, sustentabilidade do sistema em longo prazo e acima

de tudo um controle adequado da contaminao microbiana. No tocante

contaminao microbiana, pode-se afirmar que as plantas axnicas so aquelas

consideradas livres de todo e qualquer microrganismo, sendo o termo amplamente

utilizado na cultura de tecidos (PANICKER et al., 2007).

A contaminao microbiana o principal problema que impede a aplicao da

cultura de tecidos, havendo uma tendncia geral em atribuir essa contaminao s

prprias matrizes que no foram submetidas a uma desinfestao eficaz da superfcie

do explante no processo de iniciao da cultura, ou do manuseio em laboratrio,

utilizando prticas estreis ineficientes durante a manipulao (PANICKER et al., 2007;

THOMAS; PRABHAKARA; PITCHAIMUTHU, 2006; THOMAS; PRAKASH, 2004;

THOMAS et al., 2008). As contaminaes bacterianas so mais drsticas e trazem duas

consequncias bsicas: a primeira a perda de tempo e de recursos financeiros ou

genticos pela eliminao de frascos contaminados, e a segunda o risco de

contaminao de outras plantas (LOPES, 1988; THOMAS; PRABHAKARA;

PITCHAIMUTHU, 2006; THOMAS; PRAKASH, 2004).

A maior dificuldade no processo de desinfestao obter um tecido

descontaminado sem conduzi-lo morte quando isolado, uma vez que se utiliza

compostos que certamente reduzem a capacidade de resposta morfognica dos

explantes, exigindo dessa forma, o emprego de bioreguladores mais fortes para

alcanar o objetivo de propagao, o que pode acarretar em srios efeitos colaterais,

como a variao somaclonal. Os antibiticos e fungicidas so, ocasionalmente,

utilizados para o controle in vitro de microrganismos, podendo os mesmos serem

adicionados ao meio de cultura ou submetendo os explantes a banhos sob agitao,

durante alguns dias, porm, o uso de certos antibiticos tem sido limitado devido

toxicidade para as plantas (DONATO et al., 2005; LONDE et al., 2007). A limpeza dos

propgulos pode, por outro lado, eliminar tambm microrganismos identificados como

20

no patognicos que beneficiam a cultura (BARROW; OSUNA-AVILA; REYES-VERA,

2004; DIAS et al., 2009; OLIVEIRA et al., 2002; WEBER et al., 2004).

Segundo Thomas et al. (2007), uma exigncia universal primria para o trabalho

de cultura de tecido assepsia, mas as observaes sugerem que praticamente

impossvel adquirir culturas asspticas com esterilizao normal da superfcie, o que

incita a possibilidade da cultura de tecidos no axnicos como uma opo futura. Vrios

estudos j demonstraram uma grande diversidade de aspectos benficos que

microrganismos simbiontes podem promover planta hospedeira, como aumento no

crescimento e sobrevivncia de microplantas na fase de aclimatizao e a rapidez da

produo de biomassa (AKELLO et al., 2007; WEBER et al., 2004). Sendo assim, a

presena de tais microrganismos pode no somente, no representar problemas reais

cultura, como representar um ganho ao mant-los na planta, pois, alm de no

apresentarem caractersticas patognicas, tambm se configuram, na atualidade, como

vetores genticos, como agentes de controle biolgico, como fonte de metablitos

secundrios, entre outros (ALMEIDA, YARA, ALMEIDA, 2005; PEREIRA; CARNEIRO-

VIEIRA; AZEVEDO, 1999).

A interao entre plantas e microrganismos pode estimular o crescimento

vegetal, seja por competio com patgenos ou por induo de efeitos de outros

microrganismos teis, ocasionando benefcio s plantas (ARRUDA, 2000). Por essa

razo, so muito importantes os estudos com uma abordagem positiva da presena de

endfitos naturais no cultivo in vitro. Isto, porque, vrios estudos j evidenciam a

onipresena de endfitos encobertos em vrias espcies in vitro, dentre elas videira,

mamoeiro, meloeiro, bananeira, abacaxizeiros e palmeiras (ABREU-TARAZI et al.,

2010; ALMEIDA; YARA; ALMEIDA, 2005; ALMEIDA et al., 2009; THOMAS et al., 2008).

3.3 Microrganismos Endofticos

Microrganismos que vivem dentro de tecidos de plantas em parte ou em todo o

seu ciclo de vida sem causar qualquer sintoma visvel de sua presena, podendo ser

isolados de tecidos de plantas que tiveram sua superfcie desinfestada, so definidos

como endofticos (ARAJO et al., 2002; BANDARA; SENEVIRATNE; KULASOORIYA,

21

2006; GAMBOA; LAUREANO; BAYMAN, 2002; GOND et al., 2007; GUO et al., 2008;

LARRAN; MNACO; ALIPPI, 2001; PETRINI, 1991; REITER et al., 2003; SAIKKONEN,

2007; SANTOS et al., 2003; SUN et al., 2008; TEJESVI et al., 2005). Eles habitam as

regies saudveis da planta, ou regies assintomticas, numa densidade entre 103 a

106 UFC por grama de tecido fresco (BANDARA; SENEVIRATNE; KULASOORIYA,

2006; GARBEVA et al., 2001).

Os endfitos diferem-se dos epfitos, por habitarem o interior das plantas, e dos

fitopatgenos por no causarem doenas (SOUZA et al., 2004). De acordo com as

estratgias de vida dos endfitos eles podem ser classificados em obrigatrios ou

facultativos. Os obrigatrios so estritamente dependentes da planta hospedeira para

seu crescimento e sobrevivncia, j os facultativos possuem uma fase de seu ciclo

dentro da planta hospedeira e outra em que vivem fora delas (HARDOIM; OVERBEEK;

ELSAS, 2008).

Endfitos so onipresentes nos tecidos vegetais, tendo sido isolados de flores,

frutos, folhas, caules, razes, e sementes de vrias espcies vegetais (KOBAYASHI;

PALUMBO, 2000; MCINROY; KLOEPPER, 1995; MELNICK et al., 2008; PICCOLO et

al., 2010; THOMAS et al., 2007). Alguns so mais frequentes em determinado tipo de

vegetal, designados dominantes, em contraposio h outros mais raros, chamados de

secundrios (PILEGGI, 2006). Desde 1940, tem-se relatado a presena de endfitos

colonizando os tecidos saudveis de diversas plantas como, batata, tomate, pepino,

trigo, leguminosas, algodo e citros (RAI et al., 2007).

As associaes de microrganismos endofticos com seus hospedeiros so

variadas e complexas e o entendimento dessas interaes ainda prematuro

(NEWMAN; REYNOLDS, 2005; SOUZA et al., 2004), podendo ser definidas como

simbiticas ou neutras (SOUZA et al., 2004). Na maioria dos casos as relaes entre os

endofticos e as plantas hospedeiras so simbiticas e provavelmente mutualsticas

(GUO et al., 2008; MELNICK et al., 2008).

Nas interaes simbiticas os microrganismos endofticos recebem nutrientes e

proteo da planta hospedeira que, por sua vez, so beneficiadas ao abrig-los, pois

podem auxiliar o crescimento e desenvolvimento, o estabelecimento sob condies

adversas, a rapidez do aparecimento da muda, resistncia a nematides e a diversos

22

patgenos, produzindo antibiticos, ou colonizando um nicho ecolgico semelhante ao

dos fitopatognicos (ALMEIDA; YARA; ALMEIDA, 2005; ARAJO et al., 2002;

BANDARA; SENEVIRATNE; KULASOORIYA, 2006; GUO et al., 2008; TEJESVI et al.,

2005), alm de produzirem ou induzirem a produo de metablitos primrios,

secundrios e outros compostos qumicos como enzimas, alcalides e antibiticos

(FIRKOV; TURDKOV; MKOV, 2007; GOND et al., 2007; HOL et al., 2007;

TEJESVI et al., 2005).

A relao entre a planta hospedeira com a comunidade e diversidade endoftica

envolve um processo de co-evoluo, regido pela sua colonizao, que, por sua vez,

influenciada pelo gentipo, estdio de crescimento, status fisiolgico e tipo de tecido da

planta, alm de condies ambientais e prticas agrcolas (COMPANT; CLMENT;

SESSITSCH, 2010; FIRKOV; TURDKOV; MKOV, 2007; FORCHETTI et al.,

2007; HARDOIM; OVERBEEK; ELSAS, 2008; SIEBER, 2007). A composio da

comunidade associada com as plantas pode, ainda, ser diferente, dependendo da

espcie, do tipo de cultivar, e at mesmo entre espcies transgnicas e suas

respectivas progenitoras (ANDREOTE et al., 2010). A co-evoluo das plantas com

endfitos conduz a uma ntima relao, ocasionada por mudanas na informao em

nvel celular e molecular (ARAVIND et al., 2010; BACON; HINTON, 2006), que podem

contribuir de diferentes formas na sanidade e desenvolvimento da planta.

Embora o conhecimento da ecologia e filogenia de microrganismos endofticos

tenha se acumulado rapidamente durante as ltimas duas dcadas, perguntas bsicas

sobre a origem evolutiva, especiao e papel ecolgico dos endofticos permanecem

largamente sem resposta (SAIKKONEN et al., 2004). Sabe-se que de aproximadamente

300.000 espcies de plantas existentes na terra, cada uma hospedeira de um ou mais

endofticos, especialmente plantas lenhosas, que podem conter inmeras espcies

(SAIKKONEN, 2007; GUO et al., 2008).

23

3.3.1 Aplicaes na Agricultura

3.3.1.1 Controle Biolgico

Uma das grandes preocupaes atuais com a agricultura de uma maneira geral

concentra-se no ataque dos patgenos e, consequentemente, na instalao da doena

que em muitos casos pode levar a morte da planta ou a uma drstica reduo da

produtividade. Para resolver este problema, na maioria das vezes, utilizam-se produtos

como inseticidas, fungicidas e antibiticos, que alm de promoverem a reduo da

doena, eliminam importantes espcies de insetos que controlam outras pragas e

microrganismos que desempenham papel importante no ambiente (AZEVEDO et al.,

2000). Dessa forma, o controle biolgico surge como uma nova alternativa no combate

a pragas e doenas, uma vez que permite um manejo racional sem afetar outras formas

de vida e sem contaminar o ambiente, por ser altamente especfico (LIU et al., 2007).

Dentro do controle biolgico de doenas o uso de microrganismos endofticos

tem gerado bons resultados (ARAVIND et al., 2010). A efetividade dos endofticos como

agentes de controle biolgico depende de muitos fatores, podendo-se citar: a

especificidade da planta hospedeira, a dinmica de populao e padro de colonizao

da planta, a habilidade para mover-se dentro dos tecidos da planta e a habilidade para

induzir resistncia sistmica (MELNICK et al., 2008). Investigaes bioqumicas de

plantas bacterizadas mostraram uma alterao marcada na fisiologia da planta

hospedeira, como tambm mudanas anatmicas e estruturais, no inicio do processo

de resistncia induzida pelas bactrias em vrias plantas (BENHAMOU; KLOEPPER;

TUZUN, 1998).

O processo de imunizao ou resistncia induzida tem sido o foco de interesse

de vrios estudos (BENHAMOU; KLOEPPER; TUZUN, 1998). Os efeitos benficos para

as plantas hospedeiras incluem: aumento da tolerncia seca, impedimento de

herbivoria, proteo contra nematides, e resistncia contra patgenos fngicos (MEJA

et al., 2008). Muitos endofticos podem excretar substncias antimicrobiais que podem

estar envolvidas numa associao simbitica com a planta hospedeira (SUN et al.,

2006). Dessa forma, os endfitos podem especificamente inibir a infeco e proliferao

24

do patgeno diretamente dentro da planta hospedeira, ou indiretamente por induzir

respostas de resistncia intrnseca planta (MEJA et al., 2008).

Muitos endofticos apresentam ao fungicida para Fusarium oxysporum e

Rhizoctonia solani em algodo, Verticillium dahliae, Verticillium sp., e R. solani em

batata, Sclerotium rolfsii em feijo (CHO et al., 2007; SINGH et al., 2008). Espcies de

fungos endofticos isoladas de plantas cultivadas in vitro e in vivo por Almeida; Yara e

Almeida (2005), mostraram potencial para o uso no controle biolgico de patgenos

causadores do apodrecimento radicular de pupunheiras (Bactris gasipaes).

Espcies de bactrias endofticas atuam intimamente na planta hospedeira com

atividade antagnica a fungos e bactrias patognicas, podendo-se citar a

Acinetobacter baumannii, efetiva no combate ao crescimento de diversos fungos

patognicos, tais como: Cryphonectria parasitica, Glomerella glycines, Phytophthora

capsici, Fusarium graminearum, Botrytis cinerea, e Rhizoctonia solani (LIU et al., 2007).

Espcies, como Bacillus pumilus e Bacillus subtilis, so conhecidas pela sua atividade

de proteo devido produo de antibiticos e enzimas hidrolticas (ADAMS et al.,

2008; REVA et al., 2002). B. pumilus inibe o crescimento de fungos por produzir

enzimas proteolticas que degradam a parede de celular (ADAMS et al., 2008; KUMAR,

2002; NIELSEN; SORENSEN, 1997).

Outra caracterstica marcante de bactrias do gnero Bacillus, consiste no fato

de produzirem esporos com alta tolerncia a condies ambientais adversas, permitindo

seu uso em formulaes de biopesticidas para aplicao no campo com menor impacto

ambiental, alm disso, o uso de linhagens de Bacillus no biocontrole, em relao a

outras bactrias, oferece as seguintes vantagens: so mais fceis de cultivar e

armazenar; podem ser aplicadas como esporos em sementes e plantas ou como

inoculantes; possuem um amplo espectro de ao contra vrios patgenos microbianos;

e adicionalmente podem estimular o crescimento das plantas (CHOUDHARY; JOHRI,

2009; FORCHETTI et al., 2007; HERNANDEZ et al., 2009; ZHAO, et al., 2010).

Diversos estudos realizados nos ltimos vinte anos tem focado principalmente o

controle de nematides parasitas de plantas. Tais estudos comprovaram a

suscetibilidade desses nematides a uma diversidade de fungos e bactrias presentes

no solo, criando a possibilidade do uso de alguns microrganismos, como Pasteuria,

25

Pseudomonas e Bacillus, como agentes de biocontrole desses parasitas (TIAN; YANG;

ZHANG, 2007). Mendoza e Sikora (2009) relataram que Bacillus firmus o agente

biolgico presente no bionematicida registrado em Israel com o nome comercial de

Bionem WP (KEREN-ZUR et al., 2000; MENDOZA; SIKORA, 2009). A eficcia deste

bionematicida relatada para o controle de diferentes nematides como Meloidogyne

incognita, Helicotylenchus spp, Tylenchorhynchus spp, Radopholus similis e Ditylenchus

dipsaci (MENDOZA; SIKORA, 2009).

A proteo antipatognica mediada por endofticos contra nematides foi

observada em gramneas tropicais, plantas de tomateiro e bananeiras, e contra fungos

patognicos para feijo e cevada, porm, mesmo com essas evidncias de que os

endofticos podem reduzir os danos causados pelos patgenos, pouco se conhece

sobre o papel desses microrganismos em sistemas naturais e ainda, como eles podem

ser explorados como uma estratgia no controle biolgico de plantas (MEJA et al.,

2008).

3.3.1.2 Promoo de Crescimento

Estudos sugerem que os microrganismos endofticos tambm atuam nas plantas

como excelentes promotores de crescimento, sendo relatada sua eficincia em plantas

de arroz, com aumento significativo do rendimento dos gros, em plantas de cana-de-

acar, entre outras. Neste contexto, cabe destacar duas endobactrias comuns a

muitas plantas Rhizobium e Azorhizobium, que aumentam a absoro de nutrientes

pelo aumento de razes laterais, promovendo o crescimento em altura e espessura da

parte area (BANDARA; SENEVIRATNE; KULASOORIYA, 2006; TING et al., 2008).

O termo rizobactria geralmente usado para designar a ocorrncia natural de

bactrias que vivem livres no solo envolvidas em associaes benficas com as

plantas, promovendo seu crescimento (EL-TARABILY, 2008). Tais bactrias so

classificadas por dois mecanismos: - o primeiro o mecanismo direto, no qual esto

envolvidas as produes de compostos que favorecem o crescimento das plantas,

como auxinas, citocininas, giberelinas e poliamidas; alm de estarem envolvidas na

fixao de nitrognio atmosfrico; na solubilizao de ferro e fosfato inorgnico; na

26

mineralizao de fosfato orgnico e no aumento da tolerncia a estresse hdrico, salino,

toxicidade de metal e pesticidas; - o segundo o mecanismo indireto, no qual esto

envolvidos os processos de diminuio ou preveno dos efeitos danosos de

microrganismos fitopatognicos, atravs da produo de siderforos e metablitos

fungicidas (AKHTAR; SIDDIQUI, 2008; BANDARA; SENEVIRATNE; KULASOORIYA,

2006; CANBOLAT et al., 2006; EL-TARABILY, 2008; SINGH et al., 2008).

Um dos principais mecanismos de promoo do crescimento das plantas

mediada por microrganismos endofticos a produo de fitormnios. As plantas

respondem a perturbaes pela modificao dos nveis de vrios hormnios, incluindo o

cido jasmnico (JA), acdo abscsico (ABA) e etileno. Muitas bactrias endofticas

produzem esses hormnios, que podem auxiliar a planta, principalmente espcies que

crescem sob condies restritas, como seca e salinidade, (FORCHETTI et al., 2007).

Alm disso, hormnios como auxinas, citocininas e giberelinas, tambm podem ser

produzidos. As auxinas so sintetizadas pelas bactrias por diferentes rotas (Figura 1) e

auxiliam no crescimento e desenvolvimento da parte area e radicular das plantas

(TROTSENKO; IVANOVA; DORONINA, 2001).

Figura 1 Biossntese de AIA em bactrias Fonte: Trotsenko, Ivanova e Doronina (2001)

Muitas bactrias, como Acinetobacter, Azospirillum, Azotobacter, Pseudomonas,

e Bacillus, produzem fitormnios como o cido indol actico (KANG et al., 2009;

KHALID; ARSHAD; ZAHIR, 2004), cido indol butrico (MARTNEZ- MORALES et al.

2003), giberelinas (GUTIRREZ-MAERO et al., 2001), citocininas (DOBBELAERE;

RCH2CHNH2COOOH (Triptofano)

RCH2CH2NH2 (Triptamina)

RCH2CHO (Indol-3-acetaldedo)

RCH2COOH (cido indol-3-actico)

RCH2CONH2 (Indol-3-acetamida)

RCH2COCOOH (cido indol-3-pirvico)

RCH2CHOHCOOH (cido indol-3-lctico)

27

VANDERLEYDEN; OKON, 2003), octadecanoides, e compostos que imitam a ao dos

jasmonatos (PING; BOLAND, 2004). Em condies normais, auxina e giberelinas como

GA1, GA3, GA4, e GA20 tem sido detectadas em meio de cultura lquido de Bacillus

pumilus e B. licheniformis. (FORCHETTI et al., 2007; HERNANDEZ et al., 2009).

Bactrias do gnero Methylobacterium, podem atuar sinergicamente quando em

conjunto com bactrias do gnero Rhizobium, promovendo o crescimento da planta ao

estimular a germinao da semente e o crescimento da raiz, aumento na nodulao e

no rendimento, pela produo de fitormonios como cido indol actico (AIA) e

giberelinas (MADHAIYAN et al., 2006a).

Alm destes mecanismos comuns de promoo do crescimento, muitas bactrias

podem estimular o crescimento da planta pela atividade da enzima 1-

aminociclopropano-1 cido carboxilico desaminase, que hidroliza o 1-

aminociclopropano-1-cido carboxlico, precursores imediatos da biossntese do

fitormnio etileno, em tecidos de planta (EL-TARABILY, 2008). Outros efeitos da

infeco dos endofticos na planta hospedeira incluem o ajuste osmtico, controle da

abertura e fechamento estomtico, modificao da morfologia radicular, aumento da

captao de minerais e alterao do acmulo, suprimento de vitaminas essenciais e

metabolismo do nitrognio, (BANDARA; SENEVIRATNE; KULASOORIYA, 2006;

FIGUEIREDO et al., 2008). Daz et al. (2009) demonstraram que a inoculao de

bactrias endofticas do gnero Bacillus, Pseudomonas e Stenotrophomona em

Eucalyptus globulus tem a capacidade de estimular o enraizamento e o aumento da

biomassa radicular, sendo utilizadas como potenciais biofertilizantes.

3.3.1.3 Fixao Biolgica de Nitrognio

A revoluo verde na agricultura, ocorrida nos anos sessenta, resultou em

elevados aumentos na produo de gros de cereais, devido ao desenvolvimento de

gentipos de plantas que so altamente responsivas a fertilizantes qumicos,

particularmente o nitrognio (GOVINDARAJAN; KWON; WEON, 2007). O aspecto

nutricional um ponto de preocupao e busca por solues menos onerosas, assim

como no campo fitopatolgico, so inmeros os estudos utilizando maneiras

28

alternativas de fornecimento dos nutrientes essenciais s plantas, dentre eles e com

maior importncia do ponto de vista econmico, destaca-se o nitrognio, por ser mais

limitante a produtividade. (GOVINDARAJAN et al., 2006).

As plantas absorvem nitrognio presente na atmosfera na forma de amnia e

nitrato, porm tal absoro nfima, sendo necessria suplementao com

fertilizantes, o que nas condies tropicais se apresenta com elevados gastos, devido

s chuvas que provocam a lixiviao desse nitrognio, restando a fixao biolgica do

nitrognio, como uma alternativa economicamente vivel, vantajosa e menos

impactante (JENSEN; HAUGGAARD-NIELSEN, 2003; GOVINDARAJAN; KWON;

WEON, 2007).

Muitas bactrias infectam as razes de algumas plantas e formam os ndulos, em

cujo interior sintetizado um complexo enzimtico, denominado nitrogenase, que

rompe a tripla ligao existente entre os tomos de N que formam a molcula do N2 e

utilizam esses tomos para produzir duas molculas de amnia (NH3), que so

fornecidas planta, para sintetizar os compostos nitrogenados (ALBINO; CAMPO,

2001; BAKULIN; GRUDTSYNA; PLETNEVA, 2007).

A aplicao de inoculantes bacterianos como biofertilizantes tem aumentado o

crescimento e rendimento de muitas culturas de cereais, sendo atribudo a esses efeitos

benficos o uso de rizobactrias que fixam biologicamente o nitrognio, alm de

produzirem fitormnios, que promovem o desenvolvimento e proliferao radicular,

resultando em uma captao mais eficiente de gua e nutrientes (GOVINDARAJAN et

al., 2006; SENTHILKUMARNN et al., 2008). Segundo Balachandar et al. (2006) os

microrganismos diazotrficos colonizam endofiticamente razes, caules e folhas de

cereais, sofrendo provavelmente, muito menos competio por carbono com outros

organismos microscpicos, do que as bactrias presentes na rizosfera, e possivelmente

excretam parte do nitrognio por eles fixados diretamente na planta. Em cana-de-

acar, por exemplo, a inoculao com uma mistura de bactrias diazotrficas e fungos

micorrzicos mostrou-se equivalente metade da dose indicada de fertilizantes

(GOVINDARAJAN et al., 2006; OLIVEIRA et al., 2002).

Vrios endofticos que fixam nitrognio em plantas j foram informados,

podendo-se citar os do gnero Gluconacetobacter, Acetobacter, Azoarcus,

29

Herbaspirillum, Burkholderia em plantas gramneas e Methylobacterium em citrus

(ARAJO et al., 2002; BALACHANDAR et al., 2006; DONATO et al., 2005;

ELBELTAGY et al., 2001; GOVINDARAJAN; KWON; WEON, 2007). Burkholderia

vietnamiensis foi uma das primeiras espcies de Burkholderia relatada como fixadora

de nitrognio, outros estudos, porm, sugerem que muitas espcies deste gnero

desempenhem tal funo, como a Burkholderia baldani que coloniza os tecidos de

cana-de-acar, batata-doce e arroz, e Burkholderia unamae que coloniza os tecidos da

planta de milho (GOVINDARAJAN et al., 2006).

3.3.1.4 Solubilizao de Fsforo

Depois do nitrognio, o fsforo o nutriente que mais limita a planta e sua

deficincia restringe o rendimento da produo. Os solos tropicais e subtropicais so

predominantemente cidos e normalmente deficientes em fsforo, com elevada

capacidade de imobilizao, tal deficincia devida alta reatividade do fosfato solvel

com outros elementos (KHAN; ZAIDI; WANI, 2007).

A soluo mais comumente utilizada o uso de fertilizantes qumicos que

possuem alto custo, utilizam energia fssil para serem produzidos e poluem o ambiente,

alm disso, so rapidamente imobilizados, tornando-se indisponveis s plantas. Dessa

forma, torna-se indispensvel explorar fontes alternativas de disponibilizao de fsforo,

como, por exemplo, o uso de microrganismos (CANBOLAT et al., 2006; DIAS et al.,

2009; KHAN; ZAIDI; WANI, 2007).

Organismos com habilidade de solubilizar fosfato representam uma alternativa

economicamente vivel e ecologicamente correta, pois o sistema microbiano capaz

de disponibilizar grandes quantidades de nutrientes de reservas naturais e enriquecer o

solo com os nutrientes mais importantes e escassos. Os microrganismos convertem o

fsforo insolvel nas formas solveis, e dentre eles destacam-se as bactrias dos

gneros Bacillus e Pseudomonas e alguns fungos como Aspergillus e Penicillium

(KHAN; ZAIDI; WANI, 2007).

Assim como os microrganismos de solo, muitos endofticos so conhecidos por

promover o crescimento da planta atravs da solubilizao do fsforo (DIAS et al.,

30

2009; VERMA; LADHA; TRIPATHI, 2001; WAKELIN et al., 2004). Bacillus pumilus e

Acinetobacter calcoaceticus so conhecidamente bactrias endofticas que auxiliam a

planta hospedeira de diferentes formas, sendo uma delas a oferta de fsforo solvel

atravs de sua solubilizao (HERNANDEZ et al., 2009; KANG et al., 2009).

3.3.2 Aplicao Farmacolgica

Os microrganismos endofticos so fontes relativamente espontneas e

potenciais de produtos naturais modernos para explorao em medicina, agricultura e

indstria, por se tratarem de sintetizadores qumicos dentro da planta (LIN et al., 2007;

GUO et al., 2008). Muitos deles so capazes de sintetizar compostos bioativos que

podem ser usados pelas plantas para defesa contra patgenos e algumas destas

combinaes se mostraram de grande utilidade para a descoberta de drogas modernas.

Centenas de compostos naturais produzidos por endofticos como, alcalides,

terpenides, flavonides, esterides, antibiticos, foram relatados (GUO et al., 2008;

VERMA et al., 2009).

Calcula-se que pode haver cerca de 1 milho de espcies endofticas diferentes,

porm, somente poucas espcies foram estudadas at o momento, o que representa

uma grande oportunidade para encontrar novos produtos naturais sintetizados por eles

de interesse farmacolgico (GUO et al., 2008; KOUR et al., 2008). Dentro deste

contexto, cabe destacar alguns microrganismos endofticos, como Fusarium

subglutinans que produz subglutinol com funo imunosupressiva, tendo como planta

hospedeira Triptergium wilfordii (LEE et al., 1995); Paenibacillus amylolyticus, que

produz e ativa a enzima pectinaliase, tendo como planta hospedeira Coffea arabica

(SAKIYAMA, et al., 2001); Pestalotiopsis microspora presente nos tecidos de Terminalia

morobensis, produzindo compostos antioxidantes (HARPER et al., 2003).

Recentes estudos tem mostrado interesse em fungos endofticos com atividade

antimicrobiana para controlar patgenos veiculados pelos alimentos como

Staphylococcus aureus e Listeria monocytogenes, e as toxinas produzidas por esses

microrganismos (LIU et al., 2008). Ainda sob o ponto de vista alimentar, a aflatoxina

uma toxina produzida por fungos que constitui uma grande preocupao para a sade

31

humana, devido a sua capacidade carcinognica (CHO et al., 2009; SOUZA et al.,

2004). Cho et al. (2009) concluram que a bactria Bacillus pumilus pode ser utilizada

no controle dos fungos Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus, na inibio de

aflatoxina por eles produzida, alm de promover benefcios adicionais como ao

antitumoral, antimicoplasmtica, hemoltica e atividade fibrinoltica, quando adicionada

no alimento.

A podofilotoxina uma molcula bioativa potente no combate ao cncer, sendo

encontrada em diversas espcies vegetais, porm, sua sntese qumica restrita,

devido complexidade da estrutura da molcula com baixo rendimento pelos mtodos

disponveis. Entretanto, recentes estudos mostram a produo dessa molcula por

microrganismos endofticos Podophyllum hexandrum, Podophyllum peltatum e

Fusarium oxysporum (KOUR et al., 2008).

Indubitavelmente, uma das descobertas mais importantes com endofticos foi o

isolamento do microrganismo Taxomyces andreanae produtor de taxol, um diterpenide

considerado uma droga anticancergena potente, mas a proviso desta droga esteve

limitada pela explorao destrutiva da rvore usada como a fonte principal de taxol,

porm, com a descoberta do Taxomyces andreanae produtor de taxol, esse problema

pde ser resolvido (GANGADEVI; MUTHUMARY, 2008; GUO et al., 2008; WANG et al.,

2000). Assim, ao se produzir certas drogas fitoqumicas, utilizando microrganismos

endofticos, muitos problemas poderiam ser evitados, como o lento crescimento das

plantas que tambm produzem esses compostos, ou at mesmo o impacto ambiental

causado pela extrao desses compostos (LIN et al., 2007).

A produo de uma mlecula bioativa por microrganismos endofticos, que eram

somente encontradas em determinadas espcies vegetais, comprova a teoria de que

durante a colonizao da planta hospedeira esses microrganismos se adaptam ao

microambiente vegetal e assimilam parte do DNA vegetal em seu genoma, constituindo

um processo de co-evoluo, no qual os endfitos adquirem de seus hospedeiros a

capacidade de biossntese de compostos bioativos (KOUR et al., 2008). Outras teorias

assumem que o inverso tambm verdadeiro, de modo que parte do DNA microbiano,

durante um processo de co-evoluo, foi assimilado ao genoma da planta, e o que era

uma exclusividade do endfito passa a ser do seu hospedeiro tambm (PILEGGI, 2006).

32

3.3.3 Implicao na Cultura de Tecidos

Embora j existam protocolos variados de cultura de tecidos, faz-se necessrio

avaliar a qualidade do sistema comercial de multiplicao in vitro, uma vez que esta

influenciada por diversos fatores como taxa de multiplicao, altura das plantas,

presena e intensidade de estiolamento, forma, colorao e tamanho das folhas,

formao de calos, desenvolvimento de razes, perdas por contaminao microbiana,

oxidao e eficincia da aclimatao (OLIVEIRA; SILVEIRA; SILVA, 2001).

Neste contexto, inmeros esforos so necessrios para o aprimoramento dos

processos de multiplicao in vitro e o controle da qualidade das mudas, aliados

reduo de custos, para aceitao no mercado (NIETSCHE et al., 2006). Os

microrganismos endofticos tem despontado como importantes aliados no processo de

microprogao, segundo Pirttil et al. (2008), o gentipo da planta e a composio de

espcies endofticas, aliados s condies de cultivo in vitro, representam um fator

chave para a obteno de culturas com alta capacidade de regenerao.

Os endofticos foram documentados em uma grande variedade de espcies

vegetais em cultura de tecidos (THOMAS et al., 2007). Embora existam estudos que

mencionam a presena desses microrganismos como uma contaminao, outros

confirmam a associao benfica dos endofticos na micropropagao e cultura de

clulas, auxiliando no ajuste osmtico, no desenvolvimento, pela produo de

fitormnios, absoro de nutrientes e proteo contra ao de patgenos, alm de

favorecer o processo de aclimatizao das mudas em casa de vegetao (ABREU-

TARAZI et al., 2010; ALMEIDA; YARA; ALMEIDA, 2005; ALMEIDA et al., 2009; DIAS et

al. 2009; PIRTTIL et al., 2000).

Espcies endofticas do gnero Methylobacterium so relatadas na literatura

como benficas na cultura de tecidos vegetais, por promoverem a embriognese e

organognese, alm de induzirem a formao de calos e brotao em Triticum

aestivum, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, e Linum usitatissimum, e permitir o

desenvolvimento das plantas regeneradas, pela biossintese de compostos e fitormnios

como auxina e citocininas (PIRTTIL et al., 2008; TROTSENKO; IVANOVA;

DORONINA, 2001).

33

Alm dos microrganismos endofticos que naturalmente colonizam os tecidos

vegetais, uma outra alternativa para melhorar a produo das microplantas, encontra-se

na utilizao de endfitos selecionados e inoculados de maneira assptica nas

espcies, de modo a favorecer ou potencializar o desenvolvimento e regenerao

destas in vitro (SENTHILKUMAR et al., 2008). Segundo Barrow; Osuna-Avila e Reyes-

Vera (2004), a micropropagao uma valiosa ferramenta na identificao de

endofticos, para estudar suas relaes e interaes com a planta hospedeira em nveis

gentico, celular e fisiolgico.

3.3.4 Mtodos de Anlise

3.3.4.1 Anlise Histolgica da Planta Hospedeira

Sabendo-se que muitas bactrias endofticas podem ser consideradas

fastidiosas ou no cultivveis pelos mtodos tradicionais, restringindo os estudos a

espcies cultivadas, que na maioria j so conhecidas, a aplicao de tcnicas de

microscopia de luz, anlises ultraestruturais por meio de microscopia eletrnica de

transmisso e de varredura, associada s tcnicas de biologia molecular permitem a

identificao e caracterizao desses microrganismos endofticos com maior amplitude

(KIRCHHOF et al., 1997; UEDA et al., 1995).

Uma das grandes lacunas no conhecimento dentro da pesquisa de endfitos est

na definio dos stios de colonizao, neste sentido, estudos com anatomia e

microscopia ganham espao importante (THOMAS et al., 2007, 2008; THOMAS;

KUMARI, 2010; THOMAS; SOLY, 2009). Os microrganismos endofticos podem ser

detectados no interior de tecidos vegetais por meio de microscopia tica (WHITE Jr.;

MORGAN-JONES; MORROW, 1993) ou eletrnica (VIRET; PETRINI, 1994).

Dentre os mtodos de anlise da comunidade endoftica presente na planta

hospedeira, a anlise histolgica das plantas o mtodo mais direto de observao,

verificao e comprovao de sua existncia, podendo servir como uma ferramenta

auxiliar na deteco de endofticos, bem como avaliar as regies de colonizao, como

rgos, tecidos e at clulas, de maior incidncia desse microrganismo e aferir sua

34

existncia em determinada planta, como pode ser observado nos trabalho de Silvani et

al. (2008) e de Mandyam e Jumpponen (2008), que utilizaram cortes anatmicos como

uma ferramenta auxiliar na deteco de microrganismos endofticos.

Jansa e Vostka (2000) ao analisarem a presena de fungos micorrzicos em

razes de plantas da famlia Ericaceae, utilizaram a anlise histolgica para identificar o

local de colonizao, verificando uma ntima associao entre os fungos e as clulas

corticais da raiz dessas espcies, bem como observar as estruturas tpicas desses

fungos.

Alm dos cortes histolgicos fixados e emblocados, so feitos tambm cortes a

fresco, para testes histoqumicos que podem permitir a avaliao e deteco de

compostos presentes nas plantas (ABREU-TARAZI, 2010), bem como, para verificao

de movimentos dos microrganismos endofticos gerados por condies ambientais,

Donato et al. (2005), por exemplo, observaram, alm da presena de microrganismos

endofticos, bactrias que apresentavam movimentos espiralados quando prximos

bolhas de ar, caractersticos de Herbaspirillum spp. O mesmo ocorre no trabalho de

bacteriossomos presentes em plantas de Bactris gasipaes (pupunheira) realizado por

Almeida et al. (2009).

Alm da possibilidade de verificar movimentos dos microrganismos, possvel

observar os locais de preferncia, por fornecer condies adequadas para o

crescimento e colonizao, utilizando a microscopia de luz, microscopia eletrnica de

transmisso e varredura para diferentes espcies como arroz (BACILIO-JIMNEZ et al.,

2001), tomate (EL-TARABILY, 2008), repolho chins (YONEZAWA et al., 2004), cevada

(OHTAKA; NARIZAWA, 2008), que utilizam esses mtodos para localizao dos

endfitos e determinao das formas de colonizao nas diferentes espcies.

3.3.4.2 Isolamento

O mtodo de isolamento dos endofticos utilizado para a identificao dos

microrganismos, pois a partir do crescimento desses isolados, possvel observar a

configurao das colnias e realizar anlises morfolgicas, fisiolgicas e qumicas

(CHO et al., 2007). Segundo Garbeva et al. (2001), toda a informao sobre a

35

ocorrncia de microrganismos endofticos e a estrutura de suas comunidades tem sido

obtida por tcnicas de cultivo microbiano, considerando que a caracterizao dos

isolados obtidos principalmente executada pela utilizao das fontes de carbono, ou

por anlises de cido metil-ster.

Os cuidados para se realizar o isolamento de microrganismos endofticos vo

desde uma boa desinfestao da superfcie das plantas para a remoo de epifticos

at a avaliao de caractersticas como, a idade da planta e dos rgos utilizados, a

temperatura de incubao das placas para o isolamento, recorrncia do isolado, que

revela o seu verdadeiro estado endoftico, alm do local e a poca da coleta das

plantas, uma vez que a microbiota isolada de vegetais de regies temperadas, possui

maior diversidade do que a microbiota encontrada em espcies de regies tropicais,

tanto em termos quantitativos quanto qualitativos (PILEGGI, 2006).

Tais cuidados devem levar em considerao, tambm, a escolha adequada dos

meios de cultura, de acordo com o grupo de endfitos que se deseja isolar, podendo ser

acrescentadas substncias seletivas, como antibiticos, que inibem o crescimento de

bactrias, ou fungicidas, que restringem o crescimento de fungos (PILEGGI, 2006).

Scrugli et al. (2000), isolaram fungos endofticos de razes de vrias espcies de

orqudeas, dos gneros Barlia, Epipactis, Limodorum, Neottia, Ophrys e Orchis, notando

que no meio BDA (Batata, Agar e Dextrose) os resultados foram melhor evidenciados

do que no meio Meller Hinton. Pereira; Carneiro-Vieira e Azevedo (1999) isolaram

microrganismos endofticos de plantas de bananeira e observaram que os fungos

isolados eram passveis de serem selecionados sob as condies de cultivo utilizadas.

Outros autores utilizaram o isolamento para a identificao e caracterizao de

endofticos presentes em diferentes espcies vegetais como, banana (THOMAS et al.,

2008), morango (DIAS et al., 2009), pupunheira (ALMEIDA; YARA; ALMEIDA, 2005),

Guarea guidonia, Tabebuia rosea, Manilkara bidentata (GAMBOA; LAUREANO;

BAYMAN, 2002), Echinacea purpurea e Echinacea pallida (LATA et al., 2006).

Panicker et al. (2007) isolaram bactrias endofticas de crisntemo para sua

identificao, atravs da cor e morfologia das colnias no meio de cultura. Ohtaka e

Narizawa (2008) realizaram a caracterizao morfolgica das colnias isoladas e

observaram as estruturas reprodutivas dos endofticos. Bandara, Seneviratne e

36

Kulasooriya (2006) isolaram endofticos de arroz encontrando uma grande diversidade

de bactrias gram-negativas e gram-positivas, fungos e actinomicetos.

Muitos estudos utilizam o isolamento para identificar possveis funes dos

microrganismos endofticos dentro da planta hospedeira, como o caso dos trabalhos

de Jansa e Vostka (2000) que isolaram fungos micorrzicos e inocularam na planta

para verificar seu potencial fixador; Sun et al. (2006) que ao isolarem os endofticos,

obtiveram como resultado a produo por parte desses microrganismos de compostos

secundrios com funo antimicrobiana e Senthilkumar et al. (2008) que isolaram

endofticos de arroz e verificaram um grande potencial de fixao de nitrognio desses

microrganismos.

A realizao de mtodos de isolamento para verificar a possvel produo de

novas drogas ou substncias de interesse farmacolgico, tem sido amplamente

utilizada, como o caso do trabalho de Lin et al. (2007) que isolaram e caracterizaram

morfologicamente os corpos de frutificao dos microrganismos endofticos presentes

nos tecidos da raiz de Camptotheca acuminata, bem como a identificao de

substncias bioativas; e Kour et al. (2008) que realizaram o isolamento de endofticos

com potencial de produo de substncias anticancergenas.

O isolamento mesmo sendo um mtodo amplamente utilizado ainda hoje nas

pesquisas com endofticos, possui como desvantagem o fato de que certas espcies de

microrganismos podem ter exigncias especficas para crescimento e,

consequentemente, no desenvolvero colnias prontamente nas placas, havendo,

portanto, uma limitao desse processo de anlise, por no se conhecer perfeitamente

as caractersticas e necessidades desses microrganismos (GARBEVA et al., 2001).

3.3.4.3 Anlise Molecular

A maioria das informaes sobre diversidade endoftica bacteriana foi obtida

usando mtodos de isolamento em meios de cultura, porm, devido ao

desconhecimento das condies e exigncias para o crescimento de muitas bactrias e

a presena de clulas no cultivveis, a diversidade encontrada por essa tcnica no

chega a 1% das espcies bacterianas presentes na planta (LACAVA et al., 2006; SUN

37

et al., 2008). Dessa forma, a melhoria da caracterizao e anlise dessas comunidades

tem sido o foco de muitos estudos, principalmente no tocante ao desenvolvimento de

tcnicas de biologia molecular capazes de permitir o estudo da comunidade endoftica

em seu habitat (LACAVA et al., 2006).

As anlises moleculares, com destaque quelas que utilizam gene 16S de rDNA,

permitem a avaliao direta da diversidade estrutural das comunidades microbianas,

superando, assim, as limitaes do processo de cultivo desses microrganismos,

podendo ser utilizadas nos mais diversos ambientes: solo, rizosfera, alimentos e

intestino humano (GARBEVA et al., 2001; LACAVA et al., 2006; REITER et al., 2003;

SUN et al., 2008).

A diversidade das comunidades bacterianas pode ser avaliada pela amplificao,

em reaes em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction PCR), de regies

variveis de gene ribosomal 16S a partir de extratos de DNA natural, usando primers

de regies bacteriais conservadas, juntamente com tcnicas de fingerprinting como

ARDRA (Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis), DGGE (Denaturing Gradient

Gel Eletrophoresis), TGGE (Temperature Gradient Gel Electrophoresis), RISA

(Ribosomal Intergenic Spacer Analysis), ARISA (Automated Ribosomal Intergenic

Spacer Analysis), T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism) e

SSCP (Single-strand Conformation Polymorphism) (ABREU-TARAZI, 2010; ABREU-

TARAZI et al., 2010; ANDREOTE et al., 2010; ANDREOTE; AZEVEDO; ARAJO,

2009; GARBEVA et al., 2001; OROS-SICHLER et al., 2007).

Dentre as metodologias baseadas no 16S rDNA, destaca-se o DGGE por

fornecer uma rpida caracterizao das comunidades microbianas cultivveis e no

cultivveis (ARAJO et al., 2002; LACAVA et al., 2006; REITER et al., 2003). Esta

tcnica identifica diferenas estabelecidas no comportamento desnaturante da dupla fita

de DNA, com mesmo comprimento, mas diferentes quanto composio bsica, que

submetida a um gradiente crescente de concentrao de agentes desnaturantes (uria

e formamida), se separam em fragmentos discretos, chamados de domnios de

desnaturao (GARBEVA et al., 2001; LACAVA et al., 2006). Sua aplicabilidade se

relaciona ao estudo de comunidades endofticas de diversas espcies vegetais como

batata (GARBEVA et al., 2001), citros (ARAJO et al., 2002), banana (THOMAS et al.,

38

2008), pupunheira (ALMEIDA et al., 2009), abacaxi (ABREU-TARAZI et al., 2010) e

eucalipto (ANDREOTE et al., 2009a, 2009b), todos demonstrando que o DGGE pode

auxiliar no estudo da diversidade microbiana independentemente da capacidade de

crescerem ou no, em meio de cultura.

Para avaliar a comunidade endoftica com o uso da tcnica de DGGE, deve-se

ter o cuidado de minimizar interferncias por parte das organelas vegetais (cloroplasto e

mitocndrias), realizando a escolha de primers que tenham maior sensibilidade com o

gene 16S rDNA de bactria (SUN et al., 2008; THOMAS; SOLY, 2009). Visando

eliminar essa interferncia, sugere-se o uso dos primers 799f (CHELIUS; TRIPLETT,

2001) e 1492r (LANE, 1991) para aumentar a concentrao do DNA bacteriano antes

da amplificao com grampo GC (ANDREOTE; AZEVEDO; ARAJO, 2009).

39

4 MATERIAL E MTODOS

Foram analisadas espcies vegetais cultivadas in vitro, provenientes de trs

laboratrios: Laboratrio de Fisiologia de rvores do Departamento de Cincias

Florestais; Laboratrio de Cultura de Tecidos (CEBTEC) e Laboratrio de Morfognese

e Biologia Reprodutiva de Plantas, ambos do Departamento de Cincias Biolgicas,

todos pertencentes Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz - USP

Piracicaba/SP. A Figura 2 ilustra as etapas que foram seguidas, bem como as

diferentes anlises que foram realizadas para avaliao da microbiota endoftica.

Figura 2 Diagrama explicativo das etapas realizadas no trabalho. Linhas contnuas representam os objetivos ou mtodos de anlises dos resultados. Linhas pontilhadas representam os procedimentos intermedirios

40

4.1 Material Vegetal

As espcies de microplantas estudadas foram: Abacaxi (Ananas comosus),

Cana-de-acar (Saccharum officinarum), Crcuma (Curcuma zedoaria), Eucalipto

(Eucalyptus globulus), Manjerico (Ocimum basilicum), Mogno (Swietenia

macrophylla), Orqudea (Oncidium flexuosum), Pinheiro (Pinus taeda), Pupunheira

(Bactris gasipaes), Sequia (Sequoia sempervirens), Teca (Tectona grandis) e Violeta

(Viola odorata). Todas assintomticas, consideradas axnicas, provenientes de cultivo

in vitro e estabelecidas em protocolo de micropropagao, em fase de multiplicao por

mais de 1 ano. A Tabela 1 mostra a distribuio das espcies de microplantas nos trs

laboratrios.

Tabela 1 Distribuio das espcies de microplantas nos diferentes laboratrios, com a

diviso das espcies comuns aos trs laboratrios, consideradas por essa

razo como controle entre as espcies e as demais espcies avaliadas

ESPCIE

LABORATRIO

1 2 3

CONTROLE Abacaxi Abacaxi Abacaxi

Orqudea Orqudea Orqudea

DEMAIS ESPCIES

Teca Eucalipto Manjerico

Pinheiro Cana-de-acar Mogno

Sequia Crcuma Pupunheira

Violeta Violeta

Laboratrio 1 = Fisiologia de rvores (Dep. de Cincias Florestais), Laboratrio 2 = Cultura de Tecidos (CEBTEC Dep. de Cincias Biolgicas) e Laboratrio 3 = Morfognese e Biologia Reprodutiva de Plantas (Dep. de Cincias Biolgicas).

41

O controle foi constitudo por duas espcies de microplantas (abacaxi e

orqudea) provenientes dos trs locais de cultivo (laboratrio de Morfognese e Biologia

Reprodutiva de Plantas, laboratrio de Cultura de Tecidos e laboratrio de Fisiologia de

rvores). As demais espcies so provenientes de maneira aleatria, como mostra a

tabela, nesses trs laboratrios, Ao todo 12 espcies foram avaliadas, porm, 17

microplantas, devido s espcies que se repetem nos laboratrios, como caso de

abacaxi, orqudea e violeta.

As anlises para confirmar a presena e identificar os microrganismos endofticos

foram descritas nos itens a seguir.

4.2 Microplantas

4.2.1 Testes Histoqumicos

As microplantas foram analisadas por meio de testes histoqumicos de

coloraes especficas segundo o componente celular a ser identificado, em cortes a

fresco do tero mediano das lminas foliares retiradas do primeiro n completamente

expandido de cada planta.

Para a caracterizao de lipdeos utilizou-se Sudan Black B (PEARSE, 1968), de

amido o reagente de Lugol (BERLYN; MIKSCHE, 1976), e de compostos fenlicos a

soluo aquosa de cloreto frrico (JOHANSEN, 1940). Aps a colorao, os materiais

foram montados em lminas semi-permanentes, e fotomicrografados, atribuindo-se o

critrio de avaliao segundo os parmetros: ausncia (-) ou presena (+) das

substncias e, quantitativamente, classificados como pouco presente (+),

moderadamente presente (++) ou intensamente presente (+++), de acordo com a

intensidade das respostas aos testes aplicados, destacando-se que simultaneamente

aos testes foram realizadas seces-controle.

42

4.2.2 Anlises Ultraestruturais

As avaliaes por meio de microscopia eletrnica de varredura e transmisso

foram realizadas no laboratrio do Ncleo de Apoio Pesquisa/ Microscopia Eletrnica

Aplicada Pesquisa Agropecuria (NAP/MEPA/ESALQ/USP). Como forma de

padronizao das analises, as amostras foram constitudas da regio mediana da

lmina foliar retirada do primeiro n expandido de cada planta.

4.2.2.1 Microscopia Eletrnica de Varredura (MEV)

Para localizao da microbiota endoftica amostras, da regio mediana da lmina

foliar retirada do primeiro n expandido de cada microplanta, foram fixadas em soluo

de Karnovsky (KARNOVSKY, 1965) modificado (Glutaraldedo 2,5 %, Formaldedo

2,5 % em tampo cacodilato de sdio 0,05 M, pH 7,2, CaCl2 0,001 M). Aps a fixao

as amostras foram lavadas trs vezes por cinco minutos com tampo cacodilato de

sdio 0.05 M, e deixadas em glicerina 30 % (em tampo cacodilato) por 2 horas. A

seguir as amostras foram criofraturadas com nitrognio lquido e desidratadas em srie

cetnica (30, 50, 70, 90 e 100 %) e pela tcnica do ponto crtico de CO2, em aparelho

Balzers CPD 030. As amostras foram aderidas, com fita dupla face de carbono, a um

suporte adequado (stubs) e submetidas ao recobrimento com ouro-paldio em

metalizador BAL-TEC SCD 050 por 180 segundos. Finalmente foram examinadas em

microscpio eletrnico de varredura (ZEISS, DSM 940 A), utilizando-se 80 A de

amperagem e 15 kV de voltagem.

4.2.2.2 Microscopia Eletrnica de Transmisso (MET)

Para visualizao da microbiota endoftica foram seccionadas as lminas foliares

das microplantas em pequenos segmentos e esses fixados por 24 horas em soluo de

Karnovsky (KARNOVSKY, 1965) tamponado com cacodilato de sdio 0,2 M, em pH 7,2.

Aps esse perodo foram lavados no tampo cacodilato de sdio 0,05 % durante 5

minutos por trs vezes. A seguir as amostras foram fixadas durante 1 hora com

43

tetrxido de smio a 1 % (v/v), lavadas por trs vezes com gua destilada, pr-coradas

com acetato de uranila 2,5 %, pernoite a 4 C, desidratadas gradualmente em srie

cetnica (30, 50, 70, 90 e 100 %). A infiltrao pela Spurr, foi realizada gradativamente,

primeiro com cetona 100 % e resina pura, numa proporo 1:1 (metade de acetona 100

% e metade de resina pura) por 5 horas e a segunda com resina pura pernoite em

temperatura ambiente. Posteriormente, a resina foi polimerizada em estufa a 70 C

durante 72 horas. Os cortes foram examinados ao microscpio eletrnico de

transmisso. Os blocos foram cortados em ultramicrotomo (Leica Ultracut UCT) com

lmina de diamante (450). As seces obtidas com aproximadamente 70 nm de

espessura foram montadas em telas de 200 mesh, contrastadas com acetato de uranila

e citrato de chumbo (REYNOLDS, 1963) e observadas em microscpio eletrnico de

transmisso (Zeiss EM 900) operando em 50 kV.

4.2.3 Anlise Molecular

As anlises moleculares foram realizadas no laboratrio de Biologia Celular e

Molecular do Centro de Energia Nuclear na Agricultura (CENA/USP), com a co-

orientao da Profa. Dra. Siu Mui Tsai.

Visando conhecer a estrutura e a diversidade bacteriana endoftica das

microplantas assintomticas foram utilizados mtodos baseados na anlise da

heterogeneidade de cidos nuclicos por meio de amplificao por PCR especfica para

o gene 16S rRNA, seguida pelo mtodo de PCR-DGGE. Para todas as anlises o

procedimento iniciou-se com a desinfestao superficial das microplantas (ARAJO et

al., 2002). Visando confirmar o sucesso do procedimento de desinfestao superficial,

fragmentos das microplantas e alquotas da gua esterilizada utilizada para a lavagem

final foram plaqueados em meio de cultura TSA (Tryptic Soy Agar, Difco). As placas

foram incubadas a 28 C por sete dias para verificao de um possvel crescimento

bacteriano. Diante dos resultados desse teste, foram utilizadas para anlises

posteriores, somente as amostras de plantas que no foram consideradas

contaminadas.

44

Todas as reaes de PCR foram realizadas em termociclador GeneAmp PCR

System 9700 (Applied Biosystems) e as reaes de sequenciamento no sequenciador

automtico ABI Prism 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems). Aps cada PCR

realizada, uma alquota de 5 L de cada produto foi avaliada em comparao com o

marcador 100 pb (Invitrogen) aps corrida eletrofortica a 90 V por 30 minutos em gel

de agarose 1 %, usando tampo TSB (BRODY; KERN, 2004). Os gis foram

documentados usando o programa Kodak digital science 1D (Scientific Imaging

Systems). Quando necessrio, as amostras tambm foram quantificadas em

espectrofotmetro NanoDrop ND-1000 (Thermo Scientific).

4.2.3.1 Extrao do DNA Genmico Total das Microplantas

A extrao do DNA total das amostras foi realizada segundo (FERREIRA;

GRATTAPAGLIA, 1998). Para tanto, foram utilizadas microplantas inteiras e

assintomticas. Cada amostra constituiu-se de 200 mg de tecido fresco que foram

trituradas em N2 lquido. O tecido triturado foi exposto a 700 L de tampo de extrao

(CTAB 2 % (p/v); NaCl 1,4 M; Tris HCl 100 mM pH 8,0; EDTA 20 mM) e incubado por

30 min a 65 C, seguido por duas extraes: a primeira com 450 L de

clorofrmio:lcool isoamlico (24:1) e a segunda com 450 L de fenol tamponado. Aps

centrifugao de 5 minutos a 13.000 x g o DNA foi precipitado com 500 L de

isopropanol a -20 C por 30 a 60 min. O precipitado obtido foi novamente centrifugado e

posteriormente lavado com etanol 70 % e 100 %. Aps secagem o DNA foi

ressuspenso em 50 L de tampo TE (Tris HCl 10 mM pH 8,0; EDTA 1 mM) e

posteriormente tratado com 2 L de RNAse (10 mg/mL) por 30 min a 37 C.

Um volume de 5 L de DNA foi carregado em gel de agarose 1 % (p/v), corado

com brometo de etdeo em tampo TSB (BRODY; KERN, 2004) e comparado com os

padres Low DNA Mass ladder (Invitrogen) para estimar a quantidade de DNA e/ou

/Hind III (Invitrogen) para verificar a integridade da molcula de DNA extrada. Os gis

foram documentados usando o programa Kodak digital science 1D (Scientific Imaging

Systems). As amostras tambm foram quantificadas em espectrofotmetro NanoDrop

ND-1000 (Thermo Scientific).

45

4.2.3.2. Amplificao do Gene 16S rRNA de Bacteria

Para a amplificao de uma regio especfica do gene 16S rRNA de Bacteria foi

utilizado o seguinte conjunto de iniciadores fD1 (5 AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG

3) e rD1 (5 AAG GAG GTG ATC CAG CC 3) (WEISBURG et al., 1991) - da empresa

IDT Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville IA, EUA. As amplificaes foram

feitas em soluo contendo: 2,5 L de tampo para PCR 10 X, 0,1 mM de cada dNTP

(0,25 L), 1,5 mM de MgCl2 (0,75 L), 5 pmol de cada iniciador (1 L), 1 U de

PlatinumR Taq DNA Polimerase (Invitrogen) (0,2 L), 1 L da amostra de DNA total e

gua ultrapura (Milli-Q) esterilizada para um volume final de 25 L. As amplificaes

foram realizadas em termociclador modelo GeneAmp PCR System 9700 (Applied

Biosystems). A amplificao ocorreu nas seguintes condies: 94 C por 3 minutos, 30

ciclos de 94 C por 1 minuto, 55 C por 30 segundos e 72 C por 30 segundos; e 72 C

por 10 minutos.

Com as mesmas amostras de DNA foi realizada outra PCR. Desta vez o intuito

foi garantir que o DNA bacteriano eventualmente encontrado, fosse realmente

procedente de alguma bactria endoftica. Para tanto foram utilizados os

oligonucleotdeos 799f (5'AAC MGG ATT AGA TAC CCK G 3') (CHELIUS; TRIPLETT,

2001) 1492r (5'TAC GG(C/T) TAC CTT GTT ACG ACT T 3') (LANE, 1991). A reao de

amplificao (PCR) foi feita em soluo contendo: 2,5 L de tampo para PCR 10 X,

0,1 mM de cada dNTP (0,25 L), 2,5 mM de MgCl2 (0,75 L), 5 pmol de cada

oligonucleotdeo (1 L), 1U de Platinum Taq DNA Polimerase (Invitrogen) (0,2 L),

1 L da amostra de DNA e gua ultrapura (Milli-Q) esterilizada para um volume final de

25 L. A reao foi realizada nas seguintes condies: um ciclo de desnaturao inicial

a 95 C por 3 min, 35 ciclos de desnaturao a 94 C por 20 s, anelamento a 53 C por

40 s e extenso a 72 C por 40 s, extenso final a 72 C por 10 minutos. Ao final do

programa as mostras permaneceram no termociclador a 4 C.

46

4.2.3.3 PCR-DGGE

Os produtos resultantes das primeiras amplificaes, descritas no item anterior,

foram utilizados como DNA molde (~20 ng) para a reao com os primers universais

F984/GC (5 CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG

GCA ACG CGA AGA ACC TTA C 3) e r1378 (5CGG TGT GTA CAA GGC CCG GGA

ACG 3) (HEUER et al., 1997), usando 30 ciclos com temperatura de anelamento a

59 C. A reao de PCR-DGGE foi preparada para um volume final de 25 L, usando

2,5 L de tampo para PCR 10x, 0,2 mM de cada dNTP, 5 pmol de cada primer, 1 U de

Platinum Taq DNA Polimerase (Invitrogen) (0,2 L), com 2,5 mM MgCl2 e presena de

0,25 L formamida deionizada. As amplificaes foram realizadas nas seguintes

condies: 94 C por 4 min, 30 ciclos de 94 C por 1 min, 59 C por 1 min e 72 C por

2 min; e 72 C por 10 min.

4.2.3.4 Eletroforese em Gel com Gradiente Desnaturante (DGGE)

O DGGE foi realizado usando o sistema phorU2 (Ingeny, Goes, Holanda). O

protocolo da tcnica de DGGE foi adaptado de Muyzer, de Waal e Uitterlinden (1993).

Os produtos amplificados na segunda reao de PCR foram separados por eletroforese

em gel de poliacrilamida 6 % (p/v) em tampo TAE 0,5x (10 mM de Tris-acetato e 0,5

mM de EDTA, pH 8,0). O gel foi preparado com gradiente desnaturante linear 45-65 %

(onde 100 % de desnaturao significa 7 M de uria e 40 % de formamida). O gel foi

submetido eletroforese vertical por 4 h a 200 V em temperatura constante de 60 C.

Aps a eletroforese o gel foi corado com nitrato de prata 0,2 % e fotodocumentados. As

imagens do gel foram normalizadas e os perfis foram analisados utilizando-se a

plataforma do software