UNIVERSITATEA POLITEHNICA DIN BUCUREȘTI FACULTATEA DE CHIMIE APLICATĂ ȘI ȘTIINȚA MATERIALELOR

NANOFIRE POLIMERICE

ELECTROCONDUCTIVE CE FACILITEAZĂ

ADEZIUNEA, PROLIFERAREA SI

DIFERENTIEREA LINIEI DE CELULE STEM

NEURONALE IN VITRO

BUCUREȘTI2012

I. Introducere

Terapiile bazate pe ingineria țesutului celulelor stem pot aduce beneficii importante

pacienților care trăiesc cu boli neurologice și dereglări ce implică o perturbare funcțională

și/sau o schimbare patologică în măduva spinării. De exemplu boli ca poliomielita, pojarul

sau herpesul pot provoca mielită, o inflamație a măduvei spinării. Mielopatia vasculară este

un alt tip de tulburare a măduvei spinării și, adesea, rezultă din malformații vasculare ale

măduvei spinării. Când tulburările măduvei spinării sunt cauzate de o traumă, ea este

menționată ca o rană a măduvei spinării (SCI). Majoritatea indivizilor ce au tulburări la

nivelul măduvei spinării prezintă acest tip de răni cauzate de o traumă. Cauzele acestor traum

includ accidentele de mașină, actele de violență, căzăturile și practicarea sporturilor. În anul

2009 numărul de persoane cu astfel de tulburări a fost estimat a fi între 231000-311000. Mai

mult, 52% din aceste persoane sunt paralizate, adică funcția senzorială a extremităților

inferioare este afectată și își pot folosi numai extremitățile superioare. Restul de 48% sunt

tetraplegici, funcția senzorială a întregului corp este afectată, nu-și pot utiliza membrele și

trunchiul. Din păcate, nu există nici o modalitate dovedită clinic pentru a inversa procesul de

deterioare a măduvei spinării. Tratamentul actual se axează pe prevenirea agravării rănilor și

pentru ca cei afectați să poată avea o viață activă. Cercetătorii continuă să lucreze pe

tratamente inovatoare, cum ar fi injecțiile directe cu celule stem și terapie cu celule stem

asociate cu ingineria tisulară care poate promova regenerarea celulelor nervoase sau

îmbunătățirea funcției nervilor ce rămân în urma SCI.

Nanotehnologia oferă căi interesante de a explora terapiile bazate pe ingineria tisulară

a celulelor stem pentru a promova regenerarea celulelor nervoase sau pentru a îmbunătății

funcția nervilor rămași după SCI. Matricea țesuturilor fabricate cu o nanotopografie unică au

prezentat răspunsuri favorabile la celulele neuronale, atât in vitro cât și in vivo. Mai multe

studii in vitro au raportat o funcționalitate îmbunătățită a celulelor neuronale pe matrici de

nanofibre de polimer, matrici nanoporoase și matrici de nanofire. În plus, există dovezi

semnificative că celulele stem neuronale (NSC) promovează creșterea axonală extensivă când

sunt implantate cu matrice de nanofibre în locul rănii măduvei spinării și poate reduce de

asemenea și deficitele funcționale în cazul unei răni a nervului sciatic într-un model in vivo.

Astfel, se poate concluziona cu ușurință că nanotopografia pe suprafața unei matrici joacă un

rol pozitiv în interacțiile celule neuronale – suprafață. Cu toate acestea, majoritatea matricilor

nu au proprietăți fiziologice relevante ale suprafeței. În cazul celulelor mamare este cunoscută

aderența preferențială și diferențială pe suprafețe încărcate electric. De aceea, în timp ce

2

nanotopografia s-a dovedit că îmbunătățește răspunsul celular, este necesar să se

funcționalizeze matricea și să se creeze o suprafață încărcată electric pentru creșterea și

menținerea celulelor stem neuronale. Polipirolul, polimer electroconductiv, a atras un interes

substanțial pentru aplicații în ingineria tisulară neuronală datorită biocompatibilității sale,

ușurinței sintezei și proprietăților electrice. A fost utilizat frecvent în biosenzori și baterii

poliemere datorită acestor motive. Studiile au arătat că polipirolul are abilitatea de a promova

creșterea celulelor endoteliale, neuronilor primari și chiar cea a celulelor stem mezenchimale.

Nevoia unui polimer electroconductiv pentru aplicațiile de inginerie tisulară neuronală

decurge din faptul că suprafețele neîncărcate sunt mai puțin optime pentru promovarea

comportamentelor celulare fenotipe normale. În plus, capacitatea de a transmite un curent

electric celulelor prin intermediul suprafeței matricei poate avea unele avantaje. Cercetările

actuale au arătat că stimularea electrică fiziologic relevantă poate îmbunătății regenerarea

nervilor și ajută la refacerea celulelor stem neuronale în locul unei răni. Prin urmare, este

avantajoasă proiectarea unor matrici care nu numai că au o nanotopografie unică a suprafeței,

ci au, de asemenea și abilitatea de a oferi nivele fiziologice de stimulare electrică pentru a

modula și îmbunătății răspunsul lor celular.

În cadrul acestui stadiu, s-a dezvoltat o tehnică nanotemplate fără solvent pentru

fabricarea de suprafețe de tip nanofire de policaprolactonă (PCL) ca matrice pentru creșterea

și diferențierea celulelor stem neuronale. Suprafețele acestea de tip nanofire au fost apoi

acoperite cu polipirol (PPy) pentru a asigura o suprafață electroconductivă pentru interacțiile

celulă – suprafață. PCL a fost utilizată pentru fabricarea suprafețelor de tip nanofire datorită

biocompatibilității și biodegradabilității sale controlate. Nanofirele de PCL acoperite cu Ppy

au fost caracterizate utilizând spectroscopia fotoelectrică de raze X (XPS) și microscopie

electronică de scanare (SEM). În plus, stabilitatea nanofirelor de PCL acoperite cu Ppy în

condiții fiziologice a fost evaluată utilizând SEM și XPS. Celulele stem neuronale murinice

au fost folosite ca celule model pentru a studia viabilitatea, adeziunea, proliferarea și

diferențierea pe suprafețele de tip nanofire de PCL acoperite cu PPy. Această linie de celule a

derivat din stratul extern germinal a cerebelului unui șoarece nou-nascut. Cu toate acestea,

linia de celule C17.2 este un bun model de celule stem neuronale deoarece după izolare, ele

incă au abilitatea de a diferenția în neuroni și celule gliale. S-a demonstrat de asemenea că

linia de celule prezintă niveluri semnificative de mai mulți factori neurotrofici, inclusiv

factorul de creștere a nervilor, factorul neurotrofic derivat din creier și factorul neurotrofic

derivat din linia de celule gliale.

3

II. Metode experimentale

1. Fabricarea suprafețelor de nanofire de PCL

Suprafețele de nanofire

de PCL au fost fabricate conform unui protocol dezvltat anterior în

laborator și sunt ilustrate în Fig.1. Pe scurt, suprafețele de nanofire au fost

fabricate printr-o sinteză template din PCL utilizând membrane

nanoporoase de oxid de aluminiu cu o dimensiune a porilor de 20 nm.

Discuri de polimer (10mm diametru și aproximativ 2mm grosime) au fost

puse pe suprafața membranei (Fig.1A) și nanofirele au fost extrudate prin

membrane într-un cuptor la 115ºC timp de 3 minute (Fig.1B și 1C).

Membranele de oxid de aluminiu au fost dizolvate într-o soluție de NaOH

1M pentru 75 minute pentru îndepărtarea membranei, eliberând astfel

nanofirele extrudate (Fig.1D). Suprafețelor nanofirelor au fost apoi înmuiate

în apă și apoi clătite în apa DI, uscate și depozitate într-un exicator până la

utilizarea ulterioară.

Fig.1 Schema fabricării PCL-NW

2. Acoperirea suprafețelor nanofirelor de PCL cu Ppy

Suprafețele de nanofire au fost acoperite cu Ppy utilizând o tehnică de polimerizare.

Suprafețele de nanofire au fost ultrasonate într-o soluție de 14 mM pirol și 14 mM

sodiu para-toluen sulfonat pentru 30 de secunde pentru a satura suprafețele cu pirol.

Această procedură a fost urmată de o agitare blândă și incubarea suprafețelor de NW

timp de o ora la 4ºC. După îndepărtarea excesului de soluție de reacție, suprafețele de nanofire

de PCL acoperite cu PPy (Ppy-NW) au fost ultrasonate timp de 1 minut în apă DI urmată de

uscarea în cuptor sub vid.

4

3. Caracterizarea suprafețelor PPy-NW

Suprafețele de nanofire, atât cele acoperite cât și cele neacoperite, au fost caracterizate

utilizând SEM, XPS și măsurători ale rezistivității suprafeței. Stabilitatea acopririi în mediu

fiziologic a fost de asemenea caracterizată utilizând SEM și XPS.

Nanoarhitectura suprafeței înainte și după acoperirea cu PPy a fost evaluată utilizând

imaginile SEM.

Polimerizarea PPy din pirol pe suprafețele de PCL-NW implică încorporarea de

clorine și sodiu para-toluen sulfonat.

4. Cultura de celule stem neuronale

Celulele stem neuronale murinice, dezvoltate de grupul Dr. Evan Snyder, au fost

utilizate în studiul prezentat. Această linie de celule diferențiază în toate liniile neuronale.

Mediul utilizat pentru creșterea celulelor C17.2 a fost Invitrogenul suplimentat cu 10% ser

fetal bovin, 5% ser cabalin, 1% L-glutamină și 1% penicilină/streptomicină. Mediul a fost

schimbat la fiecare 2-3 zile, iar subcultura a fost făcută într-un raport de 1:10. Celulele au fost

menținute într-un incubator la 37ºC și 5% CO2. Nanofirele și suprafețele de PPy-NW au fost

sterilizate în 24 de godeuri prin incubarea lor cu 70% etanol pentru 30 min, urmată de

expunerea la lumină ultravioletă timp de 30 de minute într-un cabinet de biosecuritate. Înainte

de semănarea celulelor, toate substraturile au fost spălate de 3 ori cu PBS steril. Celulele

C17.2 au fost semănate la o densitate de 10000 de celule.

5. Adeziunea și proliferarea celulelor C17.2 pe suprafețele PCL-NW

Adeziunea și proliferarea celulelor au fost investigate după 1, 2 și 7 zile de cultură.

Suprafețele au fost îndepărtate din mediul de cultură, clătite cu PBS și incubate timp de 45min

la 37ºC.

5

III. Rezultate și discuții

Fig.2 Imagini SEM reprezentative pentru NW și PPy-NW

6

Imaginile SEM reprezenative arată că suprafețele de nanofire au o arhitectură

uniformă cu întreruperi ocazionale în uniformitate datorate prezenței aleatoare a

microcanalelor formate ca urmare a efectelor de încărcare de suprafață. Imaginile SEM arată

că nanofirele individuale ale suprafeței au un diametru de aproximativ 100-150 nm. Motivul

discrepanței dimensiunii dintre porii membranei și diametrul NW poate fi explicat prin

extinderea termodinamică a polimerului în timpul răcirii. În timpul extruziunii, PCL topită

umple nanoporii membranei (Fig.1B și 1C). În timp ce polimerul se topesște, exercită

presiune pe pereții nanoporilor. La dizolvarea membranei, polimerul răcit expandează ușor,

rezultând NW care sunt mai mari în diametru decât nanoporii. Totuși, prin utilizarea unei

membrane cu dimensiunea porilor diferită, suprafețele cu NW cu diametru diferit pot fi

fabricate.

Suprafețele de NW au fost acoperite cu PPy prin polimerizare. Necesitatea unui

polimer electroconductiv pentru aplicații de inginerie tisulară neuronală rezultă din faptul că

suprafețele neacoperite sunt mai puțin optime pentru comportamentul fenotipic neuronal. În

plus, capacitatea de a transmite un curent electric la celule prin suprafața matricei poate avea

unele avantaje în viitoarele aplicații ale ingineriei tisulare. Fig.2 (PPy-NW) prezintă imagini

SEM reprezentative ale suprafețelor PPy-NW. Aceste imagini arată că suprafețele menționate

au o arhitectură similară cu cea a suprafețelor NW la măriri mici. NW pe suprafețele acoperite

cu PPy își mențin orientarea, și mai important, NW individuale mențin un diametru

consecvent. Mai mult, imaginile SEM la măriri ridicate evidențiază faptul că NW individuale

ale suprafețelor PPy-NW au un diametru puțin mai mare în comparație cu cele ale

suprafețelor NW.

Suprafețele NW și PPy-NW au fost caracterizate utilizând XPS pentru a compara

compoziția chimică a fiecărei suprafețe și pentru a determina dacă polimerizarea a avut loc cu

succes pe suprafețele NW sau nu.

Studiile au arătat o adeziune îmbunătățită a celulelor pe suprafețe cu rezistivitate

scăzută in vitro. În plus, studiile au arătat o funcționalitate îmbunătățită a neuronilor când sunt

expuși la câmpuri electrice in vivo. Astfel, suprafețele de PPy-NW fabricate au un dublu

avantaj: o nanotopografie unică și scăderea rezistivității electrice a suprafeței, care pot fi

atribuite îmbunătățirii răspunsului celulelor stem neuronale.

7

8

Fig.3 Imagini ale celulelor stem neuronale realizate cu ajutorul microscopiei fluorescente

Adeziunea și proliferarea celulelor stem neuronale a fost evaluată după 1, 2 și 7 zile

de cultură. Rezultatele indică că suprafețele de PPy-NW au susținut o adeziune a celulelor

semnificativ mai mare comparativ cu suprafețele de NW după prima zi de cultură (Fig.3, ziua

1) . Celulele par de asemenea a avea o morfologie a împrăștierii pe suprafețele de PPy-NW,

indicând o migrație îmbunătățită. După 2 zile de cultură, celulele de pe supraftețele de PPy-

NW au prolifert și par a fi în contact cu celulele din apropiere (Fig.3, ziua 2). În timp ce,

celulele se înmulțesc pe suprafețele de NW, pare a fi un contact scăzut sau nici un contact sau

agregare. După 7 zile de cultură, există un număr semnificativ mai mare de celule viabile pe

suprafețele de PPy-NW în comparație cu suprafețele de NW (Fig.3, ziua 7). Celulele par a

forma o rețea neuronală pe suprafețele de PPy-NW.

Rezultatele indică faptul că nanotopografia suprafeței îmbunătățește adeziunea

celulelor și înmulțirea lor. Din rezultate reiese că asigurând nanotopografia cu o suprafață

electroconductivă a îmbunătățit semnificativ adeziunea și înmulțirea celulelor.

Fig.4 Imagini SEM ale celulelor stem neuronale pe suprafețe de NW și PPy-NW după 1, 2 și 7 zile de cultură

9

Din imaginile de microscopie fluorescentă rezultă că, celulele de pe suprafețele de PPy-NW prezintă o morfologie mai răspândită în comparație cu cele de pe suprafețele de NW după o zi de cultură (Fig.4, ziua 1). După 2 zile de cultură, celulele de pe suprafețele de PPy-NW prezintă un grad semnificativ mai mare de răspândire și par a fi în contact cu alte celule (Fig.4, ziua 2). După 7 zile de cultură, celulele au format ceea ce pare a fi o “rețea neuronală”(Fig.6, ziua 7).

IV. Concluzii

În cadrul acestui studiu s-a dezvoltat o tehnologie simplă pentru a fabrica suprafețe de

PCL-NW. Aceste suprafețe au fost apoi acoperite cu un film de PPy pentru a furniza o tehnică

fiziologic relevantă pentru creșterea și întreținerea celulelor stem neuronale. Rezultatele

prezentate confirmă că acoperirea cu PPy reduce rezistivitatea electrică a PCL-NW la un nivel

funcțional unde stimularea electrică poate fi aplicată pentru a controla creșterea neuronilor. În

plus, rezultatele indică faptul că scăderea rezistivității electrice a suprafeței crește

funcționalitatea celulelor stem neuronale C17.2 în termeni de adeziune, proliferare și

diferențiere. Astfel, prin controlul nanotopografiei suprafeței și oferind o suprafață încărcată

fiziologic relevant, funcționalitatea celulelor neuronale poate fi modificată pentru potențiale

aplicații în ingineria tisulară neuronală.

V. Bibliografie

1. Samuel Bechara, Lucas Wadman, Ketul C. Popat, “Electroconductive polymeric nanowire

templates facilities in vitro C17.2 neural stem cell line adhesion, proliferation and

differentiation”, Acta Bimaterialia 7, 2011.

2. Chunyan Zhao, Aaron Tan, Giorgia Pastoriu, Han Kiat HO, “Nanomaterial scaffolds for

stem cell proliferation and differentiation in tissue engineering”, 2012.

10