22
Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na mieloproliferativno novotvorbo Marija Jedrt Mandelc Mazaj,Tadej Pajič, Martina Fink, Peter Černelč, Matjaž Sever Klinični oddelek za hematologijo, UKC Ljubljana

Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na ... M p2016.pdf · Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na mieloproliferativno novotvorbo Marija Jedrt Mandelc

  • Upload
    others

  • View
    9

  • Download
    0

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na ... M p2016.pdf · Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na mieloproliferativno novotvorbo Marija Jedrt Mandelc

Mutacije v genu za kalretikulin pri

bolnikih s sumom

na mieloproliferativno novotvorbo

Marija Jedrt Mandelc Mazaj,Tadej Pajič, Martina Fink,

Peter Černelč, Matjaž Sever

Klinični oddelek za hematologijo, UKC Ljubljana

Page 2: Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na ... M p2016.pdf · Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na mieloproliferativno novotvorbo Marija Jedrt Mandelc

Mieloproliferativne novotvorbe (MPN)

Kronična mieloična

levkemija (KML) BCR-

ABL1+

Prava policitemija (PP)

Esencialna

trombocitemija (ET)

Primarna mielofibroza

(PMF)

Kronična nevtrofilna

levkemija (KNL)

Kronična eozinofilna

levkemija BDO (KEL)

Masticitoza

MPN neklasificirana (MPN

NK)

Page 3: Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na ... M p2016.pdf · Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na mieloproliferativno novotvorbo Marija Jedrt Mandelc

Mieloproliferativne novotvorbe (MPN)

Diagnozo

Prognozo

Način zdravljenja

ODKRIVANJE NOVIH

GENSKIH SPREMEMB

PREDLAGANA KLASIFIKACIJA WHO 2014

VRSTA PREISKAVE IN KDAJ

KLASIFIKACIJA WHO 2008

Tefferi A, Thiele J, Barbui T, Leukemia 2014: 1‐7,Tefferi A, Pardanani A, Nat Rev Clin Onc 2014;11:125‐6.

Diagnostični algoritem pri ET in PMF

JAK2V617F +

CALR +

-

-

MPL +

Page 4: Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na ... M p2016.pdf · Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na mieloproliferativno novotvorbo Marija Jedrt Mandelc

Molekularno diagnostični markerji

Mutacija JAK2V617F

◦ PP ~95 %

◦ ET in PMF 50-60 %

Mutacije v eksonu 10 gena MPL (W515L/K)

◦ ET in PMF ~10 % (JAK2V617F-)

Mutacija v eksonu 12 gena JAK2

◦ PP ~5 % (JAK2V617F-)

Ostali markerji

◦ (TET2, ASXL1, CBL, IDH1, LNK SF3B1, SRSF2, U2AF1, … )

2005

2006

2007

dec.

2013

Page 5: Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na ... M p2016.pdf · Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na mieloproliferativno novotvorbo Marija Jedrt Mandelc

Klampfl et al, NEJM 2013;369:2379-2390.

Nangalia et al, NEJM 2013;369:2391-2405.

CALR

Page 6: Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na ... M p2016.pdf · Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na mieloproliferativno novotvorbo Marija Jedrt Mandelc

Kalretikulin

Endoplazmatskem retikulumu (ER)

◦ Zvijanje glikoproteinov (šaperon)

◦ Hemostaza kalcija

Izven ER (v celičnem jedru, v celičnih membranah in zunajceličnem

matriksu)

◦ signalni procesi, genska ekspresija, proliferacija celic, apoptozo, fagocitoza,

celična adhezija,odstranitev rakastih celic, proces zdravljenja ran, razvoj

parazitov in imunski odziv.

Protein vsebuje tri domene: N-domeno, P-domeno in C-domeno.

Yi-ChienLu et al, HPC BioMed Research International Volume 2015, 1-9.

Page 7: Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na ... M p2016.pdf · Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na mieloproliferativno novotvorbo Marija Jedrt Mandelc

1 2 3 5 6 7 8 9 4 ekson

gen CALR - 19p13.3 (3,6 kb)

Mutacije v eksonu 9 gena CALR

Mutacije v genu CALR (ins ali del) so posledica mutacij v bralnem okvirju in

se pojavljajo v hematopoetičnih matičnih in zarodnih celicah.

Mutacije v genu CALR

Novo aminokislinsko zaporedje na koncu C terminalne domene povzroči

nastanek spremenjene C terminalne domene, izguba signala KDEL in

spremenjena vezavna mesta za Ca2+ ione.

Page 8: Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na ... M p2016.pdf · Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na mieloproliferativno novotvorbo Marija Jedrt Mandelc

Prisotnost mutacij v genu CALR

• 30-40 % bolnikov z MPN (JAK2/MPL-)

• 20 – 30 % ( 50-80 %) bolnikov ET in PMF (JAK2V617F-)

• 67 % bolnikov z ET, pri 88 % s PMF (36 mutacij), Klampfl et al., 2013)

• 70-80 % bolnikih z MPN (Nangalia et al., 2013)

• Redki primeri:

• RARS-T, RARS, MDS, KMML, atipična KML (Nangalia et al., 2013)

• Sočasno pojavljanje mutacije JAK2V617F in mutacij v genu CALR

• Sočasno pojavljanje mutacije v genu CALR (del 52 bp) pri bolniku s KML (72 letni

bolnik-trombocitoza in visoko št. blastov-Seghatoleslami et al.)

Klampfl et al, NJEM 2013;369:2379-2390. Nangalia et al, NJEM 2013;369:2391-2405. Seghatoleslami et al, MJHID 2016;1-4.

Page 9: Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na ... M p2016.pdf · Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na mieloproliferativno novotvorbo Marija Jedrt Mandelc

Rumi et al, Blood 2014;123:1544-1551.00

> 50

mutacij

Najbolj pogosti mutaciji sta delecija 52 bp (L367fs*46) in insercija 5 bp

TTGTC (K385fs*47).

Vrste mutacij v genu CALR

80 %

Page 10: Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na ... M p2016.pdf · Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na mieloproliferativno novotvorbo Marija Jedrt Mandelc

Vpliv mutacij v genu CALR pri ET, PMF in PP

Bolniki z ET:

◦ JAK2/MPL/CALR - in CALR + v primerjavi z JAK2V617F + (↓starost ,↓Hb , ↓Lkci)

◦ CALR + v primerjavi z JAK2V617F + (moška populacija, ↑Tr)

◦ CALR+ v primerjavi z JAK2V617F (↑ serumski EPO - ∆Hb <1g/dl)

Bolniki s PMF

◦ CALR + v primerjavi z JAK2V617F + (↑Tr, ↑Hb, ↓Lkci, daljši čas preživetja)

Tefferi A.,et al, Leukemia 2014;28 (7):1472-1477. Rumi E,et al, Blood 2014;123:1544-1551. Tefferi A.,et al, Blood 2014;124:2507-2513.

Page 11: Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na ... M p2016.pdf · Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na mieloproliferativno novotvorbo Marija Jedrt Mandelc

Vpliv mutacij v genu CALR na preživetje

Mutacije v genih JAK2 (V617F) in CALR nimajo

posebnega vpliva na čas preživetja pri bolnikih

z ET.

Tefferi A.,et al, Blood 2014;124:2507-2513.

JAK2/MPL/CALR- 2.3 let

JAK2+ 5.9 let

MPL+ 9.9 let

CALR+ 15.9 let

Pri bolnikih s PMF in brez mutacij v genih

JAK2/MPL/CALR je preživetje občutno slabše v

primerjavi z bolniki, ki imajo prisotne mutacije v

genih CALR in MPL.

Mutacija tipa 2:

• pri bolnikih z ET povezana z večjim številom trombocitov

• pri bolnikih s PMF povezana s krajšim časom preživetja.

Vrsta mutacije – tip 1 in tip 2

Tefferi A.,et al, Blood 2014;124:2565-2566.

Mutacijski status – PMF

CALR+ ET- 19,7 let

JAK2+ ET - 19 let

CALR+ PMF - 14,5 let

JAK2+ PMF - 4,8 let

Tip 1 – del 52 bp

(p.L367fs*46)

Tip 2 – ins 5 bp

(p.K385fs*47)

440 bolnikov

428 bolnikov

Tip 1/tipu-1 podobne

13,7 let; N=110

Tip 2/tipu-2 podobne

3,5 let; N=21

JAK2+ 4 let; N=309

Page 12: Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na ... M p2016.pdf · Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na mieloproliferativno novotvorbo Marija Jedrt Mandelc

Namen raziskave

Ugotoviti pojavnost in vrste prisotnih mutacij v genu CALR pri

bolnikih s sumom na mieloproliferativno novotvorbo (MPN) v

odsotnosti mutacije V617F v genu JAK2.

JAK2V671F negativna

mutacija

Mutacije v genu CALR

Page 13: Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na ... M p2016.pdf · Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na mieloproliferativno novotvorbo Marija Jedrt Mandelc

Izvedba preiskave

Biološki material

• 10 mL periferne krvi z antikoagulantom EDTA

• 2 mL kostnega mozga

Izolacije

• Granulocitov – gradientno centrifugiranje preko fikola

• Izolacija DNA

Metode

• Analiza talilne krivulje visoke ločljivosti (HRM)

• Gelska elektroforeza

• Sekvenčna analiza

• Obdelava sekvenc

Page 14: Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na ... M p2016.pdf · Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na mieloproliferativno novotvorbo Marija Jedrt Mandelc

Izvedba preiskave – obdelava podatkov

Divji tip – wt

Delecija 52 bp Insercija 5 bp

NG_029662.1 RefSeqGene

c.1092_1143del;p.L367fs*46 c.1154_1155insTTGTC; p. K385fs*47

Delecija 3 bp

c.1132_1134delGAG; p.E381delE

Page 15: Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na ... M p2016.pdf · Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na mieloproliferativno novotvorbo Marija Jedrt Mandelc

Rezultati I – uvajanje metode

21 bolnikov z ET ali PMF (JAK2V617F/MPL-)

Pri 9 bolnikih ni prisotne mutacije v genu CALR

Pri 9 bolnikih prisotna mutacija v genu CALR – del 52 bp

(c.1092_1143del;p.L367fs*46)

Pri 3 bolnikih prisotna mutacija v genu CALR – ins 5 bp

(c.1154_1155insTTGTC; p. K385fs*47)

CALR -

del52 bp

ins5 bp

9/21

9/21

3/21

Page 16: Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na ... M p2016.pdf · Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na mieloproliferativno novotvorbo Marija Jedrt Mandelc

Rezultati II – od 05.2015 – 03.2016

93 bolnikov s sumom na MPN (JAK2V617F-)

Pri 74 bolnikih ni prisotne mutacije v genu CALR (80 %)

Pri 10 bolnikih prisotna mutacija v genu CALR – del 52 bp

(c.1092_1143del; p.L367fs*46) (10 %)

Pri 7 bolnikih prisotna mutacija v genu CALR – ins 5 bp

(c.1154_1155insTTGTC; p. K385fs*47) (7 %)

Pri 2 bolnikih prisotna mutacija v genu CALR – del 3 bp

(c.1132_1134delGAG; p.E381delE ) (3 %)

CALR -

del52 bp

ins5 bp

del3 bp

3 %

80 %

10 % 7 %

Page 17: Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na ... M p2016.pdf · Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na mieloproliferativno novotvorbo Marija Jedrt Mandelc

Diagnoza - ET

ŠT.

BOLNIKOV

TIP 1-del52 bp TIP2-ins5 bp TIP3-del3 bp

del52 bp-Ž del52 bp-M ins5 bp-Ž ins5 bp-M del3 bp-Ž del3 bp-M

20/31 5 9 4 2 - -

del52 bp-Ž

del52 bp-M

ins5 bp-Ž

ins5 bp-M

Ž=66 let

M=53 let

Ž=65 let

M=52 let

Page 18: Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na ... M p2016.pdf · Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na mieloproliferativno novotvorbo Marija Jedrt Mandelc

Diagnoza - PMF

ŠT.

BOLNIKOV

TIP 1-del52 bp TIP2-ins5 bp TIP3-del3 bp

del52 bp-Ž del52 bp-M ins5 bp-Ž ins5 bp-M del3 bp-Ž del3 bp-M

4/31 2 2 - - - -

del52 bp-Ž

del52 bp-M

M=56 let Ž=54 let

Page 19: Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na ... M p2016.pdf · Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na mieloproliferativno novotvorbo Marija Jedrt Mandelc

Diagnoza – ni podatka

ŠT.

BOLNIKOV

TIP 1-del52 bp TIP2-ins5 bp TIP3-del3 bp

del52 bp-Ž del52 bp-M ins5 bp-Ž ins5 bp-M del3 bp-Ž del3 bp-M

7/31 1* - 3 1 - 2

del52 bp-Ž

ins5 bp-Ž

ins5 bp-M

del3 bp-M

M=33 let Ž= 64 let

Ž= 61 let M= 58 let

Page 20: Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na ... M p2016.pdf · Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na mieloproliferativno novotvorbo Marija Jedrt Mandelc

Bolnik Starost Spol Diagnoza Lkci

[109/L]

Hb

[g/L]

Tr

[109/L]

Tip mutacije

Tip 1-

del 52 bp

Tip 2

ins 5 bp

Tip 3

del 3 bp

1 65 Ž ET 15,2 143 749 *

2 67 Ž ET 12 127 821 *

3 65 M ET 9,4 138 787 *

4 75 Ž ET 8,4 137 653 *

5 42 Ž ET 7,7 138 787 *

6 53 M ET 6,9 142 682 *

7 34 M ET 6,9 150 1586 *

8 77 M ET 12 98 1234 *

9 62 M ET 10,7 142 737 *

10 62 M ET 8,62 159 839 *

11 26 M ET 6,93 155 897 *

12 38 M ET 6,25 138 627 *

13 44 M ET 10,37 165 705 *

14 66 Ž ET 5,7 147 527 *

15 62 M PMF 2,31 94 145 *

16 57 Ž PMF 9,92 122 191 *

17 51 Ž PMF 20,77 105 887 *

18 50 M PMF 18,52 137 573 *

19 64 Ž ET ali PMF 5,84 106 486 *

20 34 M / 8,35 178 330 *

21 32 M / 14,89 157 370 * *

22 43 M ET 6,7 145 949 *

23 53 Ž ET 6,7 135 774 *

24 90 Ž ET 6,9 128 729 *

25 58 M / 7,34 142 778 *

26 52 M ET 6,86 142 847 *

27 73 Ž ET 7,78 130 1200 *

28 65 Ž / / / / *

29 37 Ž / / / / *

30 77 Ž ET 6,89 111 1417 *

31 61 Ž / / / / *

Page 21: Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na ... M p2016.pdf · Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na mieloproliferativno novotvorbo Marija Jedrt Mandelc

Zaključek

Prisotnost mutacij v genu CALR pri bolnikih s sumom na MPN in z odsotnostjo mutacije JAK2V617F je bila 20 % (30-45%).

Najpogostejši prisotni mutaciji v genu CALR sta bili p.L367fs*46 – tip 1 in p.K385fs*47 – tip 2 (90 %).

Najpogostejša mutacija je mutacija tip 1.

Vsi bolniki s PMF so imeli prisotno mutacijo tip 1.

Preiskava se dela v sklopu rednih diagnostičnih preiskav pri bolnikih s sumom na esencialno trombocitemijo in primarno mielofibrozo oz. vključena je v standardni diagnostičen algoritem ugotavljanja MPN.

Pri dveh bolnikih (33 let) smo določili mutacijo tip 3 - del3 bp p.E381delE.

Page 22: Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na ... M p2016.pdf · Mutacije v genu za kalretikulin pri bolnikih s sumom na mieloproliferativno novotvorbo Marija Jedrt Mandelc

Hvala za pozornost!