Upload
others
View
9
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Mutacije v genu za kalretikulin pri
bolnikih s sumom
na mieloproliferativno novotvorbo
Marija Jedrt Mandelc Mazaj,Tadej Pajič, Martina Fink,
Peter Černelč, Matjaž Sever
Klinični oddelek za hematologijo, UKC Ljubljana
Mieloproliferativne novotvorbe (MPN)
Kronična mieloična
levkemija (KML) BCR-
ABL1+
Prava policitemija (PP)
Esencialna
trombocitemija (ET)
Primarna mielofibroza
(PMF)
Kronična nevtrofilna
levkemija (KNL)
Kronična eozinofilna
levkemija BDO (KEL)
Masticitoza
MPN neklasificirana (MPN
NK)
Mieloproliferativne novotvorbe (MPN)
Diagnozo
Prognozo
Način zdravljenja
ODKRIVANJE NOVIH
GENSKIH SPREMEMB
PREDLAGANA KLASIFIKACIJA WHO 2014
VRSTA PREISKAVE IN KDAJ
KLASIFIKACIJA WHO 2008
Tefferi A, Thiele J, Barbui T, Leukemia 2014: 1‐7,Tefferi A, Pardanani A, Nat Rev Clin Onc 2014;11:125‐6.
Diagnostični algoritem pri ET in PMF
JAK2V617F +
CALR +
-
-
MPL +
Molekularno diagnostični markerji
Mutacija JAK2V617F
◦ PP ~95 %
◦ ET in PMF 50-60 %
Mutacije v eksonu 10 gena MPL (W515L/K)
◦ ET in PMF ~10 % (JAK2V617F-)
Mutacija v eksonu 12 gena JAK2
◦ PP ~5 % (JAK2V617F-)
Ostali markerji
◦ (TET2, ASXL1, CBL, IDH1, LNK SF3B1, SRSF2, U2AF1, … )
2005
2006
2007
dec.
2013
Klampfl et al, NEJM 2013;369:2379-2390.
Nangalia et al, NEJM 2013;369:2391-2405.
CALR
Kalretikulin
Endoplazmatskem retikulumu (ER)
◦ Zvijanje glikoproteinov (šaperon)
◦ Hemostaza kalcija
Izven ER (v celičnem jedru, v celičnih membranah in zunajceličnem
matriksu)
◦ signalni procesi, genska ekspresija, proliferacija celic, apoptozo, fagocitoza,
celična adhezija,odstranitev rakastih celic, proces zdravljenja ran, razvoj
parazitov in imunski odziv.
Protein vsebuje tri domene: N-domeno, P-domeno in C-domeno.
Yi-ChienLu et al, HPC BioMed Research International Volume 2015, 1-9.
1 2 3 5 6 7 8 9 4 ekson
gen CALR - 19p13.3 (3,6 kb)
Mutacije v eksonu 9 gena CALR
Mutacije v genu CALR (ins ali del) so posledica mutacij v bralnem okvirju in
se pojavljajo v hematopoetičnih matičnih in zarodnih celicah.
Mutacije v genu CALR
Novo aminokislinsko zaporedje na koncu C terminalne domene povzroči
nastanek spremenjene C terminalne domene, izguba signala KDEL in
spremenjena vezavna mesta za Ca2+ ione.
Prisotnost mutacij v genu CALR
• 30-40 % bolnikov z MPN (JAK2/MPL-)
• 20 – 30 % ( 50-80 %) bolnikov ET in PMF (JAK2V617F-)
• 67 % bolnikov z ET, pri 88 % s PMF (36 mutacij), Klampfl et al., 2013)
• 70-80 % bolnikih z MPN (Nangalia et al., 2013)
• Redki primeri:
• RARS-T, RARS, MDS, KMML, atipična KML (Nangalia et al., 2013)
• Sočasno pojavljanje mutacije JAK2V617F in mutacij v genu CALR
• Sočasno pojavljanje mutacije v genu CALR (del 52 bp) pri bolniku s KML (72 letni
bolnik-trombocitoza in visoko št. blastov-Seghatoleslami et al.)
Klampfl et al, NJEM 2013;369:2379-2390. Nangalia et al, NJEM 2013;369:2391-2405. Seghatoleslami et al, MJHID 2016;1-4.
Rumi et al, Blood 2014;123:1544-1551.00
> 50
mutacij
Najbolj pogosti mutaciji sta delecija 52 bp (L367fs*46) in insercija 5 bp
TTGTC (K385fs*47).
Vrste mutacij v genu CALR
80 %
Vpliv mutacij v genu CALR pri ET, PMF in PP
Bolniki z ET:
◦ JAK2/MPL/CALR - in CALR + v primerjavi z JAK2V617F + (↓starost ,↓Hb , ↓Lkci)
◦ CALR + v primerjavi z JAK2V617F + (moška populacija, ↑Tr)
◦ CALR+ v primerjavi z JAK2V617F (↑ serumski EPO - ∆Hb <1g/dl)
Bolniki s PMF
◦ CALR + v primerjavi z JAK2V617F + (↑Tr, ↑Hb, ↓Lkci, daljši čas preživetja)
Tefferi A.,et al, Leukemia 2014;28 (7):1472-1477. Rumi E,et al, Blood 2014;123:1544-1551. Tefferi A.,et al, Blood 2014;124:2507-2513.
Vpliv mutacij v genu CALR na preživetje
Mutacije v genih JAK2 (V617F) in CALR nimajo
posebnega vpliva na čas preživetja pri bolnikih
z ET.
Tefferi A.,et al, Blood 2014;124:2507-2513.
JAK2/MPL/CALR- 2.3 let
JAK2+ 5.9 let
MPL+ 9.9 let
CALR+ 15.9 let
Pri bolnikih s PMF in brez mutacij v genih
JAK2/MPL/CALR je preživetje občutno slabše v
primerjavi z bolniki, ki imajo prisotne mutacije v
genih CALR in MPL.
Mutacija tipa 2:
• pri bolnikih z ET povezana z večjim številom trombocitov
• pri bolnikih s PMF povezana s krajšim časom preživetja.
Vrsta mutacije – tip 1 in tip 2
Tefferi A.,et al, Blood 2014;124:2565-2566.
Mutacijski status – PMF
CALR+ ET- 19,7 let
JAK2+ ET - 19 let
CALR+ PMF - 14,5 let
JAK2+ PMF - 4,8 let
Tip 1 – del 52 bp
(p.L367fs*46)
Tip 2 – ins 5 bp
(p.K385fs*47)
440 bolnikov
428 bolnikov
Tip 1/tipu-1 podobne
13,7 let; N=110
Tip 2/tipu-2 podobne
3,5 let; N=21
JAK2+ 4 let; N=309
Namen raziskave
Ugotoviti pojavnost in vrste prisotnih mutacij v genu CALR pri
bolnikih s sumom na mieloproliferativno novotvorbo (MPN) v
odsotnosti mutacije V617F v genu JAK2.
JAK2V671F negativna
mutacija
Mutacije v genu CALR
Izvedba preiskave
Biološki material
• 10 mL periferne krvi z antikoagulantom EDTA
• 2 mL kostnega mozga
Izolacije
• Granulocitov – gradientno centrifugiranje preko fikola
• Izolacija DNA
Metode
• Analiza talilne krivulje visoke ločljivosti (HRM)
• Gelska elektroforeza
• Sekvenčna analiza
• Obdelava sekvenc
Izvedba preiskave – obdelava podatkov
Divji tip – wt
Delecija 52 bp Insercija 5 bp
NG_029662.1 RefSeqGene
c.1092_1143del;p.L367fs*46 c.1154_1155insTTGTC; p. K385fs*47
Delecija 3 bp
c.1132_1134delGAG; p.E381delE
Rezultati I – uvajanje metode
21 bolnikov z ET ali PMF (JAK2V617F/MPL-)
Pri 9 bolnikih ni prisotne mutacije v genu CALR
Pri 9 bolnikih prisotna mutacija v genu CALR – del 52 bp
(c.1092_1143del;p.L367fs*46)
Pri 3 bolnikih prisotna mutacija v genu CALR – ins 5 bp
(c.1154_1155insTTGTC; p. K385fs*47)
CALR -
del52 bp
ins5 bp
9/21
9/21
3/21
Rezultati II – od 05.2015 – 03.2016
93 bolnikov s sumom na MPN (JAK2V617F-)
Pri 74 bolnikih ni prisotne mutacije v genu CALR (80 %)
Pri 10 bolnikih prisotna mutacija v genu CALR – del 52 bp
(c.1092_1143del; p.L367fs*46) (10 %)
Pri 7 bolnikih prisotna mutacija v genu CALR – ins 5 bp
(c.1154_1155insTTGTC; p. K385fs*47) (7 %)
Pri 2 bolnikih prisotna mutacija v genu CALR – del 3 bp
(c.1132_1134delGAG; p.E381delE ) (3 %)
CALR -
del52 bp
ins5 bp
del3 bp
3 %
80 %
10 % 7 %
Diagnoza - ET
ŠT.
BOLNIKOV
TIP 1-del52 bp TIP2-ins5 bp TIP3-del3 bp
del52 bp-Ž del52 bp-M ins5 bp-Ž ins5 bp-M del3 bp-Ž del3 bp-M
20/31 5 9 4 2 - -
del52 bp-Ž
del52 bp-M
ins5 bp-Ž
ins5 bp-M
Ž=66 let
M=53 let
Ž=65 let
M=52 let
Diagnoza - PMF
ŠT.
BOLNIKOV
TIP 1-del52 bp TIP2-ins5 bp TIP3-del3 bp
del52 bp-Ž del52 bp-M ins5 bp-Ž ins5 bp-M del3 bp-Ž del3 bp-M
4/31 2 2 - - - -
del52 bp-Ž
del52 bp-M
M=56 let Ž=54 let
Diagnoza – ni podatka
ŠT.
BOLNIKOV
TIP 1-del52 bp TIP2-ins5 bp TIP3-del3 bp
del52 bp-Ž del52 bp-M ins5 bp-Ž ins5 bp-M del3 bp-Ž del3 bp-M
7/31 1* - 3 1 - 2
del52 bp-Ž
ins5 bp-Ž
ins5 bp-M
del3 bp-M
M=33 let Ž= 64 let
Ž= 61 let M= 58 let
Bolnik Starost Spol Diagnoza Lkci
[109/L]
Hb
[g/L]
Tr
[109/L]
Tip mutacije
Tip 1-
del 52 bp
Tip 2
ins 5 bp
Tip 3
del 3 bp
1 65 Ž ET 15,2 143 749 *
2 67 Ž ET 12 127 821 *
3 65 M ET 9,4 138 787 *
4 75 Ž ET 8,4 137 653 *
5 42 Ž ET 7,7 138 787 *
6 53 M ET 6,9 142 682 *
7 34 M ET 6,9 150 1586 *
8 77 M ET 12 98 1234 *
9 62 M ET 10,7 142 737 *
10 62 M ET 8,62 159 839 *
11 26 M ET 6,93 155 897 *
12 38 M ET 6,25 138 627 *
13 44 M ET 10,37 165 705 *
14 66 Ž ET 5,7 147 527 *
15 62 M PMF 2,31 94 145 *
16 57 Ž PMF 9,92 122 191 *
17 51 Ž PMF 20,77 105 887 *
18 50 M PMF 18,52 137 573 *
19 64 Ž ET ali PMF 5,84 106 486 *
20 34 M / 8,35 178 330 *
21 32 M / 14,89 157 370 * *
22 43 M ET 6,7 145 949 *
23 53 Ž ET 6,7 135 774 *
24 90 Ž ET 6,9 128 729 *
25 58 M / 7,34 142 778 *
26 52 M ET 6,86 142 847 *
27 73 Ž ET 7,78 130 1200 *
28 65 Ž / / / / *
29 37 Ž / / / / *
30 77 Ž ET 6,89 111 1417 *
31 61 Ž / / / / *
Zaključek
Prisotnost mutacij v genu CALR pri bolnikih s sumom na MPN in z odsotnostjo mutacije JAK2V617F je bila 20 % (30-45%).
Najpogostejši prisotni mutaciji v genu CALR sta bili p.L367fs*46 – tip 1 in p.K385fs*47 – tip 2 (90 %).
Najpogostejša mutacija je mutacija tip 1.
Vsi bolniki s PMF so imeli prisotno mutacijo tip 1.
Preiskava se dela v sklopu rednih diagnostičnih preiskav pri bolnikih s sumom na esencialno trombocitemijo in primarno mielofibrozo oz. vključena je v standardni diagnostičen algoritem ugotavljanja MPN.
Pri dveh bolnikih (33 let) smo določili mutacijo tip 3 - del3 bp p.E381delE.
Hvala za pozornost!