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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA “Efeitos da inibição de Aurora-quinases em linhagens celulares de meduloblastoma pediátrico” LENISA GERON Monografia apresentada ao Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, como parte das exigências para a obtenção do título de Bacharel em Ciências Biológicas. Ribeirão Preto - SP 2013

MONOGRAFIA FINAL - LENISA · 2013, 49f. Monografia – Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE FILOSOFIA, CIÊNCIAS E LETRAS DE RIBEIRÃO PRETO

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA

“Efeitos da inibição de Aurora-quinases em linhagens celulares de meduloblastoma pediátrico”

LENISA GERON

Monografia apresentada ao Departamento de

Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras

de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo,

como parte das exigências para a obtenção do título

de Bacharel em Ciências Biológicas.

Ribeirão Preto - SP 2013

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LENISA GERON

“Efeitos da inibição de Aurora-quinases em linhagens celulares de meduloblastoma pediátrico”

Monografia apresentada ao Departamento de

Biologia da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras

de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo,

como parte das exigências para a obtenção do título

de Bacharel em Ciências Biológicas.

Área de Concentração: Genética

Orientador: Prof. Titular Luiz Gonzaga Tone

Co-orientador: MSc. Kleiton Silva Borges

Ribeirão Preto - SP 2013

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Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, para fins de estudo e pesquisa, desde que citada a fonte.

Geron, Lenisa

“Efeitos da inibição de Aurora-quinases em linhagens celulares de meduloblastoma pediátrico”. Ribeirão Preto, 2013.

49 p. : il. ; 30 cm

Monografia, apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto/USP. Área de concentração: Genética.

Orientador: Tone, Luiz Gonzaga.

1. Oncologia Pediátrica. 2. Meduloblastoma. 3. Aurora-quinase. 4. Inibidor de Aurora-quinase. 5. AMG900.

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Apoio e Suporte Financeiro Este trabalho foi realizado com o apoio financeiro das seguintes instituições:

• Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (Processo n° 2011/15645-1).

• Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto –

FFCLRP/USP.

• Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – FMRP/USP e Hospital das Clinicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP.

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FOLHA DE APROVAÇÃO

LENISA GERON

“Efeitos da inibição de Aurora-quinases em linhagens celulares de

meduloblastoma pediátrico”

Monografia apresentada ao Departamento de Biologia da

Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão

Preto da Universidade de São Paulo, como parte das

exigências para a obtenção do título de Bacharel em

Ciências Biológicas.

Área de Concentração: Genética

Data da defesa:

Aprovado em:

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. ___________________________________________________________________

Instituição:_______________________________Assinatura: _________________________

Prof. Dr. ___________________________________________________________________

Instituição:_______________________________Assinatura: _________________________

Prof. Dr. ___________________________________________________________________

Instituição:_______________________________Assinatura: _________________________

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Wxw|vÉ xáàx àÜtutÄ{É tÉá Åxâá Ñt|á gúÇ|t x V°átÜ? x õá Å|Ç{tá |ÜÅûá itÇxáát x TÇt ]ØÄ|t xÅ tzÜtwxv|ÅxÇàÉ tÉ tÑÉ|É x tÅÉÜ |ÇvÉÇw|v|ÉÇt|áA X àtÅu°Å? t àÉwÉá Éá Åxâá ytÅ|Ä|tÜxá x tÅ|zÉá ÑxÄÉ tÑÉ|É x vtÜ|Ç{É wtwÉ xÅ àÉwÉá Éá ÅÉÅxÇàÉáA

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TzÜtwxv|ÅxÇàÉá

Agradeço primeiramente a Deus pela presença constante em minha vida e por mostrar o

melhor caminho a seguir.

Ao prof. Titular Luiz Gonzaga Tone, meu orientador, pela oportunidade, e acima de tudo

pela confiança que creditou em mim durante esse trabalho.

Ao MSc. Kleiton Silva Borges, meu Co-orientador, pela confiança e pela orientação segura e

competente, sendo sempre atencioso e disponível a ajudar.

Ao MSc. Augusto Andrade Faria, pela paciência, incentivo e dedicação, estando sempre

disposto a transmitir seu conhecimento.

À todos os amigos do laboratório Drª Maria Sol Brassesco Annichini e Drª Vanessa da

Silva Silveira, Drª. Rosane Gomes de Paula Queiroz, Gustavo, Jaqueline, Julia,

Maurício, Mirela, Pamela, Paola, Priscila, Régia e Veridiana, pela amizade e por sempre

me ajudarem, contribuindo para o meu aprendizado.

Às técnicas do laboratório de Citogenética do Departamento de Puericultura e Pediatria Aide

Barbosa, Sônia Scandusi, Maria Luisa Machado e Lucimar Fernandes e à secretária do

Laboratório de Puericultura e Pediatria Evelize Visconte pelo apoio e convivência.

À Fundação de Apoio do Estado de São Paulo (FAPESP) pela concessão da bolsa de

Iniciação Científica.

Ao Departamento Financeiro da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão

Preto da Universidade de São Paulo (FFCLRP/USP) pelo auxílio financeiro.

À minha mãe, Tânia e ao meu pai, César por terem me proporcionado uma formação humana

realmente digna e por me ensinarem a sempre buscar o conhecimento e nunca desistir dos

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meus objetivos como pessoa e pesquisadora; as minhas irmãs, Vanessa e Ana Júlia, por

sempre estarem ao meu lado me apoiando.

A todos os meus familiares que sempre torceram pelo meu sucesso.

As minhas queridas amigas Carolina, Bruna, Laura, Lethícia, Patrícia e Paula, obrigada

pela amizade e pela torcida. E as minhas amigas Gabriela e Lara que sempre me apoiaram

no laboratório e proporcionaram bons momentos na faculdade e durante as participações em

eventos profissionais.

A todos que de alguma maneira contribuíram para a realização desse trabalho.

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RESUMO

GERON, L. “Efeitos da Inibição de Aurora-quinases em Linhagens Celulares de Meduloblastoma Pediátrico”. 2013, 49f. Monografia – Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brasil.

O meduloblastoma (MB) é o tumor cerebral maligno mais comum na infância. Apesar da

terapia multimodal agressiva, a disseminação da doença é comum e uma proporção

significativa de MBs tem-se revelado largamente refratária ao tratamento. A família das

Aurora-quinases (A, B e C) têm sido amplamente estudadas em diversos tumores. Essas

proteínas atuam em vários processos do ciclo celular, tais como maturação dos centrossomos,

organização do fuso mitótico, bi-orientação cromossômica e citocinese. Em diferentes tipos

de neoplasias a Aurora-A e a Aurora-B foram encontradas hiperexpressas, quando

comparadas ao tecido normal e a inibição farmacológica destas têm demonstrado resultados

promissores para a terapia do câncer. Assim, o objetivo do presente estudo é avaliar o efeito

do inibidor de Aurora-quinases AMG900 nas linhagens de meduloblastoma pediátrico

UW402 e UW473, por meio do ensaio de proliferação celular XTT®, e dos ensaios

clonogênico e de apoptose. Para o ensaio de proliferação celular, as células foram tratadas

com AMG900 nas concentrações de 5-500 nM e incubadas por 24, 48 e 72 horas. As análises

dos valores de IC50 foram calculados utilizando-se o programa CalcuSyn. Nos ensaios

clonogênico e de apoptose, as células foram tratadas com AMG900 (2,5-50 e 5-1000 nM,

respectivamente), e incubadas por 48 horas. Os experimentos foram realizados em triplicata.

O tratamento com o AMG900 causou uma inibição na proliferação celular, tendo um efeito

mais significativo a partir da dose de 50 nM, onde a partir desta, atingiu-se um platô nas doses

seguintes em ambas as linhagens estudadas (p<0.05). Os valores do IC50 foram de 183,16nM

e 242,16nM para as linhagens celulares UW402 e UW473, respectivamente. O AMG900

também causou uma diminuição da capacidade clonogênica e aumentou o número de células

apoptóticas, de uma maneira dose-dependente nas duas linhagens celulares (p<0,05). Nossos

resultados mostraram que a inibição das Aurora-quinases pelo AMG900 leva a efeitos

antineoplásicos nas linhagens de meduloblastoma pediátrico, sugerindo que a inibição dessas

proteínas pode ser um alvo para o tratamento deste tipo de neoplasia. Outros estudos estão

sendo realizados para confirmar esses resultados.

Palavras chave: Meduloblastoma; Aurora-quinase; AMG900.

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ABSTRACT

GERON, L. “Effects of Inhibition of Aurora kinases in Pediatric Meduloblastoma Cell Lines”. 2013, 49f. Monograph - School of Philosophy, Sciences and Letters of Ribeirão Preto, University of São Paulo, Ribeirão Preto, SP, Brazil.

Medulloblastoma (MB) is the most common malignant childhood brain tumor. Despite

aggressive multimodal therapy, a significant proportion of MB have proved largely refractory

to treatment. Aurora kinase family (A, B and C) has been studied in several tumors. These

proteins act in different cell cycle processes such as centrosome maturation, mitotic spindle

assembly, chromosomal bi-orientation and cytokinesis. Aurora-A and Aurora-B have been

found overexpressed in different types of malignancies, including in medulloblastoma, and

the pharmacological activity inhibition of them has shown promising results for cancer

therapy. Hence, the aim of this study was to evaluate the effects of Aurora kinase inhibitor

AMG900 on pediatric medulloblastoma cell lines UW402 e UW473 by XTT® cell

proliferation, clonogenic and apoptosis assays. For cell proliferation assay, cells were treated

with AMG900 at the concentrations of 5-500 mM and incubated for 24, 48 and 72h. IC50

analysis was performed using CalcuSyn software. For clonogenic and apoptosis assays, cells

were treated with AMG900 (2,5-50 and 5-1000 nM, respectively) and incubated for 48 hours.

The experiments were performed in triplicate. The treatment with AMG900 caused an

inhibition of cell proliferation, with a more significant effect at the dose of 50 nM, where it

reached a plateau in the remaining doses in both cell lines (p<0.05). IC50 values were

183,16nM and 242,16nM for UW402 and UW473 cells, respectively. AMG900 also caused

diminution of clonogenic capacity and increased the number of apoptotic cells in a dose-

dependent manner in both cell lines (p<0.05). These results showed that inhibition of Aurora

kinases by AMG900 leads to antineoplastic effects on pediatric medulloblastoma cell lines.

Thereby, these data suggest that Aurora kinase inhibition may be a target for medulloblastoma

treatment. Other functional studies should be conducted to expand these results.

Keywords: Medulloblastoma; Aurora-kinase; AMG900.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estrutura química do quimioterápico AMG900 (N-(4-((3-(2-aminopyrimidin-4-

yl)pyridin-2-yl)oxy)phenyl)-4-(4-methylthiophen-2-yl)phthalazin-1-amine).......................... 24

Figura 2. Análise da proliferação celular após o tratamento das linhagens UW402 e

UW473 com AMG900, após os tempos de 24, 48 e 72 horas .................................................. 33

Figura 3. Análise da redução de colônias das linhagens UW402 e UW473, após o

tratamento de 48 horas com AMG900, comparado ao controle ............................................... 34

Figura 4. Análise do efeito do AMG900 na indução de apoptose nas linhagens UW402 e

UW473...................................................................................................................................... 35

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LISTA DE TABELAS

Tabela I. Valores de 50% de inibição do crescimento celular (IC50) após tratamento de 48

horas de tratamento com o AMG900 ....................................................................................... 32

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AMG900 Inibidor de Aurora-quinase (N-(4-((3-(2-aminopyrimidin-4-yl)pyridin-

2-yl)oxy)phenyl)-4-(4-methylthiophen-2-yl)phthalazin-1-amine)

AMB Meduloblastoma Anaplásico

CO2 Dióxido de Carbono

CMB Meduloblastoma Clássico

CPP Complexo de Proteínas Passageiras

DMB Meduloblastoma Demoplásico/Nodular

DMSO Dimetilsulfóxido

FITC Isotiocinato de Fluorescência

HAM F-10 Solução Nutritiva para o Cultivo Celular

HCT-116 Células do Carcinoma de Cólon Humano

Hh Via de Sinalização Hedgehog

IC50 Valores de 50% de Inibição do Crescimento Celular

LCMB Meduloblastoma de Células Grandes

MB Meduloblastoma

MBEN Meduloblastoma Nodular Extenso

Notch Via de Sinalização Notch

OMS Organização Mundial de Saúde

PBS Tampão Salina Fosfato

PNETs Tumores Neuroectodérmicos Primitivos

RNAi Ácido Ribonucléico de Interferência

SBF Soro Fetal Bovino

SHH Via de Sinalização Sonic Hedgehog

SNC Sistema Nervoso Central

UW402 Linhagem Celular de Meduloblastoma 402

UW473 Linhagem Celular de Meduloblastoma 473

Wnt Via de Sinalização Wnt

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LISTA DE SÍMBOLOS

ºC Graus Celsius

L Litros

mg Miligramas

mL Mililitros

mM Milimolar

nM Nanomolar

µg Micrograma

µL Microlitro

µM Micromolar

rpm Rotações por minuto

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 17

1.1.Meduloblastoma ................................................................................................................. 17

1.2. Vias Moleculares ............................................................................................................... 19 1.3. A Família das Auroras-quinases ....................................................................................... 20 1.3.1. Aurora-A ......................................................................................................................... 22 1.3.2. Aurora-B ......................................................................................................................... 22 1.3.3. Aurora C ......................................................................................................................... 22

1.4. A Relação das Auroras-quinases com o Câncer ................................................................ 23 2. OBJETIVOS ....................................................................................................................... 26

2.1. Geral .................................................................................................................................. 26 2.2. Específicos ......................................................................................................................... 26

3. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................... 28

3.1. Linhagens Celulares e Condições de Cultura .................................................................... 28 3.2. Preparação das Drogas....................................................................................................... 28

3.3. Ensaios Funcionais ............................................................................................................ 28 3.3.1. Ensaio de Proliferação Celular utilizando o KIT XTT ................................................... 28 3.3.2. Ensaio Clonogênico ........................................................................................................ 29 3.3.3. Ensaio de Apoptose ........................................................................................................ 30 3.4. Análise Estatística.............................................................................................................. 30

4. RESULTADOS ................................................................................................................... 32

4.1. Efeitos do AMG900 na Proliferação Celular .................................................................... 32

4.2. Capacidade Clonogênica do AMG900 .............................................................................. 34 4.3. Ensaio de Apoptose ........................................................................................................... 35

5. DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 38

6. CONCLUSÕES ................................................................................................................... 42

REFERÊNCIAS...................................................................................................................... 44

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INTRODUÇÃO

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INTRODUÇÃO | 17

1. INTRODUÇÃO

1.1. Meduloblastoma

O meduloblastoma (MB) é o tumor embrionário neuroepitelial mais comum e constitui

uma das formas mais desafiadoras de neoplasias para se tratar de modo eficaz (PACKER,

2011). Considerado como uma variante dos tumores neuroectodérmicos primitivos (PNETs),

os MBs derivam de neurônios imaturos remanescentes da camada granulosa externa,

presentes em uma fase do desenvolvimento do cerebelo, sendo considerados como uma das

neoplasias do sistema nervoso central (SNC) mais frequentes na faixa etária infantil (RIS et

al, 2001). Corresponde a cerca de 20% de todos os tumores intracranianos em crianças, e 40%

de todos os tumores da fossa posterior na infância. Embora haja uma maior incidência de MB

durante a infância, com pico na primeira década, 30% destes ocorrem em adolescentes e

adultos jovens. (POLKINGHORN et al., 2007; ROSSI et al., 2008; PACKER, 2011;).

O MB desenvolve-se, em 85% dos casos, abaixo da tenda do cerebelo, que separa a

fossa posterior da fossa média do crânio, na região do 4º ventrículo a partir do vermis

cerebelar, parte mediana do cerebelo, responsável pelo equilíbrio. Podem crescer causando a

obstrução do fluxo liquórico, hidrocefalia e, consequentemente, sintomas de hipertensão

intracraniana (HIC), podendo se disseminar para outras partes do SNC, mas dificilmente

alcançam outras partes do corpo (RIS et al., 2001). Apesar de aparentemente bem delimitado,

o tumor é altamente infiltrativo e apresenta forte tendência à disseminação para o neuro-eixo

do próprio cerebelo e da medula espinhal (POLKINGHORN et al., 2007; PACKER, 2011).

Os MBs estão classificados dentro de um grupo de tumores embrionários de origem

neuroepitelial. A classificação da Organização Mundial de Saúde (OMS) de tumores do

sistema nervoso define cinco variantes: meduloblastoma clássico (CMB), meduloblastoma

desmoplásico/nodular (DMB), meduloblastoma nodular extenso (MBEN), meduloblastoma

anaplásico (AMB) e meduloblastoma de células grandes (LCMB) (LOUIS et al., 2007;

GILBERTSON; ELLISON, 2008). Tumores do tipo LCMB e AMB constituem cerca de 2% e

10% dos meduloblastomas, respectivamente, onde ambos apresentam um prognóstico ruim

(GILBERTSON; ELLISON, 2008). O CMB corresponde a 80% dos meduloblastomas,

enquanto que o DMB corresponde a 15%. A forma MBEN é considerada rara, apresentando

um prognóstico mais favorável quando comparada ao meduloblastoma de tipo clássico

(LOUIS et al., 2007).

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INTRODUÇÃO | 18

O tratamento atual é baseado na remoção cirúrgica, seguida de radiação local e crânio-

espinhal e/ou quimioterapia. Um desafio clínico em relação aos MBs são as respostas variadas

dos pacientes ao tratamento, onde alguns respondem bem com a remoção do tumor, enquanto

outros apresentam doença progressiva (PACKER et al., 1999; RUTKOWSKI et al., 2010). Os

MBs têm alta tendência à recorrência, que ocorre na maioria das vezes, nos dois primeiros

anos após o tratamento inicial, sendo que a sobrevida dos pacientes após os sintomas de

recorrência é de 4 a 5 meses (TORRES et al., 1994; SAUNDERS et al., 2003).

A cirurgia é o passo mais importante do tratamento de MB, visto que, esse

procedimento tem como finalidade a remoção do tumor, para que, consequentemente, ocorra

alivio do acúmulo de fluido cerebro-espinhal causado pelo edema; confirmar o diagnóstico

por obtenção de uma amostra de tecido; e remover ao o tumor causando o mínimo de danos

neurológicos ao paciente (PACKER, 2011). Porém, alguns MBs não podem ser removidos

completamente Em um terço dos pacientes, o tumor cresce no tronco cerebral, tornando difícil

sua remoção total, visto que esta poderia causar potenciais danos neurológicos ao paciente

(TORRES et al., 1994).

Apesar da terapia multimodal agressiva, a disseminação da doença é comum e uma

proporção significativa de MBs têm se revelado largamente refratária ao tratamento

(SAUNDERS et al., 2003). Diferentes agentes quimioterápicos são usados para tratar

pacientes com MB, como por exemplo, a vincristina (VCR) e o lomustine (CCNU)

(LEWANDOWICZ et al., 2000). Infelizmente essas drogas têm efeitos colaterais prejudiciais

para os pacientes, e pouco se sabe sobre seus modos de ação e seus efeitos sobre células não

neoplásicas. Ambas as drogas são citotóxicas e desencadeiam a apoptose através da via

mitocondrial em linhagens de MB (SHINWARI et al., 2008).

É reconhecido que, independente do sucesso do tratamento, é necessário o

desenvolvimento de protocolos de tratamento que resultem não apenas em uma alta taxa de

controle da doença, mas também em menos problemas neurocognitivos e sequelas

psicossociais para os pacientes. Para isso, nos últimos anos, muitos avanços têm permitido um

melhor entendimento da biologia tumoral, viabilizando assim a identificação de novos alvos

terapêuticos e, consequentemente, o desenvolvimento de novas drogas antitumorais para

melhorar a qualidade de vida desses pacientes (GULINO, ARCELLAB, GIANGASPEROA

2008).

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INTRODUÇÃO | 19

1.2. Vias Moleculares

As vias de sinalização Hedgehog (Hh) (que inclui a via Sonic Heddgehog - Shh); Wnt

e Notch são essenciais para o desenvolvimento cerebral, e desempenham um papel importante

na patogênese dos MBs. As proteínas Hh controlam funções celulares especializadas

importantes para o desenvolvimento do tronco neural. Mutações em determinados genes da

via Hh podem levar a graves malformações do SNC, como holoprosencefalia. Estudos

mostraram que, a interrupção da via Hh, como consequência de várias alterações genéticas e

epigenéticas, é a responsável por, pelo menos, um subconjunto de MB, e que cerca de 30%

desses tumores são derivados de mutações nos genes da via Hh e/ou da ativação inadequada

da sinalização desse mesmo gene (TAYLOR M et al., 2002; CARLOTTI et al., 2008).

A via Wnt é composta por um grupo de aproximadamente 20 proteínas que

desempenham um papel importante durante o desenvolvimento embrionário, diferenciação

celular e regulação das células-tronco (ELLISON et al., 2011). As proteínas Wnt se ligam a

um complexo formado pelo receptor Frizzled (FRZ), resultando no acúmulo intracelular de β-

catenina, o efetor desta via (TAYLOR R et al., 2005). Mutações que ativam a via Wnt, a

maioria envolvendo o gene da β-Catenina, podem ocorrer em 15% dos casos de MB

(CARLOTTI et al., 2008).

A via Notch está envolvida na diferenciação de várias células e tecidos. Entretanto,

poucos estudos têm sido realizados sobre os genes que fazem parte desta via. Alguns estudos

sugerem que a desregulação dos receptores Notch1 e Notch2 podem desempenhar um papel

importante no desenvolvimento de MBs. O gene Notch1 foi encontrado amplificado em 15%

dos MBs, resultando em níveis mais altos de sua expressão nas células tumorais. Porém, mais

estudos são necessários para elucidar o papel da via Notch na formação do cerebelo e dos

MBs (CARLOTTI et al., 2008).

Dados referentes a estudos clínicos e modelos animais sugerem uma importante

interação entre essas três vias, sendo que estas podem agir de maneira sinérgica na patogênese

do MB (BARON, 2003). Embora as vias Hh, Wnt e Notch tenham sido alvos constantes de

estratégias terapêuticas, outras vias de sinalização também estão sendo consideradas para

tentar compreender melhor o desenvolvimento desses tumores (BINNING et al., 2008).

Dessa forma, nos últimos anos, muitos avanços têm permitido um melhor

entendimento da biologia tumoral do MB. Um desses avanços foi a concepção de uma nova

classificação desta neoplasia, onde é atualmente classificada em quatro subgrupos, sendo eles

Wnt, Shh, Grupo 3 e Grupo 4 (NORTHCOTT et a.l, 2012; TAYLOR M et al., 2012 ).

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INTRODUÇÃO | 20

Estudos recentes mostraram que cada subgrupo origina-se a partir de diferentes tipos

celulares, possuindo características citogenéticas, perfis mutacionais e transcricionais

distintos. Sendo assim, esses subgrupos são bastante divergentes quanto a sua distribuição e

incidência, aspecto clínico, e prognóstico (CARDONA et al., 2012; KOOL, 2012;

NORTHCOTT et al., 2011).

Dentre os quatro subgrupos, o Wnt é o tipo de MB mais raro, tendo atualmente o

melhor prognóstico, onde cerca de 90% dos pacientes sobrevivem. Este subgrupo é

caracterizado por apresentar mutações somáticas no gene CTNNB1 e pela expressão do gene

Wnt e acúmulo da β-catenina no núcleo celular (marcador molecular para a ativação desta

via) (CLIFFORD, 2006; THOMPSON et al., 2006; NORTHCOTT et al., 2012). Já o MB do

tipo Shh representa um subgrupo de prognóstico intermediário, com taxas de sobrevida que

variam entre 60% e 80%. É caracterizado por possuir mutações no gene PTCH1 e se origina a

partir das células precursoras neurais da camada granulosa do cerebelo (SCHULLER et al.,

2008; KOOL, 2012; NORTHCOTT et a.l, 2011).

Pacientes com MB do tipo 3, possuem o pior prognóstico dentre os quatro subgrupos,

devido, talvez, a sua alta capacidade metastática e aos altos níveis de instabilidade genômica

do proto-oncogene MYC (CHO, 2011; NORTHCOTT et al., 2011). E dentre esses subgrupos

o mais comum é o MB do tipo 4, que afeta cerca de dois em cada cinco pacientes com esta

neoplasia, sendo caracterizado pela amplificação dos proto-oncogenes MYC e CDK6 (ciclinas

depende de quinases), apresentando um prognóstico semelhante ao do subgrupo Shh (CHO,

2011; NORTHCOTT et al., 2012).

Com isso, foi possível perceber que o que antes era considerado um único tipo de

tumor, hoje são quatro doenças distintas, cada qual exigindo diferentes abordagens

terapêuticas (NORTHCOTT et al., 2012). Dessa forma, esses achados podem contribuir para

uma possível identificação de novos alvos terapêuticos e o desenvolvimento de novas drogas

antitumorais com mecanismos de ação específicos. Todo esse esforço visa melhorar a

qualidade de vida dos pacientes, bem como tentar reduzir as sequelas do tratamento (ROSSI

et al., 2008).

1.3. A família das Auroras-quinases

Para que as cópias idênticas do genoma sejam passadas para suas células filhas, a

progressão através do ciclo celular deve ser minuciosamente e rigorosamente regulada e

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INTRODUÇÃO | 21

controlada por eventos sequenciais de síntese, ativação e degradação de proteínas, as quais às

vezes requerem uma série de modificações pós-traducionais (LOPES et al., 2003; SCHMIDT

et al., 2007). Existe uma variedade de proteínas quinases envolvidas na divisão celular, sendo

as mais conhecidas, a CDK1 (ciclina dependente de quinase 1), PLK (polo-like quinase),

Bub1 (budding uninhibited by benzimidazole 1), Nek 2 da família NIMA (never in mitose A)

e as aurora-quinases (SCHMIDT et al., 2007).

A família das aurora-quinases compreende quinases de serina/treonina que atuam em

processos do ciclo celular, tais como duplicação e separação do centrossomo, interação dos

microtúbulos com o cinetócoro das cromátides irmãs, e montagem do fuso mitótico. Além

disso, desempenham funções importantes na condensação dos cromossomos, estabelecimento

do fuso mitótico, orientação dos cromossomos, sendo necessárias também para o processo de

citocinese (CARMENA et al., 2003; MONTEMBAULT et al., 2005; GAUTSCHI et al.,

2008; MOUNTZIOS et al., 2008).

O primeiro homólogo da família das aurora-quinases foi identificado após um estudo

genético que tinha como finalidade, encontrar mutações que induziam aumento de ploidia em

células de leveduras (increase-in-ploidy phenotype - Ipl1) (CHAN et al., 1993). Um

homólogo foi encontrado em Drosophila melanogaster em 1995, após a observação de

mutações em gene chamado aurora. Esta mutação bloqueou o ciclo celular quando os

cromossomos condensados foram recrutados para apenas um pólo do fuso mitótico

(GLOVER et al., 1995). Este nome foi escolhido devido à semelhança entre a morfologia do

fuso mitótico defeituoso com o fenômeno luminoso observado nas regiões polares do Planeta

Terra (MOUNTZIOS et al., 2008).

Em 1998, três homólogos de aurora-quinase foram identificados em humanos, Aurora-

A (AURKA, Aurora-2/BTAK, STK15, STK16, ARK1, AIK), Aurora-B (AURKB, Aurora-1,

Ipl1, STK12, AIM-1, ARK2) e Aurora-C (AURKC, Aurora 3, STK13, AIK, AIE-2),

localizados nas regiões cromossômicas 20q13.2-q13.3, 17p13.1 e 19q13.43, respectivamente

(CARMENA et al., 2003; MONTEMBAULT et al., 2005; SCHMIDT et al., 2007). Estes

genes apresentam grande homologia nas sequências de nucleotídeos, ocupam locais distintos

na célula, são ciclo-dependentes e desempenham diferentes funções no ciclo celular (ADAMS

et al., 2001).

A hiperexpressão de algumas das aurora-quinases leva ao aumento da ploidia,

principalmente devido à amplificação do centrossomo e/ou desregulação dos pontos de

checagem da divisão mitótica, podendo favorecer a formação de tumores (FU et al., 2007;

GAUTSCHI et al., 2008; MOUNTZIOS et al., 2008).

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INTRODUÇÃO | 22

1.3.1. Aurora-A

A Aurora-A, está localizada no centrossomo, mas pode ser encontrada também

associada aos microtúbulos no pólo metafásico durante a mitose (KIMURA et al., 1997). A

atividade de fosforilação está envolvida na separação e maturação do centrossomo, bem como

na montagem e estabilidade do fuso mitótico (GLOVER et al., 1995). A hiperexpressão ou

inibição da expressão do aurora-A causa diversas anormalidades no fuso celular (BISCHOFF

et al., 1998; ZHOU et al., 1998).

1.3.2. Aurora-B

A proteína Aurora-B faz parte do Complexo de Proteínas Passageiras (CPP), que se

movem do centrômero para o fuso mitótico durante a divisão celular, monitorando a

separação dos cromossomos (ADAMS et al., 2001). Além disso, está associada ao cinetócoro

do cromossomo durante a passagem da prófase para a metáfase, apresentando níveis elevados

também na zona equatorial da célula em anáfase, e no anel contrátil da membrana celular

durante a telófase (CARMENA et al., 2003).

Dentre outras funções, a Aurora-B regula a interação do cinetócoro com os

microtúbulos durante a metáfase, garantindo que a célula prossiga pela metáfase somente

quando todos os cromossomos tenham adquirido uma conexão bipolar com os microtúbulos

que procedem de cada centrossomo (conexão anfitélica). De fato, a Aurora-B pode prevenir

conexões sintélicas ou monotélicas. Portanto, caso sejam identificadas conexões incorretas,

como estas, os mecanismos de correção são ativados para garantir a montagem adequada do

fuso celular (DUCAT et al., 2004; MERALDI et al., 2004).

Embora a Aurora-B não induza a transformação celular, células com a expressão

elevada do gene Aurora-B promoveram a formação de tumores agressivos quando injetadas

em camundongos imunodeficientes (OTA et al., 2002).

1.3.3. Aurora-C

A proteína Aurora-C não está muito bem caracterizado. Embora tenha sido encontrada

hiperexpressa em algumas células tumorais, provavelmente está envolvida apenas na

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INTRODUÇÃO | 23

espermatogênese (KIMURA et al., 1999). Inicialmente relatada como uma proteína

centrossômica somente da anáfase para a citocinese (KIMURA et al, 1999), a Aurora-C foi

descrita recentemente como uma proteína que também faz parte do CPP (LI X et al., 2004;

SASAI et al., 2004).

1.4. A relação das Aurora-quinases com o câncer

A aneuploidia é a alteração genômica mais prevalente nos tumores sólidos humanos

(JALLEPALLI et al., 2001). Defeitos nos centrossomos (quantidade, organização e

comportamento) têm sido encontrados em diversos tipos de câncer afetando a segregação

normal dos cromossomos e consequentemente produzindo células aneuplóides (SAUNDERS

et al., 2000; SATO et al., 2001). Todos estes defeitos contribuem para a aquisição de uma

instabilidade genética tipicamente observada em células cancerosas (BOVERI, 1914).

Aneuploidia e anormalidades do centrossomo são também detectadas após a

hiperexpressão ou inibição dos genes da família Aurora-quinase, caracterizando estas como

moléculas que possivelmente possuem uma importante função no surgimento e na progressão

do câncer (FU et al., 2007; GAUTSCHI et al., 2008). A hiperexpressão das Aurora-quinases

foi observada em muitas neoplasias, incluindo carcinomas colorretais (BISCHOFF et al.,

1998; TATSUKA et al., 1998; OTA et al., 2002), mama (ZHOU et al., 1998; TANAKA,

1999), ovário, pâncreas (TANNER et al., 2000; GRITSKO et al., 2003), hepatocarcinomas

(JENG et al., 2004), meduloblastomas (NEBEN et al., 2004) e gliomas (SCRIDELI et al.,

2008), e estudos de diferentes tecidos têm mostrado que anormalidades cromossômicas são

frequentes em regiões contendo estes genes (TANNER et al., 1995; COURJAL et al., 1996;

REZNIKOFF et al., 1996; BISCHOFF et al., 1998).

Como o Aurora-A e o Aurora-B foram encontrados hiperexpressos em diversas neoplasias

em comparação com os respectivos tecidos não neoplásicos, vários trabalhos buscaram

investigar estes genes como marcadores de prognóstico/diagnóstico e/ou como potenciais

alvos terapêuticos. Desta forma, verificou-se na literatura inúmeros relatos da associação da

hiperexpressão destes genes com um prognóstico desfavorável ou com o aumento do grau do

tumor (BOSS et al., 2009; LOK et al., 2010; BORGES et al., 2012). Além disso, diferentes

estudos mostraram os efeitos da inibição farmacológica, por RNA de interferência (RNAi),

dos dois principais membros da família das aurora-quinases, e resultados interessantes foram

alcançados em diversas neoplasias (BOSS et al., 2009; PEREZ FIDALGO et al., 2009).

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INTRODUÇÃO | 24

Devido ao fato dessas proteínas desempenharem papéis importantes na divisão celular

normal, surge o questionamento se é seguro desenvolver inibidores de Auroras-quinases para

a terapia anticâncer. Acredita-se, porém, que além de estarem hiperexpressas somente em

células tumorais, os efeitos causados pelos inibidores de Aurora-quinase são mais nocivos em

células transformadas e em intensa proliferação do que em células não neoplásicas. Desta

forma, as Aurora-quinases constituem alvos terapêuticos que devem ser investigados

(MATTHEWS et al., 2006; MONTEMBAULT et al., 2007; GAUTSCHI et al., 2008;

MOUNTZIONS et al., 2008).

Muitos inibidores de Aurora-quinases já foram descritos, alguns dos quais estão sendo

utilizados em estudos clínicos e pré-clínicos (GAUTSCHI et al., 2008; MOUNTZIOS et al.,

2008). Dentre estes está o AMG900 (N-(4-((3-(2-aminopyrimidin-4-yl)pyridin-2-

yl)oxy)phenyl)-4-(4-methylthiophen-2-yl)phthalazin-1-amine) (Figura 1), um

inibidor/competitivo de trifosfato de adenosina, altamente potente e seletivo para as auroras

A, B e C, e que está atualmente na fase I de ensaios clínicos (PAYTON et al., 2010; HUANG

et al., 2011). O AMG900 tem a capacidade de inibir a autofosforilação das aurora-quinases A

e B, bem como a fosforilação da histona H3. Ele também foi capaz de inibir a proliferação de

26 linhagens celulares tumorais em concentrações nanomolares muitos baixas, exibindo

favoráveis perfis farmacocinéticos e farmacodinâmicos com toxicidade mínima (PAYTON et

al., 2010).

Figura 1. Estrutura química do quimioterápico AMG900 (N-(4-((3-(2-aminopyrimidin-4-yl)pyridin-2-yl)oxy)phenyl)-4-(4-methylthiophen-2-yl)phthalazin-1-amine).

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OBJETIVOS

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OBJETIVOS | 26

2. OBJETIVOS

2.1. Geral

Investigar os efeitos da inibição das Aurora-quinases em linhagens celulares de

meduloblastoma pediátrico.

2.2. Específico

Investigar os efeitos in vitro da inibição das Aurora-quinases com a droga AMG900, em

linhagens celulares de meduloblastoma pediátrico nos processos de proliferação celular,

capacidade clonogênica e apoptose.

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MATERIAIS E MÉTODOS

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MATERIAIS E MÉTODOS | 28

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Linhagens Celulares e Condições de Cultura

Foram utilizadas as linhagens UW402 e UW473 de meduloblastoma pediátrico,

gentilmente cedidas pelo prof. Dr. Michael S. Bobola (Department of Neurological Surgery,

University of Washington, Seattle, WA). As células foram mantidas em meio HAM F10

(Gibco BRL, Life Technologies®, Carlsbad, CA, USA) suplementado com 10% de SBF,

100U/mL, penicilina e 100µg/mL estreptomicina, em atmosfera úmida contendo 5% CO2 a

37ºC. Na realização dos experimentos, a contagem e o teste de viabilidade celular foram

determinadas utilizando o teste de exclusão do azul de Trypan.

3.2. Preparação da droga

Uma solução estoque de 10mM do inibidor de Aurora-quinase AMG900

(Selleckchem, USA) foi preparada em DMSO e estocada em alíquotas a -80ºC. As drogas

foram adicionadas em meio de cultura imediatamente antes de serem aplicadas nas células.

Todas as doses utilizadas estavam com a mesma quantidade de DMSO, 0,1%, a qual não

causa danos celulares.

3.3. Ensaios Funcionais

3.3.1. Ensaio de Proliferação Celular utilizando o KIT XTT

O ensaio com o kit-XTT é um método de determinação colorimétrico in vitro do número

de células metabolicamente ativas, medindo a proliferação e a viabilidade celular. A clivagem do

sal amarelo tetrazolium XTT pelas células metabolicamente ativas produz o corante formazan de

coloração alaranjada. Um aumento no número de células resulta no aumento da atividade global

de desidrogenases mitocondriais na amostra, que é diretamente correlacionado com a quantidade

de formazan produzido e com diferenças na absorbância da solução.

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MATERIAIS E MÉTODOS | 29

Para o ensaio de proliferação, as células foram semeadas em densidades iniciais de

2x103 em placas de 96 poços e mantidas em condições de cultura por 24 horas. Após este

período, as células foram tratadas com diferentes concentrações da droga AMG900 (5-

500nM), e incubadas. Após 48 horas de tratamento, as células foram lavadas com PBS, e

meio completo sem droga foi adicionado à cultura. A partir deste ponto, considerado o tempo

zero, a proliferação celular foi avaliada nos tempos de 24, 48 e 72 horas. A cada intervalo de

tratamento, a remoção do meio de cultura dos poços foi realizada e em seguida foram

adicionados 100µL de meio de cultura com 10µL de XTT preparado conforme

recomendações do fabricante. As placas foram então incubadas por 4 horas em atmosfera

úmida contendo 5% CO2 a 37ºC. A leitura da absorbância de 450nM com onda de referência

de 650nM foi realizada utilizando o aparelho iMark Microplate Absorbance reader (BioRad

Laboratories, Inc, CA, EUA). Os experimentos foram realizados em triplicata em três

momentos diferentes.

3.3.2. Ensaio Clonogênico

Este ensaio foi realizado conforme Franken et al. (2006). Desta forma, 500 células

foram semeadas, para serem tratadas com diferentes concentrações do AMG900 (2,5-50nM),

em placas de cultura de seis poços. Após 24 horas, foram administrados os tratamentos e as

culturas foram incubadas por 48 horas em atmosfera úmida contendo 5% CO2 a 37ºC.

Posteriormente ao tratamento, o meio de cultura foi removido, as células foram lavadas com

PBS e foi adicionado meio de cultivo completo sem drogas. As culturas foram incubadas em

estufa a 37°C por 7-15 dias, até que as colônias se tornassem visíveis, mas não confluentes.

Para a visualização das colônias o meio de cultura foi retirado, as células foram lavadas com

PBS, fixadas com metanol absoluto por 15 minutos, e coradas com Giemsa a 1%. As colônias

foram contadas com microscópio estereoscópico (magnificação 40x), sendo consideradas

somente aquelas com pelo menos 50 células. Os experimentos foram realizados em triplicata.

3.3.3. Ensaio de Apoptose

O ensaio para detecção de morte celular foi realizado através da marcação de células

apoptóticas com Anexina V - Isotiocianato de fluoresceína (FITC) (BD Biosciences

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MATERIAIS E MÉTODOS | 30

Pharmigen, USA) e células necróticas com iodeto de propídio. Anexina V é uma molécula

que apresenta alta afinidade pela fosfatidilserina, se ligando a esta especificamente. A

fosfatidilserina é um fosfolipídio presente na face interna da membrana das células. Sua

externalização ocorre durante o processo de apoptose e serve como um sinal para as células

serem removidas. A marcação positiva com iodeto de propídio indica que as células perderam

a integridade da membrana.

Para apoptose, as células foram semeadas em densidades iniciais de 2x103, em placas

de 6 poços e mantidas em condições de cultura por 24 horas. Após este período, as células

foram tratadas com o inibidor de Aurora-quinases AMG900 (5-1000nM) e incubadas com os

diferentes tratamentos. Após 48 horas de tratamento, as células foram lavadas com PBS e

meio completo sem droga foi adicionado à cultura. Ao completar mais 48 horas com o meio

sem droga, os procedimentos para mensurar a apoptose foram iniciados. Após o tratamento,

1x105 células foram tripsinizadas e centrifugadas a 1000 rpm por 5 min a 4°C, lavadas com

PBS gelado e depois ressuspendidas em 300uL de tampão de ligação 1X (BD Biosciences

Pharmigen, USA). As células foram então coradas com 5µL de anexina e 50µL de uma

solução de iodeto de propídio (PI) e incubadas, protegidas da luz, em temperatura ambiente.

As células foram analisadas com um citômetro de fluxo BD FACSCalibur™ (BD

Biosciences, San Jose, CA, USA).

3.4. Análise estatística

A análise estatística foi realizada com o auxílio dos softwares (Graph Prism 5.0

(GraphPad Software, San Diego, CA, USA) e SPSS 15.0 (SPSS Inc. Chicago, USA). Foi

realizada One Way ANOVA seguido pelo teste de Bonferroni para analisar as diferenças entre

os tratamentos. O software Calcusyn (CHOU; TALALAY, 1984) foi utilizado para avaliar as

combinações de droga.

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RESULTADOS

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RESULTADOS | 32

4. RESULTADOS

4.1.Efeitos do AMG900 na Proliferação Celular

Os efeitos do AMG900 na proliferação celular, das linhagens UW402 e UW473, após

diferentes doses de tratamentos (5-500nM) e tempos de incubação (24, 48 e 72 horas), estão

representados na Figura 2. Pode-se observar que ambas as linhagens apresentaram um efeito

dose dependente. Não houve um efeito significativo na dose de 5nM, porém foi possível

perceber que na dose de 50nM houve uma diminuição significativa da proliferação celular,

atingindo um platô nas doses seguintes (100-500nM) em ambas as linhagens.

A determinação dos valores que levaram a 50% de inibição do crescimento celular

(IC50), de acordo com o software CalcuSyn, mostrou que a linhagem UW402 é mais sensível

aos efeitos da AMG900 quando comparada com a UW473. Os valores do IC50, após 48 horas

de tratamento estão representados na tabela 1, para ambas as linhagens.

Tabela I: Valores de 50% de inibição do crescimento celular (IC50) após tratamento de 48 horas com a droga AMG900.

Linhagens AMG900 - IC50 (nM) UW402 183,16 UW473 242,16

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RESULTADOS | 33

B

Figura 2. Análise da proliferação celular após o tratamento das linhagens UW402 (A) e UW473 (B) com AMG900, após os tempos de 24, 48 e 72 horas. *(p<0.05).

A

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RESULTADOS | 34

4.2.Capacidade Clonogênica do AMG900

Com o intuito de analisarmos a capacidade de formação de colônias após a

administração do AMG900, foi realizado o ensaio clonogênico. Dessa forma, foi possível

observar uma redução do número de colônias após 48 horas de tratamento, principalmente

com a dose de 50nM de AMG900, atingindo cerca de 90% de inibição para a UW402 e cerca

de 95% para a UW473. Ambas as linhagens responderam de forma semelhante ao tratamento

com a droga (Figura 3).

Figura 3. Análise da redução de colônias nas linhagens UW402 e UW473 após o tratamento de 48 horas com AMG900 (* p<0.05) comparado ao controle.

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RESULTADOS | 35

4.3.Apoptose

Com o objetivo de avaliar se os efeitos citotóxicos encontrados não representavam

apenas uma diminuição da proliferação celular como também morte celular, foi avaliada a

porcentagem de células apoptóticas após a marcação com anexina-V e PI, nas linhagens de

meduloblastoma pediátrico, através das análises de citometria de fluxo.

Como mostrado na figura 4, o AMG900 causou apoptose de modo dose-dependente

em ambas as linhagens. Porém, somente a partir da dose de 50nM, é que foi possível observar

que as células tratadas com o AMG900 (5-1000nM) apresentaram uma porcentagem

significativamente maior (p<0.05) de células apoptóticas quando comparadas ao controle.

Após 48 horas de incubação, foi possível observar, com a maior concentração testada

(1000nM), um aumento de aproximadamente 60% no número de células apoptóticas

(anexina-V positivas) na linhagem UW402, quando comparadas ao controle (Figura 4). Já na

linhagem UW473, este efeito foi observado na dose de 500nM, apresentando,

aproximadamente, 70% de células apoptóticas, quando comparadas ao controle (Figura 4),

havendo uma queda, não significativa, na dose de 1000nM.

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RESULTADOS | 36

Figura 4. Análise do efeito do AMG900 na indução de apoptose nas

linhagens UW402 (A) e UW473(B).*p<0.05.

A

B

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DISCUSSÃO

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DISCUSSÃO | 38

5. DISCUSSÃO

O MB é uma das neoplasias do SNC mais frequentes na faixa etária infantil e apesar da

terapia multimodal agressiva, a disseminação da doença é comum e uma proporção

significativa de MBs não respondem bem aos tratamentos atualmente disponíveis. Dessa

forma, faz-se necessário um melhor entendimento da biologia tumoral desta neoplasia,

visando à identificação de novos alvos terapêuticos para que, consequentemente, novas drogas

antitumorais sejam desenvolvidas (POLKINGHORN et al., 2007; GULINO et al., 2008;

PACKER, 2011; ROSSI et al., 2011).

As proteínas da família Aurora-quinase (A, B e C) têm sido amplamente estudadas em

diversos tumores, uma vez que dois de seus membros, a Aurora-A e a Aurora-B foram

encontrados hiperexpressos em diferentes tipos de neoplasias. A inibição farmacológica das

atividades dessas proteínas têm mostrado resultados promissores para a terapia do câncer

(BOSS et al., 2009; LOK et al., 2010). Entre os inibidores de Aurora-quinases já descritos, o

AMG900 (Figura 1), um inibidor/competitivo de trifosfato de adenosina, está atualmente na

fase I de ensaios clínicos. Essa droga é altamente potente e seletiva para as auroras A, B, e C,

e possui a capacidade de inibir, também, a fosforilação da histona H3, apresentando efeitos

similares a outros inibidores de Aurora-quinases (PAYTON et al., 2010; HUANG et al.,

2011).

No presente estudo, verificou-se que o AMG900 inibiu significativamente os níveis de

proliferação celular em ambas as linhagens de MB pediátrico estudadas, de maneira dose

dependente. Consistente com o que foi observado por Payton et al. (2010), onde o AMG900

induziu um decréscimo significativo na capacidade proliferativa de 26 linhagens celulares

diferentes, como o câncer de mama, colón, pele, fígado, incluindo as linhagens celulares

resistentes a paclitaxel, um quimiterápico comumente utilizado para o tratamento do câncer, e

resistentes a AZD1152, MK-0457, e PHA-739358, outros inibidores de Aurora-quinases.

Outro inibidor de Aurora-quinase, o ZM447439, atuou de maneira semelhante em

diferentes linhagens de tumor, incluindo as linhagens celulares de leucemia mielóide

(WALSBAY et al., 2008), mesotelioma (CRISPI et al., 2010), linhagens celulares de tumor

neuroendócrino gastroenteropancreático (GEORGIEVA et al., 2010), melanoma (PIRKER et

al., 2010), células de câncer cervical (ZHANG L, ZHANG S, 2011) e em linhagens celulares

de glioblastoma (BORGES et al., 2012), confirmando o importante efeito dos inibidores de

Aurora-quinases em células tumorais.

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DISCUSSÃO | 39

Algumas das linhagens estudadas por Payton et al. (2010), como as células tumorais

de pulmão, apresentaram um platô na diminuição celular, consistente com que foi encontrado

nas linhagens UW402 e UW473 no presente estudo, onde a partir da segunda menor

concentração da droga (50nM), os efeitos passam a não ser significativos. Este padrão de

resposta não tem uma razão clara, mas é possível que estejam associados com vias

moleculares semelhantes nestas linhagens.

Os resultados mostraram que o AMG900 inibiu a proliferação celular, com valores de

IC50 de 183,16nM para a UW402 e de 242,16nM para a UW473, indicando que a linhagem

UW402 é mais sensível aos efeitos da AMG900 quando comparada com a UW473. Payton et

al. (2010) relataram que o IC50 das 26 linhagens tumorais tiveram uma variação entre 0,7-5,3

nmol/L, porém eles utilizaram a técnica de ensaio clonogênico para calcular o IC50, fato que

explicaria as diferenças de sensibilidade a droga. Esta diferença também pode ser devido à

resistência das linhagens de meduloblastoma pediátrico utilizadas nesse estudo.

No ensaio clonogênico, as linhagens celulares tratadas com AMG900 mostraram uma

redução na capacidade de formar colônias, quando comparadas ao controle, sendo esta

diminuição dose dependente. Esses resultados, coincidem com os encontrados por Walsbay et

al. (2008) em células de leucemia mielóide, e por Pirker et al. (2010) em células de

melanoma, porém utilizando o inibidor ZM447439, que também inibe a atividade das

proteínas Aurora-quinases.

Em ambas as linhagens celulares estudadas, o efeito mais significativo no ensaio

clonogênico foi observado na concentração de 50nM. Embora as doses necessárias para se

alcançar um efeito significativo sejam bem menores no ensaio clonogênico do que na

proliferação celular, os dados obtidos neste trabalho estão um pouco diferentes dos

encontrados por Payton et al. (2010). Isso porque, no trabalho de Payton et al (2010), o

AMG900 inibiu a formação de colônias em linhagens de células HCT-116 (células de

carcinoma de cólon humano) e em outras linhagens, como as NCI-H460 (câncer de pulmão) e

as MDA-MB231 (carcinoma de mama humano), com as doses de 5 nM ou menos. Os

mesmos resultados foram encontrados por Pirker et al. (2010) em células de melanoma, onde

ocorreu a inibição na formação de colônias também em baixas concentrações do inibidor de

Aurora-quinase ZM447439.

É importante ressaltar que no presente trabalho foi utilizado um ensaio de formação de

colônias de modo que fosse possível a visualização e contagem das mesmas. Essa

característica não foi observada no trabalho de Payton et al. (2010), pois neste os autores não

utilizaram um ensaio onde fosse encontrada a formação de colônias distintas. Tais diferenças

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DISCUSSÃO | 40

podem influenciar na comparação dos ensaios clonogênicos realizados neste trabalho com os

apresentados por Payton et al. (2010).

Neste trabalho, encontramos diferentes respostas das linhagens nos diferentes ensaios

utilizados. Esta diferença, segundo Northcott et al. (2012), seria devido ao fato de o MB,

assim como muitos tumores sólidos, ser altamente heterogêneo. Além disso, segundo Castro-

Gamero et al. (2012), as linhagens apresentam diferenças na ploidia, alterações numéricas e

rearranjos estruturais. Tais características têm sido associadas às modificações no

comportamento biológico dessas células, bem como sua resposta aos quimioterápicos. Este

trabalho também relata que as linhagens possivelmente poderiam ser classificadas como

Grupo 3 ou 4, o que reforça os dados aqui encontrados, já que se trata dos grupos de pior

prognóstico.

Na apoptose, processo altamente controlado de morte celular e que tem um importante

papel no desenvolvimento e na prevenção do câncer (COTTER, 2009), foi encontrado um

grande número de células que sofreram morte celular programada após o tratamento com

AMG900, chegando a atingir uma média de 60% de células apoptóticas. A droga causou

apoptose de modo dose dependente em ambas as linhagens, sendo que a porcentagem de

apoptose aumentou significativamente após a dose de 50 nM na linhagem UW402 e após a

dose de 500 nM na linhagem UW473. Esses resultados vão de encontro aos observados por

Payton et.al (2010), onde o AMG900 também induziu um aumento dose dependente da

apoptose em células HCT-116 e em outras linhagens celulares, como a Jurkat (PAYTON et

al., 2010).

Todos os dados apresentados no presente trabalho confirmam que a inibição das Auroras-

quinases pode ser um tratamento bastante eficaz e que o AMG900 pode ser um agente

promissor para o tratamento do meduloblastoma pediátrico. Entretanto, outros estudos devem

ser realizados para que possamos ampliar os dados aqui discutidos.

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CONCLUSÕES

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CONCLUSÕES | 42

6. CONCLUSÕES

- A inibição das Aurora-quinases pelo AMG900 leva a efeitos antineoplásicos em ambas as

linhagens de meduloblastoma pediátrico;

- O AMG900 reduziu a capacidade das células em formar colônias.

- O AMG900 induziu apoptose em ambas as linhagens;

- Todos os dados encontrados no presente trabalho sugerem que o AMG900 pode ser um

agente promissor para o tratamento do MB pediátrico.

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1 De acordo com a Associação Brasileira de Normas Técnicas. NBR 6023.

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