MOLEKULIN BIOLOGIJA

Biotechnologijos institutas

Prof. K.Sasnauskas

VILNIUS - 2006

Turinys vadas 4 1. Chromatinas 5 1.1. Chromosomos 5 1.2. Nukleosomos 10 1.2.1. Nukleosom struktra 12 1.3. Chromatino pertvarkymo kompleksai 18 1.3.1. ATP naudojantys chromatino pertvarkymo kompleksai 19 1.3.2. Kovalentins histon modifikacijos 27 1.3.2.1. Histon acetilinimas 29 1.3.2.2. Histon fosforilinimas 36 1.3.2.3. Histon ubikvitinilinimas 37 1.3.2.4. Histon metilinimas 38 1.3.2.4.1. Lizino metiltransferazs 39 1.3.2.4.2. Lizino demetilazs 44 1.3.2.4.3. Arginimo metiltransferazs 44 1.3.2.5. Koordinuotos histon modifikacijos, histon kodas 46 1.3.2.6. Ryys tarp histon modifikacij ir DNR metilinimo 50 1.3.2.7. Chromatino pertvarkymo kompleks sveika 55 1.4. Nekanoniniai histonai 57 1.5. Nukleosom formavimasis 59 1.5.1. Heterochromatino formavimas 62 1.5.1.1. Centromer heterochromatinas 63 1.6. HMG baltymai 65 1.6.1. HMGA baltymai 66 1.6.2. HMGB baltymai 69 1.6.3. HMGN baltymai 71 1.7. Izoliatoriai 71 1.7.1. Enhanserius blokuojantys elementai 72 1.7.2. Heterochromatino plitimo barjerai 75 Naudota literatra 77 2. Transkripcija 78 2.1. Prokarijot transkripcija 78 2.1.1. Operonas 83 2.1.2. Katabolitin represija 88 2.1.3. Grieto atsako kontrol 89 2.1.4. Transkripcijos sulaikymas (atenuacija) 90 2.1.5. Operon autogenin kontrol transliacijos lygyje 91 2.2. Eukariot transkripcija 94 2.2.1. Eukariot RNR polimeraz I 94 2.2.2. Eukariot RNR polimeraz III 98 2.2.2.1. Polimerazs III promotoriai 99 2.2.3. Eukariot RNR polimeraz II 105 2.2.3.1. Bendrieji transkripcijos faktoriai 106 2.2.3.2. MED kompleksas 110 2.2.3.3. RNR polimerazs II promotoriai 114 2.2.2.3.1. Promotoriais erdies element tarpusavio sveika 118 2.2.3.4. Eukariot mRNR sintez ir potranskripcins modifikacijos 120 2.2.3.4.1. Transkripcijos elongacija 122 2.2.3.4.2. mRNR 3-galo modifikacijos 127 2.2.3.4.3. Histon mRNR modifikacijos 131

2

2.2.3.4.4. mRNR 3-galo modifikacij ryys su kitais transkripcijos procesais 132 2.2.4. Splaisingas 133 2.2.4.1. Alternatyvus splaisingas 133 2.2.5. mRNR transportas 139 2.2.6. Nekoduojanti RNR (nkRNR) 143 2.2.6.1. Nekoduojanios RNR identifikavimas 146 2.2.6.2. Naujos intron funkcijos 152 Naudota literatra 154 3 DNR replikacija 156 3.1. Prokariot DNR replikacija 161 3.1.1. E. coli DNR polimerazs 161 3.1.1.1. Praimazs (pradmens polimerazs), praimosomos 164 3.1.1.2. E. coli ori praimosoma 166 3.1.1.3. Negatyvi E. coli replikacijos kontrol 175 3.2. Eukariot DNR replikacija 177 3.2.1. Eukariot DNR polimerazs 177 3.2.2. Mieli DNR replikacija 183 3.2.2.1. Mieli replikacijos akuts baltymai 185 3.2.2.2. Mieli replikacijos ori arba ARS (automously replicating sequence) 185 3.2.3. Eukarijot DNR replikacijos reguliacija 187 Naudota literatra 194 4. Genomas 195 4.1. Unikalios ir retai pasikartojanios sekos 198 4.1.1. Eukariot gen evoliucija 203 4.1.2. Gen skaiius, pasikartojimai 207 4.2. Vidutinikai pasikartojanios sekos 210 4.2.1. Transpozonai, retrotranspozonai, autonomikai judantys elementai 211 4.2.2. LTR retrotranspozonai 213 4.2.3. TC1/mariner transpozon eima 214 4.2.4. Neautonomiki judrs elementai Alu sekos 215 4.2.5. Transpozon judjimo pasekms 216 4.2.5.1. Insercijos 216 4.2.5.2. L1 sukeliama transdukcija 217 4.2.5.3. Rekombinacija 218 4.2.5.4. Simbioz ar parazitizmas 218 4.2.6. Transpozon panaudojimas 219 4.3. Paprastos sekos 220 4.4. mogaus genomo iifravimas 223 4.4.1. Strategija 223 4.4.2. Gen identifikavimas 223 4.4.3. Genomo struktra 224 Naudota literatra 226 Sutrumpinim sraas 227

3

vadas Molekulin biologija yra teorinis iuolaikins biotechnologijos pagrindas.

Molekulin biologija yra viena i spariausiai besivystani ir besikeiiani mokslo

ak. Per paskutin deimtmet vyko miliniki pokyiai biologijoje, apvainikuoti

mogaus genomo iifravimu. Prasidjo postgenomin era. Dka intensyvaus

molekulins biologijos vystymosi ir stulbinani rezultat, gat pastaraisiais

deimtmeiais, atsirado naujos mokslo ir pramons kryptys: genomika, proteomika,

farmakogenomika ir kt. Molekulins biologijos inios reikalingos vis srii

specialistams, tane tarpe ir augal biotechnologijos specialistams yra btinos, norint

suvokti lstelje vykstanius reikinius ir juos skmingai panaudoti biotechnologijos

udavini sprendimui.

Molekulins biologijos paskait mediaga yra skirta universitet

studentams. Mediagoje stengtasi perteikti paskutinio deimtmeio molekulins

biologijos pasiekimus, labiausiai akcentuojat paskutinj penkmet. Mediaga

padalinta keturis didelius skyrius, skirtus chromatinui, transkripcijai, replikacijai ir

genomui. Transkripcijos skyriuje taip pat nagrinjamos ir ma RNR problemos.

Pateiktoje mediagoje stengtasi atspindti dabartin ini lyg. Pagrindiniai

informacijos altiniai, kuriais vadovautasi ruoiant i mediag yra mokslins

apvalgos ir svarbiausi moksliniai straipsniai, apibendrinantys naujausius pasiekimus.

4

1. Chromatinas

1.1. Chromosomos Tradicikai DNR molekuls vaizduojamos kaip linijin tiesi juosta, sudaryta i

fosfodiesterinio karkaso ir keturi skirting heterociklini bazi. Tikrovje, gyvuose

organizmuose DNR yra labai tampriai supakuota. DNR tankis bakterij nukleoide yra

apie 10mg/ml, tai jau beveik igrynintos DNR tirpumo riba. Eukarijot branduolyje

DNR tankis yra apie 100mg/ml, o bakteriofago T4 galvutje net 500 mg/ml. Kol kas

dar sunku sivaizduoti, kokiu bdu tokiose slygose vyksta vairs procesai, kaip

baltymai suranda specifines DNR sekas, sveikauja su jomis.

Eukarijot chromatinas kinta lstels cikle, lsteli dalijimosi metu (mejoz ar

mitoz) galima stebti kondensuotas chromosomas.

Bakterijos daniausiai turi vien chromosom, kuri sudaro nukleoid.

Nukleoide DNR yra supakuota gana kompaktik struktr. Bakterij chromosoma

organizuota kilpas, kuri vidutinis dydis yra apie 40 kb. arnyno lazdels E. coli

chromosom sudaro apie 100 kilp (genomo dydis 4,6x106 bp). Kiekviena kilpa yra

autonomika, skiriasi atskir kilp superspiralizacijos laipsnis. DNR trkio vedimas

keiia superspiralizacij tik trk turinioje kilpoje.

A B

Pav. 1.1. (A) Bakterij nukleoidas lstelje; (B) Nukleoidas lizuotoje lstelje

Bakterij DNR superspiralizacijos laipsnis yra vienas negatyvus

superspirals apsisukimas 100 arba 200 bp DNR priklausomai nuo superspiralizacijos

tyrimo metodo. Nukleoido kilp tolesnje kondensacijoje dalyvauja lstels baltymai,

vienas j HU baltymas - heterodimeras, susidedantis i HU1 ir HU2 subvienet. is

5

baltymas sugeba apsivynioti aplink save DNR ir tokiu bdu j kondensuoti. Be HU,

yra eil kit baltym, kurie lenkia DNR (IHF, FIS, H1, P), keiia jos

superspiralizacij. i baltym yra daug, jie vienas kit dalinai pakeiia, j gen

mutacijos nra letalios. Ne vis su chromosoma sveikaujani baltym funkcijos yra

inomos.

Pav.1.2. Bakterij chromosomos kilpos

Virus DNR ar RNR, kaip taisykl, turi pakavimo signal, t. y. specifin

DNR ar RNR sek, kuri atpasta viruso baltymai ir pradeda pakavim. Pakavimo

sekos isiskiria savo antrine struktra. Silini virus (pvz. TMV - tabako mozaikos

virusas, M13 - E. coli bakteriofagas) supakuojamos NR kiekis nra grietai ribojamas,

todl tokius virusus galima vesti papildomas NR sekas. iuose virusuose baltymo

apvalkallis surenkamas ant NR ir kondensuojamas spirals forma silo formos

virusin dalel. Sferiniuose virusuose NR kiek riboja galvuts dydis: SV40 - 5,2 kb,

E. coli lambda bakteriofago 48,5 kb (78-105%), E. coli P1 bakteriofago 90 kb. i

virus kapsid konstruojama i baltymini komponent, suformuojamas apvalkalas

kur terpiama NR. Kaip taisykl, toki virus paviriaus baltymai pasiymi

spontaniko susirinkimo daleles savybmis.

6

Pav. 1.3. Silinis bakteriofagas M13.

Pav. 1.4. Bakteriofagas (lambda) Eukarijotuose, pvz. detergentais lizuotuose Drosophila lstelse, EM pagalba

galima pamatyti silines, madaug 10 nm skersmens chromosomos struktras.

Superspiralizacijos laipsnis eukarijotinse chromosomose yra vienas negatyvus

apsukimas /200bp arba 1/100, priklausomai nuo superspiralizacijai nustatyti

naudojamo metodo. Superspiralizacij paalina viengrandio trkio vedimas viena

i DNR grandi, taiau superspiralizacijos panaikinimas nepaeidia 10 nm

struktros. Tai rodo, kad superspiralizacija apsprendia tolesn 10 nm silo

isidstym erdvje, bet neturi takos io silo struktrai. Norint pilnai relaksuoti

eukarijotin chromosom, reikalinga vesti viengrandius trkius madaug kas 85 kb.

Tai rodo, kad vidutinis eukarijotins chromosomos kilpos dydis yra apie 85 kb. Jeigu

7

i metafazini chromosom ekstrahuosime baltymus, gausime chromosomos

griauius (angl. scaffold), kuriuose baltymai sudarys tik apie 8% mass. Metafazins

chromosomos griauius sudaro tankus sil tinklas. DNR kilpos, vidutinikai kas 30-

90 kb, baltym pagalba yra pritvirtintos prie chromosomos griaui. iuose

griauiuose DNR galima suskaldyti, nepaveikiant j struktros. Tai rodo, kad

griauiai sudaryti i baltym.

Pav. 1.5. Eukarijot chromosomos organizacija. Skirtingi chromatino supakavimo lygiai chromosomose.

Interfaziniame branduolyje matoma struktra pavadinta branduolio matriksu.

Tai filamentin struktra esanti vidinje branduolio membranos pusje. Chromatinas

daniausiai bna susijs su matriksu. I branduoli ekstrahavus daugum baltym,

restrikcijos endonukleazi pagalba galima paalinti didij dal DNR, tada lieka tik

ta DNR, kuri buvo susijusi su baltymais ir yra apsaugota nuo restrikcijos nukleazi

poveikio. Tokiu bdu pavyksta iskirti DNR fragmentus, kurie yra susiri su

griauiais ir matriksu. ie DNR fragmentai pavadinti SAR (angl. scaffold attachment

regions) ir MAR (angl. matrix attachment regions). Apie ias sekas nieko daug

negalima pasakyti, bendra j svyb tai AT turtingos sekos (AT kiekis apie 70%).

Danai jos vadinamos bendru SAR/MAR vardu, taiau, ar tai tos paios sekos,

pasakyti kol kas negalime. Nustatyta, kad su iomis sekomis sveikauja DNR

8

topoizomeraz II, paprastai randama susijusi su MAR. Matriksas ir chromosomos yra

sudaryti i skirting baltym, taiau yra ir bendr komponent.

Pav. 1.6. Chromosom kondensacija ir lstels ciklas. (a) Chromosomos replikuoja ir ima kondensuotis. Vlyvoje profazje irykja dukterini chromatidi kontrai. Chromosom kondensacija tsiasi pasiekiant maksimali kondensacij metafazje. Pereinant i metafazs anafaz nutrksta kohezija tarp chromatidi chromosomos segreguoja. Dekondensacija prasideda kartu su branduoplio struktr formavimusi.

MAR sekoms priskiriamos kelios funkcijos: susiriimas su branduolio matriksu,

topologijos keitimas (topoizomeraz II randama susijusi su iomis sekomis), gal bt

dalyvauja LCR (angl. locus control region) ir izoliatori veikloje.

Pav. 1.7. SAR/ MAR sekos, j izoliavimas.

9

Kiekviena chromosoma sudaryta i nepaprastai ilgos DNR molekuls (E. coli -

4.6x106 bp , o maiausia mogaus chromosoma i madaug 4.6x107 bp). Kakokiu

tai bdu ios didiuls DNR labai tampriai supakuojamos metafaziniame branduolyje

ir relaksuojamos interfaziniame branduolyje (madaug 10 kart). Dominuojanti

struktra, stebima EM yra apie 30 nm skersmens silai.

Daugumoje region interfazje chromatinas yra maiau supakuotas, negu

chromosomos mitozs metu (pav.1.6.). is chromatinas vadinamas euchromatinu.

Euchromatinas uima didij dal branduolio, tai aktyvus chromatinas. Kai kurios

chromosom dalys lieka panaiai tampriai supakuotos interfazje kaip ir mitozje.

ios chromatino dalys vadinamos heterochromatinu. Interfazin lstel turi dvi

heterochromatino klases konstitutyvinis heterochromatinas (visada

heterochromatinas, iardomas tik replikacijos metu) ir fakultatyvinis

heterochromatinas, vienose lsteli linijose jis aktyvus, kitose - ne, vienuose

audiniuose aktyvus, kituose ne. Visuose organizmuose pagrindin konstitutyvaus

heterochromatino mas sudaro telomerins ir centromerins chromosomos sritys,

kuriose beveik nra aktyvi gen, didioji dalis tylinios X chromosomos,

imprintingu paveldti tylintys genai, vystymosi metu nutildyti genai ir kt.

DNR supakavime dalyvauja daug baltym, dalis j jau inomi ir

intensyviai tyrinjami. Tai ATP naudojani baltym eimos kondensinas, kohezinas

ir kiti SMC eimos (structural maintenance of chromosomes). Paveiksllyje pateiktas

hipotetinis SMC baltym veikimo modelis. Jie dimerizuojasi ir formuoja V formos

struktras, kurios jungdamos tarpusavyje formuoja struktras, tarnaujanias

chromatino kondensavimui.

10

Pav. Hipotetin SMC baltym sveika.

11

Pav. Kondensino veikimo modelis

1.2. Nukleosomos Chromatinui bdinga tam tikra DNR supakavimo organizacijos hierarchija.

Maiausias chromatino struktros vienetas yra nukleosoma. Tokia organizacija

bdinga absoliuiai visiems eukariotams. Nukleosom sudaro apie 200 bp DNR, kuri

yra apsivyniojusi aplink bazini baltym - histon oktamer. Nukleosoma yra pirma

DNR supakavimo pakopa eukarijotinje chromosomoje. Nukleosoma kondensuoja

DNR apie 6 kartus. Histonai sudaro nukleosomos erd, o DNR isidsto erdies

paviriuje apsivyniodama beveik du kartus aplink erd. Histon erd sudaro keturi

bazini baltym dimerai, i viso 8 baltymai:

12

H2A x 2 = 14x2 = 28 kDa

H2B x 2 = 14x2 = 28 kDa

H3 x 2 =15x2 = 30 kDa

H4 x 2 = 11x2 = 22 kDa

H1 penktas histoninis baltymas, tiksliau, tai grup gimining baltym, su

variacijomis tarp ri ir organ, reikaling heterochromatino formavimuisi. H1

histonas heterochromatine randamas susiris su DNR tarpnukleosominmis sritimis.

Du H3/H4 heterodimerai sudaro erd, aplink kuri apsivynioja DNR, o du H2A/ H2B

heterodimerai udengia susidariusi struktr i viraus ir apaios. Taigi, pirmas

chromatino organizacijos laipsnis yra DNR-histon karoliukai, uimantys madaug

po 200 bp kiekvienas ir sudarantys 10 nm diametro struktr. Sekantis chromatino

organizacijos laipsnis yra 10 nm skersmens silo organizacija spiral suformuojant

30 nm skersmens sil. Vienam spirals apsisukimui tenka 6 nukleosomos. ioje

struktroje DNR supakavimo laipsnis padidja iki madaug 40 kart, lyginant su

nuoga DNR molekule. ioje struktroje randama dar papildom baltym, kuri

funkcijos dar nra pilnai inomos. Treias chromatino organizacijos laipsnis yra

tolesnis 30 nm silo supakavimas, kuris siekia iki 1000 kart euchromatine ir apie 10

000 kart mitotinje chromosomoje ir heterochromatine.

Pav. 1.8. Pirmas DNR supakavimo laipsnis 10 nm silas. Vaizdas, gaunamas elektroniniu mikroskopu ir silo schema.

13

Pav. 1.9. Antras DNR supakavimo laipsnis 30 nm silas. Vaizdas, gautas elektroniniu mikroskopu ir silo skerspivio schema.

DNR ir baltym santykis chromatine yra apytikriai lygus, madaug pus chromatino

baltym sudaro histonai nukleosomose. RNR mas chromatine sudaro apie 10% nuo

DNR mass. Yra duomen, kad RNR dalyvauja daugelyje proces, tame tarpe ir

struktrinje chromatino organizacijoje, taiau kol kas jos rol chromatine dar labai

neaiki. Pastaraisiai metais aikja daug nauj RNA funkcij, susijusi su

heterochromatino formavimusi.

Be keturi nukleosomas sudarani histon baltym ir H1 histono, randamo

tarp nukleosom heterochromatine, btino heterochromatino formavimuisi, randami

ir kiti baltymai, pavadinti nehistoniniais baltymais. Tai baltymai dalyvaujantys gen

veiklos reguliacijoje, RNR polimerazi kompleks baltymai, transkripcijos faktoriai

ir represoriai, diskretin HMG baltym grup (angl. high mobility group).

1.2.1.Nukleosomos struktra

Interfazin branduol patalpinus emos jonins jgos tirpal, EM galima

stebti atsipalaiduojanias fibrilines struktras - 10 nm silus, kurie susideda i EM

matom nedideli karoliuk. Branduol paveikus didesne jonine jga stebimi 30 nm

silai. 30 nm struktr sudaro 10 nm silas sukamas spirale, madaug 600 kampu apie

14

a. vien 10 nm silo apsisukim telpa 6 nukleosomos. Tok 10 nm chromatino

preparat paveikus mikrokok nukleaze, gaunamos paviens nukleosomos, nes is

fermentas skaldo DNR, jeigu jis prie DNR gali prieiti i vis pusi.

Toki bdu mikrokok nukleaz suskaldo chromatin tarpuose tarp

nukleosom, t.y. su histonais nesusiriusi DNR. Tokiu bdu galima gauti

individualias nukleosomas. I mikrokok nukleaze paveikt chromatino preparat

igryninus DNR ir j ifrakcionavus agarozs gelyje gausime kartotines madaug 200

bp DNR juosteles. Nukleosomos mas yra apie 262 kD (su H1), auktis apie 6 nm,

skersmuo apie 11 nm. Ilgiau veikiant preparatus mikrokokine nukleaze, DNR

fragment dydis maja ik 165 bp, tai nukleosomos, dar turinios H1 histon.

Skaldant ilgiau, DNR dydis stabilizuojasi ties 146 bp. 146 bp DNR yra tampriai

apsivyniojusi apie baltymin erd ir yra neprieinama mikrokok nukleazei.

Pav. 1.10. Chromatino, suskaldyto mikrokokine nukleaze, elektroforetinis vaizdas

Pav.1.11. Chromatino skaldymo mikrokok nukleaze seka.

Be eksperiment su mikrokokine nukleaze, daug informacijos apie DNR

organizacij chromatino struktroje duoda tyrimai, panaudojant kitas nukleazes:

DNRaz I ir II. DNRaz I skelia vien DNR grandin maajame griovyje, jeigu jis

yra prieinamas. Kada DNR yra apsivyniojusi aplink histonin erd, jos maasis

15

griovys nukleosomos paviriuje eksponuojamas kas 10 nt, tokiu bdu DNRaz I kas

10 nt veda viengrandius trkius. Taigi, kad DNRaz I skaldyt DNR, reikalinga kad

bt prieinamas maasis griovys. Tokiu bdu galime patikrinti ar DNR apsivyniojusi

tampriai aplink histonin erd, ar DNR konkreioje vietoje organizuota

nukleosomas. Tam tikslui reikalinga isiskirti konkreios, tiriamos chromosomos

vietos zond, t.y. DNR fragment, kuriam komplementari srit nortume pairti

chromosomoje. Tokios DNR fragment paymjus radioaktyviu fosforu, s ymtas

fragmentas naudojamas zonduoti jo atitikmenis chromatine po DNRazs I poveikio.

Chromatinas, veikiamas nedideliu kiekiu DNRazs I, parenkant fermento

koncentracij toki, kad toje paioje chromatino struktroje vedami trkiai bt reti.

I tokio preparato igryninama DNR ir skaldoma restrikcijos endonukleazmis, tomis

paiomis, kuriomis buvo suskaldytas ms ymtas zondas. Toks DNR miinys

frakcionuojamas agarozs arba poliakrilamido geliuose, perneamas ant

nitroceliuliozins membranos ir hibridinamas su ymtu zondu. Po hibridizacijos ir

atplovim, nitroceliuliozinis filtras eksponuojamas su rentgeno plvele (arba

fosfoimideriu). Irykinus rentgeno plvel pastebsime kartotines 10 nt juosteles,

jeigu ms tiriamas DNR rajonas buvo organizuotas nukleosomas. is metodas labai

plaiai taikomas ir baltym - DNR sveikai tirti, baltymo susiriimo su DNR vietai

nustatyti, chromatino rajonams, neturintiems nukleosomins organizacijos

identifikavimui (nukleazms hiper-jautrs rajonai randami promotoriuose,

izoliatoriuose).

Ar tokia chromatino organizacija netrugdo DNR replikacijai, transkripcijai?

Ar nukleosomos iardomos replikacijos ir transkripcijos metu? Jeigu iardomos, iki

kokio laipsnio, pavieni histon ar iki tam tikr struktr, ar nukleosomos

konservatyvios, t.y. ar po iardymo tie patys baltymai susiria su ta paia DNR, kaip

pasiskirsto histonai po replikacijos, ar viena nukleosoma ilieka konservatyvi, o nauja

formuojasi i nauj histon, ar atvirkiai, viskas sumaioma. Ne visus iuos

klausimus iandien galime atsakyti.

Ankstesni rRNR koduojani lokus EM tyrimai rod, kad transkribuojama

DNR neturi nukleosom (lemp epeiai arba Kald eglut), taiau, atrodo, kad

tai bdinga tik labai intensyviai transkribuojamiems rRNR genams. Neseniai

pademonstruota, kad mieli gen promotoriuose iardoma viena arba dvi

nukleosomos.

16

SV40 viruso DNR infekcijos metu yra labai aktyviai transkribuojama, taiau

joje randamos nukleosomos, iskyrus 350 bp nukleazmis hiperjautri dal, kurioje

lokalizuotas replikacijos ori ir pagrindiniai viruso promotoriai. Transkripcijos metu

RNR polimeraz susiria madaug su 50 bp DNR, ivynioja apie 12 - 17 bp

fragment, todl nepanau, kad tokia DNR sugebt ilikti ant nukleosomos oktamero

paviriaus. Matomai, lokalus ir trumpalaikis iardymas vyksta, taiau, yra duomen,

kad oktameras lieka susijs su DNR ir tuojau pat vl suformuoja nukleosom.

Jautrumo DNRazei I tyrimai rodo, kad koduojanios geno dalys yra

supakuotos nukleosomas. Nedidels sritys, jautrios nukleazms, t.y. neturinios

nukleosom, randamos kai kuriuose promotoriuose, enhanseriuose, bei specialiose

chromatino struktrose - izoliatoriuose. Mikrokok nukleaz aktyviai

transkribuojamus genus lengviau veria nukleosomas, negu tylinius. Tai rodo, kad,

aktyvs genai yra maiau apsaugoti, turi maiau baltym. Taigi, transkripcijos metu

jeigu iardoma, tai tik viena nukleosoma. Atskir chromosomos viet hiper-jautrumas

nukleazms rodo, kad iose vietose DNR neturi nukleosomins struktros, taiau tai

nereikia, kad tose vietose DNR visikai nuoga. Kaip taisykl, jinai bna susijusi ir su

vairiais kitais baltymais, tame tarpe transkripcijos faktoriais. Hiper-jautrios

chromatino sritys charakterizuoja promotorius, o taip pat vairias ribas, kuri

nukleosomos neapsaugo nuo DNRazs, kurios apsprendia nukleosom pozicij.

Hiper - jautri viet atsiradimas koreliuoja su gen aktyvacija.

Replikacijos akuts EM tyrimai taip pat rodo DNR nukleosomin

organizacij tiek prie, tiek u replikacijos akuts. Matomai, replikacijos metu

iardoma ne daugiau kaip viena nukleosoma. Yra duomen, kad histon erdis,

susidedanti i dviej H3 ir H4 dimer yra konservatyvi ir ilaiko savo struktra

replikacijos metu, taiau visas oktameras nra konservatyvus. Tai buvo nustatyta

tyrinjant radioaktyvia yme ymto chromatino replikacij.

Vienas i kertini ir neaiki klausim yra ar nukleosoma turi savo pastovi

viet DNR sekos atvilgiu. Ar visose lstelse ta pati DNR seka guli toje paioje

nukleosomos vietoje. Tai labai svarbu transkripcijos reguliacijai, promotori

atpainimui ir kitoms DNR - baltymo sveikoms. Jeigu DNR organizuota grietai

vienodai visose lstelse, toks organizavimas vadinamas nukleosom fazikumu, t.y.

nukleosomos yra vienoje fazje, o tai reikia, kad visose lstelse kiekviena konkreti

DNR seka nukleosomos atvilgiu yra toje paioje padtyje. Ar yra kakoks sek

specifikumas nukleosomos atvilgiu, ar vienos sekos gali bti tik tarp nukleosom, o

17

kitos - tik nukleosomos sudtyje? Skaldant su mikrokok nukleaze gaunamos 200 nt

kartototins DNR juostels agarozs gelyje. Jeigu mes pasirinksime kok nors

chromosomos DNR fragment, kurio seka inoma ir kuriame yra unikalus restrikcijos

endonukleazs sklimo taikinys, galima atlikti bandym:

BamHI EcoRI BamHI

__________________________________________________

Atskirai kiekvienas fragmentas (BamHI EcoRI ir EcoRI BamHI)

paymimas radioaktyviu P32. Mikrokok nukleazs pagalba i lsteli chromatino

iskyrus nukleosomas, igryninus j DNR ir suskaldius i DNR restriktaze BamHI,

ir toki DNR ifrakcijonavus agarozs gelyje, ji suhibridinama atskirai su ms

pasiruotais zondais dviem peiais. DNR miinyje kiekvienas zondas ras sau

komplementarias DNR sekas, prisijungs prie j ir tokiu bdu payms jas. Tokiu bdu

DNR fragment miinyje mes stebsime, kaip atrodo zondams komplementarios DNR

sekos. Jeigu jos diskretikos, t.y. tai yra formuoja vien juost, visos nukleosomos

buvo toje paioje fazje DNR atvilgiu. Jeigu gausime vairiausi ilgi miin, tiksliau

ilg dm, reik kad nukleosomos buvo skirtingose fazse ir j padtis visai

nepriklausoma nuo DNR sekos. Toki bandym rezultatai parod, kad ta pati seka turi

polink bti toje paioje fazje, taiau tai nra absoliutu ir kakokiu laipsniu priklauso

nuo DNR sekos. Ne kiekviena nukleosoma turi savyb bti ties konkreia seka, taiau

genome yra tam tikros sekos, kurios apsprendia nukleosomos padt (AT turtingos,

GC turtingos). Tokiose vietose nukleosom formavimasis priklauso nuo sekos ir

nukleosoma susiformuoja specifikai sekos atvilgiu. ios nukleosomos apsprendia

kit nukleosom padt. Taigi, DNR sekoje yra enklai, reguliuojantys nukleosom

padt. Kaip taisykl, tai AT ar GC turtingos sekos. DNR turi savyb linkti vien ar

kit pus. AA/TT/TA dinukleotidai link lenkti maj griov link histon oktamero,

tuo tarpu GC seka maj griov kreipia ior. 8 AT jau rykiai takoja nukleosomos

padt. Nuo sekos priklauso ir linkerio, jungianio nukleosomas ilgis, kuris svyruoja

nuo 8 bp iki 140 bp. Nukleosomos nra visai taisyklingos, DNR prigludimas

priklauso nuo sekos, kiekviena skirtinga DNR seka skirtingai linksta, todl

nukleosomos gali bti truput kampuotos. Taigi, manoma, kad yra tam tikri

18

riboenkliai, ties kuriais susiformavusios nukleosomos apsprendia sekani

nukleosom padt DNR sekos atvilgiu. 2004 2005 metais paskelbti rezultatai apie

mieli S. cerevisiae vis nukleosom padt DNR atvilgiu. Rezultatai, gauti

naudojant chromatino imunoprecipitacijos (CHIP) metod, rodo kad apie 70% mieli

nukleosom turi savo pastovi viet. 2006 m. pasirod bioinformatik tyrim

rezultatai, tvirtinantys, kad vir 50% mieli nukleosom padt galima nuspti

bioinformatinias metodais i DNR nukleotid sekos. Tai daro prielaid kalbti apie

egzistuojant chromatino kod, apie kur inome dar labai maai.

Pav. Chromatino imuno precipitacijos schema, metodas chromatino baltym

DNR sveikai tirti.

19

Pav. 1.12. Rotacinis ir transliacinis nukleosomos padties kitimas DNR atvilgiu

Nukleosomos pozicija sekos atvilgiu gali kisti dvejopai translational

positioning - transliacinis fazikumo pakitimas, kada nukleosoma pasislenka DNR

atvilgiu per kakiek tai bazi por, tai yra nukleosomos vainja DNR atvilgiu.

Tokiu bdu, sekos buvusios nukleosomos struktroje, gali atsidurti tarp nukleosom.

Kitas variantas, kada DNR sekos pozicija nukleosomos atvilgiu pasikeiia dl DNR

superspiralizacijos pokyi, t.y. dl rotacijos, tokiu bdu DNR gali pasisukti kita

puse. Vienu atveju, maasis griovys gali bti iorje, kitu atveju, didysis griovys

iorje. Rotacinis DNR padties (fazs) pasikeitimas gali bti labai svarbus DNR-

baltym sveikai, DNR atpainimui, transkripcijos faktori prisijungimui. Paprastai

DNR sek atpainimui yra svarbus didysis griovys. ie reikiniai gerai ityrinti

promotoriuose. Nukleosom paalinimas ar kitoks chromatino permodeliavimas

danai esti btinas transkripcijos iniciacijos komplekso formavimuisi.

Kur nukleosomos stabiliausios? Negauss tyrimai rodo, kad genuose,

turiniuose TATA sek, nukleosoma randama tuoj u TATA sekos, nejungdama

TATA nukleosomos sudt. Paios stabiliausios nukleosomos yra centromer

struktroje. Didiausi nukleosom stabilumo kontrastai randami reguliatoriniusoe

regionuose.

20

1.3. Chromatino pertvarkymo kompleksai Nuo 1996 met, kada buvo identifikuoti pirmieji chromatin pertvarkantys ar

permodeliuojantys (remodeling) kompleksai, surasta ir itirta daug sudting

kompleks, dalyvaujani formuojant ir keiiant vienoki ar kitoki chromatino

bsen.

Chromatino struktr keiianius kompleksus galima suskirstyti dvi grupes,

remiantis j fermentiniu aktyvumu:

ATP naudojantys kompleksai, turintys ATPazin aktyvum. Nuo ATP

priklausantis chromatino pertvarkymas katalizuojamas kaip taisykl, i daugelio

subvienet susidedani baltym kompleks, kurie kiekvienas turi ATPazi baltym

super-eimos nar. ios super-eimos atstovai yra labai konservatyvs visuose

eukariotuose.

Kita baltymini kompleks grup, dalyvaujanti chromatino pertvarkyme

pasiymi kovalentine histon modifikacija, tai kompleksai pasiymintys histon

acetilazi/deacetilazi fermentiniu aktyvumu. Be j, labai svarb vaidmen

chromatino aktyvumo reguliacijoje vaidina histon metilazs, histon kinazs, histon

ubikvitinilinimo fermentai ir DNR metilazs. i kovalentini modifikacij sudtinga

tarpusavio sveika dar nra pilnai aiki, taiau disponuojami duomenys leido

suformuluoti (2000 m.) histon kodo hipotez.

1.3.1. ATP naudojantys chromatino pertvarkymo kompleksai

Pirmas chromatino pertvarkymo kompleksas buvo identifikuotas mielse,

tyrinjant genus, susijusius su globaline gen reguliacija. i gen mutacijos, takojo

daugelio gen raik. Tyrinjant mieli poravimosi tipo persijungim, MAT a, (HML, MAT/a, HMRa) buvo gauta serija mutacij, pavadint swi (angl. swich) su paeistu poravimosi tip persijungimu. Kitose laboratorijose, tyrinjant sacharozs

metabolizm, buvo gauta serija snf (angl. sucrose nonfermenting) mutacij. Dalis

identifikuot mutacij buvo susij tik su konkreiais genais, kontroliuojaniais

poravimosi persijungim (HO) ar sacharozs sisavinim (SUC2), taiau dalis

mutacij pasiymjo pleotropiniu poveikiu ir globaliai takojo daugelio gen, visikai

nesusijusi su naudota atrankos sistema, iraik. Klonavus snf ir swi genus, nustaius

j pirmin struktr, paaikjo, kad dalis pleotropini mutacij snf ir swi yra tuose

21

paiuose genuose, todl ie genai vadinami SWI/SNF. Swi/snf mutantai sunkiai auga

terpje su sacharoze, juose sutriks poravimosi tip persijungimas, o taip pat pakits ir

daugelio kit gen funkcionavimas. Supresorini mutacij paieka leido identifikuoti

genus, mutacijos kuriuose kompensavo (supresavo) swi/snf mutacij poveik. Tokiu

bdu buvo izoliuota sin (swich/snf independent) mutacij serija. Klonavus ir

inagrinjus atitinkamus genus, paaikjo, kad supresorins sin mutacijos daniausiai

buvo lokalizuotos histon H3, H4 genuose (sin1, sin2), tame tarpe histon gen DNR

sekose, koduojaniose H3 H4 histon tarpusavio sveikos vietas, taip pat HMG

baltym genuose. Taigi, pleotropins, globaliai veikianios mutacijos buvo susietos su

konkreia struktra chromatinu. Prieita ivada, kad SWI/SNF gen koduojami

baltymai savo reguliatorin funkcij atlieka per chromatino struktros keitim. Mieli

Swi/Snf baltymai buvo igryninti viename stabiliame komplekse, kuris pavadintas

SWI/SNF kompleksu. is kompleksas susideda i 11 baltym, kurio erdis yra

Swi2/Snf2 ATPaz, savo struktra primenanti helikazes. iame komplekse be

helikazs motyv turinio baltymo, dar du baltymai ARP7 ir ARP9 savo struktra

primenantys aktin, pasiymi ATPaziniu aktyvumu (1% viso aktyvumo). Remiantis

SWI2/SNF2 homologija ir ATPaziniu aktyvumu, analogiki kompleksai buvo rasti

kituose organizmuose: mogaus lstelse hSWI/SNF, drozofil lstelse-

dSWI/SNF (dar vadinamas brahma kompleksu su brm ATPaze). Mielse greitai buvo

igrynintas kitas didelis kompleksas, turintis kit ATPaz Sth1. is kompleksas

pavadintas RSC (angl. remodeling structure of chromatin). Sth1 ATPaz pasiymi

homologija Swi2/Snf2 ATPazei, be to abu kompleksai turi dar kelet bendr baltym

(Arp7, Arp9). Reikia paymti, kad SWI/SNF komplekso mutacijos mielse nra

letalios, tuo tarpu kai kuri RSC komplekso gen mutacijos yra letalios, be to RSC

komplekso lstelje yra apie 10 kart daugiau, negu SWI/SNF.

Toliau iekant panai chromatin pertvarkani kompleks (ChPK),

remiantis ATPazi homologija, vairiuose organizmuose buvo igryninti nauji

kompleksai su naujomis ATPazmis, pavadinti ISW1, ISW2 (imitation SWI/SNF).

Isw ATPazi eima nuo Swi/Snf eimos skiriasi baltymo domen struktra. Treia

neseniai surasta mogaus lstelse yra Mi-2 ATPazi eima ir ferment turintis

chromatino pertvarkymo kompleksas NuRD. Be ATPazi domen, atskirose ATPazi

eimose randami skirtingi papildomi domenai, kuri dka kompleksas sveikauja su

chromatino baltymais ar DNR: Swi/Snf eimoje bromodomenai, Swi/Snf ir Isw

eimoje SANT domenas, sveikaujantis su DNR, Mi-2 eimoje randamas

22

chromodomenas ir PHD cinko pirtai (angl. plant homeodomen zinc fingers). PDH

cinko pirtai paprastai sveikauja su histon deacetilazmis (HDAC1).

Chromodomenas paprastai randamas heterochromatin formuojaniuose baltymuose

(HP1, PC baltymai), dalyvaujaniuose gen represijoje. NuRD kompleksas taip pat

dalyvauja represijoje. Matomai tampresniam chromatino supakavimui taip pat

reikalingi specials chromatino pertvarkymo kompleksai. Taigi, skirtingi chromatino

pertvarkymo kompleksai turi skirting tip ATPazes.

Pav. 1.13. ATP naudojantys chromatino pertvarkymo kompleksai

Kokiu bdu buvo patvirtinta, kad ie kompleksai pertvarko chromatin?

Aikinantis chromatino pertvarkymo mechanizmus, pirmin informacija buvo gauta

genetiniais metodais, parodant, kad mutacijos kompleks komponentus

koduojaniuose genuose takoja dideli gen grupi veikl. ias mutacijas supresuoja

kompensuojamosios mutacijos, lokalizuotos histon H3, H4 ar HMG baltym

genuose, t.y. buvo nustatytas genetinis ryys tarp SWI/SNF gen ir histon gen.

Vliau genetini tyrim ivados buvo patvirtintos eksperimentuose su biochemikai

igrynintais kompleksais veikiant chromatin in vitro. Buvo pademonstruota, kad:

Paveikus igrynintu kompleksu ir ATP chromatin, keiiasi jo jautrumas DNRazei I. i nukleaz normal chromatin skaldo 10 nt kartotiniais

23

laipteliais, po poveikio ima skaldyti kas 1 nt. Tai rodo, kad tiriamajame rajone

nukleosomos yra suardytos, DNR tampa pilnai prieinama nukleazei.

DNR tampa jautri restriktazms. Tai buvo pademonstruota dirbant su Hsh60 (heat shock) geno ir jo transkripcijos faktoriaus GAGA sistema. Hsh60 geno

promotoriuje nukleosom padtis buvo inoma. Be to, iame promotoriuje yra

restriktazs taikinys, paprastai nukleosomos apsaugotas nuo restriktazs

poveikio. Paveikus promotori permodeliavimo kompleksu, promotoriuje

esantis restriktazs taikinys tapo prieinamas restriktazei.

DNR ChPK poveikyje nra atskiriama nuo H3/H4 erdies, taiau sveika susilpnja, DNR jautrumas nukleazms nra vienodas per vis 146 bp atkarp,

jautriais tampa DNR galai, ieinantys i nukleosomos, o vidurys, apie 70 bp

lieka nepakits arba maai pakits. Tai rodo, kad DNR nepalieka

nukleosomos, ilieka apsivyniojusi, taiau sveika susilpnja.

Kai kurie kompleksai perstumdo nukleosomas, i ChPK poveikyje nukleosomos juda DNR atvilgiu, tokiu bdu susidaro galimyb TF

(transkripcijos faktoriams) susiriti su atpainimo sekomis, kurios be ChPK

poveikio yra neprieinamos. Tokiu bdu gali bti aktyvuojami nauji genai.

Kai kurie kompleksai (RSC, taip pat ir SWI/SNF) in vitro slygomis gali nukleosomas permesti nuo chromatino ant nuogos (radioaktyvios) DNR. Ne

visos nukleosomos vienodai gerai persimeta, tai priklauso ir nuo DNR

sekos.

SWI tipo kompleksai turi polink in vitro sutvarkyti nereguliarias nukleosomas, taiau kiekvienas kompleksas turi savo specifik.

Drozofil NURF (ISWI) padeda GAGA TF prisiriti prie Hsh60 geno promotoriaus, o GAGA TF fiksuoja i bsen. Mieli yISW1 t pat gali

padaryti, o yISW2 ir CHRAC ne. CHRAC (ISWI) sudaro reguliari

nukleosom struktr, sutvarko nukleosomas, taiau nepadeda TF prisiriti.

ISWI tipo kompleks aktyvumui reikalingi histon galai, tuo tarpu Mi-2 kompleksams histon galai nra reikalingi, taip pat ir hSWI/SNF, jie

sveikauja su kitomis nukleosomos sritimis. Vieni kompleksai sveikauja su

histonais, kiti su DNR.

24

Pav. 1.14. Chromatino pertverkymo biocheminiai tyrimai. (A) Promotoriau srities tyrimai skaldant

chromatin mikrokokine nukleaze ir analizuojant Sauthern hibridizacijos metodu. (B) Histon DNR sveikos tyrimai skaldant DNRaze I.

Ar chromatino pertvarkymas stabilus? In vitro stabilus, skirtingi kompleksai

pertvarko skirtingai, po pertvarkymo chromatinas atsistato ltai. In vivo nra aiku,

matomai, tiek stabilus, kiek reikia, nes ia veikia ir daug kit faktori.

Ar visi ChPK dalyvauja transkripcijos reguliacijoje? Matomai ne. iuo metu

inoma, kad mielse SWI/SNF kompleksas reguliuoja apie 6% gen, vien veikl

skatina, kit, atvirkiai, slopina. ySWI/SNF mutant tyrimai panaudojant DNR

gardeles parod, kad i 5460 tirt mieli gen, 329 gen aktyvumas pakito, t.y. j

transkripcija pakito 2 ir daugiau kart. Netikta buvo tai, kad i t 329 gen, kuri

transkripcija pakito SWI/SNF- mutantuose, 203 gen transkripcija padidjo, o 126

sumajo. Tai rodo, kad is kompleksas daugiau dalyvauja represijoje, negu

aktyvacijoje. Taigi, mielse is kompleksas pasiymi tam tikru gen specifikumu, j

kakokie tai TF atveda tik prie konkrei gen. Yra inoma, kad mogaus

gliukokortikoid receptoriai atveda hSWI/SNF gliukokortikoidais reguliuojam

gen promotorius.

RSC kompleks kiekis mieli lstelje yra 10 kart didesnis, lyginant su

SWI/SNF. Sukonstravus dirbtinius TF, kuri vienas galas atpasta reporterinio geno

25

promotori (pav. E. coli LexA atpainimo seka, integruota mieli promotori), o

kitas susiria su ChPK, parodyta, kad SWI/SNF komplekso atvedimas promotori

skatina geno veikl, tuo tarpu RSC komplekso atvedimas transkripcijos neaktyvuoja.

Matomai RSC funkcija yra kita, gal bt replikacijoje, chromatino struktros

reguliacija lstels cikle, reparacijoje, rekombinacijoje.

Pav. 1.15. Hipotetinis chromatin pertvarkani kompleks veikimo modelis.

ChPK poveikyje chromatinas destabilizuojamas, jis tampa nepastovus,

takus, poveikis priklauso nuo komplekso. Tada kiti faktoriai destabilizuot

chromatin stabilizuoja, fiksuoja kakoki tai jo bsen, aktyvi arba neaktyvi. Po

chromatino destabilizavimo genas gali bti aktyvuojamas arba represuojamas,

priklausomai nuo kit faktori poveikio: jeigu po ChPK atvedami ko-aktyvatoriai,

turintys histon acetilazes, fiksuojama aktyvi geno bsena, jeigu ko-represoriai,

turintys histon deacetilazes neaktyvi bsena.

mogaus hSWI/SNF kompleksai turintis ATPaz Brg1 (arba hBrm) pasiymi

panaiu aktyvumu, kaip mieli, taiau yra maesni, susideda i 7-9 baltym, sudaro

daugiau skirting variant. mogaus lstelse randami bent 4 kompleksai

besiskiriantys keliais polipeptidais. i kompleks sudtis priklauso nuo lsteli ir

audini tipo.

26

Drozofil lstelse dSWI/SNF (brm) kompleks, skirtingai nuo mieli, yra

labai daug, kiekis kinta lstels cikle. Optimalios biosintezs metu randama madaug

1 kompleksas 20-iai nukleosom. Akivaizdu, kad i kompleks funkcija

skirtinguose organizmuose gali bti skirtinga, neirint stebimos baltym

homologijos.

Postuluojama, kad yra tarpins, pereinamos chromatino bsenos (t.y. histon

DNR sveikos bsenos). Perjim ias nestabilias bsenas ir stimuliuoja ChPK. Be

ChPK toks perjimas bt labai ltas. Tarpins bsenos gali skirtis DNR histon

sveika ir nukleosom pozicija. Pertvarkymo metu stebimi DNR jautrumo

nukleazms pokyiai. Pertvarkymo poveikyje, matomai, padidja tikimyb pereiti i

represuotos aktyvi bsen ir atvirkiai, perjimo krypt apsprendia kiti faktoriai,

pasinaudojantys ia bsena.

Pav.1.16. Chromatino pertvarkymo kompleks aktyvumas

Mi-2 eimos ChPK, kuri ATPazs turi chromodomen ir tuo skiriasi nuo

SWI/SNF, ISWI kompleks, dalyvauja represijoje, iuos kompleksus eina histon

27

deacetilazs (HDAC). is kompleksas sveikauja su specifiniais DNR surianiais

baltymais ir represuoja promotorius.

Kodl dauguma kompleks veikia promotoriuose, o ne viso geno

struktroje? Vieno ChPK ATPaz suskaldo 50-200 ATP/min, reikia reikt labai daug

ATP. Be to, kada komplekso nra, chromatinas bna neaktyvus, kompleksas

reikalingas bsenos pakeitimui. Tai palyginti paprasta reguliacija.

Lstels cikle kompleks aktyvumas kinta. Mitozs metu SWI/SNF

fosforilinamas, paalinamas nuo chromatino, o po mitozs, dekondensuojantis

chromatinui, vl prijungiamas prie chromatino, taiau nra parodyta, kad SWI/SNF

prisiriimas prie chromatino yra jo dekondensacijos prieastis.

ChPK veikimo mechanizmas daniausiai aikinamas helikazs domeno

pagalba. Helikazs gali ivynioti DNR grandines, taiau chromatino pertvarkymo

metu DNR grandins nra ivyniojamos, taiau gali lokaliai pakisti DNR topologija

bei jos superspiralizacijos laipsnis. Yra duomen, kad ChPK gali vesti negatyvi

superspiralizacij. Kitas mechanizmas nukleosom poslinkiai DNR atvilgiu, t.y.

transliacinis fazs keitimas. Kaip kompleksai stumdo nukleosomas, dar nra aiku,

taiau daugelis in vitro bandym tok veikim patvirtina.

Dauguma ChPK turi savo specifines funkcijas, kurios dar nra pilnai

iaikintos. Neseniai izoliuotas naujas ChPK pavadintas INO80, btinas dvigrandi

trki (DSB) reparacijai. INO80 kompleksas susideda i 12 polipeptid, i kuri

baltymas Ino80 turi ATP-azms/translokazms bding motyv, bei du baltymai

(Rvb1/Rvb2), panas RuvB, priklausantys AAA+ ATP-azi eimai. RuvB

dalyvauja DSB reparacijoje bakterijose, pasiymi helikazs savybmis. Funkcionali

bakterij RuvB helikaz sudaryta dviej homo-heksamer. Panaiai ir Rvb1/Rvb2

sudaro dvigub heksamer. Dka Rvb1/Rvb2, INO80 kompleksas pasiymi helikazs

savybmis, gali paalinti nukleosomas nuo paeistos DNR gal, o taip pat padeda

Holliday struktros migracijai, paalinant ar perstumiant nukleosomas migracijos

metu. Be INO80, reparacijoje dalyvauja SWR1 kompleksas, turintys kelet su INO80

bendr baltym, tame tarpe Rvb1/Rvb2 helikaz. DSB metu paaidos viet

atvedama daug baltym, tame tarpe dvi lstels ciklo reguliacijoje dalyvaujanias

kinazs Tel1 ir Mec1. i kinazi fosforilinti substratai stabdo lstels ciklo

vystimsi. Mielse ios kinazs paaidos vietoje fosforilina H2A histon 129-Ser

padtyje. is fosforilinimas ir atveda paaidos viet INO80. INO80 atlaisvina nuo

nukleosom galus, reparacijos sistema NHEJ (angl. nonhomologous end joining)

28

sujungia trkusi DNR. Kartu su INO80 iame procese dalyvauja ir SWR1

kompleksas, kuris, po reparacijos, H2A-129Ser-P pakeiia Htz1(mieli H2A.Z)

histonin baltym, kuris yra nefosforilintas. Tokiu bdu fosforilintas chromatinas

veriamas nefosforilint.

induoli lsteli branduoliuose randamas gana didelis kiekis fermento

poli(ADP-ribozi) polimerazs. is fermentas taip pat susijs su reparacija,

aktyvuojamas susirius su dvigrandiais DNR trkiais. Aktyvuotas fermentas sintetina

poli-ADP-ribozes (PAR), taip pat ribozilina ir greta sanius baltymus, tame tarpe ir

savo paties molekules. ADP-ribozilinimas inaktyvina poli(ADP-ribozi) polimerazs

fermentin aktyvum. Pastaraisiais metais ima aikti, kad poli(ADP-ribozi)

polimeraz dalyvauja daugelyje branduolio proces. Politeninse chromosomose

pastebtos io fermento sankaupos puf vietose. Fermento aktyvumas koreliuoja su

gen transkripcijos aktyvumu ir chromatino dekondensacija. Pastebta, kad is

fermentas dka cinko pirto domeno, pasiymi dideliu giminingumu DNR ijimo ir

jimo nukleosom struktr vietoms, labai panaiai, kaip ir histonas H1. ie abu

baltymai gali tarpusavyje konkuruoti dl susiriimo su tarpnukleosominmis sritimis.

Taiau jie matomai nekonkuruoja, nes abu baltymai randami skirtingose chromatino

vietose. Poli(ADP-ribozi) polimeraz randama maiau kondensuotuose rajonuose, o

H1 labiau kondensuotuose rajonuose. Poli(ADP-ribozi) polimerazs susiriimas su

tarpnukleosominmis sekomis didina chromatino kompaktikum ir koreliuoja su

transkripcijos slopinimu. Poli(ADP-ribozi) polimerazs enzimatinio aktyvumo

indukcija galina modifikuoti Poli(ADP-ribozi) polimerazes, ko dka Poli-ADP-

ribozilintos polimerazs pasialina nuo chromatino ir tokiu bdu skatina jo

dekondensacij. is fermentas modifikuoja ir histonus, poli-ADP-ribozilinti histonai

praranda galimyb sveikauti su DNR, tokiu bdu chromatinas pilnai

dekondensuojamas. Po aktyvumo stimuliacijos, fermentas greitai praranda enzimatin

aktyvum dl savo paties modifikacijos, todl signalo poveikis nusilpsta. Poli(ADP-

ribozi) polimerazs naudoja NAD+. Maos NAD+ koncentracijos branduolyje

maina fermento enzimatin aktyvum ir galina susiriti su chromatinu. NAD+

koncentracijos padidjimas, susijs su fermento NMNAT1 fosforilinimu, stimuliuoja

polimerazs aktyvum (NMNAT1 - nikotinamido mononukleotido adenilil-

transferaz i ATP sintetina NAD+). Tokiu bdu NAD+ kiekis reguliuoja transkripcij,

o poli(ADP-ribozi) polimeraz dalyvauja ir chromatino represijoje ir aktyvacijoje.

29

1.3.2. Kovalentins histon modifikacijos

Histonai, ypa H3/H4 N-galai ir H2A/H2B C-galai yra yra intensyviai

modifikuojami. Histon N-galai, nuo 15 iki 38 ar formuoja vadinamus histon galus,

kurie yra intensyviai modifikuojami. iuo metu inomos net devynios histon

potransliacins modifikacijos: Fosforilinimas (S, T), acetilinimas (K), metilinimas (K,

R), ubikvitinilinimas (K), sumoilinimas (K), ADP-ribozilinimas, glikozilinimas,

karbonilinimas.

Pirmos trys modifikacijos pastarj deimtmet yra labai intensyviai

tyrinjamos, apie jas daugiausia ir kalbsime.

30

Pav. 1.17. Histonai yra intensyviai modifikuojami. Pagrindins potransliacins modifikacijos

Ac acetilinimas, Me metilinimas, P fosforilinimas, Ub ubikvitinilinimas pateiktos paveiksllyje. Paveiksllyje paymti ir induoli fermentai, metilinantys histon specifines pozicijas. Kai kurias pozicijas modifikuoja daug skirting ferment.

emiau nurodytos galimos pagrindini modifikacij funkcijos.

H3 H3-R2, R17, R26 metilinimas - siejamas su aktyvacija (CARM metilaz aktyvatorius) H3-K4 tri-metil bdingas aktyviam chromatinui, di-tri-metil- padeda susiriti ISW1 kompleksui, kuris susijs su represija. Di-tri-metil- susij su rDNR gen slopinimu H3-R8 PRMT5 metilaz, metilinimas koreliuoja su aktyvacija;

31

H3-K9 tri-metil represija, signalas DNR metilinimui; H3-K9 acetilinimas aktyvacija, reikalingas TAF250(TFIID) susiriimui, neleidia susiriti HP1 su H3-K9; H3-K9 metilinimas inhibuoja S10 fosforilinim; di-metil sveikauja su HP1, tri-metil tarnauja signalu DNR metilinimui (SUV39H1 metilaz); H3-S10 fosforilinimas padeda ateiti GCN5 acetilazms; H3-T11 fosforilinimas, funkcija gerai neinoma; H3-K14 acetilinimas tarnauja aktyvacijai, reikalingas TAF250(TFIID) (acetilaz) susiriimui; H3-K18 acetilinimas, funkcija gerai neinoma; H3-K23 acetilinimas, funkcija gerai neinoma; H3-K27 tri-metil sveikauja su represiniais poly-comb kompleksais; H3-K27 acetilinimas koreliuoja su aktyvacija; H3-S28 fosforilinimas, funkcija gerai neinoma; H3-K36 metilinimas aktyvuoja, susijs su transkripcija ir elongacija (Metilaz SET1 valosi kartus su RNR polII.) H3-K79 metilinimas siejamas su aktyvacija ir transkripcija bei elongacija (DOT metilaz) ir su represija telomer sek ir rDNR represija. H4 H4-S1 fosforilinimas, funkcija gerai neinoma; H4-R3 metilinimas susijs su aktyvacija, stimuliuoja H3-K5, K8, K16 acetilinim (acetilaz CBP/p300), kas savo ruotu stimuliuoja H3-R2, R17, R26 metilinim (CARM metilaz aktyvatorius) ; H4-K5 acetilinimas susijs su aktyvacija; H4-K8 acetilinimas reikalingas Brg1 (hSWI/SNF) susiriimui; H4-K12 acetilinimas konfliktikas, ir aktyvacija ir represija, acetilintas heterochromatine; H4-K16 acetilinimas susijs su aktyvacija; deacetilinimas mielse skatina SIR2 susiriim (represija); H4-K16 acetilinimas iardo 30 nm silo struktr; H4-H18 fosforilinimas, funkcija gerai neinoma; H4-K20 metilinimas bdingas mitozei, antagonistikas H4-K16 acetilinimui (atvirkia koreliacija). H2A/ H2B modifikacij reikm maiau itirta, taiau taip pat svarbi. Neseniai pademonstruota, kad H2B K123 ubikvitininimas reikalingas H3-K4 ir H3-K79 metilinimui 1.3.2.1. Histon acetilinimas

Histon acetilinimas / deacetilinimas yra vienas i pagrindini chromatino

aktyvumo reguliavimo mechanizm. Histon acetilinimo reikm buvo jauiama

seniai buvo pastebta tendencija, kad acetilintas chromatinas (H3/H4 N- galai) yra

aktyvus, deacetilintas neaktyvus. Taiau i koreliacija nra vienareikm, nes

acetilintas H4- K12 padtyje randamas heterochromatine. Tuo tarpu H4-K16

randamas acetilintas tik euchromatine, t.y. aktyviame chromatine. Tiesiogiai histon

32

acetilinimo reikm gen aktyvacijai buvo parodyta 1996 m., kada i vienalsi

Tetrachymena buvo klonuotas ir sekvenuotas histon acetilazs genas. Palyginus io

fermento aminorgi sek gen bankuose, paaikjo, kad ji pasiymi labai didele

homologija mieli baltymui GCN5, kurio fermentin funkcija buvo neinoma, taiau

buvo inoma, kad GCN5 genas yra vienas i globalini transkripcijos aktyvatori.

iuo metu iskiriamos dvi pagrindins histon acetilazi klass:

Citoplazmins acetilazs HAT-B (angl. histone acetyltransferase-B)

Branduolins acetilazs HAT-A. HAT-A yra daug eim, jos yra labai skirtingos,

taiau turi ir bendr domen (bromodomenas).

Jeigu pairsime histon aminorgi sekas, j N-galuose, kurie neeina

nukleosom struktr, rasime daug bazini aminorgi, lizin (K) ir arginin (R),

kurie gali bti modifikuojami. Pagrindins geriau itirtos modifikacijos pateiktos

aukiau paveiksllyje 1.16.

Nukleosom rentgeno struktrin analiz parod, kad 30 nm chromatine

nukleosomos yra tarpusavyje suritos histon H3/H4 N-galais. Neacetilinti vienos

nukleosomos N-galai yra patalpinami gretimos nukleosomos H2A/H2B histon

suformuot neigiamu krviu pasiymini kien. Acetilinus, is ryys nutrksta.

Nustaius, kad mieli globalinis reguliatorius GCN5 yra histon acetilaz,

paaikjo ir daugelio kit reguliatorini gen funkcija ir veikimo mechanizmai. Gana

seniai buvo inoma, kad GCN5 genas dalyvauja amino rgi ir nukleotid

biosintezs bendrojoje reguliacijoje. GCN5 baltymas i mieli valosi dviej dideli

kompleks struktrose, vienas kompleksas pavadintas SAGA yra 1,8MD, kitas

ADA, 0.8MD. domu tai, kad kiti SAGA kompleks sudarantys baltymai taip pat

buvo inomi kaip gen aktyvum takojantys baltymai. Todl SAGA rekm

traskripcijos reguliacijoje yra labai vairiapusika, susijusi ne vien tik su acetilazs

aktyvumu.

33

Pav. 1.18. Kondensuotas ir dekondensuotas chromatinas ir nukleosoma.

SAGA kompleksas susideda i baltym, kuri genai SPT, ADA ir GCN buvo

identifikuoti trijuose nesusijusiuose eksperimentuose (SPT ADA GCN5-

Acetylase). Visi i genai pasiymjo globaliniu poveikiu daugelio gen aktyvum.

Mieli S. cerevisiae 20 SPT gen serija buvo identifikuota iekant

supresorini mutacij, kompensuojani LYS2 ir HIS4 gen inaktyvacij mielse,

sukelt transpozono Ty siterpimu i gen promotoriuose. Gauti mutantai, augantys

be histidino ar lyzino buvo pavadinti spt (SPT suppressor of Ty). Tarp spt mutant

buvo rastos mutacijos histon H2A ir H2B genuose, pavadintuose SPT11 ir SPT12

atitinkamai. SPT2 genas koduoja HMG tipo baltym. SPT4, 5, 6 genai yra labai

svarbs transkripcijos elongacijoje, j koduojami produktai sveikauja su H3/H4.

SPT15 genas koduoja TBP baltym (TBP baltymas yra svarbiausiais ir nepakeiiamas

formuojant visus transkripcijos iniciacijos kompleksus eukarijotuose). SPT3, SPT7,

SPT8, SPT20 gen koduojami baltymai sveikauja su TBP baltymu. Matome, kad

skmingos selekcijos sistemos sukrimas leido izoliuoti daug skirting gen, susijusi

su gen aktyvacija. Dalis Spt baltym eina SAGA kompleks. Taigi, dalis SPT gen

produkt sveikauja tiesiogiai su TBP (SPT 3, 7, 8, 20), kiti susij su chromatino

baltymais, eina transkripcijai svarbius kompleksus (SAGA, TFIID).

Kita sistema, taip pat paremta gen supresori paieka, buvo sukurta

panaudojant hibridin transkripcijos faktori, susidedant i mieli transkripcijos

faktoriaus GAL4 DNR surianio domeno ir moni viruso HSV (angl. herpes

34

simplex virus) VP16 baltymo transkripcijos aktyvacijos domeno. Toks dirbtinis

transkripcijos faktorius tam tikromis slygomis sukelia letalius efektus, t.y. miels

neauga. Iekant mutacij, kurios kompensuot, t.y. supresuot io transkripcijos

faktoriaus letalum, buvo gautos mutacijos genuose, pavadintuose ADA (alteration

deficiency in actyvation). Kai kurie ADA genai sutapo su anksiau izoliuotais SWI

genais (ADA2 SWI7, ADA3 SWI8, ADA5 SPT20), o GCN5 genas sutapo su SWI9.

i gen koduojami baltymai, ADA2, ADA3, ADA5 (GCN5) eina SAGA sudt.

Taigi, labai skirtingais genetiniais metodais buvo izoliuoti genai, kaip vliau

paaikjo, koduojantys atskirus SAGA komponentus. Visi ie komponentai yra

svarbs gen reguliacijoje. Pasirod, kad j veikimo mechanizmas pasireikia per

SAGA kompleks ir histon acetilinim. Vliau paaikjo, kad kai kurie SAGA

komplekso baltymai eina ir vieno i bendrj transkripcijos faktori, TFIID sudt

(TAFai).

Identifikavus SAGA kompleks mielse, analogiki kompleksai buvo rasti ir

kituose organizmuose, tame tarpe mogaus lstelse (hSAGA = PCAF). Toliau

tyrinjant, paaikjo, kad daugelis inom transkripcijos ko-aktyvatori, tai yra

baltym kompleks, dalyvaujani gen aktyvacijoje, yra histon acetilazs (Lentel

i Nature Reviews, Molecular cell biology, 2001, 2, 422-432 ):

HAT eimos ir j ryys su transkripcija:

HAT Organizmai Funkcija Histonai,

kuriuose acetilinama (dominuojantys)

GCN/PCAF eima Gcn5 PCAF

Miels-mons

Ko-aktyvatorius Ko-aktyvatorius

H3

35

MYST eima Sas2 Sas3 Esa1 MOF Tip60 MOZ HBO1

Miels Miels Miels Drozofilos mons mons mons

Gen slopinimas Gen slopinimas Lstels ciklo progresas Gen dozs kompensacija IV Tat sveika Leukemijos genez Sveika su Ori

H4 (H3)

TAFII250 eima

Miels - mons

TBP asocijuotas faktorius

H3

CBP/p300 eima Kirmls - mons

Globalinis ko-aktyvatorius

Visi histonai

SRC eima SRC-1 ACTR/AIB1/pCIP/TRAM/RAC3 SRC-3 TIF-2 GRIP1

Pels - mons Steroidini receptori ko-aktyvatoriai

H3/H4

ATF eima

Miels - mons

DNR sekai specifinis ko-aktyvatorius

?

Kokia acetilinimo funkcija? Vienas i logik acetilinimo reikms

chromatino struktrai paaikinim yra teigiam krvi neutralizacija histon

nestruktrizuotuose N-galuose. Acetilinimas keiia nukleosomoje esani histon

tarpusavio sveik, taip pat gretim nukleosom oktamer sveik. Kaip minjome,

30 nm sile, H3/H4 galai yra patalpinti gretimos nukleosomos neigiamoje kienje,

suformuotoje histon heterodimero H2A/H2B. Acetilinimas i sveik suardo ir,

matomai, palengvina kit baltym susiriim su DNR. Taiau acetilinimo poveikis

yra ymiai sudtingesnis, matomai, veikia ne vienas mechanizmas, tarnaujantis

acetilinimo realizacijai. Acetilinimo poveikis nra trivialus, acetilinti histonai randami

ir heterochromatine, taigi, negalima teigti grietai, kad acetilintas chromatinas

aktyvus, deacetilintas neaktyvus. Kaip minta anksiau, H4 K12 randamas

acetilintas heterochromatine, tuo tarpu K16 acetilintas tik aktyviame chromatine.

Paaikjo, kad chromatino aktyvacijai reikalingas specifinis atskir K acetilinimas. I

36

to seka, kad be krvi pasikeitimo, acetilinimas labai svarbus yra kit, su chromatinu

sveikaujani baltym prisiriimui, atpainimui. Buvo pastebta, kad po vienos

modifikacijos seka kita modifikacija, negalinti vykti be pirmosios. Dka acetilinimo

suformuojami baltymo paviriai, galinantys saveikauti kitus baltymus ir atlikti

tolesnes modifikacijas

Paraleliai su acetilazmis imta domtis ir deacetilazmis fermentais ar j

kompleksais, kurie paalina histon acetilinim. Pirma induoli deacetilaz -

HDAC1 buvo igryninta ir klonuotas j koduojantis genas, panaudojant fermento

didel giminingum deacetilazi inhibitoriui trapoksinui. Nustaius fermento pirmin

sek, paaikjo, kad mogaus HDAC1 pasiymi didele homologija (60%) inomam

mieli globaliniam reguliatoriui Rpd3 (reduced potasium dependence). I to

paaikjo, kad Rpd3 represins funkcijos mechanizmas yra vykdomas per histon

deacetilinim. Tai buvo patvirtinta su histon deacetilazi inhibitoriais trapoksinu,

trichostatinu A, butyratais, o taip pat konstruojant specialius baltymus, atvedanius

deacetilazes promotorius. S. cerevisiae buvo rasti 5 genai, koduojantys baltymus,

pasiyminius homologija ir deacetilazi aktyvumu. mogaus lstelse iuo metu jau

rasta apie 20 skirting histon deacetilazi. Paaikjo, kad deacetilazs randamos

daugumoje su gen represija susijusi kompleks, mieli Sin3, mogaus hSin3A,

hSin3B, NuRD kompleksuose. Mieli Sin3 baltymas funkcionuoja genetiniame kelyje

susijusiame su represija ir randamas komplekse su deacetilazmis HDAC.

induoliuose, be HDAC1 ir HDAC2, mSin3A komplekse randami kiti svarbs

chromatino modifikavime ir formavime dalyvaujantys baltymai RbAp46/48, SAP18,

30 (Sin associated proteins). induoliuose Sin3A stabiliai sveikauja su HDAC1 ir

HDAC2. Jeigu tok kompleks atvesime promotori, transkripcija bus represuojama.

Deacetilazes turintys kompleksai mSin3A-HDAC1,2 sveikauja su

korepresoriais NCoR (angl. nuclear co-repressor), SMRT (angl. silencing mediator of

retinoic and thyroid hormone receptors). ie ko-represoriai sveikauja ir su eile

transkripcijos faktori, susiriusi su DNR, kada jie neturi ligand, tai transkripcijos

faktoriai THX, RAR, RXR, VDR. Ligando neturintis TF susiria su ko-represoriumi,

o pastarieji atveda deacetilazes, geno transkripcija blokuojama. Atsiradus ligandui,

transkripcijos faktoriaus sveikoje su ligandu (retinoin rgtis, vitaminas D,

tiroidiniai hormonai), ko-represorius atpalaiduojamas, j pakeiia ko-aktyvatorius su

histon acetilaze ar ChPK. Taigi, dalis TF sdi ant promotori ir, priklausomai nuo

ligand, aktyvuoja arba represuoja promotori. Kiti TF (steroidini hormon

37

receptoriai) veikia kitaip, jie reziduoja citoplazmoje ir tik susijung su ligandu

patenka branduol.

HDAC1,2 eina ChPK NuRD sudt, kur eina dar RbAp46/48 ir 3

baltymai p32, p70, p240. p240 yra artimas CHD3, CHD4 baltymams ATPazms,

einanioms ChPK. Taigi NuRD turi ir chromatino permodeliavimo aktyvum ir

histon deacetilazes. In vivo io komplekso funkcija yra transkripcijos represija, be to

jis svarbus replikacijoje, reparacijoje, rekombinacijoje, taiau veikimo mechanizmas

iuose procesuose dar neaikus.

mSin3A/HDAC kompleks poveikis transkripcij pasireikia ne vien per

histon deacetilinim, panaiai ir SAGA poveikis aktyvacij pasireikia ne vien per

histon acetilinim. Neseniai paaikjo, kad Sin3A sveikauja su bendruoju

transkripcijos faktoriumi TFIIB ir tokiu bdu neleidia susiformuoti prie-iniciacijos

kompleksui.

Kam reikalingas toks didelis acetilazi ir deacetilazi kiekis? Kaip minta

anksiau, mogaus lstelse jau rasta apie 20 skirting deacetilazi. Atskiros

acetilazs bei deacetilazs pasiymi tam tikru substrato specifikumu, acetilina arba

deacetilina tik tam tikrus histon, o taip pat ir kit baltym lizinus. Pastaruoju metu

intensyviai vystomi chromatino imunoprepicitacijos (ChIP) eksperimentai parod, kad

mielse deacetilazs pasiymi ir gen specifikumu. Kai kurios deacetilazs

randamos susijusios tik su tam tikromis chromosomomis arba tik su tam tikromis

gen grupmis. Keletas deacetilazi specifikai sveikauja tik su rDNR genais (Hos1,

Hos3 mielse), kitos tik su ribisomini baltym genais (Hos2). Deacetilazs Rpd3

ir Hda1 randamos susij su subtelomerinmis sritimis ir skirting promotori srityse.

Idomu tai, kad deacetilaz randama ir aktyvi indukuojam promotori srityse.

Manoma, kad veikianiame promotoriuje, deacetilaz bna neaktyvi. I ChIP

eksperiment seka, kad kiekviena acetilaz / deacetilaz gali turti specifin unikali

funkcij. Matomai, kakokie tai transkripcijos faktoriai ar represoriai, atpastantys

rDNR promotorius, atveda specifines deacetilazes ar acetilazes.

Acetilazms bdingas struktrinis komponentas, pavadintas bromodomenu.

i struktra tarnauja acetilinto K atpainimui. Bromodomenas apie 60 ar konservatyvus regionas, randamas transkripcijos reguliatoriuose, 1992

m. identifikuotas kai kuriuose Drosophila transkripcijos reguliatoriuose (baltyme Brahma ir kt.).

Vliau paaikjo, kad is domenas visada randamas histon acetilazse, taip pat ir daugelyje kit

transkripcijos ir chromatino reguliacijoje dalyvaujani baltym struktroje. Daniausiai baltymuose

38

randama viena bromodomeno kopija, taiau keletas acetilazi turi po dvi kopijas (TFIID komplekso

didiausias baltymas TAFII250 = TAF1, Brd baltymai). Baltymai su dviem bromodomenais gali

atpainti ir sveikauti su dviems lizinais, arba sveikauti su vienu K, po to acetilinti kit K. Vienas i

Brd eimos baltym, turintis du bromodomenus, Bdf1 susiria su acetilintais H4 ir suformuoja fizin

barjer tarp euchromatino ir heterochromatino. Bromodomeno delecija bromodomen turiniuose

baltymuose paeidia acetilinim ir transkripcij. In vitro eksperimentai, taip pat branduolinio

magnetinio rezonanso analiz acetilint ir neacetilint peptid sveikos su bromodomenus turiniais

baltymais acetilazmis, patvirtino, kad bromodomenas atpasta acetilint lizin histon N- dalyje.

Bromodomenas tarnauja ir nuo acetilinimo priklausaniai baltym tarpusavio sveikai. mogaus

genome rasta per 30 gen, koduojani baltymus, turinius bromodomenus, Drosophila j turi apie 16,

miels 10. Neseniai parodyta, kad GCN5 acetilazs bromodomenas susiria su acetilintu H4 K16

histonu. Matomai, tokiu bdu, viena acetilaz acetilina vien K, tada ateina kita, atpaistanti acetilint

histon, ir acetilina kit K.

Bromodomenas yra bdingas visoms histon acetilazms, taiau randamas ir

kituose baltymuose, pav. Swi2/Snf2 ATPaz turi bromo domen, tokiu bdu

SWI/SNF kompleksas atpasta acetilintus histonus. Be histon ir kiti chromatino

baltymai (pav. HMG, transkripcijos faktoriai) modifikuojami, taiau i modifikacij

reikm itirta tik epizodikai, nes kiekvieno geno atveju, aktyvacijos metu stebimas

tik tam genui bdingas aktyvacijoje dalyvaujani baltym rinkinys. Bromodomenai

tarnauja ir kit acetilint baltym atpainimui. induoliuose PCAF acetilazs

bromodomenas atpasta HIV Tat baltymo K50, CBP acetilaz specifikai susiria su

acetilintu p53 K382. induoliuose inoma apie 80 skirting funkcij baltym, kuri K

yra acetilinami. Atatinkamai, jie yra atpastami bromodomenus turini baltym. K

gali bti ne tik acetilinami, bet ir ubikvitinilinami. Ubikvitino molekuli prijungimas

prie baltymo K yra signalas to baltymo degradacijai. Poli- ubikvitinilinti baltymai yra

degraduojami proteosom. iuo atveju K ubikvitinilinimas konkuruoja su

acetilinimu, acetilintas K negali bti ubikvitinilintas. Tokiu bdu acetilinimas

dalyvauja baltym stabilumo reguliacijoje. Pademonstruota, kad bent 12 svarbi

transkripcijos ir lstels ciklo reguliatori (p53, p73, E2F1, Smad7, SREBP1, NF-E4,

Runx3 ... ) stabilumas padidja acetilinus specifinius K. Konkurencija tarp acetilinimo

ir ubikvitinilinimo yra vienas pagrindini reguliacijos mechanizm, apsaugojani

nuo ubikvitinilinimo ir degradacijos. Buvo pademonstruota, kad baltymuose p53, p73,

E2F1, Smad7, SREBP1, NF-E4, Runx3 tas pats K gali bti acetilintas arba

ubikvitinilintas. Tokiu bdu HAT specifikai acetilinanti tok K, utikrina baltymo

stabilum ir prieingai, deacetilinimas su HDAC skatina degradacij. mechanizm

iliustruoja tyrimai su p53. p53 acetilinimo taikinys yra kartu ir ubikvitinilinimo

39

taikiniu. Baltym p53 ubikvitinilina specifinis baltymas Mdm2, kontroliuojantis p53

aktyvum (Hdm2 pas mones). Jau seniai inoma, kad Mdm2 baltymas paalina

p53 baltym i branduolio. Mdm2 randamas asocijuotas su HDAC1 deacetilaze.

Baltymuose gali bti acetilinamos ir kitos aa. N-galini amino rgi acetilinimas

labai padidina baltym stabilum, apsaugo nuo N-terminalinio poliubikvitinilinimo.

Neseniai pademonstruota, kad H4-K16 acetilinimas destabilizuoja 30

nm chromatino silo struktr. i modifikacija yra labai svarbi euchromatino

formavime.

1.3.2.2. Histon fosforilinimas

Be acetilinimo, paskutiniaisiais metais tam tikras progresas pasiektas tiriant

histon fosforilinimo svarb gen aktyvacijai. Kol kas gerai inoma ir gerai itirta tik

keletas in vivo histon fosforilinimo pozicij, tai H3-S10, H2A 119 Thr, H2A 129Ser.

Tiriant histon modifikacijas, pastebtas ryis tarp H3 fosforilinimo ir H3/H4

metilinimo ir acetilinimo. Pradeda aikti sudtinga i modifikacij tarpusavio

sveika, j seka. Modifikacij tarpusavio sveikos tyrim idavoje 2000 m. buvo

suformuluota histon kodo hipotez. Pagal i hipotez, esanios chromatino

modifikacijos apsprendia toliau vyksianias modifikacijas, modifikacijos tarnauja

atpainimo ymekliais ateiti vieniems arba kitiems baltymams ar kompleksams.

H3-S10 pozicijos fosforilinimas yra svarbus transkripcijos aktyvacijoje, o taip

pat chromosom kondensacijoje. Kadangi transkripcija ir chromatino kondensacija

tarpusavyje nelabai suderinami dalykai, nes yra lydimi prieing chromatino pokyi

(transkripcija chromatino atidarymo, dekondensavimo, chromosom kondensacija

chromatino tampraus supakavimo), atrodo, kad i modifikacija tarnauja kit baltym

atpainimo ir prisijungimo paviri formavimui, o ne tiesioginiam chromatino

struktros keitimui dl krvio pokyi. Pirma identifikuota kinaz, susijusi su

taranskripcijos aktyvacija ir fosforilinanti H3-S10 buvo mieli Snf1. Ji atvedama

promotorius ko-aktyvatori, taip pat ChPK pagalba (SWI/SNF). Drozofilose

parodyta, kad HSH (heat shock) gen indukcija kariu yra lydima intensyvaus H3-

S10 fosforilinimo. H3-S10 fosforilinimas visada koreliuoja su H3-K9 acetilinimu.

H3-S10 fosforilinimas nesuderinamas su H3-K9 metilinimu, taiau neseniai pastebta,

kad ankstyvoje G2/M fazje koegzistuoja ios dvi modifikacijos, H3-K9 metilinimas

40

ir H3-S10 fosforilinimas kartu. H3-K14 acetilinima kartu su H3-S10 fosforilinimu

paalina HP1 nuo metilinto H3-K9.

Kita, neseniai iaikinta svarbi fosforilinimo pozicija yra H2A 119 T.

histon nukleosomos struktroje fosforilina fermentas Nukleosom histon kinaz -1,

kuri nefosforilina palaid histon. i modifikacija susijusi su lstels ciklo vystymusi,

fosforilinamas vyksta tik mitozje, bet ne S-fazje.

H2A 129S fosforilinamas reparacijos metu. Paaidos vietoje kinazs Tel1 ir

Mec1 fosforilina H2A-129S. Kaip taisykl, i kinazi fosforilinti substratai stabdo

lstels cikl.

Pagrindinio transkripcijos iniciacijos komplekso TFIID didiausias

komponentas TAFII250 (TAF1), be HAT ir histono H1 ubikvitinilimo aktyvum,

pasiymi ir histon kinazs aktyvumu, taiau tikslus substratas dar nra nustatytas.

1.3.2.3. Histon ubikvitinilinimas

Ubikvitinas (Ubi) yra labai konservatyvus 76 ar polipeptidas. Paprastai

baltym ubikvitinilinimas susijs su baltym nukreipimu degradacijos keli

proteosomoje. Taiau mono ubikvitinilinimas turi ir reguliatorin funkcij.

Pirmiausia mielse buvo parodyta, kad H2B K123 yra ubikvitino ligazs (Rad6)

substratu. i modifikacija yra kritin mitozje ir mejozje. Visai neseniai parodyta,

kad H2B K123 ubikvitininimas reikalingas H3-K4 ir H3-K79 metilinimui.

Vieno i pagrindinio transkripcijos iniciacijos komplekso organizatori TFIID

didiausias baltymas TAFII250 (TAF1) pasiymi histono H1 ubikvitinilimo

aktyvumu. Be io aktyvumo, TAFII250 pasiymi HAT aktyvumu (turi du

bromodomenus) ir histon kinazs aktyvumu. Galima spti, kad H1 ubikvitinilinimas

tarnauja io baltymo paalinimui i aktyvaus chromatino.

Neseniai parodyta (2004 m.), kad H2A-K119 yra mono-ubikvitinilinamas

PRC1 (polycomb represor complex) komponento Ring1b baltymo. H2A-K119

monoubivitinilinimas yra bdingas neaktyvios X chromosomos chromatinui. ios

modifikacijos rol dar neaiki.

Be gana didelio kiekio ubikvitinilinimo aktyvumu pasiymini baltym,

neseniai rasti ir deubikvitinilinantys baltymai, tai Ubi specifins proteazs,

nuskelianios Ubi molekul. ie fermentai yra labai svarbs baltym stabilumo

41

reguliavime. Pademonstruota, kad p53 stabilum labai padidina vienas i jo partneri

HAUSP (UPS7), paalinantys mono ubikvitinilinim. Neseniai parodyta, kad

deubikvitinaz Ubp8 yra mieli SAGA komplekso komponentas. Gal bti, kad

SAGA kompleksas, turintis acetilazs (GCN5) ir deubikvitinazs (Ubp8) aktyvumus

yra svarbus transkripcijos iniciacijoje dalyvaujani baltym stabilumo reguliatorius.

Transkripcijos faktori ubikvitinilinimas yra btina transkripcijos inciacijos

slyga. Pagal juodosios nals model, transkripcijos faktorius indukavs

transkripcijos akt yra degraduojamas.

1.3.2.4. Histon metilinimas

Baltym metilinimas yra paplitusi modifikacija, rykiai pakeiianti

aminorgi hifrofobikum. Metilinamos karboksilo grups glutamate, leucine arba

oninse lysino (K) ir arginino (R) grandinse esantys azoto atomai. Histonai

metilinami tik K ir R aminorgi liekanose. R gali bti metilinamas mono ir di-

padtyse, simetrikai ir asimetrikai. Fermentai, atliekantys arginino metilinim

skirstomi dvi grupes, I tipo fermentai (PRMT I protein arginine methyltransferase)

katalizuoja mono- ir asimetrin di- metilinim, II tipo fermentai (PRMT II)

katalizuoja mono- ir simetrin di- metilinim. K gali bti mono-, di- ir tri- metilintas.

42

Pav. 1.19. Histon lizino ir arginino liekan metilinimas. A. Mono- ir di-metilarginino struktra.B. Mono, di- ir tri- lizino struktra.

Histon metilinimas buvo pastebtas labai seniai, taiau jo reikm suprasta

gana neseniai (2000 - 2003 m). Neseniai buvo parodyta, kad su branduolio

receptoriumi - ko-aktyvatoriumi asocijuotas baltymas CARM1 (co-activator

associated arginine methyltransferase 1) dar inomas kaip PRMT4 (protein metil

transferase), yra I tipo histono H3 specifin arginino metilaz. Drosophila su

heterochromatinu susijs baltymas Su(var)3-9, yra histono H3 specifin lizino

metilaz. ie duomenys leido susieti histon metilinim su transkripcijos reguliacija.

Visos histon metiltransferazs, tiek mieli, tiek induoli turi homologija

pasiyminius katalitinius domenus. Be to, ios metilazs metilina ir gana daug kit

baltym, ne tik histonus. Baltym metilinimas yra svarbus j transporte (hnRNP i

branduolio citoplazm), signalo transdukcijoje. Histon metilinimas yra labai

svarbus transkripcijos reguliacijoje. Histon metilazs skirstomos pagal metilinam

substrat lizino ir arginino metilazes.

1.3.2.4.1. Lysino metiltransferazs

Histonuose H3 lizinas metilinamas K4, K9, K14, K27, K36, K79 padtyse,

H4 tik K20 padtyje.

43

Biochemikai pirmiausia buvo igrynintos ir charakterizuotos augal histon

metiltransferazs. J ar. sek palyginimas gen bankuose parod didel homologij su

Drosophila Su(var)3-9. Tokiu bdu buvo suinota Su(var)3-9 fermentinis aktyvumas.

Pirma surasta induoli histon metilaz buvo drozofil baltymo Su(var)3-9

induoli homologas SUV39 baltymas. SUV39 specifikai metilina H3-K9. ios

metilazs katalitinis domenas yra labai konservatyviame SET domene (Su(var)3-9,

Enhancer of zeste, Tritorax). SET domenas pirmiausia buvo identifikuotas drozofil

Su(var)3-9 baltyme. Pagrindin SET domen turini baltym funkcija susijusi su

gen aktyvumo moduliacija, taiau j veikimo mechanizmas ilgai buvo neaikus. SET

domenas yra btinas metilaziniam aktyvumui. Be SET domeno, lizino metilazi

enzimatiniam aktyvumui danai yra reikalingos ir domen supanios sritys, cisteinu

turtingos sekos, pavadintos prie-SET ir po-SET (pre-SET, post-SET) domenais. ios

sekos moduliuoja fermento specifikum ir aktyvum.

mogaus genomo kompiuterin paieka leido identifikuoti 73 baltymus,

turinius SET domenus, atitinkamai 41 - Drosophila, 37 - Caenorhabditis elegans,

11 - Schizosaccharomyces pombe, 6 - Saccharomyces cerevisiae. io tipo metilazs

suskirstytos 4 dideles histon lizino (K) metilazi eimas:

SUV39 eima (SUV39H1, SUV39H2, GLP1, G9A, ESET, CLLL8...)

SET1 eima (MLL2, MLL, scSet1, hSet1.B, hSET1.A, ALR...)

SET2 eima (NSD2, NSD3, NSD1, ASH1, scSet2, HIF1...)

RIZ eima (BLIMP1, PFM1, RIZ...).

SET domenas yra evoliucikai konservatyvi seka, rasta daugelyje baltym,

susijusi su gen aktyvumu, pirmiausia drosofil mozaikinio padties efekto

supresoriuje SU(VAR)3-9 (position effect variegation- PEV), polycomb-grups

baltymuose (enhancer of zeste), tritorax-grups baltymuose ir kt. iuo metu inoma

per 200 baltym, virusuose, bakterijose ir visuose eukarijotuose, turini SET

domen, atliekani vairias funkcijas, taiau pagrindin i baltym funkcija yra

gen aktyvumo moduliavimas, kuris realizuojamas per histon metilinim. Be SET

domeno, daugumoje i baltym randami Cys turtingi prie-SET ir po-SET domenai,

supantys SET domen.

Detals SET domenus turini baltym tyrimai parod, kad SET domenas yra

pakankamas histon metiltransferazi (HMT) aktyvumui. Aplinkiniai domenai

aktyvum moduliuoja. Chromodomenas.

44

Chromodomenai yra konservatyvus baltymo domenas, susidedantis i madaug 50 ar, randamas

chromatino baltymuose. Pirmiausia buvo rastas drozofil Polycomb (PC) geno koduojamame baltyme.

PC baltymas N- gale turjo 37 ar peptid, pasiymint 65% homologija kito drozofil

heterochromatino baltymo HP1 (Su (var)2-5) N-galui. Polycomb baltymas buvo inomas homeotini

gen slopintojas. HP1 buvo inomas heterochromatino baltymas. Bendras motyvas pavadintas

chromodomenu nuo chromatin organization modifier.

HP1 baltymas turi dar vien domen, pasiymint nedidele, taiau pastebima homologija, artim

chromodomenui chromoshadow domain. is domenas taip pat btinas HP1 funkcijai, be jo HP1

nesiria su heterochromatinu. Peli HP1 (MOD1 mouse modifier protein 1) analiz parod, kad j

chromodomene yra hidrofobin kien, kuri tarnauja Met-K suriimui, o taip pat yra nedidelis histone

fold histonams bdingas domenas, reikalingas DNR suriimui. Taigi HP1 gali susiriti ir su DNR.

Neseniai pademonstruota, kad HP1 turi ir RNR suriimo domen.

Drozofil Su(var)3-9 ir Su(var)2-5 genai ir baltymai buvo dentifikuoti iekant

PEV (position effect variegation) reikinio supresori. Su(var)3-9 baltymas, be SET

domeno, turi ir kit evoliucikai konservatyv domen chromodomen, randam

baltymuose, susijusiuose su chromatinu, pagrindinai su heterochromatinu. Su(var)3-9

randamas susijs su heterochromatino baltymu HP1, taip pat turiniu chromodomen.

Drosophila HP1 yra koduojamas kito SU(VAR) geno - SU(VAR)2-5).

Homologik su Su(var)3-9 gen ir atitinkam baltym paieka kituose

organizmuose leido greitai izoliuoti SUV39H1 ir SUV39H2 histon metilazes

induoli lstelse ir j analog Clr4 mielse S. pombe. SUV39H1 fermentas

randamas sveikoje su induoli HP1, o Clr4 su mieli S. pombe HP1 analogu Swi6

baltymu. ie rezultatai parod, kad SUV39H1/HP1 ir Clr4/Swi6 funkcijos susij su

heterochromatino formavimu ir gen veiklos slopinimu yra labai konservatyvios

visose evoliucijos pakopose. Kaip minta, induoliuose be SUV39H1, buvo rastas

jam homologikas SUV39H2 genas. io geno koduojama metilaz aktyvi induoli

sklidse, specifikai kaupiama lytinse chromosomose (XY kneliai), kuri genai

nutildomi pirmos mejozs profazje. Manoma, kad ios metilazs funkcija yra

mejotinio heterochromatino organizacija ir imprintingas patin gemal linijose.

Visos ios metilazs pasiymi dideliu specifikumu ir metilina H3-K9.

Iifravus daugelio organizm genomus (po 2002 m), duomen bazse buvo

rasta dar daugiau homologik baltym, turini SET ir j supanius domenus. I j

mogaus CLLD8 genas yra vienas i kandidat atsaking u leukemijos suklim

(chromosoma 13q14). io geno koduojamas baltymas turi ir MBD domen

(methylated DNA binding domain). Panas du domenai rasti ir kitame mogaus

45

baltyme SETDB1 ir jam homologikame peli ESET baltyme. ie baltymai taip pat

metilina H3-K9. Neseniai parodyta, kad ESET baltymas sveikauja su transkripcijos

faktoriumi ERG. Tokiu bdu randamas tiesioginis ryys tarp histon metilinimo ir

transkripcijos reguliacijos.

Pastaruoju metu rasta keletas nauj HMT HeLa lstelse, viena j specifikai

metilina H4-K20. Arabidopsis genomo analiz leido identifikuoti net 29 genus, kuri

funkcija susijusi su histon metilinimu.

SUV39 lizino histon metilazi eima (H3-K9)

SUV39 genas (SU(VAR)3-9) pirmiausia buvo identifikuotas drozofilose

iekant mozaikinio pozicijos efekto supresori (1994 m, supressor of position effect

variegation). ie genai buvo inomi kaip priklausantys polycomb (PcG) gen grupei,

kuriems yra bdingos represins funkcijos. induoliuose rasti io geno homologai

SUV39 H1 ir H2 taip pat susijs su represija ir randami heterochromatino lokusuose.

ios eimos visi baltymai be SET domeno turi ir prie-, po-SET domenus. Manoma,

kad ios supanios sekos ir apsprendia fermento specifikum jis metilina tik H3-

K9. i mint paremia tai, kad ir kiti ios eimos nariai, be SUV39H1, dar ir

SUV39H2, G9A ir ESET pasiymi tuo paiu specifikumu metilina H3-K9.

SUV39H1 ir H2 baltymai, be SET domeno, dar turi ir chromodomen, nerandam

kitose histon metilazse. io domeno funkcija SUV39 baltymuose nra aiki, nes is

baltymas nesiria su metilintu H3- K9, kaip kad daro HP1 baltymo chromodomenas.

Spjama, kad iuo domenu SUV39 baltymai sveikauja su kitais metilintais histon ar

kit baltym lizinais.

SUV39H1 ir H2 randamas konstitutyviniame heterochromatine. i gen

mutacijos sukelia didelius chromosom nestabilimus, segregacij, padidint gen bei

transpozon ir retroelement aktyvum. G9A randama euchromatine, mutacijos

pasireikia embrijogenezje, yra letalios. Neseniai (2003) paaikjo, kad ios

metilazs pasiymi skirtingu specifikumu, tai yra substratu naudoja skirtingo

metilinimo laipsnio H3-K9. G9A metilina mono- ir di- metil K9. ESET dimetilina

mono-metil K9, SUV39H1 ir H2 trimetilina.

induoliuose randama HP1 baltym , ir eima. Heterochromatino

baltymas HP1 suria trimetil K9-H3. Spjama, kad HP1 ir HP1 suria mono- ar

di-metil K9-H3.

46

G9A ir GLP1 baltymai turi ankirino (angl. ankyrin) pasikartojimus, bdingus

kitoms signalinms molekulms. Tai apie 33 ar. ilgio motyvas, tendemikai

pasikartojantis 2-7 kartus. Ankirino baltymas turi net 24 tokius pasikartojimus. ie

pasikartojimai tarnauja baltym tarpusavio sveikai, formuoja sveikos pavirius. In

vitro G9A, be H3-K9, metilina ir K27, taiau in vivo ie rezultatai nepasitvirtina.

SUV39H1 ir G9A lokalizuoti skirtingose branduolio vietose. ESET ir CLLL8

baltymai turi MBD domen (methylated DNA binding domain) ir gali susiriti su

metilinta promotori DNR.

SET1 eima

Mieli ySET1 metilaz metilina H3-K4. Rasti du homologiki baltymai

moni lstelse hSET1A ir hSET1B. Kiti daugialsi ios grups baltymai

priklauso polycomb- (EZH1, EZH2) ir tritorax- (TRX, MLL, MLL2, ALR) baltym

eimoms, kuri funkcija susijusi su vystymesi dalyvaujani gen epigenetine

reguliacija. Visuose iuose baltymuose SET domenas yra baltymo C-gale.

EZH baltymai yra labai svarbs diferenciacijoje, nors veikimo mechanizmo

detals dar nra aikios. i baltym ryis su chromatino reguliacija kol kas paremtas

faktu, kad EZH2 eina HDAC kompleks ir susiria su baltymais, homologikais

Snf2 ATPaze (SWI/SNF komplekso ATPaz). EZH2 metilina H3-K27. Paskutini

met rezultatai rodo, kad metilint H3-K27 atpasta PcG represorini kompleks

komponentai chromodomen pagalba. MLL (angl. mixed lianeage leukeamia)

baltymai itirti neblogai dl j ryio su leukemija. Translokacijos, apimanios MLL ir

kit baltym gen lokusus susij su leukemija. Iki 2005 m. buvo aprayta apie 50

skirting MLL translokacij. Geriausiai inomos translokacijos yra MLL susiliejimas

su CBP acetilazs genu bei AF10 genu, homologiku HP1 (heterochromatin protein

1).

MLL, be SET domeno, homologiko mieli SET1, savo sudtyje turi

bromodomen struktr reikaling acetilinto lizino suriimui, be to dar ir MDB

domen, tarnaujant metilintos DNR atpainimui. Matomai ie baltymai, be histon

metilinimo funkcijos turi ir kit labai svarbi funkcj. MLL baltymai metilina H3-K4,

kaip ir mieli SET1.

SET2 eima

47

i eima turi SET domen, homologik mieli ySET2 baltymo SET domenui.

Pademonstruota, kad ySET2 metilina H3 histon. Kai kurie ios eimos atstovai

(NSD1) anksiau buvo identifikuoti kaip baltymai, sveikaujantys su branduolio

receptoriais (transkripcijos faktoriais), savo sudtyje turintys ir aktyvacijos ir

represijos domenus. NSD2 (TRX1) genas yra lokuse, kurio pokyiai susij su Wolf-

Hirchhorn sindromu. is lokusas yra translokuotas daugybini mielanom atveju.

NSD3 randamas amplifikuotas krties vio audini lstelse. NSD1 metilina H4-

K20.

RIZ eima

eimos pavadinimas kils i geriausiai charakterizuoto ios metilazi grups

baltymo RIZ (retinoblastoma interacting zinc finger). i eima yra labai homogenika

struktros poiriu. N-gale jie turi SET domen, taip pat prie- ir po- SET domenus, o

C gale visuose ios eimos atstovuose randama daug cinko pirt motyv. RIZ1

metilina H3-K9. Paskutiniai duomenys rodo, kad RIZ baltymas dalyvauja

diferenciacijoje, susijs su vio vystymusi. RIZ baltymas saveikauja su estrogen

receptoriais ir represuoja promotorius, turinius transkripcijos faktoriaus SP1

suriimo sek. ioms funkcijoms reikalingas nepaeistas SET domenas. Transgenins

pels su nokautuotu RIZ1 genu sta nuo dideli difuzini limfom ir kitoki vio

form. Kitas ios eimos atstovas BLIMP1 (B-cell induced maturation protein 1) yra

transkripcijos represorius, slopinantis c-myc, INF-, ir kitus genus. Treias eimos

narys PFM1 taip pat dalyvauja diferenciacijoje. io geno delecijos randamos vinse

lstelse.

Matome, kad visi SET domenus turintys baltymai yra labai svarbs

diferenciacijoje, gen aktyvacijoje. Ne vis SET domen turini baltym fermentinis

aktyvumas jau nustatytas, taiau homologija leidia galvoti, kad tai potencialios

baltym, tame tarpe histon, metilazs.

1.3.2.4.2. Lizino demetilazs

2004 m. buvo rasta pirmoji lizino demetilaz LSD1 (lysine specific

demetylase), fermentas, priklausantis poliamin oksidazi eimai. Buvo

pademonstruotas specifinis H3-K4 demetilinimas. is demetilinimas susijs su

chromatino represija. Pademonstruota, kad LSD1 geno ijungimas siRNR pagalba

enkliai padidina daugelio gen raik. LSD1 substratas yra mono- ir di-metilintas

48

H3-K4 (H3-K4-me2) ir H3-K9 (H3K9me2). Trimetilinto lisino fermentas

nemodifikuoja. Matomai, tri-metilo grupes paalina kitas, tuo metu dar nerastas

fermentas. Fermentas danai veikia komplekse su kitais baltymais. Matyt, papildomi

baltymai reguliuoja fermento specifikum. LSD1 demetilina oksiduojant dalyvaujant

FAD.

2006 m. pasirod inios apie kitas metilazes. Buvo izoliuotas JHDM1

fermentas ( Jumonji C domain = JmjC; Jmjc domain-containing histone demetylase),

specifikai demetilinantis H3-K36 lizin. Paaikjo, kad tai didel JmjC domen

turinti baltym eima. Jmjc domenas yra labai konservatyvus, analogiki baltymai,

turintys JmjC domen randami ir mielse ir induoliuose.

Pav. Lizino ir arginino demetilinimo cheminis mechanizmas.

JmjC demetilazi demetilinimo reakcija skiriasi nuo LSD1. Jmjc ferment rekcijoje

dalyvauja kofaktoriai Fe2+ ir -ketoglutaratas. Demetilinimo rekcijos metu susidaro

sukcinatas ir formaldehidas.

49

Pav. vairi organizm JmjC domen turintys baltymai. mogaus ir pels

genomuose rasta 30 skirting JmjC domenus turini baltym..

Prieingai LSD1 demetilazms, kurios demetilina tik di- ir mono- metilintus

K, JmjC domen turinios demetilazs gali paalinti visose pozicijose sanias metilo

grupes. Yra parodyta, kad JmjC fermentai gali demetilinti H3-K36 (JHDM1

50

demetilaz), H3-K9 (JHDM2A mono ir dimetil-demetilaz) ir abu H3-K9 ir H3-K36

(JHDM3 ir JMJD2A-D demetilazs).

JHDM2A demetilaz asocijuojasi su androgen receptoriumi, kuris reikalingas

H3-K9 demetilinimui.JHDM3 ir JMJD2 yra HP1 antagonistai, neleidia HP1 susiriti

su metilintu H3-K9.

Histon lizino metilinim atlieka didel, SET domen turinti matiltransferazi

eima. Histon demetilazs surastos dar visai neseniai, j aktyvum moduliuoja

kofaktoriai. Ne visi kofaktoriai identifikuoti.

1.3.2.4.3. Arginino metiltransferazs

Arginino metilinimas vyksta taip pat , kaip ir lizino H3 ir H4 N-galuose: H3

- R2, R17, R26, o H4 R3. R gali bti metilintas mono- arba di- metilintas. Arginino

dimetilinimas gali bti simetrikas arba asimetrikas. inoma 5 arginino metilazs:

PRMT1

PRMT2

PRMT3

PRMT4/CARM1

PRMT5/JBP1

PRMT1,3,4 fermentai priskiriami I klasei, jie metilina arginin

asimetrikai, PRMT5 II klasei, metilina simetrikai, PRMT2 dar nenustatyta.

Be katalitinio domeno, ie fermentai turi tik kelet inom domen:

PRMT3 - RNR suriimo domen, PRMT2 SH3 domen, naudojam signalo

perdavime. iuo metu inoma, kad PRMT1 metilina H4R3 in vivo, o

PRMT4/CARM1 gali metilinti H3- R2, R17 ir R26 ir dar kelet neidentifikuot R in

vitro. PRMT5 in vitro geriau metilina H2A, H2B, taiau metilinimo pozicijos dar

neinomos.

Histon R-metilazi taka transkripcijos aktyvacijai m aikti,

nustaius, kad CARM1 (angl. coactyvator-associated arginine methyltransferase 1)

sveikauja (dviej hibrid sistemoje) su GRIP1 - p160 eimos branduolio hormon

receptori ko-aktyvatoriumi. CARM1 aktyvacijos funkcija siejama su H3-R

metilinimu. Neseniai, naudojant specifinius antiknus prie H3-R17met, ChIP

eksperimentuose buvo patvirtinta, kad H3-R17 yra metilintas tik branduolio hormon

receptoriais reguliuojamuose aktyviuose promotoriuose. Tuo galima paaikinti

chromatino metilazi geno-specifikum. Genui specifinis trannskripcijos faktorius

51

saveikauja su specifine metilaze ir j atveda promoto