UNIVERZA V MARIBORU

FAKULTETA ZA ZDRAVSTVENE VEDE

MOLEKULARNA DINAMIKA

KVADRUPLEKSA DNK 1KF1

(magistrsko delo)

Maribor, 2014 Saša Kos

UNIVERZA V MARIBORU

FAKULTETA ZA ZDRAVSTVENE VEDE

Mentor: red. prof. dr. Milan Brumen

ZAHVALA

Želel bi se zahvaliti red. prof. dr. Milanu Brumnu, ki me je spodbudil k študiju

bioinformatike, ter doc. dr. Franciju Merzelu iz Kemijskega inštituta Ljubljana, za

pomoč in konstruktivne nasvete pri pisanju magistrskega dela. Hvala tudi moji

družini, ki mi je pri študiju stala ob strani.

II

POVZETEK

Telomerni del DNK se nahaja na koncu kromosomov in je bistvenega pomena za

normalno delovanje celice. Kromosome varuje pred degradacijo in nezaželeno

rekombinacijo ter deluje kot neke vrste števec celične delitve. Pri vsaki delitvi celice

se telomerni del nekoliko skrajša, kar posledično vodi v celično smrt. Takšen

mehanizem preprečuje neomejeno delitev oz. nesmrtnost celic. Normalne celice se

delijo med štirideset- in šestdesetkrat (t. i. Hayflickova meja). Rakaste celice so

nesmrtne, se delijo neskončno krat, zato potrebujejo mehanizem za podaljševanje

telomerjev, kar pogosto dosežejo s pomočjo encima telomeraze.

Kvadrupleksi so terciarne strukture DNK in nastajajo v telomernem delu, ki je bogat

z gvanini. Zavirajo delovanje telomeraze in otežujejo proces podaljševanja

telomerov, ki je lahko impliciran pri rakastih obolenjih. Stabilizacija kvadrupleksov,

npr. s pomočjo ligandov predstavlja eno izmed možnih tarč pri onkološkem

zdravljenju. Namen tega magistrskega dela je preučitev vpliva prisotnosti ali

odsotnosti kalijevih kationov v centralnem kanalu kvadrupleksa z oznako 1KF1 na

stabilnost celotne strukture ter na stabilnost posameznih komponent kvadrupleksa.

Stabilnost smo kvantificirali s pomočjo vrednosti srednjega odklona od kristalne

strukture. Za pristop smo izbrali metodo simulacije molekularne dinamike s pomočjo

programa GROMACS, torej eksperimente in silico.

S simulacijo molekularne dinamike v dolžini 10 ns smo pokazali, da je struktura

1KF1 presenetljivo stabilna tudi brez kalijevih kationov. Podrobnejša analiza je

pokazala, da ima kalij najbolj izrazit stabilizacijski efekt na povezovalne zanke

kvadrupleksa, v manjši meri tudi na gvaninske tetrade, medtem ko brez kalijevih

kationov struktura bolj niha (izmerjeno kot RMSD), vendar je še vedno relativno

stabilna.

Rezultati magistrskega dela so primerna osnova za nadaljnje preučevanje stabilnosti

kvadrupleksov z molekularno dinamiko ter za iskanje drugih ligandov, ki

stabilizirajo strukturo.

III

ABSTRACT

Telomeric DNA can be found at the ends of chromosomes and are essential for

normal functioning of the cell. It protects chromosomes from degradation, unwanted

recombination and it serves as a kind of counter of cell division. At every cell

division, telomeres are slightly shortened, which finally leads to cell death. Such a

mechanism prevents unlimited cell division and immortality. Normal cells divide

between forty and sixty times (also known as the Hayflick limit). Cancerous cells are

immortal, divide infinitely, so they need mechanism for telomere elongation. This is

usually achieved by telomerase enzyme activity.

Quadruplexes are tertiary structures of DNA, that are formed at the telomere region,

rich in guanines. They inhibit telomerase activity and telomere elongation, that might

be implicated in cancer. Stabilization of quadruplexes by ligands might be one of the

targets for oncological treatments. The purpose of this master’s dissertation is to

describe effect of presence/non-presence of potassium ions in the central channel of

quadruplex 1KF1 on stability of structure as a whole and its various subunits.

Stability was quantified by measuring root mean square deviation from reference

crystal structure - RMSD. Experiments were performed in silico by means of

molecular dynamics, using application GROMACS.

By simulating molecular dynamics in length of 10 ns, we have shown that structure

of 1KF1 is remarkably stable, even in absence of potassium ions. Further analysis

revealed, that potassium has most pronounced stabilization effect on the connecting

loops of quadruplex and to a lesser degree on guanine tetrads. Without potassium

ions, structure is still quite stable, but oscillates more (measured in terms of RMSD).

Results of this master’s thesis can be used as a basis for further research on

quadruplex stability using molecular dynamics. It could also be used to search for

other ligands, that could stabilize structures.

IV

Kazalo

1 UVOD IN OPIS PROBLEMA ......................................................... 1

1.1 Zgodovina odkritja strukture DNK .............................................. 1

1.2 Osnovna struktura in konformacije molekule DNK .................... 3

1.2.1 Primarna struktura ................................................................. 3

1.2.2 Sekundarna in terciarna struktura ......................................... 4

1.3 G-kvadrupleksi in 1KF1 ............................................................... 7

1.3.1 Opis in biološki pomen ........................................................... 7

1.3.2 Struktura in topologija kvadrupleksov ................................. 10

1.3.3 Opis in struktura 1KF1 ........................................................ 12

2 NAMEN IN CILJI PREUČEVANJA KVADRUPLEKSA 1KF1

15

3 RAZISKOVALNA VPRAŠANJA: STABILNOST

STRUKTURE KVADRUPLEKSA 1KF1........................................... 18

4 METODOLOGIJA ......................................................................... 19

4.1 Molekularna dinamika in program GROMACS ........................ 19

4.2 Program VMD ............................................................................ 26

4.3 Metodologija in parametri simulacij .......................................... 26

4.4 Uporabljeni viri in programi ....................................................... 29

5 REZULTATI IN DISKUSIJA: INTERPRETACIJA ČASOVNO

ODVISNIH SPREMEMB KONFORMACIJ TER STABILNOSTI

STRUKTURE KVADRUPLEKSA DNK 1KF1 ................................. 30

V

6 SKLEP ............................................................................................. 40

7 CITIRANA LITERATURA .......................................................... 41

VI

SEZNAM TABEL

Tabela1 - Primerjava pomembnejših lastnosti različnih struktur DNK ( b.p. označuje

bazne pare ) .......................................................................................................... 5

Tabela 2 – Parametri za TIP3P, TIP4P in TIP5P ....................................................... 25

Tabela 3 – RMSD vrednosti za kvadrupleks 1KF1 ................................................... 38

VII

SEZNAM SLIK

Slika 1 - Rentgenska kristalografija DNK (Gosling, 1952) ......................................... 2

Slika 2 - Struktura nukleotida: baza, deoksiriboza in fosfatna skupina ....................... 3

Slika 3 - Vezava in struktura molekule DNK .............................................................. 4

Slika 4 - Primerjava strukture A-DNK, B-DNK in Z-DNK ........................................ 6

Slika 5 – Gvaninski četverček oz. G-tetrada ................................................................ 7

Slika 6 – Tri G-tetrade, naložene ena na drugo ............................................................ 8

Slika 7 – Vpliv oblikovanja kvadrupleksa v bližini promotorja na transkripcijo gena 9

Slika 8 – Kationi (rumeni) znotraj centralnega kanala kvadrupleksa .......................... 9

Slika 9 - Možne topologije: A – tetramolekularna, B – bimolekularna, C –

unimolekularna ................................................................................................... 10

Slika 10 – Različne topologije zank pri kvadrupleksih. ............................................. 11

Slika 11 – Shematski diagram 1KF1 (human) ........................................................... 13

Slika 12 – Kvadrupleks izoliran iz Oxytricha nova ................................................... 14

Slika 13 – Kvadrupleks 1KF1 (upodobitev, ang: biological assembly) .................... 15

Slika 14 – Referenčna struktura 1KF1. Prostorska upodobitev ................................. 16

Slika 15 - Vezane (zgoraj) in nevezane (spodaj) interakcije v polju sil..................... 20

Slika 16 – Poenostavljen algoritem simulacije molekularne dinamike ..................... 21

Slika 17 – Sistem s periodičnimi robnimi pogoji v dveh dimenzijah. Osnovna celica

je obarvana modro. ............................................................................................. 22

Slika 18 – Oblike periodične celice: kocka (rumena), prisekan oktahedron (moder, 77

% volumna kocke), rombični dodekahedron (zelen, 71 % volumna kocke) ..... 23

Slika 19 – Modeli vode glede na število mest/točk interakcij ................................... 24

Slika 20 – Upodobitev simuliranega sistema. Modro – molekule vode. Rdeče –

kvadrupleks 1KF1. ............................................................................................. 29

VIII

Slika 21 – Elektrostatska interakcija med atomi kisika O6 (rdeče) ter ioni kalija

(zeleno) pri 1KF1. .............................................................................................. 32

Slika 22 – Časovni prikaz vrednosti RMSD za 1KF1 s K+ ....................................... 36

Slika 23 – Časovni prikaz vrednosti RMSD za 1KF1 brez K+ ................................. 37

IX

SEZNAM GRAFIKONOV

Graf 1 – RMSD vrednosti za celoten kvadrupleks 1KF1 .......................................... 30

Graf 2 – RMSD vrednosti hrbtenice 1KF1 ................................................................ 31

Graf 3 – RMSD vrednosti za gvanine in G-tetrade. Slike 1, 2, 3 in 4 si sledijo od

zgoraj navzdol. ................................................................................................... 33

Graf 4 - RMSD vrednosti za adenin, timin ter adenin in timin, kot je prikazano v

zaporedju od zgoraj navzdol. ............................................................................. 35

X

UPORABLJENE KRATICE IN OKRAJŠAVE

KRATICA POMEN

ADE ali A ali DA adenin

GUA ali G ali DG gvanin

CYT ali C ali DC citozin

THY ali T ali DT timin

RMSD kvadratni koren povprečne vrednosti

kvadratov odklonov

MD molekularna dinamika

DNK dezoksiribonukleinska kislina

RNK ribonukleinska kislina

H2O voda

K+ kalijev ion

Na+ natrijev ion

XI

UPORABLJENI SIMBOLI

OZNAKA KOLIČINA ENOTA

E energija J

T temperatura K

F sila N

v hitrost m/s

d dolžina nm, m

t čas s, ns, ps

p tlak bar

1

1 UVOD IN OPIS PROBLEMA

1.1 Zgodovina odkritja strukture DNK

»Če sem videl dlje, sem zaradi tega, ker sem stal na ramenih velikanov.«

Isaac Newton v pismu Robertu Hooku. 15. februar 1676.

Večina ljudi meni, da sta DNK odkrila ameriški biolog James Watson in angleški

fizik Francis Crick v petdesetih letih dvajsetega stoletja, vendar ni tako. Odkritje

DNK in posledično same strukture je rezultat dela mnogih posameznikov in skupin.

DNK je prvi identificiral švicarski kemik in fiziolog Friedrich Miescher leta 1869.

Miescher je sprva nameraval izolirati in opisati proteinske komponente levkocitov

oz. belih krvničk. Lokalna kirurška klinika mu je poslala s krvjo in gnojem prepojene

ovoje, ki so ostali kot odpadni material. Miescher je ovoje izpral, filtriral, izločil

vsebino celičnih jeder in naletel na novo substanco (snov), ki je bila kemično

bistveno drugačna od proteinov. Imela je bistveno višjo vsebnost fosforja in bila

odporna na proteolizo oz. razgradnjo proteinov. Novo odkrito spojino je poimenoval

nuklein. Ker je slutil pomembnost odkritja, je zapisal: »... zdi se verjetno, da se bo

pojavila vrsta novih spojin z rahlo različno vsebnostjo fosforja kot skupina

nukleinov; ekvivalent proteinom ...« Kasneje se je izraz nuklein spremenil v

nukleinska kislina, še kasneje v dezoksiribonukleinska kislina ali DNK.

Miescherjevo delo je v začetku dvajsetega stoletja nadaljeval izjemno uspešen ruski

biokemik Phoebus Levene, ki je prvi identificiral tri glavne komponente

posameznega DNK nukleotida: fosfat-sladkor-baza, prvi odkril karbohidratne

komponente DNK – deoksiriboza ter RNK – riboza ter prvi identificiral način

povezovanja molekul DNK in RNK v dolge verige oz. polinukleotide. (Pray, 2008)

Dokazov, da je prav DNK nosilec genetskih informacij, ni bilo vse do leta 1940, ko

je Osvald T. Avrey prišel do prelomnega odkritja. Avrey je s sodelavci odkril, da

DNK, izolirana iz virulentnega seva bakterije Streptococcus pneumoniae, ki je

prenesena v nevirulentni sev enake bakterije, spremeni nevirulentni sev v

2

virulentnega. Sklepali so, da je prav DNK nosilec genetskih oz. dednih informacij in

ne proteini, kot se je ugibalo.

Erwin Chargaff je Levenovo delo dopolnil in razširil ter prišel do novih ugotovitev

glede strukture DNK. Primerjal je DNK med različnimi živalskimi vrstami in prišel

do dveh pomembnih ugotovitev. Prvič: DNK se med živalskimi vrstami razlikuje,

torej je zaporedje nukleotidov med vrstami različno. Drugič: DNK določene lastnosti

ohrani, ne glede na to, iz katere živalske vrste prihaja. Praviloma je količina adenina

(A) podobna količini timina (T) in količina gvanina (G) podobna količini citozina

(C). Drugače povedano, količina purinov (A in G) in količina piridinov (C in T) je

običajno skoraj enaka. Chargaff sicer ni odkril, da se adenin veže s timinom in

citozin z gvaninom, vendar je kljub temu bilo njegovo delo bistvenega pomena za

Watsona in Cricka, ki sta določila tridimenzionalno strukturo DNK. Chargaffova

odkritja (znana tudi kot Chargaffova pravila) so bila pozneje v številnih poskusih

mnogokrat potrjena. Rosalind Franklin in Maurice Wilkins sta z uporabo metode

rentgenske kristalografije pridobila prvo podobo strukture DNK (slika 1). S pomočjo

vsega akumuliranega znanja in na osnovi slike rentgenske kristalografije so Watson,

Crick in Wilkins leta 1953 izpeljali tridimenzionalno strukturo DNK, ki je v obliki

znamenite dvojne vijačnice, in leta 1962 za to odkritje prejeli Nobelovo nagrado.

(Nelson & Cox, 2013)

Slika 1 - Rentgenska kristalografija DNK (Gosling, 1952)

3

1.2 Osnovna struktura in konformacije molekule DNK

1.2.1 Primarna struktura

Zaporedje nukleotidov, ki so med seboj povezani s fosfodiestrsko vezjo, tvori

primarno strukturo molekule nukleinske kisline, iz katere je sestavljen DNK.

Nukleotidi so sestavljeni iz treh komponent [slika 2]:

1. dušikove baze, ki je lahko: adenin ali gvanin, ki spadata med purine, oz.

citozin ali timin, ki spadata med piridine;

2. deoksiriboze oz. sladkorja (riboza pri RNK);

3. ene ali več fosfatnih skupin, ki tvorijo hrbtenico DNK.

Nukleinska kislina nastane, ko se nukleotidi med seboj povežejo s fosfodiestrsko

vezjo med ogljikovim atomom 5' iz fosfatne skupine (hrbtenica) ter z ogljikovim

atomom 3' iz hidroksilne skupine (deoksiriboza) in tvorijo nukleotidna zaporedja oz.

polimer [slika 3].

Slika 2 - Struktura nukleotida: baza, deoksiriboza in fosfatna skupina (Pray, 2008)

4

Slika 3 - Vezava in struktura molekule DNK (Pray, 2008)

Zaporedje nukleotidov oz. nukleinskih kislin je označeno s prvo črko nukleotida (G,

A, C, T pri DNK oz. G, A, C, U pri RNK). Sekvenca se označi od konca 5' proti 3'.

(Nucleic acid structure, 2014)

1.2.2 Sekundarna in terciarna struktura

Sekundarno strukturo določa interakcija med bazami oz. kateri deli in katere verige

DNK (ang. DNA strand) se vežejo med seboj. Pri dvojni vijačnici DNK sta verigi

vezani s pomočjo vodikovih vezi med nukleotidi na eni verigi baznih parov [na sliki

3, črtkano, rdeče barve]. Purinske baze se vedno vežejo s piridinskimi (gvanin s

citozinom in adenin s timinom) in obratno. Vezava med G-C se tvori kot trojna

vodikova vez, med A-T pa dvojna. Posledično je vez G-C nekoliko močnejša in ima

višjo talilno temperaturo. Pri sekundarni strukturi nukleinskih kislin je znanih več

motivov, kot so dvojna vijačnica pri DNK ter steblo-zanka, psevdovozli pri RNK in

druge.

5

Pri terciarni strukturi se upošteva lokacija atomov v prostoru ter se dodatno

upoštevajo geometrične ter sterične omejitve. Terciarne strukture se razlikujejo

predvsem v:

1. sučnosti (levo- ali desnosučna),

2. dolžini enega zavoja vijačnice,

3. številu baznih parov na zasuk,

4. razliki med velikostjo velike in majhne vdolbine (ang. groove).

Znane so tri pomembnejše terciarne strukture DNK: A-DNK, B-DNK ter Z-DNK.

Tabela1 - Primerjava pomembnejših lastnosti različnih struktur DNK ( b.p. označuje bazne

pare )

A-DNK B-DNK Z-DNK

Sučnost desna desna leva

Premer ~2,6 nm ~2 nm ~1,8 nm

Št. b. p. na zasuk 11 10,5 12

Dvig vijačnice na b. p. 0,26 nm 0,34 nm 0,37 nm

Naklon baze glede na os

vijačnice

20° 6° 7°

(Nelson & Cox, 2013)

6

Slika 4 - Primerjava strukture A-DNK, B-DNK in Z-DNK (Pray, 2008)

Najbolj pogosta in običajna struktura (oblika) DNK je B-DNK. To obliko sta prva

opisala Watson in Crick. A-DNK je nekoliko krajša in bolj kompaktna kot B-DNK,

kar ima za posledico rahlo povečano število baznih parov na zasuk (10 namesto 9,5

pri B-DNK), večji premer, globljo in ožjo veliko vdolbino (ang.: major groove) ter

plitvejšo in širšo majhno vdolbino. Pogosto se pojavlja v dehidriranih vzorcih DNK,

npr. v tistih, ki se uporabljajo pri rentgenski kristalografiji. Z-DNK je bistveno

drugačna od B-DNK, saj je levosučna in nekoliko manjšega premera. Določeni

pogoji so bolj ugodni za nastanek Z-DNK, npr. izmenjujoča zaporedja purinov-

piridinov, sploh sekvence poly(GC), visoka koncentracija soli in nekaterih kationov

ter fiziološka temperatura 37 °C in pH 7,3–7,4. V splošnem pa je oblikovanje Z-

DNK neugodno oz. težavno, saj struktura hitro razpade ali se preoblikuje. Z-DNK se

lahko celo poveže z B-DNK v t. i. B-Z-stik (ang. B-/Z-DNA junctionbox). Z-DNK je

težavna za preučevanje, saj ni stabilna, ampak se pojavi le ob določenih bioloških

aktivnostih in nato razpade. Z-DNK naj bi sodelovala pri regulaciji genske

transkripcije, podobno kot kvadrupleksi. (Z-DNA, 2014)

7

1.3 G-kvadrupleksi in 1KF1

1.3.1 Opis in biološki pomen

DNK lahko poleg znane oblike dvojne vijačnice zavzame tudi drugačne

konformacije, med drugimi tudi obliko G-kvadrupleksa. Vedenje, da se lahko DNK

zaporedja, ki so bogata z gvaninom, vežejo sama nase (ang: self-associate), ima

dolgo zgodovino; celo 50 let pred odkritjem znamenite dvojne vijačnice DNK.

Večinoma so bili geli elektroforez iz tovrstnih sekvenc bolj nadloga in niso imeli

večje znanstvene vrednosti. Molekularna podlaga je bila odkrita s pomočjo metode

nitne difrakcije (ang. fiber diffraction) (Gellert, Lipsett, & Davies, 1962) ter

biofizikalnih študij (Howard, Frazier, & Miles, 1977), kjer je bil uporabljen koncept

(Williamson, 1994), da se gvanin povezuje z drugimi gvanini s pomočjo

Hoogstenovih vezi in na ta način tvori gvaninski četverček, imenovan G-tetrada ali

G-kvartet [slika 5].

Slika 5 – Gvaninski četverček oz. G-tetrada (Burge, Parkinson, Hazel, Todd, & Neidle, 2006)

Študije so pokazale, da gvaninski polinukleotidi tvorijo štiri nitne spiralne strukture,

pri katerih se več G-tetrad naloži ena na drugo; analogno kot Watson-Crickovi bazni

pari pri dvojni DNK vijačnici. G-tetrada je torej osnovni strukturni motiv. Omenjene

strukture niso zbujale večjega zanimanja, dokler ni bilo ugotovljeno, da se lahko z

8

gvaninom bogate sekvence pojavijo tudi na koncih telomernega dela pri evkariontnih

kromosomih in da lahko tvorijo diskretne štirinitne strukture, imenovane

kvadrupleksi, tetrapleksi ali strukture G4. Osnovna strukturna lastnost kvadrupleksov

je, da vsebujejo vsaj dve G-tetradi, naloženi ena na drugo [slika 6].

Slika 6 – Tri G-tetrade, naložene ena na drugo (Huppert J. , 2014)

Tvorba kvadrupleksnih struktur na koncu telomerjev je možna, saj so terminalni

nukleotidi na koncu 3' telomernega DNK enonitni, čeprav so na njih pogosto vezani

proteini SSB (single-strand-bindingproteins), npr. hPOT1 pri Homo sapiensu, kjer je

previsni (ang. overhang) del dolg približno sto do dvesto nukleotidov. (Burge, in

drugi, 2006)

Kvadrupleksi se lahko pojavijo tudi na drugih mestih v genomu, ne samo v

telomernem delu. Leta 1999 je Simonsson s sodelavci dokazal, da proto-onkogen C-

MYC oblikuje kvadrupleks v delu, ki je izjemno občutljiv na delovanje nukleaze in

je posledično kritičen za delovanje samega gena (Simonsson, Pecinka, & Kubista,

1998). Po tem so bili odkriti še mnogi geni, ki imajo v promotorski regiji G-

kvadruplekse, npr. c-kit, blc-2, VEGF, H-ras, N-ras in mnogi drugi. Pri pregledu

celotnega človeškega genoma je bilo identificiranih 376.000 potencialnih

kvadrupleksnih sekvenc (PQS – Putative Quadruplex Sequences), vendar se verjetno

vse ne formirajo tudi in-vivo (Huppert & Balasubramanian, 2005). Podobne

raziskave so identificirale PQS pri prokariotih in drugih vrstah organizmov (Rawal,

in drugi, 2006). Humane telomerne ponavljalne sekvence so sestavljene iz mnogih

ponovitev zaporedja nukleinskih kislin d(GGTTAG).

Obstaja več modelov, kako naj bi kvadrupleksi vplivali na povečanje ali zmanjšanje

transkripcije določenega gena. Pri enem izmed modelov [slika 7] se G-kvadrupleks

9

oblikuje blizu promotorske regije, s tem onemogoča transkripcijo gena oz. ga

deaktivira (Bugaut & Balasubramanian, 2012). V drugem modelu kvadrupleks, ki

nastane v nekodirajočem delu DNK, s svojo obliko posredno odpre in zadrži

kodirajoči del DNK v odprti konformaciji in posledično poveča ekspresijo

omenjenega gena. Raziskave so pokazale, da je formiranje kvadrupleksov v

telomernem delu povezano z zmanjšano aktivnostjo encima telomeraze, ki je

odgovoren za vzdrževanje dolžine telomerov in impliciran pri 85 % vseh rakov. S

simulacijo se bo določala stabilnost kvadrupleksa, ki je tesno povezana z delovanjem

telomeraze in nadaljnjo delitvijo celice (Stratchan & Read, 2011). Posledično so

kvadrupleksi zanimiva tarča za nove vrste onkoloških zdravil ter bioinformatske

raziskave.

Slika 7 – Vpliv oblikovanja kvadrupleksa v bližini promotorja na transkripcijo gena (Huppert

J. , 2014)

Slika 8 – Kationi (rumeni) znotraj centralnega kanala kvadrupleksa (Burge in drugi, 2006)

10

1.3.2 Struktura in topologija kvadrupleksov

Kvadrupleksi ne nastanejo iz poljubne sekvence nukleotidov, ampak mora biti

sekvenca bogata z gvanini, da lahko nastanejo G-tetrade, ki so osnovni gradnik. G-

tetrade so naložene ena na drugo, povezujejo pa jih t. i. zanke (ang. loops), ki so

sestavljene iz enega ali več poljubnih nukleotidov, lahko tudi gvaninov. Zaradi

velikega števila možnih kombinacij nukleotidov so tudi kvadrupleksi lahko

topološko precej različni.

Eden izmed možnih načinov klasifikacije (razvrščanja) kvadrupleksov je število

DNK verig, iz katerih je sestavljen. Kvadrupleksi lahko nastanejo iz ene, dveh ali

štirih verig in so posledično poimenovani: unimolekularni, bimolekularni ali

tetramolekularni kvadrupleksi. Bimolekularni in tetramolekularni kvadrupleksi so

med seboj povezani s Hoogsenovimi vodikovimi vezmi, unimolekularni pa se vežejo

sami nase. Primeri nekaterih možnih topologij so prikazani na sliki 9. Puščica

ponazarja polarnost verige oz. smer od 5' proti 3'.

Slika 9 - Možne topologije: A – tetramolekularna, B – bimolekularna, C – unimolekularna

(Burge in drugi, 2006)

11

Če zanke povezujejo istoležeče sosednje gvanine, se imenujejo robne zanke (ang.

edge-wise ali lateral), če povezujejo gvanine na diagonalnih robovih različnih G-

tetrad, se imenujejo diagonalne zanke (ang. diagonal loops), če povezujejo sosednja

gvanina na robovih na zunanji strani, pa zunanja zanka ali tudi propelerska zanka

(externalloops, propeller-loops) (slika 10). Dodatno se lahko kvadrupleksi delijo še

na paralelne in antiparalelne. Paralelni kvadrupleksi imajo vse verige orientirane v

isto smer (npr. na sliki 9, primer B, zgoraj levo), antiparalelni pa vsaj eno verigo v

nasprotno smer od drugih.

Slika 10 – Različne topologije zank pri kvadrupleksih. (Parkinson, Lee, & Neidle, 2002)

Na stabilnost in oblikovanje kvadrupleksov bistveno vplivajo monovalentni kationi.

Ta vpliv je posledica izrazito negativnega elektrostatskega potenciala, ki ga ustvari

gvaninski kisikov atom O6, ki tvori centralni kanal G-tetrade, znotraj katere so

locirani kationi [slika 8]. Natančna pozicija kationov med tetradami je odvisna od

12

vrste kationov. Natrijevi (Na+) kationi so bili opaženi znotraj centralnega kanala v

zelo različnih konfiguracijah oz. geometrijah. Pri nekaterih Na+ leži v ravnini z G-

tetradami, pri drugih pa med dvema zaporednima tetradama. Kalijevi kationi (K+) so

vedno enako oddaljeni od ravnin, v katerih ležijo tetrade, torej ležijo med tetradami.

Kalijeve katione lahko pogosto zamenjajo natrijevi in obratno, pa tudi drugi, npr.

talij, litij, titan in podobni. Pri nekaterih kvadrupleksih, npr. evkariontih vrste

Oxytricha nova takšna zamenjava ne povzroči spremembe topologije, na drugi strani

pa je znanih precej primerov, kjer zamenjava iz Na+ v K+ povzroči velike spremembe

v konformaciji. (Burge in drugi., 2006).

Posledično je možno sklepati, da imajo kvadrupleksi pri konformacijah veliko

fleksibilnost oz. veliko lokalnih energijskih minimumov s podobnimi energijami.

Kvadruplekse lahko stabilizirajo tudi druge majhne molekule. Zahler je leta 1991

dokazal vpliv s kalijevimi kationi stabiliziranega kvadrupleksa na inhibicijo aktivnost

telomeraze (Zahler, Williamson, Cech, & Prescott, 1991), ki je implicirana pri

mnogih oblikah raka.

1.3.3 Opis in struktura 1KF1

1KF1 je kvadrupleks z nukleotidnim zaporedjem AGGG(TTAGGG)3 (št. 3 označuje

tri ponovitve sekvence, zapisane v oklepaju). 1KF1 je prvi opisal prof. Gary N.

Parkinson s sodelavci. Omenjeno sekvenco je možno najti tudi v humanem

telomernem delu DNK in drugih nižjih organizmih. Gre za t. i. intramolekularni

kvadrupleks, ki nastane z zvijanjem in povezovanjem štirih zaporednih sekvenc

AGGG. Nastali kvadrupleks je intramolekularen in shematsko prikazan na sliki 11.

1KF1 je sestavljen iz treh G-tetrad, naloženih ena na drugo, povezujejo pa jih

zunanje zanke TTA (nukleotidna zaporedja TTA), ki dajejo videz propelerja oz. t. i.

propelerske zanke. G-tetrade stabilizirajo K+ kationi, ki na sliki 11 niso prikazani.

13

Slika 11 – Shematski diagram 1KF1 (human) (Parkinson in drugi, 2002)

Kot navaja prof. Parkinson (Parkinson in drugi, 2002), ravno relativno preprosta

struktura in paralelna orientacija 1KF1 omogoča, da se 1KF1 »razširi« (t. i.

oligomerizacija) z dodajanjem novih tetrad; torej bi namesto treh G-tetrad nova

struktura imela npr. 10 tetrad, ki so naložene ena na drugo, in dodatne TTA zanke.

Takšna struktura bi imela obliko kvazi-cilindričnega super-heliksa, propelerske

(stranske) zanke pa bi bile primerne za interakcije s telomernimi proteini, kot je npr.

TRF1. Posledično bi se zavrlo podaljševanje telomeraze, še posebej če bi bila

struktura stabilizirana z ligandi.

Kot zanimivost: kvadrupleks z nukleotidnim zaporedjem AGGG(TTAGGG)3 (kot pri

1KF1) je bil najprej izoliran iz evkarionta Oxytricha nova in struktura določena s

pomočjo magnetne resonance. Kvadrupleks iz Oxytricha nova je sestavljen iz

izmenjujoče paralelne/antiparalelne (slika 12) orientacije, G-kvartete pa stabilizirajo

Na+ kationi (ne K+ kot pri 1KF1) in povezujejo zanke z nukleotidnim zaporedjem

TTA. Zanke, ki povezujejo G-kvartete, so stranske (lateralne) in diagonalne.

14

Slika 12 – Kvadrupleks izoliran iz Oxytricha nova (Parkinson in drugi, 2002)

Ko je bilo identično nukleotidno zaporedje identificirano v humanem telomernem

delu DNK (poimenovano 1KF1), je bilo pričakovati identično ali podobno strukturo

kot pri Oxytricha nova, vendar ni tako. 1KF1 ima vse štiri verige v paralelni

orientaciji ter zunanje/propelerske zanke. Ta bistvena razlika v strukturi naj bi bila

posledica spremembe kationov iz Na+ v K+, ki bistveno vplivajo na potek zvijanja

(ang. folding) kvadrupleksa. (Parkinson in drugi, 2002)

15

2 Namen in cilji preučevanja kvadrupleksa 1KF1

Cilj magistrskega dela je simulacija ter opis molekularne dinamike paralelnega

kvadrupleksa DNK iz humane telomerne DNK, ki nosi oznako 1KF1 (slika 13 in 14),

opazovanje časovnih sprememb konformacij ter preučevanje njenih stabilnosti pri

različnih fizikalnih pogojih. Prav tako se bo preučil vpliv kationov (vijolično na sliki

14) na stabilnost kvadrupleksa, kvalitativen opis opaženih sprememb ter morebitno

popačenje molekularne strukture. Če je 1KF1 pri fizioloških pogojih stabilna, potem

ne bi smelo priti do razpada molekularnega kompleksa oz. izgube sekundarne ali

terciarne strukture – t. i. denaturacije ali rekonfiguracije v novo, drugačno

konformacijo. Prav tako stabilna struktura 1KF1 ne bi smela bistveno odstopati od

osnovne oz. referenčne strukture (slika 6). Strukturo 1KF1 je pridobil prof. Parkinson

s pomočjo metode sipanja rentgenskih žarkov (ang.: X-Ray Diffraction) (Parkinson

in drugi, 2002) in je uporabljena kot referenčna v tej magistrski nalogi.

Slika 13 – Kvadrupleks 1KF1 (upodobitev, ang: biological assembly) (Parkinson & Neidle,

Structure and Packing of Human Telomeric DNA, 2014).

16

Slika 14 – Referenčna struktura 1KF1. Prostorska upodobitev

Pri preučevanju stabilnosti igra pomembno vlogo tudi sam čas opazovanja oz.

simulacije, saj se pri nekaterih molekularnih strukturah spremembe v konformaciji

zgodijo zelo hitro, npr. v nekaj pikosekundah, spet pri drugih je časovni red velikosti

spremembe nekaj milisekund ali celo sekund. V konkretnem primeru bo čas

simulacije omejen glede na procesorske zmogljivosti, ki bodo na voljo.

Kot izhaja iz zgornjega besedila, lahko ima tvorba kvadrupleksov bistven vpliv na

transkripcijo genov ali delovanje telomeraze, ki je implicirana pri 85 % rakastih

obolenj. Posledično je stabilnost kvadrupleksa zelo pomembna. Računalniške

simulacije oz. molekularna dinamika omogočajo preučevanje obnašanja in stabilnosti

bioloških molekul na nivoju atomov, kar je bistveno hitreje in lažje kot laboratorijski

17

poskusi. Pridobljene informacije o stabilnosti kvadrupleksa lahko služijo kot vodilo

pri nadaljnjem raziskovanju vezave kationov in drugih ligandov, ki stabilizirajo

kompleks 1KF1.

18

3 Raziskovalna vprašanja: stabilnost strukture kvadrupleksa

1KF1

S pomočjo opisanih metod molekularne dinamike bomo poskušali odgovoriti na

vprašanja, kako vpliva prisotnost ali odsotnost kalijevih kationov v centralnem

kanalu na stabilnost kvadrupleksa v odvisnosti od časa. Pri preučevanju stabilnosti

bomo ocenili stabilnost kvadrupleksa kot celote, fosfatne hrbtenice kvadrupleksa,

nato pa še stabilnost posameznih komponent, ki so: gvaninske tetrade, povezovalne

zanke, ter se po potrebi spustili do nivoja posameznega nukleotida. Stabilnost bomo

številsko kvantificirali z računanjem kvadratnega korena srednje vrednosti kvadrata

deviacije (ang.: root-mean-square-deviation oz. RMSD) atomov, ki se izračuna po

naslednji formuli:

𝑅𝑀𝑆𝐷 = √1

𝑁∑ 𝛿𝑖

2

𝑁

𝑖=1

(1)

Enačba 1 – kvadratni koren srednje vrednosti kvadrata deviacije - RMSD

kjer je N število parov atomov in δi je deviacija i-tega atoma.

Odstopanje oz. RMSD se običajno meri v enoti Ångström (Å), kar znaša 10-10 m, ali

nanometrih (nm), torej 10-9 m.

19

4 Metodologija

4.1 Molekularna dinamika in program GROMACS

Molekularna dinamika je bila zasnovana konec petdesetih let 20. stoletja na področju

teoretične fizike, danes pa se uporablja na mnogih področjih, med drugimi: fizikalna

kemija, preučevanje materialov, modeliranje biomolekul, preučevanje polimerov,

določanje in izboljševanje tridimenzionalnih struktur proteinov in makromolekul ipd.

(Alder & Wainwright, 1959). Molekularna dinamika (MD) je računalniška simulacija

fizičnega gibanja atomov in molekul ter interakcij med njimi. MD se pogosto

uporablja za ugotavljanje, ali se teoretični modeli oz. predvidevanja ujemajo z

eksperimentalnimi ugotovitvami, npr. kako poteka zvijanje proteinov, zakaj so ionski

kanali prehodni samo za nekatere ione, za druge pa ne, kako poteka vezava liganda

na protein.

V idealnem primeru bi s pomočjo kvantne mehanike oz. časovno odvisne

Schrödingerjeve enačbe lahko predvideli vse lastnosti molekul, vendar je tovrsten

pristop praktičen in natančen samo za nekaj deset atomov. Zato se raje uporabljajo

empirični modeli. Pri empiričnih modelih se gibanje delcev – atomov obravnava s

pomočjo klasične mehanike oz. Newtonovih enačb gibanja (enači 2 in 3), za

medatomske interakcije pa parametrizirani modeli atomov oz. funkcionalnih skupin

ter polja sil.

𝐹𝑖 = −𝜕𝑉

𝜕𝑟𝑖 (2)

𝑚𝑖

𝜕2𝑟𝑖

𝜕𝑡2= 𝐹𝑖 (3)

Enačbi 2 in 3: Newtonove enačbe gibanja

V enačbah (2) in (3) pomeni 𝑟𝑖 krajevno koordinato, V interakcijski potencial in 𝑚𝑖

maso delca. Na ta način je možno določiti t. i. trajektorije gibanja vseh atomov –

pot gibanja. Molekularni sistemi imajo zelo veliko število delcev, včasih tudi nekaj

milijonov. Posledično je analitično reševanje enačb praktično nemogoče, namesto

tega se uporabljajo numerične metode. Pri numeričnih metodah in numerični

20

integraciji prihaja do kumulativnih napak, kar pomeni, da se natančnost s

podaljševanjem časa simulacije neizbežno manjša. Tudi parametrizacije

funkcionalnih skupin ter sami parametri polja sil niso popolni, saj gre le za model –

približen opis sistema, ki ni popolnoma natančen. Kljub omenjenim omejitvam je

molekularna dinamika uporabno orodje za preučevanje bioloških molekul, tudi

kvadrupleksov.

Interakcije oz. sile med atomi in potencialno energijo določa molekularna mehanika

polja sil (ang. forcefield). Polje sil opisuje množica enačb, s katerimi je možno

izračunati potencialne energije vsakega posameznega delca/atoma v vsakem

časovnem koraku ter iz množice parametrov oz. konstant, ki so potrebne za

računanje omenjenih enačb. Polja sil so praviloma izpeljana iz eksperimentalnih

podatkov. Običajno parametri opišejo lastnosti atomov ali funkcionalnih skupin kot

so: atomska masa, van der Waalsov radij, delni naboj, lastnosti vezi, npr: dolžina,

število vezi, koti med njimi, ipd. Večina polj sil deli funkcije potencialov na: vezane

in nevezane (bonded and non-bonded interacitions). Vezane interakcije vključujejo:

raztezanje kovalentnih vezi, kot zvijanja vezi, torzijske potenciale, kote med

ravninami zaporednih atomov (ang: dihedral) ter kote izven ravnin (ang. improper).

Nevezane interakcije vključujejo: van der Waalsove interakcije (kot Lennard-

Jonesov potencial) ter Coulombove elektrostatske interakcije (slika 15).

Slika 15 - Vezane (zgoraj) in nevezane (spodaj) interakcije v polju sil

Vezi so običajno modelirane kot harmonski oscilatorji in ne dovoljujejo trganja ali

ustvarjanja novih kovalentnih vezi, lahko pa se ustvarjajo npr. vodikove vezi. Lahko

21

bi rekli, da skupno energijo sistema, ki ga obravnavamo s poljem sil, poenostavljeno

zapišemo kot (enačbe 4):

𝐸𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 = 𝐸𝑣𝑒𝑧𝑎𝑛𝑒 + 𝐸𝑛𝑒𝑣𝑒𝑧𝑎𝑛𝑒 + 𝐸∗ (4)

𝐸𝑣𝑒𝑧𝑎𝑛𝑒 = 𝐸𝑣𝑒𝑧𝑖 + 𝐸𝑘𝑜𝑡𝑎 + 𝐸𝑡𝑜𝑟𝑧𝑖𝑗𝑒 + 𝐸∗

𝐸𝑛𝑒𝑣𝑒𝑧𝑎𝑛𝑒 = 𝐸𝑣𝑎𝑛 𝑑𝑒𝑟 𝑊𝑎𝑎𝑙𝑠𝑜𝑣𝑒 + 𝐸𝑒𝑙𝑒𝑘𝑡𝑟𝑜𝑠𝑡𝑎𝑡𝑠𝑘𝑒 + 𝐸∗

𝐸∗ − 𝑝𝑟𝑖𝑠𝑝𝑒𝑣𝑘𝑖 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑎𝑘𝑐𝑖𝑗, 𝑘𝑖 𝑠𝑜 𝑏𝑖𝑙𝑖 𝑧𝑎𝑟𝑎𝑑𝑖 𝑝𝑜𝑒𝑛𝑜𝑠𝑡𝑎𝑣𝑖𝑡𝑣𝑒 𝑖𝑧𝑝𝑢šč𝑒𝑛𝑖

Enačba 4: Skupna energija sistema

Samo simulacijo molekularne dinamike lahko poenostavljeno opišemo kot algoritem

oz. zaporedje naslednjih korakov, kot je opisano na sliki 16.

Slika 16 – Poenostavljen algoritem simulacije molekularne dinamike

22

Računanje simulacije molekularne dinamike so procesorsko izjemno intenzivne in

lahko trajajo tudi nekaj tednov ali več. Čas računanja je odvisen predvsem od

velikosti sistema – števila atomov, dolžine simulacije, izbire parametrov simulacije

ter učinkovitosti uporabljenih algoritmov. Iz omenjenih razlogov je včasih potreben

kompromis med natančnostjo simulacije in praktičnostjo oz. časom računanja.

Rezultat računanja MD je običajno precej velika datoteka, v kateri so zapisane

trajektorije atomov, torej prostorski položaj vsakega atoma v vsakem časovnem

koraku ter drugi parametri, kot so npr. hitrost, energije. Nato sledi najbolj zahteven

del: interpretacija rezultatov. Pri interpretaciji so uporabna razna orodja in programi,

kot so VMD (Visual Molecular Dynamics), ki lahko izračunajo npr. razdaljo med

posameznimi atomi, odstopanje molekule od referenčne strukture – RMSD,

elektrostatske sile ipd. Tudi program GROMACS ima vgrajena orodja za nekatere

analize, ki smo jih prav tako uporabili.

Zaradi želje po čim bolj realističnih pogojih simulacij se sistemu, npr. biomolekuli,

doda še voda ali katero drugo topilo ter ioni. V takšnih primerih je primerna uporaba

t. i. periodičnih robnih pogojev (ang.: periodic boundary conditions – PCB), ki

posnemajo neskončno velik sistem. Definira se osnovna celica (ang.: unit cell),

virtualna kocka, znotraj katere se nahaja biomolekula, molekule vode in drugi atomi,

skratka celoten sistem, ki ga želimo simulirati. Osnovna celica se preslika na vse

stranice. Posledično se atom, ki prečka rob osnovne celice, pojavi na nasprotni strani

in sistem je na videz neskončno velik, kot je prikazano na sliki 17.

Slika 17 – Sistem s periodičnimi robnimi pogoji v dveh dimenzijah. Osnovna celica je obarvana

modro. (Côté, Smith, & Lindan, 2014)

23

Dimenzije osnovne celice morajo biti dovolj velike, da ne pride do interakcije med

molekulami in njihovimi periodičnimi kopijami, kar velja predvsem za nevezane

interakcije. Osnovna celica je lahko različnih oblik, odvisno od implementacije

programa za molekularno dinamiko. Pogosta je kocka/škatla, priljubljeni pa sta tudi

prirezani oktahedron ali rombični dodekahedron, ki imata le 77 % oz. 71 % volumna

kocke, kar zmanjša število molekul vode in posledično čas računanja simulacije

(slika 18). Program GROMACS podpira vse omenjene oblike, v tej nalogi pa smo

uporabili obliko kocke.

Slika 18 – Oblike periodične celice: kocka (rumena), prisekan oktahedron (moder, 77 %

volumna kocke), rombični dodekahedron (zelen, 71 % volumna kocke)

Pri Lennard-Jonsovih interakcijah, ki z razdaljo zelo hitro slabijo, se lahko definira

radij dosega interakcij oz. odseka (ang.: cut-off; rcut, slika 17), ki deluje dovolj dobro,

če je velikost periodične celice vsaj dvakrat daljša kot radij. Tako pri Coulombovih

interakcijah, ki imajo precej daljši doseg, lahko tako preprosti pristopi kot radij

delovanja povzročijo velike napake, zato je bolj primerna metoda Ewaldova sumacija

(ang.: particle mesh Ewald, PME), ki razdeli sumacije na interakcije kratkega in

dolgega dosega. Odrez (ang.: cut-off) pri PME določa le razmerje oz. ravnovesje

med kratkim in dolgim dosegom. Pri računanju energij se lahko pojavi t. i. lezenje

(ang.: dritf), kar privede do povečevanja energije sistema in posledično gretja.

Lezenje povzročajo računske napake, približki, zaokroževanja ter odrezi (ang.: cut-

off). Zato je modeliran sistem običajno vezan na termostat ali barostat, ki

temperaturo oz. tlak ves čas simulacije nadzoruje ter s pomočjo skaliranja hitrosti

atomov ali volumna vzdržuje na želeni vrednosti.

24

Pomemben del molekularne dinamike so topila, kar je pri bioloških sistemih običajno

voda. Na kakšen način so v sistemu topila predstavljena, je odvisno predvsem od

izbranega programa za molekularno dinamiko. Običajno podpirajo dve vrsti

predstavitev topil: implicitno in eksplicitno, tudi program GROMACS. Eksplicitna

topila nastopajo v sistemu kot katerekoli druge molekule, npr. voda kot množica

diskretnih molekul H2O, in tudi simulirajo se kot katerekoli druge molekule. Slabost

tovrstnega pristopa je relativno velika računska zahtevnost, saj je poleg molekul npr.

proteina potrebno računati še vse možne interakcije za vse molekule vode. Že v

relativno majhnem sistemu naraste število molekul vode na nekaj deset tisoč in več.

Implicitna predstavitev topila omenjene probleme rešuje na način, da je topilo

predstavljeno v obliki enačb kot kontinuiran medij s specifičnimi lastnostmi, npr.

dielektrično konstanto, elektrostatski naboj ipd., kar bistveno zmanjša računsko

zahtevnost in določene vrste napak. Kljub temu implicitna topila trenutno niso v tako

široki uporabi kot eksplicitna, saj zahtevajo dolgotrajno in zahtevno testiranje z

različnimi vrstami molekul. Iz omenjenih razlogov smo se odločili za uporabo

eksplicitnega modela predstavitve vode.

Program GROMACS podpira mnoge eksplicitne modele vode, med drugimi tudi:

SPC, SPC/E, TIP3P, TIP4P in druge. Razlikujejo se predvsem po naslednjih

lastnostih:

- število točk interakcij posamezne molekule vode z drugimi molekulami,

- ali so vezi med vodikom in kisikom prožne ali rigidne,

- ali model upošteva učinke delnih nabojev oz. polarizacije učinke molekul

vode.

Slika 19 – Modeli vode glede na število mest/točk interakcij

25

Preprost 3-mestni model vode, npr. TIP3P, opišejo naslednji parametri: dolžine vezi

(r), kot med atomi vodika in kisika (HOH), parametra A in B za računanje Lennard-

Jonesovih interakcij ter naboja za vodik in kisik (q), kot prikazuje tabela 2. TIP4P

ima dodan še lažen atom (označen z M na sliki 19), ki ima negativni naboj in izboljša

elektrostatsko distribucijo v okolici molekule. TIP4P je bil prvič opisan že leta 1984

in je v široki uporabi pri simulacijah proteinov in biomolekul, zato smo se tudi

odločili za uporabo le-tega. TIP5P ima še dva lažna atoma, ki predstavljata

osamljena para (ang. lone pair) elektronov pri kisiku, kar ima za posledico bolj

natančno simuliran moment dipola ter izboljšano tetrahedralno geometrijo molekule

H2O. Seveda se s povečevanjem kompleksnosti modela vode povečuje tudi računska

zahtevnost, ki je približno linearna glede na število medatomskih razdalj med

molekulami vode, ki jih je potrebno računati. Parametri za TP3P, TIP4P in TIP5P so

prikazani v tabeli 2.

Tabela 2 – Parametri za TIP3P, TIP4P in TIP5P (Wikipedia, The Free Encyclopedia, 2014)

. TIP3P TIP4P TIP5P

r(OH), Å 0,9572 0,9572 0,9572

HOH, deg 104,52 104,52 104,52

LOL, deg / / 109,47

A × 10−3, kcal Å12/mol 582,0 600,0 544,5

B, kcal Å6/mol 595,0 610,0 590,3

q(H) +0,417 +0,52 +0,241

q(O) −0,834 / /

q(M) / -1,04 /

q(L) / / −0,241

r(OM), Å / 0,15 /

r(OL), Å / / 0,70

Št. medatom. razdalj 9 10 17

Molekularna dinamika je z določenimi omejitvami primerna za preučevanje struktur

kvadrupleksov in daje uporabne rezultate. Leta 2001 je Špačková s sodelavci s

pomočjo molekularne dinamike preučila interakcije kationov z gvaninskimi kvarteti

26

in posledični vpliv na stabilnost (Špačková, Berger, & Šponer, 2001). Na stabilnost

kvadrupleksov ne vplivajo samo kationi, ampak tudi ligandi, ki so zanimivi tudi za

farmacevtsko industrijo. Read in Neidle sta v simulaciji dolgi 1000 ps preučila vpliv

liganda 1,4-bis-piperidino amidoantrakinona. Ugotovila sta natančno lokacijo vezave

liganda ter potrdila strukturo kvadrupleksa, ki je bila pridobljena s pomočjo metode

jedrske magnetne resonance (Read & Neidle, 2000).

4.2 Program VMD

Program VMD (Visual Molecular Dynamics) je nastal v skupini za teoretično in

matematično biofiziko na Univerzi v Illinoisu in je namenjen predvsem za

vizualizacijo molekul ter animacijo in analizo trajektorij. Glavne lastnosti programa

so:

- veliko število podprtih formatov datotek molekul, možnost pretvorbe med različnimi

formati;

- velik nabor načinov vizualizacije in barvanja molekul. Omogoča izdelavo

kakovostnih filmov/animacij gibanja atomov;

- učinkovito delo z zelo velikimi (več gigabajtov) trajektorijami in velikim številom

molekul. Omejitev predstavlja le količina prostega pomnilnika;

- obširen nabor ukazov za izbiro skupin atomov/molekul ter njihovo manipulacijo,

npr. premik, rotacija ter barvanje;

- omogoča programske razširitve v obliki skriptnih jezikov Tcl ali Python;

- vgrajene razširitve, npr. za analizo trajektorij, računanje RMSD, izris grafov,

povezave z zunanjimi strežniki BioCore;

- strojno pospeševanje računskih operacij z uporabo tehnologije nVidia CUDA;

- deluje na platformah: Linux, Windows, Mac OS X.

Za magistrsko delo smo program VMD uporabili predvsem za vizualizacijo

trajektorij ter izračun vrednosti RMSD.

4.3 Metodologija in parametri simulacij

Začetno strukturo kvadrupleksa 1KF1 smo pridobili s spletne strani »Protein data

bank« v obliki datoteke PDB (Parkinson & Neidle, Structure and Packing of Human

27

Telomeric DNA, 2014). 1KF1 je sestavljen iz 22-mernega nukleotidnega zaporedja:

AGGG TTAGGG TTAGGGTTAGGG.

1KF1 je prvi opisal in pridobil prof. Parkinson s pomočjo metode sipanja rentgenskih

žarkov (ang,: X-Ray Diffraction) (Parkinson, Lee, & Neidle, Crystal structure of

parallel quadruplexes from human telomeric DNA., 2002), ločljivost metode je

približno 0,21 nm. Nato smo s programi pdb2gmx ter genbox kvadrupleks 1KF1

položili v virtualno kocko, katere robovi so od kvadrupleksa oddaljeni približno 1,5

nm v smeri vseh treh koordinat x, y in z. Nato smo kocko napolnili z 11855

molekulami TIP4P vode. Ker ima DNK in posledično celoten sistem rahlo negativen

naboj, smo ga nevtralizirali z dodajanjem Na+ kationov. Da bi bil sistem čim bolj

podoben fiziološkemu, smo dodali še ione soli NaCl v koncentraciji 0,15 mol/L.

Celoten sistem vsebuje skupno 33 anionov Cl-, 51 kationov Na+. Za lažjo predstavo

je celoten sistem upodobljen na sliki 20. V centralnem kanalu 1KF1 so prisotni tudi

trije kalijevi kationi, ki strukturo stabilizirajo. Eksperimentalno smo poskus ponovili,

kjer smo NaCl zamenjali s KCl, rezultati pa so bili precej podobni (neobjavljeni

rezultati). Kot bo opisano kasneje, so bile izvedene simulacije tako z kot brez

kalijevih kationov. Nato sledi energetska minimizacija, pri kateri smo uporabili

algoritem največjega gradienta spusta (ang.: steepest descent). Minimizacija se je

končala, ko je največja sila na katerikoli atom znašala manj kot 100 kJ/(mol*nm).

Končna potencialna energija po skoraj 4000 ps minimizacije znaša približno -6*105

kJ/mol. Za obravnavo elektrostatskih interakcij je bil uporabljen algoritem PME –

Particle mesh Ewald.

Sledita dva koraka uravnoteženja (ang: equilibration), vsak v trajanju 800 ps, pri

čemer so vsi težki atomi kvadrupleksa fiksirani na svoje začetne položaje, drugi

atomi pa se lahko prosto gibajo. S tem se izognemo steričnim konfliktom ter

nepravilni geometriji kvadrupleksa ter dosežemo izenačitev temperature in tlaka

sistema na ciljne vrednosti, t. j. 310 K ter 1 bar. Pri prvem koraku uravnoteženja se

simuliran sistem ogreje na 310 K, uporabljen je modificiran Berendsenov (v-rescale)

termostat. Gre za t. i. NVT ansambel, kjer so število delcev, volumen in temperatura

konstantni. Pri drugem uravnoteženju se tlak stabilizira na 1 bar, pri čemer je

uporabljen Parrinello-Rahmanov barostat.

28

Sledi 5*106 korakov oz. 10 ns dejanske simulacije molekularne dinamike, pri čemer

gibanje atomov kvadrupleksa več ni omejeno. Kot pri uravnoteženju je uporabljen

NVT ansambel, torej temperaturo vzdržuje modificiran Berendsenov termostat, tlak

pa Parrinello-Rahmanov barostat. Identičen postopek minimizacije, uravnoteženja ter

simulacije je bil ponovljen s strukturo 1KF1, pri kateri smo odstranili kalijeve ione v

centralnem kanalu. Vsak zagon celotne simulacije je trajal okoli 55 ur.

Uporabili smo polje sil AMBER ParmBSC0 (v nadaljevanju BSC0), ki predstavlja

izboljšavo polja sil PARM99. Prednost BSC0 pred drugimi polji sil, npr. PARM99,

je predvsem v natančnejšem opisu strukturnih in dinamičnih lastnosti kanonskih in

nekanonskih oblik DNK, med slednje spadajo tudi kvadrupleksi (Alberto Perez,

2007). Opravili smo tudi simulacijo 1KF1 s poljem sil CHARMM 27, vendar smo pri

analizi rezultatov, predvsem stabilnosti strukture oz. RMSD ter pregledu literature

ugotovili, da CHARMM 27 ni primerno polje sil za preučevanje kvadrupleksov.

Program GROMACS verzija 4.6.5 smo v izvršljivo obliko prevedli neposredno iz

izvorne kode, s čimer smo dosegli optimizacijo programa na uporabljeno

procesorsko arhitekturo, predvsem z uporabo strojnih razširitev procesorjev Xeon

AVX256, ki omogočajo izvajanje več matematičnih operacij v enem urnem ciklu.

Vsak zagon izračuna celotne simulacije je trajal okoli 55 ur, generirani podatki, torej

trajektorije, pa so bile velike približno 20 GB.

Na sliki 20 je za lažjo predstavo upodobljen sistem, ki smo ga modelirali v programu

GROMACS.

29

Slika 20 – Upodobitev simuliranega sistema. Modro – molekule vode. Rdeče – kvadrupleks

1KF1.

4.4 Uporabljeni viri in programi

Kot je že bilo omenjeno, smo v magistrskem delu uporabili programe in vire:

- GROMACS: za molekularno dinamiko. Program so izdelali na oddelku za

biofizikalno kemijo univerze v Groningenu.

- program VMD za vizualizacijo rezultatov ter polje sil. Program je nastal na

oddelku za teoretično in matematično biofiziko Univerza v Illinoisu, ZDA.

- polje sil Amber ParmBSC0, ki so ga razvili na oddelku za bioinformatiko in

molekularno modeliranje univerze v Barceloni;

- spletno stran »RCSB Protein Data Bank«, www.rcsb.org, za pridobitev

kristalne strukture 1KF1.

30

5 Rezultati in diskusija: interpretacija časovno odvisnih

sprememb konformacij ter stabilnosti strukture kvadrupleksa

DNK 1KF1

Analize stabilnosti sistemov z in brez centralnih kationov smo se lotili po naslednjem

postopku: najprej poskušamo oceniti stabilnost kvadrupleksa kot celote, nato pa

bomo preučili stabilnost posameznih komponent kvadrupleksa, torej gvaninskih

tetrad, povezovalnih – propelerskih zank ter po potrebi posameznih nukleotidov.

Na videz se vrednosti RMSD za celoten sistem (tabela 3) bistveno ne razlikujejo, kar

je razvidno iz grafa 1. Pri sistemu s K+ kationi je povprečna vrednost RMSD celo

nekoliko višja (2,949 vs. 2,826), vendar so vrednosti standardnega odklona ter

maksimalne vrednosti višje pri sistemu brez kationov K+, kar nakazuje možnost, da

je sistem brez kationov K+ v resnici nekoliko manj stabilen, kar tudi pričakujemo.

Podatki za srednjo vrednost, standardni odklon ter povprečno vrednost RMSD

posameznih kompoment kvadrupleksa so v tabeli 3. Iz omenjenega podatka ni

možno razbrati ali oceniti natančno, kateri deli kvadrupleksa so bolj in kateri manj

stabilni, ampak nakazuje le grobo sliko, zato smo se lotili preučevanja RMSD

vrednosti posameznih komponent kvadrupleksa.

Graf 1 – RMSD vrednosti za celoten kvadrupleks 1KF1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000

RM

SD -

nm

Čas -ps

KVADRUPLEKS

brez K+ K+

31

Pri preučevanju konformacij ter stabilnosti DNK je običajno, da se preučujejo

RMSD vrednosti fosfatne hrbtenice, ki tvori ogrodje molekule DNK, saj le-ta določa

osnovno obliko molekule. Dodatno na ta način filtriramo oz. odstranimo vpliv

nukleotidov ter ostankov (ang. residues), ki so na začetku ali koncu verige DNK in

so posledično podvrženi večjemu termičnemu nihanju. Povprečne RMSD vrednosti

so praktično identične, 2,414 s kationi K+ ter 2,485 brez kationov K+, vendar je večja

razlika pri standardnem odklonu, ki znaša 0,244 ob prisotnosti K+ ter 0,305 brez K+.

Iz tega lahko sklepamo, da je osnovna struktura kvadrupleksa oz. fosfatna hrbtenica

pri obeh sistemih relativno stabilna, vendar pri sistemu brez kationov K+ nekoliko

bolj niha, kar je razvidno tudi iz tabele 3. Kljub opaženim razlikam ocenjujemo, da

med sistemoma ni bistvenih razlik, kar je razvidno tudi iz grafa 2.

Graf 2 – RMSD vrednosti hrbtenice 1KF1

Osnovni gradnik vsakega kvadrupleksa so gvaninske tetrade, zato smo preučili tudi

stabilnost le-teh. 1KF1 je sestavljen iz treh gvaninskih tetrad, ki so naložene ena na

drugo (slika 6). Tetrade oštevilčimo od 1 do 3, kjer je tetrada št. 1 na dnu (slika 11),

št. 2 na sredini in št. 3 na vrhu kvadrupleksa. Kot je razvidno iz grafa 3, slike 1 ter

RMSD vrednosti, med sistemoma ni bistvenih razlik. Obe tetradi sta zelo stabilni,

imata zelo podobne povprečne vrednosti RMSD ter standardnega odklona. Pri

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000

RM

SD -

nm

Čas -ps

FOSFATNA HRBTENICA

brez K+ K+

32

tetradah št. 2 in 3 je opazno odstopanje. Sistem s kationi K+ je bolj stabilen in manj

niha od sistema brez kationov K+. Večjo stabilnost sistema s K+ lahko pripišemo

elektrostatskim interakcijam med K+ ter atomi O6 v gvaninski tetradi. Kisik je

elektronegativen, kalij pa elektropozitiven, zato med njima deluje elektrostatska

privlačna sila, ki dodatno stabilizira gvaninsko tetrado. Na sliki 21 so prikazani

kisikovi atomi O6 ter kalijevi kationi v vertikalni projekciji 1KF1, na sliki 5 pa je

shematsko prikazana posamezna tetrada. Kljub odsotnosti efekta stabilizacije

kationov, sistem brez K+ v simuliranem času 10 ns ne kaže tendence k nestabilnosti

strukture, ali celo k popolnemu razpadu konformacije (kar bi bilo možno videti iz

naraščajoče vrednosti RMSD), le nekoliko bolj niha.

Slika 21 – Elektrostatska interakcija med atomi kisika O6 (rdeče) ter ioni kalija (zeleno) pri

1KF1.

33

Graf 3 – RMSD vrednosti za gvanine in G-tetrade. Slike 1, 2, 3 in 4 si sledijo od zgoraj navzdol.

0

0,1

0,2

0,3

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000

RM

SD -

nm

Čas -ps

GUA

brez K+ K+

0

0,1

0,2

0,3

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000

RM

SD -

nm

Čas -ps

G-TETRADA 1

brez K+ K+

0

0,2

0,4

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000RM

SD -

nm

Čas -ps

G-TETRADA 2

brez K+ K+

0

0,2

0,4

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000

RM

SD -

nm

Čas -ps

G-TETRADA 3

brez K+ K+

34

Pomemben del kvadrupleksa 1KF1 so tudi povezovalne zanke, ki tvorijo značilno

propelersko strukturo. Povezovalne zanke so sestavljene iz nukleotidov adenina in

timina, zato smo opazovali RMSD vrednosti obeh. Kot je razvidno iz grafa 4, slike 3

se pri sistemu s K+ RMSD relativno hitro stabilizira okoli vrednosti pribl. 4,25 Å, pri

sistemu brez K+ pa RMSD narašča ter se šele proti koncu simulacije nekoliko

zmanjša. Iz omenjenega lahko sklepamo, da so povezovalne zanke v sistemu s K+

relativno hitro stabilne. Pri sistemu brez K+ je interpretacija rezultatov bistveno težja.

Obstaja možnost, da zanke samo potrebujejo več časa, da se stabilizirajo, v

primerjavi z zankami v sistemu s K+. Takšna razlaga bi pojasnila naraščanje RMSD,

kateremu sledi rahel padec. Za potrditev omenjene hipoteze bi bilo potrebno čas

simulacije bistveno podaljšati. Nato bi iz grafa RMSD lahko ocenili, ali se je

struktura zares stabilizirala. Obstaja tudi možnost, da odsotnost kationov K+ bistveno

vpliva na stabilnost samih zank in ne samo na stabilnost gvaninskih tetrad. S slike 22

je razvidno, da med vsemi nukleotidi, ki sestavljajo zanke, prvi nukleotid adenin

povzroči največje nihanje RMSD, torej najbolj niha. Takšen pojav je pričakovan, saj

ima prvi nukleotid del 5' prost (ni vezan na kateri drug atom), zato lahko prosto

termično niha. Tudi če bi vpliv omenjenega adenina zanemarili, so na slikah 22 in 23

vidne razlike v stabilnosti propelerskih zank med sistemoma z in brez K+. Dodatno je

na sliki 23 viden prehodni pojav destabilizacije diagonalne zanke, ki jo sestavljajo

zaporedni nukleotidi TTA (oznaka na grafu: 11 DT X, 12 DT X, 13 DA X). Na sliki

22, ki prikazuje sistem s K+, tovrstni prehodni pojavi niso tako očitni, kar potrjuje

hipotezo, da je 1KF1 s kationi K+ kot celota in tudi posamezne komponente bolj

stabilen kot 1KF1 brez K+.

35

Graf 4 - RMSD vrednosti za adenin, timin ter adenin in timin, kot je prikazano v zaporedju od

zgoraj navzdol.

Ob zagonu simulacije je prišlo do spontane dislokacije kalijevega kationa, ki je

lociran na sredini tretje tetrade (glede na sliko 11 je to tetrada, ki je na vrhu).

0

0,2

0,4

0,6

0,8

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000

RM

SD -

nm

Čas -ps

ADE

brez K+ K+

0

0,2

0,4

0,6

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000

RM

SD -

nm

Čas -ps

THY

brez K+ K+

0

0,2

0,4

0,6

0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000

RM

SD -

nm

Čas -ps

ADE in THY

brez K+ K+

36

Slika 22 – Časovni prikaz vrednosti RMSD za 1KF1 s K+

37

Slika 23 – Časovni prikaz vrednosti RMSD za 1KF1 brez K+

38

RMSD vrednosti za kvadrupleks 1KF1

Tabela 3 – RMSD vrednosti za kvadrupleks 1KF1

KVADRUPLEKS HRBTENICA GUA G-TETRADA 1 G-TETRADA 2 G-TETRADA 3

RMSD K+ brez K+ K+ brez K+ K+ brez K+ K+ brez K+ K+ brez K+ K+ brez K+

avg 2,949 2,826 2,414 2,485 1,524 1,713 1,494 1,674 1,156 1,417 1,833 1,982

sd 0,308 0,463 0,244 0,305 0,176 0,218 0,183 0,236 0,179 0,263 0,264 0,278

min 0,531 0,551 0,53 0,529 0,541 0,563 0,602 0,498 0,471 0,696 0,54 0,466

max 3,592 3,791 3,172 3,329 2,115 2,481 2,206 2,488 1,888 2,37 2,643 3,064

THY THY in ADE ADE

RMSD K+ brez K+ K+ brez K+ K+ brez K+

avg 3,456 3,008 4,128 3,803 5,76 4,656

sd 0,303 0,587 0,463 0,767 0,749 1,327

min 0,515 0,492 0,519 0,536 0,526 0,595

max 3,555 4,706 4,96 5,322 7,03 7,146

39

Za čas simulacije se je omenjeni K+ prosto gibal po raztopini, mobilnosti oz.

premikov drugih kalijevih kationov pa nismo zaznali. Mobilnost kationov K+ smo

opazili pri nekaterih poskusnih zagonih simulacije 1KF1, kjer se je K+ iz druge

tetrade premaknil na prazno mesto, torej na sredino prve tetrade. Morda bi do tega

pojava prišlo, če bi podaljšali čas simulacije. Prav tako se Na+ kationi niso vezali na

mesto K+. Zanimivo je, da sama dislokacija ni povzročila opazne destabilizacije

strukture, kar je po drugi strani razumljivo, saj je kvadrupleks 1KF1 stabilen tudi

brez K+, kot je pokazala simulacija.

40

6 Sklep

S pomočjo molekularne dinamike smo pokazali, da je struktura 1KF1 presenetljivo

stabilna tudi brez kalijevih kationov, prisotnost K+ v centralnem kanalu pa povzroči

nadaljnjo stabilizacijo gvaninskih tetrad ter propelerskih oz. povezovalnih zank. Med

simulacijo smo opazili tudi dislokacijo enega izmed K+ kationov, vendar zanimivo ni

povzročila bistvene destabilizacije strukture 1KF1.

Možnosti za razširitev magistrskega dela je precej. Zaradi omejitev računskih

kapacitet, ki so nam bile na voljo, je bila dolžina simulacije omejena na 10 ns. Ob

primernejši opremi bi lahko v nadaljnjem delu čas simulacije podaljšati na nekaj µs

in posledično lažje presodili, ali so določeni opaženi pojavi stabilnosti oz.

nestabilnosti relevantni samo v opazovanem časovnem oknu. Uporabljeno polje sil

ima odločilen vpliv na rezultate, zato bi bilo potrebno simulacije ponoviti tudi z

drugimi, bolj izpopolnjenimi polji sil, kot je npr. »parmχ OL4« in drugimi (Krepl,

2012). Poskuse bi lahko tudi ponovili z drugimi kationi, npr. litijem, talijem, ipd. ter

kompleksnejšimi ligandi, npr. iz družine propirinov.

41

7 Citirana literatura

Alberto Perez, e. a. (2007). Refinement of the AMBER Force Field for Nucleic

Acids: Improving the Description of a/g Conformers. Biophysical Journal,

92, 3817–3829.

Alder, B. J., & Wainwright, T. E. (1959). Studies in Molecular Dynamics. I. General

Method. Journal of Chemical Physics, 31(2), 459.

Bugaut, A., & Balasubramanian, S. (2012). 5'-UTR RNA G-quadruplexes:

translation regulation and targeting. Nucleic Acids Research, 40(11), 4727–

4741.

Burge, S., Parkinson, G. N., Hazel, P., Todd, A. N., & Neidle, S. (2006). Quadruplex

DNA: sequence, topology and structure. Nucleic Acids Research, 34(19),

5402–5415.

Chowdhury, S., & Bansal, M. (2001). A nanosecond molecular dynamics study of

antiparallel d(G)7 quadruplex structures: effect of the coordinated cations.

Journal of biomolecular structure and dynamics, 647-69.

Chowdhury, S., & Bansal, M. (13. julij 2001). G-Quadruplex Structure Can Be

Stable with Only Some Coordination Sites Being Occupied by Cations:  A

Six-Nanosecond Molecular Dynamics Study. Journal of Physical Chemistry,

7572–7578.

Côté, A. S., Smith, B., & Lindan, P. J. (2014). Periodic Boundary Condition.

Pridobljeno 4. avgust 2014 iz A Molecular Dynamics Tutorial:

http://www.ucl.ac.uk/~ucfbasc/Theory/pbc-mi.html

Gellert, M., Lipsett, M. N., & Davies, D. R. (december 1962). Helix formation by

guanylic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United

States of America, 2013-2018.

Gosling, R. (1952). Photo 51. Pridobljeno 13. Julij 2014 iz Wikipedia, The Free

Encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/Photo_51

42

Haider, S., Parkinson, G., & Neidle, S. (2002). Crystal structure of the potassium

form of an Oxytricha nova G-quadruplex. Journal of Molecular Biology, 189-

200.

Howard, F., Frazier, J., & Miles, H. (1977). Stable and metastable forms of poly(G).

Biopolymers, 16, 791-809.

Huppert, J. (2014). G-quadruplex. Pridobljeno 15. julij 2014 iz Wikipedia, The Free

Encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/G-quadruplex

Huppert, J. L., & Balasubramanian, S. (2005). Prevalence of quadruplexes in the

human genome. Nucleic Acids Research, 33(9), 2908–2916.

Krepl, M. (2012). Reference Simulations of Noncanonical Nucleic Acids with

Different χ Variants of the AMBER Force Field: Quadruplex DNA,

Quadruplex RNA, and Z-DNA. Journal of Chemical Theory and

Computation, 8(7), 2506-2520.

Neidle, S., & Balasubramanian, S. (2006). Quadruplex Nucleic Acids. Cambridge:

Royal Society of Chemistry.

Nelson, D., & Cox, M. (2013). Nucleotides and Nucleic Acids. V Principles of

Biochemistry (str. 281-308).

Nucleic acid structure. (2014). Pridobljeno 13. julij 2014 iz Wikipedia, The Free

Encyclopedia: http://en.wikipedia.org/wiki/DNA_structure

Parkinson, G. N., & Neidle, S. (2014). Structure and Packing of Human Telomeric

DNA. Pridobljeno 28. julij 2014 iz Protein Data Bank:

http://www.rcsb.org/pdb/explore.do?structureId=1kf1

Parkinson, G. N., Lee, M. p., & Neidle, S. (2002). Crystal structure of parallel

quadruplexes from human telomeric DNA. Nature, 876-880.

Pray, L. A. (2008). Discovery of DNA Structure and Function: Watson and Crick.

Nature Education, 1(1), 100.

Rawal, P., Kummarasetti, V. B., Ravindran, J., Kumar, N., Halder, K., Sharma, R., . .

. Chowdhury, S. (2006). Genome-wide prediction of G4 DNA as regulatory

43

motifs: Role in Escherichia coli global regulation. Genome Research, 16(5),

644–655.

Read, M. A., & Neidle, S. (2000). Structural Characterization of a

Guanine−Quadruplex Ligand Complex. American Chemical Society, 39,

13422–13432.

Simonsson, T., Pecinka, P., & Kubista, M. (1998). DNA tetraplex formation in the

control region of c-myc. Nucleic Acids Research, 26(5), 1167–1172.

Stratchan, T., & Read, A. (2011). Cancer genetics. V T. Stratchan, & A. Read,

Human molecular genetics, 4th edition (str. 537-567). Garland Science.

Špačková, N., Berger, I., & Šponer, J. (1999). Nanosecond Molecular Dynamics

Simulations of Parallel and Antiparallel Guanine Quadruplex DNA

Molecules. Journal of American Chemical Society, 5519–5534.

Špačková, N., Berger, I., & Šponer, J. (2001). Structural dynamics and cation

interactions of DNA quadruplex molecules containing mixed

guanine/cytosine quartets revealed by large-scale MD simulations. Journal of

the American Chemical Society, 11, 3295-307.

Wikipedia, The Free Encyclopedia. (2014). Pridobljeno 11. September 2014 iz Water

Model: http://en.wikipedia.org/wiki/Water_model

Williamson, J. (1994). G-quartet structures in telomeric DNA. Annual Review of

Biophysical and Biomolecular Structures, 23, 703-730.

Zahler, A. M., Williamson, J. R., Cech, T. R., & Prescott, D. M. (25. April 1991).

Inhibition of telomerase by G-quartet DNA structures. Nature, 350.

Z-DNA. (2014). Pridobljeno 14. Julij 2014 iz Wikipedia The Free Encyclopedia:

http://en.wikipedia.org/wiki/Z-DNA