Genexpression von DNA-Viren

Sommersemester 2006

Molekularbiologie IV: Strategien der Virusreplikation

Elisabeth SchwarzDKFZ

13. Juni 2006

Erhalt eines Virus als infektiöse Einheit

> Vermehrung (Replikation)> produktive Infektion

dazu notwendig:Expression der viralen GeneReplikation des VirusgenomsBildung neuer Viruspartikel

Phasen einer produktiven Virusinfektion

Attachment/Adsorption/Anheftung:zelluläre Rezeptorenvirale Proteine (Envelope oder Capsid)

Penetration: rezeptorvermittelte EndozytoseMembranfusion

Uncoating: Freisetzung der viralen NucleinsäureReplikation: Expression der viralen Gene

Replikation des VirusgenomsSynthese der Virionkomponenten

Assembly/Morphogenese/ReifungRelease/Freisetzung:

LyseBudding/Knospung

Virusinfektion - verschiedene Möglichkeiten

Wechselwirkungen zwischen Virus und Wirtszelle entscheiden überVerlauf einer Virusinfektion

Grundvoraussetzung: suszeptible Zellen (= infizierbare Zellen)Gegensatz: nichtsuszeptible Zellen (nicht-infizierbar)

permissive Zellen - produktive Infektion (>Lyse)nicht-permissive Zellen - abortive Infektiontransient-permissive Z. - restriktive (restringierte) Infektion

Persistente (persistierende) Infektion:Latente Infektion: Persistenz des viralen Genoms, aber keine Bildung

infektiöser PartikelChronische Infektion: Viruspersistenz mit Bildung infektiöser Partikel

Zum Aufbau der Vorlesungsstunden

· Genexpression und Genomreplikation sindvoneinander abhängige und koordiniert ablaufendeProzesse

· Trennung in zwei Vorlesungsteile: um jeweils spezifische Probleme und Problemlösungendeutlich zu machen (an Beispielen)

· damit verbinden: Beschreibung der einzelnen Familien von DNA-Viren

DNA-Viren

© Principles of Virology, 2004

Viren als obligate intrazelluläre Parasiten

abhängig von Faktoren der Wirtszellen:Grundbausteine (Aminosäuren, Nucleotide)

TranslationsapparatTranskriptionsapparat

Replikationsapparat

nicht alle Faktoren sind zu jeder Zeit und an jeder Stelle verfügbar

räumliche Aufteilung: WO?zeitliche Aufteilung: WANN?

Genomreplikation und Genexpression

Zeitlicher Verlauf:Alle DNA-Viren benötigen für Genomreplikationmindestens ein virales Protein

Genexpression vor DNA-Replikation

Synthese von Capsidproteinen zur Verpackung der neusynthetisierten DNA

Genexpression während DNA-Replikation

Proteinmengen:Regulatorproteine vs. Capsidproteine

Stufen der viralen Genexpression

früh (early, E) spät (late, L)

Early-late switch

Genexpression von DNA-Viren- Allgemeine Betrachtungen -

• Regulation von früher und später Phase erfolgthauptsächlich auf Ebene der Transkription

• Synthese der viralen mRNAs erfolgt durch zelluläreRNA-Polymerase II

• Ausnahme: PockenvirenVoraussetzungen:virale DNA trägt Signalelemente, die von zellulärer Transkriptions-maschinerie und Regulationsfaktoren (Aktivatoren, Repressoren) erkannt werden

Studium von Viren führt zu Erkenntnissen über die WirtszellenVirusgenom im ZellkernVorhandensein der benötigten zellulären Transkriptionsfaktoren inden infizierten Zellen

Eukaryote Transkription: Initiation

TFIID: TBP + TAFs(TBP-assoziierte Faktoren)

TFIIH: Helikase + Kinase(CTD Phosphorylierung)

Transkriptionsaktivatorenund Repressoren

Allgemeine Transkriptions-faktoren (TFIIs)

Genexpression von DNA-Viren:Virale Transkriptionsfaktoren

• Transkription der viralen Gene erfolgt in festgelegter zeitlicher Reihenfolge

• Regulation durch virale Transkriptionsfaktoren• verstärkte Synthese viraler mRNAs• early-late switch• Autoregulation (Aktivierung, Repression)• Kooperation mit zellulären Faktoren• DNA-bindend / nicht DNA-bindend

Späte Genexpression- allgemeine Betrachtungen -

• Späte Proteine (Capsidproteine) werden in großen Mengen benötigt zur Bildung neuer Virionen

• große Mengen fremder Proteine sind meist toxisch für Zellen• zu frühe Synthese würde Effizienz der Virusvermehrung vermindern• Problemlösung:

Kopplung der späten Genexpression an die virale DNA-Replikation– Inhibition der viralen DNA-Replikation verhindert auch späte

Genexpression• Replizierte virale DNA:

– Matrize für weitere Replikation– Matrize für Transkription– Genom zum Verpacken

• Mechanismen für DNA-replikationsgekoppelte Aktivierung der späten Transkription noch wenig bekannt

Genexpression von DNA-Viren

Beispiele in Vorlesung:

Regulation der frühen viralen Genexpression– Polyomaviren: SV40 T-Antigen– Adenoviren: Adenovirus E1A

Early-late-switch und späte virale Genexpression– SV40– Adenovirus– Papillomviren

Stufenweise Genexpression beiSV40, Adenovirus und Herpesvirus

SV40

Adeno

HSV

early >late

immediate early >early >late

Virion protein >immediate early >early >late

© Principles of Virology, 1999, 2004

Polyomaviren• 12 Viren bekannt, enger Wirtsbereich• produktive Infektion nur in Zellen des natürlichen Wirts• Transformation nicht-permissiver Zellen• Genom: zirkuläre dsDNA, ca. 5000 bp• Virionen: Ikosaeder, Durchmesser ca. 40 nm

Polyomavirus• zuerst entdecktes Virus der Polyomaviren (1953, Ludwik Gross)• Arbeiten mit Mäuse-Leukämievirus: einige Mäuse entwickelten Tumoren derSpeicheldrüsen (und keine Leukämien)

• Zwei-Viren-Hypothese, Isolierung des zweiten Virus• Virus ruft viele andere Tumoren hervor: Name Polyomavirus (1958)• Tumorbildung nur bei Inokulation in neugeborene Labormäuse,

bei erwachsenen Mäusen keine Poloymavirus-Erkrankungen• Infektion von embryonalen Mauszellen (permissiv):lytische Infektion > Analyse des produktiven Infektionszyklus

• Infektion von Maus- und Hamsterzellen (semipermissiv):Zelltransformation > Analyse der Zelltransformation

Polyomaviren: SV40SV40 = Simian virus 40• Entdeckung von SV40: Nebenprodukt bei Arbeiten mit Poliovirus (1960; Sweet and Hilleman)

• Polio-Impfstoff (Salk-Vakzine) aus Rhesus-Affennierenzellen (Verwendung von menschlichen Zellen war verboten wg. möglicher Gefahr eines nicht bekannten Tumorvirus)

• Inaktivierung der Polioviren mit Formalin• Test des Impfstoffs:

Zellkulturen: kein cytopathischer EffektInjektion in neugeborene Hamster:

Tumoren (Latenzzeit 4-10 Monaten)• neues Virus: Infektion führt in Affennierenzellen zu Bläschenbildung

> Simian vacuolating virus 40 = SV40• Transformation von Zellen• keine Erkrankungen und Tumoren im natürlichen Wirt (Affe)• keine erhöhte Tumorrate bei Polio-Geimpften

Beiträge von Polyomaviren zur Molekularbiologie

• Struktur von superhelikaler DNA• SV40 DNA als Minichromosom: DNA + Histone,Nucleosomenstruktur

• eukaryote DNA-Replikation• eukaryote Replikationsursprünge

• Mechanismen der negativen und positivenRegulation der Genexpression

• Enhancer und Promotor• alternatives Spleißen

• Mechanismen der Onkogenese• Onkogene und Tumorsuppressorgene• Regulation des Zellzyklus

SV40 in permissiven (A) und nicht-permissiven (B) Zellen

© Molecular Cell Biology, 1995

A BA B

VP2

VP3

VP1

L-TAg

s-TAg

SV40

früheRegion

späteRegion

ori/Transkriptionskontrollregion

frühemRNAs

spätemRNAs

SV40 frühe Genexpression• Frühe Transkription zunächst ausschließlich durch

zelluläre Faktoren• alternatives Spleißen der frühen mRNAs:

• L-T (708 AS) und s-T (174 AS)• N-terminale 82 AS gemeinsam

• s-T (small t-Ag, kleines t-Antigen): Wachstumsstimulation, Akkumulation von Virus-DNA im Kern, nicht notwendig für produktive Infektion in Zellkultur

• L-T (large T-Antigen, großes T-Antigen):multifunktionales Protein,DNA-Replikation, Regulation der frühen und späten Transkription, early-late switch

SV40 L-Tintrazelluläre Lokalisation:im Kern (95 %); NLS (bei L-T erstmals identifiziert)an Plasmamembran (5 %)5-10 x 105 Moleküle pro lytisch infizierter Zelle

DNA-Bindung an GAGGCBindungsstelle I: Autoregulation der frühen viralen TranskriptionBindungsstelle II (ori): DNA-Replikation

Komplexbildung mit zellulären Proteinen•DNA-Polα/Primase: DNA-Replikation•pRB, p53, Coaktivator p300, TBP, TEF-1, AP-2

in früher Phase (niedrige L-T-Konzentration):Aktivierungunabhängig von DNA-Bindung von L-Tunabhängig von Kernlokalisation von L-T

Regulation des frühen Promotors durch SV40 L-T

in später Phase (höhere L-T-Konzentration): Repression•Bindung an Bindungsstelle I•stört Zusammenbau des Transkriptionsinitiations-Komplexes

SV40 Enhancer

72-bp repeat:•Enhancer für frühen Promotor (Enhancer-Konzept, 1980)•Bindungsstellen für zelluläre Transkriptionsfaktoren:TEF, AP-1, NF-κB

•ubiquitär aktiv (>Expressionsvektoren)

TATA-Box (Chambon, 1980)

21-bp repeat:GC-reich, Sp1-Bindungsstellen (CCGCCC)

Early-late switch und späte Genexpressionbei Polyomaviren

Änderung der frühen Genexpression:• Startstellen verschieben sich von early-early-Position (EE) zu late-early (LE)

• längere 5‘-Enden• vor T-Antigen-ORF ein kleiner ORF für early-leader protein (ELP, 23 aa)

• ELP-ORF vermindert Translationsstartan T-Ag-Startcodon

Transkription der späten Gene:• Start am späten Promotor (keine TATA-Box): heterogene 5‘-Enden

Aktivierung:• Amplifikation der Genom-DNA durch DNA-Replikation• T-Antigen:

•unabhängig von DNA-Bindung von T-Ag•wahrscheinlich durch Modifikation zellulärer Faktoren•kein T-Ag in späten Transkriptionskomplexen vorhanden

• „Verdünnen“ von zellulären Repressoren

Regulation des späten SV40-Promotors durch zellulären Repressor (Ibp-Protein)

Ibp bindet im Bereich desspäten Promotors(Ibp: initiator-binding protein,Steroid-Thyroidhormon-RezeptorFamilie)

Frühe Phase:[Ibp] > [Genom]wenige DNA-MoleküleIbp blockiert späten Promotor

Späte Phase:[Ibp] << [Genom]ansteigende Genom-Mengezu wenig IbpBlockade entfällt© Principles of Virology

DNA-Viren:Stufenweise Genexpression

SV40

Adeno

HSV

early >late

immediate early >early >late

Virion protein >immediate early >early >late

© Principles of Virology, 1999, 2004

Adenoviren: Genexpression• Genom ca. 35 kb

• 5 frühe Transkriptionseinheiten mit jeweils mehrerenalternativ gespleißten mRNAs: E1A, E1B, E2, E3, E4

• eine späte Transkriptionseinheit (MLTU: major late transcription unit)

• Strang und Gegenstrang enthalten kodierende Informationen

• Erhöhen der Kodierungskapazität durch differentiellesSpleißen(Spleißen entdeckt bei Studium von Adenovirus-mRNAs)

Adenoviren: gespleißte mRNA

© Molecular Cell Biology 2004

Adenovirenfrühe und späte mRNAs

E3

E4E2

E1

AdenovirenZiele der frühen Genexpression

• Herstellung einer optimalen Umgebung für Virusreplikation: Induktion der S-Phase: E1A x pRBApoptoseblock:

E1B-55K: Bindung an p53E1B-19 kd (wirkt ähnlich wie Bcl-2, verhindert Freisetzung von Cytochrom C aus Mitochondrien)

• Synthese viraler Genprodukte für virale DNA-Replikation (E2)

• Synthese viraler Genprodukte, die antiviraleVerteidigungsstrategien des Organismus blockieren (E3 und E4)

Adeno E1A-Einheit• als erste exprimiert: immediate early• konstitutiv aktiver Promotor• mehr als 20 Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren• Transkription zunächst unter Kontrolle zellulärer Transkriptionsfaktoren

• später: Autoaktivierung durch E1A (289 aa)• in späteren Phasen: Autorepression durch E1A

(289 aa und 243 aa)

E1A-mRNAs und -Proteine:• 13S-RNA (ca. 1000 b): 289 aa (CR1 + CR2 + CR3)• 12S-RNA (ca. 900 b): 243 aa (CR1 + CR2)zusätzlich:• 11S (217 aa), 10S (171 aa), 9S (55 aa)

Adeno E1AAktivierung der Transkription aller viraler Gene

• E1B, E2, E3, E4: delayed early• ML (major late)

Induktion von S-Phase: E1A x pRB

Transkriptionsregulation durch E1A:• keine DNA-Bindung• Interaktion mit anderen Proteinen:

• TBP: Aktivierung über TATA-Box• Coaktivator p300: Repression von Enhancern• YY1: Aufhebung der YY1-vermittelten Repression• pRB: Freisetzung von Transkriptionsfaktor E2F

(Adeno E2-Promotor: Name für E2F)

Protein-Interaktionen

von E1A• radioaktive Markierung der Proteine• Immunpräzipitation mit Antikörpern gg. SV40 T (PAb416) oder E1A(αE1A)

• Gelelektrophorese (publ. 1986)

Adeno-negativKontrolle:

Adeno-E1-transformiert

Adenoviren: early-late switchEarly-late switch• Reduktion der frühen Genexpression

• Aktivierung der Transkription von:• IVa2, pIX• major late transcription unit(MLP)

pIX:• pIX-Gen überlagert von E1B-Transkriptionseinheit• pIX-Promotor blockiert, solange E1B transkribiert wird (promoter occlusion)• pIX-Promotor wird zugänglich, wenn [DNA] und E1B .• pIX-Protein: assoziiert mit Hexoncapsomeren.

E1A IVa2 DNA-Replikation

IVa2:• Aktivierung wahrscheinlich durch „Verdünnen“ eines zellulären Repressors

• sequenzspezifischer Transkriptions-aktivator für späten Promotor

Adenoviren: späte GenexpressionMajor late transcription unit:• Transkriptionsstart an major late promoter (MLP)• Primärtranskript ca. 30.000 Basen (Genomlänge ca. 36 kb)

RNA-Prozessierung:diff. Spleißendiff. poly(A)-Stellendreiteilige nichtcodierende„leader“-Sequenz• 18 verschiedene mRNAs• 5 RNA-Familien L1-L5• RNAs einer Familieterminieren an gleichempoly(A)-Signal

AdenovirenTermination der späten Transkripte

Frühe Phase:• unvollständige Elongation und frühzeitige TerminationSpäte Phase:• vollständige Elongation und Termination, abhängig von replizierter viraler DNA

• selektiver Transport der späten viralen mRNAs ins Cytoplasma(E1B-55K + E4-34K)

• selektive Translation der späten viralen mRNAs(Inaktivierung von eIF-4F, cap binding complex; noch vorhandenes aktives eIF-4F wird von dreiteiligem leader gebunden)

Papillomaviruses• DNA viruses• icosahedral capsids(diameter 55 nm)

• circular dsDNA(6800-8400 bp)

• host species-specificity• replication in squamousepithelial cells

Animal papillomaviruses: • bovine papillomavirus (BPV)• cottontail rabbit papillomavirus (CRPV)

Human papillomaviruses (> 100 genotypes):• cutaneous HPV types: warts (papillomas)• mucosal HPV types: condylomata, carcinomas

Human PapillomavirusesCutaneous HPV types• HPV1, 2, u.a.• Infections of keratinized epithelia = skin• Skin warts (papillomas) = benign tumors

A: Verrucae vulgares (common warts)B: Verrucae plantares (plantar warts)C: Verrucae planae (flat warts)

A B

C

Verruca plana (links)

Condyloma acuminatum(rechts)

HPV-Virionenin infizierten Zellen

NC

HPV-infizierte Plattenepithelien

Papillomviren und KrebsZervixkarzinom (Gebärmutterhalskrebs, cervical carcinoma)Mehrstufenprozess der Krebsentstehung:• persistierende „high-risk“ HPV-Infektion•„high risk“-HPV-Typen: HPV16, 18, 31, 33, 35, 39,

45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, 73, u.a.[„low risk“-HPV-Typen: HPV6, HPV11 (Genitalwarzen)]• Nachweis von „high-risk“ HPV-DNA in fast 100 % aller Gebärmutterhalstumoren und in Tumorzell-Linien

•„high risk“ HPV-Onkogene E6 und E7:– Expression in Krebszellen– Inaktivierung von Tumorsuppressorproteinen (pRB, p53)– Immortalisierung und Transformation von Zellen

• Aktivierung von Onkogenen• Integration der HPV-DNA in das Zellgenom• Genominstabilität, Aneuploidie

normale ZellenKoilozyten

CIN III

Karzinom

Zytologische Untersuchung von Zellabstrichen (Papanicolau) undEpithelveränderungen bei HPV-bedingterKarzinogenese

Papillomviren: Abhängigkeit der viralen Genexpression und DNA-Replikation

vom Differenzierungszustand der Wirtszellen

Fehrmann and Laimins, Oncogene, 22, 5201 (2003)

Papillomavirusesearly and late genes and gene functions

E6

E7 E1 L2L1E2

pearly pAe pAl

early transcriptslate transcripts

E6: ~150 aa, transactivator, oncoprotein, p53 degradationE7: ~100 aa, oncoprotein, inactivation of pRB and p21 CDKI E1: ~650 aa, replication factor (ori binding) E2: ~360 aa, viral activator/repressor, replication factor (ori binding)

L2: ~470 aa, minor capsid proteinL1 : ~530 aa, major capsid protein

E6E7

E1

E2L2

L1URR

po

Papillomviren(HPV31)

Frühe ProteineE6: Hemmung der Apoptose,

Onkoprotein, p53E7: Induktion S-Phase,

Onkoprotein, pRBE1: DNA-ReplikationE2: Transkriptionsfaktor,

DNA-ReplikationE5: Wachstumsfaktor

Späte ProteineL1: CapsidproteinL2: Capsidprotein

alternatives Spleißen!

HPV16-Genexpression in infizierten Gebärmutterhalsepithelien(LSIL: low grade squamous intraepithelial lesion)

Middleton et al., J. Virol, 77, 10186 (2003)

Productive HPV Infection

Middleton et al. (2003)J. Virol., 77, 10186-10201,

Figure 2

E6, E

7 (E

1, E

2, E

4, E

5)

E4 (E

2, E

1, E

5)

S-ph

ase

com

pete

nt

• Access to basal layer• Establishment as a low-copy-number episome• E7 expression (red circles)• uninfected/nonpermissive cells (blue circles)• E4 expression (green cells)• L1+L2 expression (orange nuclei)

HPV-Genexpression bei produktiver HPV-Infektion

HPV-Genexpression in Krebsvorstufen

(alle HPV-Typen)

(„high-risk“ HPV-Typen)