Molekularbiologie in der klinischen Diagnostik

1. Zytogenetik

2. Marker für Krankheiten

1

Ultraschall

• Proben werden unter Ultraschallsicht entnommen

• Indikation zur Methode der Wahl durch US bestätigt

• Nachsorge/Kontrolle mit Ultraschall

• ....

2

Studenten und Ausbildung

3

Simulatoren

4 Alternative: digitales Stethoskop

Transducer

Sonobody Mini - Computer

Battery

around belt

Separated units for easy maintainance

Command input

Typing/voice

Trigger?

Live-transmission to expert consultant, worldwide

Telemedicine:

Executive and expert center

7

Veterinärmedizin

8

1. ZYTOGENETIK

9

Cytogenetik/Zytogenetik

untersucht die Chromosomen und ihre Rolle

während der Vererbung.

Zytogenetik beschäftigt sich mit der:

1. Diagnostik der Chromosomenstörungen.

2. Lokalisierung der chromosomalen Regionen /

DNA-Sequenzen .

Cytogenetik

10

Chromatin: ist die nicht kondensierte DNA, die werden mit Proteinen beigefügt

(während der Interphase des Zellzyklus)

Chromosom: ist die kondensierte DNA mit Proteinen beigefügt (während der

M-Phase des Zellzyklus)

Karyotyp: bezeichnet alle Eigenschaften der Chromosomenansatz eines Individuums/

Zellkernes und die Anzahl der Chromosomen (zB 46 XY, 47 XYY)

Karyogramm: ist die paarweise und angeordnete zu photografierende

Chromosomenansatz

Idiogramm: ist die schematische Darstellung der Chromosomen nach abnehmende

Grösse und Form

Die menschliche Zellen enthalten normalerweise 46 Chromosomen:

44 Autosomen und

2 Geschlechtschromosomen.

Cytogenetische Begriffsdefinitionen

11

1. Chr.

(human)

DNA Länge 50

mm

Chr. Länge 3-4

µm

10.000 x Kondensation!

Aufbau der Chromosomenstruktur

12

Die Geschichte der Identifizierung des menschlichen Chromosoms

1879. Arnold: Erste Visualisierung der menschlichen Chromosomen.

1888. Waldeyer: Das Geburt des Wortes Chromosom (Chroma: Farbe, soma: Körper)

1882. Walther Flemming: 20-28 Chromosomen in den Zellen der Hornhaut

1921. T.S. Painter: 48 menschlichen Chromosomen, X & Y-Chromosomen (Wissenschaft)

1956. Jo Hin Tijo und Albert Levan: 46 menschlichen Chromosomen (Hereditas)

1959. Lejeune: Trisomie 21 = Down-Syndrom

13

Menschliche

Chromosomen werden sich

in teilenden Zellen

(Knochenmark / Plazenta-

Zellen, Lymphozyten)

untersucht.

Der Zellzyklus und

der Nachweis der

Chromosomen

14

1960. Denver: Die menschlichen Chromosomen wurden von 1 bis 22 nummeriert, in der

Reihenfolge der Größe, mit Ausnahme der Geschlechtschromosomen. Die 22 Chromosomen

wurden in 7 Gruppen eingeteilt.

1963. London: der Schriftzug der Gruppe (AG) wurde angenommen

1966. Chicago: chromosomale Syndrome wurden markiert

1971. Paris, die 1976. Mexiko, 1978. Stockholm: Chromosom Banding

1995. ISCN: International System (für Menschen) Cytogenetische Nomenklatur

Karyotyping conferences

15

Karyotyp

46 XX

Karyogramm Idiogramm

Anwendungsgebiete?

16

Kariotyp Kariogram

Anwendungsgebiete

• Pränataldiagnostik

• Gynäkologie

• Pädiatrie

17

18

Chromosomstruktur

19

46, XX

Die Gruppen des Chromosomansatzes

20

46, XY

21

Chromosomenbänderung Die Chromosombänderungstechniken verwenden verschiedene

Färbungen um die Chromosomen und

Chromosomenstrukturänderungen zu zeigen.

Die folgende Bänderungstechniken sind oft verwendet:

G-bänderung: Giemsa Färbung

R-Bänderung: (rückwärts) geändert Giemsa Färbung

C-Bänderung: Centromer spezifische Färbung

T-Streifen: Telomer spezifische Färbung

Q-Streifen: Quinacrin Färbung (fluoreszierend)

Der kurze und lange

Chromosomarmen

werden aufgrund der

Färbungsmuster

nummeriert.

22

Q-banding G-banding

R-banding C-banding T-banding

Chromosomenbänderung

23

Die verschiedenen Krankheitsbilder werden durch Aneuploidien, Translokationen

oder Deletionen verursacht.

Chromosomale Aberrationen

24

ANEUPLOIDIE

Die Aneuploidie ist eine numerische Chromosomenaberration, einzelne Chromosomen

zusätzlich zum üblichen Chromosomensatz vorhanden sind oder fehlen

(am häufigstenTrisomien und Monosomien).

25

MITOTISCHE

NON-DISJUNCTION

MEIOTISCHE

NON-DISJUNCTION

26

MEIOTISCHE NON-DISJUNCTION—>

ANEUPLOIDIE

27

MEIOTISCHE/MITOTISCHE NON-DISJUNCTION

28

Numerische Chromosomenaberrationen

Euploid Chromosomenmutationen: Triploidie (3n), Polyploidie

Aneuploid Chromosomenmutation

Autosomale Häufigkeit Geschlechtschro

mosomale

Häufigkeit

Trisomie

Trisomie des 21. Chr.

Down-Syndrom 1/700 47, XXX Triplo-

X-Syndrom 1/1000 in

Frauen

Trisomie des 18. Chr.

Edwards- Syndrom 1/13000 47, XXY

Klinefelter-

Syndrom

1/1000 in

Männer

Trisomie des 13. Chr.

Patau-Syndrom 1/15000 47, XYY

Doppel-Y-

Syndrom

1/1000 in

Männer

Selte Trisomien 3-,7-,8-,9-,12-

,14-,15-,19-,22-es

Monosomie 45, X0 Turner-

Syndrom 1/2500 in

Frauen

29

AUTOSOMALE ANEUPLOIDIE:

DOWN-SYNDROM

Down Syndrom

• 3x 21 od. Teile (freie Trisomie, Mosaik)

• 1:650 (häufigste Chr.anomalie)

• Risk ab 35. Jahr der Mutter, dennoch 70% der Mütter jünger!

• Sonographie!

– Verdickte Nackenfalte 11.-14.SSW

– Quotient biparietaler Schädeldurchmesser

– Femurlänge >50% erhöht

30

Down Syndrom

• Labor: Triple Test (a-Fetoprotein, Estriol, HCG)

• PAPP-A (Pregnancy-associated plasma protein)

• Körperliche Befunde:

– Körperbau/Bewegungsapparat

– Extremitäten/Akren

– Kopf/Augen

• Geistig/psychisch: IQ unterschiedlich, ca.-50 vom Normalwert

31

Down Syndrom

• Fehlbildungen innerer Organe

– Herz 50% , Septum, AV-Kanal, Fallot-tetralogie,etc.

– GI Atresien/Stenosen, Pancreas anulare, Morbus Hirschsprung, Eingeweidebrüche

– Hypogonadismus, Infertilität

– Immundefizienz URTI

– Leukämie

– OSA

• Ca.45% werden älter als 60 Jahre (Demenz!) 32

33 Kariotyp: Trisomie des 21. Chromosoms

AUTOSOMALE ANEUPLOIDIE:

DOWN-SYNDROM

34

Der mütterliche Alter und die Wahrscheinlichkeit des

Down-syndroms

35

Karyotyp: Trisomie des 18. Chromosoms

AUTOSOMALE ANEUPLOIDIE:

EDWARDS-SYNDROM

Edwards Syndrom • Verdreifachtes Chr. 18 od. Teile davon

• 1:3000-5000, häufiger Mädchen

• Kurzer Stamm, kleine Mamillen

• Langer, schmaler Schädel

• Ohrmuscheldysplasie, Mikrognathie

• Extremitätenanomalien

• Herzfehler 90%

• Nierenfehl. und GI Atresien

• Keine Therapie (nur 10% überleben 1.Jahr)

36

37

Geschlechtschromosomale Aneuploidien:

38 Kariotyp: 45X0

Geschlechtschromosomale Aneuploidien: :

TURNER-SYNDROM

Turner Syndrom

• 45, X

• 1:2500 aller weiblichen Neugeboren

• Bei Geburt: Lymphödeme an Hand/Fußrücken

• Kleinwuchs, kurzer Hals m. Pterygium colli

• Epikanthus, Hypertelorismus, tiefer Haaransatz

• Schildthorax

• Breiter Mamillenstand

39

Turner Syndrom

• Metacarpalia Iv u. V. verkürzt

• Gonadendysgenesie, 1° Amenorrhö, hypoplastisches inneres u. Äußeres Genitale

• Infertilität

• Nierenfehlbildungen (Hufeisen)

40

41

Geschlechtschromosomale Aneuploidien:

KLINEFELTER-SYNDROM

Kariotyp: 47XXY

Klinefelter Syndrom

• 47, XXY, selten 48, XXXY

• 1:1000 aller männlichen Neugeborenen

• Erstdiagnose häufig in der Pubertät

• Euchnuchoider Hochwuchs

• Adipositas, Gynäkomastie

• Hypergonadotroper Hypogonadismus

• Hodenatrophie Aspermie

• Fehlen der sek. Männlichen Behaarung 42

43

Geschlechtschromosomale Aneuploidien:

TRIPLE X-SYNDROM

44

Geschlechtschromosomale Aneuploidien :

XYY-SYNDROM ???

45

Klassifizierung der strukturellen Chromosomenanomalien aufgrund der Zahl der

Chromosomenbrüche

terminális deléció

1 törés

reciprok transzlokáció centrikus fúzió

vagy

Robertson-féle

transzlokáció

2 különböző kromoszómán

paracentrikus inverzió

uazon a kromoszóma

karon

gyűrű kromoszóma pericentrikus inverzió

ellentétes kromoszóma

karon

uazon a kromoszómán

2 törés

inszerció

3 törés2 különböző

kromoszómán

szerkezeti kromoszóma aberráció

1 Bruch 2 Brüche 3 Brüche

An denselben

Chromosomarm An gegenseitigen

Chromosomarm

An denselben Chromosom An 2 verschiedenen Chromosomen

Strukturelle Chromosomaberrationen

An 2 verschiedenen

Chromosomen

Terminale Deletion Insertion

Reziproke Translokation Zentrische

Fusion

oder

Robertsonsche

Translokation

Parazentrische

Inversion

Ringchromosom Perizentrische

Inversion

46

DELETION

Ein Stück eines Chromosoms geht verloren

Kartierung mit Hilfe der Deletionen

Interstiziale Deletion - Prader-Willi; Angelman Syndromen del15 (q11-

13), Williams-Syndrom

Terminale Deletion – ein Chromosom verliert des Telomers – schwierige

Symptomen zB.: Cri du chat Syndrom

47

TRANSLOKATION

Die Zahl der Brechungen ist mehr als 1.

Die Brechungstellen sind im Fall der reziproken

Translokation:

- an denselben (homologen) Chromosomen

- an zwei verschiedenen Chromosomen

Die Bruchstellen sind meistens in den nicht kodierenden Regionen

(Proportionen der kodierenden Regionen betragen nur 5-10 %)

Balancierte Translokation

Wenn die Bruchstelle innerhalb eines Gens ist, kann das Genprodukt:

-eine neue Funktion bekommen (selten)

- in anderen Mengen hergestellt werden

- seine Funktion verlieren

48

RING CHROMOSOM

nach seriellen Telomerdeletionen bilden die

Chromosomen einen Ring

49

INVERSION

Parazentrische Inversion Perizentrische Inversion

50

Kongenitale Krankheitsbilder nach Deletionen

Deletion Symptom

Kurzer Arm des 5. Chr. (del 5p) Katzenschreien, mentale Retardierung, Herzstörungen

Kurzer Arm des 18. Chr. Körperliche und geistige Retardierung

Langer Arm des X Chr. (Fragile X) Autism, karakteristisches Gesicht

Langer Arm des 22 Chr. Entwicklungsstörung in der Schilddrüse

Langer Arm des 13. Chromosoms Augenkrebs

Kongenitale Krankheitsbilder nach Translokationen

TRANSLOKATION Symptom

ein Teil des 4. Chromosoms wird auf das 20. übergeträgt

Geistige Retardierung, deformiertes Gesicht

Ein Teil des X -> 13. Translokation Geistige Retardierung

51

Erworbene Deletionen im Tumor

DELETION TUMOR

APC-Gene Kolorektalkrebs

Retinoblastom Tumor in irgendwelcher

P53 In allen Organen

22. Chromosomdeletion Akute myeloische Leukämie

TRANSLOKATION TUMOR

9-22 Chromosom (Philadelphia-

Chromosom)

Chronische myeloische Leukämie

8-14 Chromosom Burkitt – Lymphom

8-21 Chromosom Akute myeloische Leukämie

Erworbene Translokationen im Tumor

52

Das Fragile X-Syndrom (FXS) ist eine

der häufigsten Ursachen erblicher

kognitiver Behinderung des Menschen.

Klinische Symptomen:

-Grosser Kopf, schmales

Gesicht, grosse Ohren

-mild - schwere mentale

Retardierung

- 1/3 der behinderten Frauen

haben mentale Retardierung

Xq27.3 ist die häufigste zerbrechliche

Region

X fra(X) fra(X) Y

FRAGILES X SYNDROM

Xq27.3

Fragiles X Syndrom

• Monogen vererbt, Xq27.3

• 1:1200-2500

• Mädchen: geringer ausgeprägte Symptome

• Kleinkindesalter Hochwuchs, Makrozephalie

• Gesichtsdysmorphien

• Große dysplastische Ohren

• Jungen: große Hoden

53

Fragiles X Syndrom

• Mentale Retardierung IQ < 60

• Hyperkinesie

• Hypersensibilität

• Autismus?

• Überstreckbarkeit der Gelenke

• Dilatierter Aortenbogen

• Mitralklappenprolaps

54

55

Die Mutation wirkt die CGG Trinukleotid Repeats des Gens FRAXA in der Region Xq28

Die Expansion der CGG Repeaten entsteht beim „mütterlichen Übertragung”

Es ist den 5’ Teil der nicht transkribierenden Region begleitet

die Verlängerung dieser Region folgt die Hemmung der Expression durch Methylieung

Das FMR1 Protein ist ein RNA-bindendes Protein

Für die mentale Retardation ist wahrscheinlich das mGluR5 (metabotrope glutamate receptor)

verantwortlich

FRAGILES X SYNDROM

56

CGG

CGG

5-50 Repeat

CGG

50-200 repeat

200 - repeat

Gesund

‘Prämutation’

Vollständige Mutation

FMR-1 Gen

FRAGILES X SYNDROM

57

FISH: FLUORESCENT IN SITU

HYBRIDISATION

58

FISH

59

Die Behandlung der Proben: nach einer kurzen Fixierung wird die markierte Probe (Sonde)

auf unseren Probe pipettiert, nach ein paar Stunden dauernden Hybridisierung wird die

zusätzliche markierte Probe (Sonde) gewaschen, und dann die Chromosomen unter UV-

Fluoreszenz Mikroskop sofort untersucht.

.

FISH

60

Verschiedene Arten der FISH Probe Mithilfe von Chromosom-spezifischen Tests werden die numerischen

Chromosomenanomalien erfasst.

Die X (rote) und Y (grüne) Chromosom-

spezifische Sonden in normalen männlichen

und weiblichen Zellkernen

Die Proben hybridisieren zu einem Abschnitt

der Chromosomen.

61

Identifizierung die Gonosomen.

In einem gesunden weiblichen Zellkern sind 2 X , in einem gesunden männlichen ist nur 1 X

Chromosom.

Verschiedene Arten der FISH Probe

Identifizierung der Geschlechtschromosomen

62

Die Locus-oder Gen-spezifische Sonde wird ein bestimmtes Zielgen identifizieren, und zeigt

die Position auf dem Chromosom. Fehlen des Gens, oder die Duplikation des Gens, als auch

die Translokation, Deletion eines Tumorsuppressorgens können ebenfalls nachgewiesen

werden.

Das RB1-Gen des13. Chromosoms ist sichtbar in zwei Kopien (rote Punkte)

Verschiedene Arten der FISH Probe

63

Locus spezifische FISH Probe für

verschiedene Syndromen • Prader-Willi Syndrom 15q11-13

• Angelman Syndrom 15q11-13

• Di-George Syndrom /VCFS 22q11.2

• Williams Syndrom 7q11.23

• Wolf-Hirschhorn Syndrom 4p16.3

• Cri du Chat Syndrom 5p15.2

• Kallmann Syndrom Xp22.3

• SRY Gen Yp11.3

• X-verbundene Ichthyosis Xp22.3

• Retinoblastoma (RB1-Gen) 13q14

• Smith-Magenis Syndrom 17p11.2

• Miller-Dieker Syndrom 17p13.3

64 Pränatale Untersuchung von Down-Syndrom – weitgehend abgelöst von US

Medizinische Verwendung der FISH Proben

65 Das p53 Tumorsuppressor-Gen wird mit einer lokusspezifischen

Probe in den Zellkernen der leukämischen Zellen sichtbar gemacht.

Medizinische Verwendung der FISH in

Tumoren Die Deletion der

erb-B2, EGFR und myc Gene wurden in vielen

Tumoren beobachtet (diese Onkogene sind),

als auch die RB und p53 Gene (welche

Tumorsuppressor sind).

66

Die Detektion des Philadelphia Chromosoms ist mit FISH Proben in chronischer

myeloischen Leukämie (CML) leichter, als mit den anderen Methoden.

Philadelphia Chromosom

(Ph1) abl (Abelson cluster region) kodiert

ein Tyrosine Kynase Protein

bcr (breakpoint cluster region)

Medizinische Verwendung

der FISH

67

das Gen BCR liegt normalerweise auf dem 22. Chromosom,

das ABL Gen auf dem 9. Chromosom.

Nach der Translokation werden die zwei Gene fusioniert.

Medizinische Verwendung des FISH

68

Verschiedene Arten der FISH

Telomerspezifischen Probe

Telomer

69

Das Barrkörperchen Regel: #BB = #X-1

zwei Barrkörperchen:

-> XXX

Die Funktion der X Inaktivierung:

Dosiskompensation der Genprodukte X Chromosoms

Heterochromatinisation: Gene werden inaktiv durch:

Xist RNS

DNS-Methylierung

Histon-Methylierung

X-CHROMOSOM INAKTIVIERUNG

70

- Es ist ein random Prozess

- das Prozess ist während der frühen Embryogenese schon aktiv

- Das Ergebnis ist unumkehrbar

X-CHROMOSOM INAKTIVIERUNG

71

die Pseudoautosomale Region bleibt auf den inaktiven X

Chromosomen aktiv!

XX XO

?

Die Pseudoautosomale Region ist sogar auf den X und Y Chromosom vorhanden.

Diese Region sichert eine normale Chiasmabildung und Segregation in der Meisose.

X-CHROMOSOMINAKTIVIERUNG

72

Anhidrotische Ektodermale Dysplasie:

Schweissdrüsen sind nur in den Flecken aktiv

X-CHROMOSOM INAKTIVIERUNG

Bei Menschen: Mosaicism

2. Marker für Krankheiten

• Geburtshilfe

• Neurologie

• Geriatrie

73

74

Danke für die Aufmerksamkeit!