Molecular cytogenetics of primary breast cancer by CGH

Embed Size (px)

Text of Molecular cytogenetics of primary breast cancer by CGH

  • Molecular Cytogenetics of Primary BreastCancer by CGH

    Mika Tirkkonen,1* Minna Tanner,1 Ritva Karhu,1 Anne Kallioniemi,2 Jorma Isola,1 and Olli-P. Kallioniemi2

    1 Laboratory of Cancer Genetics, Institute of Medical Technology, University and University Hospital, Tampere, Finland2 Laboratory of Cancer Genetics, National Human Genome Research Institute, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland

    Comparative genomic hybridization (CGH) reveals DNA sequence copy number changes that are shared among the differentcell subpopulations present in a tumor and may help to delineate the average progression pathways of breast cancer. PreviousCGH studies of breast cancer have concentrated on selected subgroups of breast cancer. Here, 55 unselected primary breastcarcinomas were analyzed using optimized quality-controlled CGH procedures. Gains of 1q (67%) and 8q (49%) were the mostfrequent aberrations. Other recurrent gains were found at 33 chromosomal regions, with 16p, 5p1214, 19q, 11q1314, 17q12,17q2224, 19p, and 20q13 being most often (.18%) involved. Losses found in .18% of the tumors involved 8p, 16q, 13q, 17p,9p, Xq, 6q, 11q, and 18q. The total number of aberrations per tumor was highest in poorly differentiated (P 5 0.01) and in DNAaneuploid (P 5 0.05) tumors. The high frequency of 1q gains and presence of 11q as the sole abnormality suggest that it is anearly genetic event. In contrast, gains of 8q were most common in genetically and phenotypically advanced breast cancers. Thevast majority of breast cancers (80%) have gains of 1q, 8q, or both, and 3 changes (11q, 18q, or 213q) account for 91% of thetumors. In conclusion, CGH results indicate that certain chromosomal imbalances are very often selected for, sometimes in apreferential order, during the progression of breast cancer. Further studies of such common changes may form the basis for amolecular cytogenetic classification of breast cancer. Genes Chromosomes Cancer 21:177184, 1998. r 1998 Wiley-Liss, Inc.


    Although breast cancer is the most commoncancer in females, only about 500 karyotypes (Mitel-man, 1994; Pandis et al., 1996) have been publishedin the literature. Several recurrent clonal structuraland numerical chromosomal abnormalities havebeen detected in primary breast cancer by cytoge-netic analysis. Of these, the following appear particu-larly important based either on their frequency oron their involvement in the early stages of tumorprogression: i(1q), der(1q;16p), del(1q), del(1p),del(3p), del(6q), del(11q), del(17p), i(6p), as well as22, 17, 215, and 120 (Dutrillaux et al., 1990;Thompson et al., 1993; Trent et al., 1993; Pandis etal., 1995; Steinarsdottir et al., 1995). Although thesuccess rate and sensitivity of G-banding analysishave dramatically improved during the last years,the frequency of aberrations may still be underesti-mated because of the inability to obtain analyzablemetaphase cells from some tumors. Furthermore,while karyotyping is ideal in revealing the tremen-dous genetic heterogeneity of cancer (Dutrillaux etal., 1990; Pandis et al., 1995), the identification ofall clonal genetic aberrations is sometimes difficultbecause of the overwhelming complexity of changes.

    The molecular cytogenetic method of compara-tive genomic hybridization (CGH) may supple-ment information from karyotyping (du Manoir etal., 1993; Kallioniemi et al., 1994a; Speicher et al.,

    1995; Waldman et al., 1996). CGH analysis isapplicable to all uncultured tumors regardless oftheir mitotic activity or the complexity of chromo-somal changes, thereby limiting possible selectionbiases. While the technique does not detect allstructural rearrangements, it offers an overview ofthose DNA sequence copy number changes thatare present in most of the tumor cells, i.e., thosechanges that are most likely to be clonal in origin.Many of the previous CGH studies of breast cancerwere performed during the early phases of CGHtechnology development. Therefore, only gainsand amplifications were considered able to beevaluated reliably (Kallioniemi et al., 1994a), andaberrations affecting certain chromosomes and chro-mosomal regions such as 1p32-pter, 16p, 17p, 19,and 22 were deemed unable to be evaluated withindirectly labeled genomic DNAs (Kallioniemi etal., 1994a; Isola et al., 1995). Most studies are alsobased on highly selected patient materials, such asnode-negative patients selected by disease out-come (Isola et al., 1995), metastatic tumors (Kuukas-

    Supported by: Academy of Finland; Finnish Cancer Society;Sigrid Juselius Foundation; Tampere University Hospital (EVOFoundation); Pirkanmaa Cultural Foundation; Pirkanmaa CancerSociety; Finnish Medical Foundation.

    *Correspondence to: Mika Tirkkonen, Tampere University Hospi-tal, Laboratory of Cancer Genetics, P.O. Box 2000, FIN-33521Tampere, Finland. E-mail:

    Received 20 January 1997; Accepted 20 March 1997

    GENES, CHROMOSOMES & CANCER 21:177184 (1998)

    3333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333 RESEARCH ARTICLES 33333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333333

    r 1998 Wiley-Liss, Inc.

  • jarvi et al., 1996), tumors with homogeneouslystaining chromosomal regions (Muleris et al., 1995),or tumors selected by DNA ploidy pattern (Ried etal., 1995).

    Already there are over 100 publications of CGHanalyses of various tumor types, altogether compris-ing over 1,500 tumor specimens (Kallioniemi et al.,personal communication). However, studies of un-selected primary breast cancers with modern CGHtechniques are lacking. Also, recent developmentsin directly conjugated CGH and rigorous qualitycontrol have improved the reliability and accuracyof CGH analysis (Karhu et al., 1997).

    Here, 55 breast carcinomas were analyzed withoptimized, quality-controlled CGH using directfluorescent label conjugation. The aim was todefine the most common genomic imbalances in anunselected series of breast cancers, to correlateCGH findings with clinicopathological features, aswell as to distinguish possible early genetic aberra-tions and changes that could be important in theclassification of breast cancer. Finally, CGH copynumber profiles of 20q, a genomic region oftenundergoing amplification, were compared withFISH copy number profiles generated from thesame tumors with a large collection of specificprobes.


    Tumor Specimens

    Fifty-five consecutive primary breast carcinomasdiagnosed at the Tampere University or City Hospi-tal during 19881991 were included in this study.The mean age of the patients was 62 years (range3492). Twenty-eight tumors were node-negative,26 node-positive, and 1 unknown. Fifty-three wereinvasive ductal carcinomas and 2 invasive lobular.The distribution of tumor grades (according to theWHO system) was grade I (13 cases), grade II (27),and grade III (15). None of the patients receivedany therapy prior to specimen collection. High-molecular-weight tumor DNA was isolated accord-ing to standard methods from freshly frozen breasttumor samples and, for reference female DNA,from peripheral blood. Nuclei for FISH from all thetumors were isolated from 100 m sections accord-ing to the Vindelov procedure (Hyytinen et al.,1994).

    Comparative Genomic Hybridization

    CGH was performed using directly fluorochrome-conjugated DNAs, as described previously (Kallioni-emi et al., 1994b; Isola et al., 1995; Visakorpi et al.,

    1995). Briefly, the metaphase spreads were dena-tured at 7274C for 2.53 minutes in a formamidesolution (70% formamide, 2XSSC, pH 7) and dehy-drated in a series of 70, 85, and 100% ethanols.Tumor DNAs were labeled with FITC-dUTP (Du-Pont, Boston, MA) and normal female referenceDNA with Texas red-dUTP (DuPont) using nicktranslation. Labeled tumor and normal DNAs (400ng each), together with 10 g of unlabeled Cot-1DNA (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), were dis-solved in a hybridization mixture consisting of 50%formamide, 10% dextran sulfate, and 2XSSC(1XSSC is 0.15 M NaCl, 0.015 M sodium citrate,pH 7). This mixture was denatured at 75C for 5minutes and applied on normal lymphocyte meta-phase preparations. The hybridization was done at37C for 2 days. After hybridization, the slides werewashed 3 times in 50% foramide/2XSSC (pH 7),twice in 2XSSC, and once in 0.1XSSC at 45C,followed by 4XSSC a