Modul: Osnovi bakteriologije i

virologije

Diplomski studij, izborni modul

Virologija

Virus – riječ koja je kroz povijest mijenjala značenje

u rimsko doba: svaka otrovna tvar

u 18. st.: otrov, neugodan miris znoja, iscjedak iz čira

u 19. st.: otrovne tvari povezane sa zarazama

(infekcijama), nevidljivi uzročnici bolesti

u 20. st.: sve običnim mikroskopom nevidljive zarazne

čestice

Otkriće virusa: kraj 19. st., 1892. godine Ivanovski je

proučavajući “mozaičnu bolest duhana” otkrio virus, kasnije

opisan kao TMV (Tobaco Mozaic Virus), 1989. god.

Beijerinck je nezavisno došao do istih rezultata kao

Ivanovski; contagium virum fluidum = tekući zarazni

uzročnik; Beijerinck je smatrao da je to “proteinska molekula

koja se razmnožava”

Tobaco Mozaic Virus

Važnija otkrića u povijesti virologije (Juretić 2002.)

1798. prvo cjepivo protiv velikih boginja E. Jenner

1885. cjepivo protiv bjesnoće L. Pasteur

1892. prvi virus (otkriven) D. J. Ivanovski

1902. virusna leukemija pluća W. Ellermann

1915. otkriveni bakteriofagi F.W. Twout

1935. izoliran prvi puta virus W. M. Stanley

(TMV) u čistom stanju

1937. ustanovljena nukleoproteinska F.C. Bowden

priroda virusa

1939. prvi puta promatrana čestica G. A. Kauschb

virusa elektronskim mikroskopom (TMV) E. Pfankuch

E. Ruska

1940. otkriven replikativni ciklus M. Delbrück

bakteriofaga

1951. ribonukleinska kiselina je unutar R. Movkham

proteinskog omotača

1995. iz RNA i proteina rekonstruirana je H. Fraenkel Courat

infekciozna čestica TMV R. C. Williams

1956. dokazana je zaraznost same RNA H. Fraenkel-Conrat

A. Grier

G. Schramm

1970. nađen onkogen u Rousovu virusu P. H. Deusberg

virusu sarkoma P. K. Vogt

1976. kopija onkogena retrovirusa D. Stehelin

nađena u normalnoj stanici H. E. Varmus

J. M. Bishop

1983. Izoliran retrovirus čovjeka F. Barre-Simonssi

(HTZV-III, odnosno HIV) i sur.

- Virusi su obligatni (obvezni ili isključivi) paraziti

- Virusi nemaju vlastiti metabolizam, ali mogu prusmjeriti metabolizam domaćina prema stvaranju novih virusnih čestica

- Virusi su izrazito spcijalizirani patogeni

a) Parazitiraju u bakterijskim stanicama (bakteriofagi)

b) Parazitiraju u životinjskim stanicama (animalni virusi)

c) Parazitiraju u biljnim stanicama (biljni virusi)

d) Malobrojni se mogu umnožavati u kukcima

- Nemaju staničnu građu

- Virusi su submikroskopskih veličina (izuzetak je virus velikih boginja kod ljudi – vide se dobrim svjetlosnim mikroskopom)

- Veličina im se mjeri nm (1mm = 106 nm)

- Većina virusa sastoji se od nukleinske kiseline i proteina

(bjelančevina)

- Sadrže (za razliku od drugog živog svijeta) samo jedan tip

nukleinske kiseline; RNA ili DNA)

- Nukleinska kiselina čini genom (nasljedna tvar)

- Središnja biologijska shema (“dogma”)

DNA transkripcija RNA translacija protein

DNA RNA protein

genetičke informacije mogu teči od DNA (prepisivanje) na RNA

ali i obratno od RNA prema DNA, a zatim se prevođenjem

(translacija) prevode u protein

- Virusi nemaju enzime za stvaranje biokemijske energije

- Virusi se nereproduciraju poput staničnih organizama

- Virusi nisu osjetljivi na antibiotike

Reprodukcija virusa

Definicija virusa (Frankel – Cornat i sur. 1988.)

“Virusi su zarazni uzročnici (čestice) koji sadrže samo jedan tip nukleinske kiseline: RNA ili DNA; njihova je nukleinska kiselina umotana u proteinski omotač izgrađen od jednog ili nekoliko proteina; kod nekih virusa oko proteinskog omotača dolazi složeno građena ovojnica izgrađena iz proteina, lipida i ugljikohidrata. Virusi su sposobni svoju nukleinsku kiselinu prenositi od jednog do drugog domaćina; sposobni su nametnuti stanici domaćina svoju genetičku informaciju, zbog čega se mogu koristiti enzimatskim ustrojem domaćina za svoje “razmnožavanje”. Neki virusi mogu svoju nukleinsku kiselinu ugraditi na više ili manje reverzibilan način u DNA domaćina te tako postati latentni ili perzistentni. Neki su od takvih virusa sposobni transformirati genom stanice domaćina i ometati njezin kontrolni mehanizam rasta, te uzrokovati tumore.

dalton = masa gotovo jednaka masi atoma vodika

Imunogenost virusa

- Svaka strana bjelančevina ili polisaharid molekularne mase veće od 1000 daltona (posebno ako je mase veće od 10 000 daltona) unesena u tkivo životinja izaziva imuni odgovor

- Imuni odgovor može biti:

a) stvaranje specifičnih protutjela (humoralna imunost)

b) stvaranje limfatičnih, imunokompetentnih stanica (stanična imunost)

- tvar (supstanca) koja izaziva imuni odgovor zove se imunogen

- ako imunogen specifično reagira s protutjelom koje je stvorio tada se zove antigen

- Bjelančevine koje izgrađuju protutjela pripadaju globulinima (više globulinskih proteina = imunoglobulin).

Oblik i građa virusnih čestica

- virusi su često okruglog oblika, a zapravo su poliedri (poliedrične ili izometrične građe)

- virusne čestice mogu biti anizometrične ili produžene, kratki štapići, dugačke niti

- samo ona virusna čestica koja se može umnožavati, koja može uzrokovati zarazu zove se virion

- proteinski omotač ili kapsida sastoji se najčešće od istovrsnih proteinskih molekula

- kod složenih virusa oko kapside nalazi se virusna ovojnica ili envelope, osim proteina sadrži lipide i ugljikohidrate

1. Mehaničko prenošenje

- u prirodi nije često; na biljkama nema često rana (ozljeda) kroz koje bi virus bez posrednika mogao ući u stanicu

- virusi ne mogu samostalno penetrirati (ulaziti) u stanice, barem koliko je danas poznato, također virusi se ne mogu vezati na površinu biljne stanice jer na opni nema receptora za koje bi se mogli vezati

- mehaničkim doticanjem (na pr. uz pomoć vjetra) zdravog i bolesnog lišća krumpira može se prenijeti X-virus krumpira (virus mozaika) ili na isti naćin virus mozaika duhana (TMV)

- mehanički kontakt korijena zdrave i zaražene biljke; kontakt korijena zdrave biljke i zaraženih biljnih ostataka

- često pri agrotehničkim zahvatima: kontaminiranim rukama ili priborom (noževi, škare) čak i odjećom

Načini prenošenja virusa

2. Cijepljenje

- vrlo lagani načini prenošenja bez obzira je li zaražena

plemka ili podloga, strogo gledajući ovo je antropogeno

širenje jer je za cijepljenje odgovoran čovjek.

3. Zoohorno prenošenje (kukcima)

- najčešći organizmi (vektori) koji prenose viruse su kukci

- 94% (približno) su Arthropoda ili člankonošci

- 6% (približno) su nematode

- oko 99% svih Arthropoda čine insekti

- više od 70% insekata pripadaju redu Homoptera ili

jednokrilaca; tu pripadaju najvažniji vektori virusa

Aphididae (lisne uši)

Lisne uši sišu sok (najčešće iz lišća zaraženih biljaka) i prenose viruse na tri načina:

1. perzistentno prenošenje:

Virusi koji se prenose perzistentno ili cirkulativno imaju sljedeća obilježja:

- što stjecanje virusa (sisanje staničnog soka s virusima) duže traje (na pr. 6-12 sati) mogućnost prenošenja je veća

- insekt ne može odmah nakon uzimanja virusa “obaviti” prijenos na zdrave biljke jer postoji latentni period (12 sati i duže)

- nakon latentnog perioda insekt tijekom dužeg vremena predstavlja izvor zaraze, a pojedini su to za cijelog života

- perzistentni virus ostaje u insektu u svim stadijima njegovog razvoja (trensstadijalni prijenos)

2. Neperzistentno prenošenje

Virusi koji se prenose neperzistentno su najčešći u prirodi i imaju veliko gospodarsko značenje; karakteristike ovih virusa su:

- Virus ulazi u tijelo insekta za vrijeme hranjenja, vrijeme “uzimanja” virusa je kratko, od nekoliko sekundi do nekoliko minuta (faza stjecanja virusa)

- Virus se na zdravu biljku može prenijeti odmah (faza inokulacije virusa)

- Insekt za kratko vrijeme (obično tijekom 4 sata) nakon napuštanja zaražene biljke prestaje biti nosilac virusa

3. Semiperzistentno prenošenje

Virusi ove skupine se nalaze između perzistentnih i neperzistentnih virusa.

Oni su neperzistentni jer ne cirkuliraju u svom vektoru, ali insekt-vektor zadržava sposobnost prenošenja virusa tijekom 3-4 dana.

Zajedničko semiperzistentnim i perzistentnim virusima je to što se nalaze u floemu biljke.

Neki virusi iz sve tri grupe mogu biti prenešeni lisnim ušima samo ako je biljka zaražena drugim, i to određenim virusom. Taj drugi virus zove se virus pomagač. Na pr. za aukuba mozaik krumpira vektor je lisna uš Myzus persicae, virusi pomagači mogu biti A ili Y virus krumpira, a način prenošenja je neperzistentan.

Tab. Važniji biljni virusi i način prenošenja

Virus Vektor Prenošenje

Virus žute patuljavosti

ječma

Rapalosiphum padi i dr.

lisne uši

perzistentno

Virus žutog mozaika

ječma

Polymyxa graminis -

Virus rizomanije š.

repe

Polymyxa betae -

Virus nekrotične žutice

salate

Hyperomyzus lactucae perzistentno

Virus žutice š. repe Myzus persicae semiperzistentno

Virus sterilnosti zobi Javesella pellucida

(cvrčak)

perzistentno

Virus europske

prugavosti žita

Javesella pellucida

(cvrčak)

perzistentno

Virus Vektor Prenošenje

Virus mozaika soje Aphis fabae i dr. uši neperzistentan

Virus mozaika

cvjetače

Myzus persicae neperzistentan

Virus mozaika

krastavca

više vrsta lisnih uši neperzistentan

Virus mozaika lucerne Acyrthosiphon pisum neperzistentan

Virus točkastog

venuća rajčice

Frankiniella fusca i dr.

(trips)

perzistentno

Virus uvijenosti lišća

krumpira

Myzus persicae perzistentno

Virus crtičavosti

duhana

tripsi -

A virus krumpira Myzus persicae

Macrosiphum euphorbiae

neperzistentno

Virus žute kržljavosti

krumpira

Agallia constricta perzistentno

Viruse mogu prenositi također:

- cvrčci (virus kovrčavosti vrha šećerne repe, virus mozaik

kukuruza)

- štitasti moljci (neke važne bolesti bilja u tropskom i

suptropskom području)

- kornjaši (poznato je da Coleoptera mogu prenjeti više od

40 različitih virusa)

- nematode (rodovi Trichodorus i Paratrichodorus prenose

šuštavost lista duhana, Longidorus prenose virus

prstenaste pjegavosti maline, Xiphinema prenosi viruse:

mozaik gušarke, lepezavost lista vinove loze, prstenastu

pjegavost duhana)

- neke gljive stanovnici tla (Olpidium brassicae prenosi

virus nekroze duhana, Polymyxa graminis virus

prugastog mozaika pšenice)

Sjeme je često prenosilac virusa:

Sjemenom krastavca – virus pjegavosti mozaika krastavca

rajčice – virus mozaika rajčice

ječma – virus crtičavog mozaika ječma

soje – virus mozaika soje

lobode – virus mozaika gušarke

mišjakinje – virus mozaika krastavca

Virusi se mogu prenositi vegetativnim dijelovima biljaka koji

se koriste za propagaciju (lukovice, reznice, gomolji i

dr.) osobito kod ukrasnog bilja i voćaka.

Vilina kosica je također vektor virusa, ali taj način nema

gospodarsku važnost.

Simptomi kod virusnih zaraza

1. Vanjski simptomi (vidljivi golim okom)

Mogu biti karkateristični za pojedine viruse i mogu služiti za

identifikaciju virusa

a) lokalni, u pravilu na mjestu ulaska virusa u tkivo (lokalne

lezije):

- klorotične lokalne lezije: promijena normalne zelene boje

zbog manjeg broja kloroplasta ili gubitka klorofila

http://www.dias.kvl.dk/Plantvirology/esy

mptoms/symp-color.html

- nekrotične lokalne lezije: odumrle stanice najčešće

različitog intenziteta smeđe boje, često su okružene

klorotičnom zonom

http://www.dias.kvl.dk/Plantvirology/esymptoms/symp-color.html

b) sistemični, u pravilu na mlađem lišću, a nastaju zbog

opće infekcije kada se virus od mjesta primarne infekcije

(najčešće lišća) proširi na manje više čitavu biljku

Beet yellow virus http://www.bayercropscience.co.uk/pestspotter_new.aspx

- sistemični simptomi promjene boje (kloroza):

gubitak zelene boje i pojava žute, crvene ili ljubičastocrvene

boje. Javlja se kao prosvjetljavanje lisnih žila, mozaik,

pjegavost, šarenilo, žutica, crtičavost, šarenilo plodova,

cvjetova, sjemena

http://www.dias.kvl.dk/Plantvirology/esymptoms/symp-color.html

http://www.biologie.uni-hamburg.de/b-

online/e35/symptome.htm

http://www.dias.kvl.dk/Plantvirology/esy

mptoms/symp-color.html

- Sistemični simptomi zbog histopatoloških promjena,

uzrokovani su zbog poremećaja u djeljenju stanica, rastu

stanica, zbog tvorbe novog tkiva, preobrazbe jedne vrste

tkiva u drugu, smrti stanica i dr.

Hiperplazija je uzrok enacija (izrasline na listu) i tumora;

odebljanja (mesnatosti) plojke, naboranost, lepezavost,

nitavost lišća, zastoj u porastu.

Promjene u veličini stanica (hipertrofija, hipoplazija).

Preobrazba, najčešće parenhima u meristem je obrambeni

mehanizam biljke, jer novonastali meristem (sekundarni

meristem) oko nekrotiziranog tkiva stvara pluto čime se

sprječava širenje virusa.

Nekroza (smrt stanica) ponekada nastupa takko brzo da je

onemogućeno širenje virusa od mjesta infekcije

(obrambena reakcija, hipersenzitivne biljke).

Virus mozaika duhana na rajčici

http://www.agroatlas.ru/en/content/diseases/Lycopersici/Lycopersici_Tobacco_mosaic_virus/

- Sistemični simptomi zbog patomorfoloških promjena,

najuočljiviji su a posljedica su histopatololških promjena:

morfološke promjene korijena, stabljika, lista, cvijeta,

ploda.

Rizomanija

http://www.biobio.es/plagas/bacteriasyvirus/

rizomania.htm

Virus lepezavosti lista vinove loze

http://ucdnema.ucdavis.edu/imagemap/nemmap/Ent156html/

204NEM/PRGRAPE.htm

Virus lepezavosti lista vinove loze http://ucdnema.ucdavis.edu/imagemap/nemmap/Ent156html/204

NEM/PRGRAPE.htm

Virus uvijenosti lista krumpira

2. Unutarnji simptomi (ne vide se bez mikrsokopiranja)

- anatomske promjene vezane su za unutrašnju građu

biljke i često su značajno povezane s histopatološkim

promjenama (hiperplazija, neoplazme).

- virusne stanične inkluzije su nakupine virusnih čestica (u

citoplazmi ili jezgri) koje se razlikuju od ostalih staničnih

struktura. Oblik i sastav virusnih inkluzija jako varira,

neke su vrlo karakteristične pa služe za identifikaciju

virusa.

Virusne infekcije i širenje virusa u biljci

- biljni virusi ne mogu biti adsorbirani na površinu stanice

domaćina

- biljni virusi ulaze u stanice domaćina kroz rane na stjenci

epidermalnog staničja ili kroz ektodezme (sustav pora u

celuloznoj građi stanične stijenke)

- od mjesta infekcije (lokalna infekcija) virusi se dalje šire

putem plazmodezmi ili kroz provodni sustav biljke, kada

se prošire po cjeloj biljci nastaje sistemična ili opća

infekcija

- plazmodezmama se virusi šire od jedne do druge stanice

- provodnim sustavom se šire na veće udaljenosti

- u provodni sustav virusi “ulaze” zajedno s asimilatima

- kada dospije u neki biljni organ virus “izlazi” iz provodnih

elemenata i “ulazi” u parenhim a zatim se dalje širi od

stanice do stanice plazmodezmama

- izlaženje virusa iz provodnih elemenata i ulazak u

meristem omogućuju posebni tzv. virusni transportni

proteini

- brzina širenje virusa je razčičita, na pr. virus mozaika

duhana u nekim biljkama “putuje” do 8 cm na sat

Utjecaj vanjskih čimbenika

1. Krajnja točka razrjeđenja virusa

je najmanje razrjeđenje infekcioznog soka kojim se

može mehanički zaraziti pokusna biljka. Kreće se 10-1-

10-7

- Ovisi o: a) infekcioznosti virusa

b) koncetraciji virusa u soku

c) vrsta tekućine za razrjeđivanje

d)vrsta biljke iz koje je uzet sok

e) vrsta biljke koja se inficira

f) način inokulacije

2. Termalna točka inokulacije virusa

je najniža temperatura na kojoj virus gubi infekcioznost u

soku i to tijekom 10 min.

Termalna točka inaktivacije ovisi o navedenim elementima.

Kreće se od 45-93 C°, najčešće između 55 i 70 C°.

3. Postojanost in vitro

Je najdulje vrijeme u kojem virus u soku na sobnoj

temperaturi još zadržava infekcioznost. Kreće se od 12

do više mjeseci.

Inaktivirati virusne čestice mogu:

a) Fizikalni inaktivatori

- ultrazvučne vibracije

- ionizirajuće zračenje (X, γ,ß zrake, α čestice, protoni,

deutroni)

- neionizirajuće zračenje (UV zrake dužine 254 nm)

b) Fizikalnokemijski inaktivatori

- zagrijavanje

- zamrzavanje, odmrzavanje, isušivanje

- pH

c) Kemijski i biokemijski inaktivatori

- organska otapala

- nitritna kiselina, formaldehid

- oksidirajuća sredstva

- tanini enzimi (proteolitički enzimi)

- antitjela (protutjela)

Ekologija i

epidemiologija

(Juretić, 2002.)

Mjere suzbijanja:

1. uklanjanje izvora zaraze:

- korovne biljke

- zaražene uzgajane biljke

- ostatci prethodnog usjeva

- plodored

- higijenske mjere u zatvorenim prostorima

- uporaba bezvirusnog sjemena i sadnog materijala

2. Suzbijanje vektora

- kemijsko

- fizičko

- biološko

3. Uzgoj otpornih kultivara

Taksonomija/klasifikacija biljnih virusa

Od 1993. Međunarodni komitet za taksonomiju virusa

prihvatio je novu klasifikaciju biljnih virusa. Oni su

svrstani u redove (order) sufiks je – virales, porodice

(familia), sufiks je – viridae i rodove, sufiks je – virus.

U bilnoj virologiji je za sada jedan red (Mononegavirales) s

dvije porodice (Rhabdoviridae i Bunyaviridae). Druge

porodice (ima ih ustanovljenih 10) su izvan redova.

Za sada svi rodovi nisu svrstani u porodice. Izvan porodica

su 22 roda.

Virusi se dijele na RNK i DNK viruse (jedno ili dvospiralne,

+ i – nukleinska kiselina oblika čestica).

Pregled navažnijih rodova virusa (Agrios, 1997.,

Juretić, 2002.)

RNK (jednospiralna, poz. RNK)

1. Štapičaste čestice – oko 32 virusa

Rod: Tobakovirus (virus mozaika duhana, TMV)

Furovirus (virus nekrotičnog žučenja žila š. repe, ---)

Hodeivirus (virus prugastog mozaika ječma, BSMV)

2. Končaste čestice – oko 280 virusa

Rod: Potexvirus (virus mozaika krumpira, X-virus, PVX)

Potyvirus (virus crtičavosti krumpira, y- virus, PVY)

(virus mozaične kržljavosti kukuruza, MDMV)

(virus šarke šljive, Plum Pox virus)

(virus mozaika šećerne repe, BMV)

(virus crtičavog mozaika pšenice, WSMV)

(virus mozaika soje, SMV)

Closterovirus (virus žutice šećerne repe, BYV)

3. izometrične čestice – oko 165 virusa

Rod: Tambusvirus (virus grmolike kržljavosti rajčice, TBSV)

Nekrovirus (virus nekroze duhana, TNV)

Luteovirus (virus žute patuljavosti ječma, BYDV)

(virus uvijenosti lišća krumpira, PLPL)

Comovirus (virus šarenila crvene djeteline, RcMV)

Nepovirus (virus prstenaste pjegavosti duhana, TRsV)

(virus infektivne degeneracije vinove loze:

lepezavost lista, GFLV, uvijenost lista, GFLV)

Cucumovirus (virus mozaika krastavca, CMV)

Alfamovirus (virus mozaika lucerne AMV)

RNK (jednospiralna, neg. RNK) Rod:Nucleorhabdovirus (virus žite kržljavosti krumpira,

PYDV)

DNK virusi (jednospiralna, standardna DNK) porodica: Genuiniviridae (neimenovani rod)

I podskupina – vektori su cvrčci (virus crtičavosti kukuruza,

MSV), domaćini monokotiledone vrste

II podskupina – virus kovrčavosti vrha šećerne repe, BCTV –

ne prenosi se cvrčcima

virus uvijenosti lišća rajčice (TLRV) domaćini

su dikotiledone vrste

III podskupina – vektori su bijele uši (Bemisia sp. – ne

isključivo)

viruskovrčavosti lista duhana -TLCV

Bakteriologija

- do danas je opisano oko 300 vrsta fitopatogenih

bakterija izoliranih s više od 1000 billjnih vrsta (prirodni

domaćini)

- umjetnim infekcijama zaraženo je daleko više biljaka

(nisu prirodni domaćini)

- iako su kao uzročnici bolesti (možda) manje značajne niti

do danas nije potpuno riješeno njihovo suzbijanje

- neke fitopatogene bakterije uzrokuju značajne gubitke

(Erwinia amylovora, Pseudomonas syringae pv. tabaci,

Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Clavibacter

michiganense pv. sepedonicum, Clavibacter

michiganensis subsp. michiganensis i dr.)

- 1877. god. Burill je prvi utvrdio bakteriku kao uzročnika

bolesti: Erwinia amylovora (bakterijska plamenjača

jabuka i krušaka)

- U proučavanju biljnih bakterija veliki značaj imaju radovi

Erwina Smitha (1854.-1927.) kasnije i drugi Elliott,

Dowson, Gorlenka, Izrailjskij

- Povijesni razvoj biljne bakteriologije može se podijeliti u

pet faza (Tešić, 1962. cit. Arsenijević 1988.):

1. 1882.-1901. god. postavljene su znanstvene osnove

proučavanja fitopatogenih bakterija. Smith, koji se

smatra utemeljiteljem fitobakteriologije, je opisao

nekoliko fitopatogenih bakterija i razradio metode

proučavanja.

2. 1901.-1921. god., značajan broj istraživanja o

bakterijama kao uzročnicima bolesti biljaka. Posebno su

značajna djela Stitha “Bacteria in relation to plant

diseases” i “An introduction to bacterial diseases of

plants”.

3. 1921.-1942. god., proučava se povezanost bakterija s

drugim bakterijama i njihovom mjestu u sistematici

mikroorganizama

4. 1942.-1962. god., istraživanja koja su omogućila

spoznaje o porijeklu i karakteristikama fitopatogenih

bakterija i zajedničkoj klasifikaciji s drugim bakterijama

5. 1962.-1980. god., proučavaju se suodnosi između

parazita i domaćina, fiziološki i biokemijski procesi u

bolesnim biljkama kao i u fitopatogenim bakterijama,

otkrivene su hipersenzitivne redukcije i dr.

Nakon 1980. god. Započinje novo (šesta faza?) razdoblje:

istražuju se nove bakterijske bolesti i njihovi uzročnici,

usvaja se nova nomenklatura, sistematika, uvodi se

patovar - pv. (patogeni varijetet) kao novi takson, nove

metode i tehnike laboratorijskog rada i td.

Evolucija fitopatogenih bakterija

- prve fitopatogene bakterije bile su saprofiti

- vode porijeklo od:

a) zemljišne i rizosferne mikropopulacije

b) epifitne mikropopulacije nadzemnih (zelenih) dijelova

biljaka i sjemena

- nemaju jednog zajedničkog pretka

- prijelaz od saprofitizma u parazitizam je vrlo dugi

evolucijski proces, smatra se da je tekao kroz nekoliko

razvojnih faza: autotrofne bakterije saprofiti

simbionti paraziti

- u tijeku evolucije od saprofita do parazita bile su nužne

neke kvalitativne promjene koje se odnose na način

korištenja hrane, osobito je važna promjena u

enzimatskom sastavu saprofitnih bakterija

- bilo je i drugih procesa kao na pr. mutacije, hibridizacije

Karakteristike fitopatogenih bakterija

- fitopatogene bakterije (phyton=biljke, pathos=bolest,

genein= izazivati, rađati) uzrokuju u biljnom tkivu

patološke promjene koje se manifestiraju simptomima

- fitopatogene bakterije su jednostanični, heterotrofni

mikroorganizmi

- vide se pod običnim svjetlosnim mikroskopom, pod

elektronskim mikroskopom vidljiva je fina struktura

bakterijske stanice kao i broj i lokacije flagela

- sve fitopatogene bakterije su štapičaste (osim

Streptomyces koje su nitaste (končaste)), mogu biti bez

flagela (atrihe), s jednom flagelom (monotrihe), s više

flagela na jednom polu (lofotrihe), s više flagela na oba

pola (amfitrihe), oko cijele stanice (peritrihe)

- flagele omogućuju kretanje bakterija

http://ncse.com/creationism/analysis/molecular-machines

monotrihe

lofotrihe

amfitrihe

peritrihe

- razmnožavanje bakterija je nespolno, običnom diobom,

od jedne stanice nastaju dvije nove, smatra se da

tijekom 24 sata od jedne stanice nastaje 17 milijuna

novih bakterija

- krajem 40-tih godina 20. stoljeća elektronskim

mikroskopom utvrđeno je spolno razmnožavanje kod

vrste Escherihia coli i Agrobacterium tumefaciens,

spolno razmnožavanje je iznimno rijetko

- veličina fitopatogenih bakterija: 0,5-4,5 x 0,3-0,6 µm

- većina, oko 90%, fitopatogenih bakterija su Gram-

negativne, a samo oko 10% Gram-pozitivne

- fitopatogene bakterije su asporogene

- bakterijska stanica sastoji se od citoplazme i nukleusa

(jezgre) te inkluzija (vjerojatno rezervne tvari kao lipidi i

zrnca škroba) sadržaj stanice okružene je

citoplazmatičnom i zatim čvrstom staničnom opnom

- veliki broj bakterija okružen je sluzastim ovojem ili

kapsulom koji štiti bakterije od nepovoljnih vanjskih

utjecaja, kapsula je značajna i pri serološkim analizama

- enzimi fitopatogenih bakterija su vrlo značajni jer

omogućuju razgradnju organskih tvari (uzimanje hrane)

- ishrana se obavlja apsorpcijom – odnosno osmozom

kroz polupropusnu citoplazmatičnu opnu

Specijalizacija fitopatogenih bakterija

- s obzirom na krug domaćina fitopatogene bakterije dijele

se na: monofagne parazitiraju jednu biljnu vrstu ili vrste

jednog roda, polifagne, parazitiraju veliki (vrlo veliki) broj

biljnih vrsta iz botanički udaljenih porodica i redova.

- monofag most ili polifag most je nastala tijekom evolucije

pojednih bakterija

- jedna polifagna vrsta bakterije koja je morfološki i

biokemijski jedna cjelina i koja parazitira veliki broj biljnih

vrsta (na pr. Pseudomonas syringae ili P. solanacearum

ili Erwinia carotovora) nije jedinstvena u fitopatogenoj

aktivnosti. Očito postoje niže taksonomske jedinice kao:

varijeteti, rase, patotipovi i sl.

- nomenklatura u fitobakteriologiji je složenija i često

neusaglašena u odnosu na mikologiju

- f. sp. (forma specialis) znači nejednaku patogenost koju

bakterija ima prema biljnoj vrsti i podudara se s

“varijetet”, što je česta taksonomsk ajedinica kod

fitopatogenih bakterija

- uvođenjem “patogeni varijetet – patovar, pv.” (Dye i sur

1980.) bakterije s istim ili sličnim morfološkim,

kulturalnim i biokemijskim karkateristikama ali s

različitom patogenosti prema različitim domaćinima

označavaju se kao pv. Najčešće nazivi vrsta

fitopatogenih bakterija svode se na patogeni varijetet.

- fiziološke rase (paototipovi) i sojevi još su nedovoljno

razjašnjeni

- serološke grupe ili serološki tipovi (serotype) označavaju

nejednaku antigenu strukturu

- tipovi bakterijskih kolonija (colony type) označavaju

razlike i u morfološkom pogledu (boja, konzinstencija) uz

razlike u patogenosti

Sistematika (Agrios, 1997.)

Carstvo: Prokarioti, Bakterije

Odjel: Gram-negativne bakterije

Porodica: Enterobacteriaceae

Rod: Erwinia (bakterijska plamenjača jabuka i krušaka,

Stewart-ovo venuće kukuruza, vlažna trulež povrća)

Porodica: Pseudomonadaceae

Rod: Pseudomonas (brojne lisne pjegavsti, paleži, venuće,

vlažna trulež, tumori)

http://ohioline.osu.edu/b895/b895_17.html

Rod: Ralstonia (venuće biljaka porodice Solanaceae)

agroatlas.ru

courtesy of Clemson University, USDA Cooperative Extension Slide Series,

Bugwood.org

Rod: Xanthomonas (lisne pjegavosti, pjegavost plodova,

palež, venuće)

Porodica: Rizobiaceae

Rod: Agrobacterium (tumori na korijenu i vratu korijena)

Prepared by M. Bess Dicklow, UMass Extension,

Fernald Hall, University of Massachusetts

http://www.rense.com/general82

/scideb.htm

Odjel: Gram-pozitivne bakterije

Rod: Clavibacter (venuće lucerne, krumpira, rajčice)

Rod: Curtobacterium (venuće graha i drugih biljaka)

Rod: Streptomyces (krastavost gomolja krumpira)

http://microplantas.wordpress.com/2009/02/16/curtobacterium-

flaccumfaciens-pv-flaccumfaciens/judias/

Curtobacterium flaccumfaciens Streptomyces scabies

Izvori zaraze

1. Sjeme i sadni materijal (zaraza nastaje tijekom vegetacije)

a) unutarnje zaraze

- Xanthomonas campestris pv. translucens:pšenica – pljevice – sjeme

- Clavibacter michiganensis pv. michiganensis:

provodni sustav biljke - sjeme

- Erwinia carotovora pv. atroseptica: stoloni – gomolji krumpira

b) Površina sjemena i sadnog materijala

- zaraza nastaje prilikom ubiranja plodova ili sakupljanja

sjemena

c) prjevoz sjemena i sadnog materijala

- bakterije ovim putem mogu biti prenešene na velike udaljenosti

2. Biljni ostatci

- dospjevaju na površinu tla ili budu unešeni u tlo

- vitalnost bakterija u tlu ovisi o antagonističnoj

mikropopulaciji, temperaturi, vlazi, brzini razlaganja

biljnih ostataka i dr.

3. Održavanje u kukcima (kukci kao izvor zaraze)

- Erwinia stewarti prezimljuje u probavnom sustavu buhača

(Chaetocnema pulicaria)

- Psudomonas syringae pv. savastanoi prezimljuje u

maslininoj muhi (Dacus oleae)

- Erwinia carotovora pv. carotovora prezimljuje u kupusnoj

i lukovoj muhi (Hylemya brassicae, H. antiqua)

Putevi širenja fitopatogenih bakterija

Vektori (prenosioci) fitopatogenih bakterija najčešće su:

1. Ljudi – proizvođači – uzgajivači kultiviranog bilja:

uporabom zaraženog sjemena i sadnog materijala, prilikom

cjepljenja šire bakterije i navelike udaljenosti

2. Širenje različitim kukcima:

u prirodi kukci često pomažu širenju bakterija, npr. pčele,

muhe, ose. Prenošenje je mehaničko. U nekim

sličajevima bakterije se mogu održati i u kukcima (E.

stewarti – buhač). Neke bakterijske bolesti povezuju se

s nematodama, puževima golaćima pa čak i pticama (E.

amylovora – čvorci)

3. prenošenje kišnim kapima:

- Kapljice bakterijskog eksudata se rasprskavaju na veće ili

manje udaljenosti, eksudat može biti i ispran s površine

biljke. Ovaj način širenja karakteristična je za uzročnike

lisnih pjegavosti. Voda za zaljevanje, osobito u

povrćarstvu, također je put za širenje bakterija.

4. Prenošenje zračnim strujama ili vjetrom

- u širenju fitopatogenih bakterija su malo značajni

Ulazna mjesta u biljni organizam

1. Prirodni otvori

- puči (naročito uzročnici pjegavosti lišća kao

Pseudomanas syringae pv. tabaci, Clavibacter

michiganensis pv. michiganensis

- hidatode (Xanthomonas campestris)

- lenticele (na organima koji su prirodno prekriveni plutom

npr. Agrobacterium tumefaciens)

- nekutinizirani organi (kroz nektarske žljezde npr.

Erwinia amylovora)

2. Mehaničke ozljede

- nastale bilo kojim biotskim ili abiotskim čimbenikom

Nakon infekcije bakterije se dalje šire međustaničnim

prostorima (intercelularno) zahvačajući uglavnom

parenhimslo staničje.

Rjeđe bakterije ulaze u provodni sustav (traheje) kada se

šire na veće udaljensti i izazivaju traheobakterioze.

Inkubacija ovisi o vrsti bakterije, temperaturi, vlažnosti,

ishrani, svjetlu i dr. i može trajti od nekolko dana do više

mjeseci.

Erwinia amylovora 2 dana

Pseudomaonas solancerarum 4-6 dana

Clavibacter michiganensis pv. insidiosum 3-4 mj.

Utjecaj okolinskih čimbenika

Okolinski čimbenici jednako i istovremeno djeluju i na

fitopatogene bakterije i na njihove domaćine.

Gotovo nikada ne djeluje samo jedan okolinski čimbenik;

njihov utjecaj je udružen (sinergija) s drugim

čimbenicima.

1. Temperatura

- za većinu fitopatogenih bakterija je:

- optimalna temp. 20-25°C

- minimalna temp. 0-2°C

- maksimalna temp. 35-37°C

- letalna 45-47°C

Pseudomonas solanacerum: opt. 35-37°C, min. 10°C, max. 40°C

X. c. pv. malvacearum 30°C 10°C 40°C

2. Vlažnost

- Većina fitopatogenih bakterija razvija se pri visokoj vlazi. Infekcije

gotovo uopće nema bez kapi vode. Bez vlage bakterije brzo

gube vitalnost pa se zbog toga otpornost biljaka povezuje s

niskom RVZ.

3. Zračna strujanja

- raznose bolesne dijelove biljaka na relativno velike udaljenosti

- raznose bakterijski eksudat u kišnim kapima na susjedne

zdrave biljke

- pomažu “ulazak” bakterija kroz puči u biljku (zračne struje

pokreću lišće – lišće se povija - kišne kapi s bakterijskim

eksudatom dolaze do puči – “uvlačenje” bakterija u puč)

- vjetar može sniziti temperaturu zraka i time pospješiti

neke infekcije

- vjetar može ozljediti biljke i time se otvar put za infekcije

4. Svjetlo

- Velika većina bakterija osjetljiva je na direktnu sunčevu

svjetlost. Nešto su malo otpornije one vrste bakterija koje

imaju žute kolonije (karotenoidi) kao npr. Vrste roda

Xanthomonas.

Simptomi bakterioza

1. Pjegavost i nekroza

- pjegavost je najčešći simptom bakterioza, razvija se na

svim nadzemnim dijelovima i tipična je za lokalne

infekcije.

- pjege su u početku svjetlije boje (rjeđe tamnozelene) i

vlažnog izgleda (eksudat), kasnije nastupa nekroza pa

pjege postaju svjetlije ili tamnije smeđe, ponekada su

crvene ili crne

- oblik varira od okruglog do poligonalnog

- ponekada nekrotizirano tkivo “ispada”, a ponekada se

lomi

- na plodovima pjege mogu izgledati kao kraste

Pseudomonas syringae pv. aptata Pseudomonas syringae pv. lachrymans

Pseudomonas syringae pv. tabaci http://www.ces.ncsu.edu/depts/pp/notes/Vegetable/vdin018/img_pepf.htm

Xanthomonas campestris pv. vesicatoria

2. Plamenjača

- na mladim organima biljke (lišće, izboji, cvjetni pupovi)

zbog brze i nagle nekroze javlja se venuće i propadanje,

tkivo je uglavnom crne boje i vlažno (eksudat)

Erwinia amylovora

3. rak-rane

- obično se javljaju na kori izboja, grana ili stabla

- prvo se vide udubljenja u kori, a zatim se nekrotični

procesi mogu proširiti u drvenasti dio, tkivo puca,

otvaraju se rane i često se pojavljuju kapljice smole

Erwinia amylovora

4. Vlažna trulež

- pektinolitičkim enzimima neke bakterije razlažu središnju

lamelu biljnih stanica zbog čega se gubi kontinuitet

obično u parenhimu

- daljnje razlaganje nastavljaju saprofitne bakterije pa tkivo

postaje poput kaše

http://www.agroatlas.ru/en/content/diseases/Solani/Solani_Erwinia_c

arotovora_subsp_atroseptica/

http://www.omafra.gov.on.ca/IPM/english/peppers/disea

ses-and-disorders/bacterial-soft-rot.html

Erwinia carotovora pv. atroseptica

Erwinia carotovora pv. carotovora

5. Venuće

- Uzrokuju bakterijekoje naseljavaju provodni sustav biljaka,

bakterije mehanički onemogućuju normalno usvajanje i

transport vode kroz biljku. Nastaju tile (tvorevine tipa smole)

koje “začepe” provodni sustav. U nekim slučajevima u

bolesnom tkivu nastaje neka vrsta toksina koji također

uzrokuju venuće.

Clavibacter michiganensis pv. michiganensis

6. Tumori

- bakterije mogu izazvati ubrzanu diobu stanica

(hiperplazija) biljke domaćina zbog čega nastaje tumor ili

rak.

- unutrašnjost tumora može biti kompaktna kao kod A.

tumefaciens ili je unutrašnjost tumora manje-više šuplja

kao kod P. syringae pv. savastanoi

http://biomesfourth09.wikispaces.com/Tropical+Rainforest+Facts http://www.inra.fr/hyp3/pathogene/6pssysa.htm

Pseudomonas syringae pv. savastanoi Agrobacterium tumefaciens

Mjere suzbijanja

1. Preventivne mjere

- kontrola pri uvozu biljaka i biljnog matrijala

2. Agrotehničke mjere

- otporni kultivari

- zdravo sjeme i sadni materijal

- plodored (u tlu bakterije žive relativno kratko, ali ima

iznimaka, A. tumefaciens – plodored 3-4 god., X.

campestris – plodored 3-5 god.)

- pravilna gnojidba

- zaoravanje i spaljivanje zaraženih ostataka

- suzbijanje vektora bakterija

- suzbijanje korova

3. Mehaničke mjere

- uništavanje bolesnih biljaka ili bolesnih djelova

- uništavanje jako osjetljivih biljaka kao izvora zaraze

(Crategus (glog) jako osjetljiv na E. amylovora)

4. Fizičke mjere

- dezinfekcija tla vodenom parom

- potapanje sjemena u toplu vodu (X. campestris pv.

campestris 20 min – 50°C, X. campestris pv. carotae 10

min – 54°C)

5. Kemijske mjere

- vrlo ograničene mogućnosti primjene fungicida:

dezinfekcija tla, dezinfekcija sjemena i sadnog materijala