Modifikation der Enzymatischen Mutationsdetektionsmethode (EMD) zur Identifikation von Punktmutationen im PMP22-Gen

nach DNA-Isolierung aus Nerv, Muskel oder Blut

Von der Medizinischen Fakultät der Rheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen zur Erlangung des akademischen Grades einer Doktorin der

Medizin genehmigte Dissertation

vorgelegt von

Cordula Margarete Nellessen geb. Fuchs

aus

Düren

Berichter: Herr Universitätsprofessor Dr. med. J. Michael Schröder Herr Universitätsprofessor Dr.med. Johannes Noth

Tag der mündlichen Prüfung: 25. November 2003 Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothek online verfügbar

Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung

2. Mutationen im PMP22-Gen bei hereditären motorisch-sensorischen Neuropathien 2.1. Historische Entwicklung

2.2. Klinisches Erscheinungsbild

2.3. Elektrophysiologische Diagnostik

2.4. Morphologie

2.5. Differentialdiagnosen

2.6. Therapie und Prognose

3. Patientenkollektiv

4. Untersuchungsgut

5. Methoden

5.1. DNA-Extraktion aus paraffineingebetteten formalin- oder glutaraldehydfixierten Suralnerven- bzw. Muskelbiopsien

5.2. DNA-Extraktion aus Frischmaterial (Nerv, Muskel, Blut)

5.3. Polymerase-Kettenreaktion

5.4. Kapillarelektrophoretische Auftrennung der PCR-Produkte auf dem ABI

PRISM 310

5.5. Aufreinigung der PCR-Produkte

5.6. Identifikation heterozygoter Punktmutationen mit der Enzymatischen

Mutationsdetektionsmethode (Enzymatic Mutation Detection, EMD)

5.7. Automatisierte DNA-Sequenzanalyse

6. Ergebnisse

6.1. Allgemeine Anmerkungen

6.2. Ergebnisse der Methodenoptimierung

6.3. Patient Nr. 18

6.4. Untersuchung auf Mutationen im Cx32-Gen

6.5. Untersuchung auf MPZ Mutationen

6.5.1. Probe Nr. 5

6.6. Patienten Nr. V1, V18, und 44

7. Diskussion

7.1. Diskussion der Methode

7.2. Diskussion der Analyseergebnisse

7.3. Bedeutung des Polymorphismus in Probe Nr. 18

7.4. Potentielle Mutationen außerhalb des codierenden Bereichs des PMP22-Gens

7.5. Punktmutationen im P0-Gen – gemeinsamer Pathomechanismus für CMT1A und CMT1B?

7.6. Andere im Zusammenhang mit HMSN stehende Gene und Proteine

7.7. Differentialdiagnostische Überlegungen

8. Zusammenfassung

9. Literatur

10. Anhang

10.1. Sequenzen der untersuchten Exone des PMP22-Gens

10.2. Patientenkollektiv: Histologie und Klinik

10.3. Übersicht der Analyseergebnisse

11. Danksagung

1. Einleitung

Bei der hereditären motorisch-sensorischen Neuropathie (HMSN), auch Charcot-

Marie-Tooth (CMT) Krankheit genannt, handelt es sich um die häufigste erbliche

Erkrankung des peripheren Nervensystems. Dabei umfasst der Begriff HMSN eine

Gruppe genotypisch heterogener Krankheitsbilder, die in der phänotypischen

Ausprägung hervorstechende Gemeinsamkeiten zeigen. Diese sind insbesondere

eine chronisch progrediente, symmetrische Schwäche und Atrophie vornehmlich der

distalen Extremitätenmuskulatur, Sensibilitätsstörungen, eventuell auch

Fußdeformitäten und ein herabgesetztes Reflexniveau (Pareyson 1999).

Nach klinischen, morphologischen und molekulargenetischen Parametern

lassen sich die Krankheitsbilder wie folgt einteilen (nach Dyck et al. 1993; Poeck und

Hacke 1998 und http://www.neuro.wustl.edu/neuromuscular/time/hmsn.html):

• CMT1: demyelinisierende Form

• CMT2: axonale Form

• DSS: Dejerine Sottas Syndrom, schwere demyelinisierende Form

• CMT4: demyelinisierende Form (rezessiv)

• CMT5-7: mit spastischer Paraparese / Optikusatrophie / Retinitis Pigmentosa /

Taubheit

• CMTX: axonale und demyelinisierende Form (X-chromosomal)

• HNPP: hereditäre Neuropathie mit Neigung zur Drucklähmung

• CH: kongenitale Hypomyelinisationsneuropathie

In der vorliegenden Arbeit bezieht sich die Abkürzung HMSN auf die Gesamtheit der

zum Formenkreis hereditärer motorisch-sensorischer Neuropathien gehörenden

Erkrankungen. Die einzelnen Untergruppen werden mit den in der obigen

Klassifikation vorgestellten Abkürzungen bezeichnet. Angesichts der aufgeführten

Unterteilung der HMSN muss jedoch angemerkt werden, dass die klinische

Symptomatik sowie die histologischen, neurologischen und elektrophysiologischen

Untersuchungsbefunde einer großen Variationsbreite unterliegen, was sowohl die

exakte Klassifikation als auch die Diagnosestellung erschwert. Große Bedeutung ist

in dieser Hinsicht der molekulargenetischen Analyse beizumessen: Mit ihr ist es

möglich, einem Teil der Krankheitsbilder konkrete Mutationen zuzuordnen und somit

1

Klassifikation und Diagnostik zu erleichtern. Bis heute ist für siebzehn Gene eine

Assoziation mit HMSN bekannt. Auf fünf dieser Gene, deren Veränderungen im

kausalpathogenetischen Zusammenhang mit den häufigsten Formen der HMSN

stehen, soll kurz eingegangen werden (http://molgen-www.uia.ac.be/CMTMutations/):

Das PMP22-Gen auf Chromosom 17p11.2 kodiert für ein

Transmembranprotein der Myelinscheiden peripherer Nerven. Eine Duplikation

dieses Gens liegt in bis zu 80% der Fälle dem Phänotyp der CMT1 Krankheit

zugrunde, wohingegen eine Deletion zur HNPP-Erkrankung führt. Für beide

Erkrankungen sowie CH und DSS wurden darüber hinaus Punktmutationen des

PMP22-Gens beschrieben. Das MPZ-Gen auf Chromosom 1q22 kodiert für das

Myelinprotein Zero (MPZ), welches mit 50% den größten Teil der Myelinproteine

peripherer Markscheiden ausmacht und dort als transmembranöses

Adhäsionsmolekül fungiert. Mutationen dieses Gens sind assoziiert mit den

Erkrankungen CMT1, DSS, CH und CMT2. Darüber hinaus konnten das EGR2-Gen

auf Chromosom 10q21 als ursächlich für CMT1, CH und DSS sowie das LITAF-Gen

auf Chromosom 16p13 als ursächlich für CMT1 identifiziert werden. In den aktuellen

Klassifikationen bezeichnet man den PMP22-assoziierten Typ der CMT1 als CMT1A,

den MPZ-assoziierten Typ als CMT1B, den LITAF-assoziierten Typ als CMT1C und

den EGR2-assoziierten Typ als CMT1D. Schließlich existiert neben den autosomalen

Erbgängen auch ein X-chromosomaler Vererbungsmodus, nämlich durch das Cx32-

Gen auf Chromosom Xq13. Mutationen in diesem für ein Gap Junction Protein

kodierenden Gen finden sich bei an CMTX erkrankten Patienten.

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Etablierung und Optimierung eines

effizienten und zuverlässigen Screeningverfahrens für heterozygote Punktmutationen

im PMP22-Gen. Aufbauend auf diesen Ergebnissen konnte ein ausgewähltes

Patientenkollektiv, welches die Krankheitsbilder CMT1, HNPP, DSS und CH umfasst,

auf bisher unbekannte Punktmutationen im PMP22-Gen untersucht werden.

Bezüglich der erstgenannten Erkrankungen wurde im Vorfeld eine Duplikation oder

Deletion ausgeschlossen. So gelangte Patientengut zur Analyse, dessen

molekulargenetische Untersuchung und damit die eindeutige diagnostische

Zuordnung noch nicht abgeschlossen waren. Während die Identifikation der

Duplikation oder Deletion des PMP22-Gens mittlerweile zur molekulardiagnostischen

Routine gehört, wird die Suche nach Punktmutationen bisher nur an einigen Zentren,

vornehmlich unter Forschungsaspekten, durchgeführt. Auf dem Hintergrund eines

2

täglich wachsenden Wissens um molekulargenetische Erkrankungsmechanismen ist

es jedoch notwendig, auch in der Routinediagnostik schnell, effizient und präzise ein

umfassendes Mutationsscreening durchzuführen. Die in dieser Arbeit vorgestellte

Vorgehensweise soll hierfür ein Beispiel sein. Sie ermöglicht nicht nur eine weitere

Einengung der diagnostischen Lücke in Fällen unklarer HMSN-Erkrankungen,

sondern auch eine differenzierte humangenetische Beratung der betroffenen

Familien. Darüber hinaus kann das zunehmende Wissen um die Art der Schädigung

des PMP22-Gens in Korrelation zum klinischen Erscheinungsbild zu einem tieferen

Verständnis von der Funktion des Proteins und dem eigentlichen Pathomechanismus

der Erkrankung verhelfen. Nicht zuletzt ist die Kenntnis dieser Aspekte Fundament

für eine eventuell in Zukunft mögliche Gentherapie, die bis heute für diese Patienten

die einzige Chance auf eine kausale Behandlung ihres Leidens darstellt.

3

2. Mutationen im PMP22-Gen bei hereditären motorisch-sensorischen Neuropathien

2.1. Historische Entwicklung

Erstbeschreiber der Erkrankung: Erste Veröffentlichungen zu einem Krankheitsbild,

welches die typischen Charakteristika der HMSN zeigt, finden sich bereits Mitte des

19. Jahrhunderts. Berühmte Ärzte wie Virchow (1855), Aran (1855), Eulenberg

(1856) und Friedreich (1873) beschrieben zu dieser Zeit Krankheitsfälle, die durch

eine fortschreitende distale Muskelatrophie gekennzeichnet waren (Pearce 2000,

http://www.ultranet.com/~smith/history.html).

Im Februar 1886 veröffentlichten Jean–Martin Charcot (1825-1893) und sein

Schüler Pierre Marie (1853-1940) unter dem Titel: « Sur une forme particulière

d'atrophie musculaire progressive, souvent familiale, débutant par les pieds et les

jambes et atteignant plus tard les mains » die Beschreibung eines Krankheitsbildes,

welches sie an fünf Kindern im Hôpital de la Salpétrière zu Paris studiert hatten

(Charcot et al. 1886). Nahezu zeitgleich vollendete Howard Tooth (1856-1926) eine

Arbeit an der Cambridge University in England zum Thema «The Peroneal Type of

Progressive Muscular Atrophy» (Tooth 1886). Als typische Charakteristika führten

alle drei Autoren den frühen Erkrankungsbeginn, die fortschreitende Schwächung

und Atrophie der distalen Beinmuskulatur mit späterer Ausdehnung auf die obere

Extremität und das mögliche Auftreten von Hohlfußdeformitäten sowie

Sensibilitätsstörungen an.

Während Charcot und Marie von einer muskulären Ursache ausgingen,

lokalisierte Tooth den Krankheitsursprung korrekter Weise im Bereich der peronealen

Nerven (Pearce 2000). In Reminiszenz an die drei berühmten Ärzte des 19.

Jahrhunderts ging die von ihnen beschriebene Erkrankung als Charcot-Marie-Tooth

Krankheit in die Nosologie ein. In früheren Artikeln wird man jedoch noch auf die

damalige Bezeichnung PMA für Progressive / Peroneal Muscular Atrophy stoßen,

wohingegen heute oft auch das Synonym HMSN (Hereditäre motorisch-sensorische

Neuropathie) verwendet wird.

1893 beschrieben Dejerine und Sottas in Frankreich die Krankengeschichte

zweier Geschwister, die unter einer von ihnen als interstitielle hypertrophische

Neuritis bezeichneten schwerwiegenden Muskelatrophie litten (Dejerine und Sottas

4

1893). Diese Erkrankungsform wurde als hypertrophische Neuropathie oder Dejerine

Sottas Erkrankung als eigenständige Entität von der CMT Krankheit abgegrenzt.

Eine weitere Form peronealer Muskelatrophie, welche mit Tremor, Ataxie,

Pyramidenbahnzeichen und Optikusatrophie einhergeht, wurde 1926 nach den

Erstbeschreibern Roussy-Lévy-Syndrom genannt (Roussy und Lévy 1926).

Im 20. Jahrhundert bemühte man sich, die bis dahin unabhängig voneinander

veröffentlichten Syndrome und Erkrankungen des Formenkreises der „PMA“ in einer

Klassifikation zusammenzufassen; ein erster Versuche erfolgte 1927 durch

Dawidenkow. Diese Bemühungen konnten in der Mitte des 20. Jahrhunderts

entschieden verbessert und präzisiert werden durch das Aufkommen

elektrophysiologischer Messmethoden an Nerv und Muskel sowie der

Elektronenmikroskopie. So unterschieden Dyck und Lambert 1968 erstmalig anhand

von physiologischen und morphologischen Merkmalen zwei Hauptgruppen unter den

hereditären motorisch-sensorischen Neuropathien (Dyck und Lambert 1968a; Dyck

und Lambert 1968b). Zur ersten Gruppe, CMT1, gehörten Patienten, deren

Nervenbiopsien histologisch auffällige Zeichen segmentaler De- und

Remyelinisierungsprozesse aufwiesen. Die offensichtlich gestörte Myelinisierung

führte bei diesen Patienten zur Ausbildung charakteristischer

Zwiebelschalenformationen; hierbei handelt es sich um konzentrisch um das Axon

angeordnete Schwannzellfortsätze. Die unzureichende Myelinisierung der Nerven

drückte sich bei diesem Patientenkollektiv darüber hinaus in elektrophysiologischen

Untersuchungsbefunden aus, die pathologisch verlangsamte

Nervenleitgeschwindigkeiten (NLG) zeigten. Folglich wurde diese Entität auch als

demyelinisierende Form bezeichnet. Im Gegensatz hierzu zeigt die axonale Form,

CMT2, in der Biopsie hauptsächlich Veränderungen der Axone wie z.B. Ausfall und

Atrophie von Nervenfasern oder auch Regenerationsgruppen, jedoch gibt es kaum

Zeichen einer Demyelinisation. Zwiebelschalenformationen kommen folglich bei

dieser Patientengruppe nicht vor. Die Nervenleitgeschwindigkeit ist nicht oder nur

geringfügig verlangsamt.

Neue Horizonte für die HMSN-Forschung öffneten sich in den 70er Jahren des

20. Jahrhunderts, als man begann, verstärkt die genetischen Grundlagen der

Erkrankung zu betrachten. Schon die Erstbeschreiber hatten Erblichkeit vermutet.

Fallbeschreibungen ließen sowohl dominante als auch rezessive, autosomale wie

gonosomale Vererbungsmodi möglich erscheinen – was erneut die außerordentliche

5

Heterogenität der HMSN, nicht nur in der klinischen Ausprägung, sondern auch im

molekulargenetischen Korrelat, unterstreicht. So erweiterte Dyck seine Klassifikation

1975 unter Berücksichtigung von Klinik und Vererbungsmodus auf 7 Untergruppen

(siehe Einleitung).

Entdeckung des PMP22-Gens im Zusammenhang mit CMT1: Im Jahre 1989

konnten Vance und Kollegen erstmalig aufzeigen, dass bei CMT1-Familien eine

Kopplung der Erkrankung zum Chromosom 17p11.2-12 besteht (Vance et al. 1989).

Ein weiterer entscheidender Durchbruch gelang, als man eine Tandemduplikation auf

dem Chromosom 17p11.2-12 durch positionelle Clonierung identifizieren konnte

(Raeymaekers et al. 1991; Lupski et al. 1991). Der duplizierte Abschnitt in der Größe

von etwa 1,5 Megabasen umfasst eine Distanz von 6 CentiMorgan (Raeymaekers et

al. 1991). Neben der autosomal dominanten Vererbung kommt es nicht selten zu

einem de novo Ereignis der Tandemduplikation. Dieses findet zu 90 % während der

väterlichen Spermatogenese statt. So konnte für Familien, bei denen zunächst ein

rezessiver Erbgang vermutet worden war, die Erkrankung auf eine de novo Mutation

zurückgeführt werden (Keller und Chance 1999).

Die Identifikation der Duplikation warf weitere Fragen auf: Welches Gen bzw.

welche Gene sind in dieses Ereignis involviert und welche molekularen

Mechanismen führen schließlich zur Ausprägung des CMT1 Phänotyps? Werden

Gene im Bereich der Bruchstellen frakturiert und damit unwirksam oder liegt der

Erkrankung eher ein Gendosiseffekt zugrunde? Hinweise für letztere Vermutung

lieferte die Betrachtung von Patienten, die eine totale oder partielle Trisomie für das

Chromosom 17p trugen und unter anderem ähnliche Symptome wie CMT1A

Patienten zeigten (Chance et al. 1992). Entscheidende weiterführende Erkenntnisse

brachte schließlich die Betrachtung der Tiermodelle für CMT1: die Trembler Maus

(Tr) und die Trembler j Maus (Tr j). Beide zeigen CMT-ähnliche Symptome, beide

tragen Punktmutationen in den transmembranösen Domänen des PMP22-Gens auf

dem murinen Chromosom 11 (Tr: G150→D, Tr j L16→P) (Suter et al. 1992a; Suter et

al. 1992b). Da diese Region synthän zum humanen Chromosom 17p ist, gelang es

Patel et al. (1992) den homologen Genort auf Chromosom 17p12-p11.2 zu

identifizieren. Die Arbeitsgruppe konnte des Weiteren zeigen, dass bei Trägern der

Tandemduplikation eben jenes Gen stark exprimiert und daher in verdoppelter und

nicht in frakturierter Form vorliegen muss; somit war ein weiterer Hinweis für einen

Gendosiseffekt gefunden.

6

Die Sequenz des PMP22-Gens wird im

Abstand von ca. 1,5 Mb von zwei sehr

ähnlichen repetitiven Sequenzen flankiert, den

sogenannten proximalen und distalen CMT1A-

REP. Diese Tatsache prädestiniert für die

Tandemduplikation durch ein ungleiches

nichthomologes Crossing-over, aus dem zwei

reziproke Mutationen resultieren: Eine das

PMP22-Gen umfassende 1,5 Mb große

Deletion sowie die bei CMT1A beschriebene

Duplikation von 3 Mb, welche je die zwei

repetitiven Sequenzen, zwei PMP22-Gene

sowie zentral eine hybride Repeatsequenz

umfasst (siehe Abbildung 1).

Der beschriebene Mutations-

mechanismus ist für 76% der familiären und

53% der sporadischen Fälle verantwortlich

(Rieß und Schöls 1998a). Die Duplikation

erklärte also nicht alle Fälle von CMT1; darüber

hinaus gibt es Familien, in denen

Kopplungsanalysen zwar auf den selben

Genort 17p12-p11.2 hinweisen, bei denen

jedoch keine Duplikation vorliegt. Bereits 1992

gelang es Valentijn et al. eine Missensemutation im PMP22-Gen nachzuweisen –

faszinierender Weise dieselbe Mutation, die man bei der Trembler-J Maus identifiziert

hatte. Weitere Veröffentlichungen von Punktmutationen im PMP22-Gen bei CMT 1

Patienten folgten, so dass die Zahl bislang auf etwa zwölf gewachsen ist (Roa et al.

1993b; Fabrizi et al. 1999).

Abbildung 1: Durch ein nichthomologes Crossing-over kommt eszur Duplikation (CMT1A Phänotyp)bzw. Deletion (HNPP Phänotyp) (Rießund Schöls 1998a)

x

Deletion HNPP

Duplikation: CMT IA

Rep

PMP22

Rep

PMP22

Rep

Rep Rep

PMP22

Rep

PMP22

Rep

Rep

Das PMP22-Gen und HNPP: Durch De Jong (1947) wurde erstmals diese

durch Druckschädigung ausgelöste Neuropathie im Zusammenhang mit Migräne

beschrieben. Dyan et al. (1968) und Behse et al. (1972) betonten besonders die

globulären Verdickungen der Myelinscheiden, „Sausages“, welche dann 1975

erstmalig mit dem entsprechenden Fachterminus „Tomakula“ von Madrid und

Bradley (1975) bezeichnet wurden. Den molekularpathologischen Ursachen kam

7

man 1993 auf die Spur, als Chance et al. (1993) mit Hilfe von DNA Markern eine 1.5

Mb große Deletion auf Chromosom 17p11.2 nachweisen konnten. Die deletierte

Region umfasste nicht nur das PMP22-Gen, sondern auch sämtliche in der CMT1A-

Duplikation enthaltenen Marker. Dies legte die Vermutung nahe, dass mit der HNPP

der reziproke Phänotyp des zum CMT1A führenden Pathomechanismus gefunden

worden war. Dies wird darüber hinaus durch die Tatsache erhärtet, dass die

Bruchstellen für beide Erkrankungen im selben Intervall auf 17p11.2 liegen. Die

Häufigkeit der Deletion als Ursache für die HNPP liegt bei 86% in familiären und bei

77% in sporadischen Fällen (Rieß uns Schöls 1998a). Wie für die CMT1A sind auch

de novo Deletionen beschrieben worden (Stögbauer et al. 1998), die ebenfalls

häufiger paternalen Ursprungs sind. Auch sind im Zusammenhang mit der HNPP

zurzeit zehn Sequenzveränderungen des PMP22-Gens bekannt. Es handelt sich

meist um schwerwiegende Ereignisse, die zu komplettem Funktionsverlust bzw.

Ausfall eines Allels führen wie Frameshiftmutationen (Nicholson et al. 1994; Young et

al. 1997) oder Veränderungen der splice site (Bort et al. 1997); aber auch „einfache“

Punktmutationen sind beschrieben worden (Sahenk et al. 1998). Es ist zu vermuten,

dass die HNPP häufiger ist als allgemein angenommen wird; dies kann z.B. an der

sehr variablen, teilweise nur milden Ausprägung des Phänotyps liegen. Einige

Autoren empfehlen daher das Deletions-Screening bei jeder Art von

demyelinisierender Neuropathie ungeklärter Genese (Kumar et al. 1999).

Das PMP22-Gen und DSS: Nach der Erstbeschreibung 1893 wurde diesem

Krankheitsbild in den Mitte des 20. Jahrhunderts verstärkte Aufmerksamkeit gezollt,

mehrere Autoren beobachteten die Hypertrophische Neuropathie über bis zu 5

Generationen hinweg (Bedford und James 1956; Croft et al. 1957). Die

Beschreibungen ließen einen rezessiven autosomalen Vererbungsmodus vermuten.

Die Symptomatik ist bei DSS zwar schwerer ausgeprägt als bei CMT1, jedoch haben

beide Syndrome sehr viele Gemeinsamkeiten. Daher war es naheliegend, auch in

diesen Fällen das PMP22-Gen auf Mutationen zu untersuchen. Tatsächlich gelang

es Roa et al. (1993a) erstmals, dort - wohlgemerkt dominante - Punktmutationen

nachzuweisen. In der Folge bestätigten weitere Veröffentlichungen (bislang

mindestens 16) von sowohl dominanten als auch rezessiven Mutationen den

kausalpathogenetischen Zusammenhang zwischen Gen und Erkrankung (Marques et

al. 1998; Parman et al. 1999; Ohnishi et al. 2000). Gerade angesichts dieser

Ergebnisse wird mehr denn je diskutiert, ob es sich bei der Erkrankung tatsächlich

8

um ein eigenständiges Krankheitsbild handelt, oder ob nicht viel mehr das DSS als

extreme Form des klinisch-symptomatischen Kontinuums der CMT1-Erkrankung

anzusehen ist (Vance 2000; Keller und Chance 1999).

Das PMP22-Gen und CH: Ähnliches wird bei der Betrachtung der

kongenitalen Hypomyelinisationsneuropathie (CH) deutlich. Hier wiederum fällt

klinisch besonders die Abgrenzung zum DSS schwer. Im PMP22-Gen wurden bei CH

Patienten bisher mindestens 2 Punktmutationen gefunden (Simonati et al. 1999;

Fabrizi et al. 2001).

Funktion des Proteins und Pathomechanismus: Das PMP22-Gen codiert für

ein Transmembranprotein, welches sich in den kompakten Anteilen der

Myelinscheiden peripherer Nerven befindet (Snipes et al. 1992). Das 160

Aminosäuren umfassende Protein hat ein Molekulargewicht von 18 Kilodalton (kDA),

welches durch Glykosylierung auf 22 kDa erhöht wird (Manfioletti et al. 1990); es

durchzieht die Plasmamembran mit 4 Domänen (siehe Abbildung 2). Es macht etwa

5% des gesamten Myelins aus. Darüber hinaus

wird das Gen auch in anderen Geweben

exprimiert, zwei verschiedene Promotoren

ermöglichen die Transkription der jeweiligen

gewebsspezifischen Form (Suter et al. 1994).

Transkriptionsprodukte, die das Exon 1A

enthalten, finden sich in hohem Maße während

der Myelinbildung peripherer Nerven, während

Exon 1B enthaltende Proteine bevorzugt in nicht

neuralen Geweben wie z.B. Fibroblasten

aufzufinden sind. Die Funktionen des Proteins

und seine Interaktion mit anderen zellulären Strukturen werden zurzeit noch intensiv

beforscht, doch sind in den letzten Jahren schon einige Aspekte diesbezüglich

bekannt geworden, die für das Verständnis der HMSN von besonderem Interesse

sind. In Zellkulturen regelt PMP22 sowohl Zelltod als auch, in Abhängigkeit von der

Rho-GTPase, die Zellentfaltung (cell spreading) von Fibroblasten und Schwannzellen

(Brancolini et al. 1999; Fabbretti et al. 1995). Im Zusammenhang mit der Duplikation

bei CMT1A und der Deletion bei HNPP wurde, wie bereits erwähnt, ein Gen-Dosis-

Effekt als Pathomechanismus vermutet (Patel und Lupski 1994). Mehrere Studien

konnten die Vermutung untermauern, dass die gestörte Stöchiometrie des PMP22-

Abbildung 2: Aufbau des PMP22-Proteins (http://molgen-www.uia. ac.be/CMTMutations/)

9

Gens für die Myelinisationsstörungen der HMSN verantwortlich sein könnte (Vallat et

al. 1996; Gabriel et al. 1997; Robaglia-Schlupp et al. 2002).

Da Träger von Punktmutationen häufig schwerer betroffen sind als Träger der

Duplikation und da die meisten Mutationen in den Transmembrandomänen gefunden

wurden, wird in diesen Fällen schon länger ein „gain-of–function“ Mechanismus

vermutet (Hanemann et al. 1998). Auch das Tiermodell unterstützt diese These, da

Trembler Mäuse (PMP22-Punktmutation Tr: G150→D) wesentlich stärker betroffen

sind als Mäuse, die nur ein Allel tragen (PMP22+/-) (Adlkofer et al. 1997).

Punktmutierte Proteine, wie sie bei CMT1 und DSS vorkommen, können weder

Apoptose noch Zellwanderung und Zellformung regelrecht induzieren (Brancolini et

al. 1999). Verschiedene Arbeitsgruppen konnten zeigen, dass Wildtyp PMP22 an der

Zelloberfläche präsentiert wird, während die punktmutierten Varianten im Bereich des

endoplasmatischen Reticulums zurückgehalten wurden (D'Urso et al. 1998; Naef und

Suter 1999; Brancolini et al. 2000). Die Versuche von Brancolini et al. deuten darauf

hin, dass die Mutationen den intrazellulären Transport stören und die PMP22-

Proteine durch mangelnde Präsenz an der Zelloberfläche ihre oben beschriebenen

Funktionen nicht ausführen können. Die Arbeitsgruppe vermutet, dass gerade

fehlende Interaktion mit dem MPZ-Gen für den Pathomechanismus verantwortlich

sein könnte (Brancolini et al. 2000). Darüber hinaus ist es möglich, dass es zu

intrazellulären Wechselwirkungen von mutiertem PMP22 mit Wildtyp PMP22 oder

anderen Proteinen des endoplasmatischen Reticulums (ER), vielleicht sogar dem

MPZ-Protein, kommt und dadurch zusätzlich die Verfügbarkeit der Myelinproteine an

der Zellmembran reduziert wird (Naef et al. 1997; D'Urso et al. 1999; Tobler et al.

1999). Die enorm reduzierte myelinspezifische Genexpression könnte außerdem

erklärt werden durch eine Signaltransduktionskaskade zwischen ER und Zellkern,

welche durch die missgefalteten PMP22-Proteine induziert wird (Kamholz et al.

2000). Diverse Studien deuten darauf hin, dass die veränderte Physiologie der

Schwannzellen schließlich zu axonaler Degeneration und damit zu progredienter

Schwächung und Behinderung der betroffenen Patienten führt (Watson et al. 1994;

Sahenk 1999).

Andere involvierte Gene: Erste Kopplungsstudien zeigten in den 80er Jahren,

dass bei einem Teil der CMT1-Familien das krankheitsverursachende Gen zum Duffy

(Fy) Blutgruppenlocus auf Chromosom 1 gekoppelt war (Bird et al. 1982; Stebbins

und Conneally 1982). Anfang der 90er Jahre konnten dann Hyasaka et al. das

10

sogenannte MPZ-Gen auf Chromosom 1q22 als weiteres in die Pathogenese der

HMSN involviertes Gen identifizieren, welches für das transmembranöse

Adhäsionsmolekül Myelinprotein Zero (auch P0-Protein genannt) kodiert.

Punktmutationen in diesem Gen können zu CMT1B, welche phänotypisch kaum von

CMT1A unterscheidbar ist, zum Dejerine Sottas Syndrom oder CH führen (Hayasaka

et al. 1993a; Hayasaka et al. 1993b; Warner et al. 1996). Auch Mutationen des

EGR2-Gens, kodierend für einen Transkriptionsfaktor der Myelinogenese, bewirken

demyelinisierende Neuropathieformen wie CMT1, DSS und CH (Warner et al. 1998;

Timmerman et al. 1999).

Die Arbeitsgruppe um Street et al. identifizierte jüngst einen weiteren mit

CMT1 assoziierten Lokus auf Chromosom 16p13.1-p12.3: das „lipopolysaccharide-

induced tumor necrosis factor-alpha factor“-Gen (kurz LITAF oder SIMPLE) (Street et

al. 2002; Street et al. 2003). Die Autoren beschreiben Mutationen in drei Familien.

Das zugehörige Protein scheint eine Rolle im Proteinabbau zu spielen. Welche

Pathomechanismen zum Tragen kommen und wie häufig solche als CMT1C

klassifizierten Fälle sind, bleibt allerdings zum jetzigen Zeitpunkt noch offen.

Neben den autosomalen Erbgängen war schon lange ein X-chromosomaler

Vererbungsmodus vermutet worden. Nach Kopplungsanalysen in den achtziger

Jahren (Gal et al. 1985) konnten schließlich 1992 Bergoffen et al. Mutationen im

Cx32 Gen auf Chromosom Xq13 identifizieren (Bergoffen et al. 1993), und bis heute

ist die Zahl der beschriebenen Mutationen (über 250) beständig gewachsen

(Senderek et al. 1999; Felice und Seltzer 2000).

Abbildung 3 auf Seite 15 verdeutlicht in einer Zusammenschau einerseits den

Aufbau einer myelinisierten Nervenfaser, andererseits die Lokalisation einiger der

erwähnten Proteine in der Myelinscheide.

Für die Diagnostik ist die Kenntnis dieser involvierten Gene insofern von

Bedeutung, als bei unbekannter Familienanamnese ein CMT1 Patient ohne

Duplikation des PMP22-Gens durchaus Träger eines Defektes in einem der anderen

Gene sein kann.

11

ein

bes

we

bei

CM

z.

(Ne

(MT

al.

Abbildung 3: Aufbau eines myelinisierten Axons. In Abbildung A ist eine „entrollte“myelinisierende Schwannzelle dargestellt. Abbildung B zeigt die Proteine, die im kompaktenbzw. nicht-kompakten Myelin enthalten sind: Links die Proteine des kompakten Myelins P0,PMP22 und MBP (myelinbasisches Protein), rechts das nicht-kompakte Myelin mit denProteinen Cx32, E-Cadherin, DM20 (Isoform des Proteolipid-Proteins), MAG (Myelin-assoziiertes Glycoprotein) und Claudin (Scherer und Arroyo 2002)

Aktuelle Situation, Ausblick: Trotz weitreichender Erkenntnisse konnte für

en nicht unbeträchtlichen Teil der HMSN-Patienten bisher keiner der

chriebenen genetischen Defekte identifiziert werden, so dass die Suche nach

iteren beteiligten Genen noch lange nicht abgeschlossen ist. Neben dem kürzlich

CMT1C beschriebenen LITAF-Gen sind besonders für die rezessiv vererbte Form

T4 in den letzten Jahren neue Gene als ursächlich involviert beschrieben worden

B. das „ganglioside-induced differentiation-associated protein 1“-Gen (GADP1)

lis et al. 2002; Senderek et al. 2003), das „myotubularin-related protein-2“-Gen

MR2) (Bolino et al. 2000), das „SET binding factor 2“-Gen (SBF2) (Senderek et

2003) und das „N-mycdownstream-regulated gene 1“-Gen (NDRG1) (Kalaydjieva

12

et al. 2000), so dass das Wissen um die Ursachen dieser Erkrankungen mit enormer

Dynamik an Umfang gewinnt.

Mittlerweile kann für einige der HMSN auch eine pränatale Diagnostik und

Beratung durchgeführt werden, die zurzeit das PMP22-, MPZ- und Cx32-Gen

umfasst (Bird 2000). Allerdings muss man sagen, dass die pränatale Diagnostik bei

Erkrankungen, die sich erst im frühen Erwachsenenalter manifestieren, eher selten

ist und einer sorgfältigen genetischen Beratung bedarf. Ähnliches gilt für die

Präimplantationsdiagnostik (PID), die in einigen Ländern bereits erfolgreich für Paare

mit HMSN angeboten wird (De Vos et al. 1998).

Nicht zuletzt schafft das wachsende Wissen über die

molekularpathogenetischen Zusammenhänge der HMSN die Basis für zunehmende

Fortschritte in Richtung kausaler Therapiemöglichkeiten (Bell und Haites 1998). So

wurde bereits im Tierversuch gezeigt, dass transplantierte Gliazellen

Myelinisatinsprozesse im ZNS ermöglichen können (Archer et al. 1997). Kamholz et

al. (2000) zeigen in einer Übersicht, dass durch Gentransfer mit rekombinanten

Adenoviren als Vektoren die Genexpression in den wichtigsten Zellgruppen des

peripheren Nervensystems modifiziert werden kann. Solche Ansätze lassen auf

weitere Fortschritte auch zur Behandlung der hereditären demyelinisierenden

Erkrankungen des peripheren Nervensystems hoffen.

13

Abbildung 4 zeigt eine fürHMSN typische Fußdeformitätmit Hammerzehen, Hohlfußund Atrophie der kleinenFußmuskulatur (http://www.neuro.wustl.edu/neuromuscular/time/hmsn.html)

www.neuro.wustl.edu/neuromuscular/time/hmsn.html)

2.2. Klinisches Erscheinungsbild 2.2. Klinisches Erscheinungsbild

Von der CMT1Von der CMT1 sind etwa einer von 2500 Personen

betroffen (Lupski und Garcia 1992). Damit ist sie die

häufigste neurogenetische Erkrankung und somit

auch der vorherrschende Krankheitstyp unter den

HMSN. Dem Kliniker präsentiert sich eine

weitgefächerte Symptompalette, deren Ausprägung

selbst innerhalb einer Familie einer hohen Variabilität

unterworfen sein kann. Erste Symptome zeigen sich

meist im ersten bzw. zweiten Lebensjahrzehnt

(durchschnittliches Ersterkrankungsalter 12,2 ± 7,3

Jahre), selten auch im Erwachsenenalter. Die

Patienten leiden unter distal betonten, chronisch

progredienten atrophischen Paresen, die besonders

die kleinen Fußmuskeln und die

Unterschenkelmuskulatur (Fußheber: Mm. peronei und

tibiales anteriores) betreffen. Durch die fortschreitende

Schwächung der Muskelgruppen kommt es zu

Skelettdeformierungen wie Pes cavus oder equinovarus

und Hammerzehen (siehe Abbildung 4) sowie

Gangauffälligkeiten (Stepper- oder Bügeleisengang).

Eventuell können verdickte Nervenstränge unter der Haut

tastbar sein, z.B. am Sulcus ulnaris oder am

Fibulaköpfchen.

Die neurologische Untersuchung zeigt oft Minderung

oder Verlust der Sehnenreflexe der unteren Extremität

sowie teilweise leichte Sensibilitätsstörungen, die im frühen

Stadium besonders die Vibration, später auch

Propriozeption und Berührung betreffen. Daraus

resultierende Stand- und Gangunsicherheit kann mit dem

Underberger Tretversuch und dem Rombergversuch

objektiviert werden. Es kann zu sensiblen

Reizerscheinungen wie schmerzhaften nächtlichen

AM E C A Hk nu

14

bbildung 5: it Fortschreiten derrkrankung kann es beiMT1-Patienten zurtrophie der kleinenandmuskulatur ommen (http://www.euro.wustl.edu/neuromscular/time/hmsn.html)

Muskelkrämpfen sowie strumpf- oder handschuhförmigen distalen Parästhesien

kommen.

Das Krankheitsbild verschlechtert sich über Jahrzehnte hinweg und dehnt sich

schließlich auch auf die Oberschenkelmuskulatur und die obere Extremität aus.

Durch Schwächung der intrinsischen Handmuskulatur können im weiteren Verlauf

auch eine Einschränkung der Feinmotorik sowie eine Krallenhanddeformität

auftreten. (siehe Abbildung 5 auf Seite 17). Meist ist der Verlauf jedoch relativ

gutartig und die Patienten werden eher selten rollstuhlpflichtig oder berufsunfähig.

Selten kann die CMT1 mit Ataxie, Armtremor, sekundärer Skoliose bei

Beteiligung der Rückenmuskulatur oder Wadenhypertrophie korreliert sein.

Hirnnerven oder autonome Nerven können gelegentlich betroffen sein, und in

schweren Fällen kann es zu einer Einschränkung der Atemfunktion durch Affektion

des N. phrenicus kommen.

Die Hereditäre Neuropathie mit Neigung zur Drucklähmung äußert sich als

Parese eines oder seltener mehrerer peripherer Nerven nach leichter mechanischer

Beanspruchung. Infolge der Druckschädigung kommt es plötzlich zu schmerzlosen

motorischen und sensorischen Ausfällen, die sich nach Tagen bis Wochen

vollständig zurückbilden. Mit abnehmender Häufigkeit sind N. peronealis, N. ulnaris,

N. radialis, Plexus brachialis und N. medianus betroffen. Obwohl zunächst den

Anschein einer Mononeuropathie erweckend, weist die klinische Diagnostik auf ein

polyneuropathisches Geschehen hin. Erste Erkrankungsepisoden treten später auf

als bei der CMT1, meist in der 2. oder 3. Lebensdekade. Der Krankheitsverlauf ist in

der Regel milder und führt selten zu Behinderungen. Nur bei häufiger Schädigung

desselben Nervs kann es zu bleibenden Defekten kommen. Selten beobachtet man

die klassischen Fußdeformitäten, doch gibt es auch Verläufe, die klinisch kaum von

einer CMT1 unterscheidbar sind. Andererseits ist eine beachtliche Zahl von

Mutationsträgern subjektiv beschwerdefrei. Auch hier ist also die phänotypische

Variabilität beachtlich (Pareyson et al. 1996).

Die Klinik des Dejerine Sottas Syndroms ist der CMT1-Symptomatik sehr

ähnlich, jedoch ist die Erkrankung wesentlich stärker ausgeprägt und früher

beginnend. Besonders charakteristisch ist eine verzögerte motorische Entwicklung in

den ersten Lebensjahren, manchmal werden die Säuglinge schon nach der Geburt

durch Muskelhypotonie auffällig (Parman et al. 1999). Im Gegensatz zu CMT1 kann

es zu früher Invalidität kommen. Schmerzen und Skelettdeformitäten wie sekundäre

15

Skoliosen treten häufiger auf, die verdickten Nervenstränge können besonders im

Sulcus ulnaris und am Fibulaköpfchen tastbar sein. Teilweise fallen

Pupillenstörungen (Hirnnervenbeteiligung) sowie bemerkenswerter Weise eine

Erhöhung des Liquorproteins auf, was differentialdiagnostische Schwierigkeiten

bereiten kann.

Die Kongenitale Hypomyelinisationsneuropathie (CH) zeigt die Symptome des

DSS besonders ausgeprägt. Neben Hypotonie („floppy infant“), Areflexie,

Muskelschwäche und sensorischen Defiziten kann es zu Schluckstörungen und

Ateminsuffizienz bereits im Neugeborenenalter kommen. In seltenen schweren

Erkrankungsfällen kann die CH mit Gelenkkontrakturen, Lissenzephalie oder

Arthrogyrosis multiplex congenita vergesellschaftet sein. Die Prognose ist wesentlich

schlechter als bei den oben beschriebenen Neuropathien, schlimmstenfalls

versterben die Patienten bereits vor dem 3. Lebensmonat.

2.3. Elektrophysiologische Diagnostik

Elektrophysiologische Untersuchungen bei Patienten mit CMT1 ergeben eine

verminderte Nervenleitgeschwindigkeit (NLG) motorischer und sensorischer Nerven

von durchschnittlich 17 bis 20 m/s. Harding und Thomas definierten 1980 eine NLG

des N. medianus von 37 m/s als kritische Grenze, oberhalb derer eher eine axonale

als eine demyelinisierende Störung in Betracht kommt. Verzögert sind auch die

distalen Überleitungszeiten und die F-Wellen Antwort. Die Veränderungen im

Elektroneurogramm (ENG) sind bereits vor Manifestation klinischer Zeichen

messbar; je früher die Erkrankung beginnt, desto langsamer sind die NLG. Im

Elektromyogramm (EMG) kann in Folge der Nervenschädigung eine Verringerung

der zusammengesetzten motorischen Aktionspotentiale beobachtet werden. Weitere

Zeichen der neurogenen Muskelatrophie sind ein gelichtetes Aktivitätsmuster,

pathologische Spontanaktivität und verlängerte, polyphasische Potentiale

motorischer Einheiten. Sensorische Potentiale fehlen oft oder sind verlangsamt und

amplitudengemindert. Die elektrophysiologisch messbaren Veränderungen sind bei

Punktmutationen noch drastischer ausgeprägt. Da klinisch unauffällige Träger der

PMP22-Duplikation ebenfalls stark verlangsamte NLG aufweisen können, wird diese

16

Diagnosemöglichkeit von einigen Autoren besonders hervorgehoben (Berciano et al.

1994).

Die elektrophysiologischen Befunde bei HNPP Patienten zeigen eine

vergleichsweise leichte Reduktion der NLG motorischer und auch sensibler Nerven.

An anatomischen Engpässen lassen sich zusätzliche fokale Veränderungen

feststellen. Ähnlich der CMT1 kann man im EMG Zeichen der neurogenen

Muskelatrophie messen (Neundörfer et al. 1987).

Bei der elektrophysiologischen Diagnostik von DSS und CH lassen sich

ebenfalls die charakteristischen Befunde einer disseminierten Markscheidenläsion

mit konsekutiver neurogener Muskelatrophie erheben. Die Resultate sind hier

entsprechend der Schwere der Krankheitsbilder noch pathologischer, meist liegt die

NLG sogar unterhalb von 10 m/s (Kennedy et al. 1977; Parman et al. 1999). (Zu

Elektrophysiologischen Veränderungen siehe auch unter:

http://www.neuro.wustl.edu/neuromuscular/time/hmsn.html)

2.4. Morphologie

Den PMP22-assoziierten Neuropathien ist wegen der Erkrankung der Markscheiden

als hervorstechendes morphologisches Kriterium die Demyelinisierung gemeinsam.

Je nach Krankheitsbild lassen sich in Folge der gestörten Formation der

Myelinscheiden unterschiedliche pathologische Umbauprozesse beobachten:

Die charakteristischen histopathologischen Merkmale der CMT1 sind die

segmentalen De- und Remyelinisationsprozesse, die durch Vermehrung von

Schwannzellen und endoneuralem Kollagen zur Ausbildung von sogenannten

„Zwiebelschalenformationen“ führen (siehe Pfeilspitzen in Abbildung 6, Seite 21).

Regelmäßig finden sich auch hypermyelinisierte Nervenfasern, oft assoziiert mit

atrophischen Axonen (Schröder 1999). Häufig fallen in Relation zum Axonkaliber zu

dünn myelinisierte Nervenfasern auf; mit Fortschreiten der Erkrankung kommt es

zunehmend zum Ausfall besonders der großen markhaltigen Nervenfasern.

Gabreëls-Festen et al. korrelierten 1995 die morphologischen

Untersuchungsergebnisse von CMT1 Patienten mit den molekulargenetischen

Befunden. Es zeigte sich, dass im Falle einer PMP22-Punktmutation das Verhältnis

von Axondurchmesser zu Nervenfaserdurchmesser wesentlich größer war als in

17

Fällen mit einer PMP22-Duplikation. Bei letzteren lag das Verhältnis deutlich

unterhalb der Norm. Bei Patienten mit Punktmutationen zeigten sich

Zwiebelschalenformationen schon früher und zahlreicher, auch der totale

Faserdurchmesser war erhöht (Gabreëls-Festen et al. 1995).

Andere Autoren beschrieben im Zusammenhang mit PMP22-Punktmutationen

(Asp37Val) Myelinscheidenveränderungen wie Tomakula und eine inkomplette

Kompaktierung der Myelins (Fabrizi et al. 1999).

Als Beispielhistologie ist in Abbildung 6 die Nervenbiopsie von Patient Nr.

NPA3B dargestellt (Semidünnschnitte: Toluidinblau). Der zum Zeitpunkt der

Untersuchung 72-jährige Patient litt an einer links stärker als rechts ausgeprägten

Fußheberparese sowie Parästhesien der Unterschenkelaußenseite links.

Histometrisch erschien die Zahl der großen markhaltigen Nervenfasern um bis zu 60

% reduziert. Des Weiteren fallen zu dünn myelinisierte Nervenfasern sowie

Zwiebelschalenformationen auf (siehe Pfeilspitzen in Abbildung 6).

Abbildung 6: Ausschnitt aus dem N. suralis des Patienten Nr. NPA3B (CMT1, die Pfeilspitzen weisen auf Zwiebelschalenformationen hin)

18

Bei der HNPP zeigen bis zu etwa 25% der Internodien so genannte Tomakula,

d.h. wurstartige Verdickungen der Myelinscheiden (Behse et al. 1972). Zwar sind

diese Tomakula Hauptcharakteristikum der HNPP, aber sie sind kein hartes

diagnostisches Kriterium, da sie im fortgeschrittenen Erkrankungsstadium fehlen

können (Schröder 1999). Auch werden sie nicht selten bei anderen Erkrankungen

wie der CMT1 (Thiex und Schröder 1998), der Anti-MAG-Neuropathie, der CIDP,

DSS und CMT4B beobachtet (http://www.neuro.wustl.edu/neuromuscular

/nother/bx.html#tomacula). Wie bei der CMT1 findet man auch bei der HNPP Zeichen

der segmentalen Demyelinisierung. Morphometrische Vergleichsanalysen beider

Erkrankungen zeigen allerdings analog den klinischen Befunden, dass bei den

HNPP-Patienten die Neuropathie wesentlich milder ausgeprägt ist (Thiex und

Schröder 1998). Abbildung 7 zeigt das histologische Präparat eines zum

Diagnosezeitpunkt 61-jährigen Mannes (Patient Nr. 4), bei dem klinisch zunächst der

Verdacht auf eine sensible Neuropathie vom axonalen Typ geäußert worden war.

Abbildung 7: Histologisches Präparat von Patient Nr.4. Der Pfeil markiert eine tomakulöse Nervenfaser.

19

Die histopathologische Untersuchung zeigte eine Reduktion großer und

kleiner markhaltiger Nervenfasern um bis zu 20%, Zeichen der Hypomyelinisation

sowie eine typische tomakulöse Nervenfaser (siehe Pfeil in Abbildung 7, Seite 22).

Somit ließ sich die Erkrankung als sehr frühes Stadium einer tomakulösen

Neuropathie (HNPP) einstufen.

Die DSS-Erkrankung erinnert im morphologischen Bild an eine besonders

stark ausgeprägte Form der CMT1. So finden sich auch hier die charakteristischen

Zwiebelschalenformationen, Hypomyelinisation und eine starke sekundäre Reduktion

großer myelinisierter Nervenfasern. Auch die marklosen Axone sind betroffen: Zwar

ist ihre Anzahl nicht vermindert, jedoch ihre durchschnittliche Größe geringer als die

Norm. Häufig fallen abnorm verdickte Nerven auf; daher auch das Synonym

„hypertrophische Neuropathie“. Abbildung 8 zeigt exemplarisch das Nervenpräparat

einer zum Zeitpunkt der Diagnostik 21 Jahre alten Patientin (Fall Nr. 12) mit einer

demyelinisierenden Neuropathie vom Typ des DSS. Auffällig sind der subtotale

Ausfall großer markhaltiger Nervenfasern sowie die zahlreichen

Zwiebelschalenformationen.

Abbildung10: Histologisches Präparat des Pat. 12 (DSS)

Abbildung 8: Zwiebelschalenformationen im Nerven der Patientin Nr. 12 (DSS)

20

In Fällen mit Verdacht auf kongenitale Hypomyelinisationsneuropathie fehlen

die Markscheiden gänzlich oder sind in der Mehrzahl der Axone sehr dünn

ausgebildet. Einige Autoren berichten über ein vermehrtes Vorkommen von

Zwiebelschalenformationen, die mehrschichtige Umhüllungen aus Basalmembranen

enthalten (Bornemann et al. 1996). In anderen Fällen ließen sich hingegen gar keine

Zwiebelschalenformationen feststellen (Seitz et al. 1986). Der axonale Untergang

kann vergleichsweise moderat ausgeprägt sein. Abbildung 9 zeigt die Histologie

eines bei Einsendung der Nervenbiopsie fünfzehn Monate alten Jungen (Patient

Nummer V5), der durch eine hypotone statomotorische Entwicklungsverzögerung

aufgefallen war. Das Schnittpräparat zeigt Charakteristika einer

Hypomyelinisationsneuropathie, da zahlreiche großkalibrige Nervenfasern im

Vergleich zur Altersnorm zu dünne Markscheiden aufweisen.

Abbildung 9: Hypomyelinisationsneuropathie bei Patient Nr. V5.

21

2.5. Differentialdiagnosen

Bei Patienten, die sich mit den oben beschriebenen Symptomen der HMSN

vorstellen, kommen zunächst eine Reihe metabolischer, exogen-toxischer und

entzündlicher Polyneuropathien differentialdiagnostisch in Betracht, die größtenteils

durch sorgfältige Anamneseerhebung und Laboruntersuchungen ausgeschlossen

werden können. Die Suralnervenbiopsie ermöglicht schließlich eine diagnostische

Einengung auf die Gruppe der Polyneuropathien mit primärem Markscheidenbefall,

wobei die Zwiebelschalenformationen recht eindeutig auf den demyelinisierenden

Typ der HMSN hinweisen. Besonders wichtig ist hier gerade bei sehr jungen

Patienten die Unterscheidung des altersadäquaten, normalen Entwicklungsstandes

der Axone und Myelinscheiden von verzögerten, gestörten oder gar fehlenden

Reifungsprozessen der kindlichen peripheren Nerven (Schröder et al. 1988).

Schwer ist allerdings die Abgrenzung der CMT1 zur Chronischen

Inflammatorischen Demyelinisierenden Polyneuropathie (CIDP), da bei dieser

Erkrankung histologisch ebenfalls segmentale Demyelinisierung und

Zwiebelschalenformationen nachweisbar sein können. Bei der CIDP handelt es sich

um eine Autoimmunreaktion gegen das periphere Nervensystem, welche im Rahmen

von andern Autoimmunerkrankungen oder postinfektiös auftreten kann. Jedoch

können diese ätiologischen Unterscheidungskriterien anamnestisch fehlen.

Mononukleäre Zellinfiltrate im perivaskulären Raum sollen hinweisend auf CIDP sein

(Dyck und Arnason 1984), jedoch sind diese selten nachweisbar (Schröder 1999).

Liquorbefunde können weiterhelfen (bei der CIDP ist die Eiweißfraktion erhöht)

jedoch kann dies auch bei DSS-Patienten der Fall sein. Die Abgrenzung ist also

keinesfalls trivial und in sofern von herausragender Bedeutung, als CIDP Patienten

im Gegensatz zu HMSN Patienten von einer immunsuppressiven Therapie

profitieren.

Auch für die HNPP kommen diverse andere Polyneuropathien

differentialdiagnostisch in Betracht, bei denen Drucklähmungen auftreten können.

Ein aufschlussreicher Fund bei der Nervenbiopsie sind die Tomakula, die jedoch,

wenn nur wenige Tomakula vorliegen, nicht spezifisch für diese Erkrankung sind.

Nicht zuletzt besteht immer noch eine nicht unerhebliche Schwierigkeit in der

Abgrenzung der in dieser Arbeit betrachteten hypomyelinisierenden Neuropathien

untereinander und von anderen Formen der HMSN, da Klinik, Elektrophysiologie und

22

Morphologie überlappend und uneindeutig sein können. Molekulargenetische

Untersuchungen können in solchen Fällen oft den ausschlaggebenden Hinweis

liefern.

2.6. Therapie und Prognose

Von wenigen Ausnahmen wie dem Morbus Fabry oder dem Morbus REFSUM

abgesehen gibt es bis heute leider noch keine kausaltherapeutischen Möglichkeiten

für Patienten, die an HMSN vom CMT-Typ erkrankt sind. Daher stehen supportive

Maßnahmen nach wie vor im Vordergrund der Behandlung, wie zum Beispiel

sorgfältige Fußpflege, Verordnung von orthopädische Einlagen bzw. Schuhen oder

Peronaeusschienen (Wicklein et al. 1997, http://users.rcn.com/smith.ma.

ultranet/WhatIsCMT.html). Von großer Wichtigkeit ist eine möglichst lebenslange

Physiotherapie, die Übungen zur Muskelkräftigung, Muskeldehnung zur

Kontrakturprophylaxe, Sensibilitätstrainig, Skoliosebehandlung und Atemgymnastik

umfasst. Auch eine ergotherapeutische Beratung kann mit zunehmendem Grad der

Bewegungseinschränkung sehr sinnvoll sein.

Im Bereich der Pharmakotherapie kommen symptomatisch besonders

Analgetika und Muskelrelaxantien zum Einsatz. Der Effekt neurotroper Substanzen

wie Vitamin B12 oder α-Liponsäure ist noch nicht durch Studien belegt. Für die

Verordnung von Anabolika wie Nandrolon besteht angesichts der Pathogenese keine

Indikation. Schließlich gibt es viele Möglichkeiten operativer Korrekturmaßnahmen,

zum Beispiel Archillessehnenverlängerung, Korrektur von Hammerzehen,

Sehnentransplantationen, Sprungelenksarthrodesen, Plantarfaszienspaltung und

Eingriffe an der Wirbelsäule zur Skoliosekorrektur. Die Weichteiloperationen im

Bereich der Füße erzielen oft gute Resultate, gerade wenn sie frühzeitig erfolgen und

so knöchernen Fehlbildungen vorgebeugt werden kann (Holmes und Hansen 1993).

Dahingegen sind die Resultate der knochenkorrigierenden Verfahren kritischer zu

betrachten, lediglich durch die Tripelarthrodese lässt sich für eine begrenzte Zeit eine

Verbesserung der Fußstellung erzielen.

Krankheitsverstärkende Faktoren sind soweit irgend möglich zu meiden. Auf

der Internetseite CMTnet (http://users.rcn.com/smith.ma.ultranet/MedicalAlert.html)

findet man Listen mit Medikamenten, die die Progredienz der Erkrankung fördern

23

können und deren Kenntnis daher für den Patienten und den behandelnden Arzt von

großer Wichtigkeit ist: So wurde zum Beispiel mehrmals in der Literatur eine akute

Exazerbation der Erkrankung nach Gabe des Cytostaticums Vincristin beobachtet

(Olek et al. 1999; Hildebrandt et al. 2000). Auch Umweltgifte können einen Rolle

spielen (Senderek et al. 2000). Des Weiteren können physikalische Traumata,

Schock, emotionaler Stress oder auch eine Schwangerschaft eine Verschlechterung

des Krankheitsbildes mit sich bringen (Gastaut et al. 2000).

Durch molekulargenetische Analysen kann heute die Diagnose einer HMSN

schon in einem sehr frühen Erkrankungsstadium oder sogar präklinisch gestellt

werden. Gerade in diesen Fällen sind eine ausführliche Beratung der Patienten

hinsichtlich möglicher Krankheitsverläufe und die Ermutigung zu präventivern

Maßnahmen wichtig. Der behandelnde Arzt muss sich stets bewusst sein, dass die

Diagnose für die Patienten oft einen entscheidenden Einfluss auf Familienplanung,

Berufswahl oder die Erwägung von Umschulungsmaßnahmen bedeutet. Somit ist

eine gute, tragfähige Arzt-Patient-Beziehung essentiell, um den Betroffenen das

Leben mit ihrer Krankheit zu erleichtern.

24

3. Patientenkollektiv

Das Archiv des Institutes für Neuropathologie der RWTH Aachen verfügt als

Referenzzentrum für neuromuskuläre Erkrankungen über mehr als 7000 fixierte,

paraffineingebettete Präparate von Nerven- und Muskelbiopsien, von denen ein Teil

auch als Frischpräparat bei –70 °C konserviert wurde. Für die vorliegende Studie

wurden 59 Präparate von Patienten ausgewählt, die an den oben beschriebenen

Erkrankungen CMT1, HNPP, DSS oder CH erkrankt waren. Für die an CMT1 oder

HNPP erkrankten Patienten war im Vorfeld eine PMP22-Tandemduplikation bzw. -

Deletion ausgeschlossen worden. Dies erfolgte durch einen semiquantitativen PCR-

Ansatz (Thiex und Schröder 1998) bzw., in der Mehrzahl der Fälle, durch

Mikrosatellitenanalyse und die Direkt-doppelt-differentielle PCR (Beckmann und

Schröder 2000). Dieser Untersuchung wurden auch 5 der 11 DSS-Fälle unterzogen,

da hier die Abgrenzung von schwerer CMT1 zu DSS nicht eindeutig war. Die CH

Patienten wurden vorab auf eine MPZ-Mutation untersucht, so dass dieses Gen als

Ursache für eine erbliche Neuropathie ausgeschlossen werden konnte (genauere

klinische und histopathologische Angaben zu den untersuchten Fällen finden sich

tabellarisch gelistet im Anhang unter 11.2).

25

4. Untersuchungsgut

Das zur Diagnostik eingereichte Material umfasst bei Verdacht auf HMSN neben der

Biopsie des Nervus suralis auch oft eine Muskelbiopsie. Ein Teil des jeweiligen

Präparates wurde in 4%iger Formalinlösung, ein Teil in 3,9%igem Glutaraldehyd mit

0,1 M Phosphatpuffer nach SØRENSEN fixiert. Nach Entwässerung der

Gewebeproben in einer aufsteigenden Alkoholreihe und einem Xylolbad erfolgte die

Einbettung der fixierten Präparate in Paraffin.

Für die lichtmikroskopische Beurteilung wurden Semidünnschnitte der

Suralnervenbiopsien angefertigt. Die glutaraldehydfixierten Nerven mussten zu

diesem Zweck in einer 2%igen phosphatgepufferten Osmiumtetroxidlösung mit 0,1 M

Phosphatpuffer (nach SØRENSEN) nachfixiert werden. Nach Entwässerung in

aufsteigender Ethanolreihe und Einbettung in Epoxydharz wurden 1 µm dicke

Semidünnschnitte angefertigt und mit Paraphenylendiamin und Toluidinblau gefärbt.

35 der 59 in dieser Studie untersuchten Proben wurden wie oben beschrieben

fixiert. Die DNA der übrigen 24 Proben wurde aus frischem Muskel, frischem Nerv

oder Blut gewonnen.

26

5. Methoden 5.1. DNA-Extraktion aus paraffineingebetteten formalin- oder

glutaraldehydfixierten Suralnerven- bzw. Muskelbiopsien

Von den ausgewählten Paraffinblöcken wurden je nach Größe des Präparats 10-20

etwa 10 µm dicke Schnitte gewonnen.

Um das Gewebe von Paraffin zu befreien, wurden die Proben zunächst mit

1000 µl Xylol versetzt und anschließend zweimal mit 100%igem Ethanol gewaschen.

Das restliche Ethanol wurde bei 37°C verdampft.

Die DNA-Isolierung erfolgte in leicht abgewandelter Form gemäß dem Tissue

Protocol des QIAamp DNA Mini Kit (Quiagen, Hilden): Das gewonnene Gewebepellet

wurde nach Lösung in 180 µl AL Puffer mit 20 µl Proteinase K, einer Endopeptidase,

im Wasserbad bei 56°C über Nacht inkubiert, um störende Proteinbestandteile zu

zersetzen. Nach Zugabe von 200 µl Puffer AL, einem weiteren zehnminütigen

Inkubationsschritt bei 70°C und Versetzen mit 200 µl 100%igem Ethanol erfolgte die

Trennung von DNA und Proteinresten mit Hilfe der QIAamp spin columns. In diese

Röhrchen ist eine Filtermembran aus Silica-Gel eingebaut, die, abhängig von

Salzgehalt und pH, DNA bindet, während das abzentrifugierte Eluat mit allen

störenden Bestandteilen verworfen werden kann. Nach Waschung mit je 500 µl AW1

bzw. AW2 Puffer konnte die DNA mit 50 µl steril filtriertem Wasser (LiChrosolv®,

Merck, Darmstadt) von der Säule gelöst werden. Dies wurde wiederholt, so dass von

jedem Gewebepräparat zwei DNA-Elutionen zur Verfügung standen. Photometrische

Messungen (Perkin Elmer Lambda Bio Spektrometer) ermöglichten es, den DNA-

Gehalt der Proben zu bestimmen und die Probenverunreinigung z.B. durch

Proteinreste zu beurteilen.

5.2. DNA-Extraktion aus Frischmaterial (Nerv, Muskel, Blut)

Auch hier wurden die Protokolle des QIAamp DNA Mini Kit verwendet. Vom frischen

Muskel- oder Nervenpräparaten wurde im Kryostat 10-30 mg entnommen und mit

180 µl Buffer ATL sowie 20 µl Proteinase K versetzt. Die Lyse durch Inkubation bei

27

56°C erfolgte in wenigen Stunden oder auch über Nacht. Von da ab wurden diese

Proben genauso behandelt wie oben für die fixierten Präparate beschrieben.

Von Blutproben wurde auf 25 µl Proteinase K 200 µl Probe sowie 200 µl AL

Puffer gegeben. Eine Lysezeit von 10 Minuten bei 56°C war in diesen Fällen

ausreichend. Nach Zugabe von 200 µl Ethanol wurden die Proben in „spin columns“

übertragen und die Aufreinigung wie oben beschrieben ausgeführt. Abschließend

wurde zweimal mit 50 µl TrisHCl Puffer, pH 8,3, eluiert.

5.3. Polymerase-Kettenreaktion

Die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) stellt eine

essentielle Methode der molekulargenetischen Forschung dar. Sie ermöglicht es, in

vitro gezielt und in kurzer Zeit DNA Abschnitte zu vervielfältigen. Seit der

Erstveröffentlichung durch Mullis et al. (1986) hat die Methode viele Modifikationen

und Adaptationen erfahren; unter anderem gelangen Saiki et al. (1988) eine

entscheidende Verbesserung durch den Einsatz einer hitzestabilen DNA-

Polymerase. Selbst geschädigte, stark fraktionierte DNA aus formalinfixiertem

Gewebe lässt sich noch Jahre nach der Fixierung amplifizieren (Kösel und Graeber

1994). In der vorliegenden Arbeit wurde die PCR zur Vermehrung der codierenden

vier Exone des PMP22-Gens verwendet; die gewonnenen Templates konnten dann

in weiteren Arbeitsschritten mit der Enzymatischen Mutationsdetektionsmethode

(Enzymatic Mutation Detection, EMD) und durch eine automatische Sequenzanalyse

weiterbearbeitet werden.

Das Prinzip der Reaktion lässt sich wie folgt erklären: Zunächst benötigt man

Kenntnisse über die Basensequenz des zu untersuchenden DNA Abschnittes, um

Primer zu entwerfen. Dies sind um die 18 bis 25 Basen lange Oligonukleotide, die

sich an komplementären Sequenzen der denaturierten DNA Stränge anlagern. Sie

sollten so gewählt werden, dass sie die zu untersuchende Sequenz jeweils am 5’

Ende flankieren und möglichst ausschließlich in der Zielregion binden, um

unspezifische PCR-Produkte zu vermeiden. Der amplifizierte Abschnitt sollte eine

Länge von 5 kb nicht überschreiten, da die Vervielfältigung mit zunehmender Länge

des DNA-Abschnitts immer problematischer wird (Strachan 1994). In der PCR folgt

auf einen Denaturierungsschritt bei etwa 95°C die Anlagerung der Primer (Annealing)

28

bei Temperaturen zwischen 50 und 65°C. Ausgehend von diesen Startermolekülen

kann nun eine hitzestabile Polymerase im Extensionsschritt (72°C) die Einzelstränge

mit den Desoxyribonukleotiden dATP, dCTP, dGTP, dTTP zu Doppelsträngen

komplementieren. Jeder der neusynthetisierten Stränge fungiert nun als Matrize für

den nächsten Reaktionszyklus, so dass nach 30 Zyklen aus Denaturierung,

Primeranlagerung und Kettenverlängerung das 108 bis 109 -fache der Zielsequenz im

Reaktionsansatz vorliegt (siehe Abbildung 10).

5’3’

3’5’

zu vervielfältigende DNA

2. Zyklus: Hitzedenaturierung, Anlagerung der Primer, DNA Synthese:

3. Zyklus: Hitzedenaturierung, Anlagerung der Primer, DNA Synthese:

1. Zyklus: Hitzedenaturierung:

DNA Synthese:

Anlagerung der Primer:

nach 30 Zyklen erhält man 108 bis 109 Kopien der gewünschten Zielsequenz

Abbildung 10: Schematische Darstellung der Polymerasekettenreaktion (nach Strachan 1994; Koolmann et al. 1998)

Das PMP22 Gen umfasst 5 Exone, von denen das erste nicht codierend ist

und daher in der vorliegenden Arbeit nicht mit untersucht wurde. Im Folgenden

29

beziehen sich die Nummern 1 bis 4 nur auf die codierenden Exone. Sie wurden mit

Hilfe der folgenden Primerpaare amplifiziert:

Exon 1 (166bp):

Primer 1F 5’- AGAAACTCCGCTGAGCAGAA -3’

Primer 1R 5’- GGAACCCAGATGGGGAAG-3’

Exon 2 (156bp):

Primer 2F 5’- TCAGGATATCTATCTGATTCTC -3’

Primer 2R 5’- AAGCTCATGGAGCACAAAACC -3’

Exon 3 (239bp) :

Primer 3F 5’- CCATGGCCAGCTCTCCTAAC -3’

Primer 3R 5’- CATTCCGCAGACTTTGATGC -3’

Exon 4 (249bp):

Primer 4F 5’- GCCATGGACTCTCCGTC -3’

Primer 4R 5’- CCTATGTACGCTCAGAG -3’

Primerpaar 1 und 3 wurden nach den Angaben von G. A. Nicholson et al.

(1994) hergestellt. Ursprünglich sollten auch Exon 2 und 4 nach dem in dieser

Arbeitsgruppe angewandten Primern amplifiziert werden. Für DNA aus frischem

Gewebe oder Blut war dies problemlos möglich; bei DNA aus fixiertem

paraffineingebetteten Material waren die Resultate für PCR und Sequenzierung

jedoch trotz zahlreicher Optimierungsversuche nicht zufriedenstellend. Der Versuch,

selbst Primer zu kreieren brachte auch keine Verbesserung, darum wurde für Exon 2

und 4 auf die Angaben von Roa und Kollegen (1993b) zurückgegriffen. Die Längen

der PCR-Produkte liegen unter 300 bp, da sich kurze Fragmente in PCR und

Sequenzanalyse besser bearbeiten lassen, besonders wenn stark fraktionierte DNA

aus paraffineingebettetem formalinfixierten Gewebe vorliegt.

Die PCR-Bedingungen konnten wie folgt optimiert werden: Pro Ansatz wurden

60 ng genomische DNA, 2,5 µl 10x Qiagen PCR Puffer (Tris-Cl, KCl, (NH4)2SO4,

15 mM MgCl2; pH 8,7), 6,25 mmol jedes Desoxynucleotids (TaKaRa, SHUZO CO.,

Otsu, Shiga), 1,5 U HotStarTaqTM DNA-Polymerase (Qiagen), jeweils 25 pmol der

30

beiden Primer (MWG-Biotech AG, Ebersberg) und steril filtriertes Wasser (Merck) ad

25 µl zur Reaktion gebracht. Der Ansatz für Exon 1 und 3 enthielt je noch 5 µl 5x Q-

Solution (Qiagen), ein PCR Zusatz, der durch Verbesserung des Schmelzverhaltens

der DNA in schwierigen Fällen die Vervielfältigung ermöglicht. Zudem wird das

spezifische Primerannealing gefördert, so dass weniger unerwünschte PCR-

Fragmente synthetisiert werden.

Nach einem initialen Denaturierungsschritt von 8 min bei 95°C folgten 35

Reaktionszyklen bestehend aus Denaturierung (1 min, 95°C), Primerannealing (1

min, 55°C für Exon 2, 58°C für Exon 1 und 3, 60°C für Exon 4) und Extension (1 min

72°C). Ein finaler Extensionsschritt für 7 min bei 72°C ermöglichte die

Vervollständigung von noch unkomplett synthetisierten DNA-Strängen. Abschließend

wurde der gesamte Ansatz auf 4°C abgekühlt und konnte bei dieser Temperatur für

einen längeren Zeitraum aufbewahrt werden.

Die verwendete HotStarTaq DNA-Polymerase ist die gentechnisch modifizierte

Form einer hitzestabilen DNA-Polymerase aus dem Bakterium Thermus aquaticus

mit einer Extensionsrate von 2-4 kb pro Minute bei 72°C. Sie besitzt die besondere

Eigenschaft, erst bei einer Temperatur von 95°C aktiviert zu werden. Dies verringert

die Bildung von Primer-Dimeren und unspezifischen Produkten bei niedriger

Temperatur, was die Spezifität und den Ertrag der Reaktion erhöht. Anders als im

Handbuch des Herstellers angegeben, wurde der erste Denaturierungsschritt kürzer,

nämlich 8 statt 15 min gewählt. Diese Modifikation soll die Spezifität der Reaktion

noch erhöhen: In jedem Zyklus wird während der Aktivierungsphase bei 95°C mehr

Enzym aktiviert, so dass sukzessive mehr aktives Enzym mit einer größeren Menge

Ziel-DNA reagieren kann.

Für die weiteren Analysen auf dem Laser-induzierten-Fluoreszenz-

Kapillarelektrophoresesystem ABI PRISM 310 (Perkin Elmer Applied Biosystems,

Foster City, USA) mussten die PCR-Produkte mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert

sein. Daher wurden in PCR–Ansätzen für die im Folgenden beschriebene

Endonukleasereaktion ein Fam- und ein Hex-markierter Primer eingesetzt. Für

Sequenzierungen wurden die Templates lediglich einfach Fam-markiert.

Des Weiteren ist es sowohl für Sequenzierung als auch Endonukleaseverdau

von großer Bedeutung, spezifische und vor allen Dingen ausreichend stark

amplifizierte Templates zu gewinnen. Gerade bei DNA aus paraffineingebetteten,

fixierten Proben war der Ertrag der PCR oft zu gering. In diesen Fällen wurde nach

31

konzentrierender Aufreinigung des ersten Ansatzes eine zweite PCR mit einer

adäquaten Menge des gewonnenen Templates (je nach Ertrag 10-90%) angesetzt.

Die Bedingungen waren wie oben erläutert, jedoch wurde weniger Primer (5 pmol)

verwendet.

Jeder PCR-Ansatz enthielt eine Negativkontrolle mit Wasser anstelle von

genomischer DNA, um Kontaminationen identifizieren zu können.

5.4. Kapillarelektrophoretische Auftrennung der Amplifikationsprodukte auf dem ABI PRISM 310

Der ABI PRISM 310 ist ein Mikroprozessor gesteuertes

Kapillarelektrophoresesystem, welches in der Lage ist, fluoreszenzmarkierte DNA-

Fragmente zu detektieren. Die zu analysierenden Fragmente werden in eine

gelgefüllte Kapillare injiziert (Injektionszeit 5 Sekunden, Injektionsspannung 15.0 kV).

Unter konstanten Elektrophoresebedingungen (Spannung 15.0 kV, Temperatur 60°C,

Laufzeit 24 Minuten) wandert die negativ geladene DNA durch das Polymer in der

Kapillare in Richtung Anode. Dabei gehen die DNA-Fragmente mit den

Polymermolekülen Verwicklungen ein, die das Laufverhalten verlangsamen und

umso zahlreicher sind, je länger die Fragmente sind. Dadurch kommt es zur

Auftrennung der DNA-Moleküle entsprechend ihrer Größe. Kurz vor Ende der

Kapillare befindet sich die Detektionseinheit des Systems. Dort angelangt, werden

die markierten Fragmente durch einen Argonlaser (Hauptemission bei Wellenlängen

von 488 nm bis 514,5 nm) zu Fluoreszenzemission angeregt. Diese Strahlung wird

nach Linsenfokussierung und prismatischer Aufspaltung von einer CCD Kamera

detektiert (Detektionsfarben: gelb, rot, blau, grün). Die Datenspeicherung und

Analyse erfolgt durch die entsprechende Software des Herstellers (PE Applied

Biosystems, Abi Prism 310 Collection und GeneScan Analysis ® 2.1.1). Da bei

jedem Elektrophoreselauf ein Standard (fluoreszensmarkierte Fragmente bekannter

Größenordnung) mitanalysiert wird, kann jedem Fragment unbekannter Länge seine

Größe bis auf 1-3 Basenpaare genau zugeordnet werden entsprechend dem

Zeitpunkt, an dem es die Detektionseinheit im Verhältnis zum Standard passiert.

Darüber hinaus gibt die Intensität der emittierten Fluoreszenzstrahlung Auskunft über

die Quantität des DNA-Templates. Nach Datenanalyse erhält man ein

32

Elektropherogramm, anhand dessen man die Länge der Fragmente (Position der

entsprechenden Peaks) sowie die Quantität (Höhe, Breite und Fläche der Peaks)

beurteilen kann (Beispiel in Abbildung 11).

Abbildung 11 zeigt das Elektropherogramm des PCR-Produktes von Exon 2 des PMP22-Gens beider erwarteten Länge von 156 bp (schwarzer Peak). Die roten Peaks sind die Signale desLängenstandards GENESCAN-500TM TAMRA (Applied Biosystems).

Für die Analyse auf dem ABI PRISM 310 wurden 0,5 µl der Probe mit 0,3 µl

GENESCAN-500TM TAMRA (Applied Biosystems) in 19,2 µl Wasser (Merck)

aufgenommen. GENESCAN-500TM TAMRA ist in unserem Fall der entsprechende

Referenzstandard zur Bestimmung der Fragmentlängen. Nach erfolgter

elektrophoretischer Auftrennung und Datenanalyse konnte wie oben beschrieben

anhand der Elektropherogramme beurteilt werden, ob in der PCR Fragmente der

gewünschten Länge in ausreichender Menge synthetisiert worden waren.

5.5. Aufreinigung der PCR-Produkte

Für die nachfolgenden Arbeitsschritte war es wichtig, möglichst aufgereinigte

Templates frei von störenden Primern, Proteinen und Salzen zu gewinnen. Daher

erfolgte die Aufreinigung der Templates mit dem PCR Purification Kit (Qiagen). Das

Protokoll des Herstellers (QIAquick spin Handbook) wurde wie folgt adaptiert: Die

PCR-Ansätze wurden je in 100 µl Puffer PB aufgenommen und in die QIAquick spin

columns übertragen. Diese mit einer Silica-Gel Membran ausgestatteten Säulen

binden DNA im salzreichen sauren Milieu, während störende Bestandteile

33

abzentrifugiert und mit dem Eluat verworfen werden können. Nach Waschung mit

700 µl des ethanolhaltigen Puffers PE und einem zusätzlichen Zentrifugationsschritt

wurden die PCR-Produkte mit 30 µl steril filtriertem Wasser (Merck) von der Säule

gelöst. Bei gering amplifizierten PCR-Produkten wurde zweimal mit weniger Volumen

(10-20 µl) eluiert, um die Produktkonzentration zu erhöhen.

5.6. Identifikation heterozygoter Punktmutationen mit der Enzymatischen

Mutationsdetektionsmethode (Enzymatic Mutation Detection, EMD)

Zwar ist die DNA-Sequenzanalyse bis heute aufgrund hoher Sensitivität der

Goldstandard bei der Identifikation von Mutationen, jedoch ist sie mit einem hohen

Arbeits-, Zeit- und Kostenaufwand verbunden. Daher wurden in letzter Zeit viele

andere Systeme entwickelt, die mit ausreichender Sensitivität ein praktikableres,

schnelleres und kostengünstiges Mutationsscreening ermöglichen, z.B. SSCP (engl.:

single-strand conformation polymorphism), HA (engl.: heteroduplex analysis),

TGGE/DGGE (engl.: temperature/denaturating gradient gel electrophoresis) etc.

(Highsmith et al. 1999). In der vorliegenden Studie kam die sogenannte Enzymatic

Mutation Detection EMD zum Einsatz. Es handelt sich um eine enzymatische

Methode, die auf den Eigenschaften der T4 Endonuklease VII aus dem

Bakteriophagen T4 beruht. Dieses zur Gruppe der Resolvasen gehörende Enzym

erkennt Falschpaarungen in DNA-Doppelsträngen („Heteroduplex-Schleifen“) und

schneidet diese Stränge ca. 6 bp 3’-wärts der Fehlpaarung. Um eine Punktmutation

als Fehlpaarung detektieren zu können, werden zunächst fluoreszensmarkierte PCR-

Produkte von den zu analysierenden Proben hergestellt. Vermutet man homozygote

Mutationen, so werden die Proben jeweils mit ebenfalls markierter, nicht mutierter

Wildtyp-DNA versetzt. Nach Hitzedenaturierung wird das Gemisch abgekühlt und die

Einzelstränge hybridisieren wieder zu Doppelsträngen. Dabei kommt es auch zu

Wildtyp-Mutante-Paarungen, welche nun während eines Inkubationsschrittes mit der

T4 Endonuklease erkannt und geschnitten werden können. Die Schnittprodukte

können dann nach elektrophoretischer Auftrennung der Fluoreszenzmarkierung

entsprechend detektiert werden. Vermutet man eine hetergozygote Mutation, kann

auf die Zugabe von Wildtyp-DNA verzichtet werden, da im Ansatz ja bereits ein

Wildtypallel und ein mutiertes Allel enthalten sind. Abbildung 12 stellt den Ablauf der

34

EMD-Reaktion für heterozygote Proben schematisch dar. Die Zuverlässigkeit der

Methode wurde in einer Blindstudie am Tumor-Supressorgen p53 mit einer

Sensitivität von 100% und einer Spezifität von 94% im Vergleich zu Ergebnissen der

Sequenzanalyse bestimmt (Del Tito et al. 1998). Dies ist eine deutliche

Verbesserung zur weit verbreiteten SSCP Methode (Sensitivität 60-80%). Darüber

hinaus ist ein EMD Protokoll für unterschiedliche Amplicons anwendbar, eine

jeweilige Optimierung wie für die SSCP Analyse ist nicht notwendig.

*

*

DNA mit heterozygoter Punktmutation

Vervielfältigung: PCR mit floureszenz-gelabelten Primern

Denaturierung, Hybridisierung

*

*

*

*

*

*

*

*

Zugabe der T4 Endonuklease VII; Erkennen der Fehlpaarung, Schneidevorgang Schnittprodukte

(z.T. fluoreszenzgelabelt)

! Missmatch-Paarung !

Detektion der gelabelten Fragmente (Kappillarelektrophorese auf dem ABI Prism 310)

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

Legende: DNA (Wildtypallel) Fluoreszenz DNA (Allel mit Mutation) T4 Endonuklease VII

* *

Abbildung 12: Ablauf der EMD-Reaktion am Beispiel einer heterozygoten Punktmutation.

Die verwendeten Reagenzien entstammen dem PASSPORTTM Mutation

Scanning Kit (Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden). Es umfasst

T4 Endonuklease VII, je einen Puffer für Enzymverdünnung, Probenverdünnung und

Hybridisierung sowie Stop Solution. Es wurde das Protokoll für heterozygote Proben

angewendet, da in allen untersuchten Fällen eine dominante Mutation sehr viel

wahrscheinlicher ist als eine rezessive. Nur ausreichend amplifizierte DNA konnte

eingesetzt werden. Daher mussten die spezifischen Peaks in der Gene Scan

Analyse auf dem ABI PRISM 310 mindestens eine Höhe von 6000 erreichen; zu

schwach amplifizierte Templates wurden in einer 2. PCR erneut vervielfältigt. Da

35

Punktmutationen im PMP22-Gen sehr selten sind, konnte auf eine Negativkontrolle

verzichtet werden. Jedoch wurde jedes Mal einen Positivkontrolle mitgeschnitten, um

sicherzugehen, dass die Reaktion wie beabsichtigt abgelaufen war. Die

Positivkontrolle war in diesem Fall eine stumme, heterozygote Mutation im Exon 3

des PMP22-Gens.

Für den Hybridisierungsschritt wurden je 3 µl Probenverdünnungspuffer, 2 µl

Hybridisierungspuffer und 10 µl des entsprechenden PCR-Produktes sorgfältig

gemischt und bei 95°C für 5 Minuten denaturiert. Während die Proben auf

Raumtemperatur abkühlten, wurde das Enzym verdünnt (pro Ansatz 2 µl Enzym und

3 µl Verdünnungspuffer). Jede Probe wurde mit 5 µl dieser Verdünnung gemischt

und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. An diesem Punkt wurde das vom Hersteller

angegebene Protokoll verlassen, da die Analyse nicht, wie vorgegeben, mit dem ABI

PRISM 377, sondern mit dem ABI Prism 310 erfolgte. Im Herstellerprotokoll ist nach

der Inkubation die Zugabe des sogenannten Stop Mix vorgesehen, welches aus je

4 µl der im Kit enthaltenen Stop Solution sowie den für die Analyse auf dem ABI

PRISM 377 vorgesehenen Reagentien Molecular Weight Marker (1 µl) und Loading

Buffer (1 µl) besteht. Die 6 µl Stop Mix werden dann mit 4 µl Reaktionsgemisch

versetzt, gemischt, 3 min bei 95°C denaturiert und auf dem ABI PRISM 377

analysiert. Nicht verwendeter Reaktionsansatz soll bei –20°C gelagert werden. In

unserem Fall waren verschiedene Optimierungsversuche notwendig, um die EMD

Resultate auf dem ABI PRISM 310 zu analysieren:

1. Ansatz: Es wurden 4 µl des Reaktionsansatzes mit einem Gemisch aus

12 µl Stop Solution sowie 0,5 µl GENESCAN-500TM TAMRA als Längenstandard

versetzt, der restliche Reaktionsansatz wurde wie angegeben eingefroren. Das

Gemisch wurde 1 min bei 95°C denaturiert. Für die elektrophoretische Auftrennung

wurden die gleichen Bedingungen wie für PCR-Fragmente gewählt (Injektionszeit 5

Sekunden, Injektionsspannung 15.0 kV, Elektrophoresespannung 15.0 kV,

Temperatur 60°C, Laufzeit 24 Minuten).

2. Ansatz: Die kapillarelektrophoretische Auftrennung wurde nicht wie in 1 mit

5, sondern mit 20 Sekunden Injektionszeit durchgeführt.

3. Ansatz: Es wurde gänzlich auf Stop Solution verzichtet und nur 1 µl des

eingefrorenen Reaktionsansatzes mit 20 µl Wasser (Merck) und 0,5 µl GENESCAN-

36

500TM TAMRA vermischt. Vor der Elektrophorese wurde 1 min bei 95°C denaturiert,

die Elektrophoresebedingungen waren wie im zweiten Ansatz.

4. Ansatz: Nach der Inkubation bei 37°C wurde der gesamte Ansatz bei

–20°C eingefroren, um die Reaktion sofort abzubrechen. Zur weiteren Analyse

wurden 10 µl des gerade aufgetauten Reaktionsansatzes einer Ethanolfällung

unterzogen, um alle störenden Bestandteile für die Kapillarelektrophorese zu

entfernen. Im einzelnen lauten die Schritte der Fällung wie folgt: 10 µl Probe wurden

mit je 80 µl steril filtriertem Wasser (Merk), 10 µl 3 M Natriumacetatlösung pH 4,6 und

250 µl 100%igem Ethanol versetzt. Nach 25 Minuten Zentrifugation bei maximaler

Umdrehungsgeschwindigkeit (13000-15000 rpm) wurde die gesamte Flüssigkeit

entfernt und das Pellet mit 250 µl 70%igem Ethanol gewaschen (5 Minuten

Zentrifugation bei 13000-15000 rpm). Das Ethanol wurde abpipettiert und das Pellet

im Trockenschrank bei 37°C getrocknet, bis sämtliche Flüssigkeit entfernt war (ca. 10

Minuten). Die gefällte DNA wurde mit einer Mischung aus 12 µl Formamid und 0,5 µl

GENESCAN-500TM TAMRA gelöst und im ABI PRISM 310 elektrophoretisch

aufgetrennt (Bedingungen wie im 2. Ansatz).

5. Ansatz: Es wurde statt 30 Minuten eine Stunde lang mit dem Enzym

inkubiert. Es wurde der gesamte Reaktionsansatz (20 µl) gefällt und die

Kapillarelektrophorese wie in Ansatz 2 durchgeführt.

6. Ansatz: Die Inkubationszeit betrug eine halbe Stunde, der gesamte

Reaktionsansatz wurde gefällt und die Injektionszeit betrug 20 Sekunden.

7. Ansatz: Die Aufreinigungsmethoden Ethanolfällung und PCR-Purification

Kit (Qiagen) wurden miteinander verglichen: Um den Vergleich auszuführen, wurden

10 µl desselben EMD-Ansatzes (30 Minuten Inkubationszeit) einmal mit der Fällung

und einmal mit dem Purification Kit aufgereinigt. Für die kapillarelektrophoretische

Analyse wurden die Fällungen in 12 µl Formamid mit 0,5 TAMRA aufgenommen. Die

mit dem Aufreinigungskit bearbeiteten Proben wurden mit 14 µl eluiert, 12 µl des

Eluates wurden mit 0,5 µl GENESCAN-500TM TAMRA und 7,5 µl Wasser versetzt.

Die Injektionszeit betrug 20 bzw. in einem zweiten Durchgang 5 Sekunden.

Nach dieser Optimierungsphase zeigte sich, dass mit einer 30-minütigen

Inkubationszeit, Ethanolfällung von 10 µl des Reaktionsansatzes und 5 Sekunden

Injektionszeit die Analyse problemlos durchgeführt werden kann und optimale

Ergebnisse erhalten werden (siehe unter 6.2). Eine vorherige Denaturierung bei 95°C

37

ist nicht notwendig. Anzumerken ist darüber hinaus, dass die Ethanolfällung auch

direkt an den Inkubationsschritt bei 37°C angeschlossen werden kann.

Um für die Interpretation der Ergebnisse optimale Bedingungen zu schaffen,

wurden bei der elektrophoretischen Auftrennung nacheinander jeweils die

ungeschnittene Probe (1 µl aufgereinigtes PCR-Produkt mit 0,5 µl GENESCAN-

500TMTAMRA in 12 µl Formamid) und die geschnittene Probe injiziert. Meistens

reicht eine Injektionszeit von 5 Sekunden aus, bei Bedarf kann die Injektionszeit

erhöht werden. Die entsprechenden Elektropherogramme konnten so schließlich

übereinanderprojiziert werden, so dass man genau erkennen konnte, ob nach der

Schneidereaktion neue Peaks entstanden waren. Alle auffälligen Proben wurden

dann der Sequenzanalyse unterzogen.

5.7. Automatisierte DNA-Sequenzanalyse

Für die automatische Sequenzierung von DNA sind viele Methoden entwickelt

worden, basierend auf chemischen (Maxam und Gilbert 1977) oder enzymatischen

Prinzipien. Die klassische Version nach Sanger verwendet die T7-Polymerase

(Sequenase®), radioaktiv markierte Primer, Desoxyribonukleotide, sowie

Didesoxyribonukleotide (Sanger et al. 1977). Es werden vier parallele Ansätze

benötigt, in denen je eine Sorte Didesoxyribonukleotid (ddATP, ddTTP, ddCTP,

ddGTP) mit den normalen Nukleotiden konkurriert. Während der Reaktion baut die

T7-Polymerase neben den Desoxyribonukleotiden somit auch die konkurrierenden

Didesoxyribonukleotide ein, die zum Syntheseabruch führen. Das Verhältnis von

Desoxyribonukleotiden zu Didesoxyribonukleotiden ist dabei so gewählt, dass neben

kurzen Abbruchfragmenten auch lange Fragmente entstehen. Die unterschiedlich

langen, markierten Fragmente können dann nach vierspuriger elektrophoretischer

Auftrennung detektiert werden. Die in der vorliegenden Arbeit verwendete modernere

Variante dieser Methode wird als „Cycle Sequencing“ bezeichnet und bietet im

Vergleich einige entscheidende Vorteile: Es wird nur ein Reaktionsgefäß benötigt

und es tritt keine radioaktive Strahlung auf, da fluoreszenzmarkierte

Didesoxyribonukleotide eingesetzt werden (Schema siehe Abbildung 13 auf Seite

42). Der verwendete ABI PRISM® BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing Ready

Reaction Kit enthält das Enzym AmpliTaq®Polymerase, FS (FS für Fluoreszenz-

38

Sequenzierung). Es handelt sich um die Doppelmutante der hitzestabilen

Wildtyppolymerase aus dem Bakterium Thermus aquaticus: Die erste Mutation

(G46D) bewirkt den Verlust der 5’-3’ Nucleaseaktivität des Enzyms. Durch die zweite

Mutation im aktiven Zentrum der Polymerase (F667Y) wird sie toleranter gegenüber

den Kettenabbruch-Didesoxyribonukleotiden, so dass diese leichter eingebaut

werden können. Des Weiteren ist das Enzym mit einer Pyrophosphatase assoziiert,

die Pyrophosphorylierungprobleme minimieren soll.

Für die Sequenzierungsreaktion wurden stets einfach Fam-markierte PCR-

Produkte hergestellt, die, wie oben beschrieben, mit dem PCR Purification Kit

aufgereinigt wurden. Zwar ist die Reaktion auch mit zweifach markierten Templates

möglich, es kommt jedoch an den Primerpositionen zu störenden

Fluoreszenzüberstrahlungen.

markierte Produkte

A

ACGTCA

ACGTC

ACGT

ACG

AC

Reaktionsansatz: Fluoreszenzmarkierte

ddNTPs (T C A G) Enzym

Primer

Puffer

dNTPs

DNA

Denaturierung des original-Templates Einstieg in den Zyklus

orginal Template

Primeranlagerung

Denaturierung

ACGT

Kettenverlängerung ACGT

Abbildung 13 stellt das Prinzip des Cycle-Sequencing anhand eines exemplarischen Zyklusdar. Nach 25 Zyklen enthält man ausreichend viele Fragmente, um die Sequenz auf dem ABIPrism 310 Genetic Analyzer zu ermitteln (Abbildung gemäß dem ABI PRISMTM Kurshandbuch:Sequenzanalyse (310), S. 2.3, Ausgabe von Dezember 1998).

39

Um abzuschätzen, wie viel Template in die Sequenzierungsreaktion

eingesetzt werden muss, wurden die Gene Scan Analyseergebnisse zu Grunde

gelegt: DNA aus archiviertem Material konnte ab einer Peakhöhe von 5000

sequenziert werden. Waren die Peaks kleiner, so wurde nach Aufreinigung eine

zweite PCR angesetzt. Bei DNA aus Frischmaterial waren die Peaks oft sehr viel

höher, bzw. im Elektropherogramm „abgeschnitten“. Diese Proben wurden dann 1:10

verdünnt bevor sie zur Sequenzierung eingesetzt werden konnten. Die für die

Analysereaktion verwendeten nicht markierten Primer entsprechen den in der PCR

eingesetzten Oligonukleotiden. Die Reaktion wurde in Anlehnung an die

Herstellerempfehlung des ABI PRISM® BigDyeTM Terminator Cycle Sequencing

Ready Reaction Kit durchgeführt. Dieser Kit enthält ein Premix (Terminator Ready

Reaktion Mix), welches folgende Reagenzien umfasst: Enzym AmpliTaq®

Polymerase, FS, mit thermostabiler Pyrophosphatase, die vier mit unterschiedlichen

Fluoreszenzfarbstoffen markierten Didesoxyribonukleotide, die vier nicht markierten

Desoxyribonukleotide, MgCl2 und Tris-HCl Puffer, pH 9. Des Weiteren steht die

Doppelstrang DNA des Plamids pGEM-3Zf(+) mit dem zugehörigen Primer –21

M13 zur Verfügung, welche als Positivkontrolle fungiert. Das von Applied Biosystems

redigierte, aktuelle Arbeitsprotokoll wurde für unsere Bedingungen wie folgt adaptiert:

Pro Ansatz wurden 1 µl der aufgereinigten und gegebenen Falls verdünnten

Template DNA mit 2,5 pmol nicht markiertem Primer (F oder R), 2 µl Premix und

steril filtriertem Wasser (Merck) ad 10 µl zur Reaktion gebracht: Nach einminütiger

Denaturierung bei 96°C folgten 25 Zyklen aus Denaturierung (10 Sekunden bei

96°C), Primerannealing (5 Sekunden bei 58°C) und Extension (4 Minuten bei 60°C).

Nach abschließender Extension von 7 min bei 60°C wurden die Proben auf 4°C

heruntergekühlt. Für Exon 4 betrug die Annealingtemperatur nicht 58 sondern 60°C.

Bis zur Aufreinigung wurden die Ansätze bei 4°C gelagert, jedoch meist nicht länger

als einen Tag. Vor der eigentlichen Analyse musste das Reaktionsgemisch

aufgereinigt werden, um die Nukleotidketten von überschüssigen Reagenzien zu

befreien. Eigens für diesen Zweck ist das Centri Sep Spin Column System von

Princeton Separations (Adelphia, USA) entwickelt worden. Es basiert auf dem von

Sambrook und Kollegen 1989 vorgestellten Prinzip der Gelfiltration (Sambrook et al.

1989). Die Röhrchen sind mit einer Filtermembran sowie einem Pulver ausgestattet,

welches nach Zugabe von 800 µl destilliertem Wasser zu einem Gel polymerisiert.

Nach ausreichender Quellungszeit (am besten über Nacht, mindestens jedoch eine

40

halbe Stunde) lässt man ca. 200 µl des überschüssigen Wassers abtropfen und

zentrifugiert bei 2500 rpm für 2 Minuten. Auf die Gelsäulen wird nun das

Reaktionsgemisch aufgetragen und nochmals mit denselben Bedingungen

zentrifugiert. Das Gel hält die überschüssigen Reagentien zurück, während sich die

aufgereinigten DNA Einzelstränge im Eluat befinden.

Zur Analyse auf dem ABI Prism 310 Genetic Analyzer wurden 4 µl des Eluates

mit 16 µl Wasser versetzt und nacheinander der kapillarelektrophoretischen

Auftrennung unterzogen (Elektrophoresebedingungen: Injektionszeit 30 Sekunden,

Injektionsspannung 2.0 kV, Elektrophoresespannung 15.0 kV, Temperatur 50°C,

Laufzeit 36 Minuten). Die registrierten Daten werden durch das Abi Prism 310

Collection Programm gesammelt und durch das Sequencing Analysis 3.0 Programm

ausgewertet. Jedem detektierten Datenpeak kann entsprechend der emittierten

Fluoreszenz eine Farbe und somit auch eine Base der DNA-Sequenz zugeordnet

werden (grün = Adenin, blau = Cytosin, rot = Thymin, gelb = Guanin, letzteres wird in

Ausdrucken der Übersichtlichkeit halber schwarz dargestellt). Abbildung 14 zeigt ein

Beispiel für eine solche Sequenzanalyse.

Abbildung 14: Das Elektropherogramm zeigt ein Beispiel für eine Sequenzanalyse auf demABI PRISM 310 (Wildtyp Sequenz, Ausschnitt aus PMP22, Exon 3, Hinstrang)

Die Sequenz, die das Programm somit anhand des Elektropherogramms

entschlüsselt, muss immer visuell mit der Wildtypsequenz abgeglichen werden, um

rezessive Mutationen zu erkennen und vom Programm nicht auswertbare Stellen wie

Sequenzüberlagerungen oder ähnliches zu interpretieren.

Fast immer war es nötig, zum eindeutigen Ausschluss einer Mutation sowohl

den Hin- als auch den Rückstrang zu sequenzieren.

41

6. Ergebnisse

6.1. Allgemeine Anmerkungen

In der vorliegenden Studie konnten 59 Proben von Patienten, die an einer Form der

HMSN erkrankt sind, auf Veränderungen der Sequenz des codierenden Bereichs des

PMP22-Gens untersucht werden. Damit umfasst sie alle Patienten mit CMT1 und

HNPP, bei denen das Screening auf Duplikation oder Deletion am Institut für

Neuropathologie Aachen negativ ausgefallen war, sowie einen großen Teil der am

Institut verfügbaren Patientenproben der Erkrankungen DSS und CH.

Auf der Basis der erarbeiteten methodologischen Protokolle konnten bei 58 Patienten

des beschriebenen Patientenkollektivs gemäß den in dieser Arbeit erhobenen

Ergebnissen eine Sequenzveränderung im codierenden Bereich des PMP22-Gens

ausgeschlossen werden. Bei Patient Nr. 18 konnte ein Polymorphismus identifiziert

werden, auf dessen Bedeutung im Folgenden noch ausführlicher eingegangen wird.

6.2. Ergebnisse der Methodenoptimierung

Um optimale Analyseergebnisse zu erlangen, wurde besonderer Wert auf die

dezidierte Ausarbeitung und Verbesserung der angewandten Methoden gelegt.

Dabei gelang es, durch sorgfältige Auswahl der Primer für die vier kodierenden

Exone des PMP22-Gens und modifizierte PCR-Bedingungen ein zuverlässiges

Protokoll zur Vervielfältigung gerade von problematischen DNA-Abschnitten (z.B.

formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe) zu entwickeln. Darüber hinaus

konnte ein äußerst modernes Screeningverfahren, nämlich die enzymatische

Mutationsdetektionsmethode (EMD), für die vorliegenden Anforderungen optimiert

und erstmalig auf dem ABI PRISM 310 etabliert werden. Die Ergebnisse der

einzelnen Optimierungsschritte sollen im Folgenden im Überblick dargestellt werden:

1. Ansatz: (30 Minuten Inkubationszeit / 4 µl Reaktionsansatz + 12 µl Stop

Solution + 0,5 µl GENESCAN-500TM TAMRA / Denaturierung bei 95°C für 1 Minute /

Injektionszeit 5 Sekunden): Das Ergebnis zeigte im Elektropherogramm keinerlei

Signale, nicht einmal die Standardpeaks.

42

2. Ansatz: (wie 1, jedoch 20 Sekunden Injektionszeit): Es konnte ebenfalls

keinerlei Signal detektiert werden.

3. Ansatz: (30 Minuten Inkubationszeit / 1 µl Reaktionsansatz + 20 µl Wasser

(Merck) + 0,5 µl GENESCAN-500TM TAMRA / Denaturierung bei 95°C für 1 Minute /

20 Sekunden Injektionszeit): Der verdünnte Ansatz lässt sich

kapillarelektrophoretisch auftrennen. Im Elektropherogramm erkennt man den Peak

des PCR-Produktes bei 239bp und auch an erwarteter Stelle das Schnittprodukt bei

152.04 bp mit einer Höhe von 380 (schwarzer, „Hex“-markierter Peak in Abbildung

15). Es handelt sich um das längere Fragment, das kurze Schnittprodukt ist im

„Anfangsrauschen“ meist nicht mehr zu detektieren (Verunreinigungen durch Primer-

Dimere und unspezifische kurze Fragmente). Diese in der EMD ermittelte

Schnittstelle entspricht der durch Sequenzanalyse nachgewiesenen Mutation (exakt

bei 153 bp, Details zu dem Fall siehe unter 6.3).

Anmerkung zu den Abbildungen 15 bis 17: Da für die Ansätze 1 bis 5 PCR-Produkte

verwendet worden waren, die im Rückstrang größtenteils Hex (schwarz), zu einem

geringen Teil jedoch auch Fam (blau) markiert waren, ist innerhalb des schwarzen

Peaks bei 153 bp auch ein kleiner blauer Peak zu erkennen.

Abbildung 15: Elektropherogramm der Positivkontrolle des 3. Ansatzes

4. Ansatz: (30 Minuten Inkubationszeit / Fällung von 10 µl des Ansatzes /

Fällungsprodukt + 12 µl Formamid + 0,5 µl GENESCAN-500TM TAMRA / 20

Sekunden Injektionszeit): Dieser Ansatz ermöglicht eine noch bessere Detektion des

43

spezifischen Schnittproduktes (153,58 bp) mit einer Höhe von 2130 (siehe Abbildung

16).

Abbildung 16: Elektropherogramm der Positivkontrolle des 4. Ansatzes

5. Ansatz: (eine Stunde Inkubation / Fällung des gesamten

Reaktionsansatzes (20 µl) / Elektrophorese wie in 4) In diesem Ansatz ist das

detektierte Fragment 1552 hoch (siehe Abbildung 17).

Abbildung 17: Elektropherogramm der Positivkontrolle des 5. Ansatzes.

6. Ansatz: (30 Minuten Inkubationszeit / Fällung des gesamten

Reaktionsansatzes (20 µl) / Elektrophorese wie in 4.). Der Peak des Schnittproduktes

wird mit einer Höhe von 818 detektiert (siehe Abbildung 18 auf Seite 48).

44

Abbildung 18: Elektropherogramm der Positivkontrolle des 6. Ansatzes.

7. Ansatz: (Vergleich Ethanolfällung / PCR-Purification Kit (Qiagen)): Die

gefällten Proben zeigen zwar etwas mehr Hintergrundrauschen, allerdings sind die

Peaks größer als bei Aufreinigung mit dem Purification Kit (siehe Abbildung 19).

PCR-Purification-Kit

Ethanolfällung

Abbildung 19: Vergleich der Aufreinigung mit Ethanolfällung versus PCR-Purification-Kit.

45

Die Zusammenschau der Ergebnisse der Methodenoptimierung zeigt, dass mit

den Bedingungen von Ansatz 4 das Schnittprodukt am besten zu detektieren ist. Im

weiteren Verlauf zeigte es sich, dass bei ausreichender Menge PCR-Produkt oft eine

Injektionszeit von 5 Sekunden ausreichend ist.

Wenn sich beim ersten Screening mit der EMD Auffälligkeiten zeigten,

konnten diese mit der automatisierten DNA Sequenzanalyse verifiziert werden. Somit

konnten in der vorliegenden Studie zwei moderne Verfahren zur Mutationsanalyse in

effizienter und zuverlässiger Weise kombiniert werden.

Es gelang, 91,5% der Proben vollständig zu analysieren. Die Analysen der

einzelnen Exone (insgesamt 252 ohne Kontroll- und Wiederholungsanalysen) lassen

sich wie folgt aufschlüsseln: 27% der untersuchten DNA-Abschnitte wurden

ausschließlich sequenziert und 38% ausschließlich mit EMD untersucht. 33% wurden

beiden Methoden unterzogen, um die neu etablierte EMD-Methode in ihrer

Sensitivität kritisch zu prüfen. Lediglich 2% aller Einzelanalysen waren nicht

durchführbar (siehe Diskussion). Eine detaillierte Aufschlüsselung der Ergebnisse ist

der Tabelle im Anhang (11.3.) zu entnehmen.

Es ist zu betonen, dass die hohe Analysenvollständigkeit nur durch den

kombinierten Einsatz dieser beiden hochsensitiven Methoden möglich war. Die

Ergebnisse zeigen, dass es gerade bei schwierigen Fällen (wie DNA aus fixiertem,

paraffineingebettetem Gewebe) sehr empfehlenswert ist, nach den in dieser Arbeit

erprobten Verfahren zunächst mit EMD zu screenen und in Einzelfällen eine

Sequenzanalyse anzuschließen. Darüber hinaus ist zu erwähnen, dass die in dieser

Studie entwickelte Methodik Anwendung in weiteren Forschungsprojekten in der

Arbeitsgruppe des Institutes für Neuropathologie, Aachen, fand. So konnten mit Hilfe

der hier beschriebenen Enzymatischen Mutationsdetektionsmethode und DNA-

Sequenzanalyse im MPZ-Gen zwei bis dato noch nicht beschriebene

Punktmutationen sowie zwei Polymorphismen nachgewiesen werden. Nach

denselben Prinzipien werden zurzeit neben dem PMP22- und MPZ-Gen auch die

Gene für EGR2 und Cx32 untersucht, so dass die in dieser Arbeit entwickelten

Vorgehensweisen als wegweisend für weitere Forschungsarbeit gewertet werden

können.

46

6.3. Patient Nr. 18

Der 1984 geborene Patient Nummer 18 hatte klinisch zunächst Symptome einer

CMT1 gezeigt. Mit zunehmendem Alter entwickelte sich zusätzlich eine bulbäre

Beteiligung in Form von Dysarthrie sowie bemerkenswerter Weise ein Diabetes

mellitus. Im Alter von 12 Jahren wurde eine Muskelbiopsie sowie eine Biopsie des N.

suralis entnommen. Lichtmikroskopisch zeigt sich im Muskelpräparat eine große Zahl

teilatrophischer und atrophischer Muskelfasern mit ausgedehnten

Fettvakatwucherungen. Die lichtmikroskopische Untersuchung des N. suralis ergibt

eine subtotale Reduktion großer markhaltiger Nervenfasern sowie zahlreiche

Regenerationsgruppen (siehe Abbildung 20). Wiederholt treten zu dünn myelinisierte

Nervenfasern umgeben von zwiebelschalenartig angeordneten

Schwannzellfortsätzen auf. Zusammengenommen zeigen sich also die Merkmale

einer weit fortgeschrittenen gemischten Neuropathie mit axonalen und

demyelinisierenden Anteilen.

Patient Nr. 18 Kontrolle

Kontrolle

Abbildung 20: Dargestellt ist das histologische Präparat des Patienten Nr. 18 (rechts) sowie im Vergleich ein normales Nervenpräparat als Kontrollfall (links). Unter den mikroskopischen Abbildungen befinden sich die zugehörigen dreidimensionalen Histogramme (Anzahl der Nervenfasern, Dicke der Axone und Dicke der Markscheiden sind gegeneinander aufgetragen).

47

Somit ist eine eindeutige diagnostische Zuordnung schwierig, gerade in Anbetracht

der bulbären und endokrinologischen Begleitsymptomatik. Im Screening auf

Duplikation oder Deletion konnte keine veränderte Anzahl des PMP22-Gens

festgestellt werden. Die Sequenzanalyse zeigte im dritten codierenden Exon eine

Veränderung der Wildtypsequenz: Im Codon 97 (TAC) wurde in einem Allel die dritte

Base Cytosin gegen Thymin ausgetauscht (siehe Abbildung 21).

Abbildung 21: Heterozygote Punktmutation im Exon 3 des PMP22-Gens: Austausch der BaseCytosin gegen Thymin im Codon 97 (TAC).

Das Ergebnis war bei Wiederholung von PCR und Sequenzanalyse

reproduzierbar. Auch in der EMD-Reaktion ließ sich an erwarteter Stelle (bei 153 bp)

ein eindeutiges Schnittprodukt feststellen (siehe Abbildung 22), ein ebenfalls in

mehreren Wiederholungen verifizierbarer Befund.

Abbildung 22: Nach EMD und Kapillarelektrophoretischer Auftrennung zeigt sich ein neuesSchnittprodukt bei 153 Basenpaaren.

48

Der Basenaustausch verändert die Aminosäurensequenz allerdings nicht, da

sowohl TAC als auch TAT für Tyrosin codieren.

6.4. Untersuchung auf Mutationen im Cx32-Gen

Um der Erkrankungsursache weiter auf den Grund zu gehen wurden von den

Patienten, die weder eine Duplikation noch eine Punktmutation im PMP22-Gen

aufwiesen, diejenigen ausgewählt, die potentiell Träger einer Mutation des Cx32-

Gens sein konnten. Auswahlkriterien waren männliches Geschlecht, mild bis

mittelgradig ausgeprägte Neuropathie und – besonders wichtig – neben der

demyelinisierenden Komponente Zeichen einer axonalen Schädigung. Es gelangten

die Patienten NPA3B, 4, 56, 68 und 69 zur Untersuchung. Mittels Sequenzanalyse

konnte eine Mutation des Cx32-Gens in allen fünf Fällen ausgeschlossen werden.

6.5. Untersuchung auf MPZ Mutationen

In der Arbeitsgruppe für molekulargenetische Forschung des Instituts für

Neuropathologie Aachen wird neben dem PMP22-Gen auch das MPZ-Gen im

Zusammenhang mit HMSN untersucht. So konnten 40 der 59 Proben auch einer

Untersuchung auf Sequenzveränderungen in den codierenden Exonen des MPZ-

Gens durch cand. med. C. Vitt unterzogen werden. Es wurden dieselben

Arbeitsmethoden eingesetzt. Interessanter Weise konnte in diesem Patientenkollektiv

durch das zusätzliche MPZ-Screening eine Missense-Mutation sowie zwei

Polymorphismen in diesem Gen identifiziert werden, was im Falle der Patientin Nr. 5

zur Klärung der Krankheitsursache führte.

6.5.1. Patientin Nr. 5

Die 1931 geborene Patientin war klinisch durch eine ausgeprägte axonale

Polyneuropathie auffällig geworden. Klinisch vermutete man eine Polyneuropathie

vorwiegend axonaler Genese. Die klinischen Beobachtungen konnten durch die 1996

49

entnommene Nervenbiopsie in soweit bestätigt werden, als die Zahl großer

markhaltiger Nervenfasern in der Tat bis zu 60% reduziert war. Neben Zeichen der

Demyelinisierung stachen besonders die große Zahl regenerierender Nervenfasern

sowie Ansammlungen mononukleärer Zellen hervor. Insgesamt wies das

histologische Bild also Zeichen axonaler, demyelinisierender sowie entzündlicher

Schädigung auf (siehe Abbildung 23)

Die molekulargenetischen Analysen ergaben einen normalen Befund für das PMP22-

Gen, im MPZ-Gen zeigte sich jedoch im Exon 6 eine Punktmutation: Im Codon 237

war die erste Base Guanin zu Adenin mutiert, so dass nicht mehr GCC für Alanin,

sondern ACC für Threonin codiert (weitere Einzelheiten: siehe Vitt et al. 2002).

Abbildung 23: Dargestellt ist das histologische Präparat der Patientin Nr. 5 (rechts), dasPräparat eines Kontrollfalles (links) sowie das zugehörige Ergebnis der Morphometrie.

Patientin Nr. 5Kontrolle

6.6. Patienten Nr. V1, V18 und 44

Auf die Bearbeitung der Patientenproben V1, V18 und 44 soll kurz eingegangen

werden, da hier charakteristische Analyseschwierigkeiten auftraten, die in der

50

Diskussion eingehender betrachtet werden sollen. Bei den Patienten V1 und V18

(beide an kongenitaler Hypomyelinisationsneuropathie erkrankt) wurden DNA-Proben

aus fixiertem, paraffineingebetteten Gewebe gewonnen, welche in der PCR nur

mühsam zu amplifizieren waren. Meist musste eine zweite PCR des ersten PCR-

Produktes durchgeführt werden, um überhaupt genügend Material für die EMD und

die Sequenzanalyse zu erhalten. Im ersten Screening zeigte sich bei beiden Proben

scheinbar eine heterozygote Sequenzveränderung, die zu einer stummen Mutation

geführt hätte. Bei Wiederholung beider PCR Ansätze und der Sequenzanalyse waren

diese Befunde jedoch nicht reproduzierbar, was Polymorphismen in diesen Fällen

ausschloss.

Die DNA von Patientin Nr. 44 (Dejerine Sottas Syndrom) stammte ebenfalls

aus formalinfixiertem, paraffineingebetteten Gewebe, was die Sequenzanalyse

entsprechend heikel gestaltete: Zwar zeigte sich im Hin-Strang des Exon 2 ein Indiz

für eine mögliche heterozygote Mutation, im Rückstrang konnte das entsprechende

Codon jedoch aus technischen Gründen auch bei mehrfacher Wiederholung nicht

dargestellt werden. Dies ist jedoch für einen Mutationsnachweis unabdingbar; daher

wurde eine EDTA-Blutprobe von der Patientin erbeten. Die DNA-Anayse der

Frischprobe zeigte im Hin- und Rückstrang die Wildtypsequenz, so dass eine PMP22

Mutation ausgeschlossen werden konnte.

51

7. Diskussion 7.1. Diskussion der Methode

Zum ersten Mal wurden in dieser Studie Punktmutationsanalysen des PMP22-Gens

mit Hilfe der Enzymatischen Mutationsdetektionsmethode in Kombination mit der

automatisierten DNA-Sequenzanalyse durchgeführt. Unseres Wissens ist die

Arbeitsgruppe des Institutes für Neuropathologie Aachen die einzige, die im großen

Umfang DNA-Analysen an archivierten, paraffineingebetteten Gewebeproben von

HMSN Patienten durchführt. In der Vergangenheit lag der Schwerpunkt jedoch eher

beim Duplikations-/Deletionsscreening des PMP22-Gens (Thiex und Schröder 1998;

Beckmann und Schröder 2000) sowie der Identifikation von Punktmutationen im

CX32 bzw. MPZ-Gen (Senderek et al. 1998; Senderek et al. 2000). In der

vorliegenden Arbeit gelang es erstmalig, für alle codierenden Exone des PMP22-

Gens optimale PCR-Bedingungen zu etablieren, die auch die Amplifikation von DNA

aus formalin- bzw. glutaraldehydfixierten, paraffineingebetteten, Jahrzehnte lang

gelagerten Gewebeproben ermöglicht. Die in anderen Arbeiten vorgeschlagenen

Bedingungen sind zwar für die Analyse von Frischmaterial tauglich, erwiesen sich

aber für die hier gewählte Fragestellung als nicht suffizient. Durch Optimierung der

Methode - besonders durch Verbesserung der PCR-Bedingungen und intensive

Suche nach optimalen Primerpaaren – gelang es, 91,5% der Proben vollständig zu

analysieren. Bezogen auf die Gesamtzahl aller Exonanalysen konnte sogar ein

Vollständigkeitsgrad von 98% erreicht werden. Da Sequenzvarianten des PMP22-

Gens sehr selten sind, wurde auf die Vollständigkeit der Analysen besonders großer

Wert gelegt. Bezogen auf die archivierten Proben machte dies zum Teil einen 2.

PCR-Ansatz notwendig. Insgesamt lassen sich die Beobachtungen anderer Autoren

(Kösel und Graeber 1994) bezüglich der Arbeit mit DNA aus formalinfixierten,

paraffineingebettetem Gewebe durch die in der vorliegenden Arbeit gemachten

Erfahrungen bestätigen: Während Amplifikation von DNA-Sequenzen aus

Frischmaterial keinerlei Probleme bereitet, ist die Menge erzeugten PCR-Produktes

bei Verwendung von DNA aus formalinfixiertem, paraffineingebettetem Gewebe

wesentlich geringer. Durch Steigerung der in der PCR eingesetzten Menge

genomischer DNA konnte das Ergebnis in den meisten Fällen nicht sonderlich

gesteigert werden. Diese Beobachtungen stützen die von mehreren Autoren

52

geäußerte These, dass die DNA aus paraffineingebettetem Gewebe einen

intrinsischen PCR-Inhibitor enthält, der bis dato noch unbekannt ist und durch die

Isolierungsschritte nicht entfernt werden kann (An und Fleming 1991; Kösel und

Graeber 1994). Die Schwierigkeit der Bearbeitung solcher Proben zeigt die

Ergebnisfindung für die Proben V1, V18 und 44. Bei Proben V1 und V18 war die

Ausbeute der PCR trotz optimaler Bedingungen und ausreichendem Einsatz von

genomischer DNA so gering, dass erst die erneute Vervielfältigung des 1. PCR-

Produktes genug Template zur Bearbeitung erbrachte. Jedoch kam es durch die

mehrfache Amplifizierung zur „Einschleppung“ einer Mutation, die dann bei

Wiederholung der Ansätze nicht mehr nachzuweisen war. Dies ist vermutlich darauf

zurückzuführen, dass die Taq-Polymerase keine prove-reading Aktivität hat und nicht

wie in vivo durch korrigierende Enzyme wie Endonukleasen kontrolliert wird. Bei

Patientin 44 blieben die Ergebnisse der Paraffinprobenanalyse auch bei mehrmaliger

Wiederholung uneindeutig, erst die Blutprobe verschaffte Klarheit darüber, ob es sich

um eine Mutation handelte oder nicht. Es wird deutlich, dass die Bearbeitung solch

problematischer Fälle zwar möglich ist, jedoch teilweise zur Erhärtung des

Ergebnisses auf eine Blutprobe zurückgegriffen werden muss. Auch muss nochmals

betont werden, wie wichtig gerade bei solchen Ansätzen mit zweifacher Amplifikation

die Kontrollwiederholung ist, um falsch-positive Ergebnisse auszuschließen.

Darüber hinaus gelang es in der vorliegenden Studie erstmalig, eine neue,

aktuelle Methode im molekulargenetischen Arbeitskreis des Institutes für

Neuropathologie Aachen zu etablieren: die Enzymatische Mutationsdetektion (EMD).

Mit einer Sensitivität von nahe 100% und einer Spezifität von 94% ist sie der bisher

verwendeten SSCP Methode (Sensitivität 60-80%) deutlich überlegen (Del Tito et al.

1998). Die Methode wurde bereits an den unterschiedlichsten Genen erprobt (p53,

CFTR, Rh, BRCA1 etc.), und alle Arten von Basenfehlpaarungen können detektiert

werden. Die EMD übertrifft die SSCP nicht nur in puncto Sensitivität; vorteilhaft ist

darüber hinaus, dass ein einheitliches Protokoll für jegliche Art von Amplicon

verwendet werden kann und sogar Fragmente von einer Größe bis zu 1200 bp

(versus 250 bp bei SSCP) analysiert werden können. Pluspunkte der Methode im

Vergleich zur Sequenzanalyse sind die einfache, wenig störanfällige

Durchführbarkeit, der hohe Probendurchsatz pro Zeiteinheit und die niedrigeren

Kosten (Del Tito et al. 1998; Babon et al. 1999). So muss bei der Sequenzanalyse

meist sowohl der Hin- als auch der Rückstrang analysiert werden, um eine Mutation

53

sicher ausschließen zu können, bei der EMD reicht ein Analysedurchgang. Die

Autoren um Babon und Del Tito führen sogar an, dass EMD bei der Detektion

heterozygoter Mutationen der Sequenzanalyse überlegen sei (Del Tito et al. 1998;

Babon et al. 1999).

Als qualitative Analysemethode muss die Sequenzanalyse also nur in den

Fällen eingesetzt werden, in denen ein Schnittprodukt in der EMD Reaktion auf eine

potentielle Mutation hinweist.

In der vorliegenden Arbeit gelang es darüber hinaus erstmalig, die EMD

Methode unabhängig vom Herstellerprotokoll für die Analyse auf dem ABI PRISM

310 zu modifizieren und zu optimieren. Die Herstellerinstruktionen sowie bisherige

Veröffentlichungen beziehen sich auf den ABI PRISM 377 bzw. Microdevice

Electrophoresis (Schmalzing et al. 2000). Im Zuge der Methodenetablierung wurde

deutlich, dass die Proben auf dem ABI PRISM 310 nicht analysiert werden können,

wenn der Reaktionsansatz nach der Inkubationszeit mit der vom Hersteller

empfohlenen Stop Solution versetzt wird (Ansatz 1). Vermutlich sind so viele

störende Bestandteile (Ionen, Proteine etc.) enthalten, dass die Injektion der DNA-

Fragmente inhibiert wird. Auch Verlängerung der Injektionszeit kann dieses Problem

nicht beheben (Ansatz 2). Diese Vermutung wird durch das Ergebnis von Ansatz 3 gestützt: Verzichtet man auf die Stop Solution und verdünnt den Reaktionsansatz

(was die Konzentration störender Bestandteile reduziert), lassen sich schwache

Signale detektieren. Sehr gute Analyseergebnisse erzielt man, wenn man den

Reaktionsansatz direkt nach der Inkubation einer Ethanolfällung unterzieht (Ansatz 4). Dadurch wird der Gehalt an hochmolekularen Substanzen und Ionen im

Reaktionsansatz auf ein Minimum reduziert und die Injektion in die Kapillare nicht

mehr gehemmt. Die Elektropherogramme der so behandelten Ansätze weisen sogar

meist ein wesentlich geringer ausgeprägtes Hintergrundrauschen auf als die vom

Hersteller veröffentlichten Elektropherogramme auf dem ABI PRISM 377. Eine

Verlängerung der Reaktionszeit auf eine Stunde scheint angesichts des Ergebnisses

von Ansatz 5 nicht ratsam; der Peak des geschnittenen Produktes ist geringer. Dies

könnte daran liegen, dass bei längerem Verdau die unspezifische Schneideaktivität

des Enzyms stärker zum Tragen kommt, was die Anzahl spezifischer Produkte

vermindert. Auch erwies es sich als vorteilhaft, nur die Hälfte des Reaktionsansatzes

zu fällen, der Peak des Schnittproduktes ist in Ansatz 6 (Fällung des gesamten

Ansatzes) nicht höher als in Ansatz 4. Fällt man nur die Hälfte, kann man den

54

ungefällten Rest im Tiefkühlfach aufbewahren. Dies ist in sofern von Vorteil, als die

gefällten Ansätze bei Zimmertemperatur nur begrenzt haltbar sind. Sollte es also bei

der kapillarelektrophoretischen Analyse zu technisch bedingten Verzögerungen

kommen, kann man den Reserveansatz fällen und analysieren, ohne die gesamte

Reaktion wiederholen zu müssen. Zwar ist statt der Fällung auch eine Aufreinigung

mit dem PCR-Purification Kit (Quiagen) möglich, doch ist dies wesentlich teurer und

zeigt in der Praxis keine einschneidenden Vorteile (siehe Ergebnis von Ansatz 7).

Generell ist anzumerken, dass ein kurzfristiges Einfrieren nach der Inkubation mit

dem Enzym vor der Fällung durchaus praktikabel ist, da man so beide Arbeitsschritte

zeitlich unabhängig von einander durchführen kann. Auch kann durch das starke

Herunterkühlen das Risiko unerwünschter Reaktionen zwischen den einzelnen

Schritten minimiert werden.

Bei der Endanalyse auf dem ABI PRISM 310 erwies es sich als vorteilhaft,

zunächst das ungeschnittene und direkt im Anschluss das geschnittene PCR-Produkt

kapillarelektrophoretisch zu analysieren, da man nur so eindeutig feststellen kann,

welche Peaks bereits vorher z.B. als PCR-Artefakte bestanden oder erst nach dem

Verdau mit T4 Endonuklease auftraten. Dadurch, dass beide Fragmente im selben

Lauf analysiert werden, können kleinste material- oder apparaturbedingte

Schwankungen der elektrophoretischen Auftrennung auf ein Minimum reduziert

werden. Auch diese Parallelbetrachtung wurde in den bisherigen Studien nicht

durchgeführt, erleichtert aber enorm die Differenzierung unspezifischer Peaks von

möglichen Schnittprodukten. Von großem Nutzen im Zuge der Methodenetablierung

war der zuvor in der automatischen DNA-Sequenzanalyse detektierte

Polymorphismus bei Patient Nr. 18. Wie erwartet zeigte sich im Bereich der

Mutationsstelle bei 153 bp ein Hex-markierter Peak. Der reziproke Fam-markierte

Peak ist meist nicht sichtbar, da er bei einer Größe von 86 bp im Anfangsrauschen

verschwindet. Die Probe diente in der Folge als Bestätigung dafür, das die

erarbeitete Methode funktioniert: In jedem EMD Ansatz wurde sie als Positivkontrolle

mitanalysiert, jedes Mal war der Peak an entsprechender Stelle detektierbar. Somit

waren also auch die Wiederholbarkeit sowie der zuverlässige Ablauf eines jeden

Ansatzes durch diesen Polymorphismus gesichert. Überdies spricht die

Beobachtung, dass der 153 bp Peak in den EMD Analysen des Exon 3 anderer

Proben nicht zu detektieren war - neben dem eindeutigen Korrelat in der

Sequenzanalyse - für die Spezifität dieses Schnittproduktes.

55

33% der Analysen wurden mit beiden Methoden durchgeführt. Durch diese

Kontrollanalysen sollte gerade in der Etablierungsphase die Zuverlässigkeit der

EMD-Methode überprüft werden. Auch musste zunächst Erfahrung in der

Interpretation der EMD-Elektropherogramme gesammelt werden. Um kein

potentielles Schnittprodukt als „Geisterpeak“ fehl einzuschätzen, wurde mit strengem

Maß beurteilt und im Zweifelsfall häufiger eine Kontrollsequenzierung durchgeführt.

Mit zunehmender Erfahrung zeigt sich aber, dass gewisse Peaks in allen Analysen

eines jeweiligen Exons auftreten können, ohne dass eine Mutation in der Sequenz

nachzuweisen ist. Diese unspezifischen Hintergrundpeaks entstehen vermutlich

durch Fraktionierung der PCR-Produkte während des Fällungsvorgangs oder durch

unspezifische Schneideaktivität des Enzyms.

Zukünftig sind noch weitere Optimierungsschritte denkbar, um die Effizienz

der Methode für besonders große Gene weiter zu steigern: Wählt man die Abstände

der Primerpaare größer als für SSCP oder Sequenzierung, kommt man schon mit

wenigen EMD Analysen zum Ergebnis. Die Verwendung von Multiplex-PCR-

Ansätzen kann durch unterschiedliche Fluoreszenzmarkierung der Fragmente die

Analysenzahl nochmals verringern.

Wie bereits erwähnt ist das EMD Protokoll für alle Amplicons anwendbar, eine

jeweilige Optimierung für jedes Exon eines Gens wie bei der SSCP Analyse ist nicht

notwendig. Daher konnte das in der vorliegenden Arbeit entwickelte Verfahren in der

molekulargenetischen Forschungsgruppe der Neuropathologie Aachen auch für die

Analyse von Punktmutationen in anderen Genen wie P0, Cx32 und EGR2

übernommen werden. So wurde eine neue methodische Basis für die weitere

Ursachenforschung der HMSN geschaffen, welche von den oben genannten

Vorteilen der Screeningmethode EMD profitieren kann.

7.2. Diskussion des Analyseergebnisses

Es gelang in der vorliegenden Arbeit, für alle 59 Patienten eine Punktmutation im

PMP22-Gen, welche die Aminosäurensequenz verändert, auszuschließen. Dies ist

insofern von Bedeutung, da nun die Grundlage geschaffen wurde, um Analysen an

seltener betroffenen Genen wie zum Beispiel EGR2 anzuschließen. Auch konnte

bereits ein großer Teil der Proben direkt im Anschluss an die PMP22-Analyse dem

56

Screening auf P0-Mutationen unterzogen werden, welches die Identifikation von

einer Mutation sowie zwei Polymorphismen ermöglichte. Darüber hinaus wird anhand

der erhobenen Daten die Seltenheit von Sequenzvariationen im PMP22-Gen

deutlich. Mutationsereignisse im Cx32-Gen (über 200 beschriebene Mutationen bei

CMTX) und im P0-Gen (ca. 50 beschriebene bei CMT1) sind wesentlich häufiger.

Das Ergebnis bestätigt ähnliche Prozentzahlen anderer Veröffentlichungen: In der

European Collaborative Study unter der Leitung von Professor Dr. Christine Van

Broeckhoven wurden 98 Patienten CMT1-Patienten ohne Duplikation des PMP22-

Gens untersucht, jedoch nur 3 Sequenzvariationen (4,1%) gefunden (Nelis et al.

1996). Mersiyanova et al. (2000) konnten unter 115 CMT Patienten ohne Duplikation

lediglich 2 PMP22-Gen Mutationen nachweisen, jedoch 12 Mutationen im Cx32- und

8 im P0-Gen

Auf den in dieser Studie identifizierten Polymorphismus sowie auf die Frage,

welche Erkrankungsursachen nach Ausschluss einer PMP22-Mutation für die

untersuchten Patienten in Frage kommen, soll im Folgenden eingegangen werden.

7.3. Bedeutung des Polymorphismus in Probe Nr. 18

Die in Patientenprobe Nr. 18 entdeckte Mutation führt zu keiner Veränderung der

Aminosäurensequenz des PMP22-Gens. Daher ist es naheliegend, dass es sich um

einen Polymorphismus handelt, der die Erkrankung des Patienten nicht erklären

kann. Allerdings muss gesagt werden, dass trotz des beschleunigten Wachstums

molekulargenetischen Wissens in den letzen Jahren längst noch nicht alle

Zusammenhänge aufgedeckt sind. Es wäre also durchaus denkbar, dass diese

Mutation nicht durch eine Veränderung der Aminosäurensequenz pathogen wirkt,

sondern dass sie Einflüsse auf bis jetzt noch nicht entschlüsselte Funktions- und

Regelkreise hat. Vielleicht wurde eine Bindungsstelle für ein Protein verändert,

welches eine Rolle im Transkriptions- oder Splicingprozess spielt. Es könnte auch

sein, dass eine bis dato noch unbekannte Splice Site Sequenz entstanden ist, die

von einem Schneideenzym der Zelle erkannt und zum falschen Splicing der m-RNA

führt. Im Hinblick auf den aktuellen Kenntnisstand bleibt dies jedoch spekulativ.

In einer anderen Hinsicht haben solche Polymorphismen - auch SNPs (single

nucleotide polymorphisms) genannt – in den vergangenen Jahren an Bedeutung

57

gewonnen: Das „SNP Consortium“ und das „International Human Genome

Sequencing Consortium“ haben intensiv die Suche nach solchen SNPs im humanen

Genom vorangetrieben, um eine „map of human genome sequence variation“ mit

insgesamt 1.42 Milionen SNPs zu erstellen. Dieses Projekt erlaubt zum einen,

Aussagen über die Häufigkeit von Sequenzvariationen im Genom, die

Prädilektionsstellen für SNPs sowie deren Verteilung auf codierende und nicht

codierende Abschnitte zu machen. Zum anderen können bestimmte Muster von

SNPs den Träger besonders empfänglich oder aber resistent gegen Erkrankungen

machen. Gerade bei multifaktoriell vererbten Erkrankungen kann die SNP-Kartierung

also dazu beitragen, identische Muster und Häufigkeiten von SNPs in jeweiligen

Patientenkollektiven zu erkennen und verantwortliche Gene zu identifizieren

(Chakravarti 2001; Sachidanandam et al. 2001). In diesem Kontext ist also der

Nachweis von bisher unbekannten Polymorphismen keineswegs belanglos, sondern

im Rahmen der aktuell betriebenen Forschung von besonderer Bedeutung.

7.4. Potentielle Mutationen außerhalb des codierenden Bereichs des PMP22-Gens

Nach der vorliegenden Untersuchung lässt sich für das untersuchte Kollektiv zwar

eine die Aminosäurensequenz verändernde Mutation im codierenden Bereich des

PMP22-Gens ausschließen, dies heißt jedoch nicht, dass das Gen bei einigen

Betroffenen nicht doch direkt oder indirekt von pathologischen

Sequenzveränderungen betroffen sein kann. So ist zum Beispiel denkbar, dass

Mutationen außerhalb des codierenden Bereichs des PMP22-Gens einen Einfluss

auf seine Transkription oder die Stabilität der m-RNA haben (Keller und Chance

1999). Auch wäre es von Interesse, die Promotorregionen des PMP22-Gens näher

zu untersuchen. Wie auch das Cx32-Gen besitzt das PMP22-Gen einen

nervenspezifischen Promotor sowie Promotoren für die Expression in nichtneuralen

Geweben, welche die gewebsspezifische Transkription steuern.

Sequenzveränderungen im nervenspezifischen Promotor könnten dazu führen, dass

das Gen nicht mehr abgelesen wird, was sich phänotypisch wie eine Deletion, also

eine HNPP Erkrankung, äußern würde. Bei einer Mutation, welche die Ableserate

steigert, könnte sich phänotypisch eine CMT1 ausprägen. Es könnte auch sein, dass

58

mehrere nervenspezifische Promotoren existieren, die zu unterschiedlichen

Entwicklungsstufen der Myelinisation aktiv sind bzw. funktionsspezifisch

unterschiedliche Transkripte initiieren (z.B. für Signaltransduktion oder als

Strukturprotein). Bis jetzt gibt es nur eine Veröffentlichung zu dieser Fragestellung,

bei der unter 31 Patienten keine Mutation im nervenspezifischen Promotor gefunden

wurde (Nelis et al. 1998). Das untersuchte Kollektiv war allerdings nicht sehr groß, es

wurde nur ein Promotor untersucht und die Fragestellung wurde bis jetzt noch nicht

darüber hinausgehend beforscht, so dass bei HMSN Fällen unklarer Genese nach

den üblichen Screeningverfahren durchaus auch eine Analyse der

Promotorenregion(-en) zu erwägen ist – zumal im Promotor des Cx32-Gens bereits

Mutationen identifiziert werden konnten (Ionasescu et al. 1996; Bergmann et al.

2000). Des Weiteren könnte die Transkription des PMP22-Gens beeinflusst werden

durch modifizierende Gene oder epigenetische Interaktion wie Methylierung oder

„genomic imprinting“ (Rieß et al. 1998b)

7.5. Punktmutationen im P0-Gen – gemeinsamer Pathomechanismus für CMT1A und CMT 1B?

Bemerkenswerter Weise konnte bei einer Patientin aus dem für die PMP22-Studie

ausgewählten Kollektiv in weiteren Untersuchungen eine heterozygote

Punktmutation des P0-Gens festgestellt werden (Vitt et al. 2002). Im Anschluss an

die in der vorliegenden Studie geleisteten Analysen konnte in diesem Fall eine

molekulargenetische Ursache für die Neuropathie der Patientin identifiziert werden.

An dieser Stelle wird einmal mehr das unter den HMSN nicht seltene Phänomen

deutlich, dass ein und demselben Krankheitsbild Defekte in unterschiedlichen Genen

zugrunde liegen. Dies wirft die interessante Frage auf, in welcher Weise die

Kandidatengene für HMSN zusammenwirken. Arbeiten über die Assoziation von

PMP22 und P0 in den Myelinscheiden legen die Vermutung nahe, dass es für

CMT1A und CMT1B einen gemeinsamen Pathomechanismus gibt, der somit zum

selben Phänotyp führt (Muller 2000). In diesem Zusammenhang sind die von

Brancolini et al im Jahre 2000 publizierten Ergebnisse interessant: Sie zeigten, dass

Produkte punktmutierter PMP22-Gene nicht an der Zelloberfläche präsentiert

werden, diese Präsenz jedoch unabdingbar für die Fähigkeit des Proteins ist,

59

Zellformung und Zelltod zu regulieren (Brancolini et al. 2000). Die Autoren vermuten,

dass PMP22 Teil an einem Signaltransduktionsprozess der Plasmamembran beteiligt

ist. Es könnte also sein, dass sich PMP22 im Rahmen dieses Prozesses mit anderen

Proteinen der Plasmamembran zu einem Komplex zusammenlagert, oder aber dass

PMP22 im Rahmen einer Signaltransduktionskaskade mit anderen Proteinen in

Interaktion tritt. Das P0 Protein könnte ein Partner des PMP22-Gens im Rahmen

dieser membrangebundenen Vorgänge sein; Griffiths et al. (1992) konnten sogar

zeigen, dass es zwischen den beiden Proteinen zu einer heterophilen Interaktion

über die L2/ HNK-1 Epitope der glykosylierten Links kommt. Solche Interaktionen

könnten der Grund dafür sein, dass ein Phänotyp wie bei Patientin Nr. 5 zunächst

eine Veränderung des PMP22-Gens vermuten lässt, bei Analyse jedoch eine

Veränderung des Partnerproteins P0 zu Tage tritt. Es wäre höchst interessant,

weitere Einblicke in das Zusammenwirken speziell dieser, aber auch anderer

Myelinproteine zu gewinnen.

7.6. Andere im Zusammenhang mit HMSN stehende Gene und Proteine

Die vorliegende Studie wirft die Frage auf, welche Gene abgesehen vom PMP22-

Gen in die Pathogenese der HMSN involviert sein könnten. Für die X-chromosomale

Form der CMT konnten bisher über 200 Mutationen im Cx32 Gen nachgewiesen

werden. Die Häufigkeit dieser Mutationsereignisse veranlasste uns, 5 männliche

Patienten mit einer milderen, gemischten Form der Neuropathie aus dem

vorliegenden Kollektiv auszuwählen und einer Cx32-Analyse zu unterziehen. Die

Sequenzanalyse des codierenden Bereichs sowie der Promotorregion zeigte

allerdings keine Beteiligung dieses Gens. Wie bereits erwähnt konnten auch für

einen großen Anteil der Patienten in einer Parallelstudie P0-Mutationen

ausgeschlossen werden. Welche weiteren Analysen kommen für diese zwei bzw.

dreifach gescreenten Proben nun in Betracht? Bell und Kollegen wiesen 1998 darauf

hin, dass im Zusammenhang mit HMSN neben dem PMP22-, P0- und Cx32-Gen

noch mindestens acht weitere Genloci identifiziert wurden (Bell et al. 1998). Die

weitere Entwicklung zeigte, dass es sich bei einem der unbekannten Loci um das

EGR2-Gen, welches für einen auch Krox2 genannten Transkriptionsfaktor kodiert,

handelt. Bemerkenswerter Weise reguliert EGR-2 unter anderem auch die

60

Expression von PMP22, P0 und Cx32 (Nagarajan et al. 2001) – daher wäre die

Analyse dieses Gens im vorliegenden Patientengut eine weitere interessante

Aufgabe für folgende Studien.

Spätestens seit der Entdeckung von EGR2-Mutationen bei an HMSN

erkrankten Patienten ist die Betrachtung von Proteinen, die regulierend auf die

Transkription des PMP22-Gens Einfluss nehmen, besonders vielversprechend.

Außer EGR2 ist von den Transkriptionsfaktoren und anderen Regulatorproteinen der

Myelinogenese nur Oct 6 bekannt (Kamholz et al. 1999), dessen Bedeutung für die

Pathogenese der HMSN noch nicht geklärt ist.

Darüber hinaus wird seit Kurzem das LITAF-Gen (lipopolysaccharide-induced

tumor necrosis factor-alpha factor) als ursächlich für CMT1C diskutiert (Street et al.

2003). Dieses Gen codiert für ein in den Proteinabbau (Degradation) involviertes

Protein. Abgesehen davon wurden in letzter Zeit einige neue Gene als verantwortlich

für die CMT4 (rezessiv vererbte demyelinisierende Form der CMT) identifiziert (z.B.

GADP1, MTMR2, SBF2, NDRG1, siehe auch unter Abschnitt 2.1). Interessant wäre

es zu untersuchen, ob diese Gene eventuell auch andere Erkrankungsformen aus

dem Kreis der HMSN verursachen. Für das Myotubularin-relatet protein 2-Gen

(MTMR2) wurde ein solcher Zusammenhang schon von Bolino et al. (2001)

betrachtet. So scheint dieses Gen, dessen zugehöriges Protein ebenfalls in die

Transkriptionsregulation eingeschaltet ist, in sehr seltenen Fällen auch für andere

Formen der HMSN (z.B. CH) verantwortlich zu sein. Es ist zu erwarten, dass durch

die Entschlüsselung von Regulationsmechanismen der Myelinogenese weitere

Kandidatengene für die molekulargenetische Forschung ins Blickfeld gelangen.

Auch ist noch nicht geklärt, welche Bedeutung andere Myelinscheidenproteine

peripherer Nerven für die Entstehung erblicher Neuropathien haben können.

Tiermodelle geben Hinweise auf das myelinbasische Protein MBP und das

myelinassoziierte Glykoprotein MAG: die shiverer-Mausmutante besitzt eine Mutation

im MBP-Gen und auch das Knock-out Modell für MAG zeigt eine gestörte

Myelinscheidenbildung sowie Zeichen der Neuropathie (Rieß und Schöls 1998a). Ein

Zusammenhang zu den beim Menschen bekannten Erkrankungen des peripheren

Nervensystems oder im Speziellen den HMSN konnte bisher noch nicht gesichert

werden. Bei der Trembler Mausmutante sind allerdings PMP22, P0 und MBP in

ultrastrukturellen immuncytochemischen Analysen deutlich vermindert nachweisbar;

61

MAG zeigt eine abnorme Lokalisation (Vallat et al. 1999) – ein weiteres Indiz für den

engen funktionellen Zusammenhang dieser Proteine.

Insgesamt wird deutlich, dass noch längst nicht alle Möglichkeiten der

Pathogenese erblicher Neuropathien bekannt und erforscht sind. Nicht zuletzt ist die

große Zahl nicht geklärter HMSN Fälle – z.B. aus dem hier untersuchten

Patientenkollektiv - ein Ansporn, die Forschungsprojekte auf diesem Gebiet weiter

voranzutreiben.

7.7. Differentialdiagnostische Überlegungen

Bei einigen in dieser Arbeit untersuchten Patienten konnte nach Betrachtung

klinischer Angaben sowie morphologischer Befunde keine eindeutige Diagnose

gestellt werden. Nach den abgeschlossenen PMP22-Analysen erscheinen nun für

einen Teil der Patienten alternativ diskutierte Diagnosen wahrscheinlicher zu sein.

Ins Besondere sind dies Patienten, bei denen der begründete Verdacht auf ein

entzündliches Geschehen bestand. Zusätzlich zu den für die HMSN

charakteristischen Veränderungen hatten die Befunde bei diesen Patienten in

unterschiedlicher Ausprägung leukozytäre Infiltrate und Anzeichen der Vaskulitis

oder Polyneuritis gezeigt. Neben anderen Subtypen der HMSN kommt nun für 7 der

59 untersuchten Patienten eher die Diagnose eines Guillain-Barré-Syndroms (GBS),

für 3 Patienten die Chronische Inflammatorische Demyelinisierende Polyneuropathie

(CIDP) in Betracht. Wie bereits erwähnt ist die Abgrenzung von HMSN und

entzündlichen Neuropathien schwierig – sowohl bei CIDP als auch bei der chronisch

wiederkehrenden experimentellen allergischen Neuritis können

Zwiebelschalenformationen nachgewiesen werden (Pollard et al. 1975; Thomas et al.

1997). Molekulargenetische Analysen wie diese können also wie in den 9 genannten

Fällen zur Entscheidungsfindung in unklaren Fällen beitragen.

5 Patienten weisen neben der demyelinisierenden Komponente des

neuropathischen Geschehens eindeutige Zeichen der axonalen Schädigung auf. Sie

wurden in dieser Studie ebenfalls untersucht, da es zu einer solchen Schädigung in

Folge der abnormen Myelinisierung kommen kann. Die nachweislich fehlende

Aberration im PMP22-Gen legt nun den Verdacht nahe, dass es sich in diesen Fällen

vielleicht auch um primär axonale Prozesse handelt. Dies wiederum veranlasst dazu

62

- soweit bekannt - andere Genorte zu untersuchen und ist somit richtungsweisend für

die weitere Diagnostik und Forschung.

Schließlich muss bei der Befundinterpretation auch das Alter der Patienten

berücksichtigt werden. 20 der hier untersuchten Patienten waren bei Einsendung der

Biopsien älter als 50 Jahre. Im fortgeschrittenen Alter wird es natürlich immer

schwieriger, toxische Einflüsse, endokrine Erkrankungen (Diabetes mellitus),

entzündliche Geschehen, stattgehabte Traumata und andere Umweltfaktoren mit

schädigendem Einfluss auf periphere Nerven auszuschließen. Diese können den bei

HMSN auftretenden Veränderungen sehr ähnlich sein, wie in mehreren Studien

nachgewiesen werden konnte: Durch Injektion von reizenden Substanzen oder

wiederholte „tourniquet compression“ können hypertrophische, zwiebelschalenartige

Veränderungen im Nerv sogar experimentell erzeugt werden (Weller und Das Gupta

1968; Dyck 1969). Gerade unter den älteren Patienten könnten daher also auch

einige sein, deren Neuropathie nicht durch einen zu HMSN führenden genetischen

Defekt, sondern durch andere exogene wie auch endogene Prozesse hervorgerufen

wurde.

63

8. Zusammenfassung

In der vorliegenden Studie wurden 59 Patienten, die an unterschiedlichen Formen

einer hereditären motorisch-sensorischen Neuropathie erkrankt waren, auf

Sequenzveränderungen im codierenden Bereich des PMP22-Gens untersucht.

Erstmalig kam hier die Methode der Enzymatischen Mutationsdetektion (EMD) in

Kombination mit der automatisierten DNA-Sequenzanalyse an Patientenproben zum

Einsatz, deren DNA aus archivierten, paraffineingebetteten Suralnervenbiopsien

gewonnen wurde. Durch die Optimierung der EMD für die kapillarelektrophoretische

Analyse auf dem ABI PRISM 310 gelang es, eine hochaktuelle Methode mit nahezu

hundertprozentiger Sensitivität für ein effizientes Mutationsscreening zu etablieren.

So war es möglich, im ausgewählten Patientenkollektiv für 58 Patienten eine

Mutation im PMP22-Gen sicher auszuschließen. Bei Patient Nr. 18 konnte ein

Polymorphismus im Exon 3 nachgewiesen werden. Die vorliegende Untersuchung

unterstreicht also die Seltenheit von Sequenzvarianten im PMP22-Gen und gewährt

Einblick in die Häufigkeitsverteilung allelischer Varianten dieses Gens. Überdies

konnten für fünf Proben Mutationen im Cx32-Gen und für 39 Proben Mutationen im

P0-Gen ausgeschlossen werden (letzteres durch C. Vitt). Somit liefert diese Studie

die Ausgangsbasis für Untersuchungen weiterer mit HMSN assoziierter Gene wie

z.B. EGR2. Es ist zu betonen, dass mit den beschriebenen Verfahren auch nach

jahrelanger Archivierung eine valide Untersuchung und gegebenenfalls

Reklassifikation paraffineingebetteter Gewebeproben möglich ist. So ist gemäß der

erhobenen Analyseergebnisse für 15 Patienten nun eine entzündliche Ursache

(CIDP oder GBS) oder eine axonale Form der Neuropathie als wahrscheinlichere

Ursache des neuropathischen Krankheitsbildes in den Vordergrund getreten.

Insgesamt wird also deutlich, wie wichtig ein umfassendes, effizientes

Mutationsscreening in der modernen Medizin ist: Für die Patienten stellt es ein

minimal invasives diagnostisches Verfahren mit hoher Aussagekraft dar, da das

Ergebnis Grundlage für eine ausführliche genetische Beratung sowie gegebenenfalls

die rechzeitige Einleitung therapeutischer Maßnahmen ist. Nicht zuletzt sind Studien

wie diese auch vom wissenschaftlichen Standpunkt her unerlässlich: Nur durch

stetiges Wachstum des Wissens über Ursachen und pathogenetische

Zusammenhänge der hereditären Neuropathien kommt man dem Ziel, eines Tages

auch kausale, gentherapeutische Hilfen anbieten zu können, Schritt für Schritt näher.

64

9. Literatur 1 Adlkofer K, Naef R, Suter U (1997) Analysis of compound heterozygous mice

reveals that the trembler mutation can behave as a gain-of-function allele. J

Neurosci Res 49: 671-680.

2 An SF, Fleming KA (1991) Removal of inhibitor(s) of the polymerase chain

reaction from formalin-fixed, paraffin wax-embedded tissues. J Clin Pathol 44:

924-927.

3 Archer DR, Cuddon PA, Lipsitz D, Duncan ID (1997) Myelination of the canine

central nervous system by glial cell transplantation: a model for repair of

human myelin disease. Nat Med 3(1): 54-59.

4 Babon JJ, McKenzie M, Cotton RGH (1999) Mutation detection using

fluorescent enzyme mismatch cleavage with T4 endonuclease VII.

Electrophoresis 20: 1162-1170.

5 Beckmann A, Schröder JM (2000) Screening for Charcot-Marie-Tooth type 1A

and hereditary neuropathy with liability to pressure palsy in archival nerve

biopsy samples by direct-double-differential PCR. Acta Neuropathol 100(5):

459-463.

6 Bedford PD, James FE (1956) A family with the progressive hypertrophic

polyneuritis of Dejerine and Sottas. J. Neurol. Neurosurg. Psychiat. 19: 46-51.

7 Behse F, Buchthal F, Carlsen F, Knappeis GG (1972) Hereditary neuropathy

with liability to pressure palsies. Electrophysiological and histopathological

aspects. Brain 95(4): 777-794.

8 Bell C, Haites N (1998) Genetic aspects of Charcot-Marie-Tooth disease. Arch

Dis Child 78: 296-300.

9 Berciano J, Calleja J, Combarros O (1994) Charcot-Marie-Tooth disease.

Neurology. 44(10): 1985-1986.

10 Bergmann C, Schröder JM, Rudnik-Schöneborn S, Zerres K, Senderek J

(2001) A point mutation in the human connexin32 promotor P2 does not

correlate with X-linked dominant Charcot-Marie-Tooth neuropathy in Germany.

Brain Res Mol Brain Res 88(1-2): 183-185.

11 Bergoffen J, Scherer SS, Wang S, Oronzi-Scott M, Bone L, Paul DL, Chen K,

Lensch MW, Chance PF, Fischbeck K (1993) Connexin mutations in X-linked

Charcot-Marie-Tooth disease. Science 262: 2039-2042.

65

12 Bird TD (2000) Charcot-Marie-Tooth Hereditary Neuropathy Overview.

GeneClinics (www.geneclinics.org/profiles/cmt/details.html).

13 Bird TD, Ott J, Giblett ER (1982) Evidence for Linkage of Charcot-Marie-Tooth

Neuropathy to the Duffy Lokus on Chromosome 1. Am J Hum Genet 34: 388-

394.

14 Bolino A, Lonie LJ, Zimmer M, Boerkoel CF, Takashima H, Monaco AP,

Lupski JR (2001) Short communication: Denaturating high-performance liquid

chromatography of the myotubularin-relatet protein 2 gene (MTMR2) in

unrelated patients with Charcot-Marie-Tooth disease suggests a low frequency

of mutation in inherited neuropathy. Neurogenetics 3: 107-109.

15 Bolino A, Muglia M, Conforti FL, LeGuern E, Salih MA, Georgiou DM,

Christodoulou K, Hausmanowa-Petrusewicz I, Mandich P, Schenone A,

Gambardella A, Bono F, Quattrone A, Devoto M, Monaco AP (2000) Charcot-

Marie-Tooth type 4B is caused by mutations in the gene encoding

myotubularin-related protein-2. Nat Genet 25(1): 17-19.

16 Bornemann A, Hansen FJ, Schmalbruch H (1996) Nerve and muscle biopsy in

a case of hereditary motor and sensory neuropathy type III with basal lamina

onion bulbs. Neuropathol Appl Neurobiol 22(1): 77-81.

17 Bort S, Nelis E, Timmerman V, Sevilla T, Cruz-Martinez A, Martinez F, Millan

JM, Arpa J, Vilchez JJ, Prieto F, Van Broeckhoven C, Palau F (1997)

Mutational analysis of the MPZ, PMP22 and Cx32 genes in patients of

Spanish ancestry with Charcot-Marie-Tooth disease and hereditary

neuropathy with liability to pressure palsies. Hum Genet. 99(6): 746-754.

18 Brancolini C, Edomi P, Marzinotto S, Schneider C (2000) Exposure at the cell

surface is required for Gas3/PMP22 to regulate both cell death and cell

spreading: Implication for the Charcot-Marie-Tooth Type 1A and Dejerine-

Sottas Diseases. Molecular Biology of the Cell 11(9): 2901-2914.

19 Brancolini C, Marzinotto S, Edomi P, Agostoni E, Fiorentini C, Muller HW,

Schneider C (1999) Rho-dependent regulation of cell spreading by the

tetraspan membrane protein Gas3/PMP22. Mol. Biol. Cell 10: 2441-2459.

20 Chakravarti A (2001) Single nucleotide polymorphisms: ...to a future of genetic

medicine. Nature 409: 822-823.

21 Chance PF, Alderson MK, Leppig KA, Lensch MW, Matsunami N, Smith B,

Swanson PD, Odelberg SJ, Disteche CM, Bird TD (1993) DNA deletion

66

associated with hereditary neuropathy with liability to pressure palsies. Cell 72:

143-151.

22 Chance PF, Bird TD, Matsunami N, Lensch MW, Brothman AR, Feldman GM

(1992) Trisomy 17p associated with Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 1A

phenotype: evidence for gene dosage as a mechanism in CMT1A. Neurology

42(12): 2295-2299.

23 Charcot JM, Marie P (1886) Sur une forme particulière d'atrophie musculaire

progressive, souvent familiale, débutant par les pieds et les jambes et

atteignant plus tard les mains. Revue de Médecine (Paris) 6: 97-138.

24 Croft PB, Wadia NH (1957) Familial hypertrophic polyneuritis: review of a

previously reported family. Neurology 7: 356-366.

25 De Jong JGY (1947) Over families met hereditarie disposite tot het optreten

van neuritiden, gecorreleard met migraine. Psychiat. Neurol. Bl. 50: 60-76.

26 De Vos A, Sermon K, Van de Velde H, Joris H, Vandervorst M, Lissens W,

Mortier G, De Sutter P, Lofgren A, Van Broeckhoven C, Liebaers I, Van

Steirteghem A (1998) Pregnancy after preimplantation genetic diagnosis for

Charcot-Marie- Tooth disease type 1A. Mol Hum Reprod 4(10): 978-984.

27 Dejerine J, Sottas J (1893) Sur la névrite interstitielle, hypertrophique et

progressive de l'enfance. C R Soc Biol (Paris) 45: 63-96.

28 Del Tito BJJ, Poff HEr, Novotny MA, Cartledge DM, Walker RIn, Earl CD,

Bailey AL (1998) Automated fluorescent analysis procedure for enzymatic

mutation detection. Clin Chem 44(4): 731-739.

29 D'Urso D, Ehrhardt P, Muller HW (1999) Peripheral myelin protein 22 and

protein zero: a novel association in peripheral nervous system myelin. J

Neurosci Res 19(9): 3396-3403.

30 D'Urso D, Prior R, Greiner-Petter R, Gabreëls-Festen AA, Muller HW (1998)

Overloaded endoplasmic reticulum-Golgi compartments, a possible

pathomechanism of peripheral neuropathies caused by mutations of the

peripheral myelin protein PMP22. J. Neurosci. 18: 731-740.

31 Dyck PJ (1969) Experimental hypertrophic neuropathy: pathogenesis of onion

bulb formations produced by repeated tourniquet applications. Arch Neurol 20:

490-507.

67

32 Dyck PJ, Arnason B (1984). Chronic inflammatory demyelinating

polyradiculoneuropathy. Peripheral Neuropathy. Dyck PJ, Thomas PK,

Lambert EH, Bunge R. Philadelphia, Saunders: 2104-2114.

33 Dyck PJ, Chance P, Lebo R, J.A. C (1993). Hereditary Motor and Sensory

Neuropathies. Peripheral Neuropathy. Dyck PJ, Thomas PK, Griffin JW, P.A.

L, J.F. P. Philadelphia, Saunders. 2: 1094-1117.

34 Dyck PJ, Lambert EH (1968a) Lower motor and primary sensory neuron

diseases with peroneal muscular atrophy, I: neurologic, genetic and

elektrophysiologic findings in hereditary polyneuropathy. Arch Neurol 18: 603-

618.

35 Dyck PJ, Lambert EH (1968b) Lower motor and primary sensory neuron

diseases with peroneal muscular atrophy, II: neurologic, genetic and

elektrophysiologic findings in various neuronal degenerations. Arch Neurol 18:

619-625.

36 Fabbretti E, Edomi P, Brancolini C, Schneider C (1995) Apoptotic phenotype

induced by overexpression of the wilde type gas3/PMP22: its relation to the

demyelinating peripheral neuropathy CMT1A. Genes Dev 9: 1846-1856.

37 Fabrizi GM, Cavallaro T, Taioli F, Orrico D, Morbin M, Simonati A, Rizzuto N

(1999) Myelin uncompaction in Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 1A with

a point mutation of peripheral myelin protein-22. Neurology 53(4): 846-851.

38 Fabrizi GM, Simonati A, Taioli F, Cavallaro T, Ferrarini M, Rigatelli F, Pini A,

Mostacciuolo ML, Rizzuto N (2001) PMP22 related congenital hypomyelination

neuropathy. J Neurol Neurosurg Psychiatry 70(1): 123-126.

39 Felice KJ, Seltzer WK (2000) Severe X-linked Charcot-Marie-Tooth

neuropathy due to new mutations [G59R(G-->C), W44X(G-->A)] in the

connexin 32 gene. Eur Neurol 44(1): 61-63.

40 Gabreëls-Festen AA, Bolhuis PA, Hoogendijk JE, Valentijn LJ, Eshuis EJ,

Gabreëls FJ (1995) Charcot-Marie-Tooth disease type 1A: morphological

phenotype of the 17p duplication versus PMP22 point mutations. Acta

Neuropathol 90(6): 645-649.

41 Gabriel JM, Erne B, Pareyson D, Sghirlanzoni A, Taroni F, Steck AJ (1997)

Gene dosage effects in hereditary peripheral neuropathy. Neurology 49: 1635-

1640.

68

42 Gal A, Mücke J, Theile H, Wieacker PF, Ropers HH, Wienker TF (1985) X-

linked dominant Charcot-Marie-Tooth disease: suggestion of linkage with a

cloned DNA sequence from the proximal Xq. Hum Genet 70: 38-42.

43 Gastaut JL, Benaim J, Livet MO, Philip N (2000) Charcot Marie Tooth disease:

exacerbation in pregnancy. Rev Neurol 156(10): 778-779.

44 Griffiths LS, Schmitz B, Schachner M (1992) L2/HNK-1 carbohydrate and

protein-protein interactions mediate the homophilic binding of the neural

adhesion molecule P0. J Nerrosci Res 33: 639-648.

45 Hanemann CO, Muller HW (1998) Pathogenesis of Charcot-Marie-Tooth 1A

(CMT1A) neuropathy. Trends Neurosci 21: 282-286.

46 Harding AE, Thomas PK (1980) Genetic aspects of hereditary motor and

sensory neuropathy (type I and II). J Med Genet 17: 329-336.

47 Hayasaka K, Himoro M, Sato W, Takada G, Uyemura K, Shimizu N, Bird TD,

Conneally PM, Chance PF (1993a) Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 1B

is associated with mutations of the myelin P(0) gene. Nature Genet. 5: 31-34.

48 Hayasaka K, Himoro M, Sawaishi Y, Nanao K, Takahashi T, Takada G,

Nicholson GA, Ouvrier RA, Tachi N (1993b) De novo mutation of the myelin

P(0) gene in Dejerine-Sottas disease (hereditary motor and sensory

neuropathy type III). Nature Genet. 5: 266-268.

49 Highsmith WEj, Jin Q, Nataraj AJ, O`Connor JM, Burland VD, Baubonis WR,

Curtis FP, Kusukawa N, Garner NN (1999) Use of a DNA toolbox for the

characterization of mutation scanning methods. I: Construction of the toolbox

and evaluation of heteroduplex analysis. Electrophoresis 20: 1186-1194.

50 Hildebrandt G, Holler E, Woenkhaus M, Quarch G, Reichle A, Schalke B,

Andreesen R (2000) Acute deterioration of Charcot-Marie-Tooth disease IA

(CMT IA) following 2 mg of vincristine chemotherapy. Ann Oncol 11(6): 743-

747.

51 Holmes JR, Hansen STJ (1993) Foot and ankle manifestations of Charcot-

Marie-Tooth disease. Foot Ankle 14(8): 476-486.

52 Ionasescu VV, Searby BS, Ionasescu BR, Neuhaus IM, Werner R (1996)

Mutations of the noncoding region of the connexin32 gene in X-linked

dominant Charcot-Marie-Tooth neuropathy. Neurology 47: 541-544.

53 Kalaydjieva L, Gresham D, Gooding R, Heather L, Baas F, de Jonge R,

Blechschmidt K, Angelicheva D, Chandler D, Worsley P, Rosenthal A, King

69

RH, Thomas PK (2000) N-myc downstream-regulated gene 1 is mutated in

hereditary motor and sensory neuropathy-Lom. Am J Hum Genet 67(1): 47-58.

54 Kamholz J, Awatramani R, Menichella D, Jiang H, Xu W, Shy M (1999)

Regulation of myelin-specific gene expression. Relevance to CMT1. Ann N Y

Acad Sci 14: 91-108.

55 Kamholz J, Menichella D, Jani A, Garbern J, Lewis RA, Krajewski KM, Lilien J,

Scherer SS, Shy ME (2000) Charcot-Marie-Tooth disease type 1: Molecular

pathogenesis to gene therapy. Brain 123: 222-233.

56 Keller MP, Chance PF (1999) Inherited Neuropathies: From Gene to Disease.

Brain Pathology 9: 327-341.

57 Kennedy WR, Sung JH, Berry JF (1977) A case of congenital hypomyelination

neuropathy. Clinical, morphological, and chemical studies. Arch Neurol. 34(6):

337-345.

58 Koolmann J, Röhm K-H, Wirth J (1998). Molekulare Genetik. Taschenatlas der

Biochemie. Stuttgart, Georg Thieme Verlag: 251.

59 Kösel S, Graeber MB (1994) Use of neuropathological tissue for molecular

genetic studies: parameters affecting DNA extraction and polymerase chain

reaction. Acta Neuropathologica 88: 19-25.

60 Kumar N, Cole J, Parry GJ (1999) Variability of presentation in hereditary

neuropathy with liability to pressure palsy results in underrecognition. Ann N Y

Acad Sci 883: 344-350.

61 Lupski JR, de Oca-Luna RM, Slaugenhaupt S, Pentao L, Guzzetta V, Trask

BJ, Saucedo-Cardenas O, Barker DF, Killian JM, Garcia CA, et al. (1991) DNA

duplication associated with Charcot-Marie-Tooth disease type 1A. Cell. 66(2):

219-232.

62 Lupski JR, Garcia CA (1992) Molecular genetics and neuropathology of

Charcot-Marie-Tooth disease type 1A. Brain Pathol 2(4): 337-349.

63 Madrid R, Bradley WG (1975) The pathology of neuropathies with focal

thickening of the myelin sheath (tomaculous neuropathy): studies on the

formation of the abnormal myelin sheath. J. Neurol. Sci. 25: 415-418.

64 Manfioletti G, Ruaro ME, Del Sal G, Philipson L, Schneider C (1990) A growth

arrest-specific (gas) gene codes for a membrane protein. Mol. Cell Biol. 10:

2924-2930.

70

65 Marques W, Jr., Thomas PK, Sweeney MG, Carr L, Wood NW (1998)

Dejerine-Sottas neuropathy and PMP22 point mutations: a new base pair

substitution and a possible "hot spot" on Ser72. Ann Neurol 43(5): 680-683.

66 Maxam AM, Gilbert W (1977) A new method for sequencing DNA. Proc Natl

Acad Sci U S A Feb;74(2): 560-564.

67 Mersiyanova IV, Ismailov SM, Polyakov AV, Dadali EL, Fedotov VP, Nelis E,

Lofgren A, Timmerman V, van Broeckhoven C, Evgrafov OV (2000) Screening

for mutations in the peripheral myelin genes PMP22, MPZ and Cx32 (GJB1) in

Russian Charcot-Marie-Tooth neuropathy patients. Hum Mutat 15(4): 340-347.

68 Muller HW (2000) Tetraspan myelin protein PMP22 and demyelinating

peripheral neuropathies: new facts and hypotheses. Glia 29(2): 182-185.

69 Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H (1986) Specific

enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold

Spring Harb Symp Quant Biol 51 Pt 1: 263-273.

70 Naef R, Adlkofer K, Lescher B, Suter U (1997) Aberrant protein trafficking in

Trembler suggests a disease mechanism for hereditary human peripheral

neuropathies. Mol Cell Neurosci 9(1): 13-25.

71 Naef R, Suter U (1999) Impaired intracellular trafficking is a common disease

mechanism of PMP22 point mutations in peripheral neuropathies. Neurobiol.

Dis. 6: 1-14.

72 Nagarajan R, Svaren J, Le N, Araki T, Watson M, Milbrandt J (2001) EHR2

mutations in inherited neuropathies dominat-negatively inhibit myelin gene

expression. Neuron 30: 355-368.

73 Nelis E, De Jonghe P, De Vriendt E, Patel PI, Martin JJ, Van Broeckhoven C

(1998) Mutation analysis of the nerve specific promoter of the peripheral

myelin protein 22 gene in CMT1 disease and HNPP. J Med Genet 35(7): 590-

593.

74 Nelis E, Erdem S, Van Den Bergh PY, Belpaire-Dethiou MC, Ceuterick C, Van

Gerwen V, Cuesta A, Pedrola L, Palau F, Gabreels-Festen AA, Verellen C,

Tan E, Demirci M, Van Broeckhoven C, De Jonghe P, Topaloglu H,

Timmerman V (2002) Mutations in GDAP1: autosomal recessive CMT with

demyelination and axonopathy. Neurology 59(12): 1865-1872.

75 Nelis E, Van Broeckhoven C (1996) Estimation of the Mutation Frequencies in

Charcot Marie Tooth Disease Type 1 and Hereditary Neuropathy with Liability

71

to Pressure Palsies: A European Collaborative Studie. Eur J Hum Genet 4: 25-

33.

76 Neundörfer B, Schröder JM, Claus D (1987). Familiäre Polyneuropathie mit

Neigung zu Druckparesen. Praktische Neurologie. Neundörfer B, Schimrigk K,

Soyka D. Weinheim, VCH Verlagsgesellschaft. 2: 525.

77 Nicholson GA, Valentijn LJ, Cherryson AK, Kennerson ML, Bragg TL,

DeKroon RM, Ross DA, Pollard JD, McLeod JG, Bolhuis PA, et al. (1994) A

frame shift mutation in the PMP22 gene in hereditary neuropathy with liability

to pressure palsies. Nat Genet 6(3): 263-266.

78 Ohnishi A, Yamamoto T, Izawa K, Yamamori S, Takahashi K, Mega H, Jinnai

K (2000) Dejerine-Sottas disease with a novel de novo dominant mutation, Ser

149 Arg, of the peripheral myelin protein 22. Acta Neuropathol (Berl) 99(3):

327-330.

79 Olek MJ, Bordeaux B, Leshner RT (1999) Charcot-Marie-Tooth disease type I

diagnosed in a 5-year-old boy after vincristine neurotoxicity, resulting in

maternal diagnosis. J Am Osteopath Assoc 3: 165-167.

80 Pareyson D (1999) Charcot-Marie-Tooth Disease and Related Neuropathies:

Molecular Basis for Distinction and Diagnosis. Muscle & Nerve 22: 1408-1509.

81 Pareyson D, Scaioli V, Taroni F, Botti S, Lorenzetti D, Solari A, Ciano C,

Sghirlanzoni A (1996) Phenotypic heterogeneity in hereditary neuropathy with

liability to pressure palsies associated with chromosome 17p11.2-12 deletion.

Neurology 46(4): 1133-1137.

82 Parman Y, Plante-Bordeneuve V, Guiochon-Mantel A, Eraksoy M, Said G

(1999) Recessive inheritance of a new point mutation of the PMP22 gene in

Dejerine-Sottas disease. Ann Neurol 45(4): 518-522.

83 Patel PI, Lupski JR (1994) Charcot-Marie-Tooth disease: a new paradigm for

the mechanism of inherited disease. Trends Genet 10(4): 128-133.

84 Patel PI, Roa BB, Welcher AA, Schoener-Scott R, Trask BJ, Pentao L, Snipes

GJ, Garcia CA, Francke U, Shooter EM, Lupski JR, Suter U (1992) The gene

for the peripheral myelin protein PMP-22 is a candidate for Charcot-Marie-

Tooth disease type 1A. Nature Genet. 1: 159-165.

85 Pearce JM (2000) Howard Henry Tooth (1856-1925). J Neurol 247(1): 3-4.

72

86 Poeck K, Hacke W (1998). Polyneuropathien und hereditäre Neuropathien.

Neurologie. Poeck K, Hacke W. Berlin, Heidelberg, New York, Springer-

Verlag: 644-647.

87 Pollard JD, King RHM, Thomas PK (1975) Recurrent experimental allergic

neuritis. An electron microscope study. J Neurol Sci 24: 365-383.

88 Raeymaekers P, Timmerman V, Nelis E, De Jonghe P, Hoogendijk JE, Baas

F, Barker DF, Martin JJ, De Visser M, Bolhuis PA et al. (1991) Duplication in

chromosome 17p11.2 in Charcot-Marie-Tooth neuropathy type 1a (CMT 1a).

The HMSN Collaborative Research Group. Neuromuscul Disord. 1(2): 93-97.

89 Rieß O, Schöls L (1998a). Herreditäre Neuropathien. Neurogenetik:

Molekulargenetische Diagnostik neurologischer Erkrankungen. Berlin

Heidelberg, Springer-Verlag: 315-332.

90 Rieß O, Schöls L, Auburger G (1998b). Einführung und tabellarischer

Überblick über genetisch diagnostizierbare neurologische Erkrankungen.

Neurogenetik: Molekulargenetische Diagnostik neurologischer Erkrankungen.

Berlin Heidelberg, Springer-Verlag: 3-14.

91 Roa BB, Dyck PJ, Marks HG, Chance PF, Lupski JR (1993a) Dejerine-Sottas

syndrome associated with point mutation in the peripheral myelin protein 22

(PMP22) gene. Nat Genet 5(3): 269-273.

92 Roa BB, Garcia CA, Suter U, Kulpa DA, Wise CA, Mueller J, Welcher AA,

Snipes GJ, Shooter EM, Patel PI, et al. (1993b) Charcot-Marie-Tooth disease

type 1A. Association with a spontaneous point mutation in the PMP22 gene. N

Engl J Med 329(2): 96-101.

93 Robaglia-Schlupp A, Pizant J, Norreel JC, Passage E, Saberan-Djoneidi D,

Ansaldi JL, Vinay L, Figarella-Branger D, Levy N, Clarac F, Cau P, Pellissier

JF, Fontes M (2002) PMP22 overexpression causes dysmyelination in mice.

Brain 125(Pt 10): 2213-2221.

94 Roussy G, Lévy G (1926) Sept cas d'une maladie familiale particulière. Rev

Neurol (Paris) 1: 427-450.

95 Sachidanandam R, Weissmann D, Schmidt SC, Kakol JM, Stein LD, Marthe

G, Sherry S, Mullikin JC, Mortimore BJ, Willey DL, Hunt SE, Cole CG, Coggill

PC, Rice CM, Ning Z, Rogers J, Bentley DR, Kwok PY, Mardis ER, Yeh RT,

Schultz B, Cook L, Davenport R, Dante M, Fulton L, Hillier L, Waterston RH,

McPherson JD, Gilman B, Schaffner S, Van Etten WJ, Reich D, Higgins J,

73

Daly MJ, Blumenstil B, Baldwin J, Stange-Thomann N, Zody MC, Linton L,

Lander ES, Attshuler D, Group TiSMW (2001) A map of human genome

sequence variation containing 1.42 million single nucleotide polymorphisms.

Nature 15: 928-933.

96 Sahenk Z (1999) Abnormal Schwann cell-axon interactions in CMT

neuropathies. The effects of mutant Schwann cells on the axonal cytoskeleton

and regeneration-associated myelination. Ann N Y Acad Sci 883: 415-426.

97 Sahenk Z, Chen L, Freimer M (1998) A novel PMP22 point mutation causing

HNPP phenotype: studies on nerve xenografts. Neurology 51(3): 702-707.

98 Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB,

Erlich HA (1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a

thermostable DNA polymerase. Science 239(4839): 487-491.

99 Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989) Molecular Cloning: A Laboratory

Manual. Cold Spring Harbor Laboratory.

100 Sanger F, Nicklen S, Coulson AR (1977) DNA sequencing with chain-

terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A Dec;74(12): 5463-5467.

101 Scherer SS, Arroyo E (2002) Recent progress on the molecular organisationof

myelinated axons. J Peripher Nerv Syst 7(1): 1-12.

102 Schmalzing D, Belenky A, Novotny MA, Koutny L, Salas-Solano O, El-Difrawy

S, Adourian A, Matsudaira P, Ehrlich D (2000) Microchip electrophoresis: a

method for high-speed SNP detection. Nucleic Acids Research 28: E43-e43.

103 Schröder JM (1999). Hereditäre motorisch-sensorische Neuropathien (HMSN).

Pathologie des Nervensystems VIII. Pathologie peripherer Nerven. Schröder

JM. Berlin, Heidelberg, Springer-Verlag. 8: 251-412.

104 Schröder JM, Bohl J, von Bardeleben U (1988) Changes of the ratio between

myelin thickness and axon diameter in human developing sural, femoral, ulnar,

facial and trochlear nerves. Acta Neuropathol 76: 471-483.

105 Seitz RJ, Wechsler W, Mosny DS, Lenard HG (1986) Hypomyelination

neuropathy in a female newborn presenting as arthrogryposis multiplex

congenita. Neuropediatrics 17(3): 132-136.

106 Senderek J, Bergmann C, Quasthoff S, Ramaekers VT, Schröder JM (1998)

X-linked dominant Charcot-Marie-Tooth disease: nerve biopsies allow

morphological evaluation and detection of connexin32 mutations (Arg15Trp,

Arg22Gln). Acta Neuropathol (Berl) 95(5): 443-449.

74

107 Senderek J, Bergmann C, Ramaekers VT, Nelis E, Bernert G, Makowski A,

Züchner S, De Jonghe P, Rudnik-Schöneborn S, Zerres K, Schröder JM

(2003) Mutations in the ganglioside-induced differentiation-associated protein-

1 (GDAP1) gene in intermediate type autosomal recessive Charcot-Marie-

Tooth neuropathy. Brain 126(Pt 3): 642-649.

108 Senderek J, Bergmann C, Weber S, Ketelsen UP, Schorle H, Rudnik-

Schoneborn S, Buttner R, Buchheim E, Zerres K (2003) Mutation of the SBF2

gene, encoding a novel member of the myotubularin family, in Charcot-Marie-

Tooth neuropathy type 4B2/11p15. Hum Mol Genet 12(3): 349-356.

109 Senderek J, Hermanns B, Bergmann C, Boroojerdi B, Bajbouj M, Hungs M,

Ramaekers VT, Quasthoff S, Karch D, Schröder JM (1999) X-linked dominant

Charcot-Marie-Tooth neuropathy: clinical, electrophysiological, and

morphological phenotype in four families with different connexin32

mutations(1). J Neurol Sci 167(2): 90-101.

110 Senderek J, Hermanns B, Lehmann U, Bergmann C, Marx G, Kabus C,

Timmerman V, Stoltenburg-Didinger G, Schröder JM (2000) Charcot-Marie-

Tooth neuropathy type 2 and P0 point mutations: two novel amino acid

substitutions (Asp61Gly; Tyr119Cys) and a possible "hotspot" on Thr124Met.

Brain Pathol 10(2): 235-248.

111 Simonati A, Fabrizi GM, Pasquinelli A, Taioli F, Cavallaro T, Morbin M, Marcon

G, Papini M, Rizzuto N (1999) Congenital hypomyelination neuropathy with

Ser72Leu substitution in PMP22. Neuromuscul Disord. 9(4): 257-261.

112 Snipes GJ, Suter U, Welcher AA, Shooter EM (1992) Characterisation of a

novel peripheral nervous system myelin protein (PMP22/SR13). J. Cell Biol.

117: 225-238.

113 Stebbins NB, Conneally PM (1982) Linkage of dominantly inherited Charcot-

Marie-Tooth neuropathy to the Duffy locus in an Indian family. Am J Hum

Genet 34: 388-394.

114 Stögbauer F, Young P, Kerschensteiner M, Ringelstein EB, Assmann G,

Funke H (1998) Recurrent brachial plexus palsies as the only clinical

expression of hereditary neuropathy with liability to pressure palsies

associated with a de novo deletion of the peripheral myelin protein-22 gene.

Muscle Nerve 21(9): 1199-1201.

75

115 Strachan T (1994). Die Analyse menschlicher DNA. Das menschliche Genom.

Verlag SA. Heidelberg Berlin Oxford: 83-110.

116 Street VA, Bennett CL, Goldy JD, Shirk AJ, Kleopa KA, Tempel BL, Lipe HP,

Scherer SS, Bird TD, Chance PF (2003) Mutation of a putative protein

degradation gene LITAF/SIMPLE in Charcot-Marie-Tooth disease 1C.

Neurology 60(1): 22-26.

117 Street VA, Goldy JD, Golden AS, Tempel BL, Bird TD, Chance PF (2002)

Mapping of Charcot-Marie-Tooth disease type 1C to chromosome 16p

identifies a novel locus for demyelinating neuropathies. Am J Hum Genet

70(1): 244-250.

118 Suter U, Moskow JJ, Welcher AA, Snipes GJ, Kosaras B, Sidman RL,

Buchberg AM, Shooter EM (1992a) A leucine-to-proline mutation in the

putative first transmembrane domain of the 22-kDa peripheral myelin protein in

the trembler-J mouse. Proc Natl Acad Sci U S A 89: 4382-4386.

119 Suter U, Snipes GJ, Schoener-Scott R, Welcher AA, Lupski JR, Murphy RA,

Shooter EM, Patel PI (1994) Regulation of tissue-specific expression of

alternative peripheral myelin protein-22 (PMP) gene transcripts by two

promoters. J. Biol. Chem. 269: 25795-25808.

120 Suter U, Welcher AA, Ozcelik T, Snipes GJ, Kosaras B, Francke U, Billings-

Gagliardi S, Sidman RL, Shooter EM (1992b) Trembler mouse carries a point

mutation in a myelin gene. Nature 356: 241-244.

121 Thiex R, Schröder JM (1998) PMP-22 gene duplications and deletions

identified in archival, paraffin-embedded sural nerve biopsy specimens:

correlation to structural changes. Acta Neuropathol 96(1): 13-21.

122 Thomas PK, King RHM, Bradley JL (1997) Hypertrophic neuropathy: atypical

appearances resulting from the combination of type 1 hereditary motor and

sensory neuropathy and diabetes mellitus. Neuopathology and Applied

Neurobiology 23: 348-351.

123 Timmerman V, De Jonghe P, Ceuterick C, De Vriendt E, Lofgren A, Nelis E,

Warner LE, Lupski JR, Martin JJ, Van Broeckhoven C (1999) Novel missense

mutation in the early growth response 2 gene associated with Dejerine-Sottas

syndrome phenotype. Neurology 52(9): 1827-1832.

124 Tobler AR, Notterpek L, Naef R, Taylor V, Suter U, Shooter EM (1999)

Transport of Trembler-J mutant peripheral myelin protein 22 is blocked in the

76

intermediate compartment and affects the transport of the wild-type protein by

direct interaction. J Neurosci Res 19(6): 2027-2036.

125 Tooth HH (1886) The peroneal type of progressive musular atrophy. Lewis,

London.

126 Valentijn LJ, Baas F, Woltermann RA, Hoogendijk JE, van den Bosch NH,

Zorn I, Gabreëls-Festen AW, De Visser M, Bolhuis PA (1992) Identical point

mutations of PMP22 in Trembler-J mouse and Charcot-Marie-Tooth disease

type 1A. Nat Genet 2: 2143-2146.

127 Vallat JM, Sindou P, Garbay B, Preux PM, Anani T, Richard L, Diot M (1999)

Expression of myelin proteins in the adult heterozygous Trembler mouse. Acta

Neuropathol 98: 281-287.

128 Vallat JM, Sindou P, Preux PM, Tabaraud F, Milor AM, Couratier P, LeGuern

E, Brice A (1996) Ultrastructural PMP22 expression in inherited demyelinating

neuropathies. Ann Neurol. 39(6): 813-817.

129 Vance JM (2000) The many faces of Charcot-Marie-Tooth disease. Arch

Neurol 57(5): 638-640.

130 Vance JM, Nicholson GA, L.H. Y, Stajich J, Steward CS, Speer MC, Hung

WY, Roses AD, Barker D, Pericak-Vance MA (1989) Linkage of Charcot-

Marie-Tooth neuropathy type 1A to chromosome 17. Exp Neurol 104: 186-

189.

131 Vitt C, Fuchs C, Wiendieck K, Schröder JM, Beckmann A (2002) PMP22, P0

and Cx32 mutations in HMSN patients identified by enzymatic mutation

detection capillary electrophoresis and sequencing analysis. Acta Neuropathol

104 Number 5: 575.

132 Warner LE, Hilz MJ, Appel SH, Killian JM, Kolodny EH, Karpati G, Carpenter

S, Watters GV, Wheeler C, Witt D, Bodell A, Nelis E, Van Broeckhoven C,

Lupski JR (1996) Clinical phenotypes of different MPZ(P0) mutations may

include Charcot-Marie-Tooth type 1B, Dejerine-Sottas, and congenital

hypomyelination. Neuron 17: 451-460.

133 Warner LE, Mancias P, Butler IJ, McDonald CM, Keppen L, Koob KG, Lupski

JR (1998) Mutations in the early growth response 2 (EGR2) gene are

associated with hereditary myelinopathies. Nat Genet 18(4): 382-384.

77

134 Watson DF, Nachtman FN, Kuncl RW, Griffin JW (1994) Altered neurofilament

phosphorylation and beta tubulin isotypes in Charcot-Marie-Tooth disease

type 1. Neurology 44(12): 2383-2387.

135 Weller RO, Das Gupta TK (1968) Experimental hypertrophic neuropathy: an

electron microscopy study. J Neurol Neurosurg Psychiatry 31: 34-42.

136 Wicklein EM, Pfeiffer G, Ratusinski T, Kunze K (1997) Charcot-Marie-Tooth

Syndrom Typ I. Behinderung und Management. Der Nervenarzt 68(4): 358-

362.

137 Young P, Wiebusch H, Stögbauer F, Ringelstein B, Assmann G, Funke H

(1997) A novel frameshift mutation in PMP22 accounts for hereditary

neuropathy with liability to pressure palsies. Neurology 48: 450-452.

78

10. Anhang 10.1. Sequenzen der untersuchten Exone des PMP22-Gens Dargestellt wird die genomische DNA der Amplicons. Die Codons sind nummeriert

und mit der zugehörigen Aminosäure aufgeführt. Die Primersequenzen wurden grau

unterlegt.

Exon1

1 2 3 4 5cgcccagcgc tctcctcgca ggcagaaact ccgctgagca gaacttgccg ccaga atg ctc ctc ctg ttg

M L L L L

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25ctg agt atc atc gtc ctc cac gtc gcg gtg ctg gtg ctg ctg ttc gtc tcc acg atc gtcL S I I V L H V A V L V L L F V S T I V

26 agc gtgagtg cctggcgggg aggctccctg cgcggcccgc ccttccccat ctgggttccc agcccgtgct cctgctS

Exon2

27 28 29 30 31 32 33cactcctccc tccctccctg actcaggata tctatctgat tctctctag caa tgg atc gtg ggc aat gga

Q W I V G N G

34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52cac gca act gat ctc tgg cag aac tgt agc acc tct tcc tca gga aat gtc cac cacH A T D L W Q N C S T S S S G N V H H

53 54 55 56 57 58 59 tgt ttc tca tca tca cca aac gg tgaggctggt tttgtgctcc atgagcttgt cctcagacgc ctgtaacacgC F S S S P N

Exon3

60 61 62cgaggcagag ccctcccccg gccatggcca gctctcctaa ccaagtgtct ctttccccca gaa tgg ctg

E W L

63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81cag tct gtc cag gcc acc atg atc ctg tcg atc atc ttc agc att ctg tct ctg ttcQ S V Q A T M I L S I I F S I L S L F

82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100ctg ttc ttc tgc caa ctc ttc acc ctc acc aag ggg ggc agg ttt tac atc act ggaL F F C Q L F T L T K G G R F Y I T G

101 102 103 104 105 106 atc ttc caa att ctt gct ggtaagttg tggatggtaa agtccatgtg gaagcggggt gcatccI F Q I L A

aagt ctgcggaatg attagtttag tagaaggatg

Exon4

107ccggggtgg cggagagggg gccgctctgc catggactct ccgtcaccca gcttgtccct ctccttcccc a ggt

G

108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124ctg tgc gtg atg agt gct gcg gcc atc tac acg gtg agg cac ccg gag tggL C V M S A A A I Y T V R H P E W

125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141cat ctc aac tcg gat tac tcc tac ggt ttc gcc tac atc ctg gcc tgg gtgH L N S D Y S Y G F A Y I L A W V

142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158gcc ttc ccc ctg gcc ctt ctc agc ggt gtc atc tat gtg atc ttg cgg aaaA F P L A L L S G V I Y V I L R K

159 160 161 cgc gaa tga ggcg cccagacggt ctgtctgagg ctctgagcgt acatagggaa gggaggaagg gaa R E Stop aacagaa

10.2. Patientenkollektiv: Histopathologische und klinische Daten Nr. Geb.

Dat. Alter

w/m

1 Klinik Zwiebelschalen-formationen

Hypermyeli-nisierte / tomakulöse NF

Hypomyelini- sation

NF-Reduktion2 Regenerations-gruppen

sonstige histo-logische Auffälligkeiten

histologische Beurteilung

2 1971w

24 nächtliche Arm-schmerzen, Parästhesien der Hand, hochpatho-logische NLG (Demyelini-sation), HMSN? GBS?

wiederholt angedeutete Zwiebelschalen-formationen

zahlreiche Markschlingen, eine tomakulöse NF, z.T. breite MS

wiederholt 30% (große, normal myelinisierte Fasern)

vereinzelt Pi-Granula, keineentzdl. Zellinfiltrate

HMSN / HNPP

3 1932m

63 seit 3 J. mäßig verzögete NLG, Liquoreiweiß erhöht, Parästhesien, restless legs

wiederholt zudünn myelinisierte NF

gering selten ein Polyglykosan-körper, mononukleäre Zellen, keine frischen Infiltrate

demyelinisierende NP im Stadium der Remyelinisation, Z. n. GBS?

4 1938m

61 V. a. sensible axonale NP (seit 2 J.)

keine eine tomakulöseNF

mehrfach, einige atrophische Axone

10-20% (große und kleine markhaltige NF)

selten keine entzdl.Zellinfiltrate, Gefäße normal

HNPP

5 1996w

65 sensible Ataxie, PNP vom vorwiegend axonalen Typ

atrophischeAxone mit dicken MS, Markschlingen

50-60% viele wenige MS-Abbauprodukte, mononukleäre Zellinfiltrate, Mastzellen

chron. NP vom überwiegend axonalen Typ mit demyelinisierender Komponente, ausgeprägte Regenerations-tendenz, Z. n. GBS?

6 1939m

57 Polyneuropathie,monoklonale Gammopathie

atrophischeAxone mit dicken MS

wiederholt 30-40% vorhanden Mikroangiopathie, Blut-Nerven-Schranken-Störung?

chron. progrediente Neuropathie, teils axonal, teils demyelinisierend, Mikroangiopathie

8 1961m

35 Polyneuropathie keine wiederholt zudünn myelinisierte NF, ein demyelinisiertes Axon

geringgradig keine vereinzelt MS-Abbauprodukte, keine entzdl. Zellinfiltrate

demyelinisierende Neuropathie, V. a. GBS

9 1937m

68 Wadenschmerz beimGehen EMG verdächtig

wiederholt 20%(markhaltige NF)

keine Endoneuriumödematös, MS-Abbauprodukte perivaskulär

demyelinisierende NP im Stadium der Remyelinisation, Z. n. GBS?

10 1941m

54 DM, Tetraparese nach gastrointestinalem Infekt, NLG normal, massive Denervierungszeichen, schwere axonale PNP / Polyneuritis, DD GBS

schalenförmig angeordnete Schwannzellen

wiederholt 30% (große, normal myelinisierte Fasern)

dünn bemarkte regenerierende NF

MS-Abbauprodukte, obliterative Mikroangiopathie (Vaskulitis / DM?), mononukleäres Zellinfiltrat perivaskulär

demyelinisierende NP im Stadium der Restitution, Z. n. GBS?

11 1948m

47 keine wiederholt 40% (große, normal myelinisierte Fasern)

vereinzelt dünn bemarkte NF

Pi-Granula, MS-Abbauprodukte, obliterative Mikroangiopathie (Z. n. Vaskulitis?), keine floriden entzündl. Zellinfiltrate

demyelinisierende NP im Stadium der Remyelinisation, Z. n. GBS?

12 1977w

21 demyelinisierende,akrodistal betonte, chron. progrediente sensomotorische PNP – HMSN?

zahlreich wenige, auchdemyelinisierte NF, keine segmentale Demyelinisierung

subtotaler Ausfall der großen markhaltigen NF

keine keine entzdl.Zellinfiltrate, Gefäße normal

CMT I oder DSS

13 1915w

74 reichlich wiederholt, auchdemyelinisierte NF

>90% keine Gefäßwände etwasverbreitert, keine entzdl. Zellinfiltrate

CMT I oder CIDP

14 1918w

77 seit ca. 2 Monaten Pallhypästhesie, diskretes motorisches Defizit, herabgesetzte NLG, Potentiale aufgesplittert und verlängert

schalenförmig angeordnete Schwannzellen

wiederholt 80% dünn bemarkte regenerierende NF

Subperi- und endoneurales Ödem; MS-Abbauprodukte; obliterative Mikroangiopathie (Z. n. Vaskulitis?), Mononukleäre Zellen

demyelinisierende NP, Z. n. GBS? Vaskulitis?

16 1934m

65 leichte Fußheberpareseli., atrophische Waden-muskeln, Vorfuß-hypästhesie, V. a. CMT

schalenartig angeordnete Schwannzellen

wenige dünnmyelinisierte NF

70% wiederholt MS-Abbauprodukte,Gefäßwand-veränderungen, keine entzdl. Zellinfiltrate

chronische NP vom neuronalen / axonalen Typ / CMT II

17 1920m

72 seit 5 J. Muskelschwäche, Tetraparese, Sensibilitätsstörungen, Reflexausfälle, NLG langsam / nicht messbar, schlecht eingestellter DM

schalenartig angeordnete Schwannzell-fortsätze

einzeln <5% einzelne selten MS-Abbauprodukte, Angiopathie

Neuropathie vom neuronalen Typ bei Diabetes / CMT II

18 1984m

12 CMT I? bulbäre Beteiligung, endokrine Störungen (Diabetes)

zwiebelschalenartige Veränderungen, paranodale Entmarkung

wiederholt subtotalreduziert

viele vereinzelt MS-Abbauprodukte, keine entzdl. Zellinfiltrate, pseudohypertrophische Muskelatrophie

gemischte NP, CMT I / II

19 1934w

65 V. a. HMSN keine eine tomakulöse NF

vereinzelt

40-50% (große und kleine markhaltige NF)

einige kaum MS-Abbauprodukte, sehr spärliches mono-nukleäres Zellinfiltrat

gemischte NP, HMSN / HNPP

20 1966m

33 seit 6 Wochen Druckläsionen (zuvor Gewichtsreduktion) Leitungsblock, V. a. HNPP

keine Markschlingen,Markscheiden-deformitäten,

wiederholt

eine tomakulöse NF

5-10%, einige atrophische Axone

gelegentlich gelegentlich MS-Abbauprodukte u. frische Büngersche Bänder, keine entzdl. Zellinfiltrate

demyelinisierende NP, HNPP?

21 1993w

57 seit 7 J. Beschwerden, seit 5 J. Tremor (Halte- und Intentionstremor) strumpfförmige Hyp- / Dysästhesien

wiederholt Markschlingen in großer Zahl >90% selten vereinzelt MS-Abbauprodukte

hypertrophische NP, Roussy-Levy Syndrom

22 1942w

56 seit 0,5 J. Taubheitsgefühle, V.a. HNPP

eine zwei wiederholt 20-30% (große und kleine markhaltige NF)

vereinzelt Gefäße normal, keine

entzdl. Zellinfiltrate demyelinisierende NP, evtl. HNPP

26 1956w

31 Hypakusis seit Geburt (auch beim Bruder), seit 1,5 J. gangunsicher, Störung der Feinmotorik li. Hand, Hohlfüße bds. Hyperreflexie, Babinski li. positiv, verminderte NLG, Liquoreiweiß 0,42

um fast alle markhaltigen NF schalenartig angeordnete Schwannzellen

viel 50%(auch kleine markhaltige NF)

DSS, M. Refsum

32 1981m

13 Haltungsschäden,proximale Beinschwäche, kein Fersengang, herabgesetzte NLG, Spastizität

häufig zwiebelschalenartige Schwannzell-manschetten

Markschlingen hypomyelinisierteNF

70-80% spärlich subperineurales undendoneurales Ödem, MS-Abbau, endoneural zahlreiche Mastzellen

DSS

33 1970m

22 Hohlfuß und Atrophie der Unterschenkel

um fast alle NF selten Anzahl reduziert

endoneurales Ödem,kein entzündl. Zellinfiltrat

DSS

37 1961w

33 Friedreichfuß seit Geburt, verzögerte motorische Entwicklung, Ataxie, Areflexie, Muskelatrophie, Torticollis, herabgesetzte Vibrations- und Bewegungsempfindung ENG: Markscheidenläsion

häufig schalenartig angeordnete Schwannzell-fortsätze

häufig,Demyelinisation, unterschiedl. dick myelinisierte NF

hochgradig selten selten MS-Abbauprodukte, kein entzündl. Zellinfiltrat

hypertrophische NP, eher DSS als CMT I

38 1971m

23 Gangunsicherheit,Wadenkrämpfe, Atrophie des M. quadriceps bds.

sehr viele häufig, einige demyelinisierte NF

70-80% vereinzelt ELMI: leichte mitochondriale Myopathie

hypertrophische NP, eher DSS als CMT I

40 1977m

19 schwere sensomotorischeNP, NLG ca. 2 m/s, V. a. kongenitale Hypo-myelinisation / HMSN III

sehr viele sehr viele zu dünn myelinisierte NF, auch Demyelinisation

Gefäße normal, keine entzdl. Zellinfiltrate, MS-Abbauprodukte

DSS

43 1985w

12 Hohlfuß, Hammerzehen,Wadenatrophie, Tremor, kein Hacken- und Zehen-stand, NLG 13,5 m/s

sehr viele viele zu dünn myelinisierte NF

De- undRemyelinisation, Regenerations-gruppen

MS-Abbauprodukte, keine entzdl. Zellinfiltrate

Hypertrophische NP, eher DSS als CMT I

44 1982w

15 sensomotorische NP(DSS)

viele, segmentale Demyelinisation

viele unverhältnis-mäßig dünn myelinisierte NF, demyelinisierte NF

De- undRemyelinisation

vereinzelt MS-Abbauprodukte, keine entzdl. Zellinfiltrate

DSS

46 1961w

38 seit Jahren progrediente Atrophie der Extremitäten-muskulatur, Sensibilitäts-störungen, Elektrophysiologie: HMSN?

zahlreich zahlreich 70% fast keine normalen markhaltigen NF

sehr selten MS-Abbauprodukte, keine entzdl. Zellinfiltrate

DSS

50 1923w

73 eine hyper-myelinisierte NF

vereinzelt 30-40% wiederholt entzdl. Zellinfiltrat perivaskulär

axonale Neuropathie mit demyelinisierender Komponente bei chron. Vaskulitis

51 1937 59 hochgradige, auf die Beine beschränkte, axonale PNP

vereinzelt eine tomakulöseNF

wiederholt, auch demyelinisierte Axone

80-90% (Faszikel unregelmäßig betroffen)

vereinzelt keine entzdl. Infiltrate CIDP oder HMSN oder HNPP

52 1963w

46 V. a. tomakulöse PNP, symptomatisch seit einigen Monaten, Läsionen des N. ulnaris, medianus, peroneus

es wurde nur Blut zur Untersuchung eingesendet

53 1948m

51 zwei zahlreicheMarkschlingen, eine tomakulöse NF

spärlich, De- und Remyelinisation

60% (beson-ders kleine, auch große markhaltige NF)

vereinzelt selten MS-Abbauprodukte, axonale Einlagerungen, endoneurales Ödem, Gefäße normal

gemischte / axonale NP, HSAN I / HNPP

55 1950m

50 V.a. CIDP keine hypermyelinisierteNF, eine tomakulöse NF

wiederholt gering selten vereinzelt MS-Abbauprodukte; spärliche T-Zellinfiltrate

HNPP? / Vaskulitis / Polyneuritis?

56 1954m

45 Engpasssyndrome,Peroneusparese bds., eingeschränkte Fein-motorik, NLG 35m/s, Antigangliosid IGM erhöht

keine hypermyelinisierteNF

einige

20-30% einige kein lockeres Myelin im ELMI, keine entzdl. Zellinfiltrate

hyper-/ hypomyelinisieren-de NP mit axonaler Komponente

57 1945m

55 Kompressionssyndrome,NLG 30-36 m/s, sensomotoeisch gemischte PNP

einmal zwiebel-schalenartig angeordnete Schwannzellfortsätze

Markschlingen, zwei tomakulöse NF

vereinzelt

40-50% (große und kleine markhaltige NF)

anstelle großer, markhaltiger NF wiederholt regenerierende NF

zahlreiche MS-Abbauprodukte, Büngersche Bänder, leichtes Ödem, Mastzellen

axonale NP (aufgrund d. HNPP), Mikroangiopathie

58 1954w

46 keine segmentaleDe- oder Remyelinisation

Markschlingen, eine tomakulöse NF

selten 20% vorhanden kaum MS-Abbauprodukte, leichtes Ödem, keine entzdl. Zellinfiltrate, Gefäße normal

gemischte NP

59 1956w

44 V. a. Spastische Spinalparalyse, DD HMSN, Paraspastik der Beine, Beginn vor 16 J., Demyelinisation der Pyramidenbahn, ENG pathologisch, Atrophie Gyrus prä- und postzentralis

schalenförmig angeordnete Schwannzellen, keine segmentale Demyelinisierung

wiederholt, evtl.sekundär demyelinisiert

40-50% fokal Verlust markloser Axone

vorhanden kaum MS-Abbauprodukte, subperineurales Ödem, keine entzdl. Zellinfiltrate, Gefäße normal

CMT V, axonale NP

60 1970w

29 Pallhypästhesie,Fallneigung, kein Blindgang möglich, EMG: gemischte PNP

zahlreich eine tomakulöseNF, Mark-schlingen, hyper-myelinisierte NF

wiederholt, eine demyelinisierte NF

kaum, vereinzelt degenerierende NF

vereinzelt keine entzdl.Zellinfiltrate; Gefäße z.T. kollabiert

demyelinisierende NP mit axonaler Komponente HNPP?

61 1970m

30 V. a. tomakulöse NP (seit 1999)

es wurde nur Blut zur Untersuchung eingesendet

64 1935w

75 asymmetrische,multifokale sensomotorische NP sowie distal betonte symmetrische, sensomotorische axonale NP, V. a. HNPP

es wurde nur Blut zur Untersuchung eingesendet

68 1954m

46 V. a. HMSN es wurde nur Blut zur Untersuchung eingesendet

69 1984m

16 V. a. tomakulöse NP es wurde nur Blut zur Untersuchung eingesendet

AC48 1990m

8 Areflexie, distaleMuskelschwäche, Laufen erschwert, Z. n. Achillotomie, NLG 44,8 m/s, zunehmend Arme betroffen

viele viele zu dünn myelinisierte NF

90% wiederholt MS-Abbauprodukte,keine entzdl. Zellinfiltrate

Neuropathie vom gemischten Typ, Sonderform der HMSN

AC78 1986m

11 DSS bei der Schwester, Vater auch betroffen, verminderte NLG, Pes cavo-varo-adductus bds.

einige, segmentale Demyelinisation

Markschlingen wiederholt

NF-Dichte 70-80% reduziert (große u. kl. markhaltige NF)

vereinzelt vereinzelt MS-Abbauprodukte

Hypo- / Hypermyelinisa-tionsneuropathie

AC103 1994m

3 V. a GBS / CIDP schalenförmig angeordnete Schwannzellen

relativ dick myelinisierte große Axone

ELMI: viele demyelinisierte NF, alle markhaltigen NF zu dünn myelinisiert, große nichtmyeli-nisierte Axone

NF Dichte 70-80% reduziert, keine akute Degeneration

De- und Re-myelinisations-vorgänge

MS-Abbauprodukte, subperineurales Ödem,Liquoreiweiß erhöht, Gefäße normal, Lymphozyten endo- und epineural, ELMI: Makrophagen

eher CIDP als CH

AC491 1977m

20 kongenitaler Klumpfußbds., Mutter auch betroffen, ENG/EMG: senorische und motorische PNP

schalenartig angeordnete Schwannzellen

Markschlingen, dadurch vereinzelt verdickte Markscheiden

wiederholt, auch demyelinisierte NF

50% (alle Faszikel)

vereinzelt kaum MS-Abbauprodukte

CMT I

NPA3B

1927m

72 V.a. CMT I / Vaskulitis Fußheberparese bds., Parästhesie der Unterschenkel

einige einige 50-60% (große und kleine markhaltige NF)

einige vereinzelt MS-Abbauprodukte, Mikroangiopathie, keine entzdl. Zellinfiltrate

gemischte NP mit Mikroangiopathie CMT I + DM?

V1 1988w

4 Mo. generalisierte Anfälle, Muskelhypotonie, Makroglossie, Fußdefomitäten

wiederholt große Anteile keine selten keine eindeutigen Entzündungszeichen, metachromatische Substanzen, Gefäße normal

Neuropathie vom demyelinisierenden Typ

V2 1950m

39 Torticollis spasmodicus keine häufig große, dünn myelinisierte Axone

gelegentlich Zeichen des akuten NF-Unterganges

eine keine entzdl.Zellinfiltrate

entwicklungsbe-dingte Hypomyelinisation

V3 1984m

13 V. a. axonale NP DD HMSN Klumpfuß / Hohlfuß?

wiederholt zudünn myelinisierte NF

gering, fokal vermindert

hypomyelinisierte NF, die Regenera-tionsgruppen sein können

ELMI: V. a. gering-gradige mitochondriale Myopathie, endoneurales Ödem, Pi-Granula

Hypomyelinisation, nicht typisch für HMSN, evtl. mitochondriale Myopathie.

V4 1993w

1 muskuläre Hypotonie,statomotorische Entwicklungsretardierung, Balkenhypoplasie, zentralnervöse Myelinisierungshemmung, Makrozephalie

keine dünn myelinisierteAxone

keine osmophile Granula in perivaskulären Fibroblasten und Gefäßwandzellen

Myelinisierungs-hemmung

V5 1995m

1 hypotonestatomotorische Entwicklungsverzögerung, V.a. Mitochondropathie

z.T. schalenartig angeordnete Schwannzellen

zu dünneMarkscheiden

keine lipidhaltige Substanzenperivaskulär, keine entzdl. Zellinfiltrate

hypomyelinisieren-de NP bei Entwicklungs-störung

V6 1986m

3 zerebrale Anfallsleiden,statomotorische und mentale Retardierung

keine wiederholt nichtvermindert

keine atrophische Axone, z. T. verdichtetes Axoplasma, keine entzdl. Zellinfiltrate, Gefäße normal

Entwicklungsverzö-gerung? V.a. Glykogenose

V8 1991w

5 ENG o. B., im EMG V. a. HMSN

zahlreiche zudünn myelinisierte NF

50% keine entzdl.Zellinfiltrate

Hypomyelinisation vom Lyon Typ

V14 1930m

60 Schwäche in Beinen und Händen

z.T. verdickte MS zahlreiche hypomyelinisierte NF

20-30% (große und kleine markhaltige NF)

einige leichte Vaskulitis, z.T. MS-Abbau

NP vom axonalen Typ mit Hypomyelinisation, leichte Vaskulitis

V18 1998w

3 verdickte MS und Markschlingen

häufig deutlicheReduktion

keine entzdl.Zellinfiltrate gelegentlich metachromatische Ablagerungen

kongenitale Hypo- und Hypermyelinisa-tionsneuropathie

V23 1990w

1 Hypotonie,Kardiomyopathie, V. a. Dysmorphiesyndrom (Hypochondroplasie)

wiederholthypomyelinisierte NF

geringe Dichte großer markhaltiger NF

keine entzdl.Zellinfiltrate

neurogene Muskelatrophie bei spinalem oder zentralen Prozess, myopathische Komponente

V63 1997m

2 V.a. neurogeneMuskelschwäche, Lippen-Kiefer-Gaumenspalte, Pulmonalstenose, hyper-trophe Kardiomyopathie, Knicksenkfuß, Schwer-hörigkeit, NLG 31 m/s, distal verminderte Muskelsilhouette

häufig fast aus-schließlich große, markhaltige NF mit zu dünnen MS, ELMI: vollständig demyelinisierte Axone

gering (markhaltige NF), ELMI: Ausfall einiger markloser NF, axonale Degeneration

kaum MS-Abbauprodukte, axonale Einlagerungen, keine entzdl. Zellinfiltrate, Gefäße normal

(kongenitale) Hypomyelinisa-tionsneuropathie mit De- und Remyelinisierung

1 Alter bei Einsendung in Jahren (wenn nicht anders angegeben) 2 bezogen auf große, markhaltige Nervenfasern Abkürzungen: bds. = beidseits

CH = Congenitale Hypomyelinisationsneuropathie CIDP = Chronische Inflammatorische Demyelinisierende Polyneuropathie CMT = Charcot-Marie-Tooth Krankheit Cx32 = Connexin 32 DD = Differentialdiagnose DM = Diabetes mellitus DSS = Déjerine-Sottas-Syndrom ELMI = Elektronenmikroskop EMG = Elektromyographie ENG = Elektroneurographie entzdl. = entzündlich GBS = Guillain-Barré-Syndrom Geb. Dat. = Geburtsdatum HMSN = hereditäre motorisch-sensorische Neuropathie HNPP = Hereditäre Neuropathie mit Neigung zur Drucklähmung

HSAN = Hereditäre sensorische axonale Neuropathie J. = Jahre li. = links m = männlich M. = Morbus M. = Musculus MS = Markscheiden N. = Nervus NF = Nervenfaser(n) NLG = Nervenleitgeschwindigkeit NP = Neuropathie o. B. = ohne Befund PNP = Polyneuropathie re = rechts US = Unterschenkel V. a. = Verdacht auf

w = weiblich Z. n. = Zustand nach z. T. = zum Teil

10.3. Übersicht der Analyseergebnisse

Exon 4 (Roa-Primer) Probe Ergebnis Exon 1 Exon 2 Exon 3 4a* 4b* EN ?, S 0 2 0 EN 0 S 0 EN ?, S 0S 0 EN ?, S 0 3 0 EN ?, S 0 EN 0 S 0 S 0

4 0 EN 0 S 0 S 0 S 0 S 0 5 0 EN 0 S 0 S 0 S 0 S 0 6 0 EN 0 S 0 S 0 S 0 S 0 8 0 EN 0 S 0 S 0 S 0 S 0

EN 0 9 0 EN 0 EN 0 EN 0 S 0

10 0 EN 0 EN 0 S 0 S 0 EN ?, S 0 11 0 EN 0 S 0 S 0 S 0 S 0

EN 0 12 0 EN ?, S0 S 0 S 0 S 0

13 0 EN 0 EN 0 EN 0 S 0 S 0 EN ?, S 0 14 0 EN 0 S 0 EN 0 EN 0

16 0 EN ?, S0 EN ?, S 0 EN 0 EN 0, S 0 17 0 S 0 EN ?, S 0 S 0 S 0 EN 0 18 PM EN 0, S 0 S 0 EN:PM

S: PM S 0 EN 0

19 0 EN ?, S 0 EN 0 EN ?, S 0 EN 0, S 0 20 0 EN ?, S 0 EN 0 EN ?, S 0 EN 0 21 0 EN ?, S 0 EN ?, S 0 EN 0 EN ?, S 0 22 0 S 0 S 0 S 0 S 0 26 x EN ?, S 0 EN 0 - S 0 32 0 EN 0 EN 0 EN 0 EN 0, S 0 33 0 EN 0 EN 0 EN 0 EN 0, S 0 37 0 EN 0 EN ?, S 0 EN 0 EN 0, S 0 38 0 EN 0 EN 0 S 0 EN 0, S 0 40 x EN 0 EN 0 - EN 0, S 0 43 0 EN 0 EN 0 EN 0 EN 0, S 0

S 0 44 0 EN 0, S 0 S 0 S 0 EN ?

46 0 EN 0 EN 0 EN 0 EN 0, S 0 50 x EN ?, S 0 EN ?, S 0 - EN 0, S 0 51 x EN ?, S 0 EN ?, S 0 - EN ?, S 0 52 0 EN 0 EN 0 EN 0 EN ?, S 0 53 0 EN ?, S0 EN 0 EN ?, S 0 EN 0 55 0 EN ?, S0 EN 0 EN 0 EN 0, S 0 56 0 EN ?, S0 EN 0 EN 0, S 0 57 0 EN 0 EN 0, S0 EN ?, S 0 EN 0, S 0 58 0 EN 0 EN 0 EN 0 EN 0, S 0 59 0 EN 0 EN ?, S0 EN 0 EN 0, S 0 60 0 EN ?, S0 S 0 S 0, EN 0 EN 0, S 0 S 0 61 0 EN 0 EN ?, S 0 EN 0 EN ?, S 0 64 0 EN ?, S 0 EN ?, S 0 EN ?, S 0 EN 0, S 0 67 0 S 0 S 0 S 0 S 0 68 0 S 0 S 0 S 0 S 0 69 0 S 0 S 0 S 0 S 0 AC48 0 EN 0 EN 0 EN 0 EN 0, S 0 AC78 0 EN 0 EN 0 EN 0 EN 0, S 0

EN 0

AC103 0 EN 0 EN 0 EN ?, S 0 EN 0, S 0 AC491 0 EN 0 EN 0, S 0 EN 0 EN 0, S0 NPA3B 0 EN 0, S 0 EN ?, S 0 EN 0 EN ?, S 0 V1 0 EN 0 EN ?, S 0 EN ?, S 0 EN 0, S 0 V2 0 EN 0 EN 0 EN 0, S 0 S 0 V3 0 EN 0 EN 0 S 0 EN 0, S 0 V4 0 EN 0 EN 0 EN 0 EN ?, S 0 V5 0 EN 0 EN 0 EN 0 S 0 V6 x EN 0 EN ?, S 0 - EN 0, S 0 V8 0 EN 0 S 0 EN 0 S 0 V14 0 EN ?, S 0 EN 0 EN ?, S 0 EN 0, S 0 V18 0 EN ?, S 0 EN ?, S 0 EN 0 S 0 V23 0 EN 0 EN ?, S 0 S 0 EN 0, S 0 V63 0 EN 0 EN 0 EN 0 EN 0, S 0

* Zu Beginn wurde mit Primern nach den Angaben von G.A. Nicholson gearbeitet; die Arbeitsgruppe amplifizierte Exon 4 in zwei Abschnitten a und b (Nicholson et al. 1994) Abkürzungen:

EN = Endonukleasereaktion S = Sequenzierung 0 = keine Mutation ? = Auffälligkeiten in der Analyse PM = Polymorphismus - = Analyse nicht durchführbar x = die Analyse konnte nicht für alle Exone durchgeführt werden

11. Danksagung

An erster Stelle möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. med. J. M. Schröder, dem

Direktor des Institutes für Neuropathologie der RWTH Aachen, für die Überlassung

des Promotionsthemas sowie die Förderung und Unterstützung meiner Arbeit

bedanken. Durch ihn war es mir möglich, einen faszinierenden Einblick in die aktuelle

molekulargenetische Forschung zu gewinnen und in eigenständiger Arbeit auf

diesem Gebiet Erfahrung zu sammeln.

Besonders dankbar bin ich darüber hinaus Herrn Dr. rer. nat. A. Beckmann für

die hervorragende fachliche Betreuung in den vergangenen drei Jahren. Stets fand

er Zeit zur Entwicklung von Arbeitsstrategien, Diskussion der Ergebnisse und gab

wertvolle Ratschläge. Ohne sein Engagement wäre die vorliegende Arbeit in der

Form nicht möglich gewesen.

Meiner Studienkollegin C. Vitt sei an dieser Stelle ebenfalls großer Dank

ausgesprochen. Die gute, zuverlässige Zusammenarbeit mit ihr, die vielen

konstruktiven Gespräche und Ihre einzigartige Freundschaft waren mir in den

vergangenen Jahren unverzichtbar.

Für die vielen praktischen Tipps im Labor möchte ich ganz besonders Frau E.

Pascual danken. Auch allen anderen Mitarbeitern des Institutes für Neuropathologie

sei für die freundliche Unterstützung und gute Arbeitsatmosphäre gedankt.

Außerordentlich dankbar bin ich meinen Eltern, die mir mein Medizinstudium

ermöglichen und meine wissenschaftliche Tätigkeit gefördert haben.

Nicht zuletzt möchte ich meinem Ehemann M. Nellessen danken für sein

Interesse an meiner Arbeit, seine kritischen Fragen und seine große moralische

Unterstützung.

Abschließend sei all jenen gedankt, die hier nicht explizit erwähnt wurden,

aber direkt oder indirekt zum Gelingen meiner Doktorarbeit beigetragen haben.

Lebenslauf

Persönliche Daten

Vor- und Zuname: Cordula Nellessen, geb. Fuchs

Geburtsdatum: 6. Juli 1977

Geburtsort: Düren, Ortsteil Birkesdorf

Familienstand/Kinder: verheiratet/keine

Staatsangehörigkeit: deutsch

Konfession: römisch-katholisch

Eltern: Gregor Fuchs

Pia Fuchs-Dransfeld

Geschwister: Johannes Fuchs

Schullaufbahn

1983 bis 1987 Johann-Kaspar-Kratz-Grundschule, Golzheim

1987 bis 1996 Gymnasium am Wirteltor, Düren

17.06 1996 Abitur

Hochschulstudium

Oktober 1996 Immatrikulation an der RWTH Aachen für das Fach

Humanmedizin

September 1998 Physikum

August 1999 Erstes Staatsexamen

April 2002 Zweites Staatsexamen

April 2002 – März 2003 Praktisches Jahr mit dem Wahlfach Dermatologie

April 2003 Drittes Staatsexamen

Seit September 2003 Tätigkeit als Ärztin im Praktikum, Abteilung für Innere Medizin,

St. Elisabeth Krankenhaus Geilenkirchen