MMO10-1

การตรวจยนเบตาธาลสซเมยชนด Codon 17 (A->T) โดยการเพมปรมาณดเอนเอในอณหภมเดยว Detection of Beta-thalassemia Gene, Codon 17 (A->T) by Single-temperature DNA Amplification

พรพรรณ หงสศรพนธ (Pornpan Hongsriphan)* อ ำนำจ เพชรรงนภำ (Amnat Phetrungnapha)**

พฤฒนนท สฤทธ (Phrutthinun Surit)*** สำยศร มระเสน (Saisiri Mirasena)***

บทคดยอ

เบตำธำลสซเมยเปนโรคทำงพนธกรรมทพบมำกในประเทศไทย มอำกำรทำงคลนกทแตกตำงกนขนกบชนดของกำรกลำยพนธของยนเบตำธำลสซเมย คณะผวจยจงพฒนำเทคนคกำรตรวจยนเบตำธำลสซเมยชนด codon 17 (A->T) ซงเปนกำรกลำยพนธทพบมำกในประเทศไทยโดยเพมปรมำณดเอนเอในอณหภมเดยว โดยออกแบบไพรเมอรจ ำนวน 5 ชดเพอทดสอบประสทธภำพ หำสภำวะทเหมำะสม และตรวจ cross detection กบยนเบตำธำลสซเมยชนดอนๆ ยนฮโมโกลบนอ และในคนปกต พบวำ ไพรเมอรชดท 2 (S2) และชดท 3 (S3) มควำมจ ำเพำะตอยนเบตำธำลส ซเมยชนด cd 17 (A->T) ไมเกด cross-detections กบยนเบตำธำลสซเมยชนดอน ยนฮโมโกลบนอ และในคนปกตทไมมยนดงกลำว และบมปฏกรยำกำรเพมดเอนเอทอณหภม 64 องศำเซลเซยสเปนเวลำ 60 นำท เมอเปรยบผลกบเทคนคมำตรฐำน multiplex ARMS-PCR พบวำใหผลตรงกน เทคนคนสำมำรถน ำไปใชตรวจยนเบตำธำลสซเมยชนด codon 17 (A->T) ในโรงพยำบำลชมชน โรงพยำบำลสงเสรมสขภำพต ำบล หรอภำคสนำม เพอก ำหนดคเสยง และชวยลดอบตกำรณของโรคธำลสซเมยในประเทศไทย

ABSTRACT

Beta-thalassemia is the prevalent genetic disease in Thailand. Clinical symptoms vary with mutation type of -thalassemia gene. We developed single-temperature DNA amp l i f i c a t i on technique to detect the high prevalent -thalassemia gene in Thailand, codon 17 (A->T). We designed 5 sets of primer, tested, optimized and checked cross detection with other -thalassemia genes, HbE gene and normal. We found that primer set 2 (S2) and set 3 (S3) showed high specificity to -thalassemia gene, codon 17 (A->T) and no cross detection to other -thalassemia genes, HbE gene and normal. The optimal condition was incubated at 64 degree celcius for 60 minutes. Furthermore, we observed complete concordance between multiplex ARMS-PCR assay and this technique’s results. This technique could be applied to detect -thalassemia gene mutation, codon 17 (A->T) gene in community hospital, Tambon health promotion hospital and on-site to define risk couple and reduce incidence of the -thalassemia incidence in Thailand

ค าส าคญ: ธำลสซเมย กำรตรวจยนเบตำธำลสซเมย โคดอน 17 (A->T) Keywords: Thalassemia 0-thalassemia gene Codon 17 (A->T) * นสต หลกสตรวทยาศาสตรมหาบณฑต สาขาวชาวทยาศาสตรการแพทย คณะวทยาศาสตรการแพทย มหาวทยาลยนเรศวร ** ผชวยศาสตราจารย ภาควชาชวเคม คณะวทยาศาสตรการแพทย มหาวทยาลยนเรศวร *** อาจารย ภาควชาชวเคม คณะวทยาศาสตรการแพทย มหาวทยาลยนเรศวร

842

MMO10-2

บทน า ธำลสซเมยเปนโรคทำงพนธกรรมทมอบตกำรณสง ในปจจบนทวโลกมเดกแรกเกดทเปนธำลสซเมยประมำณ

รอยละ 4.4 หรอ 1 ใน 10,000 คนของเดกแรกเกด เบตำธำลสซเมยพบมำกในประเทศไทย มอำกำรทำงคลนกทแตกตำงกนขนกบชนดของกำรกลำยพนธของยนเบตำ ชนดท รนแรงคอ homozygous 0-thalassemia และ compound heterozygous 0-thalassemia/hemoglobin E (0-thal/HbE) ในชวงแรกเกดจะไมพบควำมปกต แตจะเรมมอำกำรเมอเขำขวบปแรก คอตวซด ออนเพลย ทองปอง ตบมำมโต กระดกใบหนำเปลยน จมกแบน โหนกแกมสง กระดกบำงเปรำะหกงำย รำงกำยแคระแกรน ในรำยทซดมำกจ ำเปนตองไดรบเลอด ซงอำจมภำวะเหลกเกนตำมมำ ดำนกำรรกษำเปนกำรรกษำแบบประคบประคอง คอรกษำตำมอำกำร ไมสำมำรถรกษำใหหำยขำดได คำใชจำยทใชในกำรดแลสขภำพของผปวยทเปนโรคเบตำธำลสซเมย/ฮโมโกลบนอตงแตแรกเกด จนมอำย 30 ป คอ 3,180,000 บำทตอคน จดเปนปญหำเศรษฐศำสตรสำธำรณสขของประเทศ จงเปนนโยบำยระดบชำต ทจะควบคมและปองกนไมใหมเดกกดใหมเปนโรคธำลสซเมย โดยเฉพำะในคสมรสทเสยงตอกำรมบตรเปนโรคธำลสซเมยชนดรนแรง เทคนคกำรตรวจวนจฉยโรคทแมนย ำเพอประเมนควำมรนแรงของโรคเบตำธำลสซเมยถอเปนเครองมอหนงในกำรลดอบตกำรณของโรคธำลสซเมยในประเทศไทย เทคนคทใชตรวจหำยนเบตำธำลสซเมยในปจจบน ไดแก Amplification Refractory Mutation System (ARMS), Allele-Specific Oligonucleotide probes (ASO), Reverse dot-blot hybridization, Single-Strand Confirmation Polymorphism (SSCP), Real-time PCR และ Direct sequencing ซงเทคนคเหลำนใชเวลำในกำรตรวจวนจฉยประมำณ 3-4 ชวโมง และตองใชเครองมอทจ ำเพำะ รำคำสง จงไมสำมำรถน ำไปใชตรวจวนจฉยในหองปฏบตกำรโรงพยำบำลชมชน โรงพยำบำลสงเสรมสขภำพต ำบล (รพ.สต.) ท ำใหกำรตรวจคดกรองเพอก ำหนดคเสยง ไมครอบคลม ซงเปนสำเหตหนงทท ำใหอบตกำรณของโรคธำลสซเมยไมลดลง

คณะผวจยจงพฒนำเทคนคกำรเพมปรมำณดเอนเอโดยใชอณหภมเดยวเพอตรวจหำยนเบตำธำลสซเมยชนด codon 17 (A->T) ซงพบมำกในประเทศไทย เพอน ำไปใชตรวจคดกรองในโรงพยำบำลชมชนและ รพ.สต. ท ำใหก ำหนดค เ สยงตอกำรม บตร เ ปน homozygous 0-thalassemia หรอ compound heterozygous 0-thalassemia/HbE ซ ง เ ปนเบตำธำลสซเมยชนดรนแรงได เทคนคนชวยลดระยะเวลำท และไมจ ำเปนตองใชเครองมอทจ ำเพำะและรำคำสงในกำรตรวจ เหมำะกบกำรน ำไปใชในโรงพยำบำลชมชน และรพ.สต. หรอภำคสนำม ท ำใหบคลำกรทำงกำรแพทยและสำธำรณสขสำมำรถตรวจคดกรองเพอก ำหนดคเสยงและใหค ำปรกษำในกำรวำงแผนครอบครว สำมำรถลดอบตกำรณของโรคธำลสซเมยในประเทศไทยได วตถประสงคการวจย

เพอพฒนำเทคนคกำรตรวจยนเบตำธำลสซเมยชนด codon 17 (A->T) ทพบมำกในประเทศไทยดวยเทคนคกำรเพมปรมำณดเอนเอโดยใชอณหภมเดยว เทคนควจย

1. ตวอยาง ตวอยำงทใชเปนกำรขอแบงตวอยำงเลอดของผปวยทมำสงตรวจ ณ หนวยวจยธำลสซเมย ศนยวจยโลหตวทยำ

คณะแพทยศำสตร มหำวทยำลยนเรศวร จ ำนวนทงหมด 6 ตวอยำง โดยเปนตวอยำงเลอดของผทมยนเบตำธำลสซเมยชนด codon 17 (A->T) จ ำนวน 2 ตวอยำง ชนด codon 41/42, -TCTT; IVS I nt l, G->T; ฮโมโกลบนอ (HbE, cd 26, G->A) และ

843

MMO10-3

ตวอยำงเลอดของผทไมมยนเบตำธำลสซเมย (Normal) ชนดละ 1 ตวอยำง สกดดเอนเอจำกตวอยำงเลอด 30 µl ดวยชดน ำยำ Masterpure™ (Epicenter (an illumina company), USA)

2. การออกแบบไพรเมอร ผวจยไดออกแบบไพรเมอรส ำหรบใชในกำรเพมปรมำณดเอนเอ และตรวจสอบยนเบตำธำลสซเมยชนด codon

17 (A->T) (cd 17 (A->T)) โดยอำงองจำกกำรตรวจวนจฉยยนเบตำธำลสซเมย (0-thal genes) ทพบมำกในคนไทย และยนฮโมโกลบนอ (HbE) ดวยเทคนค Multiplex ARMS (Mirasena et al., 2008) ดวยโปรแกรม Primer explorer V5 software (http://primerexplorer.jp/e/) และ OligoCalc (Kibbe, 2007) ผวจยไดออกแบบไพรเมอรเพอเพมปรมำณจ ำนวน 4 เสนคอ L, B, F และ P primers เพอตรวจหำกำรกลำยพนธของยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) โดยก ำหนดใหต ำแหนงกำรกลำยพนธของยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) อยบรเวณปลำย 5’ (ดงภำพท 1) และไดออกแบบ P primers เพอใหมควำมควำมจ ำเพำะสงโดยกำรปรบเปลยนและเพมล ำดบเบสใหมควำมแตกตำงกน จ ำนวน 5 ชด (Primer Set 1-Set 5 โดยแตละชดจะแตกตำงกนท P1-P5 primers) (Duan et al., 2014) ล ำดบนวคลโอไทดของไพรเมอรไดแก L primer : 5’ TAA CGG CAG ACT TCT CCT CAG GAG ACA CAA CTG TGT TCA CTA GCA3’, F primer : 5’ GGC AGA GCC ATC TAT TGC TT 3’, B primer : 5’ GAG TCT TCT CTG TCT CCA CAT G 3’, P1 primer : 5’ TAG GTG AAC GTG GAT GAA GTT GGT GGT CTC CTT AAA CCT GTC TTG T 3’, P2 primer : 5’ TTC GTG AAC GTG GAT GAA GTT GGT GGT CTC CTT AAA CCT GTC TTG T 3’, P3 primer : 5’ CG TAG GTG AAC GTG GAT GAA GTT GGT GGT CTC CTT AAA CCT GTC TTG T 3’, P4 primer : 5’ GC TAG GTG AAC GTG GAT GAA GTT GGT GGT CTC CTT AAA CCT GTC TTG T 3’, P5 Primer : 5’ CG TTC GTG AAC GTG GAT GAA GTT GGT GGT CTC CTT AAA CCT GTC TTG T 3’

เมอน ำดเอนเอทมยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) ไปเพมปรมำณจะเกดกำรสรำงสำยดเอนเอทยำวขนหลำยๆ ขนำดปรำกฏผลบน agarose gel ทม band หลำกหลำยขนำด เกดเปนรปแบบ ladder-like pattern (อมรรตน, 2554)

ภาพท 1 แสดงต ำแหนงของไพรเมอรทออกแบบใหกำรกลำยพนธอยบรเวณทำงดำนปลำย 5’ ของ P primer และต ำแหนงทไพรเมอรเขำจบบนดเอนเอเปำหมำย

844

MMO10-4

3. ปฏกรยาการเพมปรมาณดเอนเอในอณหภมเดยว น ำชดไพรเมอรส ำหรบตรวจยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) จ ำนวน 5 ชดแลว (Primer Set 1-Set 5)

ไปท ำปฏกรยำเพมปรมำณดเอนเอทอำงองจำกคมอของ Bst DNA polymerase (New England Biolabs, USA) โดยผสมสำรตำงๆ ประกอบดวย 320 U/ml Bst DNA polymerase, 1 X ThermoPol Buffer, 6mM MgSo4, 1.4 mM dNTPs, 1.6 µM L primer, 1.6 µM P primer, 0.2 µM F primer, 0.2 µM B primer และ 50 ng DNA ในปรมำตรรวม 25 µl แลวน ำไปบมในอณหภมทเหมำะสม เปนเวลำ 60 นำท แลวตรวจสอบผลดวย 2% agarose gel ใชกระแสไฟฟำ 135V เปนเวลำ 30 นำท และบนทกภำพดวยเครอง Gel documentation (Major Science, Taiwan)

4. การหาสภาวะทเหมาะสมของเทคนค เมอทดสอบกำรท ำงำนเบองตนของไพรเมอรทตรวจยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) ท ง 5 ชด

(Primer Set: S1- 5) แลว ผวจยจงหำสภำวะทเหมำะสมของเทคนคนโดยกำรเปรยบเทยบเพอหำอณหภมและเวลำทเหมำะสม เรมจำกเปรยบเทยบไพรเมอรท ง 5 ชดทบมในอณหภมทแตกตำงกน ไดแก 62, 63, 64, 65, และ 66 องศำเซลเซยส เปนเวลำ 60 นำท เมอไดอณหภมทเหมำะสมแลว ผวจยจงน ำสภำวะนไปท ำปฏกรยำเพอเปรยบเทยบระยะเวลำททใชในกำรบมไดแก 20, 30, 40, 50, และ 60 นำท เพอใหไดชดไพรเมอร (P primer) และสภำวะทท ำใหไพรเมอรท ำปฏกรยำเพมปรมำณดเอนเอเพอตรวจหำยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) ใหผลดมประสทธภำพมำกทสด

5. การตรวจสอบ cross-detections ของเทคนค ผวจยไดท ำ cross-detections ของเทคนคน เพอทดสอบควำมจ ำเพำะของชดไพรเมอร (Primer Set) ทตรวจ

ยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) โดยใชดเอนเอทมยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T); cd 41/42, -TCTT; IVS I nt l, G->T; ฮโมโกลบนอ (HbE, cd 26 , G->A) และดเอนเอทไมมยนเบตำธำลสซเมย (Normal) โดยไพรเมอร (P primer) จะตองใหผลทมรปแบบ ladder-like pattern เฉพำะกบดเอนเอทมยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) เทำนน

6. การยนยนความถกตองของเทคนคโดยเปรยบเทยบกบเทคนคมาตรฐาน Multiplex ARMS-PCR เปรยบเทยบผลกำรตรวจของเทคนคนกบเทคนค multipex ARMS-PCR (Mirasena et al., 2008) ซงเปน

เทคนคมำตรฐำนกำรตรวจยนเบตำธำลสซเมยและฮโมโกลบนอของหองปฏบตกำรหนวยวจยธำลสซเมย ศนยวจยโลหตวทยำ คณะแพทยศำสตร มหำวทยำลยนเรศวร โดยเปรยบเทยบผลกำรตรวจดเอนเอทมยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T); cd 41/42, -TCTT; IVS I nt l, G->T; ฮโมโกลบนอ (HbE, cd 26, G->A) และดเอนเอทไมมยนเบตำธำลสซเมย (Normal)

ผลการวจย

ผวจยไดพฒนำเทคนคกำรตรวจยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) โดยกำรเพมปรมำณดเอนเอในอณหภมเดยว โดยออกแบบชดไพรเมอรจ ำนวน 5 ชด (Primer Set 1-Set 5) ประกอบดวย primer set 1 (L,F,B,P1 primer), primer set 2 (L,F,B,P2 primer), primer set 3 (L,F,B,P3 primer), primer set 4 (L,F,B,P4 primer), primer set 5 (L,F,B,P5 primer) และทดสอบกำรท ำงำนของแตละชดไพรเมอรโดยน ำไปตรวจยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) ในดเอนเอทมยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) และดเอนเอทไมมยนเบตำธำลสซเมย (Normal) เมอน ำไปบมในอณหภมทเหมำะสม อำงองจำกคมอของ Bst DNA polymerase (New England Biolabs, USA) เปนเวลำ 60 นำท แลวน ำไปตรวจสอบดวย 2% agarose gel electrophoresis พบวำ ไพรเมอรชดท 2 (S2), ชดท 3 (S3) และชดท 5 (S5) จะปรำกฏลกษณะ ladder-like pattern ในตวอยำงทมยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) เพยงอยำงเดยว แสดงวำไพรเมอรทง 3 ชดนมควำมจ ำเพำะ

845

MMO10-5

กบยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) สำมำรถแยกควำมแตกตำงระหวำงผทมยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) และผทไมมยนเบตำธำลสซเมยได สวนไพรเมอรชดท 1 (S1) และชดท 4 (S4) ปรำกฏลกษณะ ladder-like pattern ทงในตวอยำงทมยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) และไมมยนเบตำธำลสซเมย (Normal) แสดงวำไพรเมอรชดท 1 (S1) และชดท 4 (S4) ไมมควำมจ ำเพำะกบยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) ไมสำมำรถแยกควำมแตกตำงระหวำงผทมยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) และผทไมมยนเบตำธำลสซเมยได (ภำพท 2)

ภาพท 2 ผลกำรทดสอบประสทธภำพของไพรเมอรส ำหรบตรวจวนจฉยยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) จ ำนวน 5 ชด (Primer set 1-5: S1-S5) ในตวอยำงทมยน cd 17 (A->T) และในตวอยำงทไมมยนเบตำธำลสซเมย (normal) ไพรเมอรชดท 2, 3 และ 5 (S2, S3 และ S5) ปรำกฏลกษณะ ladder-like pattern ในตวอยำงทมยน cd 17 (A->T) (แถวท 3, 5 และ 9) และไมมลกษณะ ladder-like pattern ในตวอยำงทไมมยนดงกลำว (แถวท 4, 6 และ 10) สวนไพรเมอรชดท 1 และ 4 (S 1 และ S4) ปรำกฏลกษณะ ladder-like pattern ทงในตวอยำงทมยน cd 17 (A->T) (แถวท 1 และ 7) และไมมยน (แถวท 2 และ 8) แสดงวำไพรเมอรชดนไมมควำมจ ำเพำะตอยน

cd 17 (A->T) (M) 100 bp DNA ladder. (Codon17) ตวอยำงทมยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T). (Normal) ตวอยำงทไมมยนเบตำธำลสซเมย

การหาสภาวะทเหมาะสมส าหรบเทคนคการเพมปรมาณดเอนเอในอณหภมเดยว จำกผลกำรทดสอบประสทธภำพของชดไพรเมอร พบวำไพรเมอรชดท 2 (S2), ชดท 3 (S3) และชดท 5 (S5) ม

ควำมจ ำเพำะตอยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) จงคดเลอกไพรเมอร 3 ชดนมำเปรยบเทยบเพอหำอณหภมทเหมำะสมส ำหรบเทคนคกำรเพมปรมำณดเอนเอในอณหภมเดยวเพอตรวจยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) โดยกำรบมทอณหภมตำงกน 5 อณหภมไดแก 62, 63, 64, 65, และ 66 องศำเซลเซยส เปนเวลำ 60 นำท ในตวอยำงทมยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) ตรวจสอบผลดวย 2% agarose gel พบวำไพรเมอรทง 3 ชดปรำกฏลกษณะ ladder-like pattern ในทกอณหภม แสดงวำไพรเมอรทง 3 ชดสำมำรถท ำงำนไดดในชวงอณหภมท 62-66 องศำเซลเซยส (ภำพท 3)

846

MMO10-6

ภาพท 3 ผลกำรหำอณหภมทเหมำะสมของกำรตรวจวนจฉยยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) ไพรเมอรชดท 2 (S2), ชดท 3 (S3) และ ชดท 5 (S5) ในตวอยำงทมยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) ปรำกลกษณะ ladder-like pattern ในทกอณหภม (62, 63, 64, 65, และ 66 องศำเซลเซยส) (M) 100bp DNA ladder. แถวท 1-15 แสดงผลกำรตรวจยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) ดวยไพรเมอร 3 ชด (S2, S3และ S5) ทอณหภม 62, 63, 64, 65, และ 66 องศำเซลเซยส ตำมล ำดบ

จำกผลกำรหำอณหภมทเหมำะสมในกำรท ำปฏกรยำเพมปรมำณดเอนเอในอณหภมเดยวเพอตรวจวนจฉยยน

เบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) พบวำ ไพรเมอรทง 3 ชด (S2, S3 และ S5) สำมำรถท ำงำนไดดในชวงอณหภมท 62-66 องศำเซลเซยส ผวจยจงเลอกอณหภมท 64 องศำเซลเซยส เพอน ำมำใชท ำปฏกรยำเพอเปรยบเทยบหำเวลำทเหมำะสมของเทคนคดงกลำวโดยน ำไปบมทอณหภม 64 องศำเซลเซยส ในระยะเวลำทท 20, 30, 40, 50 และ 60 นำท และตรวจสอบดวย 2% agarose gel พบวำไพรเมอรชดท 2 (S2) ปรำกฏลกษณะ ladder-like pattern ในกำรบมตงแตเวลำ 40 นำทจนถง 60 นำท สวนไพรเมอรชดท 3 (S3) และ 5 (S5) ปรำกฏลกษณะ ladder-like pattern ในกำรบมตงแตระยะเวลำท 50 นำทและ 60 นำท เพอใหสำมำรถใชไพรเมอรทง 3 ชดในกำรตรวจยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) ผวจยจงเลอกระยะเวลำทในกำรบมปฏกรยำนทอณหภม 50-60 นำท (ภำพท 4)

847

MMO10-7

ภาพท 4 ผลกำรหำระยะเวลำททเหมำะสมในกำรบมปฏกรยำเพอตรวจยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) ไพรเมอรชดท 2 (S2) ปรำกฏลกษณะ ladder-like pattern ในกำรบมระยะเวลำทท 40 นำทขนไป (แถวท 3, 4, 5) ไพรเมอรชดท 3 (S2) และ 5 (S2) ปรำกฏลกษณะ ladder-like pattern ในกำรบมระยะเวลำทท 50 นำทขนไป (แถวท 9, 10, 14 และ 15) (M) 100bp DNA ladder. แถวท 1-15 แสดงผลกำรตรวจยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) ดวยไพรเมอร 3 ชด (S2, S3 และ S5) ทอณหภม 64 องศำเซลเซยส ทระยะเวลำทกำรบม 20, 30, 40, 50 และ 60 นำท ตำมล ำดบ

ตรวจสอบ cross-detections ของเทคนค เพอทดสอบควำมจ ำเพำะของไพรเมอรชดท 2 (S2), ชดท 3 (S3) และชดท 5 (S5) ตอยนเบตำธำลสซเมยชนด

cd 17 (A->T) ผวจยจงไดท ำ cross-detections โดยใชดเอนเอทมยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T); cd 41/42, -TCTT; IVS I nt l, G->T; ฮโมโกลบนอ (HbE, cd 26, G->A) และดเอนเอทไมมยนเบตำธำลสซเมย (Normal) โดยไพรเมอร (P primer) จะตองใหผลทมรปแบบ ladder-like pattern เฉพำะกบดเอนเอทมยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) เทำนน พบวำไพรเมอรชดท 2 (S2), และชดท 3 (S3) ปรำกฏลกษณะ ladder-like pattern ในตวอยำงทมยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A ->T) เทำนน และไมปรำกฏลกษณะ ladder-like pattern ในตวอยำงทมยนเบตำธสซเมยชนดอนๆ รวมทงในตวอยำงท ไมมยนเบตำธำลสซเมย (normal) แสดงวำไพรเมอร 2 ชดน (S2 และ S3) มควำมจ ำเพำะตอยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) สำมำรถตรวจพบยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) ไดเพยงอยำงเดยว ไมเกด cross-detections กบยนเบตำธำลสซเมยชนดอน สวนไพรเมอรชดท 5 (S5) ปรำกฏลกษณะ ladder-like pattern ในตวอยำงทมยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) และพบชนสวนเอนเอขนำดประมำณ 1,500 bp ในตวอยำงยนฮโมโกลบนอ (HbE) และตวอยำงทไมมยนเบตำธำลสซเมย (normal) (ภำพท 5)

848

MMO10-8

ภาพท 5 ผลกำรตรวจสอบ cross-detections ของไพรเมอรทง 3 ชด (S2, S3 และ S5) ทใชตรวจยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) ในตวอยำงทมยนเบตำธำลสซเมยชนดตำงๆ (cd 17 (A->T); cd 41/42, -TCTT; IVS I nt l, G->T; ฮโมโกลบนอ (HbE, cd 26, G->A)) และในตวอยำงทไมมยนเบตำธำลสซเมย ไพรเมอรทง 3 ชด ปรำกฏลกษณะ ladder-like pattern ในตวอยำงทมยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) (แถวท 1, 6 และ 11) ในขณะทไพรเมอรชดท 5 (S5) ปรำกฎชนดเอนเอขนำดประมำณ 1,500 bp ในตวอยำงทไมมยนเบตำธำลสซเมย (แถวท 12) และ ตวอยำงทมยนฮโมโกลบนอ (แถวท 14) (M) 100bp DNA ladder. (Codon17) cd 17 (A->T). (Normal) ตวอยำงทไมมยนเบตำธำลสซเมย. (Codon 41/42) cd 41/42, -TCTT. (HbE) cd 26, G->A. (IVS I-1) IVS I nt l, G->T และ normal.

การยนยนความถกตองของเทคนคโดยเปรยบเทยบกบเทคนคมาตรฐาน Multiplex ARMS-PCR เปรยบเทยบผลกำรตรวจของเทคนคนกบเทคนค multipex ARMS-PCR (Mirasena et al., 2008) ซงเปนเทคนค

มำตรฐำนกำรตรวจยนเบตำธำลสซเมยและฮโมโกลบนอของหองปฏบตกำรหนวยวจยธำลสซเมย ศนยวจยโลหตวทยำ คณะแพทยศำสตร มหำวทยำลยนเรศวร โดยเปรยบเทยบผลกำรตรวจดเอนเอทมยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T); cd 41/42, -TCTT; IVS I nt l, G->T; ฮโมโกลบนอ (HbE, cd 26, G->A) และดเอนเอทไมมยนเบตำธำลสซเมย (Normal) พบวำ

เทคนค multipex ARMP-PCR แสดงชนดเอนเอของ internal control (861 bp) และชนดเอนเอของยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) (239 bp) ในตวอยำง codon 17 เทำนน และในตวอยำงชนดอนๆ พบเพยงชนดเอนเอของ internal control (861 bp) เทำนน ซงใหผลตรงกนกบเทคนคกำรตรวจยนเบตำธำลสซเมยชนด codon 17 (A->T) โดยกำรเพมปรมำณดเอนเอโดยใชอณหภมเดยว (ภำพท 6)

849

MMO10-9

ภาพท 6 ผลกำรตรวจยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) ดวยเทคนค multipex ARMS-PCR ในตวอยำงทมยนเบตำธำลสซเมยชนดตำงๆ และในตวอยำงทไมมยนเบตำธำลสซเมย แถวท 1-5 แสดงผลกำรตรวจยนเบตำธำลสซเมยดวยเทคนค multipex ARMP-PCR แถวท 1 ปรำกฏชนดเอนเอของ internal control ขนำด 861 bp และยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) ขนำด 239 bp ในตวอยำง Codon 17 เทำนน สวนตวอยำงทมยนเบตำธำลสซเมยชนดอนๆ ฮโมโกลบนอ และในคนปกตจะปรำกฏแตชนดเอนเอของ internal control ขนำด 861 bp เทำนน (M) 100bp DNA ladder. (Codon17) cd 17 (A->T). (Normal) ตวอยำงทไมมยนเบตำธำลสซเมย. (Codon 41/42) cd 41/42, -TCTT. (HbE) cd 26, G->A. (IVS I-1) IVS I nt l, G->T.

อภปรายและสรปผลการวจย

เบตำธำลสซเมยเปนโรคทำงพนธกรรมทพบมำกในประเทศไทย มอำกำรทำงคลนกทแตกตำงกนขนกบชนดของกำรกลำยพนธ หำกมเทคนคกำรตรวจยนเบตำธำลสซเมยทสำมำรถท ำไดในโรงพยำบำลชมชน โรงพยำบำลสงเสรมสขภำพต ำบล (รพ.สต.) หรอภำคสนำม ท ำใหสำมำรถก ำหนดคเสยงไดเรว และชวยลดอบตกำรณของโรคธำลสซเมยในประเทศไทย คณะผวจยจงพฒนำเทคนคกำรเพมปรมำณดเอนเอในอณหภมเดยวเพอตรวจยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) ซงเปนกำรกลำยพนธของเบตำโกลบนยนชนด nonsense mutation (อรณ, 2552) ทพบมำกในประเทศไทย อำศยหลกกำรของเทคนค loop-mediated isothermal amplification (LAMP) โดยผวจยไดออกแบบไพรเมอรจ ำนวน 5 ชด (Set 1-5; S1-S5) แตละชดประกอบดวยไพรเมอรจ ำนวน 4 เสน (L,F,B, P1-5) ทสำมำรถตรวจสอบยนเบตำธำลสซเมยทมควำมจ ำเพำะสง กำรเพมปรมำณดเอนเออำศยกำรท ำงำนของ Bst DNA polymerase ซงม displacement activity ท ำใหสำมำรถท ำปฏกรยำเพมปรมำณดเอนเอไดในอณหภมเดยว ในขนตอน cycle amplification เมอไพรเมอรพบยนเปำหมำยจะเกดกำรสรำงสำยดเอนเอทมควำมยำวหลำยขนำด เมอน ำไปตรวจสอบดวยเทคนคอเลคโตรโฟรซสจะปรำกฏดเอนเอทมควำมยำว หลำกหลำยขนำดมลกษณะเปน ladder-like pattern (อมรรตน, 2554; Notomi et al., 2000; Nagamine et al., 2002; Notomi et al., 2015; Chomean et al., 2018) ผวจยจงน ำเทคนคนมำพฒนำโดยท ำปฏกรยำดวยเครอง heating block หรอ water bath ซงเทคนคนไมตองใชเครอง thermal cycler ซงมรำคำสง และใชเวลำนอยกวำกำรเพมปรมำณดเอนเอ

850

MMO10-10

ดวยเทคนค PCR จงเหมำะกบกำรตรวจในหองปฏบตกำรขนำดเลก โรงพยำบำลสงเสรมสขภำพต ำบล โรงพยำบำลชมชน

ผวจยไดออกแบบไพรเมอรทจ ำเพำะกบยนเบตำโกลบนธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) โดยใหต ำแหนงกำรกลำยพนธอยบรเวณปลำย 5’ ของ P primer (ภำพท 1) และไดออกแบบ P primer ใหมควำมจ ำเพำะมำกขนโดยกำรเพม และปรบเปลยนล ำดบเบสใหมควำมแตกตำงกน จ ำนวน 5 ชด (S1-S5) (Duan et al., 2014; Duan et al., 2016) และไดน ำไพรเมอรทง 5 ชดนมำหำสภำวะทเหมำะสม พบวำไพรเมอรชดท 2 (S2), ชดท 3 (S3) และชดท 5 (S5) มควำมจ ำเพำะตอยนเบตำโกลบนธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) เพรำะไดปรบเปลยนล ำดบเบสทบรเวณปลำย 5’ ของ P Primer มำกกวำ 2 ต ำแหนงขนไป ท ำใหไพรเมอรมควำมจ ำเพำะตอกำรตรวจยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) (ภำพท 2)

เทคนค LAMP จะท ำปฏกรยำทอณหภมประมำณ 60-65 องศำเซลเซยส (Notomi et al., 2000; Notomi et al., 2015) ผวจยจงไดหำสภำวะทเหมำะสมของเทคนคกำรตรวจยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) โดยเปรยบเทยบกำรท ำงำนของไพรเมอรในอณหภมท 62, 63, 64, 65, และ 66 องศำเซลเซยส พบวำปฏกรยำเกดขนไดดทกอณหภม (ภำพท 3) เนองจำกเมอน ำเทคนคนไปใชในโรงพยำบำลชมชน รพ.สต.หรอในภำคสนำม เครอง heating block หรอ water bath ทตำงยหอกนอำจมกำรควบคมอณหภมทคลำดเคลอนไปบำง จงเลอกใชอณหภมท 64 องศำเซลเซยส เมออณหภมคลำดเคลอนไป +2 องศำเซลเซยส กยงคงสำมำรถเกดปฏกรยำได จำกนนผวจยไดหำระยะเวลำทกำรบมทเหมำะสมโดยบมทอณหภม 64 องศำเซลเซยสในระยะเวลำทท 20, 30, 40, 50 และ 60 นำท พบวำไพรเมอรชดท 2 (S2) จะปรำกฏลกษณะ ladder-like pattern ตงแตกำรบมเปนเวลำท 40-60 นำท ไพรเมอรชดท 3 (S3) และชดท 5 (S5) จะปรำกฏลกษณะ ladder-like pattern ต งแตกำรบมเปนเวลำ 50-60 นำท (ภำพท 4) เนองจำกควำมแตกตำงของเครอง heating block หรอ water bath ผวจยจงเลอกระยะเวลำในกำรบมท 60 นำท เพอใหกำรเพมปรมำณดเอนเอเกดขนไดอยำงสมบรณ ซงใชเวลำนอยกวำเทคนค PCR

เมอท ำ cross-detections เพอทดสอบควำมจ ำเพำะของชดไพรเมอร พบวำไพรเมอรชดท 2 (S2), ชดท 3 (S3) และชดท 5 (S5) มควำมจ ำเพำะตอยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) ไมเกด cross-detections กบยนเบตำธำลสซเมยชนดอน ยนฮโมโกลบนอ และในคนปกตทไมมยนดงกลำว แสดงวำไพรเมอรชดนสำมำรถน ำมำใชตรวจยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) ดวยกำรเพมปรมำณดเอนเอในอณหภมเดยวไดอยำงมประสทธภำพ สวนชนดเอนเอขนำดประมำณ 1,500 bp ทพบในยนฮโมโกลบนอ และในคนปกตของไพรเมอรชดท 5 (S5) นนผวจยจะน ำไปตรวจสอบหำล ำดบนวคลโอไทดดวยเทคนค DNA sequencing ตอไป (ภำพท 5) จำกนนจงเปรยบเทยบผลกำรตรวจยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) ของเทคนคนกบเทคนค multipex ARMS-PCR (Mirasena et al., 2008) ซงเปนเทคนคมำตรฐำนกำรตรวจยนเบตำธำลสซเมยและฮโมโกลบนอของหองปฏบตกำรหนวยวจยธำลสซเมย ศนยวจยโลหตวทยำ คณะแพทยศำสตร มหำวทยำลยนเรศวร พบวำใหผลตรงกน (ภำพท 6) แสดงวำเทคนคตรวจยนเบตำธำลสซเมยชนด codon 17 (A->T) ดวยเทคนคกำรเพมปรมำณดเอนเอโดยใชอณหภมเดยวมควำมจ ำเพำะ และถกตองแมนย ำ

เทคนคกำรตรวจยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) โดยกำรเพมปรมำณดเอนเอในอณหภมเดยวนมแนวโนมทจะน ำมำใชไดจรง ผวจยจะด ำเนนกำรทดสอบควำมไวของเทคนค และน ำเทคนคนไปตรวจยนเบตำธำลสซเมยชนด cd 17 (A->T) ในตวอยำงทหลำกหลำยและมจ ำนวนมำกขน รวมทงน ำไปทดลองใชในโรงพยำบำลชมชม โรงพยำบำลสงเสรมสขภำพต ำบล (รพ.สต.) และในภำคสนำม เพอพฒนำเทคนคนในกำรตรวจยนเบตำธำลสซเมยชนดอนๆ และฮโมโกลบนอทพบมำกในประเทศไทย เพอก ำหนดคเสยง และลดอบตกำรณของโรคธำลสซเมยในประเทศไทย

851

MMO10-11

กตตกรรมประกาศ ผวจยขอขอบคณหนวยวจยธำลสซเมย ศนยวจยโลหตวทยำ คณะแพทยศำสตร มหำวทยำลยนเรศวรท

อนเครำะหตวอยำงในกำรท ำวจย และขอบคณคณะวทยำศำสตรกำรแพทย มหำวทยำลยนเรศวรทเออเฟอสถำนทในกำรท ำวจย เอกสารอางอง อรณ เจตศรสภำพ. ธำลสซเมยแบบองครวม. ขอนแกน: โรงพมพมหำวทยำลยขอนแกน; 2552. อมรรตน รมพฤกษ. เทคนค Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP). ว. โลหตวทยำและเวชศำสตรบรกำร

โลหต 2554; 21(3): 201-206. Chomean, S., Pholyiam, K., Thamwarokun, A., & Kaset, C. Development of Visual Detection of α-Thalassemia-1 (the

- -. Hemoglobin 2018; 1-7. Duan, Y., Yang, Y., Li, T., Zhao, D., Cao, J., Shi, Y., et al. Development of a rapid and high-throughput molecular

method for detecting the F200Y mutant genotype in benzimidazole-resistant isolates of Fusarium asiaticum. Pest Manag Sci 2016; 72(11): 2128-2135.

Duan, Y., Zhang, X., Ge, C., Wang, Y., Cao, J., Jia, X., et al. Development and application of loop-mediated isothermal amplification for detection of the F167Y mutation of carbendazim-resistant isolates in Fusarium graminearum. Sci Rep 2014; 4: 7094.

Kibbe, W. A. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator. Nucleic Acids Res, 35(Web Server issue) 2007, W43-46.

Mirasena, S., Shimbhu, D., Sanguansermsri, M., Sanguansermsri, T. Rapid detection of -thalassemia mutations in Thailand using multiplex ARMS. AJSTD 2008; 25(2): 321-332.

Nagamine, K., Hase, T., & Notomi, T. Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers. Molecular and Cellular Probes 2002; 16: 223-229.

Notomi, T., Mori, Y., Tomita, N., et al. Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): principle, features, and future prospects. J Microbiology 2015; 53(1): 1-5.

Notomi, T., Okayama, H., Masubuchi, H., et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acid Res 2000; 28(12): 63.

852