microbi 2 corectat

Microbiologie

Anul II

Anul II Microbiologie - cursul 1

1.

Microbiologie

Curs 1 1.X.2007

Microbiologia

este stiinta a studiului vietii; are ca obiect de studiu microorganismele; aplicatii practice - tehnici de lucru care permit izolarea si identificarea agentilor

patogeni; virusurile nu pot fi vazute la microscopul optic (10-9 m) si nu sunt celule; bacteriile:

- sunt unicelulare si pot fi vazute la microscopul optic (10-6 m); - nu exista diferentiere tisulara dar exista diferentieri celulare:

* celula vegetativa (activa metabolic); * sporul – forma rezistenta (inactiva metabolic).

Paradigma = (model) trebuie sa explice starea de boala sau sanatate prin tratament diagnostic.

o anatomo-functionala * se refera la organism ca ansamblu si structura * perturbarile de structura si functie se evidentiaza prin diagnostic clinic

o chimica * se refera la organism ca ansamblu de substante chimice * modificarile calitative sau cantitative ale unei substante se evidentiaza prin diagnostic de

laborator o genetica = bio - moleculara

Unelte medicale:

Seruri terapeutice – ser imun - ser antitetanic – bacilul tetanic produce o toxina

- serul contine anticorpi fata de toxina tetanica (neutralizeaza toxina) - ser antidifteric – ramane in faringe unde elibereaza toxina

- serul contine anticorpi de neutralizare ex. Botulism

• toxiinfectie alimentara de tip particular • spre deosebire de restul – constipatie in loc de diaree • se trateaza doar cu ser antibiotic • bacilul botulinic: 8 tipuri (la om 4) – ser specific

Vaccinuri – in scop profilactic

- primul vaccin = BCG impotriva TBC (bacilul Calmette-Guerin) Antibiotice (chimioterapice)

EX: -penicilina are ca tinta o proteina din celula procariota pe care eucariotele nu o au (deoarece proteina se gaseste in peretele celular, prezent doar la procariote)

Microorganismele

au rol si in sanageneza nu doar in patogeneza Streptococcus viridans = sanogen (bacterie comensala din faringe) Streptococcus piogenes (β-hemolitic) = patogen

lumea microorganismelor este ubivitara, evolutiva si diversificata (complexa) Microbiocenoza = ansamblu organizat de microorganisme (care se opun microorganismelor

patogene), gasit pe suprafata sau in interiorul organismului (colon, cavitatea bucala) organismul uman contine

- 1013 celule eucariote - 1014 celule procariote

au efecte favorabile in: dospirea painii; fermentatie; putrefactie


2.

bolile infectioase se caracterizeaza printr-o morbiditate si mortalitate crescuta

ex: - infectii respiratorii - hepatite virale (A, B, C, D, E) - hepatite - epidemice (A, E)

- cronice (B, C) - boli cu transmitere sexuala (BTS): sifilis, gonoreea, SIDA

Istoricul microbiologiei Fracastoro

- notiunea de carantina (boala se ia prin contagiune) Antonie van Leeuwenhoek

- primul care a evidentiat microorganismele (animalicule) la un microscop construit de el Karl Linne Edward Jenner

- introduce vaccinarea antivariolica fara a cunoaste agentul etiologic al variolei (virusul) - laptarii care aveau contact cu ugerul vacii (deci cu Vaccina) nu dezvoltau boala - preleveaza substanta de pe ugerul vacii si o inoculeaza oamenilor ⇒ succes - 1978 – variola considerata eradicata

Louis Pasteur

- a aratat ca viata ia nastere din viata - studiaza procesul de fermentatie provocat biologic sau chimic si demonstreaza specificitatea de

substrat a acesteia - a gasit primele posibilitati de sterilizare

Sterilizarea = distrugerea tuturor microorganismelor vii (minim 30 minute) Dezinfectia = distrugerea microorganismelor patogene

- a izolat bacterii pe mediu de cultura - a dovedit ca o activitate metabolica se poate dezvolta si in conditii de anaerobioza - a descoperit vaccinul antirabic

Robert Koch

- a descris pentru prima data bacilul carbunos (antrax): Baccilus antracis - a descoprit agentii etiologici ai tuberculozei - scrie „postulatele lui Koch” despre etiologia bolilor infectioase = reguli ce stabilesc specificitatea

etiologica a unei infectii - determina aparitia chimioterapiei - bacilul Koch

Paul Ehrlich

- întemeietorul chimioterapiei - descopera substantele care sunt active pe procariote dar nu si pe eucariote = substante

antibacteriene - principiul toxicitatii selective

Gerhard Domagk – 1935 – sulfamidele (sulfamida rosie). Alexander Fleming

- 1929 - descopera penicilina ce se utilizeaza in terapie din 1940. - realizeaza diversificarea microbiologiei desprinzandu-se o serie de discipline ce acopera un

camp larg: bacteriologia, virusologia, parazitologia, micologia, algologia, helmintologia, imunologia.

Anul II Microbiologie – cursul 2

1.

Microbiologie Curs 2 8.X.2007

Istoricul microbiologiei romanesti Victor Babes - a scris primul tratat de microbiologie valabil si azi „Bacteriile si rolul lor in

anatomia si histologia bolilor infectioase” - a descris niste protozoare „babesia”

- anatomo-patolog la Budapesta - a descoperit incluziunile intracitoplasmatice - s-a ocupat de vibrionul holerei si de antagonismul microbian - a fost profesor la facultatea de medicina din Cluj (1919-1920) - profesor de morfopatologie si microbiologie la Bucuresti (din 1887) - primul care asociaza vaccinul antirabic si seroterapia antirabica (turbare)

Ioan Cantacuzino

- studiaza la Paris - probleme de imunitate dobandita (de contact) - introduce vaccinul BCG (Bacil Calmette-Guérin) - intemeiaza laboratorul de microbiologie si institutul care ii poarta numele - s-a ocupat de vibrionul holerei si scarlatinei

Microorganismele Evolutia microorganismelor = este un rezultat al interactiunii dintre modificarile materialului genetic

(prin mutatii, duplicare, transfer de material genetic) si presiunea selectiva a mediului inconjurator (pastreaza in evolutie acele molecule cu proprietati ale microorganismelor)

MACROEVOLUTIA – se refera la aparitia de noi genuri, specii, clase determinand diversificarea formelor de viata

MICROEVOLUTIA – se refera la aparitia unor componente si proprietati noi in interiorul unei specii. Ex: evolutia mecanismului de rezistenta la antibiotice

Microorganismele sunt cofactori ai unor boli tumorale, degenerative cu mecanism umoral.

Oraganism imun-competent – organismul normal la care mecanismul de aparare functioneaza la un anumit nivel

Organism imun-compromis – la el au acces si alte bacterii nu numai cele patogene BACTERII

- patogenice de ordin I = bacterii patogene care produc imbolnaviri - comensale (patogenice de ordin II) = pot produce infectii la organismul imun-

compromis (ex: Escherichia coli) Clasificarea patogenilor in functie de: Riscul de infectie = probabilitatea ca intr-o situatie de intalnire dintre microorganism si om sa apara

infectia. Riscul biologic (biohazard) = grad de periculozitate pe care un microorganism il are fata de

organismul uman. Criterii pentru gradul de periculozitate (risc):

• este patogen pentru om (infectia se manifesta ca boala) • risc pentru omul de laborator • risc de raspandire in colectiv • exista mijloace de tratament si profilaxie


2.

Grupa I - microorganisme putin patogene - au o probabilitate scazuta de a produce îmbolnavirea

Grupa II

- microorganisme patogene pentru om - pot produce imbolnavirea cand exista in cantitati crescute - risc pentru omul de laborator - pericol scazut de raspandire - exista mijloace de tratament si profilaxie - ex: Stafilococcus; Bacillus cereus; Bordetella pertussis (⇒ tusea convulsiva), unele Salmonelle,

Treponema palidum (⇒ sifilis); Nisseria meningitidis, virusul gripal, virusul herpetic, Klebsiella

Grupa III

- pot produce boli grave - risc crescut pentru omul de laborator - se raspandesc usor in populatie - exista mijloace de tratament si profilaxie - ex: bacilul carbunos (antrax), bacilul tuberculos, Brucella, Salmonella typhi, virusul hepatitei B,

HIV, virusul rabic, taxoplasma, Rickettsia typhi (⇒ tifos) Grupa IV

- produc boli grave pentru care gradul de mortalitate e mare - risc crescut pentru omul de laborator - raspandire foarte mare - de obicei nu exista mijloace de tratament iar mijloace de profilaxie sunt putine - ex: arbovirusuri (care produc encefalite virale), virusul Ebola, virusul Marburg

Organisme acelulare (fara structura celulara):

• virusuri: segmente de acid nucleic intr-o capsida de natura proteica cu capacitate de infectie • viroizi: nu au capsula protectoare (numai ARN) ⇒ produc boli la plante • prioni

- proteine infectioase - nu exista acizi nucleici - boli ale SNC (boala vacii nebune)

• plasmide - dupa Monod sunt niste organisme vii deoarece au:

* emergenta (reproductibilitate, variabilitate) * teleonomie (capacitatea de a reactiona chimic dupa un anumit program)

- molecule de acizi nucleici; au ca mediu de viata citoplasma bacteriana („cromozomi facultativi”)

Organisme celulare:

• unicelulare cu celula : - de tip procariot: bacterii - de tip eucariot: fungi, protozoare, alge

• pluricelulare, dintre care pentru medicina prezinta interes: - helminti - artropode

Regnuri – incadrarea se face in principal dupa:

tipul de celula nutritie-prin difuziune

-prin endocitoza tipul de energie utilizata-chimica

- radianta


3.

Animal Vegetal Protista

- organisme unicelulare de tip eucariot - alge unicelulare, protozoare

Miceta (Fungi) - masa de filamente se inlantuie ⇒

hife - fungi inperfecti (nu formeaza hife)

Procariota - Cyanobacteria (alge albastre-verzi) - Archaebacteria (bacterii metanogene,

extrem halofile, termoacidofile) - Eubacteria (toate bacteriile care

paraziteaza omul = chimiosintetice) Bacteriile se clasifica pe baza structurii peretelui celular in:

• Gram + • Gram –

1. Gracillicutes - perete celular subtire, gracil (fragil) - Gram –

2. Firmicutes - perete celular ferm, puternic - Gram +

3. Tenericutes - fara perete celular - Mycoplasma (gen din clasa Molicutes)

4. Mendosicutes - perete celular imperfect (un peptidoglican modificat) - incluse in Archaebacteria

Obs. Bacteriile se impart pe baza ARN 16S in 10 grupe.

Deosebiri intre celula eucariota si celula procariota:

Eucariota Procariota

Nucleu • adevarat • are membrana (mb) nucleara, nucleoli

• zona nucleara - nucleoid – echivalent nuclear, genofor

• nu exista membrana nucleara sau nucleoli

Organizarea genomului

celular

• cromozomi (cu ADN si histone) • perechi de cromozomi ⇒ informatia

genetica este diploida • material genetic extranuclear

- in cloroplaste - in mitocondrii

• cromozom reprezentat de ADN dublu catenar circular, unic – informatia genetica haploida

• materialul genetic exista si extranuclear-plasmid

-profag • elemente genetice mobile

Biosinteza produsilor

genici

• genele – sunt alcatuite din introni si exoni • etapele sintezei proteice

- transcriere primara - prelucrarea prin splicing

• genele de structura – fara introni • transcriere + traducere etape

concomitente ARNm – policistronic, viata scurta


4.

- traducere-succesiva in compartimente diferite

• ARNm – monocistronic si cu viata lunga

Citoplasma • compartimentata: RE, Ap Golgi, citoschelet

• ribozomi 80S (60S + 40S)

• necompartimentata – absenta organitelor celulare si a citoscheletului

• ribozomi 70S (50S + 30S) Invelis

(mb, perete) • mb lipoproteica + colesterol • nu exista perete celular • unele celule au perete rigid format din

celuloza sau chitina

• mb nu contine steroli, cu exceptia bacteriilor din genul Mycoplasma

• peretele celular = obliagatoriu, contine peptidoglican – mureina

Multiplicare • diviziune sexuata • mitotica sau meiotica condusa de un

aparat de diviziune celulara • uniunea a doua celule germinative

haploide conduce la formarea unui ou (zigot) diploid

• diviziune amitotica, prin sciziparitate, fisiune binara, nu exista apartat mitotic

• apare fenomenul de sexualitate primitiva – conjugarea bacteriilor

Morfologie bacteriana

• frotiu – germeni omorati, se coloreaza examinare prin imersie • preparat nativ – contine germeni vii, nu se coloreaza se

examineaza la microscopul optic (MO) ⇒ ne da informatii in special despre mobilitate

Forme fundamentale de bacterii:

• coci – sferici • bacili – alungiti, bastonas • spirili – forma spiralata

1. Coci bacterii sferice diametru de 1 μm

pot fi asezati in diplo:

in varf de lance (flacara de lumanare) ⇒ pneumococi (Streptococcus pneumoniae)

forma reniforma ⇒ meningococi, gonococi (Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae)

pot fi asezati izolat pot fi asezati in gramezi ~ ciorchine:

Staphylococcus aureus, epidermidis pot fi asezati in lanturi: Streptococi

Streptococcus pyogenes, viridans pot fi asezati in tetrade (cate 4): Micrococcus pot fi asezati in colturile unui cub (cate 8):

Sarcina


1.

Microbiologie Curs 3 15.X.2007

2. Bacili • dimensiuni

bacili mici: 2-4 μm; 0,4-0,8 μm bacili mari: 7-11 μm; 0,4-1,2 μm

• forma variata rotunjite: E. coli taiate drept: Bacillus anthracis/Bacillus cereus ascutite: bacilul fusiform deformate (cu spor sau incluziuni)

* in forma de bat de chibrit: Clostridium tetani * in forma de racheta de tenis (spor subterminal) :

Clostridium botulinum * in forma de barcuta (spor central) : Clostridium

sporogenes • asezare

izolati - enterobacterii in lanturi - genul Bacillus (antracis, subtilis, cereus) litere chinezesti (bete de chibrit): Corynebacterium

diphtheriae in diplo litere majuscule (pot ramane agatati dupa diviziune):

X, Y, M, L, N, V: Mycobacterium tuberculosis Cocobacilii au dimensiunea lungimii apropiata cu cea a latimii⇒ ex: Brucella, Bordetella, Haemophilus

• antropozoonoze = boli care apar la animale dar care pot trece la om in mod accidental: *boli profesionale cum ar fi antraxul (bacilul carbunos)

3. Spirili

Pot fi cu : • o singura tura de spira: virgula – Vibrio (cholerae) • mai multe ture de spira:

spirili adevarati: celula rigida, citoplasma septata spirochete

* citoplasma neseptata, celula flexibila, mobilitate accentuata: rotatie, translatie, flexiune

* ex. Treponema, Leptospira, Borrelia burgdorferi (⇒boala Lyme)

La bacteriile fara perete celular (Mycoplasma) ⇒ forma variaza in functie de conditiile de mediu

Exista bacterii: lipsite in mod natural de perete celular (Mycoplasma) care iau nastere din coci si bacili prin actiunea

factorilor chimici/fizici (ex. antibiotice, detergenti); dupa disparitia factorilor isi pot reforma peretele ⇒ formele L (Lister)

fara

en de schimbare a aspectului morfologic la bacterii in functie de conditiile de mediu

perete celular obtinute in laborator * din Gram + ⇒ protoplasti (sub actiunea lizozimului) * din Gram - ⇒ sfereoplasti (sub actiunea lizozimului si EDTA)

Pleomorfism = fenom


2.

Structura celulei bacteriene Date obtinute prin:

• microscopie electronica (ME) • studii histochimice • tehnici de dezintegrare celulara – radiatii, lizozim • marcare radioactiva – ex: a acizilor nucleici

Formatiuni: obligatorii: nucleoid, citoplasma, mb, perete celular facultative: capsula, glicocalix, cili, pili, spori

Streptococcus mutans (in cav bucala) – are glicocalix ⇒caria dentara (cea mai frecventa boala infectioasa)

Formatiuni obligatorii 1. Nucleoidul

• greu de evidentiat datorita bazofiliei citoplasmei • Acridine-orange, Feulgen, microscopie in contrast de faza,

microscopie electronica (structura fibrilara) • nu are mb nucleara • nu are nucleoli si aparat mitotic • 1 molecula de ADN dublu catenar, circulara, inchisa covalent, cu

GM = 2,8x109 D, L =1000 μm • molecula de ADN este suprahelicoidala, suprarasucita • este compact, legat de mb citoplasmatica prin structuri derivate

din mb: mezozomi (implicati in diviziunea celulara) • celulele in curs de diviziune - au mai multi nucleoizi (2-4) • NUCLEOIDUL ESTE: * unicul cromozom ⇒ bacteria este o celula haploida

* sediul ereditati- cromozomul detine informatia genetica pt specie * exista plasmide – ereditatea extracromozomiala

• Exista antibiotice care actioneaza asupra moleculei de ADN: nitrofuran, imidazol, rifampicina, quinolone.

2. Citoplasma • nu e compartimentata datorita absentei organitelor celulare • are aspect fin granulat datorita prezentei numarului mare de ribozomi – 20.000-40.000/cel:

subunitatea 30S: ARNr 16S + 21 molecule proteice subunitatea 50S: ARNr 5S + 23S + 34 de molecule proteice

• ARN citoplasmatic – 90% ARNr + ARNm +ARNt • exista antibiotice care actioneaza asupra ribozomilor: aminozide (ex. Streptomicina), tetracicline,

macrolide (ex. Eritromicina), fenicoli (ex. Cloramfenicol). • mai contine 3-5000 molecule diferite (de la H2O la acizi nucleici) = lotul celular • incluzii = depozite de material de rezerva (mai ales la cele mature)

polimetafosfat (Corynebacterium diphtheriae) ⇒ corpusculi metacromatici care deformeaza capetele bacilului

glicogen – enterobacterii amidon – Clostridium vacuole – sferice, cu substante lichide/gazoase plasmide („cromozom facultativ”) – molecule de ADN mai mici decat cromozomul mezozomi, lipide si corpusculi Babes-Ernst


3.

3. Membrana citoplasmatica • strat subtire care înconjoara citoplasma (10-15 nm) • in celulele bacteriene exista o presiune ridicata ce impinge membrana celulara si o face sa devina

aderenta de peretele celular astfel ca e greu de evidentiat • metode de evidentiere :

1. prin plasmoliza celula se suspenda in solutii hipertonice astfel ca apa iese din celula, citoplasma se retracta si membrana se desprinde de pe peretele celular putand fi evidentiata

2. prin indepartarea peretelui celular prin tratare cu enzime: gram + : lizozim ⇒ protoplasti gram - : lizozim + EDTA ⇒ sferoplasti

3. prin microscopie electronica (ME)- membrana apare ca fiind formata din straturi intunecoase dense separate printr-un strat transparent, mai putin opac

• din punct de vedere chimic: o proteine 60-70% o lipide 40-30% ( glicolipide, fosfolipide) o nu contine steroli (exceptie Mycoplasma)

• modelul structural Singer membrana celulara = fluid fosfolipidic in care plutesc proteinele sub forma unor insule, care se gasesc fie pe partea externa, fie pe partea interna a membranei sau in grosimea ei. Este un model dinamic care explica functiile membranei.

• din citoplasma pleaca prelungiri ce leaga nucleoidul de mb = mezozomi: au rol functional (in diviziunea celulei)

Functiile membranei:

1. bariera osmotica permeabilitate selectiva: nu permite patrunderea unor molecule cu greutate

moleculara (GM) mai mare decat GM a glicerolului patrunderea substantelor se face prin:

i. difuziune simpla: se desfasoara lent; fara consum de energie; e folosita pentru metaboliti cu GM mica si pentru substantele liposolubile

ii. difuziune facilitata: intervin proteine membranare numite carausi; fara consum de energie

iii. transport activ: cu consum de energie; intervin permeaze care ajuta la transportul nutrientilor impotriva gradientului de concentratie

iv. translocatie: modificarea chimica a substantelor transportate; are loc cu ajutorul unor transferaze; are loc unidirectional

2. sediul unor procese bioenergetice – preia functiile mitocondriei 3. intervine in diviziunea celulara (prin mezozomi) 4. sediul proceselor de biosinteza = sediul enzimelor ce intervin in sinteza ADN-ului si in

sinteza peretelui celular 5. functie de secretie-excretie a enzimelor hidrolitice (scindeaza macromoleculele)

o la bacterii Gram +: enzimele sunt secretate in mediul inconjurator o la bacterii Gram - : enzimele sunt secretate in spatiul periplasmic (intre mb celulara si

mb externa) 6. sediu de actiune -pt. detergenti utilizati ca dezinfectanti (altereaza structura si functia mb) -pt. unele antibiotice : polimixine, gramicidina 7. sediul unor reactii chemo-tactice la nivelul mb exista receptori chemotactici cu rol de

atractie a unor substante (atractanti) sau respingere (repelenti) 8. motor ciliar = la bacteriile mobile, in membrana se gaseste motorul ciliar

9. membrana asigura transportul unor molecule de ADN cu GM mica permitand transferul de material genetic intre 2 celule prin fenomenul ce se numeste transformare 10. sediul unor purtatori lipidici (carrier) si ai unor metaboliti esentiali ce intrevin in sinteza peretelui celular


1.

Microbiologie Curs 4

22.10.2007

4. Peretele celular

• structura de suprafata ce se gaseste peste membrana • 15-50 nm grosime • relativ rigid ⇒ mentine forma celulei impotriva presiunii osmotice din celula care variaza intre

5-20 atm • toate bacteriile au perete celular cu exceptia Mycoplasmei • evidentiere

plasmoliza fragmentarea celulei bacteriene cu agenti fizici si chimici; centrifugare studiu la

microscopul electronic (ME) indepartarea peretelui celular cu ajutorul enzimelor

Structura: peptidoglican (mureina) – numai la bacterii; diferentiaza celulele procaiote de cele

eucariote • heteropolimer repetitiv cu GM mare, care inconjoara celula bacteriana, avand forma

aproximativa de sac ⇒ sac de mureina • peptidoglicanul este alcatuit din 2 componente

a) componenta glican (glucidica) - este aceeasi la toate bacteriile - formata din lanturi in care se repeta N-acetil-glucozamina legata prin legaturi

1-4 - β-glicozidice (desfacute de lizozim) de acidul N-Acetil-Muramic


2.

b) componenta peptidica - difera cu specia - formata din lanturi de L si D-aminoacizi legati de acidul N-acetil-Muramic:

monomerul peptidoglicanului

• legarea unitatii monomer se face intre diaminoacidul 3 de pe o catena si D-Ala din 4 a

catenei urmatoare (cu indepartarea D-Ala 5) • pozitia 3 are cea mai mare variabilitate: la bacterile: Gram - : in pozitia 3 = acid diaminopimelic

Gram +: in pozitia 3 = Lys, Hys, ornitina, acid diaminobutiric • legarea se face prin interventia unor enzime: transpeptidaze si carboxipeptidaze

direct la bacteri Gram (-) cand peptidoglicanul are o structura bidimensionala indirect la Gram (+),

stafilococi printr-o punte penta-glicinica

• in formarea puntilor intervin enzime (transpeptidaze, carbozipeptidaze) care fac parte din clasa PLP (proteine de legare a penicilinei ← care inhiba formarea peretelui – engl. PBP)

Streptococcus viridans este foarte sensibil la

penicilina; dar s-ar putea sa existe in faringe si un stafilococ (S. aureus) care sintetizeaza o penicilinaza astfel ca streptococul nu este afectat.

Exista diferente intre peretele celular la Gram + si Gram –

La bacteriile Gram (+) = peretele celular este foarte gros 40-50 nm Straturile peretelui:

1. Peptidoglicanul – multistratificat - pana la 40-50 de straturi de peptidoglicani 2. Acizi teichoici – polimeri de ribitol-fosfat sau glicerol-fosfat

pot fi: - de perete: polimeri de ribitol-P (la suprafata peptidoglicanului) - de membrana: acizi lipoteichoici polimeri de glicerol-fosfat care fac legatura

intre peptidoglican si membrana celulara Acizii teichoici participa la cresterea, diviziunea si functionarea celulei bacteriene; stabilizeaza suprafata celulei bacteriene si au rol de antigen pentru ca uneori pot determina un raspuns imun in organism; intervin in functionarea suprafetei bacteriei si capteaza unele molecule si ioni din mediu (Mg2+) ; in mediu cu PO43- scazuti nu se sintetizeaza acizi teichoici ci acizi teichuronici.

3. Polizaharide – nu in cantitate mare, dar la unele bacterii, polizaharidele atasate de acizii teichoici pot conduce la aparitia unor polizaharide de perete:

Ex: la streptococi: polizaharidele duc la formarea carbohidratului C care duce la clasificarea pe baza antigenica a streptococilor

4. Proteine – in cantitate mica, cu exceptia unor bacterii ce au in peretele celular proteina A sau stafilococul care are proteina M

5. Lipide: - in cantitate foarte mica (sub 1%) - exceptie face genul Mycobacterium care are lipide in peretele celular in cantitate mare


3.

(30%). Acidul mycholic confera acestui gen caracterul de acido-alcoolo-rezistenta. Se evidentiaza prin coloratie Zeihl-Nielsen. - Corynebacterium dyphteriae are mai multe lipide (dar nu atat de multe ca Mycobacterium)

La bacteriile Gram (–) = peretele celular mai subtire (10-20 nm) 1. Peptidoglican are doar 1-2 straturi 2. Strat lipoproteic - reprezentat de molecule lipoproteice care pornesc din membrana si prin componenta proteica se leaga de peretele celular (de acidul diaminopimelic), iar prin componenta lipidica patrunde in stratul urmator al peretelui celular, care e reprezentat de membrana externa.

3. Membrana externa – structura asemanatoare cu membrana citoplasmatica (masa fosfolipidica in care plutesc insule de proteine:

*proteine majore = 70% a) Matrix-proteine: se asociaza in

triplete (cu alte molecule lipoproteice) si formeaza niste canale (pori) care strabat peretele celular pana la mb citoplasmatica permitand trecerea unor molecule si a unor nutrienti cu greutate moleculara mai mica.

b) Inductibile: induse in anumite situatii; pot actiona fie ca receptori pentru bacteriofagi fie ca receptori pentru pilul sexual (aspect important in fenomenul de conjugare a bacteriilor); uneori pot functiona ca transportori pentru unii nutrienti.

* proteine minore = 30% Intervin in transportul unor metaboliti cu GM mica (ex. Viamina B12, exista proteine numite siderofori cu rol de captare a Fe din mediu). Unele au si rol de enzime hidrolitice sau muralitice (autolizine capabile sa desfaca anumite legaturi din peretele celular si sa creeze niste locuri in care se inclaveaza monomeri nou sintetizati permitand cresterea peretelui), iar altele au rol de legare a penicilinelor (PBP).

Obs: celulele sistemului RE au proprietatea de a sechestra Fe in caz de boli infectioase ⇒ in bolile infectioase apare anemia

4. Stratul lipopolizaharidic (LPS) - Strat de suprafata identic cu endotoxina si cu antigenul „O” ale bacteriilor Gram (–). Este alcatuit din:

lipidul A care e responsabil de toxicitatea pentru organism a endotoxinelor carora le confera termostabilitate

un polizaharid complex organizat care proemina pe suprafata celulei format dintr-o portiune centrala (sambure, core) de care se leaga componente formate din unitati oligozaharidice care se repeta la suprafata bacteriei (trizaharide liniare; tetra sau pentazaharide ramificate); unitatile repetitive confera specificitatea antigenului O

Intre mb citoplasmatica si mb externa se gaseste spatiul periplasmic cu:

• enzime hidrolitice⇒ scindare a macromoleculelor din mediu in fragmente care pot patrunde in celula bacteriana

• proteine neenzimatice ⇒ transportul unor metaboliti spre interiorul celulei • oligozaharide ⇒ reglare osmotica la bacterii

Exista bacterii fara perete celular: Mycoplasma, protoplasti (Gram +), sferoplasti (Gram -) Enzime care actioneaza asupra peretelui celular:

lizozim - indeparteaza peretele celular la Gram (+) - la Gram ( –) doar impreuna cu EDTA (si nici atunci complet)

autolizine


4.

Rolul peretelui celular:

1) mentine forma bacteriei 2) bariera osmotica ce permite trecerea moleculelor cu GM mica 3) receptor pentru bacteriofagi si pilul sexual (intervine din diviziunea sexuala) 4) tinta de actiune pentru antibiotice 5) protectie mai ales la bacteriile intestinale fata de enzimele digestive si sarurile biliare 6) permit impartirea in Gram + si Gram - 7) sediul enzimelor hidrolitice ce degradeaza macromoleculele in fragmente ca sa poata fi

introduse in celula 8) sediul antigenului O la Gram (–) (care prin aglutinare permite identificarea bacteriilor) 9) serveste ca matrice (primer) in propria sinteza

Formatiuni facultative

- bacteriile ce le au nu le sintetizeaza tot timpul-

1. Capsula • Strat superficial peste peretele celular, ce inconjoara bacteria

a. Capsula propriu-zisa: e reprezentata de o structura compacta, densa, bine organizata ce inconjoara strans corpul bacteriei.

evidentiere: coloratii speciale: Burri (cu tus de China, capsula nu se coloreaza), Muir prin coloratie Gram: daca frotiul este realizat direct din produsul patologic

capsula apare ca o zona necolorata (se decapsuleaza prin coloratie); iar in caz de frotiu cu o cultura pura, capsula nu se evidentiaza prin coloratie Gram.

tehnici imunologice: utilizare seruri cu anticorpi care reactioneaza cu antigenele din capsula ⇒ impingerea capsulei: „fenomen de umflare a capsulei”

natura chimica • polizaharidica: Pneumococcus, Klebsiella, Haemophilus (cocobacili),

Bordetella • proteica: bacilul carbunos (B. antracis) capsula e un polimer de acid D-

glutamic; iar la streptococul β-hemolitic de acid hialuronic rolul

* factor de patogenitate/virulenta (pneumococii decapsulati nu mai sunt patogeni) * protectie fata de actiunea combinata litica a anticorpilor si a complementului * sediul unor antigene (ex. la pneumococ polizaharidul capsular permite

clasificarea pneumococilor in 80 de tipuri antigenice) [pneumococul este pe locul 2 in etiologia meningitei la copii]

* identificarea pneumococilor ser anti pneumococic ⇒ umflarea capsulei

b. unele bacterii pot prezenta un strat mucos format dintr-o substanta capsulara produsa in cantitate crescuta in general mai solida si care inconjoara multe bacterii avand rol de aderare de diferite suprafete. Unele bacterii au drept invelis un antigen= K/Vi: la unele Salmonelle


1.


29.10.2007 2. Glicocalixul

• Este o formatiune pe care bacterile o secreta numai in mediul lor de viata (nu si in laborator) • Reprezentat de o retea de fibre polizaharidice forte lungi care inconjoara bacteria • In aceasta retea pot fi captate si alte bacterii (alte specii decat cea care elibereaza glicocalixul) • nu poate fi vazut la microscopul optic, ci doar la cel electronic prin coloratii speciale: rosu de

ruteniu Roluri:

in aderarea bacteriei de diferite suprafete in organism aderenta nespecifica: aderarea la diferite tipuri de suprafete aderenta specifica: aderarea numai la suprafata anumitor tipuri de celule

ex: Streptococcus mutans (din cavitatea bucala) are proprietati de a elibera glicocalix cu ajutorul caruia adera de smaltul dentar. El are enzime speciale cu care formeaza glicocalix sub 2 forme:

prin actiunea glucozil-transferazei se obtine un polimer de glucoza⇒ dextran prin actiunea fructozil-transferazei se obtine un polimer de fructoza⇒ levan

prin aceste structuri Streptococcus mutans adera de smaltul dentar unde formeaza colonii de bacterii (pot fi incluse si alte bacterii) incluse in dextran sau levan rezultand palca dentara. Bacteriile care se gasesc in glicocalix au activitate metabolica si produc pH acid (prin anumiti metaboliti care acidifica mediul) avand actiune distructiva la nivelul smaltului si determinand aparitia cariei dentare.

Unele bacterii se pot atasa prin intermediul glicocalixului pe diferite catetere vasculare, pe sonde sau proteze.

3. Flageli (cili) – apar ca niste prelungiri filamentoase, foarte lungi subtiri fragile ce asigura mobilitatea bacteriei. Evidentierea :

La microscopul optic cilii pot fi evidentiati doar prin coloratii speciale: impregnari cu saruri de Ag (maresc dimensiunile lor)

Prin metoda tuburilor in „U” - daca bacteria e mobila se gaseste si la

celalalt capat - daca bacteria nu e mobila se gaseste la

un singur capat

In functie de numarul si prezenta cililor bacteriile pot fi: o monotriche= cu un flagel la un capat o amfitriche= cu 2 flageli (cate unu la fiecare capat)

Examples of bacterial flagella arrangement schemes. A-Monotrichous; B-Lophotrichous; C-Amphitrichous; D-

Peritrichous;

o lofotriche =cu un manunchi la un capat o peritriche= cu flageli pe toata suprafata o atriche= fara flageli (sunt imobile) • Bacteriile cu multi cili prezinta fenomenul de invazie (ex. Proteus) fiind extrem de mobile. • Din punct de vedere chimic flagelii sunt de natura proteica = flagelina (asemanatoare miozinei)

= proteina contractila alcatuita din subunitati proteice care agrega si conduc la aparitia unei structuri tubulare, rasucita helicoidal; (prezinta antigenul H)

• La microscopul electronic a fost observata ultrastructura cilului acesta fiind format din 3 componente:

http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Flagella.png�


2.

1. corpuscul bazal (cilindru proteic delimitat de 2 perechi de discuri: una ancorata in peretele celular, asigurand stabilitatea cilului, iar una in membrana citoplasmatica, asigurand energia necesara miscarii cilului)

2. carlig- manson incurbat 3. filament axial care strabate carligul

• Rolul cililor:

1. asigura mobilitatea bacteriei = in sens orar (rostogolire) si antiorar (in linie dreapta)

- combinata cu chemotaxia = miscare dirijata intr-un gradient de

concentratie a substantelor chimice - fototaxia; aerotaxia (spre concentratie

crescuta de O2, la aerobe) 2. la nivelul cililor se gaseste antigenul H ciliar

(flagelar) care ne ajuta la identificare 3. poate fi receptor pentru bacteriofagi

*Treponema, Leptospira, Borrelia = genuri fara cili/flageli dar cu mobilitate foarte mare datorita unui aparat locomotor intracelular (rotatie/translatie).

4. Pili: formatiuni de suprafata prezente mai ales la bacilii Gram (-) dar si la bacteriile Gram (+). Sunt prezente atat la bacteriile mobile (patogene) cat si la cele imobile (nepatogene). Sunt de 2 categorii:

a) sexuali - prelungiri mai lungi decat pilii comuni, flexibili, se termina in buton - natura proteica - numar mic pe celula (1-4) - au determinism plasmidic: informatia genetica ce codifica acesti pili se gaseste in

plasmide b) comuni (fimbrii)

- prelungiri foarte scurte (apr0x. 1 μm), drepte, rigide, vizibile la ME

- se gasesc in numar mare pe celula bacteriana (100-200)

- informatia genetica pentru sinteza lor e detinuta in special de cromozomi

- natura proteica: pileina = proteina formata din subunitati mici care agrega

- rol: aderare de diferite suprafete in special epitelii – gonococ, meningococ

- de multe ori fimbriile se pot prinde de receptorii zaharidici (proteine care au ca ligand o structura polizaharidica si care au caracter de lectine)

- o specie bacteriana poate avea fimbrii care sa permita aderarea de diferite tipuri de celule Ex:*mai multe forme de E. coli:

o ETEC = E. coli enterotoxigen care elaboreaza o toxina responsabila de diaree masiva cu caracter apos, adera de epiteliul intestinal cu ajutorul pililor

o EIEC = E. coli enteroinvaziv o EHEC = E. coli enterohemoragic o EPEC = E. coli enteropatogen


3.

5. Spori: formatiuni endocelulare, greu colorabile care mai apoi sunt eliberate ca exospori - sunt o forma de rezistenta a bacteriei (atunci cand o celula vegetativa ajunge in conditii nefavorabile de mediu, celula trece intr-un spor, care atunci cand ajunge in conditii favorabile redevine celula bacteriana). Spre deosebire de forma vegetativa (activa metabolic) sporul este inactiv metabolic aflat in stare latenta (stare criptobiotica). • 2 genuri cu spori cu importanta medicala: Clostridium (tetani, botulinum) si Bacillus (anthracis,

cereus) • sporul poate avea diametrul

- mai mic decat al celulei si nu deformeaza celula (Bacillus) - mai mare decat al celulei pe care o deformeaza (Clostridium)

Clostridium botulinum Bacillus cereus

• Evidentierea: - coloratii speciale (pentru microscopul optic): verde malaki

si safarina - in coloratie Gram sporul nu se coloreaza - microscopie electronica - microscopie in contrast de faza (preparate native)

• Ultrastructura

o portiunea centrala (core) =protoplastul sporal format din: nucleoid, citoplasma, mb citoplasmatica; reprezinta 50-70% din substanta uscata a sporului

o peretele sporal – peptidoglican care va da nastere peretelui celular pentru celula vegetativa cand sporul trece in bacterie (va germina)

o cortex – strat voluminos format de un peptidoglican cu structura laxa datorita unui numar mai mic de legaturi incrucisate intre componente (mai gros)

o invelisuri sporale: strat intern + strat extern o uneori la unele bacterii peste cele 2 straturi

exista si un exosporium • Compozitia – se caracterizeaza printr-un continut redus

de H2O libera (aceasta gasindu-se numai legata) astfel ca toate reactiile metabolice sunt reduse, aproape inexistente. In invelisurile sporale se gasesc proteine cu sulf iar in cortex se gaseste un constituent particular cu rol in metabolismul Lys: dipicolinatul de Ca. La nivelul sporului o serie de enzime dispar sau isi reduc activitatea, dar pot aparea altele noi pe care nu le gasim la celula vegetativa: dipicolinat sintetaza, alanin-racemaza. La nivelul sporului nu se detecteaza ARN mesager pentru ca sinteza proteica este aproape inexistenta.


4.

Capacitatea unei celule de a sporula (de a forma spori) Sporogeneza = este un proces complex ce se desfasoara in mai multe etape fiind implicate aproximativ 200 de gene. Germinarea = capacitatea sporului de a trece in celula vegetativa cand ajunge in conditii favorabile.

Sporii pot rezista mai multi ani pana la germinare. Germinarea este un proces complex ce se desfasoara in mai mute etape: 1. incepe cu activarea sporului = aparitia unor mici leziuni pe invelisurile sporale determinate de aciditatea mediului, de temperaturi crescute si elemente abrazive. 2. initierea germinarii se face datorita factorilor nutritivi din mediu care stimuleaza activitatea unor autolizine ce actioneaza asupra cortexului, si il indeparteaza (dispare si dipicolinatul de Ca). Bacteria se imbiba cu apa (rehidratarea sporului) si activitatea metabolica este reluata. 3. cresterea celulei bacteriene cu reluarea activitatii enzimatice (metabolice)

⎯⎯⎯⎯⎯ SPORULARE → ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ →⎯ )favorabile conditii(in GERMINAREaprox. 80 gene

spor celula vegetativa

ROLURI: • forma de rezistenta la diferiti factori chimici si fizici • termorezistenta e datorata deshidratarii sporului sau cantitatii mari de dipicolinat de Ca • rezistenta la alti factori fizici (radiatii, presiune) si factori chimici asigurata de abundenta

proteinelor cu sulf din invelisuri. • are importanta in clasificarea bacterilor-exista in 2 genuri sporulate • reprezinta o forma primitiva de evidentiere celulara • unele specii de bacterii sporulate pot elibera niste produsi extracelulari folositori (ex: antibiotice) S-a demonstrat ca productia de antibiotice e controlata de gene implicate in etapele initaiale ale

sporularii; aceste gene in celula vegetativa sunt represate.


1.

Microbiologie

Curs 6 5.XI.2007

Metabolismul bacterian

Bacteriile sunt organisme unicelulare capabile de o activitate metabolica neintrerupta. Ele cresc, se divid, isi obtin energia si se diferentiaza spre forme de rezistenta (sporuleaza), se misca si se adapteaza la mediu. La baza acestei activitati sta metabolismul bacterian reprezentat de toate reactiile care se desfasoara intr-un organism (o celula).

Microorganismele sunt sisteme vii, deschise, complex organizate, specifice care schimba cu mediul substante si informatii. Metabolismul celulei bacteriene se suprapune cu metabolismul celorlalte forme de viata. Bacteriile se incadreaza in unitatea biochimica a lumii vii pentru ca au o unitate de structura chimica identica cu restul celulelor (aminoacizi, nucleotide, acizi grasi, polizaharide) si pentru ca au si o unitate de procese metabolice (reactii biochimice).

Metabolismul bacterian poate fi primar si secundar: metabolism secundar

• Metabolismul primar este reprezentat de o succesiune de reactii chimice necesare cresterii si dezvoltarii unui organism (celula bacteriana).

• Metabolismul secundar este reprezentat de ansamblul de reactii care duc la formarea unor compusi care influenteaza unele organisme din jur (le stimuleaza, le inhiba sau le distruge). ex: sub nuc nu creste nimic

Metabolismul este reprezentat de o serie de reactii chimice, catalizate de enzime, care se desfasoara intr-o anumita succesiune. Este reprezentat de o serie de cai si cicluri metabolice ce formeaza o retea complexa si variata si care functioneaza perfect datorita unui control extrem de riguros.

metabolism primar

Metabolismul se caracterizeaza prin diversitate determinata de factori fizici, chimici si substante nutritive foarte diverse care se gasesc in habitatele in care traiesc bacteriile. Trasaturi particulare ale metabolismului bacterian:

1. metabolismul bacterian → se desfasoara intr-o singura celula; fiecare celula este capabila sa isi sintetizeze toti constituentii necesari fara sa fie influentata de produsii altor celule specializate.

2. este necompartimentat ca urmare a necompartimentarii structurale (a citoplasmei)→ reteaua metabolica e completa si complexa

3. este teleonomic: in cursul evolutiei bacteriene s-au selectat acele cai metabolice ce au o eficienta maxima (nimic nu se sintetizeaza in exces)

4. este foarte flexibil → bacteriile sunt capabile sa utilizeze un numar foarte mare de substante nutritive (ca urmare a adaptarii la diferite conditii de mediu) ex. bacilul piocianic (Pseudomonas aeruginosa) utilizeaza 70-100 nutrienti diferiti

5. este intens – schimbul dintre celula bacteriana si mediul inconjurator este foarte intens, celula bacteriana creste foarte repede iar raportul dintre suprafata si volum se schimba. De asemenea diviziunile celulare sunt foarte dese (timpul dintre 2 diviziuni = timp de generatie = 20 minute)

6. este foarte riguros controlat → exista control cibernetic → sintetizeaza ce au nevoie si cat le trebuie

In celula bacterina au loc 4 tipuri de reactii:

1) catabolice: implicate in degradarea nutrientilor din mediu cu eliberare de energie (exergonice) 2) anabolice: asigura formarea intermediarilor cheie pentru sinteza monomerilor→ se face cu

consum de energie 3) amfibolice: functioneaza atat in anabolism cat si in catabolism 4) cai auxiliare = cai anaplerotice, ce asigura refacerea compusilor cu 3-4 atomi de C plecand de

la compusi cu 1 atom de C care altfel s-ar pierde sau s-ar consuma

http://images.google.ro/imgres?imgurl=http://www.uibk.ac.at/microbiology/images/petri_-bipesco.jpg&imgrefurl=http://www.uibk.ac.at/microbiology/research_areas.html&h=350&w=353&sz=27&hl=ro&start=8&um=1&tbnid=Uu8ZhCO1UDQ56M:&tbnh=120&tbnw=121&prev=/images%3Fq%3Dmicrobiology%2Bprimary%2Bmetabolism%2B%26um%3D1%26hl%3Dro�


2.

Schema metabolismului bacterian O celula bacteriana pusa intr-un mediu cu nutrienti isi foloseste enzimele hidrolitce pentru a degrada polimerii organici din mediu (⇒digestie) rezultand molecule mai mici (cu numar mic de atomi de C si cu eliberare de energie) ce pot fi transportate in celula.

1. reactii de clasa I sunt reactii degradative si duc la formarea de substante cu 3 pana la 7 atomi de C = intermediari cheie = schelete de C, energizate de la care se porneste sinteza monomerilor

2. reactii de clasa II → reactii anabolice → conduc la sinteza monomerilor, substante cu un numar mai mic sau egal cu 60 atomi de C pe molec ⇒ aminoacizi, monozaharide, acizi grasi, nucleotide

3. reactii de clasa III – reactii de polimerizare → conduc la formarea polimerilor biologici homopolimeri si heteropolimeri :

• periodici/repetitivi: peptidoglicanul (levan→ glicocalix) • aperiodici/nonrepetitivi (proteine, acizi nucleici)

O celula bacteriana este alcatuita din: apa 70%, ioni anorganici: Na+, K+, Ca2+, Mg2+, Fe, P, S; cataboliti si precursori, lipide si precursori, enzime si vitamine, proteine, ADN (cromozomi)

Nutritia bacteriana - se refera la capacitatea unei bacterii de a folosi substante nutritive din

mediu pentru a creste. Nutritia se refera la sursele de substante nutritive, energia folosita de bacterie si la modalitatile prin care substantele ajung in celula bacteriana.

Bacteriile au nevoie de sursa de C, N, S, H2O, saruri minerale; altele de factori de crestere Sursa de C – dupa sursa de carbon bacteriile pot fi:

• bacterii carbon-autotrofe (importante in circuitul C in natura): utilizeaza CO2 ca sursa de C • bacterii carbon-heterotrofe (de importanta medicala pentru patologie): utilizeaza C din

substantele organice • carbon-mixotrofe: utilizeaza in mod obisnuit sursa anorganica dar pot folosi si subst. org.

Sursa de N • bacterii care utilizeaza N din atmosfera - poate fi fixat cu ajutorul enzimelor = nitrogenaze

- au importanta in agricultura • utilizeaza N din compusi anorganici (nitrati, nitriti) – bacterii patogene pentru om • pot utiliza N din compusi organici (ex. N aminic)

Sursa de S • poate fi utilizat sub forma oxidata (sulfat, sulfit) • sau sub forma de H2S

Apa – este un constituent obligatoriu Saruri minerale - necesare pentru activitatea enzimelor

- anioni (de S, P) - cationi (Na+, K+, Ca2+) - microelemente (Cu, Mg, Co, Fe – catalizeaza reactiile enzimatice)

Factorii de crestere: substante ce sunt necesare pentru dezvoltarea bacteriilor in cantitati foarte mici, μg/ml, dar pe care bacteriile nu le pot sintetiza

Exemple: vitamina B, K, aminoacizi, baze azotate, colesterol (pt Mycoplasma), acizi grasi (pt Leptospira) - recent genul Haemophilus (de tip β-capsulat) a fost delimitat de restul familiei prin necesarul de factor de crestere: factorul X =Hemina, si factorul V = Nicotinamid Adenin Dinucleotid (NAD) Sursa de energie

bacteriile fototrofe - folosesc lumina bacteriile chimiotrofe - folosesc energia rezultata din degradarea substantelor:

o chimiolitotrofe (implicatii medicale) – degradeaza substantele anorganice o chimioorganotrofe - degradeaza substantele organice

bacteriile prototrofe se dezvolta pe medii de cultura simple (necesitati minime) bacterii paratrofe - determina parazitismul intracelular


1.

Microbiologie Curs 7 12.11.2007

Factorii fizici care influenteaza dezvoltarea bacteriilor 1. Temperatura – pentru fiecare bacterie exista o relatie intre

viteza de multiplicare si temperatura • graficul temperatura/viteza de crestere (multiplicare): pentru fiecare

specie exista o temperatura maxima, o temperatura minima si o temperatura optima pentru dezvoltarea bacteriei:

- temperatura minima - la care bacteria nu se mai multiplica - temperatura optima - la care viteza de multiplicare este maxima - temperatura maxima - la care bacteria nu se dezvolta

• in functie de temperatura, bacteriile se clasifica astfel: - b. criofile (psihrofile): Tmin = 0 °C, Tmax = 15-20 °C, Toptima = 10-15 °C - b. mezofile (implicatie medicala): Tmin = 10-15 °C, Tmax =45 °C, Toptima = 30-40 °C - b. termofile (din ape termale, gunoaie): Tmin > 50 °C, Tmax = 80-100 °C, Toptima = 60-70 °C

• unele bacterii se dezvolta numai la 37 °C (interval de multiplicare foarte strans). Aceste bacterii se numesc stenoterme.

Ex: de bacterii stenoterme (mor sub 30°C): Neisseria meningitidis/ Neisseria gonorrhoeae • Unele bacterii se multiplica bine la 4°C: Ex: Listeria monocytogenes (infectii cu transmitere

digestiva) • La unele bacterii, pentru alte functii biologice, temperatura poate fi alta decat cea pentru

multiplicare datorita faptului ca exista operoni termoinductibili ce functioneaza doar daca temperatura creste peste 30°C.

Ex: bacilul Shigella (dizenterie) prezinta proteine responsabile de capacitatea acestuia de a patrunde in celula si de a se multiplica, si prezinta operoni termoinductibili. In acest caz, temperatura este un semnal in activarea sau dezactivarea exprimarii fenotipice.

• temperaturi < decat tmin – efect bacteriostatic (opreste multiplicarea) • temperaturi > decat tmax – efect bactericid - se folosesc pentru sterilizare

(autoclavare la 120°C, 1 atm, 30 min – distruge si sporii) 2. pH –ul • majoritatea se dezvolta la pH - 7,2-7,4 • bacterii acidofile - se dezvolta la pH acid (pana la pH= 1)

- ex: Archaebacteria, lactobacilii-pH = 1-5 - fara importanta in patologie

Archaebacteria

• bacterii alcalofile - se dezvolta la pH alcalin (pana la pH= 9-10)

- ex:Vibrionul holeric - pH = 9,2 vibrionul holerei

• bacterii acidurice - se dezvolta la pH neutru, dar in urma activitatii metabolice produc acizi care scad mult pH-ul (<5) si continua sa se dezvolte si la acel pH (Streptococcus

mutans)

Streptococcus mutans


2.

3. Presiunea osmotica BACTERIILE SUNT OSMOTOLERANTE:

• bacteriile sunt tolerante la variatii mari de presiune osmotica deoarece peretele celular permite dezvoltarea unei presiuni ridicate

• pentru bacterii cu perete celular subtire Gram (–) presiunea osmotica = 10 atm • pentru bacterii cu perete celular gros Gram (+) presiunea osmotica = 20 atm • pentru bacterii fara perete celular (Mycoplasma) presiunea osmotica = 1-2 atm

4. Puterea ionica (concentratia de saruri) a. Exista bacterii halotolerante care suporta concentratii de NaCl 7,5% (stafilococul) b. Exista bacterii halofile pentru care concentatia de NaCl 7,5% este obligatorie (Vibrio

parahaemolyticus) Ex: concentratii crescute de sare sau zaharuri au efect bacteriostatic (folosite la muraturi sau dulceturi) Exista un interval de permisivitate pentru fiecare factor (care permite multiplicarea bacteriei), in afara acestui interval efectele pot fi bacteriostatice sau bactericide. La limita superioara a intervalului, bacterile elibereaza proteine de stres utilizand alte cai metabolice (ex: HSP=Heat Shock Proteins) 5. CO2

• Exista bacterii care izolate din organism necesita cantitati de CO2 mai mari decat cele produse - bacteriile capneice

6. Radiatii

• UV – efect bactericid - nu au capacitate de penetrare si se folosesc la sterilizarea aerului si suprafetei de lucru

• γ –se folosesc la sterilizarea instrumentelor de unica folosinta (seringi) 7. O2

• necesar pentru dezvoltarea bacteriilor strict aerobe (acceptor final de electroni) • toxic pentru bacteriile strict anaerobe

Metabolismul bioenergetic

REACTII DE CLASA I Metabolismul energetic este reprezentat de reactii de oxidoreducere care au la baza transportul de electroni pornind de la un substrat care se oxideaza (cedeaza electroni) pana la un substrat care se reduce (acceptor final de electroni). In functie de natura substratului care cedeaza sau accepta electroni, avem mai multe modalitati de eliberare a electronilor:

a. respiratia aeroba: donatorul de electroni este o substanta organica, de regula glucoza. Acceptorul final de electroni este O2. De la glucoza la O2 electronii sunt transportati prin lanturile sistemului transportor de electroni reprezentat de o serie de componente gasite in membrana citoplasmatica. In acest tip de respiratie cantitatea de energie eliberata este mai mare pentru ca substratul care cedeaza electronii se oxideaza complet.

b. respiratia anaeroba: donatorul este reprezentat de substante organice. Acceptorul final de electroni este o substanta anorganica diferita de O2 : nitrat, nitrit, sulfat, carbonat, fumarat. Si in acest proces functioneaza lantul respirator, partial sau integral. Se poate ajunge la oxidari complete de substante si se elibereaza o cantitate destul de mare de energie.

c. fermentatia: este o restructurare moleculara si nu se ajunge niciodata la oxidarea completa a substratului, cantitatea de energie eliberata fiind mult mai mica. Atat donatorul cat si acceptorul sunt substante organice iar in mediu se acumuleaza o serie de produsi finali cu natura diferita.


3.

In functie de natura produsilor finali: 1) fermentatie lactica

a) homolactica - asemanatoare cu fermentatia care se produce in timpul travaliului muscular - exista la unii lactobacili

b) heterolactica - alaturi de acidul lactic se acumuleaza si alti produsi acizi (ex: acetat; etanol) - exista la unii streptococi si la unii lactobacili

2) fermentatie alcoolica : se acumuleaza alcool etilic (ex: S. cerevisiae -fara implicatii medicale) 3) fermentatie acida mixta:duce la acumularea de acid acetic, acid formic, acid succinic, CO2, H

liber care duc la scaderea pH-ului sub 5 (la unele enterobacterii care se evidentiaza prin testul rosu-metil)

4) fermentatia acetoinica - se acumuleaza in mediu acetil-metil carbonilul sau acetoina si butinil-

glicolul - caracteristica pentru unele enterobacterii: Klebsiella - se pot evidentia in laborator prin testul Voges-Proskauer

5) fermentatie butirica: rezulta acid butiric si este prezenta la unele Clostridii (Clostridium tetani) si la unele sporulate, sau la unii bacili: ! strict anaerobe

6) fermentatie propionica: se acumuleaza in mediu acidul propionic, acetic, succinic, si este caracteristica pentru bacteriile anaerobe (Propionibacterium sp., si unele clostridii)

In cazul bacteriilor anaerobe diversitatea tipurilor de fermentatie este mult mai mare iar spectrul substantelor care rezulta reprezinta o caracteristica de gen si specie. In functie de necesitatea prezentei O2 si efectul toxic pe care acesta il poate avea, bacteriile pot fi:

1. aerobe obligatorii - se multiplica in prezenta O2 si folosesc respiratia - in absenta O2 este posibil ca unele bacterii sa se multiplice cu conditia sa existe un

acceptor final de electroni (oxigenul nu este toxic) ex: Pseudomonas 2. microaerofile

- se multiplica la concentratii mici de O2 (5%) si folosesc respiratia - in absenta O2 nu se multiplica - O2 poate fi toxic in concentratii mari - ex: Campylobacter, Helicobacter

3. aerobe – anaerob facultative - in prezenta O2 – folosesc respiratia si se multiplica - in absenta O2 – folosesc fermetatia - O2 nu este toxic - cele mai multe se gasesc la om (ex: enterobacterii, stafilococul)

4. anaerobe – aerob tolerante - se multiplica atat in prezenta O2 dar si in absenta O2 folosind fermentatia - ex: Streptococcus

5. anaerob obligatorii - nu se multiplica in prezenta O2 si folosesc fermentatia - O2 este toxic

* Clostridium Gram+ (sporulate) * Bacteroides Gram- (in colon) - Metronidazol– actioneaza pe b. anaerobe

REACTII DE CLASA II – reactii de biosinteza (anabolice cu consum de energie) Reactia de sinteza a acidului folic:

Sulfamidele (analogi ai PABA) se leaga competitiv si inhiba dihidropteroat sintetaza. Trimetoprimul se leaga de dihidrofolat reductaza, inhiband-o.


4.

REACTII DE CLASA III reactii anabolice de polimerizare folosesc monomerii obtinuti in reactiile de clasa II si sintetizeaza polimeri

- homopolimeri - heteropolimeri (repetitivi sau nerepetitivi)

Homopolimeri - din acelasi monomer care se repeta liniar sau ramificat - pot fi extracelulari: ex: glicocalix - sau pot fi intracelulari: ex: incluzii, amidon, lipide, proteine - pentru sinteza lor au nevoie de un numar mic de enzime de polimerizare si de un

substrat care pentru unii homopolimeri poate fi sintetizat in celula, alteori poate fi preluat din mediu

Heteropolimeri - periodici sau repetitivi = ansamblu de substante cu greutate moleculara mica care se

repeta si formeaza retele bidimensionale sau tridimensionale ex: peptidoglican; ac. teichoici

- aperiodici sau nerepetitivi: formati din mai multe substante care de obicei apartin aceleiasi clase chimice dar de-a lungul polimerului nu exista nici o secventa care sa se repete identic ex: proteine, ADN, ARN

- pentru sinteza este nevoie de multe enzime de polimerizare, dintre care unele sunt organizate in structuri supramoleculare

Biosinteza peptidoglicanuilui: are loc in citoplasma celulei, la nivelul membranei si se ajunge pe acel primer = peretele celular (peretele celular este primer in propria sinteza)

UDP – N-Ac-Glu fosfo enol piruvic (PEP) UDP – N-Ac-Glu piruvat enol eter

+ 2H

- aminoacizii din pentapeptid sunt adaugati secvential si fiecare aditie

UDP – N-Ac-Mur acid

este catalizata de o alta enzima L-Ala ATP

implicand scindarea ATP in ADP si Pi D-Glu - inhiba aceasta etapa (impiedica

ADP + Pi

formarea unui pentapeptid complet pentru ca nu permite

CICLOSERINA

atasarea ultimelor doua D-Ala) UDP – N-Ac-Mur acid - pentapeptid - trecut pe membrana, la acest nivel monomerul astfel -impiedica reciclarea format trece de pe UDP pe un alt BP-ului transportor BACTOPRENOLUL si i -monomerul gata se adauga N-Acetil-Glucozamina format trece la nivelul

peretelui celular - inhiba trecerea monomerului la nivelul peretelui celular

BP – N-Ac-Mur acid - pentapeptid

+ N-Ac-Glu

VANCOMICINA

PG – N-Ac-Mur acid - pentapeptid

BP-UDP BACITRACINA

+ N-Ac-Glu

PENICILINE

PG – N-Ac-Mur acid - tetrapeptid

+ N-Ac-Glu


1.

Microbiologie

Curs 8 19.XI.2007

Metabolismul ADN-ului

Molecula de ADN participa la multe cai metabolice ce formeaza metabolismul ADN-ului. Acesta este matrice pentru exprimarea fenotipica a informatiei genetice.

Metabolismul ADN-ului cuprinde: • replicarea • repararea • restrictia si modificarea • recombinare genetica • transcrierea

Structura ADN-ului: 1) Structura primara

• heteropolimer aperiodic si nonrepetitiv • molecula flexibila care ia diferite forme in spatiu: pliere/rasucire • format din doua catene polinucleotidice = dublucatenar (la bacterii si

eucariote), dar poate fi si monocatenar (la unele virusuri) • contine baze - purinice (A; G)

- pirimidinice (T; U - in ARN; C) • catenele au un capat 5’ cu grupari fosfat si un capat 3’ cu grupari OH libere • nucleotidele se ataseaza la capatul 3’ deci lantul creste in directia 5’→ 3’

2) Structura secundara • catene antiparalele (anticomplementare) • au sens opus

• stabilitatea este mentinuta prin legaturi de H intre

A=T si G≡C • exista forme liniare si forme circulare (cromozomul

bacterian si unele virusuri) • capetele pot fi libere sau legate (covalent sau prin

legaturi de H) ⇒ capete coezive/adezive/ lipicioase

• starea ADN-ului poate fi superhelicoidala sau relaxata; trecerea dintre cele doua stari se face cu ajutorul unor enzime

Proteine implicate in metabolismul ADN-ului 1. ADN-ligaza 2. helicaza – care separa catenele 3. ADN polimeraza III – fuctioneaza cu mare precizie: cu rol in alungire si corectare 4. ADN polimeraza I – cu rol in refacerea golurilor 5. exonucleaze – actioneaza pe capetele libere ale moleculei de ADN→ desfac legaturile

fosfodiesterice 6. endonucleaze – ce actioneaza in interiorul catenelor → desfac legaturile fosfodiesterice 7. ligaze – refac continuitatea catenei de ADN; actioneaza indiferent de secventa

a) secvente palindromice (4-6-10 nucleotide) GAATTC

CTTAAG capete coezive

b) secvente repetative - directe: ATTC – ATTC - inverse: ATTC – CTTA


2.

1. Replicarea AND-ului bacterian

Replicarea este semiconservativa = o molecula bicatenara de ADN va forma doua molecule noi (identice intre ele, precum si cu molecula “parentala”) fiecare formata dintr-o catena veche si o catena “nou-sintetizata”. Replicarea poate interesa o molecula intreaga (cromozom sau plasmida) sau doar o parte a acesteia (reparare, recombinare).

Etapele replicarii: initiere, alungire, terminare

a) Initierea Incepe la locuri bine determinate, recunoscute de enzime implicate in acest proces (helicaza,

topoizomeraze, ARN-primaza) numite originile replicarii si notate cu „ORI”. Se caracterizeaza prin faptul ca sunt bogate in A=T. Din acest punct porneste “furculita de replicare”. Cuprinde mai multe momente :

- este necesara desfacerea duplexului parental pe anumite zone prin ruperea legaturilor de hidrogen stabilizatoare.

- pe lanturile izolate de ADN se fixeaza imediat proteine de destabilizare a helixului care impiedica refacerea legaturilor de hidrogen si a structurii dublu helicoidale.

- se realizeaza stabilizarea furcii prin interventia topoizomerazelor (produc o superspiralare) - asamblarea-proteinelor de replicare (replizom): helicaza

-proteinelor de stabilizare (primazom): primaza, ARN-polimeraza, ADN-polimerazaB Pentru plasmide si bacteriofagi o molecula de ADN serveste ca matrice pentru sinteza mai multor

molecule. Este posibil la bacterii sa se replice numai o portiune din molecula de ADN. Replicarea poate fi - bidirectionala (modelul θ – la E. coli) –pentru diviziunea celulei

- unidirectinala (modelul σ) – in transfer (conjugare) la plasmide si cromozomi

b) Elongarea (alungirea) Reprezinta progresia furcilor pana se parcurge intreaga matrice (punctul terminus situat la 180º

fata de ORI). In timpul elongarii, pe o catena sinteza se face in directia 5’-3’ lantul nou format numindu-se lant conducator sau director, iar pe cealalta catena sinteza se face tot in directia 5’-3’ dar nu continuu, lantul nou format numidu-se lant succesor sau intarziat.

c) Terminarea Se produce atunci cand cele doua furculite de replicare se intalnesc intr-o regiune opusa regiunii

ORI (punctele terminus).Are loc separarea cromozomilor si plasmidelor. 2. Repararea ADN-ului: constitutiva sau inductibila; specifica sau nespecifica Modificari ale ADN-ului

1. Erori de replicare: citire gresita a matritelor, sau greseli de incorporare a monomerilor in catenele care se sintetizeaza

2. Leziuni independente de replicare a. modificari ale bazelor azotate:

- prin agenti alchilanti, ce determina metilarea bazelor azotate care nu mai pot face perechi corecte (se imperecheaza gresit)


3.

- dezaminari spontane (citozina ⎯⎯ →uracil; adenina ⎯⎯ →hipoxantina) ⎯⎯ dezaminare ⎯⎯ dezaminare

- formarea de dimeri pirimidinici prin actiunea razelor UV (ex: dimeri de timina) - scindari ale purinelor prin radiatii sau agenti chimici - depurinari (la caldura sau la pH acid)

b. sectionari ale scheletului zahar-fosfat: intreruperea legaturilor fosfo-diesterice pe o catena sau pe ambele catene prin radiatii ionizante sau prin tratare chimica (deletii, insertii)

c. legari covalente: intre cele doua catene sau intre baze din aceeasi catena, determinand perturbarea replicarii sau a functiei de matrice.

Exista doua categorii de sisteme de reparare (prereplicativa, in timpul replicarii, postreplicativa): a) reparare constitutiva, specifica, directa, tintita la leziune b) reparare inductibila, nespecifica care recunoaste o varietate de leziuni

a) Repararea constitutiva (specifica) Fotoreactivarea = sistem capabil sa desfaca legatura covalenta care apare intre dimerii de timina

rezultand reversia lor. Se datoreaza unei enzime fotomonomerizante/fotoreactivatoare numita fotoliaza, inactiva la intuneric. Fotoliaza se leaga de dimerii de timina si la intuneric, dar pentru clivarea si monomerizarea lor are nevoie de lumina (λ=300-600). Enzima recunoaste leziunea din ADN, se leaga de dimer iar dupa absorbtia energiei luminoase este activata si desface dimerul apoi este eliberata pentru ca ADN-ul revine la forma initiala.

Exista si alte enzime implicate in repararea specifica: • glicozilaze de reparare – indeparteaza gruparea metil mai ales de pe adenina • metil-transferaze – indeparteaza gruparea metil mai ales de pe guanina

b) Repararea inductibila (nespecifica) 1. excizia si resinteza: se bazeaza pe faptul ca informatia genetica este prezenta in doua catene

complementare. Leziunea este sesizata de cel putin trei proteine dupa care se produce scindarea leziunii (catenei) si indepartarea ei ⇒ exonucleaze. Catena este refacuta prin actiunea polimerazelor care vor insera bazele corecte datorita catenei complementare.

2. replicarea recombinationala (reparare postreplicativa): ARN-polimeraza sare peste leziune ramanand astfel o breşă

3. sistemul S.O.S – sistem inductibil de reparare ce intervine cand toate celelalte sisteme de reparare nu au reusit sa repare leziunile. Actioneaza postreplicativ. Se gaseste in forma inactiva fiind format din 20 de gene represate. Este predispus la erori si face parte din grupul sistemelor de raspuns al celulelor bacteriene la stress. Are caracter de urgenta. Este responsabil de supravietuirea celulei.

Ex: in boala ereditara Xeroderma pigmentosum – pielea este inchisa la culoare (expunere la UV cancer cutanat); nu sunt reparate leziunile din ADN cauzate de razele UV.

⇒

3. Restrictia si modificarea

Fenomene complementare care permit recunoasterea ADN-ului propriu (care va fi protejat si conservat) de ADN-ul strain (care va fi sectionat si eliminat din celula).

Modificarea: metilarea in anumite locuri a ADN-ului propriu imediat dupa replicare (modifica baze la locul sau langa locul cu potential de clivare). ADN-ul metilat in pozitii caracteristice este recunoscut ca propriu.

Restrictia: fenomen complementar la care participa enzime speciale numite endonucleaze de restrictie; acestea recunosc ADN-ul nemetilat ca strain si il degradeaza in fragmente mai mici facandu-l nefunctional. Endonucleaza de restrictie este o enzima care recunoaste anumite secvente de baze azotate (4-8 baze) la nivelul carora actioneaza = secvente palindromice (se citesc la fel si de la stanga si de la dreapta); au capetele coezive/adezive/lipicioase. Impiedica invazia ADN-ului strain si este folosita in clonarea moleculara (tehnologia ADN-ului recombinant). Ex: endonucleaza de restrictie EcoR1


4.

4. Recombinarea

Reprezinta interactiunea intre doua molecule de ADN care fie provin fie din aceeasi celula bacteriana fie din doua celule diferite.

Intervine in: o repararea leziunilor acizilor nucleici o integrarea sau excizia de plasmide sau genom fagic in/din cromozomul bacterian o transpozitia elementelor mobile

Consecinte: • integrarea unei secvente (in intregime) in alta; pentru moleculele de talie aproximativ

egala cu plasmidele se numeste cointegrare • excizia este un proces invers prin care se face separarea plasmidei din cromozom =

rezolvarea integrarii Recombinarea poate fi:

omoloaga (legitima) situs specifica situs nespecifica (ilegitima)

1. Recombinarea omoloaga (dependenta de proteina RecA)

- intre segmente omoloage aproape identice intre care nu exista decat mici modificari la nivelul unor perechi de baze

- au regiuni capabile sa formeze perechi complementare pe zone extinse - are loc intre molecule diferite de ADN sau secvente de pe acelasi ADN

Mecanism molecular: - ruperea si reuniea catenelor insotita de sinteza partiala de ADN - exista mai multe modele de recombinare moleculara rezultand formarea unui

heteroduplex, structura dublu catenara formata din catenele celor doua molecule care se recombina

Recombinarea omoloaga are loc numai intre specii apropiate, inrudite. Intervine in repararea prin recombinare in fenomenul de transfer de ADN = transductie, transformare si in recombinarea intre rezerva de gene si caseta de expresii fenotipice (la gonococi).

2. Recombinarea situs-specifica Are loc intre molecule total diferite ca secvente cu exceptia unui anumit loc unde secventa este identica.

Exista mai multe mecanisme moleculare cum ar fi integrarea si excizia plasmidelor si profagilor. Ex: bacteriofagul λ ce paraziteaza E. coli – se integreaza in cromozomul bacteriei intotdeauna intr-o pozitie caracteristica, intre genele GAL si BIO. Desprinderea se poate face corect sau incorect.

Recombinarea situs-specifica e intalnita si la elementele genetice mobile (EGM) sau transpozabile (EGT). Acestea sunt molecule de ADN care nu se pot replica singure si au capacitatea de a se deplasa de pe o molecula pe alta sau in diferite locuri in cadrul aceleiasi molecule. Transpozitia este asigurata de enzime numite transpozaze, si poate fi replicativa sau nonreplicativa.


1.

Microbiologie

Curs 9 26.XI.2007

5. Transcrierea Este un proces ce se desfasoara in mai multe etape:

1. initierea - intervine enzima ARN-polimeraza ce recunoaste o anumita secventa (promotor) 2. alungirea - are loc citirea in sens 3’-5’ si sinteza in sens 5’-3’ 3. terminarea - poate fi ρ-dependenta sau

- ρ-independenta (este implicata proteina ρ [„ro”]) Unitatea de transcriere este operonul, format din: • gene de structura (detin informatia genetica pentru sinteza) • secvente semnal = gene reglatoare ce codifica proteine de control • operatori si promotori de care se leaga ARN-polimeraza (asigura transcrierea)

Gena reglatoare codifica proteine reglatoare (alosterice); acestea au doua locusuri: - un locus activ - prin care recunoaste cu foarte mare specificitate un operator - un locus efector - recunoaste si permite atasarea unor molecule mici din mediu (molecule efectoare)

ce are ca si consecinta schimbarea configuratiei proteinelor reglatoare modificandu-le afinitatea pentru substrat.

Exista doua categorii de proteine reglatoare ce intervin in controlul activitatii operonului: 1. proteine de reglare care atunci cand se fixeaza de operon, inhiba functia ARN-polimerazei si astfel

si transcrierea informatiei pe ARN-ul mesager cat si sinteza de proteine. Sunt proteine represoare ce exercita un control negativ asupra biosintezei proteice.

2. proteine reglatoare care cand se fixeaza pe regiunea operatoare, favorizeaza activitatea ARN-polimerazei si implicit transcrierea informatiei genetice pe ARN-ul mesager cat si biosinteza proteica. Sunt proteine activatoare ce exercita un control pozitiv asupra biosintezei proteice.

Ex: 1. operonul lactozei - are trei gene structurale (z, y, a) ce codifica enzime (vezi desen) - gena operator si secvente adiacente Desen foarte important! retineti toate detaliile!

Gena represoare (regulatory gene) codifica o proteina ce are afinitate pentru operon. Dupa ce este sintetizata, aceasta proteina reglatoare se fixeaza pe operon, motiv pentru care ARN-plimeraza nu se mai poate lega de promotor si nu se mai poate deplasa de-a lungul genelor structurale. Astfel sinteza proteica nu are loc. In momentul in care se introduce LACTOZA in mediu (inducer molecules) aceasta se fixeaza de locusul efector al proteinei reglatoare, care se desprinde de pe operon. Se formeaza complexul represor - lactoza (inactive represor) care ramane in citoplasama. Operonul ramane liber, ARN-polimeraza se fixeaza pe acesta si se deplaseaza de-a lungul genelor structurale, citeste informatia genetica si determina sinteza proteica. Se sintetizeaza β-galactozidaza, permeaza si acetilaza.


2.

Operonul este supus si altor mecanisme de control in care intervine proteina catabolit activatoare ce functioneaza numai in prezenta ciclic AMP-ului cu care formeaza un complex. Acest complex permite legarea ARN-polimerazei si deplasarea ei de-a lungul genelor structurale stimuland sinteza proteinei respective.

Un alt mecanism este cel de represie catabolica a activitatii metabolice, efect datorat glucozei. Daca glucoza este prezenta in mediu, bacteria nu isi sinetizeaza enzime degradative pentru alte zaharuri. Pentru formarea acestor enzime este nevoie de ciclic AMP si de proteina catabolit activatoare. In momentul in care glucoza este transportata in celula pentru a fi utilizata, formarea ciclic AMP-ului este perturbata. Complexul ciclic AMP – proteina catabolit activatoare nu se mai formeaza astfel ca este inhibat operonul lactozei si implicit sinteza enzimelor degradative.

2. operonul triptofanului • este supus unui fenomen de atenuare datorat organizarii ADN-ului • are gene de structura: se gaseste o proteina leader intre prima gena de structura si operator • este un mecanism mai eficient

(sigma)

(1, 2, 3, 4)

, In fenomenul de atenuare nu se impiedica initierea transcrierii Reglarea : 1. se face in timpul transcrierii prin cooperare intre ARN polimeraza si ribozomi 2. nu necesita proteine reglatoare


3.

Cresterea si dezvoltarea bacteriilor

Dezvoltarea unei bacterii reprezinta cresterea ordonata a tuturor componentelor bacteriene si

marirea volumului pana la dublare. De la o celula se ajunge la o populatie de celule. Dezvoltarea se face mai ales pe medii lichide.

Daca se insamanteaza o specie bacteriana pe un mediu lichid si la diferite intervale de timp se iau probe pentru a se urmarii dezvoltarea populatiei, inregistrand datele pe un grafic se obtine curba de dezvoltare a unei populatii. Pentru o specie bacteriana curba este aceeasi in aceleasi conditii de mediu.

Etapele curbei de dezvoltare:

a. perioada de latenta b. perioada logaritmica (de multiplicare exponentiala) c. perioada stationara d. perioada de declin (descendenta)

A. Perioada de latenta • numarul de bacterii nu se modifica, fiind egal cu numarul

celulelor inoculate. • au loc modificari metabolice, bacteriile programandu-si

metabolismul pentru a putea utiliza nutrientii din mediu • a fost demonstrata de Monod prin fenomenul de

diauxie: a cultivat E. coli intr-un mediu care contine 0,01% glucoza si 0,1% lactoza. Aspectul curbei de dezvoltare prezinta doua perioade de latenta (A) demonstrand ca bacteriile sufera doua modificari: cresc pe glucoza iar dupa ce aceasta se termina bacteriile isi reprogrameaza metabolismul si cresc pe lactoza.

B. Perioada logaritmica

• are o durata variabila influentata de bogatia mediului si de resursele nutritive • in momentul in care resursele incep sa se reduca permit trecerea in etapa stationara • caracterizata printr-o multiplicare accentuata a bacteriei • numarul celulelor creste in progresie geometrica • bacteriile sunt tinere, au un metabolism activ: sinteza proteica intensa, cantitati mari de ARN • la microscopul electronic apar cu 2-4 nucleoizi datorita diviziunii rapide • celulele au cele mai reprezentative proprietati ale speciei respective:

sunt cele mai sensibile la actiunea antibioticelor si a substantelor dezinfectante au afinitate fata de coloranti

Timpul de generatie la bacterii = timpul ce se scurge intre doua diviziuni (aprox. 20 min)

C. Perioada stationara • apare un echilibru intre numarul celulelor care se divid si numarul celor care mor • celulele sunt de obicei mature cu proprietati alterate si morfologie aberanta • se pot produce modificari ale afinitatii pentru coloranti • celulele pot prezenta incluziuni in aceasta perioada putand elibera mari cantitati de toxine

D. Perioada de declin

• bacteriile mor la o rata accentuata • putine celule supravietuiesc pe seama materiei rezultate din moartea celorlalte bacterii • moartea se datoreaza epuizarii nutrientilor din mediu cat si interventiei enzimelor (autolizine) • bacterile sunt batrane cu perete celular gros rezistente la factori fizici si chimici si la antibiotice • au forme aberante iar proprietatile lor nu seamana cu cele ale speciei respective


Microbiologie

Curs 10 10.XII.2007

Genetica este stiinta care studiaza ereditatea si variabilitatea speciilor (caracterele speciei sunt transmise de la parental la descendent). Dupa 1940, dupa descifrarea structurii bacteriene s-a demonstrat ca intreaga informatie genetica este depozitata la nivelul acizilor nucleici si s-a descifrat modul de replicare. Genetica se ocupa cu studiul ereditatii si variabilitatii. Ereditatea studiaza mecanismele prin care sunt mentinute stabile caracterele de specie si prin care sunt transmise de la parental la descendenti. Este determinata de structura dublu catenara a ADN-ului si de modaliatea de replicare semiconservativa. Variabilitatea = fenomen prin care se determina aparitia de noi caractere care permit ca celulele fiice sa fie diferite de parental. Exista doua categorii de fenomene: • Variatii genotipice = determinate de aparitia unei modificari in genomul bacterian si se

transmite la descendenti. Apar independent de factorii de mediu ce au rolul doar de a selecta aceste variatii. Sunt stabile si se transmit la descendenti. Apar prin mutatie, sau transfer de material genetic intre doua celule.

• Variatii fenotipice = nu apar modificari in genom, ci doar la nivelul caracterelor observabile. Sunt determinate de factorii de mediu, nu sunt stabile si reprezinta o exprimare diferita conditionata de mediu. Nu se transmit la descendenti.

Ex: bacilul tuberculos – prezinta in strucura peretelui celular un numar mai mare de lipide (30%) = alcoolo-rezistenta Genetica bacteriana studiaza organizarea si functionarea ADN-ului bacterian.

• Genotip = genomul bacterian = totalitatea materialului genetic dintr-o celula bacteriana. • Fenotip = caracterele observabile = modul de exprimare a informatiei genetice

Avantajele modelului bacterian:

1. timpul de generatie foarte scurt = intr-un timp scurt poate fi urmarita transcrierea caracterelor la mai multe generatii

2. bacteriile sunt celule haploide usor de analizat 3. pot fi cultivate pe medii de cultura sintetice ce au compozitie bine cunoscuta (cel mai

simplu mediu de cultura trebuie sa aiba o sursa de carbon una de azot si saruri minerale) 4. pot fi purtatoare de virusuri = bacteriofagi – pot fi studiate relatiile dintre genomul

bacteriofagului si genomul celulei. 5. in bacterii se gaseste si material genetic extracromozomial = plasmide si bacteriofagi

Organizarea materialului genetic la bacterii • Material genetic cromozomial = este reprezentat de cromozom si este sediul ereditatii

cromozomiale care detine informatia genetica pentru caracterele esentiale vietii celulei. • Material genetic extracromozomial = sediul ereditatii extracromozomiale care codifica

caracterele neesentiale pentru viata celulei dar uneori extrem de importante in patogenitate; este reprezentat de plasmide si bacteriofagi. Exista elemente genetice mobile (transpozabile) care au capacitatea de a se deplasa de pe un compartiment pe celalalt.

O parte din materialul genetic este dotat cu capacitatea de autoreplicare (repliconi) – cromozomi, plasmide, bacteriofagi – in timp ce elementele transpozabile nu sunt repliconi si se gasesc doar ca parte integranta dintr-un replicon. Cromozomul

molecula circulara de ADN bicatenar GM = 2,8 x 109 Daltoni 4000 perechi de gene (structurale, reglatoare, criptice)

1.


2.

Plasmidele molecule circulare de ADN mai mici decat cromozomul codifica informatia pentru caractere neesentiale vietii celulei se numesc si cromozomi facultativi si se gasesc intracelular exista plasmide cu rezistenta la antibiotice se pot gasi:

- autonom in citoplasma: se replica independent de cromozom - integrate in cromozom: se replica odata cu cromozomul

dupa capaciatatea de a media transferul de material genetic pot fi: - Plasmide conjugante = sunt mari si in numar mic in celula, contin informatia genetica

pentru transfer prin conjugare si operonul TRA (de transfer) putand initia transferul intre doua celule.

- Plasmide neconjugante = sunt mici si in numar mai mare de copii in celula. Nu pot initia procesul de conjugare pentru ca nu au operonul TRA. Pot fi transferabile de la o celula donatoare la una acceptoare prin fenomenul de transformare, transductie sau prin cointegrare cu o plasmida conjuganta.

Principalele gene care se gasesc intr-o plasmida sunt: gene de autonomie care asigura functiile existentei autonome a plasmidei in celula

bacteriana; gene de excludere a altor plasmide sau a altor elemente extracromozomiale (excluderea se

poate face prin gene de incompatibilitate sau prin gene pentru enzime de restrictie si modificare);

gene care asigura transferul si gene de fertilitate; gene de interactiune cu alte molecule de ADN; gene care codifica o serie de caractere fenotipice (observabile) si de patogenitate; gene care codifica o serie de structuri bacteriene: pili;

Plasmida F = plasmida de fertilitate – se poate gasi autonom in citoplasma (se replica independent), sau se poate gasi integrata in cromozom (replicarea se face odata cu acesta).

In functie de prezenta plasmidei F, in functie de raportul pe care il au cu cromozomul si de capaciatatea de facilitare a transferului de gene, celulele se clasifica astfel:

- Celula F+ = are plasmida F in citoplasma (celula masculina – donatoare) - Celula F- = nu are plasmida F (celula feminina – receptoare) - Celula Hfr = are plasmida F integrata in cromozom - Celula F’ = plasmida integrata initial in cromozom se desprinde si poate lua gene din

cromozom Plasmidele R = plasmide de rezistenta la antibiotice • conjugante = pot initia procese conjugante pentru ca au operonul de

transfer RTF (factor de transfer al rezistentei) • neconjugante = nu au operonul RTF si pot fi transferate altor celule

prin transformare, transductie Plasmidele R au determinanti de rezistenta „r” pentru un numar variabil de antibiotice (max 8). Ele reprezinta principalul mijloc de de transmitere a rezistentei la antibiotice.

Ex: streptococul β-hemolitic a ramas fidel penicilinei = nu se face antibiograma Plasmide care codifica substante cu actiune antimicrobiana/antibacteriana (Klebsiella → Klebocine, Piocianic → Piocine, Stafilococ → Stafilocine) Plasmide bacteriocianogene – in ecologia microbiana (in alcatuirea microbiogenozei) Plasmide de patogenitate (de virulenta)

- codifica toxine bacteriene = enterotoxina de la stafilococ; toxina exfoliativa - codifica adezine – caracter de invaziditate

Plasmide metabolice – implicate in metabolism Plasmide care produc tumori la plante Plasmide care codifica serorezistenta bacteriana – rezistenta la actiunea bactericida a serului Plasmide criptice – nu codifica nici un caracter.


1.

Microbiologie

Curs 11 17.XII.2007

Bacteriofagii – Genomul fagic

Bacteriofagii sunt virusuri care paraziteaza bacteriile. Un virus

este alcatuit dintr-un singur tip de acid nucleic (ADN/ARN) si din capsida (cutie proteica protectoare)

bacteriofag

Exista bacteriofagi: eicosaedrici cu coada filamentosi cu coada contractila/necontractila; pe coada exista

receptori pentru bacteriofagi In celula bacteriana poate patrunde doar acidul nucleic al

bacteriofagului (prin mecanism asemanator unei seringi = infectare), restul elementelor raman afara.

Fibrile – capacitatea de a se fixa pe celula Dupa ce a patruns in celula acidul nucleic poate lua doua cai:

1. ciclul litic 2. ciclul lizogen

1. Ciclul litic

la bacteriofagii salbatici mecanism de liza asemanator lizozimului celular dupa intrarea acidului nucleic in celula, acesta se exprima prin sinteza:

acidului nucleic patogen proteinelor capsidale

proteinele capsidale se asambleaza (incapsidarea acidului nucleic) formand bacteriofagi maturi care parasesc celula prin liza ei


2.

2. Ciclul lizogen

la bacteriofagii temperati informatia pentru multiplicarea vegetativa a bacteriofagului este represata de o proteina represoare

codificata de bacteriofag segmentul de material genetic al bacteriofagului se insera in cromozomul bacteriei

Profag = bacteriofag integrat in bacterie (in cromozomul bacteriei) - celula care poarta profagul se numeste celula lizogenizata Ex: bacilul difteric = profagul β-TOX - bacteriofagul se poate integra la intamplare in cromozom, sau poate

recunoaste o zona specifica din cromozom in care se va integra Ex: bacteriofagul λ – paraziteaza E. coli si se integreaza intotdeauna intre genele GAL si BIO

- bacteriofagul codifica o nucleaza capabila sa taie acidul nucleic al celulei in segmente egale cu materialul genetic al bacteriofagului celula lizogenizata ⇒

- la un moment dat se poate desprinde: corect = acidul nucleic al profagului trece in citoplasma unde se

multiplica vegetativ si apoi se elibereaza profagi prin liza celulei incorect = acidul nucleic al bacteriofagului ia o portiune din acidul

nucleic al celulei bacteriene

Transductia genei GAL Bacteriofagul λ se desprinde incorect luand cu el gena GAL din cromozomul bacteriei E. coli

Transductie = transfer unidirectional de material genetic de la o celula donatoare la una receptoare prin intermediul unui vector (acidul nucleic al bacteriofagului); ex: datorita faptului ca acidul nucleic al bacteriofagului λ se integreaza intotdeuna intr-un anumit loc in cromozomul bacteriei E. coli se vor transfera segmentele invecinate locului unde acesta se integreaza ⇒ transductia genelor GAL si BIO Elemente genetice transpozabile/mobile (EGM)

sunt segmente de ADN cu lungime variabila de 70-80 de mii de perechi de baze si sunt dotate cu capacitatea de deplasare (transpozitie), fie de pe un replicon pe altul fie in cadrul aceluiasi replicon

nu au capacitate de replicare si se gasesc doar ca parte integranta a unui replicon (cromozom, plasmida, profag)

se pot gasi: 1. autonom 2. integrate in cromozomi = molecule cu comportament enzimatic = epizomi

prezinta o enzima capabila sa asigure deplasarea = transpozaza, care actioneaza la nivelul unor secvente terminale repetate care sunt recunoscute de aceasta si care pot fi in ordine directa sau inversa; secventele terminale pot fi de 2 feluri:

*de insertie (IS) cele mai simple (nu sunt repliconi) sunt segmente de ADN cu o lungime de 800-1400 pb (perechi de baze) dotate cu

capacitatea de transpozitie in structura lor se gaseste doar gena ce codifica transpozaza sunt marginite de secvente repetate directe sau inverse


3.

*transpozonii (TN)

o EGM mai lungi si mai complexe care ajung pana la 80.000 pb si sunt flancate de secventele de insertie

o prezinta si alte gene ce codifica anumite caractere fenotipice noi cum ar fi rezistenta la antibiotice sau la unele metale grele

o sunt marginite de secventele de insertie (IS)

Transpozitie:

• replicativa – originalul ramane, copia se deplaseaza • nereplicativa – originalul se deplaseaza

Clasificarea transpozomilor

1. Transpozoni de clasa I se deplaseaza de la un loc la altul fara ca transpozitia sa fie precedata de replicare Ex: transpozomii - simpli IS

- compusi: au gena pentru transpozaze dar si alte gene 2. Transpozoni de clasa II

• transpozitia se face cu replicare • modalitate de amplificare a materialului genetic • transpozonul ramane la locul initial si o copie a lui ajunge in alt loc

Enzime : transpozaza; enzime cu capaciatea de a media cointegrarea in alta molecula = cointegrat-rezolvaza

3. Transpozoni de clasa III secvente de nucleotide ce poarta un intreg genom de bacteriofag de fiecare data cand apar, rezultatul transpozitiei este o mutatie

Importanta: 1. in variabilitate (EGM pot ingloba gene adiacente) 2. EGM pot functiona ca virusuri oncogene ce pot produce modificari genetice ce stau la baza

mutatiilor 3. fac sa nu mai existe delimitare neta intre cele doua componente, cromozom si material

extracromozomial

Mobile genetic elements in the Cell (left) and in what ways they can be acquired (right).

http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Bacterial_mobile_elements.svg�


1.

Microbiologie Curs 12 07.I.2008

Modificarea materialului genetic

Principalele procese prin care materialul genetic poate fi modificat sunt:

• mutatiile • transfer de material genetic

1. Mutatia: este o modificare in secventa de nucleotide care apare brusc, rar, spontan si se transmite la descendenti.

Celula care sufera mutatia se numeste celula mutanta, fiindu-i afectata o parte din genom si avand proprietati diferite fata de cea parentala. Mutatia poate sa apara in cromozom dar si in materialul genetic extracromozomial si poate afecta orice proprietate a bacteriei. Dintr-o celula mutanta poate lua nastere o populatie de celule mutante care poate supravietui cu celelalte celule, le poate inlocui sau poate sa dispara datorita mediului nefavorabil. Mutatia este independenta de factorii de mediu care au doar rol de selectie a mutantelor. Mutatia are un caracter spontan. Caracterul spontan si rolul de selectie al mediului este demonstrat prin doua teste:

1. testul fluctuatiei populatiilor Luria-Delbrück 2. testul insamantarii replicative efectuat de sotii Lederberg

Din punct de vedere cantitativ mutatia poate fi caracterizata prin: 1. rata de mutatie: ce reprezinta probabilitatea ca o anumita mutatie care vizeaza un anumit

caracter sa apara intr-o celula bacteriana in timpul unei diviziuni. Poate fi de 1 x 10-7 pana la 1 x 10-8. Pare sa fie controlata genetic si adaptata la un anumit nivel optim de fortele evolutiei.

2. frecventa mutatiilor: este reprezentata de numarul sau cantitatea de celule mutante care se gasesc intr-o populatie bacteriana privind anumite caractere fenotipice. Este raportul dintre numarul de celule mutante si numarul total de celule din populatia bacteriana. Poate fi de 1 x 10-5 pana la 1 x 10-10. Este influentata de rata mutatiei si de momentul in care apare mutatia.

Mecanismele moleculare ale mutatiei

1. substitutia de baze azotate: • Fenomenul de tranzitie: o baza purinica este inlocuita cu o alta baza purinica sau o baza

pirimidinica este inlocuita cu alta baza pirimidinica. • Fenomenul de transversie: o baza purinica este inlocuita de o baza pirimidinica sau invers.

Poate fi afectat un codon (mutatie punctiforma) iar daca aminoacizii codificati se afla in centrul activ al unei enzime va rezulta alta proteina (daca aminoacizii nu se afla in centrul activ nu se intampla nimic).

2. cresteri sau sectionari ale scheletului de zahar-fosfat: pot permite adaugarea sau pierderea (deletia sau insertia) de baze azotate, ce pot duce la mutatii genice sau plurigenice = mutatii extinse

3. rearanjari sau inversari de baze azotate: se datoreaza elementelor genetice mobile (EGM), transpozonilor ce pot actiona pe acelasi element genetic sau pe elemente genetice diferite.

Mecanismul de aparitie a mutatiilor spontane

1. transformarile tautomere - bazele din strucura ADN-ului in mod normal se gasesc in forma ceto (A=T; G≡C). Prin tautomerizare trec uneori in forma enol formandu-se perechi gresite (A=C).

2. gerseli ale ADN-polimerazei - mutatii in genele care codifica ADN-polimeraza, enzima care odata modificata nu isi mai indeplineste corect functia de corectare sau de replicare;

3. modificari produse in genele care codifica alte enzime de replicare = metilaza ⇒ produce metilari in alte pozitii astfel ca ADN-ul nu va mai fi recunoscut ca propriu.

4. greseli in genele care codifica nucleotidele: se poate produce excesul unor nucleotide, perturband echilibrul dintre ele;

5. inserarea unor elemente genetice mobile sau profagi (insertii sau deletii de baze azotate) 6. radicalii activi de oxigen pot influenta secventele de nucleotide din acizii nucleici.


2.

Mecanismul de aparitie a mutatilor induse (determinate de agenti mutageni chimici sau fizici) Factori fizici - razele UV ce pot determina formarea dimerilor de timina - razele X ce pot rupe legaturile dintre bazele complementare rezultand deletii Factori chimici

analogi de baze azotate care se incorporeaza in ADN in timpul replicarii, in locul bazelor normale (ex: 5-brom-uracilul care seamana cu timina, 2-brom-deoxiuridina)

substante care produc dezaminarea bazelor din molecula de ADN favorizand erori de impachetare (ex: acidul nitros) - prin dezaminarea adeninei se formeaza hipoxantina care se leaga de citozina ⇒ tranzitia de la timina la citozina

agenti alchilanti: (etil-metan sulfonatul, metil-metan sulfonatul) metileaza la intamplare unele baze care vor face perechi gresite ex: metil-guanina face perche cu timina

colorantii acridinici (acridin orange) se pot intercala intre doua nucleotide adiacente iar dupa ce se desprind lasa un loc liber unde se poate insera o alta baza formandu-se perechi gresite

Tipuri de mutatii:

1. dupa modul de aparitie pot fi: spontane sau induse 2. dupa marimea leziunii pot fi: - punctiforme (prin tranzitie sau transversie)

- extinse (genice sau plurigenice) prin deletie, inversie, insertie 3. dupa efectul mutatiei asupra traducerii in proteine:

mutatie cu sens gresit – sinteza unui alt aminoacid decat cel initial, rezultand alta proteina mutatie cu acelasi sens – nu apare o modificare in structura proteinei (un aminoacid

poate fi codificat de mai multi codoni astfel ca schimbarea unei baze poate duce la formarea unui codon ce codifica acelasi aminoacid)

mutatie non sens – codoni non sens ce determina oprirea sintezei proteice (codon STOP= UGA, UAG, UAA)

4. in raport cu exprimarea fenotipica: mutatie perceptibila = schimbari de diferite grade ale caracterelor fenotipice (observabile) mutatii silentioase = nu se exprima fenotipic mutatii letale

5. in raport cu parentalul salbatic (cu informatia initiala): • mutatii inainte: celula mutanta castiga, pierde sau isi modifica o functie in raport cu

parentalul (difera de parental printr-o proprietate) • mutatii inapoi: readuc parentalul salbatic prin:

o reversmutatie (numai in cazul mutatiilor punctiforme) o mutatii supresoare - intragenice sau intergenice

Tipuri de mutante

Oricare dintre proprietatile unei bacterii poate fi modificata: mutante morfologice – ex: dintr-o celula cu capsula se poate forma una acapsulara iar dintr-una

cu cili se poate forma una fara cili mutante biochimice – utilizeaza sau nu un anumit substrat mutante metabolice

de virulenta (3 colonii foarte virulente = Bacilul tuberculos, Bacilul difteric, Bacilul carbunos)

de patogenitate de cultura

mutante conditionat letale: al caror caracter letal nu se exprima decat in anumite conditii de mediu (de regula stabilite de catre experimentator)

Ex: mutantele termosensibile: folosite in prepararea vaccinurilor – virusul gripal are mutante ce se replica la 300 2. Transferul de material genetic Patrimoniul genetic al unei bacterii poate fi modificat si prin transfer de material genetic intre doua celule: una donatoare si una receptoare. Transferul este unidirectional si nu are loc schimbul reciproc de materal genetic.


3.

Materialul genetic al celulei receptoare se numeste endogenom iar cel care provine din celula donatoare se numeste exogenom. Exista trei mecanisme ale transferului de material genetic:

1. Transformarea 2. Transductia 3. Conjugarea

1. Transformarea = transfer de ADN liber (rezultat din liza celulei sau extras chimic) intre o

celula donatoare si o celula receptoare. Este cel mai vechi mecanism descoperit (in 1928) de Griffith printr-un experiment. A inoculat la soarece (pneumococul S = capsulat - produce imbolnaviri; R= necapsulat): • pneumococ S III care va

produce pneumonie si moartea soarecelui

• pneumococ R II care nu omoara soarecele

• pneumococ S III omorat prin caldura care nu omoara soarecele

• pneumococ S III omorat +R II viu – omoara soarecele, de la care se va recolteaza pneumococ S III capsulat ⇒ se observa transformarea tipului R in S care produce imbolnavirea

In 1944 Avery, MacCarthy si McLean au adaugat componente ale unui pneumococ S III la un mediu de cultura pe care a fost insamantat pneumococul R II. Din acest mediu au izolat apoi pneumococ S III cu capsula. Acest fenomen are loc deoarece ADN-ul extras chimic din pneumococul S III a fost preluat de pneumococul viu R II. ADN-ul aduce informatia genetica necesara pentru sinteza polizaharidului capsular. Transformarea are mai multe etape :

a. adsorbtia materialului genetic la suprafata celulei receptoare b. penetrarea acidului nucleic prin membrana celulara c. integrarea ADN-ului exogen in cromozomul celulei

Daca ADN provine din bacteriofag sau plasmide = transfectia. 2. Transductia = proces de transfer al ADN-ului de la celula donatoare la celula receptoare prin

intermediul bacteriofagului. Exista doua tipuri de transductie: • GENERALIZATA (nespecifica): fiecare segment din ADN-ul celulei donatoare poate fi

preluat si transferat cu sanse egale la o celula receptoare. Bacteriofagul codifica nucleaze ce fragmenteaza cromozomii bacterieni in fragmente egale cu acidul nucleic al bacteriofagului. In cursul fazelor de maturare, in bacteriofag se poate incorpora un fragment din acidul nucleic al celulei donatoare, realizandu-se un transductant. Acest acid nucleic, preluat cand bacteriofagul paraziteaza alta celula, va fi transferat celulei receptoare. Acidul nucleic din bacteriofag se poate integra in cromozom sau poate ramane liber in citoplasma.

• LOCALIZATA (specifica): se transduc doar acele fragmente de ADN din imediata vecinatate a locului unde se integreaza bacteriofagul. Ex: bacteriofagul λ- intre genele Gal si Bio (preia sau gena Bio sau gena Gal) Transductie – conversie lizogena = simpla prezenta a unui bacteriofag integrat in cromozom poate aduce caractere importante pentru bacteria respectiva. ex: bacteriofagul β-TOX se integreaza in cromozomul bacilului difteric si influenteaza gena necesara pentru sinteza toxinei.


1.

Microbiologie

Curs 13 14.I.2008

3. Conjugarea bacteriana = fenomen de transfer al materialului genetic intre doua celule (donator si receptor), ce se face prin intermediul unor punti de legatura realizate intre pilii sexuali.

Pilii pot fi : • comuni – ce au proprietati de aderare • sexuali (in numar de 1-4) – ce au un determinism plasmidic (plasmida poate fi in citoplasma

sau integrata in cromozom) Celula donatoare Celula receptoare

F+ F − Hfr sau

Operonul Tra este operon de transfer. Plasmida ce contine operonul Tra initiaza fenomenul de conjugare = plasmie conjugante. Plasmidele mici ce nu contin operonul Tra; se numesc plasmide neconjugante care pot fi transferate prin fenomenele de transformare si transuctie. Conjugarea: Etapele conjugarii F+ → F-:

1. formarea perechilor specifice (o celula donatoare se apropie de o celula receptoare si se formeaza o punte de legatura)

2. formarea perechilor efective (cele doua celule se apropie foarte mult si puntea se micsoreaza- retractia pilului)

3. transfer de material genetic (proces caracteristic de replicare a ADN-ului: molecula de ADN plasmidic se liniarizeaza si incepe replicarea semiconservativa, o catena trece in celula receptoare iar alta ramane in cea donatoare)

4. stabilizarea materialului genetic (pe fiecare catena se resintetizeaza catena complementara)

Exista plasmide R = cu rezistenta la antibiotice. RTF = factor de transfer al rezistentei


2.

Conjugarea Hfr → F-:

Parcurge aceleasi etape. Replicarea ADN incepe in locul unde se insera plasminda. Pentru a trece tot cromozomul celulele trebuie sa ramana in contact aproximativ 120 de minute.

Fenomenul de conjugare intrerupta a permis cunoasterea hartii cromozomiale de la E. coli. Replicarea ADN plasmidic se produce odata cu cromozomul.

La bacterile Gram (+) conjugarea este diferita. Are loc transferul de material genetic fara puntea de legatura formata de pilii sexuali. Celulele receptoare nu au plasmida; ele secreta substante numite feromoni de sex cu rol de atractie. Nu s-a observat formarea unei punti de legatura.

Antibiotice

Antibioticele = chimioterapice

Antibioticele sunt obtinute pe cale naturala in timp ce chimioterapicele sunt obtinute prin sinteza dar au acelasi mecanism de actiune si acelasi spectru de actiune. Denumirea provine de la antibioza = fenomen de antagonism bacterian (bacterii care secreta substante ce omoara alte bacterii) PAUL EHRLICH:

Este parintele chimioterapiei ca stiinta A observat ca unii coloranti se fixeaza selectiv pe bacterii. A studiat 10.000 de substante pentru

actiunea antibacteriana si a descoperit o substanta activa (606 = Salvarsan) care s-a dovedit a fi toxica pentru Treponema pallidum.

Introduce principiul toxicitati selective - un chimioterapic trebuie sa fie toxic pentru celula bacteriana si mai putin toxic pentru celula eucariota (sa nu atace celula eucariota).

A descris aparitia fenomenului de rezistenta al bacteriei fata de antibiotice.


3.

DOMAGK: Introduce sulfamidele (cele rosii); Prontozilul – pentru tratamentul infectiilor cu streptococ Este intemeietorul chimioterapiei moderne si influenteaza evolutia imbolnavirilor scazand

mortalitatea. FLEMING: Descopera penicilina in 1929 pe cultura de stafilococi; aceasta a fost purificata abia in 1940 de catre

Florey si Chain.

Rezistenta la un antibiotic se refera la tulpina nu la specie. Pentru orice antibiotic exista: Indice terapeutic = raport intre concentratia de substanta care este toxica asupra organismului si concentratia efectiva antibacteriana. Cu cat intervalul dintre cele doua este mai mare cu atat prezinta mai multa siguranta in a fi folosit.

concentratie efectiva

concentratie toxica pentru organism

antibiotic Spectru de actiune = totalitatea speciilor asupra carora antibioticul este activ Poate fi :

• Larg = antibiotic activ pe mai multe specii, inclusiv pe bacteriile cu multiplicare intracelulara ex: tetraciclina, sulfamidele, cefalosporinele

• Restrans = ex: eritromicina, polipeptidele ciclice Antiseptice (dezinfectante) = substante active asupra microorganismelor si care nu se supun principiului toxicitatii selective. Nu au o tinta precisa de actiune in celula bacteriana putand sa atace mai multe tinte. De aceea se folosesc numai in aplicatiile externe, ca dezinfectante pentru obiectele din mediul inconjurator. Antibiotic = substante cu actiune antibacteriana ce se exercita la nivel molecular (inhiba o cale metabolica care fie nu se gaseste la celula eucariota, fie nu e influentata datorita unor particularitati structural-functionale. Antibioticele pot avea efect:

• Bacteriostatic = inhiba dezvoltarea bacteriei, si poate fi reversibil • Bactericid = omoara bacteria, este ireversibil

Pentru ca un antibiotic sa fie eficient el trebuie: 1. sa ajunga la celula bateriana 2. sa penetreze celula bacteriana 3. sa se lege de molecula tinta pe care sa o inhibe 4. sa o inactiveze si sa o distruga

Penicillin culture


1.


26.02.2008

Clasificarea antibioticelor

Familii:

I. β-Lactamine

A) Derivati ai acidului 6-amino-penicilanic

Subgrupe: 1) Penami (peniciline) = inelul lactam

este asociat cu un ciclu imidazol

2) Peneni = au o dubla legatura in ciclul

adiacent

3) Carbapeneni = au o dubla legatura,

dar in loc de sulf au carbon

4) Oxapenani (clavani) = sulful este inlocuit cu oxigen

1) Penami (peniciline)

• penicilina G (benzilpenicilina – injectabila)

• peniciline orale PV fenoximetilpenicilina feneticiclina clometocilina

• peniciline M (antistafilococice) Meticilina Izoxazolilpeniciline:

Oxacilina Cloxacilina Dicloxacilina

• peniciline cu spectru larg (active pe anumiti bacili Gram (-), dar sensibile la actiunea diverselor β-lactamaze) Aminopenicilinele (Pen A)

Ampicilina si derivatii (Bacampicilina, Talampicilina, Metampicilina)

Amoxicilina Carboxipenicilina (Pen C)

Carbpenicilina Ticarcilina Temocilina

Ureidopenicilinele Azlocilina Mezlocilina Piperacilina

Amidinopeniciline Mecilinam Pivmecilinam

Penami inhibitori de β-lactamaze=Sulbactam 2) Penemi (produsi aflati in studiu) 3) Carbapenemi

• Imipenem • Meropenem (are spectru larg si

stabilitate la β-lactamaze) 4) Oxapenami (clavani)

Acidul clavulanic (inhiba β-lactamaza, dar nu are actiune antibacteriana – se asociaza cu Amoxicilina sub forma de Augmentin, sau cu Ticarcilina ca Timentin)

B) Derivati ai acidului 7-amino-

cefalosporanic o Cefemi = inel β-lactan + ciclu

dihidrotiazinic

o Oxacefemi = sulful este inlocuit cu un

atom de oxigen

Cefemii si Oxacefemii corespund Cefalosporinelor:

generatia I: Cefalexin, Cefazolin, Cefadroxil, Cefalotin, Cefacetril, Cefaclor;


2.

generatia II: Cefamandol, Cefuroxim, Cefoxitin;

generatia III: Ceftazidim, Cefotaxim,Ceftriaxon (Rocephine), Latamoxef (Moxalactam), Ceftizoxim;

generatia IV - active pe enterobacterii rezistente: Cefepim si Cefpirom

C) Monobactami

- nucleu limitat la inelul β-lactam - spectru restrans pe bacterii Gram

negative - ex: Azthrenam

In ultimii ani: γ-Lactamine (inel γ-lactamic):

Lactovicin (produs natural) Pirazolidinon

II. Aminozide-aminociclitoli

(AMAC) au in structura mai multe cicluri glicozidice

legate de un aminociclitol (streptidina sau dezoxi-streptamina)

au spectru larg de actiune (cu exceptia streptocococilor si a bacteriilor anaerobe)

au actiune bacteriostatica sau bactericida inhiba sinteza proteinelor au un grad de toxicitate pentru celula

eucariota (neurotoxicitate si nefrotoxicitate) I) Streptomicina II) Neomicina, Kanamicina, Gentamicina,

Tobramicina, Sisomicina, Netilmicina, Amikacina. Spectinomicina si Kasugamicina au numai efect bacteriostatic.

III. MLS (Macrolide–Lincosamide–Sinergistine)

Sunt antibiotice cu structura diferita dar cu acelasi mecanism de actiune, spectru de actiune si aceleasi mecanisme de rezistenta. • Macrolide

Eritromicina Oleandomicina Josamicina Spiramicina Midecamicina

• Lincosamide Lincomicina Clindamicina

• Sinergistine (streptogramine)

Pristinamicina Virginiamicina

IV. Tetracicline

au spectru larg

inhiba sineza de proteine au efect bacteriostatic inclusiv pe bacterii

cu multiplicare intracelulara au o absorbtie partiala in intestin ⇒

distrug bacteriile normale din intestin pot afecta tesutul osos in dezvoltare astfel

ca nu se administreaza la gravide si copii Oxitetraciclina Metaciclina Minociclina Doxiciclina (Vibramicina)

V. Fenicoli

Cloramfenicolul – prescris cu prudenta datorita toxicitatii hematologice

Thiamfenicolul – toxicitate mai redusa, cu indicatii in infectii urinare, oculare, sau de cai respiratorii cu bacterii ce prezinta rezistenta la alti produsi antibacterieni.

VI. Quinolone

actioneaza la nivelul aparatului genetic • Acidul nalidixic • Acidul oxolinic ⇒ acestea au

spetru limitat la bacterii Gram (-) cu exceptia Bacilului piocianic

• derivatii fluorurati cu spectru larg obtinuti prin sinteze chimice (fluoroquinolone):

Norfloxacin Enoxacin Ofloxacin Ciprofloxacin Pefloxacin

VI. Rifamicine

obtinute prin semisinteza actioneaza la nivelul aparatului genetic

Rifamicina SV – cu spectru restrans Rifampicina – spectru larg; actioneaza

chiar si pe Mycobacterium tuberculosis

VII. Sulfamide spectru larg, obtinute prin sinteza chimica bacteriostatice se poate instala rapid rezistenta fata de sulf

Sulfadiazina – se poate administra pe cale ganerala

Sulfatiazol – utilizat mai ales in infectii digestive

Sulfafurazol – (Neoxazol) – in infectii urinare

Sulfametoxazol – asociat cu Trimetoprine se comercializeaza sub forma de Cotrimoxazol (Biseptol)


3.

VIII. Polipeptide ciclice spectru foarte restrans active numai pe bacili Gram negativi cu

exceptia genurilor: Proteus, Providencia, Serratia si Bacteriodes

au actiune bactericida, tinta = MC Polimixina B Polimixina E (Colistin)

IX. Nitroimidazoli

se obtin prin sinteza chimica sunt active pe bacterii anaerobe

Metronidazolul – are si actiune antiparazitara

Ornidazolul Tinidazolul (Fasigin)

X. Nitrofurani

spectru destul de larg actioneaza la nivelul aparatului genetic

Nitrofurantoin – se administreaza in infectii urinare

Furazolidon – se administreaza in infectii digestive

XI. Glicopeptide

Televancina – activa pe tulpini MRSA si pe bacili Gram (-)

Vancomicina – (foarte activa pe stafilococi rezistenti la alte antibiotice si pe enterococi)

Teichoplanina – asemanatoare cu Vancomicina

XII. Alte antibiotice

1. Acidul fusidic = antibiotic de natura sterolica – are spectru restrans

2. Fosfomicina = are spectru larg, are efect bactericid actionand la nivelul peretelui celular

3. Cicloserina 4. Novobiocina

Chimioterapice antituberculoase 1. cu actiune bactericida:

HIN Rifampicina Streptamicina Pirazinamida

2. cu actiune bacteriostatica: Etanbutol Tiosemicarbazona

Chimioterapice antifungice (antimicotice)

• unii Imidazoli – interfereaza cu sinteza ergosterolului din membrana celulara a fungilor:

Metronidazolul Clotrimazol Miconazol Ketoconazol

• Griseofulvina (in micoze cutanate) • 5-Fluorocitozina • Poliene:

Amfotericina B Nistatin

Chimioterapice antiparazitare

• Metronidazolul - pentru Giardia si Trichomonas

• Clorochin – pentru malarie • Sulfamida + Pirimetamina – in infectie cu

Taxoplasma (taxoplasmoza)

Antivirale putine influenteaza celula eucariota

Lantibiotice

antibiotice peptidice care contin unii aminoacizi rari (lantionina si metillantionina)

altereaza structura si functiile membranei (cea energetica)

active pe bacili Gram (+) iar pe cele Gram (-) sunt slab sau deloc active

- Nisina (conservant) - Subtilina - Duramicina

Defensine

o eliberate de organime; la adult = 2g/24 ore

o prezente in granulatiile azurofile din polimorfonucleatele neutrofile

o sunt peptide formate din circa 30 aminoacizi

Antibioticele actioneaza asupra:

A. PERETELUI CELULAR 1. β-LACTAMINE au ca tinta de actiune PBP (protein-binding-peniciline), care functioneaza in mod normal ca transpeptidaze, carboxipeptidaze, transglicozilaze, sau mentin forma celulei. Permit sinteza subunitatii de baza din PG dar perturba legarea subunitatilor pentru a forma sacul de mureina.


4.

2. CICLOSERINA impiedica sinteza subunitatilor de baza prin lipsa de formare a dipeptidului terminal D-Ala-Ala. Inhiba activitatea a doua enzime Alaninracemaza si D-Alanyl-alaninsintetaza. 3. BACITRACINA se combina cu lipidul transportor al nucleodidelor precursoare cand traverseza membrana celulara. Bacteriile Gram negative sunt rezistente datorita impermeabilitatii membranei externe pentru antibiotice. 4. FOSFOMICINA actioneaza in etapa intracitoplasmatica a sintezei PG = inhiba piruviltransferaza (enzima care asigura combinarea fosfoenolpiruvatului cu UDP-N-Acetil-glucozamina). 5. VANCOMICINA si TEICOPLAMINA impiedica fixarea N-acetilmuramylpenta-peptidului pe PG in formare. Tinta este transglicozilaza necesara fixarii. 6. HIN (tuberculostatic major) inhiba sinteza acidului micolic. B. MEMBRANEI CELULARE si MEMBRANEI EXTERNE de la bacteriile Gram negative 1. Polimixinele B si E actioneaza la nivelul membranei externe se combina cu LPS si fosfolipidele dezorganizand substanta si determina aparitia veziculelor la suprafata bacteriei. Ajung si la nivelul membranei celulare unde se leaga de fosfatidiletanolamina si perturba functia de bariera osmotica si semipermeabila determinand iesirea metabolitilor esentiali din celula. 2. IMIDAZOLII se fixeaza la nivelul lipidelor si blocheaza sinteza lor la nivelul membranei celulare. 3. CHIMIOTERAPICELE ANTIFUNGICE se fixeaza la nivelul colesterolului din membrana celulara (Mycoplasma, fungi) si perturba functia de bariera. C. SINTEZEI PROTEICE inhiband-o: chimioterapice antiribozomale:

Pe 30S – AMINOZIDE – STREPTOMICINA –se leaga de proteinele S12 determinand modificari conformationale si perturba formarea coplexului de initiere a sintezei proteice, perturba citirea mesajului genetic din ARN-mesager si astfel se incorporeaza aminoacizi eronati in lantul polipeptidic formandu-se astfel proteina nefunctionala. Rolul de legare il are ARN-ul 16S (configuratia este asigurata de mai multe proteine S12, S4, S5). Aminozidele intervin in stabilizarea monomerilor (nu se mai formeaza polisomii)

Streptomicina intra in celula prin transportul activ cu consum mare de energie-modifica functionarea sistemului de transportori de e-acceptor final de O2. NU SE DA PENTRU BACTERII ANAEROBE!!! Tetraciclinele blocheaza faza de elongare, strabat membrana celulara prin difuziune sau transport activ si se acumuleaza (creste concentratia) in celula bacteriana. Pot strabate si membrana celulara a celulei eucariote. Pe 50S – CLORAMFENICOL – afecteaza peptidiltransferaza, enzima importanta pentru alungirea lantului polipeptidic. Are efecte toxice hematologice. MACROLIDELE impiedica atat formarea complexului de initiere cat si elongarea lantului polipeptidic. Eritromicina se leaga de ARN-ul ribozomal 23 S. D. APARATULUI GENETIC Rifampicinele – se fixeaza pe ARN-polimeraza ADN dependenta, bacteria isi blocheaza sinteza mARN si se impiedica transcrierea informatiei genetice. Nu au actiune in faza de elongare. Quinolonele – blocheaza ADN-giraza. Imidazoli – necesita mai intai o reducere partiala a gruparii nitro care se realizeaza in prezenta feredoxinelor, prezente doar la anaerobi. Dupa reducere se fixeaza pe ADN mai ales la nivelul regiunii bogate in timina si adenina determinand rupturi. Nitrofuranii – necesita reducere partiala realizata de nitroreductaze ale bacteriei aerobe. Derivatii redusi reactioneaza cu ADN determinand leziuni la nivelul acestuia. E. ANTIBIOTICE CARE INHIBA SINTEZA ACIDULUI FOLIC Sulfamidele – sunt analogi structurali ai PABA si intra in competitie cu PABA pentru locul activ al folatsintetazei. In aceeasi cale metabolica intervine Trimetoprimul (+Sulfametoxazol = Cotrimoxazol) care interactioneaza cu folat-reductaza. La bacilul tuberculos intervine alt analog al PABA = PAS cu afinitate pentru folat-sintetaza. Pirimetamina are actiune pe folat-reductaza si este utilizata in tratamentul unor infectii cu protozoare.


1.


04.III.2008

Rezistenta bacteriana la antibiotice Rezistenta poate fi naturala sau dobandita: 1. Rezistenta naturala = toti reprezentantii unei specii sunt rezistenti fata de un antibiotic. Rezistenta se poate produce prin

lipsa tintei de actiune (Mycoplasma – nu are perete celular); Mecanisme de rezistenta la antibiotice

lipsa sistemului de transport (bacteriile anaerobe sunt rezistente la aminozide pentru ca nu le pot transporta in interiorul celulei) ex: in TBC nu se da penicilina pentru ca bacilul are in perete acid mycholic

2. Rezistenta dobandita = apare doar la cateva tulpini ale unei specii care in mod normal e sensibila la acel antibiotic. Este o propietate de tulpina NU de specie.

Definitie: 1) atunci cand concentratia de antibiotic pe care o suporta o bacterie e semnificativ mai mare decat cea care poate fi atinsa in vivo. 2) atunci cand concentratia de antibiotic pe care o suporta e semnificativ mai mare decat concentratia capabila sa inhibe dezvoltarea majoritatii celorlalte tulpini din aceeasi specie

Rezistenta unei tulpini – se determina prin antibiograma (rezistenta la antibiotice)

o Metoda dilutiei – se determina concentratia minima inhibitorie = concentratia cea mai mica de antibiotic ce impiedica dezvoltarea bacteriei

o Metoda difuzimetrica – se inhiba dezvoltarea culturii de catre antibiotic conform unui gradient de concentratie, si se determina rezistenta ⇒ o tulpina bacteriana poate fi sensibila sau intermediar sensibila la un antibiotic.

o Metoda E-test – combina primele doua metode Rezistenta poate sa apara prin mecanisme genetice: Cromozomiale = modificari in informatia genetica endogena. Modificarile apar in genele

cromozomiale care controleaza sensibilitatea la antibiotice. Mecanismul prin care apare este mutatia. Extracromozomiale = achizitionarea de material genetic exogen (de gene) care asigura caracterul

de rezistenta. Mecanismul are loc prin interventia plasmidelor si transpozonilor. Mecanismele cromozomiale: Mutatia = modificare in secventa de nucleotide a ADN-ului cromozomial care apare rar, spontan, brusc, se transmite la descendenti, e stabila iar factorul de mediu are rol de a selecta mutanta. Rezistenta determinata de mecanismele cromozomiale se raspandeste lent. Prin mutatie apare rezistenta la un singur antibiotic = monorezistenta. Poate sa apara fata de orice antibiotic si la aproape toate speciile. (pentru unele bacterii reprezinta principalul mecanism prin care se dobandeste rezistenta –ex:bacilul tuberculos) Mecanisme extracromozomiale: Plasmidele R

molecule circulare de ADN mai mici decat cromozomul = cromozom facultativ

conjugante care au determinanti de rezistenta (1→ 8), pot media procesul de transfer prin conjugare si au un factor de transfer al rezistentei RTF

neconjugante nu au capacitatea de a media transferul prin conjugare, ele se transmit prin transductie

se pot transmite (castigarea rezistentei) - orizontal (la specii neinrudite) - vertical

se raspandesc epidemic


2.

Indiferent de mecanismul genetic prin care este gastigata rezistenta la antibiotice, din punct de vedere chimic aceasta e asigurata prin trei mecanisme: 1. Secretia de enzime care degradeaza/inactiveaza antibioticul, astfel incat acesta nu isi mai poate desfasura activitatea. A fost evidentiat pentru β-lactamine, aminozide, macrolide, cloramfenicol si este principalul mecanism de rezistenta. Enzimele eliberate de bacterie actioneaza asupra antibioticelor aflate inafara bacteriei. Ex: β-lactamazele secretate de bacteriile gram (-) si gram (+) desfac inelul β-lactam ce determina inactivarea medicamentului Bacteriile gram (+) = elibereaza β-lactamazele in afara bacteriei si vor actiona asupra

antibioticelor inainte ca acestea sa ajunga la bacterie; ex:penicilinazele hidrolizeaza penicilinele In faringe se poate cantona streptococul β-hemolitic sensibil la penicilina, si deasemenea se poate cantona stafilococul aureus care elibereaza penicilinaze ce inhiba antibioticul inainte sa ajunga la streptococ. La bacterile gram (+) enzimele sunt codificate de plasmid. Bateriile gram (-) elibereaza enzime in spatiul periplasmic astfel ca antibioticul trebuie sa ajunga

in spatiul periplasmic pentru a fi inactivat. Enzimele au determinism cromozomial. Fenotip de rezistenta = comportamentul unei tulpini bacteriene fata de un ansamblu de antibiotice care se testeaza simultan si care apartin unei singure familii. Ex: aminoglicozidazele – actioneaza asupra aminozidelor si au determinism plasmidic. Exista trei tipuri: aminozid transferaze, aminozid acetil transferaze, aminozid nucleotidil transferaze; Ex: cloramfenicolul – inactivat de acetil-transferaza care produce acetilarea lui in prezenta acetil-CoA; Ex: macrolide – inactivate de esteraze (pentru eritromicina) si acetil-transferaze (pentru alte macrolide); 2. Modificari de permeabilitate si transport Modificari de permeabilitate:

La bacteriile Gram (+) datorita structurii peretelui celular este permisa trecerea mai usoara a antibioticelor, dar poate sa apara o modificare de permeabilitate prin mutatie (mecanism cromozomial). La bacteriile Gram (-) la nivelul membranei externe exista proteine majore (matrix-proteine) = porine. Modificarile ce apar la nivelul acestora impiedica trecerea nu numai a unei singure familii de antibiotice, aparand rezistenta la mai multe familii de antibiotice. Modificari de transport:

Ex: rezistenta la tetraciclina = are determinism plasmidic (plasmida R) care codifica proteine membranare ce determina un eflux accentuat, o eliminare a tetraciclinei din celula bacteriana. Astfel se impiedica realizarea unei concentratii active in celula bacteriana. Exista mai multe gene care codifica aceste proteine de eflux (TET). Ex: rezistenta la streptomicina = apare datorita unor mutatii care afecteaza proteinele implicate in transportul activ al streptomicinei (streptomicina ajunge in celula prin transport activ) 3. Modificarea tintei de actiune pentru antibiotice = modificare cromozomiala Tinta pentru β-lactamine = PBP pentru quinolone = subunitatea A a ADN-girazei pentru aminozide = proteina S12 din subunitatea 30S pentru rifampicine = ARN polimeraza pentru nitrofurani = reductazele pentru sulfamide = foalat sintetaza, reductaza

Triunghi terapeutic Asocieri de antibiotice :

pentru a acoperii mai multe tinte de actiune (efect sinergic) pentru a largi spectru de actiune (in infectiile plurimicrobiene) pentru a evita selectarea de variante rezistente.

Antibioticele antibacteriene au efecte secundare mai scazute decat chimioterapicele antivirale

1. fenomene de hipersensibilitate = de tip imediat ex: β-lactamazele (urticarie, soc anafilactic) 2. fenomene toxice = medulotoxice (merg pana la anemie plastica) ex:cloramfenicolul

= neurotoxice (pot da surditate) ex: aminozidele, sulfamidele = nefrotoxice ex: aminozidele, sulfamidele

3. selectarea de variante rezistente = actioneaza asupra florei bacteriene intestinale


1.


11.III.2008

Virusologia

Au adus contributii importante in domeniul virusologiei: Löeffler – Frosch, Twort – d’Hérélle, Rous. Parintele virusologiei este considerat Ivanovski care in 1892 descrie boala frunzelor de tutun si demonstreaza ca agentul infectios nu este o bacterie.

Virusurile participa in oncogeneza, au efecte teratogene, sunt agenti etiologici ai unor infectii permanente, infectii virale ce se pot transforma in infectii cronice. Trasaturi generale: nu au organizare celulara au un singur tip de acid nucleic (ADN sau ARN – niciodata ambele tipuri) ce alcatuieste genomul

viral. Genomul viral este sediul informatiei genetice virale ce se adauga in celula parazitata sau o inlocuieste complet = virusurile realizeaza un parazitism la nivel genetic. Virusurile cu ARN sunt singurul caz in care depozitul informatiei se face la nivelul ARN-ului.

sunt paraziti obligatorii ai celulelor vii sunt lipsiti de activitate metabolica = inerte din punct de vedere metabolic, nu au enzime si nu dispun

de sisteme energetice proprii astfel ca nu pot realiza activitate metabolica proprie. virusul aduce in celula parazitata informatia necesara pentru sinteza componentelor virale iar celula

parazitata pune la dispozitie precursorii si energia necesara sintezei. odata intrat in celula parazitata virusul se poate integra in cromozomul acesteia sub forma de

provirus si poate ramane sub aceasta forma vreme indelungata. Uneori informatia genetica din provirus se poate exprima si poate duce la transformarea tumorala a celulei

se multiplica doar in interiorul celulei Virionii = particule virale mature extracelulare, libere, cu toate caracterele morfologice, structurale si biochimice. Sunt un pachet de gene responsabile de persistenta virusului in natura si de transmiterea lui de la o persoana la alta. Sunt particule virale inerte metabolic, incapabile de multiplicare. Pentru multiplicarea in celula, virionii se dezagrega, si elibereaza in celula molecula de acid nucleic, care detine informatia necesara pentru sinteza de noi virioni. Virus = notiune mai larga, cuprinde virionii dar si stadiile intracelulare ale multiplicarii virale Viroid = a fost descris la plante in 1971 = molecula de acid nucleic (ARN) cu caracter de infectiozitate Prioni = proteine cu caracter de infectiozitate (nu s-au descoperit molecule de acid nucleic atasate); produc boli degenerative ale SNC (boala vacii nebune – encefalopatia spongiforma bovina).

Plan general de organizare a virusurilor Structura virusurilor a fost evidentiata prin microscopie electronica. Particula virala este formata din: 1. molecula de acid nucleic = genomul viral 2. capsida virala, cu rol de protectie a acidului nucleic viral. Capsida

este formata din subunitati proteice si se dispune in jurul acidului nucleic dupa un tip de simetrie. Acidul nucleic si capsida formeaza nucleocapsida virala.

3. unele virusuri au peste capsida un invelis = anvelopa = peplos de natura proteica si se numesc virusuri invelite. Peplosul este format dintr-o proteina codificata de virus (proteina M = de membrana), din lipide preluate de virus din celula parazitata iar la unele virusuri sunt prezente proeminente (ca niste spini) numite peplomere. Ex: la virusul gripal H5N1 (Hemaglutinina si Neuraminidaza sunt peplomere ale virusului gripal si au rol de antigene ce stimuleaza aparitia anticorpilor specifici in organism; produc imbolnaviri pandemice; variatiile mionore ale proteinelor duc, la inceput, la apritia epidemiilor.

Compozitia chimica a virusurilor

1. Acidul nucleic viral – reprezinta genomul viral si este responsabil de infectiozitatea virusurilor. Poate fi o molecula de ADN sau de ARN. Majoritatea virusurilor au o singura molecula de acid nucleic, exceptand virusul HIV si unele Retrovirusuri care prezinta doua molecule de ARN. Molecula de ADN


2.

este de obicei dublu catenara (exceptie: la parvovirusuri = Parvoviridae – monocatenara); ARN-ul este monocatenar (exceptie: reovirusuri = Reoviridae – dublu catenar). Acizii nucleici se afla in cantitati reduse la unele virusuri (virusul gripal - 1% ARN) fata de altele (virusul poliomielitei - 50% ARN). Tipul de acid nucleic este criteriu major utilizat in clasificare. Acidul nucleic poate fi linear, circular sau superhelicoidal. Poate fi nesegmentat (format dintr-un singur segment) sau poate fi segmentat (in 8 segmente la virusurile gripale, in 10-12 segmente la reovirusuri si din 5 segmente la arenavirusuri). Polaritatea catenei:

de polaritate pozitiva = cand patrunde in celula parazitata e recunoscut functional ca ARN-mesager si poate fi tradus in proteine

de polaritate negativa = catena fara sens = nu va fi recunoscut astfel ca in prima etapa trebuie sa se sintetizeze o catena complementara de polaritate pozitiva Acidul nucleic prezinta infectiozitate numai dupa eliberarea din particula virala. 2. Proteine virale: sunt in numar variabil (3 pana la 30-40) in functie de virus. Proteine majore: Proteine capsidale – alcatuite din formatiuni structurale sau biochimice identice numite protomere.

Aceste protomere sunt formate dintr-un singur tip de polipeptid sau uneori din 3, 4 tipuri de polipeptide. Nu se vad la microscopul electronic. Protomerele se asociaza si formeaza capsomere = unitati morfologice care se vad la microscopul electronic. Numarul lor este acelasi pentru oricare specie a unei familii.

De invelis - proteina M formata din subunitati repetitive - glicoproteiene din peplos (peplomere) Din core (sambure)

Proteine minore: sunt enzime virale care intervin in replicarea virala: transcriptaze si replicaze virale, proteine 3. Lipide virale: sunt prezente la virusurile invelite. Sunt preluate din membranele (citoplasmatica sau nucleara) ale celulei gazda. Sunt glicolipide sau fosfolipide. 4. Carbohidratii se gasesc in cantitate mica in peplomerele virale, au caracter de antigenitate.

Arhitectura – doua tipuri de simetrie (al doilea criteriu major de clasificare) 1. Simetrie Helicoidala Protomerele se dispun in asociere stransa, in contact direct cu helixul de acid nucleic. Ele se dispun simetric in jurul axei de simetrie care strabate centrul helixului de acid nucleic. Pe fiecare tura a helixului de acid nucleic exista un numar de protomere, care variaza in functie de lungimea helixului. La unele virusuri helixul are o forma rigida (la virusul mozaicului tutunului = VMT, sau la unii bacteriofagi, particula virala avand aspectul de bastonas sau bat), iar la alte virusuri helixul nucleoproteic este lax, putand fi pliat (la virusurile invelite: Orthomyxovirusuri, Paramyxovirusuri, Coronavirusuri).

Simetrie helicoidala la VMT 2. Simetrie Cubica = Icosaedrica Protomerele se asociaza in capsomere. Capsomerele pot rezulta din asocierea:

- a 5 protomere (capsomere pentamerice sau pentoni) - a 6 protomere (capsomere hexamerice sau hexoni).

Icosaedrul este un corp geometric format din 12 varfuri, 20 de fete triunghiulare, si 30 de laturi. Are trei axe de simetrie (de rotatie): Orthomyxovirusuri

- axe de rotatie de ordinul 5: unesc doua varfuri opuse si exista 6 astfel de axe - axe de rotatie de ordinul 3: unesc mijlocul a doua fete opuse si exista 10 astfel de axe - axe de rotatie de ordinul 2: unesc mijlocul a doua laturi opuse si exista 15 astfel de axe

Ordinul axei de simetrie este numarul care arata de cate ori, in cursul unei rotatii complete de 360o, particula virala ajunge intr-o pozitie identica cu cea initiala. Numarul total de capsomere (caracteristic fiecarei familii) = 10 (n-10)2+2, unde n reprezinta numarul de capsomere care se vad la ME pe o latura. Dimensiunile virusurilor Virusurile au dimensiuni mici, de ordinul nanometrilor. Exista virusuri: • mici = 20-27 nm (Parvoviridae, Picornaviridae) • medii = 40-70 nm (Togaviridae) • mari = 150-300 nm (Paramyxoviridae, Arenaviridae, Poxviridae)


3.

Forma virusurilor – deriva din arhitectura virala (tipul de simetrie si prezenta sau absenta invelisului viral). Formele pot fi variate:

sferice : virusuri gripale aspect nisipos: Arenaviridae roata cu spite: Reoviridae obuz/glont: virusul rabic coroana solara: Coronaviridae caramida/piscot: Poxviridae

Clasificarea se face dupa sistemul LHT (Lwoff, Horne, Tournier) care cuprinde toate virusurile Criterii majore de clasificare: Criterii minore de clasificare:

1. tipul de acid nucleic (ADN/ARN); 1. ARN segmentat sau nu 2. tipul simetriei (helicoidala/cubica); 2. numarul capsomerelor 3. prezenta sau absenta invelisului 3. diametrul helixului 4. ARN-ul/ADN-ul dublu sau mono catenar

Prin sumarea criteriilor majore se delimiteaza: Virusuri cu ADN Virusuri cu ARN

Virusuri cu simetrie cubica invelite Virusuri cu simetrie cubica invelite neinvelite neinvelite

Virusuri cu simetrie helicoidala invelite Virusuri cu simetrie helicoidala invelite neinvelite neinvelite

In cadrul acestor grupe se delimiteaza: • Familii de virusuri: desemnate prin sufixul „–viridae” • Subfamilii de virusuri: desemnate prin sufixul „–virinae” • Genuri de virusuri: desemnate prin sufixul „–virus” • Specie de virusuri: desemnate prin denumire binominala internationala (ex: Paramyxovirus influenzae)

1. Virusuri cu ADN Virusuri cu simetrie cubica invelite Virusuri cu simetrie cubica neinvelite

Herpetoviridae: ADN dublucatenar, 162 capsomere - virus herpes simplex tip 1 (oral) si tip 2 (genital) - virusul varicella zoster: varicela la copii respectiv zona zoster la batrani - virusul Epstein Barr (EB) – mononucleoza infectioasa - virusul citomegalic – citomegalia - virusul herpes 6, 7, 8 - virusul herpes simian Reprezentanti oncogeni: - virusul Luke: adenocarcinom renal la broasca - virusul neurolimfomatozei Marek la pui - virusul Hinze: limfom la iepure Hepadnaviridae: - virusul hepatitei B (HBV) 42 nm, ADN partial dublucatenar; singurul virus cu ADN al hepatitelor; poate produce cancer hepatic primitiv.

Parvoviridae: ADN monocatenar 32 capsomere, 20nm. Ex: virusuri adenoasociate (AAV); B19 (ce produce eritem infectios = boala eruptiva) Papovaviridae: ADN dublucat. 72 capsomere, 50nm - virusuri ale papiloamelor (negi; veruci) - virusuri ale poliomei - virus vacuolizat (SV40) = virus simian

- la om: v. JC→encefalopatia multifocala progresiva v. BK→izolat din urina la persoanele cu transplant renal

Acum exista o alta impartire: Papilomaviridae – virusuri ale papiloamelor Poliomaviridae – virusul SV40: produce vacuole in culturi celulare, tumori la animale - virusul polioma-like Adenoviridae:ADN dublucat. 252 capsomere,80nm

- dau infectii ale cailor respiratorii - febra faringoconjunctivala - faringita acuta febrila - exista peste 47 de tipuri antigenice dintre care

tipurile 40, 41, 42 produc boli diareice, altele conjunctivita hemoragica.

Virusuri cu simetrie helicoidala invelite Virusuri cu simetrie helicoidala neinvelite Poxviridae: sunt cele mai mari (100-300 nm) Gen orthopoxvirus - v. variolei (vaccinabil) Gen parapoxvirus - v. nodulilor laptarilor - v. variolei la vaci Neclasificati: - virusul Molluscum contagiosum care cauzeaza tumori cutanate benigne - v. simian IABA car poate trece la om

-nu prezinta interes in patologia umana = sunt bacteriofagii

virusul varicella zoster

HVB

http://flickr.com/photos/ajc1/1406196883/�


4.

2. Virusuri cu ARN Virusuri cu simetrie cubica invelite Virusuri cu simetrie cubica neinvelite

Togaviridae:ARN monocatenar nesegmentat; 40- 70 nm; 32 capsomere Gen Alfavirus- encefalite ce se transmit prin tantar Gen rubovirus- v. rubeolei se transmite pe cale respiratorie Flaviviridae -v. febrei galbene -v. bolii Denga -v. encefalitogene transmise de tantar sau capusa -v. hepatitei C (VHC) apartine genului Hepacivirus -v. hepatitei G (VHG) Retroviridae contin reverstranscriptaza atasata genomului viral si doua catene de ARN identice; Trei subfamilii: - Oncovirinae: v. leucemiei/sarcoamelor aviare - Lentivirinae: v. imunodeficientelor bovine (BIV), simiene(SIV) si umane (HIV1 si HIV2) - Spumavirinae

Picornaviridae: ARN monocat. 32 capsomere, 27 nm Gen enterovirus – rezistent la pH acid -v. poliomielitei 1, 2, 3 -v. Coxsackie B: 6 tipuriantigenice - determina pleurodinia si encefalomiocardita la nou-nascuti -v. Coxsackie A:24 tipuri antigenice - determina herpangina=faringe eritematos (la copil mic) si boala mana-picior-gura Ambele tipuri (A si B) produc pareze, paralizii si meningite asepice. -v. Echo: 32 de tipuri -enterovirus 68 si 71 Gen Hepavirus -enterovirus 72=VHA hepatita A ⇒Gen Rhinovirus - peste 120 de tipuri antigenice

- produc guturai, rinita, corize Gen Cardiovirus si genul Aphtovirus nu produc infectii la om Caliciviridae: 30-40nm, aspect de caliciu -v. hepatitei E (VHE) -v. Norwalk like produce boli diareice la copii Astroviridae: ARN monocatcatenar, dimens. mici

- v. gastroenteritelor Reoviridae: ARN dublucat. segmentat, capsida dubla Gen Reovirus 1, 2, 3 – produc enterite la sugari si infectii respiratorii (faringita, rinita) Gen Orbivirus (arbovirusuri) Gen Rotavirus Gen Coltivirus – v. febrelor de Colorado

Virusuri cu simetrie helicoidala invelite Virusuri cu simetrie helicoidala neinvelite Orthomyxoviridae: ARN monocat. segmentat – 100 nm; diametru helix = 9 nm - virusuri gripale A, B, C Paramyxoviridae: ARN monocat. nesegmentat – 200 nm – sens (-); diametru helix = 18 nm Gen Paramyxovirus -v. paragripale 1, 2, 3, 4 -v. urlian (parotiditis) Gen Morbillivirus -v. rujeolei Gen Pneumovirus -v. respirator sincitial (VRS) Rhabdoviridae: ARN monocat. nesegmentat, sens- Gen Vessiculovirus – v. stomatitei veziculare Gen Lyssavirus – v. rabic si virusuri rabic-asociate Coronaviridae: 80-130 nm Arenaviridae: genom segmentat, 50-300 nm -v. coriomeningitei limfocitare -v. Lassa (febre hemoragice), Junin, Machupo, Pichinde Filoviridae: produc febre hemoragice africane si prezinta pleomorfism accentuat -v. Murburg -v. Ebola – febra hemoragica Bunyaviridae: ARN segmentat, monocat. 70-90nm, sunt Arbovirusuri 1. Gen Bunyavirus – v. encefalitelor de capuse 2. Gen Phlebovirus – v. Papatassi –febra Papatassi 3. Gen Nairovirus – v. febrei hemoragice de Crimeea 4. Gen Hantavirus – v. febrei hemoragice Coreene 5. Gen Unkuvirus

Nu prezinta interes in patologia umana - v. mozaicului tutunului (VMT)

VMT - structura

VMT – la ME



18.III.2008

Multiplicarea virusurilor

Virusurile sunt paraziti obligatorii ai celulelor vii. Multiplicarea lor are loc numai in celula vie. In celula infectata de virus patrunde numai acidul nucleic, capsida ramanand la suprafata celulei. O celula in care patrunde un virus este diferentiata biochimic, si uneori morfologic, datorita faptului ca se pot induce o serie de stari: producerea de virioni si distrugerea celulei; integrarea genomului viral in cel al celulei (ceea ce cauzeaza infectii persistente). Multiplicarea are loc numai dupa dezorganizarea virionului cu eliberarea acidului nucleic care patrunde in celula si aduce informatia genetica necesara pentru sinteza componentelor virale (proteinele capsidale si acidul nucleic viral), iar celula parazitata este cea care pune la dispozitie aparatul de sinteza, energia si precursorii necesari sintezei. Virusurile nu se multiplica, ele sunt replicate in celula. Genomul viral directioneaza metabolismul celular spre producerea de noi virioni, numiti virioni progeni. Se realizeaza astfel un metabolism viral. Virusul care infecteaza celula poate fi: • virus complet: are gene structurale, gene pentru multiplicare, gene de control ale replicarii virale, gene care

nu sunt absolut necesare replicarii (are informatia genetica necesara desfasurarii tuturor etapelor replicarii); • virus defectiv: nu are sau nu functioneaza genele de replicare (nu contine tot pachetul de gene pentru

multiplicare fie natural fie in urma unor fenomene de rezistenta Celula gazda poate sa fie: • sensibila: celula prezinta receptori pentru virus si va putea fi infectata de acesta • rezistenta: celula nu prezinta receptori pentru virus si nu va putea fi infectata Tropismul unei celule (este conditionat de prezenta sau absenta receptorilor pentru virusuri) • celula permisiva: permite derularea tuturor etapelor de multiplicare virala (virusul se poate atasa de celula,

patrunde in celula iar celula infectata asigura virusului toate procesele metabolice necesare multiplicarii). • celula nonpermisiva sau celula nonrepetitiva care nu permite derularea tuturor etapelor de replicare virala. Producerea de noi virioni = infectie. Poate fi: • productiva rezultand virioni progeni (celula este susceptibila, permisiva, iar virusul e complet); • abortiva cand nu rezulta virioni progeni (celula este susceptibila, permisiva, iar virusul defectiv) sau (celula

este susceptibila, nonpermisiva, iar virusul este complet). Multiplicarea virala este un aspect al relatiei dintre virus si celula si relatia dintre virus si organism reprezentata prin imunitate (mediata celular).

Multiplicarea virala: Etape: 1. initiale: (de initiere a infectiei): atasare, penetrare si decapsidare (dezvelire) = eliberarea acidului nucleic din invelisul viral; 2. faza de eclipsa - biosinteza componentelor virale (ADN, proteine) - in celula parazitata nu se poate detecta nimic 3. faze terminale - asamblarea = maturarea particulei virale - eliberarea virionilor progeni din celula infectata 1. Faze initiale - chimioterapicele antivirale trebuie sa ajunga in celula ele actionand in aceste etape. a) Atasarea – se face daca celula are receptori (are tropism) iar daca celula este rezistenta nu poate fi infectata. La inceput atasarea se face intamplator prin legaturi slabe. Apoi se realizeaza o legatura stransa datorita unor straturi de suprafata ale celulei si virionului si datorita unei complementaritati intre structurile membranei si structurile virale. Exisa receptori specifici: Ex: - virusul HIV → receptorul = CD4 de pe limfocitul T-helper (dar si alte celule pot fi infectate) - virusul gripal→ receptorul = glicoproteine - virusul poliomielitei → receptorul = proteine aflate numai pe celulele de la om si maimuta Virusurile pot folosi si receptori utilizati in alte scopuri: - virusul rabic → foloseste receptorii pentru acetilcolina din SNC - virusul Ebstein-Barr → care foloseste receptorii pentru complement de pe limfocitul B - virusul HIV, Rhinovirusurile → au ca receptor o molecula de adeziune intercelulara (ICAM)

1.


b) Penetrarea - la virusurile neinvelite se face prin vezicule = endocitoza = viropexie - la virusurile invelite are loc fuzionarea invelisului viral cu lipide din membrana celulei infectate c) Decapsidarea = eliberarea acidului nucleic viral (poate fi completa sau partiala) Dezvelirea pentru virusurile invelite. eliberare faza initiala 2. Faza de eclipsa – esentiala este transcrierea informatiei genetice din acidul nucleic viral intr-un ARNmesager (intervine transcriptaza). Transcrierea se poate face in nucleul celulei gazda (cand virusurile nu prezinta enzima) sau in citoplasma celulei (cand virusul este mai mare si are enzima proprie). ARN-ul mesager este tradus la nivelul ribozomilor in proteine virale:

asamblare

• de replicare – necesare pentru replicarea acidului nucleic viral (ADN-polimeraza, ARN-polimeraza ADN-dependenta); penetrarea

• de control a metabolismului celulei si al replicarii virale; faza de eclipsa • de structura = capsidale (peplomerele);

La virusurile mici cu ARN transcrierea si traducerea au loc aproape concomitent. La cele cu ADN, faza de eclipsa se desfasoara sub forma unor programe: - precoce = timpuriu → informatia genetica din anumite zone ale acidului nucleic este transcrisa pe

un ARNmesager precoce care la nivelul ribozomilor se traduce in proteine timpurii necesare replicarii si controlului acesteia.

- tardiv → transcrierea altor gene din genomul viral rezultand ARN-ul mesager tardiv care este transportat in citoplasma si este tradus in proteine de structura si de asamblare.

3. Faze terminale a) Asamblarea: se ajunge la o particula virala matura; se poate realiza spontan (autoasamblare), sau se poate realiza cu ajutorul proteinelor de asamblare (ex: la virusurile mari = poxviridae). b) Eliberarea → virionilor progeni din celula infectata se realizeaza prin liza celulei infectate (citoliza) sau prin inmugurire la virusurile invelite. Pot ramane si capside goale (in functie de multiplicare, in nucleu/citoplasma) aparand ca niste incluzii intranucleare/intracitoplasmatice.

STRATEGII DE MULTIPLICARE Se refera la modalitatea de sinteza a ARN-ului mesager si la natura indicilor de replicare. Indiferent daca ADN-ul, ARN-ul este dublu sau monocatenar, segmentat sau nesegmentat, replicarea se face datorita unor intermediari dublucatenari. Exista opt strategii de multiplicare pentru virusuri cu:

1. ARN monocatenar, cu catena (+) cu sens – in momentul in care patrunde in celula este recunoscuta functional ca ARNmesager. ex: Picornaviridae, Togaviridae, Flaviviridae care se multiplica in citolplasma.

2. ARN monocatenar, catena (-) – se multiplica in citoplasma. ex: Paramyxoviridae (rujeola, Pneumovirus = VRS, paragripale, urlian); Rhabdoviridae; Ortomyxoviridae ( v. influenzae tipuri antigenice A, B, C)

3. ARN dublucatenar – se multiplica in citoplasma. ex:Reoviridae (au capsida dubla, acid nucleic segmentat = 10 segmente)

4. ARN monocatenar – 2 molecule de ARN identice. ex: Retroviridae - familia lentivirinae = HIV 5. ADN dublucatenar – determina formarea incluziunilor in nucleu. ex: Adenoviridae,

Herpetoviridae, Papovaviridae. 6. ADN dublucatenar cu transcriptaza proprie, se multiplica in citoplasma. ex: Poxviridae 7. ADN monocatenar, cu catena (+) sau (-). ex: Papovavirusuri 8. ADN dublucatenar cu o catena mai scurta (partial dublu catenar). ex: Hepadnaviridae (Hep B)

EFECTELE MULTIPLICARII ASUPRA CELULELOR GAZDA transformarea tumorala a celulelor infectate: Retroviridae, Papovaviridae, Herpetoviridae, Hep B proliferari celulare: Poxviridae, Papovaviridae modificarea antigenitatii prin modificarea peplomerelor, ceea ce conduce la distrugerea celulelor

infectate prin limfocite „natural killer” fuzionari intre celulele in care se multiplica virusul sau intre cele cu virus si cele din jur:

Ex: Paramyxoviridae, HIV

2.


3.

In culturile celulare virusurile induc un efect citopat (ECP), citocid sau noncitocid: A) Efect noncitocid • formarea de sincitii (celule gigante multinucleate) = sincitiile au rol in diagnosticul infectiilor virale

Ex:Paramyxoviridae, HIV si uneori Herpetoviridae • formarea de incluziuni celulare (intracitoplasmatice sau intranucleare) datorate unei sinteze in

exces a componentelor virale care raman neasamblate Ex: pentru virusul rabic → incluziuni patognomonice – virusul se multiplica in nucleu incluziuni intracitoplasmatice = corpii Babes-Negri – in neuroni; pentru Herpeto-, Papova-, Adenovirusuri → incluziuni intranucleare B) Efect citocid = litic –determina liza celulelor infectate: Picornaviridae, Poxvirusuri, unele herpetice

CHIMIOTERAPICE ANTIVIRALE Actioneaza in diferite etape ale multiplicarii virale, si nu respecta principiul toxicitatii selective actionand atat asupra strucurilor virale cat si asupra celulei gazda motiv pentru care in prezent exista un numar mic de chimioterapice antivirale.

1. Chimioterapice care actioneaza in fazele initiale: - AMANTADINA si derivatul metilat RIMANTADINA pentru virusul gripal A efecte secundare: cefalee, varsaturi - OSELTAMIVIR, ZANAMIVIR – inhibitori ai neuraminidazei

2. Chimioterapice care actioneaza in faza de eclipsa: A. Chimioterapice care inhiba sinteza acizilor nucleici:

An

alo

gi d

e b

aze

azo

tate

Analogi de baze purinice

Pentru a deveni activi trebuiesc fosforilati de catre enzime (kinaze) celulare/virale si inhiba replicarea Herpetoviridaelor (HSV, VZV) Ara-A = Vidarabina (adenozin arabinozid) Acyclovir (Zovirax) – se administreaza in herpesul oral sau genital Gancyclovir – inhiba ADN-polimeraza Herpetoviridaelor

Analogi de baze pirimidinice

AZT= Azidomidina (Zidiviudina) – activa pe reverstranscriptaza virusului HIV - prelungind viata DDC= Dideoxicitidina – se alterneaza cu AZT DDI= Dideoxiinozina (Didanozina) – efecte secundare majore

Analogi halogenati de baze azotate

IUDR= ioddeoxiuridina – se aplica local (keratita herpetica) TFT= triflorotimidina – pentru grupul herpes Bromvinildeoxiuridina – HSV, VZV

Inhibitori nucleozidici ai reverstranscriptazei

Lamivudin = 3-TC = 3 Tiocitozina Stavudin = d-4T = derivat de timidina

Inhibitori nenucleozidici ai reverstranscriptazei

Nevirapin Delaviridin

Analogi de pirofosfat Fosfonoformat = Fosfocarnet

B) Chimioterapice care inhiba sinteza proteinelor: • in etapa de transcriere =

RIBOVIRIN (VIRAZOLE) • in etapa de traducere - INTERFERONII = α, β, γ-interferon comun = citochina; - inhibitori proteazici: INDINAVIR, RITONAVIR, NELFINAVIR, SAQUINAVIR.

3. Chimioterapice care actioneaza in etapele terminale: - 2-DEOXIGLUCOZA = utiliza in terapia hepatitei cronice cu HBV - derivati de tiosemicarbazona = MARBORAN (v. variolei), METISOZONA - derivati de rifampicine

INTERFERONII Sunt glicoproteine cu efect antiviral sintetizate de celulele infectate cu virus. Informatia genetica pentru sinteza interferonului exista in celula eucariota dar este represata. Derepresarea genelor este posibila datorita unor inductori: • Inductori virali: virusuri, forme de ARN dublucatenar • Inductori nevirali: poliribonucleotide sintetice, bacterii cu multiplicare intracelulara, endotoxinele bacterilor Gram (-),

polizaharidul capsular de la pneumococ, paraziti intracelulari (toxoplasma), mitogeni specifici: concanavalina A, hemaglutinina

Interferoni de tip I α- leucocitari = peste 20 de tipuri antigenice β- fibroblastici = aproximativ 5 tipuri antigenice

Interferoni de tip II - γ- imun = sintetizat de limfocitele T (CD4, CD8) = sintetizat de macrofagele stimulate antigenic ACTIUNI BIOLOGICE: • Toti au actiune antivirala foarte puternica, specifica in functie de specie (un interferon de la soarece este activ doar la

soarece). Mecanismul de actiune antivirala este cunoscut. Induc sinteza unor proteine antivirale dintre care unele cu functie de oligonucleotidil-sintetaze care sunt utilizate ca si cofactori ai unor endoribonucleaze ce scindeaza ARN-ul mesager viral (actioneaza in etapa de traducere in proteine). Altele actioneaza ca si kinine (proteinkinaza) care fosforileaza un factor necesar pentru initierea traducerii (nu mai are loc traducerea in proteine).

• Unii sunt utilizati in tratamentul diferitelor boli chiar si in tumori (carcinoame; dar nu si in sarcoame).


1.


25.03.2008

Relatiile ecologice ale microorganismelor Ecologia este ramura biologiei ce studiaza relatiile dintre organism si microorganisme si relatiile

acestora cu mediul inconjurator. Exista 60 de genuri bacteriene cu importanta in patologia umana. Biocenoza = ansamblu de specii bacteriene care se gasesc intr-un sector. Biotop = sector ocupat de o biocenoza. Ecosistem = ansamblu dintre biocenoza si biotop.

1. Relatii intre microorganisme de indiferenta de sinergism (potentarea efectelor pe care le au impreuna) de simbioza (isi potenteaza efectele unele altora) de antagonism

2. Relatii intre microorganisme si mediu Simboza ☺ 3. Relatii intre microorganisme si organismele superioare:

Exista 2 categorii de microorganisme: • Saprofite = traiesc utilizand materia moarta si anorganica si nu au actiune nociva asupra organismului • Parazite = traiesc in stransa legatura cu materia vie, sunt strict parazite si se dezvolta numai pe seama

organismelor vii si pot merge pana la parazitism obligatoriu intracelular (Ricketsiile, Clamydiile). Pot fi facultativ parazite, putand folosi si materie moarta.

Pentru relatia principala care duce la infectii, microorganismele parazite sunt de doua feluri: • Bacterii cu patogenitate certa = patogene de ordin I – prezenta lor in organism determina aparitia bolii

(Bacillus anthracis, Treponema pallidum) si pot depasi rezistena naturala; • Bacterii oportuniste = patogene de ordin II – sunt conditionat patogene si se gasesc in mod normal in

diferite locuri in organism dar daca parasesc locul pot produce infectii fie prin scaderea rezistentei organismului fie isi depasesc rezistenta. Astfel produc imbolnaviri cand gasesc conditii propice.

Bacteriile au evolutie rapida deoarece au material genetic extracromozomial. Organismul are mecanisme de aparare impotriva bacteriilor ce produc infectii:

• Mecanismele de rezistenta naturala (nespecifice si innascute) • Mecanismele de imunitate dobandita = actioneaza asupra agentului care a deteriminat-o

- Umorala = anticorpi = imunglobuline; - Celulara = limfocite T, limfokinele, macrofagele;

Bacterii comensale = folosesc aceleasi resurse nutritive ca si organismul organizate in ansamblu fiind in echilibru dinamic perfect (ocupa cavitaiile naturale; pe piele:

Staphylococcus epidermidis);

Comensalism ☺

formeaza microbiocenoze: ex: nazala, bucala, faringiana, vaginala, uretrala (bacterii de vecinatate), la nivelul colonului unde este diferita in functie de varsta si alcatuita din bacterii anaerobe nesporulate, Gram(-) Ex: genul Bacteroides (90-95%), E. coli, Candida, Proteus. Starea normala se numeste eubioza iar cand intervin modificari apare starea de disbioza.

Rol: - Mentinerea starii de sanatate – demonstrat pe animale aseptice - Dezvoltarea organelor limfoide - Dezvoltarea tractului digestiv INFECTIA - totalitatea proceselor ce apar (la nivelul homeostaziei) ca urmare a patrunderii agentului infectios - conflict intre microorganisme care intervin prin factori de patogenitate si organism care se apara prin mijloace de aparare (rezisenta naturala, imunitatea dobandita). Infectia poate fi data de bacterii cu patogenitate certa sau de bacteriile comensale. Poate sa se manifeste clinic (apar simptome, semne = boala infectioasa) sau poate evolua fara simptome, inaparenta clinic (ex: hepatita A). Nu toate bolile infectioase sunt transmisibile (ex:botulismul). INFECTIA → SPECIFICITATEA ETIOLOGICA = legatura dintre un microorganism si o infectie (o anumita boala e produsa de un microorganism) Posulatele lui Koch (sunt valabile si azi cu mici exceptii)

1. un agent infectios trebuie sa fie prezent la persoana infectata si trebuie sa lipseasca de la persoanele sanatoase. Leziunile produse sunt in concordanta cu prezenta bacteriei in diferite teritorii ale org.


2.

CRITICA: agentul infectios nu poate fi evidentiat la toate cazurile de boala ex: infectii persistente lente → purtator sanatos (Staphylococcus aureus);

2. agentul etiologic trebuie sa poata fi izolat in laborator si sa poata fi intretinut prin treceri succesive prin medii de cultura;

CRITICA: nu toti agentii infectiosi au putut fi cultivati in laborator → ex: bacilul leprei 3. agentul infectios izolat de la bolnav trebuie sa reproduca infectia umana la animale de laborator si de la animal sa poate fi din nou izolat. CRITCA: nu toti agentii infectiosi pot sa reproduca boala la animale ex: scarlatina, rujeola, gonoreea, febra tifoia; - unii agenti infectiosi pot sa reproduca boala la animale ex: → difteria Mycobacterium leprae

4. trecerea prin infectii trebuie sa fie urmata de instalarea unei imunitati specifice fata de agentul infectios care a dat imbolnavirea;

CRITICA: trecerea printr-un abces, flegmon nu determina instalarea imunitatii → ex: gonoreea;

Caractere generale ale infectiei 1. Evolutia stadiala – in mai multe etape a) perioada de incubatie = intervalul de timp care se scurge intre patrunderea agentului infectios in organsim si aparitia primelor semne de boala; poate fi variabila:

• ore = toxiinfectie alimentara (stafilococ), gripa • zile = febra tifoida (14 zile) • luni= hepatita B (3 luni) • ani = infectii persistente

b) perioada de debut = aparitia primelor semne de boala, necaracteristice (greturi, cefalee)

Salmonella typhi

- se poate instala: brusc (in gripa - prin frisoane), sau insidios (in 2-3 zile). c) perioada de stare = se instaleaza tabloul clinic si are durata variabila pentru diferitele boli infectioase (apar semne caracteristice); d) perioada de vindecare (uneori spre exitus = moarte) e) perioada de convalescenta 2. Febra = boala infectioasa = determinata de interleukina I = citokina eliberata de macrofage ce este transportata la nivelul hipotalamusului determinand febra; 3. Modificari sangvine – calitatea si cantitatea tabloului leucocitar

• leucocitoza = cresterea leucocitelor carateristica pentru infectiile bacteriene • leucopenia = in infectii virale (dar si in febra tifoida)

Cresc neutrofilele = infectii bacteriene Limfomonocitoza = boli virale Eozinofilia = boli parazitare

4. Mecanism de transmitere – agentul infectios trebuie sa patrunda in organism pe la nivelul unei porti de intrare. Unii raman cantonati la poarta – perioada de incubatie e scurta; elibereaza toxine care difuzeaza in organism, apar primele semne de boala (ex: bacilul difteric). Agentul infectios poate migra spre diferite tesuturi, organe pentru care are tropism (pe celulele sangvine sau de-a lungul filetelor nervoase). Agentul infectios se elimina din organism prin calea de eliminarea (uneori identica cu cea de intrare). Ca sa ajunga de la un organism la altul trebuie sa existe o cale de transmitere. • Patogenitatea = capacitatea unui agent infectios de a produce o infectie (este o proprietate

calitativa). Initial – proprietate de specie, dar in aceeasi specie unele bacterii sunt mai patogene iar altele mai putin patogene (specie patogena = Staphylococcus aureus). Scara de patogenitate (DL50 = doza letala, DI50 = doza infectioasa, DLM = doza limita mortala).

• Virulenta = masoara patogenitatea (este o proprietate cantitativa) Factori de patogenitate = bacteriile pot produce leziuni (celulele au receptori specifici – de complementaritate, si alti receptori). Principalele strategii: • Toxinogeneza = proprietatea de a elibera exo/endotoxine. • Invazie

Factorii de patogenitate = structuri celulare = produsi de metabolism eliberati de structura – toxici/netoxici;

1. Adezine: permit aderarea bacteriilor de suprafete (pilii comuni); 2. Invazine: permit patrunderea in celula; 3. Toxine: endotoxine si exotoxine; 4. Impedine (agresine): factori care permit bacteriilor sa scape de sub controlul mecanismelor

de aparare antiifectioasa.


1.

Microbiologie Curs 19 1.IV.2008

Factori de patogenitate (continuare) Unele bacterii au un singur factor de patogenitate (ex: b. botulinic, b. difteric, b. tetanic). Totusi, patogenitatea este multifactoriala (ex: stafilococul = are multi factori de patogenitate ceea ce explica tabloul variat al infectiilor)

1. Adezine = factori de patogenitate ce permit atasarea de celulele susceptibile aflate la poarta de intrare (suprafete epiteliale); bacteriile pot ramane la poarta sau se poate generaliza in organism. Principalele structuri cu rol de adeziune sunt pilii couni. Ex: gonococ, meningococ, E. coli (mai multe serotipuri: EHEC, EIEC, EPEC, ETEC). Aderarea se mai poate face prin capsula, glicocalix, proteine de membrana externa sau prin structuri de aderare complexe intalnite la vibrionul holerei, salmonele sau la stafilococul β-hemolitic (determina angina) care adera de epiteliul faringian prin proteina M care se asociaza cu acidul hialuronic.

2. Invazinele = asigura patrunderea si mentinerea bacteriilor in tesut. Baceriile pot patrunde prin leziuni sau chiar prin pielea intacta (ex: Leptospirele). Pot fi:

1. Enzime bacteriene (precursori de enzime) sau activatori de enzime bacteriene (ex: colagenaze, fibrinolizine, kinaze, hialuronidaza (la stafilococ si streptococ) proteaze, lipaze, nucleaze)

2. Structuri care se opun fagocitozei: capsula, proteina A (la stafilococ), proteina M (la streptococ) 3. Factori care se opun mecanismelor bactericide din fagocite: leucocidine, catalaze, peroxidaze.

3. Toxinele = pot fi exotoxine si endotoxine

A. Exotoxinele: eliberate de bacterii in afara celulei (cea mai cunoscuta este toxina difterica); • in special de catre bacteriile Gram (+): ex: bacilul difteric, bacilul tetanic, bacilul botulinic, stafilococul, streptococul (eritrotoxina DICK→ infectii streptococice = scarlatine), b. carbunos (mai are si alt factor de patogenitate – capsula); • dar si de catre bacteriile Gram (-) : bacilul dizenteric Shiga elibereaza toxine (este o exceptie – deoarece

bacilul dizenteric actioneaza de obicei prin enteroinvazie).

Caractere generale ale exotoxinelor: sunt proteine; au greutate moleculara variabila sunt termolabile (distruse la 600-700); exceptie face toxina stafilococica (care rezista 30 min la fierbere); sunt otravuri foarte puternice: toxina botulinica – nociva in cantitati de μg/ng (cea mai puternica toxina,

cu 3 kg se poate omari toata populatia globului!!!). produc anticorpi neutralizanti pentru ca sunt antigene puternice;

anatoxina = toxina deoxifiata ce isi pastreaza numai proprietatile antigenice – este folosita in vaccinuri – se obtine prin tratare cu formaldehida 4‰ timp de 40 de zile la 400 din exotoxine;

sunt influentate de pH (inactivate la pH acid – exceptie facand cea botulinica); au mecanisme de actiune specifice (au determinism extracromozomial – plasmide, bacteriofagi);

Clasificare: • Toxine cu actiune intracelulara: Toxine bimodale - fragment B – se prinde de celula susceptibila - fragment A – patrund in celula: inhiba sinteza proteica in celula eucariota, inhiba cAMP si cGMP (ex: toxina difterica= inhiba sinteza proteica in celula eucariota) • Toxine cu actiune membranara • Enterotoxine – eliberate de vibrionul holeric (dar si de b. piocianic, b. cereus, si de Salmonellae);

enterotoxina: modifica functia celulei intestinale care din celula absorbanta devine celula secretorie de apa si elemente; se evidentiaza prin testul ansei ligaturate de intestin de iepure.


2.

B) Endotoxinele: sunt legate de celula bacteriana iar evidentierea se poate face prin distrugerea celulei sau prin extractie

chimica; sunt lipopolizaharide asemanatoare antigenului O; sunt termorezistente (stabile); actioneaza in cantitati de mg; nu induc anticorpi neuralizanti; nu se transforma in anatoxine; au mecanism de actiune nespecific (acelasi mecanism de actiune) in doze mici determina aparitia unor fenomene iar in doze mai mari a altor fenomene ca de exemplu

CID = coagulare inravasculara diseminata.

Autovaccin: in infectiile urinare cu E. coli.

4. Agresinele (impedinele) – permit bacteriei evadarea de sub controlul mecanismelor de aparare antiinfectioasa. Mecanisme de scapare de sub control:

1. structura cu actiune antifagocitara 2. exista bacterii serorezistente 3. rezistenta metabolica = capacitatea organismului de a sustrage unele oligoelemente de care au nevoie

bacteriile (ex: Fe) 4. bacteriile au capacitatea de a se opune si mecanismelor de imunitate dobandita prin eliberarea de

proteaza care degradeaza IgA secretorii de la nivelul mucoaselor. 5. variatia antigenica (ex: gonococ)

Apararea antiinfectioasa = prin doua categorii de mecanisme 1. rezistenta naturala 2. imuntatea dobandita - umorala = anticorpi - mediata celular = limfocitele T, limfokinele, macrofagele;

1. Rezistenta naturala – mecanism genetic innascut caracteristic de specie (are determinism genetic) Sunt boli care le fac - numai oamenii = antroponoze: gonoreea, scarlatina; - numai animalele - si omul si animalele = antrax

2. Mecanisme de rezistenta naturala • Bariere anatomice: cutanate, mucoase – prima linie de aparare care impiedica patrunderea µorg.

- se opun mecanic prin pastrarea integritatii - se opun chimic prin enzime (mucoasa conjunctivala – lizozim, cavitatea bucala – saliva);

• Varsta: mecanisme de rezistenta naturala; • Factorii hormonali: infectii mai frecvente la persoanele cu diabet zaharat; • Rezistenta nutritionala: redistribuirea oligoelementelor (sechestrarea Fe); • Factori celulari si tisulari: proteine, acizi grasi, enzime lizozomale; • Fagocitoza; • Inflamatia;

FAGOCITOZA = capacitatea de digestie ce apare in urma patrunderii unui agent infectios in organism; descrisa de Metchnikoff (1900); Celule implicate in fagocitoza: • fagocitele profesioniste = factorii principali de

inglobare si digerare a particulelor straine -ex: PMN-neutrofile, celulele sistemului

mononuclear fagocitar (SMF) - migreaza dirijat spre locul unde sunt prezente

particulele straine - au receptori pentru fragmentul C al

complementului si pentru Ig G - au pe suprafata lor receptori pentru fragmentul

C3 si C1 al complementului - sunt capabile de mecanisme puternic microbicide

• fagocitele amatoare = neprofesioniste - nu au capacitatea de a ingloba si a digera; nu au capacitatea de migrare; nu au pe suprafata receptori;

sunt reprezentate de celulele reticulocitare, endoteliale, fibroblastice.


1.


Etapele fagocitozei 1. chemotaxia – influentata de factori ce tin de bacterie sau factori ce tin de organismul gazda 2. atasarea – este intamplatore

– bacteriile au structuri ce impiedica atasarea astfel ca ele trebuiesc pregatite pentru fagocitoza, proces numit opsonizare – prin mecanisme specifice sau nespecifice.

3. inglobarea = emiterea de pseudopode formandu-se vezicule in care ajunge agentul infectios. Acest proces se desfasoara cu consum de energie.

4. digerarea: fagozomul + lizozomii → fagolizozomi → are loc digestia.

Mecanismele microbicide a) dependente de O2

1. mieloperoxigenaza (enzima stocata in PMN neutrofile) in prezenta H2O2 si a pH-ului acid determina formarea de compusi halogenati cu efect bactericid;

2. explozia respiratorie = cale metabolica de respiratie dormanta → formarea de compusi cu efect bactericid;

b) independente de O2 1. proteine bazice = antibiotice eliminate in organismul

uman (= defensine) – in granulatiile PMN de origine animala;

Rezultatele fagocitozei: a) digerarea particulelor straine; b) initiaza raspunsul imun; c) fagocitele sunt distruse uneori – cand numarul de bacterii inglobat este prea mare, sau cand bacteriile au factori de patogenitate; d) bacteriile pot supravietui – determinand infectii cronice (ex: Mycobacterium tuberculosis, Brucella).

INFLAMATIA - modificari vasculare, celulare, umorale; - semne Celsiene (rubor, color, tumor, dolor si functio leza); • reactia de aparare defensiva; • procese care incearca sa blocheze agentul infectios acolo unde a patruns (reactie locala); • uneori leziunile pot depasii limitele (apar si fenomene generale nervoase sau endocrine);

1. inflamatie acuta (de scurta durata) – aglomerarea la locul infectiei a neutrofilelor, cu acumulare de puroi; 2. inflamatie cronica (de durata) – celulele se acumuleaza (celulele sistemului mononuclear fagocitar dupa

care apar granulocitele).

Modificari vasculare: Vasodilatatie; Staza circulatorie – cu modificarea dispozitiei celulelor endoteliale, cresc permeabilitatea vasculara cu

extravazarea plasmei in tesuturi (= aparitia tumorului). Mai trec si: fibrinogen → retea de fibrina ce izoleaza agentul infectios; factori bactericizi: complementul, ce este activat pe cale clasica sau alternativa amplificand

reactia inflamatorie; anticorpi, care impreuna cu complementul => eliminarea agentului infectios.

Modificari celulare: - aderenta celulelor leucocite de endoteliul vascular = marginatie leucocitara; - primele celule care ajung la locul inflamatiei sunt PMN neutrofile; - ajung si celule din SMF, mastocite, bazofile, trombocite care fuzioneaza, si o serie de mediatori ai inflamatiei

care se gasesc in stare inactiva in celule sau se gasesc ca precursori. Unii mediatori actioneaza local sau la distanta: - histamina, serotonina

- derivati ai acidului arahidonic activati pe doua cai: ciclooxigenaza → prostaglandine, tromboxani lipooxigenaza → leucotriene

Fenomene generale (cunoscute sub numele de sindrom umoral al inflamatiei): - aparitia unei proteine, proteia C reactiva; - creste VSH-ul; - hiperfibrinemie; - distribuirea diferita a electrolitilor

Apararea antiinfectioasa: - rezistenta naturala nespecifica - sistemul imun


2.

SISTEMUL IMUN Specificitate: capaciatatea de a raspunde specific la antigene diferite ca structura (cu mici diferente); Memorie: odata ce a intalnit un antigen, sistemul imun isi aduce aminte, si la o noua intalnire raspunde diferit. Sistemul imun face diferenta dintre self si non-self: • in cursul dezvoltarii face cunostinta cu structurile proprii organismului si nu mai raspunde la acestea:

- raspunde negativ = toleranta imunologica; - daca raspunde pozitiv = boli autoimune (nu recunosc structuri proprii organismului);

• este stimulat in prezenta antigenului Antigenul = substanta straina care e capabila sa determine un raspuns imun umoral (anticorpi) sau celular. Imunogenul = are doua proprietati:

Imunogenitate – capacitatea de a declansa un raspuns imun Specificitate – capacitatea de a reactiona cu efectorii imunitari

Antigen complet = are ambele proprietati Jumatate de Antigen = haptena = nu are decat una din proprietati – specificitatea. Substantele cu rol de haptena reactioneaza cu anticorpii dar nu genereaza un raspuns imun (ex: hormonii steroizi, sulfamidele). In organism se cupleaza cu o proteina cheie si formeaza un antigen complet ce determina un raspuns imun.

Imunogenitatea este conditionata de o serie de factori: Conditii - filogenetice: cu cat o substanta este mai indepartata taxonomic de organism cu atat e mai imunogena; - fizico-chimice: ◘ GM – ca sa fie antigen trebuie sa aiba GM>10.000 daltoni (exista unele exceptii); ◘ Complexitatea structurala (chimica) – cele mai bune antigene sunt proteinele, dar si polizaharidele pot fi antigene (ex: polizaharidul capsular de la pneumococ; antigenul O din peretele celular la bacteriile Gram (-); antigenul H – in cili, flageli; acizii theicoici la bacteriile Gram(+)); lipidele nu pot fi antigene. ◘ Remanenta in organism – antigenul trebuie analizat de sistemul imun - de gazda – imaturitatea sistemului imun (la nou-nascut sist. imun nu are capacitatea de a raspunde fata de bacteriile capsulate, de aceea sunt frecvente infectiile produse de pneumococ sau de Haemofilus inluenzae; - calea de patrundere (subcutanata, intravenoasa, parenterala, digestiva) - doza: prea mare => instalarea tolerantei / prea mica => nu exista raspuns - administrarea de adjuvanti = substante minerale.

Specificitatea = complementaritatea intre epitop si paratop Epitop = parte a unui antigen; are conformatie spatiala perfecta pentru a se lega de anticorpi; Paratop = parte a unui anticorp care recunoaste un epitop. Un antigen are un numar variabil de epitopi: (pana la zeci de epitopi diferiti) ex: la moleculele proteice = 5-7 aminoacizi (epitopi secventiali, epitopi de contiguitate) la polizaharide = 4-6 zaharuri Exista epitopi comuni ai unor antigeni diferiti. Prezenta epitopilor comuni explica reactiile incucisate. Superantigen = antigen care spre deosebire de antigenele conventionale are proprietati de a se lega direct de moleculele de MHC de clasa 2 de la suprafata APC (celule prezentatoare de antigen), realizand o punte de unire cu limfocitele T. Superantigenul stimuleaza eliberarea unor citokine care amplifica raspunsul imun. ex: toxinele (7 toxine ale stafilococului, exfoliativa). Antigenul este preluat in organism de APC-uri dar superantigenul nu are nevoie de preluare, determinand raspunsul imun (se leaga direct de MHC II de la suprafata APC-urilor → punte de legatura cu limfocitele T → eliberarea citokinelor ce determina amplificarea raspunsului imun. Complementul = complex de proteine ce se gasesc in serul mamiferelor cu rol de a amplifica raspunsul imun. Fiecare fractiune actioneaza asupra fractiunii dinainte si este suport pentru cea care urmeaza. Se poate activa pe cale clasica sau pe cale alternativa. In cursul activarii fiecare fractiune este scindata in doua fragmente – unul cu greutate moleculara mare, instabil ce se ataseaza de membrana celulei, si altul cu greutate moleculara mica ce ramane in ser. Rol: citoliza, proinflamator, aderenta, memorie imunologica.

Calea Clasica Calea Alternativa

Complexe imune Activatori nespecifici

Ag-Ac

C1

C1

4 C2

C4b2a (C3 convertaza)

C2b

C3

C3a + C4b2a3b

C5 (C5 convertaza)

C5b C5a

Mb. celulara scindarile enzimatice inceteaza

C5b67 C6 C7

C C8 C9

5b6789 (MAC)

liză

C3bBb(C3b)nP (C5 convertaza)

C3

C3bBb (C3 convertaza)

+ P

C bBbP 3 C3 convertaza stabila

C3b + B + D

C3b + B → C B C3bBb → C3bBbP → C3bBb(C3b)n 3b

Activator c ⎯⎯⎯ →⎯++

DMg

C C C conv. 3 3 5 C5a

C 5 C5b

C3a C3b

C3a C3b

Activarea complementului

C4a


1.


Antigenul este caracterizat prin imunogenicitate si prin specificitate. Poate fi Ag complet sau haptena. Moleculele naturale precum proteinele, polizaharidele, GP, GL, mai slab si acizi nucleici, sunt Ag. Intre aceste grupe de Ag exista doua deosebiri importante care se refera:

• la varietatea, diversitatea de epitopi (determinanti antigenici); • la numarul de copii ale unui epitop pe molecula.

1) Moleculele polizaharidice sunt: monodeterminante (varietate mica de E = 2-3); polivalente (numar mare de copii); sunt Ag timoindependente, pentru care raspunsul in Ac nu necesita cooperarea limfocitelor B

(LB) cu limfocitele T – helper (LTH) deoarece Ag polivalent este capabil sa stimuleze singur expansiunea clonala a LB (expansiune clonala = multiplicare si diferentiere a unor clone).

2) Moleculele de proteine sunt: multideterminante (varietate mare de determinanti de specificitate); monovalente; sunt Ag timodependente – raspunsul in Ac necesita cooperarea intre clona de LB stimulata de Ag

pe deoparte si LTH pe de alta parte. Epitopii pot fi: • de continuitate (secventiali), recunoscuti de LT si

LB; • de contiguitate (conformationali) recunoscuti de LB

dar nu si de LT!!!

Ig = Ac = efectori ai imunitatii umorale Anticorpii pot fi prezenti:

• in ser (umori) ≈ 20% din proteinele plasmatice • pe suprafata unor celule – Ig membranare de pe LB

Structura de baza: • 4 lanturi polipeptidice: 2 H (heavy) si 2 L (light) • punti disulfurice intre lanturile H dar si intre un lant

H si un lant L; confera stabilitate moleculei de Ig; • pentru fiecare lant exista o parte variabila si o parte

constanta; • lanturile nu sunt liniare, se pliaza si pliurile duc la

formarea unor bucle in interiorul lanturilor = domenii:

pentru L = 2 → VL si CL pentru H = 4 → VH, CH1, CH2, CH3, iar la unele

clase de Ig (IgM si IgE) si CH4; • intre CH1 si CH2 = regiune balama ⇒ T, Y; • papaina – actioneaza la nivelul lanturilor H, mai sus

de legatura S-S ⇒ 2 fragmente identice Fab (format din lantul L si o portiune a lantului H) si un fragment Fc;

• papaina lasa intacte legaturile S-S care unesc lanturile grele ⇒ F(ab)2 care contine ambele brate ale monomerilor legate.


2.

Functiile Ig: 1. de recunoastere si de legare a Ag; 2. functii efectoare prin Fc

Clasele de Ig se deosebesc prin: GM, constanta de sedimentare, lant H (γ, μ, α, σ, ε), valenta, gradul de glicozilare, proprietatile farmacodinamice (timp de injumatatire, concentratie in ser, functie).

IgG: • principalul tip de Ig din ser (70-75%); GM = 150000 D, constanta

de sedimentare = 7S; • 4 subclase IgG1-IgG4; • monomeri → bivalente; • singura clasa care traverseaza placenta asigurand protectia n-n; • caracterizeaza Raspuns imun secundar(RIS) • cele mai importante opsonine (favorizeaza fagocitoza); • intervin in fixarea complementului.

IgM: • reprezinta 5-10%; GM = 900000 D; constanta de sedimentare = 19S; • sunt Ig polimerice => forma de stea => valenta 10; 5 monomeri legati prin

punti S-S si piesa J, de legatura, sintetizata de LB; • fiecare monomer are un domeniu in plus; • apar primele in Raspunsul imun primar (RIP); • sub forma de monomeri se gasesc la suprafata LB; • rol in aparare – principalele Ig aglutinante, in reactia de

citoliza, fixeaza C’, in opsonizare indirect – activeaza C’. IgD:

• monomeri; GM=180000 D, constanta de sedimentare = 6,5S • titru seric scazut 0,2% < 1% din totalul Ig serice; • foarte sensibile la actiunea proteazelor; • reprezinta marker al LB (Ig membranare); • rol mai putin cunoscut.

IgA: • serice sub forma de IgA monomerice 80% si IgA

dimerice 20%; ≈16% din totalul Ig din ser; GM = 160000 D; constanta de sedimentare = 7S; rol in apararea antivirala; exista 2 subclase α1 si α2 (in ser mai mult α1; in secretii ambele);

• secretorii: in secretii salivare, lacrimale, nazale, bronsice, lapte, colostum, genito-urinare; GM = 400000 D; constanta de sedimentare = 11S; structura diferita de IgA serice; dimerice – 2 monomeri legati prin piesa J – au in plus componenta secretorie sau piesa de transport T care este secretata de celula epiteliala la nivelul RE, glicozilata la nivelul aparatului Golgi. Protejeaza IgA secretorii de activitatea proteazelor. Piesa T este secretata independent de IgA! IgA sunt secretate de plasmocite, componenta secretorie serveste ca receptor dimerilor IgA la suprafata celulelor epiteliale (la polul lor bazal). Urmeaza endocitarea, apoi ansamblul, prin endocitoza, traverseaza aceste celule pentru a fi secretate la polul apical si tapeteaza lumenul digestiv sau bronsic. Rol in imunitatea locala!

IgE: • in ser sunt prezente in cantitati f. mici (ng/ml); GM=190000; constanta de sedim=8S; monomeri; • au un domeniu in plus pe H → CH4; • au proprietati de citofilie pentru mastocite si bazofile; • sunt responsabile de fenomene de hipersensibilitate(HS) imediata • au rol in imunitatea antiparazitara – impotriva helmintilor; Izotipurile sunt: • Clasele – determinanti antigenici de pe lantul greu; • Subclase – epitopi prezenti pe lanturile grele: IgG → γ1, γ2, γ3, γ4; IgA → A1 si A2; • Tipuri – determinanti antigenici situati pe portiunea constanta a lanturilor usoare. k ≈ 70%; λ ≈

30%; in molecula de Ig ambele lanturi sunt fie k fie λ!!!


3.

Allotipuri – determinanti antigenici (fie pe lant H fie pe lant L); • sistem Gamma markeri (marker allotipic) pentru IgG ≈ 25 markeri; determinanti antigenici pe lantul

H; • sistem Am (2 markeri tot pe lantul H); • sistem Kappa markeri (Inv!!!) – 3 markeri pe lantul L.

Idiotipuri – determinanti antigenici ce se gasesc in regiunile variabile ale lanturilor H si L (aa din structura pozitiilor de combinare). Heterogenitatea Ig – baze genetice atribuite lui Tonegawa (1987 – Nobel). Organizarea genelor Ig in AND germinal este discontinua: (desen)

Anticorpi monoclonali (Köhler si Milstein – 1984 – Nobel) • au o singura specificitate fata de un epitop; elaborati de o clona de celule. Celule mielomatoase + LB separate din splina de soarece imunizat cu un Ag care prezinta interes, in prezenta de polietilenglicol care favorizeaza formarea mb => celule hibride care prezinta:

de la celula mielomatoasa capacitatea de a se multiplica nedefinit in vitro, dar si capacitatea de a secreta cantitati mari de Ig omogene;

de la LB – capacitatea de a secreta Ac specifici. Prin multiplicare, celulele hibride se divid => descendenti care formeaza o clona care secreta Ac cu specificitatea dorita + pastreaza imortalizarea. Utilizare: in diagnostic de infectie, in terapie, in biotehnologie, pentru studiul si caracterizarea diferitilor markeri de pe suprafata LB si LT. Ag de HC se deosebesc prin : 1) determinism genic:

Molecule de clasa I: Molecule de clasa a IIa: codificate de genele DR DQ DP, subregiuni plasate pe regiunea HLA-D.

codificate de genele HLA-A, HLA-C, HLA-B;


4.

2) structura biochimica - heterodimeri compusi din lant greu (transmembranar) si lant usor; β2 microglobulina (este aceeasi pe toate celulele; numai extracelular). Are 3 domenii extracelulare (α1, α2, α3) cu domenii variabile care formeaza locul de prezentare al Ag la T cell receptor(TCR). Este ancorat in celula prin portiunea transmembranara

- heterodimeri formati din 2 lanturi α si β legate necovalent;

- ambele lanturi sunt transmembranare; - fiecare lant are 2 domenii extracelulare α1, α2 si

β1, β2.

3) repartitia pe celule - pe suprafata tururor celulelor nucleate din organism cu exceptia: celulelor musculare striate, celulelor hepatice, celulele SN (pe care sunt fie absente, fie exprimate in cantitate foarte scazuta; in stari inflamatorii si aceste celule pot exprima cantitati crescute de Ag HLA clasa I

- se gasesc numai pe suprafata celulelor implicate in RI si pe cele care prezinta Ag; - in procesele inflamatorii si alte celule pot exprima Ag HLA clasa aIIa.

4) functia lor - sunt asociate cu LTCTX CD8+ (sunt tinta pentru CD8 care distrug celulele care au pe suprafata Ag clasa I; - au rol in respingere a grefelor (recunosc Ag endogene);

- sunt asociate cu LT CD4; - au rolul de a prezenta Ag LTH CD4+ care va recunoaste Ag exogen numai daca este cuplat cu o proteina de clasa a IIa; - au rol in cooperarea celulelor in RI.

MHC(Major Histocompatibility Complex) sunt: • molecule esentiale pentru recunoasterea si prezentarea Ag => rol in elaboarea RI; • au importanta in transplanturi; • restrictia MHC – diferenta esentiala intre LT si LB in modul de recunoastere a Ag! LB! LT! • asociere intre anumite Ag si predispozitia spre diverse boli.

Molecule de adeziune = molecule de la suprafata celulei care mediaza: • contactul dintre celule; • contactul dintre celulele circulante si moleculele din substanta fundamentala.

Adeziunea intercelulara se realizeaza intre celule de acelasi tip sau celule diferite. Moleculele de adeziune: una = receptor, iar alta = ligand al receptorului. Familii:

1) integrine = heterodimeri alcatuiti din 2 polipeptide α si β transmembranare – 3 subfamilii β1, β2, β3. LFA-1 (leucocyte function associated antigen-1 – antigen asociat functiei limfocitare-1) este exprimata pe toate leucocitele.

2) selectine = molecule de adeziune pe suprafata leucocitelor si a endoteliilor care se leaga de carbohidrati:

• selectina L = exprimata pe leucocite; • selectina E = endoteliala; • selectina P = exprimata pe plachete.

3) molecule de adeziune care apartin superfamiliei de gene a Ig (Intercellular Cell Adhesion Molecule) ICAM-1, ICAM-2

LFA-2 exprimata pe LT si NK(Natural Killer) LFA-3 exprimata pe toate tipurile de celule


5.

VCAM (molecule de adeziue vasculara) 4) caderine – molecule esentiale pentru dezvoltarea unor tesuturi. Sunt P, L, N, E. 5) alte CAM(Cell Adhesion Molecule) – CD44 CD15 CD38

Toate intervin in recircularea Ly, in cooperarea celulelor in RI, in procesele inflamatorii, in aderarea plachetelor de endotelii. Limfocite T Limfocite B Celula precursoare Aceeasi Maturare timus Bursa F + echiv (maduva osoasa

hematogena) % in sange 70-80% 30-20% Markeri prezenti pe suprafata CD2 + CD3 pe toate

Iar CD4 si CD8 – caracterizat subpopulatiilor

CD19 CD20 CD21

Receptorul pt Ag este format din Lanturi α si β O populatie redusa γ, σ

IgM si IgD monomeri

Expansiunea clonala in prezenta Ag specific recunoscut de receptori

Prezenta in ambele cazuri

Actiunea mitogenilor nespecifici (substante ce pot determina proliferarea nespecifica a populatiilor de limfocite)

(PHA)phytohaemagglutinin (ConA)concanavalin A

(LPS)Lipopolysaccharide (PPD)Purified Protein Derivative

Functia populatiilor de limfocite - LTCD4 intervin in special in HTT si in stimularea RI, functie helper; - LTCD8 cu functii citotoxice si functii supresoare ce pot duce la blocarea imunitatii umorale si a imunitatii mediate celular.

- eliberarea de Ac cu functii diferite; - opsonizante.

Ag care stimuleaza Raspunsul Imun sunt: • in sange → sunt captate de splina; • in tesuturi → sunt captate de ggl limfatici • la nivelul mucoaselor → MALT =Mucosa-associated lymfoid tissue-(GALT, BALT)(Gut/Brochus

associated lymfoid tissue) In realizarea RI participa LT, LB, celulele SMF prin interrelatii directe (cel-cel) si indirecte (produsi solubili).

Documents

microbi 2 corectat