Mtodos espectroscpicos en bioqumicaSensibilidadEspecificidadComplementariedadVelocidadAccesibilidadPrecio
Citocromo cEstructura de rayos X
LisozimaEstructura de RMN
Estructuras por RMN
tomos de la cadena para los residuos 72-145 de las estructuras en disolucin de apo-BsCopAb (a) y Cu(I)-BsCopA(73-151) (b) Representados como un tubo de radio variable proporcional al valor del desvo estndar de la posicin de cada residuo. Se muestran tambin las cadenas laterales del Cys85, Cys88 y el ion Cu(I).
J. Mol. Biol. (2002) 317, 415-429
Representacin esquemtica de las caractersticas de las protenas globulares que pueden seguirse durante el plegamiento. Aunque no hay una sola forma de seguir todos los detalles estructurales de un intermediario del plegamiento el uso de sondas mltiples y complementarias puede brindar una imagen detallada de la distribucin de confromaciones que componen los transitorios del plegamientoCurrent Opinion in Structural Biology 1996, 6:630-636.
Despliegue de guanilato kinasa inducido por cloruro de guanidinio medido por fluorescencia con excitacin a 282 nmJ. BIOL. CHEM. (1997) 272; 1934319350
290 nm
Espectros de RMN 19F del despliegue de DHFR marcada con 6-19F-triptofano al pasar de 0 a 5 M urea con mezcla rpida a 22 C.Intensidad de picos de resonancia asignados a W30 y W47 en la protena desplegada. Hay una primera fase demasiado rpida para registrar con este mtodo.
Constantes de velocidad y amplitudes para el despliegue de DHFR marcada con 6-19F-triptofano en urea 5 M.
Mtodo
A1
k1 (s-1)
A2
k1 (s-1)
Fluorescencia
0.205
0.727
0.795
0.014
Dicrosmo circular
0.199
0.499
0.801
0.014
RMN: Trp 22
0.237
ND
0.763
0.010
RMN: Trp 30 + 47
0.225
ND
0.775
0.015
RMN: Trp 74
0.252
ND
0.748
0.020
RMN: Trp 133
0.438
ND
0.562
0.015
Espectros FTIR en la regin de 1700 a 1540 cm-1. A, Protena hp8 (no fosforilada, lnea continual), y PKAhp8 (fosforilada (lnea punteada). B, porcentajes calculados de estructura secundaria en las muestras no fosforiladas (barras blancas) y fosforiladas (barras negras)J. BIOL. CHEM. (2001) 276; 27422751
Intercambio de protones de amida para hp8 luego de 5 minutos de incubacin con D2O a 25 C.J. BIOL. CHEM. (2001) 276; 27422751
Espectro Raman de elastina bovina (en slido) en la regin de 500 a 1750 cm-1 y asignaciones propuestas.Descomposicin de las bandas amida I de elastinas bovinas a, BE; b, BE-K. Perfiles experimentales (lnea continua) y calculados (lnea punteada). Asignaciones HW, agua de hidratacin; a, hlice a; b, hebra b; U, conformaciones no identificadas (giros + ovillo).J. BIOL. CHEM. (1995) 270; 2609926103
Anlisis y ajuste de los espectros de FTIR (regin de amida I) registrados en 1H20 de los pptidos g-T-5K (A) y b-T-8K (B). En cada caso la lnea continua representa los datos experimentales. El espectro ajustado (lnea punteada) est superpuesto. Se presentan tambin las bandas de los componentes.J. BIOL. CHEM. (1998) 273; 771777
J. BIOL. CHEM. (1998) 273; 771777a-T-4Kg-T-5K
Resumen de resultados de estructura secundaria derivados de dicrosmo circular: Los porcentajes se obtuvieron por descomposicin espectral en espectros bsicos reportados. Otra indica estructuras desordenadas o no asignadas
Hlice
hoja
Giro
Otra
-T-8K (M2-M3)
85
15
-T-10K (M1-M2-M3)
80
20
-T-4K (M4)
87
13
-T-5K (M4)
80
11
9
Espectros de FTIR en el tiempo y anlisis cintico. (a) Espectros de absorcin a tiempos de 1.1, 3.4, 5.7, 10.2, 21.6 y 103 ms. Espectro antes de mezclar (negro) con trifluoroetanol y espectro final (verde). (b) Segunda derivada de los espectros de a (lneas continuas y los resultados de un ajuste exponencial de tres estados (punteado). (c) Los tres espectros bsicos resultantes del ajuste. (d) Curso temporal de los tres estados deducidos del ajuste.PNAS (2001) 98; 66466649
Plegamiento por NMR
Superficie de energa libre (F) para el plegamiento de la lisozima. La trayectoria amarilla es una va rpida en que se pueblan los dominios a y b en forma conjunta. La trayectoria roja es una va lenta en que la cadena queda presa en un intermediario de vida larga con estructura formada slo en el dominio a. Los residuos cuyos hidrgenos de amida estn protegidos de intercambio con el disolvente aparecen en rojo o amarillo. Las regiones de estructura nativa se siguen por el desarrollo de proteccin respecto al intercambio de hidrgeno.
TIBS 25 (2000); 331-339
Cintica de plegamiento de citocromo c en presencia y ausencia de imidazol por dilucin de desnaturalizante qumico. Se mide la emisin total de fluorescencia a l > 320 nmAutoquenching
TIBS (2000) 25; 631-637FRET
Espectro visible de citocromo aa3 de P. denitrificans oxidado (a) y reducido con ditionito (b). La lnea c es el espectro diferencial de la forma reducida unida a CO menos la forma reducidaJ. BIOL. CHEM. (2002) 277; 1356313568
Espectros de resonancia raman de citocromo aa3 de P. Denitrificans reducido (a) mutante Y280H (b). Los espectros c y d corresponden al complejo con 12CO y 13CO respectivamente. El espectro diferencial 12CO 13CO aparecen en e.J. BIOL. CHEM. (2002) 277; 1356313568
Cobalamina(II) en solucin ; Complejo enzima + Cobalamina(II) Complejo enzima + Cobalamina (II) + 5-desoxiadenosinaBiochem. J. (2001) 355, 131-137
Espectro de EPR del aducto MNP/Hb a partir de la reaccin de Hb con peroxinitrito y comparacin con los aductos MNP/pptido (A) Hb + ONOO- + MNP(C) Igual que A + 0.5 mg/mL de pronasa. (E) Pptido GGYR (10 mM) + ONOO- + MNP. Tiempos de correlacinBiochemistry (1999) 38; 2078-2087
Tcnica
Escala de tiempo
Parmetro estructural observado
Fluorescencia
nss
(i)
Intrnseca
Ambiente de Trp y Tyr
(ii)
unin de ANS
Exposicin de superficie hidrofbica
(iii)
Unin de sustrato
Formacin del sitio activo
(iv)
FRET
Distancias entre residuos
(v)
Anisotropa
Tiempo de correlacin
Dicrosmo circular
nss
(i)
UV lejano
Formacin de estructura secundaria
(ii)
UV cercano
Formacin de estructura terciaria
Ingeniera de protenas
Depende del mtodo de deteccin
Funcin de cada residuo en la estabilidad de los intermediarios y los estados de transicin
Dispersin de rayos X en ngulo pequeo
> ms
Dimensiones y forma del polipptido
Absorbancia (UV cercano)
nss
Ambiente de residuos aromticos y cofactores
FTIR
nss
Formacin de estructura secundaria
RMN
(i)
tiempo real
mss
Ambiente de residuos individuales
(ii)
Dinmica
250 s
Anlisis de forma de lneas dan velocidades de plegamiento-despliegue en las cercanas del equilibrio
intercambio de hidrgeno (HX)
(i)
Estado nativo
minmeses
Estabilidad global y estados metaestables
(ii)
HX Pulsado NMR
mss
Fomacin de enlaces de hidrgeno en residuos especficos
(iii)
HX Pulsado ESI MS
mss
Poblaciones plegadas
Espectroscopa de fuerza atmica (AFM o tenaza pticas)
s
Fuerzas de despliegue y velocidades de despliegue de molculas nicas
TIBS 25 (2000);611-618
