Click here to load reader

Métodos espectroscópicos en bioquímica Sensibilidad Especificidad Complementariedad Velocidad Accesibilidad Precio

  • View
    216

  • Download
    0

Embed Size (px)

Text of Métodos espectroscópicos en bioquímica Sensibilidad Especificidad...

  • Mtodos espectroscpicos en bioqumicaSensibilidadEspecificidadComplementariedadVelocidadAccesibilidadPrecio

  • Citocromo cEstructura de rayos X

  • LisozimaEstructura de RMN

  • Estructuras por RMN

    tomos de la cadena para los residuos 72-145 de las estructuras en disolucin de apo-BsCopAb (a) y Cu(I)-BsCopA(73-151) (b) Representados como un tubo de radio variable proporcional al valor del desvo estndar de la posicin de cada residuo. Se muestran tambin las cadenas laterales del Cys85, Cys88 y el ion Cu(I).

    J. Mol. Biol. (2002) 317, 415-429

  • Representacin esquemtica de las caractersticas de las protenas globulares que pueden seguirse durante el plegamiento. Aunque no hay una sola forma de seguir todos los detalles estructurales de un intermediario del plegamiento el uso de sondas mltiples y complementarias puede brindar una imagen detallada de la distribucin de confromaciones que componen los transitorios del plegamientoCurrent Opinion in Structural Biology 1996, 6:630-636.

  • Despliegue de guanilato kinasa inducido por cloruro de guanidinio medido por fluorescencia con excitacin a 282 nmJ. BIOL. CHEM. (1997) 272; 1934319350

  • 290 nm

  • Espectros de RMN 19F del despliegue de DHFR marcada con 6-19F-triptofano al pasar de 0 a 5 M urea con mezcla rpida a 22 C.Intensidad de picos de resonancia asignados a W30 y W47 en la protena desplegada. Hay una primera fase demasiado rpida para registrar con este mtodo.

  • Constantes de velocidad y amplitudes para el despliegue de DHFR marcada con 6-19F-triptofano en urea 5 M.

    Mtodo

    A1

    k1 (s-1)

    A2

    k1 (s-1)

    Fluorescencia

    0.205

    0.727

    0.795

    0.014

    Dicrosmo circular

    0.199

    0.499

    0.801

    0.014

    RMN: Trp 22

    0.237

    ND

    0.763

    0.010

    RMN: Trp 30 + 47

    0.225

    ND

    0.775

    0.015

    RMN: Trp 74

    0.252

    ND

    0.748

    0.020

    RMN: Trp 133

    0.438

    ND

    0.562

    0.015

  • Espectros FTIR en la regin de 1700 a 1540 cm-1. A, Protena hp8 (no fosforilada, lnea continual), y PKAhp8 (fosforilada (lnea punteada). B, porcentajes calculados de estructura secundaria en las muestras no fosforiladas (barras blancas) y fosforiladas (barras negras)J. BIOL. CHEM. (2001) 276; 27422751

  • Intercambio de protones de amida para hp8 luego de 5 minutos de incubacin con D2O a 25 C.J. BIOL. CHEM. (2001) 276; 27422751

  • Espectro Raman de elastina bovina (en slido) en la regin de 500 a 1750 cm-1 y asignaciones propuestas.Descomposicin de las bandas amida I de elastinas bovinas a, BE; b, BE-K. Perfiles experimentales (lnea continua) y calculados (lnea punteada). Asignaciones HW, agua de hidratacin; a, hlice a; b, hebra b; U, conformaciones no identificadas (giros + ovillo).J. BIOL. CHEM. (1995) 270; 2609926103

  • Anlisis y ajuste de los espectros de FTIR (regin de amida I) registrados en 1H20 de los pptidos g-T-5K (A) y b-T-8K (B). En cada caso la lnea continua representa los datos experimentales. El espectro ajustado (lnea punteada) est superpuesto. Se presentan tambin las bandas de los componentes.J. BIOL. CHEM. (1998) 273; 771777

  • J. BIOL. CHEM. (1998) 273; 771777a-T-4Kg-T-5K

    Resumen de resultados de estructura secundaria derivados de dicrosmo circular: Los porcentajes se obtuvieron por descomposicin espectral en espectros bsicos reportados. Otra indica estructuras desordenadas o no asignadas

    Hlice

    hoja

    Giro

    Otra

    -T-8K (M2-M3)

    85

    15

    -T-10K (M1-M2-M3)

    80

    20

    -T-4K (M4)

    87

    13

    -T-5K (M4)

    80

    11

    9

  • Espectros de FTIR en el tiempo y anlisis cintico. (a) Espectros de absorcin a tiempos de 1.1, 3.4, 5.7, 10.2, 21.6 y 103 ms. Espectro antes de mezclar (negro) con trifluoroetanol y espectro final (verde). (b) Segunda derivada de los espectros de a (lneas continuas y los resultados de un ajuste exponencial de tres estados (punteado). (c) Los tres espectros bsicos resultantes del ajuste. (d) Curso temporal de los tres estados deducidos del ajuste.PNAS (2001) 98; 66466649

  • Plegamiento por NMR

    Superficie de energa libre (F) para el plegamiento de la lisozima. La trayectoria amarilla es una va rpida en que se pueblan los dominios a y b en forma conjunta. La trayectoria roja es una va lenta en que la cadena queda presa en un intermediario de vida larga con estructura formada slo en el dominio a. Los residuos cuyos hidrgenos de amida estn protegidos de intercambio con el disolvente aparecen en rojo o amarillo. Las regiones de estructura nativa se siguen por el desarrollo de proteccin respecto al intercambio de hidrgeno.

    TIBS 25 (2000); 331-339

  • Cintica de plegamiento de citocromo c en presencia y ausencia de imidazol por dilucin de desnaturalizante qumico. Se mide la emisin total de fluorescencia a l > 320 nmAutoquenching

  • TIBS (2000) 25; 631-637FRET

  • Espectro visible de citocromo aa3 de P. denitrificans oxidado (a) y reducido con ditionito (b). La lnea c es el espectro diferencial de la forma reducida unida a CO menos la forma reducidaJ. BIOL. CHEM. (2002) 277; 1356313568

  • Espectros de resonancia raman de citocromo aa3 de P. Denitrificans reducido (a) mutante Y280H (b). Los espectros c y d corresponden al complejo con 12CO y 13CO respectivamente. El espectro diferencial 12CO 13CO aparecen en e.J. BIOL. CHEM. (2002) 277; 1356313568

  • Cobalamina(II) en solucin ; Complejo enzima + Cobalamina(II) Complejo enzima + Cobalamina (II) + 5-desoxiadenosinaBiochem. J. (2001) 355, 131-137

  • Espectro de EPR del aducto MNP/Hb a partir de la reaccin de Hb con peroxinitrito y comparacin con los aductos MNP/pptido (A) Hb + ONOO- + MNP(C) Igual que A + 0.5 mg/mL de pronasa. (E) Pptido GGYR (10 mM) + ONOO- + MNP. Tiempos de correlacinBiochemistry (1999) 38; 2078-2087

  • Tcnica

    Escala de tiempo

    Parmetro estructural observado

    Fluorescencia

    nss

    (i)

    Intrnseca

    Ambiente de Trp y Tyr

    (ii)

    unin de ANS

    Exposicin de superficie hidrofbica

    (iii)

    Unin de sustrato

    Formacin del sitio activo

    (iv)

    FRET

    Distancias entre residuos

    (v)

    Anisotropa

    Tiempo de correlacin

    Dicrosmo circular

    nss

    (i)

    UV lejano

    Formacin de estructura secundaria

    (ii)

    UV cercano

    Formacin de estructura terciaria

    Ingeniera de protenas

    Depende del mtodo de deteccin

    Funcin de cada residuo en la estabilidad de los intermediarios y los estados de transicin

    Dispersin de rayos X en ngulo pequeo

    > ms

    Dimensiones y forma del polipptido

    Absorbancia (UV cercano)

    nss

    Ambiente de residuos aromticos y cofactores

    FTIR

    nss

    Formacin de estructura secundaria

    RMN

    (i)

    tiempo real

    mss

    Ambiente de residuos individuales

    (ii)

    Dinmica

    250 s

    Anlisis de forma de lneas dan velocidades de plegamiento-despliegue en las cercanas del equilibrio

    intercambio de hidrgeno (HX)

    (i)

    Estado nativo

    minmeses

    Estabilidad global y estados metaestables

    (ii)

    HX Pulsado NMR

    mss

    Fomacin de enlaces de hidrgeno en residuos especficos

    (iii)

    HX Pulsado ESI MS

    mss

    Poblaciones plegadas

    Espectroscopa de fuerza atmica (AFM o tenaza pticas)

    s

    Fuerzas de despliegue y velocidades de despliegue de molculas nicas

    TIBS 25 (2000);611-618

Search related