Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)-1

7/24/2019 Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)-1

1/20

Metode PCR (Polymerase chainreaction)dalam mendekteksiisolat klinisMycobacterium

tuberculosispada Anakdr. Putu Ayunda Trisna

dr. Ni Putu Wirantari

dr. Putu Diah Pratiwi


2/20

PENDAHULUAN


3/20

PENDAHULUAN


4/20

Baku emas dalam penegakan diagnosis adalah adanyamikobakterium pada biakan sampel cairan tubuh atau

jaringan PERLU WAKTU

pengecatan bakteri tahan asam akan tetapi cara ini kurang sensitifdibandingkan kultur

PENDAHULUAN

aat ini mulai berkembang pemeriksaanmolekular dimana sensitifitas lebih baikdibandingkan pengecatan bakteri tahan asam

dengan hasil lebih cepat dibanding pemeriksaankultur


5/20

Tuberkulosis

Penyakit akibat infeksi kumanMycobacteriumtuberkulosissistemis sehingga dapat mengenai

hampir semua organ tubuh! dengan lokasiterbanyak di paru yang biasanya merupakan

lokasi infeksi primer


6/20

Patogenesis TBC1


7/20

Parameter 0 ! "Kontak T#$ tidak "elas - laporan keluarga

- BTA#$% atau tidaktahu

- ka&itas #'%- BTA tidak

"elas

BTA #'%

Uji Tuberkulin Negati&e Positif ( )* mm!atau ( + mmpada keadaanimunosupresi

##%keadaan gi&i BB,TB - */ atau

BB,0 -1*/

2linis gi3i buruk

atau BB,TB - 4*/atau BB,0 -5*/

'emam tanpa sebabyang jelas

( 6 minggu

#atuk ( 7 mingguPembesaran kelenjarlim(e koli) aksila)

inguinal

( ) cm! "umlah ( )!tidak nyeri

Pembengkakantulang%sendi panggul)lutut) (alang

Ada pembengkakan

*oto rontgen toraks Normal,tidak "elas

8nfiltrate! pembesarankelen"ar! konsolidasisegmental,lobar

2lasifikasi'infiltrate! pembesarankelen"ar '

infiltrate

+koring Tuberkulosis


8/20

Petunuk diagnosis TBC menurut !H"

'icurigai tuberkulosis9 Anak sakit dengan riwayat kontak penderita tuberkulosis dengandiagnosis pasti #BTA Positif%

9 terdapat reaksi kemerahan cepat setelah penyuntikan B:;#dalam 7$4 hari%!

9 terdapat ge"ala umum TB:,ungkin tuberkulosis

Anak dicurigai tuberkulosis dengan tambahan NA% suatu patogen

- Ekstrasi Asam Nukleat : Proses ekstrasi harus dilakukan di

- Amplifikasi: Asam Nukleat pada sampel ataupun kultur di amplfikasi.

PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan salah satu metode

amplifikasi.

- Deteksi: Metode yang digunakan untuk mendeteksi asam nukleat yang

telah di amplifikasi dapat dengan cara elektroporesis line probe assay

atau real time detection


11/20

Alur sampel pada pemeriksaan molekuler tuberkulosis


12/20

#agan prookol pemeriksaan biomolekular pada pasien Tuberkulosis


13/20

Mengidentifikasi M.tuberkulosis menggunakan PCR

Prinsip prosedur P:> adalah denaturasi thermal DNA sampel!diikuti hibridisasiprimeroligonukleotida #annealing% ke utas DNA

Pada proses P:> khususnya dalam mendeteksi . Tuberkulosisdiperlukan beberapa komponen yang memegang peranan penting

). DNA cetakan

2.Primer7. Proses amplifikasi DNA

C.Analisis DNA hasil amplifikasi


14/20

DNA Cetakan

Perlu diperhatikan kemurnian dan "umlah DNA sasaranmenurunkan efesiensi P:>

Dalam hal mendeteksi kumat Tuberkulosis ekstrasi nyadengan cara! bakteri yang sudah tumbuh! dibuat

suspensi dengan menambahkan larutan Na:l *!/ #b,&%ke dalam kultur tersebut

uspensi kemudian dipanaskan! disentrifugasi! dandicuci sebanyak 6 kali

Pelet bakteri kemudian dilarutkan dengan larutanpenyangga T@,Tris$@DTA p 1!*.

@kstraksi DNA dilakukan sesuai dengan prosedur


15/20

Primer

Primeradalah oligonukleotida dengan pan"ang 6* E 7*basa yang menginisiasi sekaligus membatasi reaksipeman"angan rantai atau polimerisasi DNA.

Primermerupakan basa komplemen dari masing$

masing u"ung +F fragmen DNA yang akan diperbanyak. P:> diperlukan sepasangprimer.

Primerpertama sebagai upstream primer danprimerkedua sebagai downstreamprimer


16/20

Proses ampli#ikasi DNA

Amplifikasi DNA dilakukan dengan metode P:> menggunakanprimer oligonukleotida Pt1 #+G$;T;:;;AT;;T:;:;A;AT$7G% danPt #+G$:T;;AT;:: :T: A:; ;TT:A$7G%

larutan penyangga #)*m Tris$:l p 1!7 ' +* m 2:l%! 6!* mg:l6! *!*)/ #b,&% gelatin! dNTP #dATP! d:TP! d;TP! dTTP%

Proses P:> dilakukan dalam DNA thermocycler #Perkin$@lmer%dengan tahapdenaturasi )!+ menit pada suhu Co:! annealingpadasuhu 5+o:! 6 menit! tahap extension7 menit pada suhu 46o:! danextended extensionpada suhu 46o: selama 4 menit! untuk tiapsiklus.

Humlah siklus yang diperlukan C* siklus.


17/20

Analisis DNA $asil ampli#ikasi

Teknik elektroforesis gel agarosa digunakan untuk menganalisisDNA hasil amplifikasi dengan konsentrasi agarosa )!+/ #b,&%

Pewarnaan DNA hasil elektroforesis dilakukan denganmenggunakan larutan etidium bromida

;el kemudian di&isualisasi melalui ultraviolet transilluminator

enentukanukuran fragmen DNA! digunakan penanda beratmolekul ae888 I)4C yang dinyatakan dengan pasangan basa#basepairJ bp%.


18/20

Analisis DNA $asil ampli#ikasi

Batas deteksi u"i P:>! yaitu "umlah DNA minimum yangmemberikan hasil positi( dengan metode P:> dan elektroforesisgel agarosa! ditun"ukkan dengan adanya pita DNA pada gel dariisolatM. tuberkulosis

ensiti&itas u"i P:> yang ditun"ukkan dengan batas deteksi tersebut

untuk 5 isolat yang digunakan dalam penelitian ini ber&ariasi. Padaumumnya makin tinggi tingkat kemurnian '-A) sensiti.itasuji P$R makin meningkat


19/20

Tahap Reaksi P$R


20/20

Documents

Metode PCR (Polymerase Chain Reaction)-1