516
Editori Mihaela Aluaş Simion Simon METODE EXPERIMENTALE AVANSATE PENTRU STUDIUL ŞI ANALIZA BIO-NANO-SISTEMELOR Casa Cărţii de Ştiinţă Cluj-Napoca, 2012

Metode experimentale avansate

  • Upload
    ramdal

  • View
    240

  • Download
    10

Embed Size (px)

DESCRIPTION

nano

Citation preview

  • 3

    Editori Mihaela Alua Simion Simon

    METODE EXPERIMENTALE AVANSATE PENTRU

    STUDIUL I ANALIZA BIO-NANO-SISTEMELOR

    Casa Crii de tiin Cluj-Napoca, 2012

  • 4

    Coperta: Patricia Puca Editur acreditat CNCSIS (24) Universitatea Babe-Bolyai, 2012 Material editat n cadrul proiectului Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdisciplinar, ID 36154 Descrierea CIP a Bibliotecii Naionale a Romniei Metode experimentale avansate pentru studiul i analiza bio-nano- sistemelor / ed.: Mihaela Alua, Simion Simon. - Cluj-Napoca : Casa Crii de tiin, 2012 Bibliogr. ISBN 978-606-17-0115-5 I. Alua, Mihaela (ed.) II. Simon, Simion (ed.) 53

  • 5

    Prefa

    n calitate de director al proiectului cu titlul Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdisciplinar, cod contract POSDRU/21/1.5/G/36154, doresc s mulumesc tuturor colaboratorilor care au contribuit prin expertiza i pro-fesionalismul lor la realizarea acestui volum i, implicit, la dezvoltarea pro-gramului doctoral.

    Mulumirile mele se ndreapt de asemenea ctre echipa de management a proiectului, n urmtoarea componen:

    Prof. dr. Simion Simon, coordonator tiinific program doctoral

    Prof. dr. Octavian Popescu, coordonator tiinific relaii internaionale

    Cristina Dominic, asistent manager

    Andra Ghira, responsabil logistic i asistent manager

    Jr. Alexandru Braoveanu, consilier juridic

    Ec. Gelu Silviu Moldovan, responsabil financiar

    Ing. Carmen Ciplea, expert IT

    Ec. Istvn Psk, expert contabil

    Am convingerea c informaia cuprins n aceast lucrare va sprijini gene-raiile prezente i viitoare de conductori de doctorat n activitatea lor de cercetare. De asemenea, va facilita orientarea doctoranzilor n lumea minu-nat a tiinei contribuind la determinarea acestora de a face din meseria de cercettor o vocaie.

    Proiectul Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdisciplinar, cod contract POSDRU/21/1.5/G/36154, a fost cofinanat din Fondul Social European prin Programul Operaional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007-2013.

    C.S.III. dr. Mihaela ALUA

  • 6

  • 7

    Cuvnt nainte

    Institutul de Cercetri Interdisciplinare a fost nfiinat prin Hotrrea Sena-

    tului Universitii Babe-Bolyai din data de 30.05.2001, ca unitate de cercetare i transfer tehnologic, avnd ca obiectiv de activitate att realizarea de studii i cercetri interdisciplinare n domeniile biologie molecular, biomateriale i sisteme biologice, materiale avansate i mediu ambiant, sisteme nanostructurate natural i artificial, ct i transferul rezultatelor obinute ctre beneficiari locali, naionali sau internaionali. Institutul beneficiaz de o cldire proprie, cu o suprafa desfurat de peste 3000 mp, modernizat la nivelul standardelor internaionale din punct de vedere al dotrilor conexe i avnd laboratoare de cercetare structurate n acord cu nevoile cercetrilor interdisci-plinare menionate. ntre timp institutul, prin efortul conjugat al celor care au decis s-i dedice energia i cunotinele cercetrilor la interfaa Bio-Nano-Sistemelor, a devenit Institutul de Cercetri Interdisciplinare n Bio-Nano-tiine (ICI-BNS). n cadrul acestuia i desfoar activitatea n prezent 12 profesori universitari (dintre care 10 conductori de doctorat), 25 alte cadre didactice i cercettori i peste 40 de doctoranzi cu frecven. Acetia aparin domeniilor Fizic, Chimie, Biologie, Informatic, tiina mediului i Psihologie.

    Proiectul Program doctoral performant pentru formarea resursei umane nalt calificate n cercetarea tiinific interdisciplinar a oferit posibilitatea de a mobiliza un set de cercettori valoroi, cu experien deosebit n tehnicile experimentale frecvent utilizate n cercetrile interdisciplinare din domeniul Bio-Nano-tiinelor.

    Marea majoritate a experilor a beneficiat de stagii doctorale sau postdoc-torale n prestigioase laboratoare din lume unde au dobndit o bogat experi-en n utilizarea echipamentelor de nalt performan de care dispune Insti-tutul nostru.

    Studenii doctoranzi, dar i specialiti din domenii ca: fizic, chimie, biologie, geologie sau tiina mediului interesai n studii experimentale interdisciplinare vor gsi n materialele incluse n prezentul volum date teoretice dar mai ales prac-tice, despre tehnici experimentale avansate prezentate ntr-o form accesibil, cu exemple semnificative, menite a facilita nelegerea fenomenelor studiate i a con-tribui la creterea aportului fiecrui cercettor la dezvoltarea domeniului n care i va desfura activitatea tiinific.

    Prof. Dr. Simion SIMON Director ICI-BNS

  • 8

  • 9

    CUPRINS

    I. ANALIZE GENETICE ................................................................................................. 13

    Clonarea i exprimarea genelor o metod excepional pentru obinerea de proteine .......................................................................................................................... 13

    Asist. univ. dr. Iulia Lupan Aplicaii ale tehnicilor de biologie molecular n studii interdisciplinare ........... 36

    Asist. univ. dr. Iulia Lupan

    II. CULTURI CELULARE ............................................................................................... 64 Culturi celulare ........................................................................................................... 64

    Lect. dr. Mircea Teodor Chiriac Culturi celulare partea a II-a .................................................................................... 82

    Lect. dr. Mircea Teodor Chiriac

    III. MICROSCOPUL CONFOCAL RAMAN ............................................................ 101 Microspectroscopia Raman ....................................................................................... 101

    Conf. dr. Monica Maria Baia Microspectroscopia Raman partea a II-a ................................................................ 121

    Conf. dr. Monica Maria Baia

    IV. SPECTROMETRUL IR ........................................................................................... 134 Spectroscopia de absorbie n infrarou .................................................................. 134

    Lect. dr. Nicolae Leopold Tendine moderne n spectroscopia de absorbie IR ............................................. 147

    Lect. dr. Nicolae Leopold

    V. SPECTROFLUORIMETRUL .................................................................................. 160 Spectrofluorimetria .................................................................................................... 160

    Conf. dr. Dana Maniu Spectrofluorimetria - aplicaii ................................................................................... 172

    Conf. dr. Dana Maniu

    VI. SPECTROMETRUL DE REZONAN MAGNETIC NUCLEAR ......... 191 Spectroscopie de rezonan magnetic nuclear pe solide (RMN-S) .................. 191

    C.S.I. dr. Claudiu Filip, C.S.III. dr. Mihaela Alua Spectroscopie de rezonan magnetic nuclear pe solide (RMN-S) Implemen-tarea de metode avansate RMN-S pentru aplicaii pe sisteme moleculare organi-ce n faza solid .......................................................................................................... 216

    C.S.I. dr. Claudiu FILIP, C.S.III. dr. Mihaela Alua

  • 10

    Rezonana magnetic nuclear pe sisteme lichide ................................................ 246 Lect. dr. Mihai Vasilescu

    VII. MSURTORI TERMICE .................................................................................. 266 Analiz termic diferenial. Analiz calorimetric diferenial ......................... 266

    Conf. dr. Raluca Ciceo-Luccel Ghid de utilizare a aparatelor de analiza termic diferenial si analiz calori-metric diferenial. Ghid de interpretare a msurtorilor DTA/TG i DSC........................................................................................................................... 275

    Conf. dr. Raluca Ciceo-Luccel

    VIII. DIFRACTOMETRUL DE RAZE X ................................................................... 286 Difracie de raze X pe pulberi ................................................................................... 286

    C.S.I. dr. Gheorghe Borodi Determinarea structurii cristaline prin difracie de raze X ................................... 305

    C.S.I. dr. Gheorghe Borodi

    IX. MICROSCOPUL ELECTRONIC DE BALEAJ I DE TRANSMISIE ........... 327 Microscopia electronic ............................................................................................. 327

    ef lucrri dr. Lucian Barbu-Tudoran Microscopia electronic - partea a II-a .................................................................... 347

    ef lucrri dr. Lucian Barbu-Tudoran

    X. MICROSCOPUL DE FOR ATOMIC ............................................................ 365 Microscopia de for atomic ................................................................................... 365

    Conf. dr. Ioan Burda Microscopia de for atomic partea a II-a ........................................................... 378

    Conf. dr. Ioan Burda

    XI. SPECTROMETRUL DE FOTOELECTRONI DE RAZE X I ULTRAVIOLETE .......................................................................................................... 394

    Spectroscopia fotoelectronic ................................................................................... 394 C.S.III. dr. Maria Teodora Radu

    Studiul prin spectroscopie fotoelectronic de raze X a suprafeelor diferitelor tipuri de materiale ................................................................................... 424

    C.S.III. dr. Teodora Maria Radu, C.S.dr. Emilia Sabina Varga

    XII. SPECTROMETRUL DE REZONAN ELECTRONIC DE SPIN .......... 437 Spectroscopia de rezonan electronic de spin ................................................... 437

    C.S. dr. Milica Todea Spectroscopia de rezonan electronic de spin partea a II- a ............................ 452

    C.S. dr. Milica Todea

  • 11

    XIII. METODE ELECTROCHIMICE ......................................................................... 467 Elaborarea, testarea i verificarea protocoalelor de practic experimental pentru echipamente de investigare prin metode electrochimice ........................ 467

    Conf. dr. ing. Graziella Liana Turdean Electrochimia unei substane cu potenial biologic activ. Studiu de caz ............ 490

    Conf. dr. ing. Graziella Liana Turdean

    XIV. SISTEME DE ANALIZ A SUPRAFEEI SPECIFICE I A DIMENSIUNII PARTICULELOR .......................................................................... 509

    Sisteme de analiz a suprafeei specifice i a dimensiunii particulelor ............. 509 Lect. dr. ing. Rka Barabs

  • 12

  • 13

    I. ANALIZE GENETICE

    Clonarea i exprimarea genelor o metod excepional

    pentru obinerea de proteine Asist. univ. dr. Iulia Lupan

    Cuprins

    1. Prezentarea principiilor metodei de clonare i exprimare a genelor n sistem procariot ................................................................................................................. 13

    2. Utilizarea clonrii de gene i exprimrii de proteine recombinate n studii interdisciplinare ..................................................................................................... 31

    3. Infrastructura existent n cadrul Centrului de Biologie Molecular ................... 33 4. Bibliografie ............................................................................................................. 34

    1. Prezentarea principiilor metodei de clonare i exprimare a genelor n sistem procariot

    ADN n sine are doar 2 funcii importante i anume pstrarea informa-iei genetice i furnizarea acesteia pentru sinteza de proteine. Pstrarea in-clude transmiterea materialului genetic nemodificat de la o generaie la alta. Acest fapt este realizat prin replicarea ADN i mprirea egal a celor dou copii n timpul diviziunii celulare. A doua funcie este legat de desci-frarea informaiei pentru sinteza de proteine. Mesagerul informaiei ntre ADN i proteine este ARN, care este sintetizat n procesul de transcriere a ADN de ctre o enzim numit ARN polimeraz. ARNm rezultat servete ca matri n procesul de traducere a ADN (sinteza proteinelor) care are loc n ribozomi. Practic ARN este cruul informaiei din nucleu n citoplasm unde are loc sinteza proteinelor. Dogma central a biologiei presupune transmiterea unidirecional a informaiei de la ADN la proteine prin in-termediul ARN (Figura 1). Informaia genetic nu poate fi transmis invers, de la proteine la ADN. Informaia genetic poate fi transmis de la ARN la ADN n cazul retrovirusurilor la care materialul genetic este ARN. Nu exis-t cazuri de transmitere a informaiei de la ADN direct la proteine.

  • 14

    Clonarea genelor const n izolarea unei gene dintr-un genom i introducerea ei n alte celule gazd pentru multiplicare i n unele cazuri pentru exprimare. Prin multiplicarea celulelor cu genele clonate se pot obine mili-oane de copii ale unei singure gene. Sumar, procesul clonrii const din urmtoarele etape:

    amplificarea genei de interes introducerea genei de interes

    ntr-un vector de clonare introducerea moleculelor recombi-

    nate n celule gazd selecia celulelor transformate (pur-

    ttoare ale moleculei recombinate) verificarea moleculelor recombinate

    Amplificarea genei de interes. O gen este considerat orice fragment

    de ADN care se transcrie ntr-o molecul de ARN. Moleculele de ARN re-zultate n urma transcrierii pot fi mprite n 2 categorii:

    ARN funcional ARN informaional

    ARN funcional este ARN care nu se traduce, ndeplinete anumite funcii n celul (n cea mai mare parte particip la procesul de traducere) i ocup cea mai mare parte din ARN total din celul: ARN ribosomal (ARNr) i ARN de transport (ARNt).

    ARN informaional este ARN mesager (ARNm) care codific un polipeptid i servete ca matri n procesul de traducere (sintez a proteine-lor). De cele mai multe ori genele de interes care sunt scopul clonrii codific un polipeptid. n alte cazuri scopul clonrii nu este obligatoriu o gen, ci un fragment de ADN care nu poate fi separat dintr-un amestec heterogen de molecule apropiate ca mrime. Din aceast cauz n continuare se va utiliza doar termenul fragment ADN de interes pentru a evita confuziile.

    Deoarece fragmentul ADN de interes sau int se afl ntr-un genom este necesar extragerea acestuia. Exist 2 modaliti de a obine fragmentul dorit, fie prin tierea acestuia din genom, fie prin copierea acestuia. Tierea fragmentului din genom este mai dificil deoarece necesit prezena unor situsuri (secvene specifice) la capetele fragmentului, care necesit apoi o izolare din amestecul de fragmente generate, iar numrul moleculelor deci i cantitatea de ADN este mic.

    A doua opiune de copiere a fragmentului din genom este cea mai des

    Figura 1. Dogma central a biologiei.

  • 15

    utilizat. n acest scop se utilizeaz tehnica PCR (Polymerase Chain Reaction). Aceast tehnic poate fi considerat un adevrat copiator de gene. Tehnica este pe larg utilizat, este rapid i sensibil deoarece necesi-t cantiti foarte mici de ADN matri. O condiie obligatorie pentru o am-plificare reuit este cunoaterea secvenei int, n special la capetele aces-teia. Dac secvena este necunoscut, atunci se vor analiza cel puin secven-e ADN omoloage de la alte specii sau secvena de aminoacizi a proteinei dac este vorba despre o gen. Principiul tehnicii PCR este o imitaie a pro-cesului de replicare a ADN care are loc n celule. Dac n celule pentru re-plicare se folosete o ntreag serie de proteine, aici rolul unora dintre ele este preluat de unii factori fizici, cum ar fi spre exemplu denaturarea ADN. Denaturarea ADN presupune separarea celor dou catene. Procesul este reversibil, catenele complementare formnd molecula dublu catenar dup nlturarea agentului de denaturare. Reacia de amplificare este una ciclic, fiecare ciclu fiind alctuit din 3 etape:

    denaturarea ADN alinierea amorselor sinteza catenei complementare de ctre ADN polimeraz

    Dup fiecare ciclu practic cantitatea de ADN se dubleaz, iar dup 35-40 de cicluri se obin milioane de copii ale fragmentului int pornind de la o singur copie.

    Denaturarea ADN este necesar pentru separarea celor 2 catene. Ca agent denaturant se utilizeaz temperaturi nalte de 94-98C. Denaturarea din primul ciclu dureaz cteva minute (2-6) deoarece pentru denaturarea moleculelor de ADN genomic, care sunt foarte mari, e nevoie de mai mult timp. Etapele de denaturare dup primul ciclu sunt mai scurte, doar de 30-45 sec.

    Amorsele (termenul englezesc este primer), denumite i oligonucleotide, sunt secvene scurte de ADN monocatenar. Aceste amorse sunt complemen-tare cu extremitile secvenei int i formeaz cu acestea poriuni scurte dublu catenare. Pentru alinierea amorselor la secvenele complementare, temperatura este cobort la 40-60C timp de cteva zeci de secunde. Aceast etap este numit de aliniere sau hibridizare. Temperatura de aliniere se sta-bilete la cteva grade (2-5C) mai puin dect temperatura de topire (Tm) a amorsei. Temperatura de topire se calculeaz n dependen de lungimea amorsei i de compoziia ei. Exist mai multe formule de calcul, cea mai sim-pl formul de calcul pentru o amors de pn n 25 de nucleotide este:

    Tm = 4 (G + C) + 2(A + T)

  • 16

    Unde G, C, A i T sunt numrul de nucleotide ce conin aceste baze azotate. Numrul de G i C se nmulete dublu fa de A i T deoarece ntre acestea exist 3 legturi de hidrogen, n consecin moleculele bogate n G i C au o temperatur mai mare de topire.

    Exist cteva reguli pentru construirea amorselor i anume: numrul de nucleotide este de 15-35 temperatura de topire a amorselor trebuie s fie ntre 40 i

    70C coninutul de G i C nu trebuie s depeasc 50-55% la captul 3' al amorsei este de dorit s fie o G sau C, deoare-

    ce ofer o stabilitate mai mare amorsele nu trebuie s prezinte complementaritate intern,

    n caz contrar amorsa poate forma secvene interne dublu ca-tenare care au aspect de stem sau bucl

    cele dou amorse sens (forward) i antisens (reverse) nu tre-buie sa fie complementare ntre ele, altfel se vor forma pori-uni dublu catenare sau dimeri de amorse, iar ca rezultat se vor amplifica poriunile scurte rmase monocatenare.

    De la aceste poriuni dublu catenare formate ntre catena matri i

    amorsa ADN, polimeraza poate iniia sinteza catenei complementare. ADN polimeraza catalizeaz sinteza catenei complementare n direcia 5'3' (Fi-gura 2). Amorsele servesc n primul rnd la delimitarea fragmentului am-plificat, dar i ca punct start pentru ADN polimeraz, care nu poate porni sinteza de la zero i are nevoie de un capt liber 3'.

    Iniial la originea tehnicii PCR se folosea ADN polimeraza izolat de la bacteria Escherichia coli, care are activitatea optim de sintez la 37C. Cel mai mare dezavantaj al utilizrii acestei enzime era inactivarea termic n timpul denaturrii ADN. n acest fel tuburile de reacie trebuiau schimbate de la o temperatur la alta i dup fiecare ciclu era nevoie de un surplus de ADN polimeraz. Astfel amplificarea fragmentelor de ADN era una foarte costisitoare. Salvarea acestei metode a venit dup descoperirea i descrierea ADN polimerazelor de la bacteriile termofile. Enzima revoluionar n acest sens, pe larg utilizat i astzi este Taq polimeraza. Aceast enzim este o ADN polimeraz, izolat de la o bacterie termofil Thermococcus aquaticus (de unde i denumirea ei), care sintetizeaz polimerizarea nucleotidelor trifosfat ntr-un lan polinucleotidic n direcia 53. Taq polimeraza are activitatea optim la 72C i nu se denatureaz la temperaturi ridicate de peste 90C foarte repede, astfel dup cteva ore la 95C pierderea de activi-tate este nesemnificativ. Viteza de polimerizare a Taq polimerazei este de

  • 17

    aproximativ 1000 de nucleotide per minut. Durata elongrii necesare sinte-zei va fi n dependen de mrimea fragmentului int. Pentru un fragment de 500 de nucleotide vor fi suficiente 30 sec, iar pentru un fragment de 2000 de nucleotide 2minute.

    3'

    3'

    3'

    Etapa de elongare sau sintez a catenei

    complementare de ctre ADN polimeraz

    5'

    5' 3'

    3'

    5'

    5' 3'

    3'

    5'

    5' 3'

    3'

    5'

    5'

    3'

    3

    5'

    5' 3'

    3'

    5' 5'

    3' 5' 5'

    3' 3'

    5' 3'

    5'

    5' 3'

    3'

    5' 3'

    5'

    5' 3'

    3'

    ADN genomic cu fragmentul int

    Etapa iniial de denaturare

    Alinierea amorse-lor la capetele

    fragmentului int

    Sfritul primului ciclu

    Ciclu II

    Ciclu I

  • 18

    Figura 2. Reprezentarea schematic a primelor cicluri de PCR.

    Un tip special de PCR este RT-PCR sau PCR de transcriere invers.

    Acest tip este asemntor PCR obinuit, doar c folosete o matri de ARN pentru a sintetiza ADN. Enzima responsabil de aceast sintez este transcriptaza invers, care este de fapt o ADN polimeraz ARN-dependent. Taq polimeraza este o ADN polimeraz deoarece sinteti-zeaz ADN i este ADN dependent deoarece utilizeaz o matri ADN pentru sintez. Transcriptaza invers a fost izolat de la virusurile care au material genetic ARN i n momentul intrrii n celul necesit sinteza unei copii a materialului su genetic. RT-PCR se utilizeaz pentru obinerea co-piilor de gene eucariote care nu conin introni i analiza exprimrii de gene. n ambele cazuri se pornete de la ARNm (ARN informaional care codific proteine).

    Enzime de restricie Enzimele de restricie sau restrictazele sunt enzime care taie molecule

    monocatenare sau dublu catenare de ADN la anumite situsuri specifice. Ele pot fi numite cu alte cuvinte adevrate foarfece de ADN. Restrictazele re-cunosc doar anumite secvene scurte numite situsuri specifice de recunoa-tere, se fixeaz de acestea i taie legturile fosfoesterice ntre nucleotide.

    Aceste enzime au fost descoperite la bacterii i se presupune c funcia lor este de aprare contra bacteriofagilor (virusuri ale bacteriilor). n mo-

    5' 3'

    5' 3'

    3'

    3'

    5'

    5'

    5' 3'

    5' 3'

    3'

    3'

    5'

    5'

    5' 5'

    3'

    3'

    3'

    3'

    3' 5'

    5' 3' 3' 5'

    3'

    Ciclu III

    Taq polimeraza

    amors

    amors ce indic direcia de sintez

  • 19

    mentul intrrii ADN fagic n bacterii, enzimele de restricie diger aceste molecule. ADN bacterian propriu este protejat contra enzimelor de restric-ie prin metilarea unor baze azotate, enzimele de restricie, n general, nu taie ADN metilat. Pn acum au fost descrise 4000 de enzime de restricie de la cteva sute de specii bacteriene. Toate aceste enzime se mpart n 3 clase: I, II i III. Aceast clasificare este n dependen de cofactorul utilizat i de secvena de recunoatere. Enzimele cele mai utilizate n tehnicile mo-leculare sunt cele de tip II, care au secvena de recunoatere un palindrom i utilizeaz ioni de Mg2+ ca i cofactor. Secvena palindrom este alctuit din 4-6 nucleotide i citit pe ambele catene n direcia 53 este identic.

    Nomenclatura enzimelor de restricie pornete de la denumirea bacte-riei de la care a fost izolat. Astfel, HindIII este izolat de Heamophilus influenzae tulpina Rd, iar EcoRI de la Escherichia coli tulpina RY13.

    Figura 3. Secvenele de recunoatere pentru enzimele EcoRI (A) i SmaI (B) i capetele libere dup tiere. Locurile de tiere sunt indicate cu sgei.

    Capetele libere dup tierea de ctre enzimele de restricie pot fi de 2

    feluri: coezive sau drepte. Enzima BamHI i EcoRI genereaz capete coezive dup tiere, iar enzimele SmaI i EcoRV genereaz capete drepte sau netede (Figura 3).

    Cu ajutorul unor programe speciale se pot alctui hri de restricie ca-re reprezint situsurile de recunoatere pentru diferite restrictaze ntr-o secven (Figura 4).

    GGGCCC

    CCCGGG

    GAATTC

    CTTAAG

    EcoRI

    5

    5 3

    3

    SmaI

    5

    5 3

    3

    A B

    GGG CCC

    G CTTAA

    AATTC G

    5

    3 5

    3

    CCCGGG

    3

    5

    5

    3

  • 20

    Figura 4. Harta de restricie a unei gene de la drojdia Saccharomyces cerevisiae. Cu cifre n paranteze sunt indicate situsurile enzimelor de restricie.

    Ligarea fragmentelor de ADN Dei moleculele de ADN pot fi asemnate cu nite fire, acestea nu pot fi

    legate prin creare de noduri sau nu exist nici un lipici special. Pentru lega-rea fragmentelor de ADN se utilizeaz o enzim numit ADN ligaz. Aceast enzim reface legturile fosfoesterice ntre gruparea hidroxil a unui nucleotid (captul 3) i gruparea fosfat de la nucleotidul altui fragment (captul 5) (Figura 5). Funcia ligazei n celule vii este legarea fragmentelor n timpul replicrii, recombinrii i dup repararea ADN. Cea mai des uti-lizat este ADN ligaza T4 izolat de la bacteriofagul T4. ADN ligaza T4 utilizeaz ATP ca i cofactor.

    Figura 5. Reprezentarea schematic de legare de ctre ADN ligaz a dou fragmente ADN care au

    capete netede.

    Vectori de clonare Prin vectori de clonare subnelegem molecule de ADN transportatoare

    ale fragmentului de ADN strin n celulele gazd. Vectorii sunt de mai multe tipuri: cosmide, bacteriofagi, plasmide i vectori artificiali. Aceti vectori sunt utilizai n dependen de scopul clonrii. Cele mai pe larg uti-lizate sunt plasmidele. Un plasmid este o molecul dublu catenar de ADN, care este circular, nchis i capabil de replicare autonom n celule

    Y LR3 7 7 C1047 bp

    NcoI (7 77)

    EcoRV (58)

    BamH I (533)

    BamHI (773)

    EcoRI (605)

    EcoRI (633)H infI (32)

    H infI (7 5)

    H infI (461)

    HinfI (616)

    HinfI (942

  • 21

    gazd. Plasmidele comerciale utilizate pe larg sunt plasmide naturale izola-te de la bacterii care au fost modificate. Plasmidele au nite secvene speci-fice necesare replicrii, clonrii, seleciei i uneori exprimrii genelor. Pen-tru replicarea autonom n celule gazd plasmidele conin secvena ori, care este originea de replicare. Nicio molecul de ADN nu poate fi replicat fr o origine de replicare. Originea de replicare este o regiune a moleculei de ADN de unde poate ncepe replicarea i care este recunoscut de anumite proteine care iniiaz replicarea.

    O regiune foarte important ntr-un vector de clonare este Situsul Mul-tiplu de Clonare (termenul englezesc este Multiple Cloning Site). n aceast regiune se introduce fragmentul int de ADN cu ajutorul enzimelor de restricie i a ligazei. Att vectorul ct i fragmentul ADN sunt tiate cu aceleai enzime de restricie i legate mpreun cu ajutorul ligazei. SMC conine secvenele de recunoatere pentru mai multe enzime de restricie care nu se conin n alt regiune a vectorului.

    O alt component foarte important a plasmidelor sunt markerii de selecie care sunt de obicei nite gene, a cror produs (enzim) fac posibil selectarea celulelor cu plasmid de cele fr plasmid care sunt mai numeroa-se. Cei mai frecveni markeri utilizai sunt genele ce confer rezisten la antibiotice, mai corect spus produsul genei confer rezisten. Spre exem-plu, -lactamaza confer rezisten la ampicilin. Plasmidele care conin gena pentru aceast enzim vor proteja celulele bacteriene de efectul anti-bioticului. Astfel dac un amestec de celule transformate cu plasmide care vor conine att celule cu, ct i fr plasmid, se nsmneaz pe un mediu cu ampicilin, vor supravieui doar celulele care conin plasmidul.

    Un alt fel de selecie este selecia celulelor transformate cu plasmid re-combinat adic cu insert de cele cu plasmid fr insert. Insert se refer la fragmentul de ADN int clonat. n acest scop situsul multiplu de clonare se afl ntr-o gen ce codific o enzim. Dac n SMC nu a fost introdus niciun fragment ADN atunci gena este intact, produsul ei este o protein activ. Dac n SMC a fost introdus un fragment ADN atunci gena este modificat i produsul ei este inactiv. Spre exemplu dac SMC se afl n gena lacZ care codific subunitatea a enzimei -galactozidaz, atunci produsul acestei gene mpreun cu subunitile codificate din genomul celulei gazd bacteriene vor forma o enzim activ capabil s metabolize-ze un derivat al galactozei numit X-Gal (bromo-cloro-indolil galactopiranozid) care este adugat n mediu i este incolor. Dac -galactozidaza este activ atunci va metaboliza acest substrat, iar produsul format n urma reaciei va avea o culoare albastr. n acest fel coloniile re-

  • 22

    zultate dup transformare care conin vectorul fr insert vor fi albastre, iar cele ce conin vector recombinat vor fi albe, deoarece ele nu produc enzim activ capabil de metabolizarea substratului X-Gal. Un alt tip de selecie utilizeaz o enzim toxic pentru celulele bacteriene. Astfel, celulele cu plasmid fr insert au gena funcional care va provoca moartea celulelor. Celulele bacteriene care au plasmidul cu insert vor avea gena nefuncional i vor supraveui.

    Vectorii de clonare au de obicei mrime mic, doar de cteva mii de pb i n care pot fi inserate fragmente de ADN de la 100 pb pn la 2000-3000 pb (Figura 6: A, B). O caracteristic important pentru plasmide este num-rul de copii per celul. Vectorii de clonare mai mici au de obicei un numr mai mare de copii per celul. Acest fapt permite obinerea unei cantiti mari de ADN plasmidic dintr-o cultur mic de bacterii (din 3-5 ml de cul-tur se pot obine cteva g de ADN plasmidic). Pentru vectorii mai mari numrul copiilor per celul este mai mic, n consecin i pentru a obine o cantitate mai mare de ADN este necesar o cantitate mai mare de cultur.

    Vectorii de exprimare sunt de asemenea vectori de clonare dar care ofe-r n plus posibilitatea exprimrii genei clonate (Figura 6 C). Plasmidele de exprimare trebuie s mai conin cteva elemente n plus fa de vectorii de clonare. Aceste elemente sunt cele care se gsesc i n genom i fac parte dintr-o gen: promotorul, situsul de legare al ribosomilor, codonii START i STOP care delimiteaz cadrul deschis de citire (termenul englezesc este Open Reading Frame). Promotorul este o secven care se afl n amonte de gen i este recunoscut de factorii de transcriere, care se fixeaz la nivelul promotorului i iniiaz transcrierea. Numai n prezena promotorului ex-primarea va fi foarte sczut, de aceea situsul de legare al ribozomilor (termenul englezesc este Ribosome Binding Site) este o secven care se transcrie dar care nu se traduce i care este recunoscut de ribosomi. Ribosomii se leag la acest situs i se deplaseaz de-a lungul ARNm pn ntlnesc primul codon START de unde ncepe traducerea. Codonul START la procariote este n cele mai dese cazuri ATG. Acest codon este de obicei inclus n situsul multiplu de clonare, n caz contrar acesta se poate introdu-ce n fragmentul int cu ajutorul amorselor. Codonul STOP este inclus i el de obicei n situsul de clonare. n unele cazuri acesta este prezent dup re-giuni care codific anumite aa-zise etichete. Etichetele faciliteaz purifica-rea proteinelor recombinate prin cromatografie de afinitate. Cele mai des utilizate sunt eticheta de 6 histidine (His-tag), Glutation S-transferaza (GST) i proteina de legare a maltozei (Maltose Binding Protein, MBP este termenul n englez). Aceste etichete vor fi parte integrant a proteinelor la

  • 23

    captul ei C-terminal sau N-terminal dac secvena ce codific eticheta este prezent dup sau nainte de situsul de clonare respectiv. Etichetele vor conferi proteinelor recombinate afinitate fa de anumite rini cromatogra-fice.

    Figura 6. Hrile unor vectori plasmidici. A harta plasmidului pBR322 include 2 gene de rezisten la antibiotice: Apr confer rezisten la ampicilin, iar TCr rezisten la tetraciclin, situsul multiplu de clonare l poate constitui oricare dintre cele dou gene de rezisten, n dependen de gena selecta-t pentru inserare, rezistena la antibioticul respectiv se va pierde . B harta plasmidului de clonare pTZ57R comercializat de firma Fermentas. Plasmidul are rezisten la ampicilin, iar situsul multi-plu de clonare se afl n gena lacZ' care ofer selecia alb-albastr a clonelor pozitive. C harta vector

    de exprimare pET21a de la Novagen care include gena bla care confer rezisten la ampicilin, situsul multiplu de clonare care conine un codon START i un codon STOP dup eticheta de 6

    histidine, promotorul de la fagul T7 care este inductibil cu IPTG.

    pBR3224361 bp

    TC r

    APr

    ORI

    BamHI (376)

    ClaI (25)

    EcoRI (4360) HindIII (30)

    Pst I (3612)

    Eco RV (188)

    Bst Z17I (2247)

    PvuI (3737)

    SalI (652)

    Sca I (3847)

    SphI (567)

    pTZ57R2886 bp

    LacZ

    bla(AmR)

    MCS

    T7 pOri

    BamHI

    EcoRI

    HindI

    Pst I (6

    Xba I (6

    Sac I (6

    SalI (6

    Kpn I (6

    Apa I (6

    A B

    pET-21a5443 bp

    bla (Ap)

    lacI

    MCS

    T7 prom

    His tag

    ColE1 pBR322 origin

    f1 origin

    T7 terminator

    BamHI (199

    BglII (34

    EcoRI (193)

    HindIII (174)

    NdeI (239

    Not I (167)

    Sac I (191)

    SalI (180)

    XhoI (159)C

  • 24

    Introducerea moleculelor recombinate n celule gazd Introducerea plasmidelor recombinate n celule gazd se numete

    transformare dac sunt utilizate celule bacteriene sau transfecie dac sunt celule eucariote. n continuare se va detalia doar transformarea celulelor procariote, acestea avnd cea mai mare aplicabilitate i simplitate n scopul obinerii clonelor i proteinelor recombinate. Exist dou tipuri de trans-formare a celulelor bacteriene pe larg utilizate n laboratoarele de biologie molecular:

    transformarea chimic transformare sub influena cmpului electric.

    Ambele tipuri de transformare necesit inducerea unei competene de transformare, deoarece E. coli nu are proprieti de transformare natural.

    Aceast competen n cazul transformrii chimice este indus cu CaCl2. n acest scop se realizeaz o cultur de E. coli i prin tratarea celule-lor cu clorur de calciu la rece se poate induce transformarea celulelor bac-teriene (Figura 7 A). Celulele sunt ocate termic foarte scurt, timp de ma-xim 2 minute, la 42C. Acest timp este suficient pentru intrarea moleculelor recombinate n celulele bacteriene.

    Transformarea n cmp electric este mai eficient dect transformarea chimic. Prepararea celulelor competente presupune doar creterea lor p-n n faza logaritmic (D=600nm = 0,6-0,8) i nlturarea prin splri repe-tate a mediului de cultur. Aceste splri repetate vor asigura eliminarea ionilor care pot afecta transformarea. Pentru acest tip de transformare este necesar un aparat numit electroporator, care va crea cmpul electric ntre doi electrozi. Amestecul de celule competente i plasmide recombinate vor fi depuse ntr-o cuv special de electroporare, ai crei perei laterali sunt electrozii. Transformarea are loc la o tensiune de 1800 sau 2500 V timp de cteva msec (Figura 7 B). Dup transformare celulele ocate sunt preluate n mediu de cultur i apoi nsmnate pe mediu selectiv cu antibiotice.

    Doar unele celule bacteriene sunt transformate, cea mai mare parte din-tre ele fiind netransformate, adic fr plasmid. Eficiena de transformare a celulelor se poate msura efectund o transformare cu o cantitate de 1 ng de ADN plasmidic i apoi numrnd coloniile rezultate. Numrul de colo-nii va corespunde numrului de celulele transformate deoarece fiecare co-lonie ia natere dintr-o singur celul. Numrul obinut de la transformarea a 1 ng de ADN plasmidic se raporteaz la 1 g de ADN (nmulind valoa-rea la 1000). O eficien bun de transformare este 106, ceea ce nseamn ca la transformarea unui g de plasmid s-ar obine 1 milion de colonii, o va-loare foarte mare innd cont de faptul c avem nevoie de o singur colonie

  • 25

    sau de cteva cnd avem un amestec eterogen de molecule int. Desigur n amestecul de ligare numrul de molecule recombinate este mic i din aceas-t cauz este recomandat o eficien ct mai mare a celulelor competente.

    Fiecare dintre cele dou metode de transformare prezint avantaje i dezavantaje legate de eficiena de transformare i de costuri. Transformarea chimic este mai puin eficient dect electroporarea, dar mai ieftin deoa-rece nu necesit aparatur i cuve costisitoare.

    Figura 7. Transformarea celulelor bacteriene cu ADN plasmidic. A transformarea chimic cu

    CaCl2; B electroporarea celulelor bacteriene.

    Electroforeza acizilor nucleici Electroforeza este procesul de migrare a moleculelor cu sarcin ntr-un

    cmp electric. Migrarea moleculelor se realizeaz printr-o matrice specific. Metoda este aplicat pentru analiza proteinelor i a acizilor nucleici. Pentru proteine se aplic cel mai des electroforeza proteinelor n condiii denatu-rante n gel de poliacrilamid (termenul englezesc SDS-PAGE). Poliacril-amida se poate utiliza ca matrice i pentru electroforeza acizilor nucleici care ofer o rezoluie foarte bun a separrii fragmentelor de ADN, mai ales n cazul fragmentelor mici. Aceast matrice este folosit mai rar n la-boratoarele de analize genetice, deoarece este mai laborioas. Primul loc n utilizarea vizualizrii acizilor nucleici aparine electroforezei n gel de agaroz. Dei metoda ofer o rezoluie inferioar celei din poliacrilamid, ea este utilizat cu succes deoarece este mai simpl.

    Moleculele de acizi nucleici sunt ncrcate negativ datorit gruprilor fosfat. Aceast sarcin face posibil migrarea moleculelor de ADN i ARN

    Splarea celulelor bacteriene

    A

    B Celule de

    E.coli

    CaCl2 2 min

    42C

    1800 V 5 msec

    Celule transformate de E.coli

    nsmnarea celule-lor transformate pe

    mediu selectiv

  • 26

    ntr-un cmp electric de la catod la anod. Amestecul de molecule nu se va deplasa n cmp electric cu aceeai vitez. Moleculele mici se vor deplasa mai repede prin porii matricei, iar cele mai mari vor avansa mai lent. Astfel sepa-rarea moleculelor va fi n dependen de masa lor molecular. Pentru estima-rea aproximativ a mrimii fragmentelor n acelai gel, dar n godeu separat se va migra un amestec de molecule cu mase moleculare diferite dar cunos-cute. Acest amestec de molecule se numete marker molecular ADN.

    Agaroza este un poliglucid extras din alge marine roii. Gelurile de agaroz se realizeaz prin nclzirea agarozei ntr-un tampon specific. Con-centraia agarozei n gel poate fi ntre 1 i 3% n dependen de scopul ur-mrit. Cu ct concentraia agarozei este mai mare, cu att mrimea porilor va fi mai mic. La concentraii mai mici de agaroz, porii vor fi mai mari i migrarea moleculelor mai rapid. n concluzie concentraii mai mici se folo-sesc pentru fragmente mari (cteva mii de pb), iar concentraii mari pentru fragmente mici. Gelurile de agaroz de 1% sunt cel mai des utilizate, ofe-rind separarea moleculelor ntre 0,1 i 10 kpb. Gelurile de agaroz sunt pla-sate ntre cei doi electrozi n cuve speciale care conin tampon de migrare. Acest tampon este acelai folosit i pentru realizarea gelului. Cele mai folo-site tampoane sunt TAE (Tris/Acetat/EDTA) i TBE (Tris/Borat/EDTA).

    Deoarece ADN nu poate fi vizualizat cu ochiul liber este necesar utili-zarea unui colorant. Cel mai des folosit n acest scop este bromura de etidiu, care fixat de ADN n lumin ultraviolet devine fluorescent i are o culoare portocalie (Figura 8). Bromura de etidiu se intercaleaz ntre bazele azotate din molecula dublu catenar de ADN. Lungimea de und a luminii ultravio-lete la care este expus gelul trebuie s fie cuprins ntre 260 i 300 nm.

    Figura 8. Separarea unor fragmente de ADN cu ajutorul electroforezei n gel de agaroz.

    A imaginea gelului la expunerea n UV; B fotografia aceluiai gel.

    Electroforeza n gel de agaroz este utilizat pentru vizualizarea i pu-rificarea ADN. Vizualizarea ne ofer informaii despre integritatea ADN

    A B

  • 27

    (ADN genomic, ADN plasmidic etc), rezultatul digestiilor enzimatice, es-timarea cantitii de ADN obinut n reaciile PCR sau de extracie. ADN poate fi purificat din gel de agaroz dup migrare prin excizarea fragmen-tului int i purificarea din gel cu kituri special predestinate acestui tip de purificri.

    Verificarea moleculelor recombinate Rezultatul ligrii i transformrii se poate vedea doar dup 12-18 ore

    de la transformare cnd apar coloniile de E. coli pe mediu selectiv. Apariia coloniilor nu indic neaprat i o reuit deplin a clonrii, deoarece aces-tea pot conine un amestec de colonii pozitive i colonii cu plasmid fr insert. Chiar dac se folosete un sistem alb-albastru de selecie a coloniilor pozitive, acestea necesit totui o dovad n plus a prezenei plasmidului recombinat. n acest scop se va efectua o cultur lichid de 3-5 ml de mediu cu antibiotic care se va nsmna cu o singur colonie. Cultura se va incu-ba peste noapte cu agitare la 37C. Ziua urmtoare din bacteriile rezultate se va purifica ADN plasmidic cu ajutorul unor metode clasice sau cu ajuto-rul unor kituri speciale. ADN plasmidic urmeaz a fi analizat iniial prin digestie enzimatic i apoi prin secvenializare. Digestia ADN plasmidic se va realiza cu enzimele de restricie cu care acesta a fost introdus n vector sau care se afl la extremele situsului multiplu de clonare. Aceast digestie va confirma prezena insertului n plasmid i aproximativ mrimea acestu-ia, dar nu va furniza nicio informaie despre secvena fragmentului clonat.

    Secvenializarea fragmentului int este verificarea definitiv a clonrii. Aceast verificare este necesar deoarece ADN polimeraza utilizat pentru amplificarea insertului prin PCR poate introduce erori de sintez. Pentru a evita erorile n produii PCR se poate utiliza o ADN polimeraz care are proprietatea de a corecta erorile introduse. Astfel de ADN polimeraze sunt Vent polimeraza, Pfu polimeraza, Tli polimeraza . a. Taq polimeraza nu are activitate de corectare a erorilor, dar asigur de obicei randamente de sinte-z mai mari. n unele cazuri se utilizeaz un amestec de 2 polimeraze (3 pri de Taq polimeraz i o parte Pfu polimeraz) pentru a combina un randament mai mare cu o fidelitate crescut. n cadrul Centrului de Biologie Molecular exist 2 secveniatoare: Analizorul Genetic ABI Prism 310, Applied Biosystems, SUA (laser cu de-tecie pentru 5 fluorocromi), Analizor Genetic CEQ 8800 Genetic Analysis System (laser cu detecie pentru 4 fluorocromi). Ambele aparate utilizeaz principiul Sanger de secveniere. Acest principiu presupune utilizarea unei variante de PCR pentru secveniere. Matria ADN ce urmeaz a fi secveniat este denaturat, apoi la unul din capetele sale are loc ataarea

  • 28

    unei amorse de la care ADN polimeraza va porni sinteza catenei comple-mentare. Amestecul PCR conine dezoxiribonucleozide trifosfat (dNTP) dar i di-dezoxiribonucleozide trifosfat (ddNTP) care nu conin gruparea OH n poziia 3' a dezoxiribozei. Lipsa acestei grupri va face imposibil continua-rea sintezei ADN, deoarece ADN polimeraza nu poate aduga urmtorul nucleotid. Rezultatul acestui PCR vor fi fragmente monocatenare (deoarece se folosete o singur amors) de diferite mrimi. Numrul de cicluri este de 40, ceea ce permite sinteza tuturor fragmentelor care se opresc n toate punctele matriei de ADN. Pentru detecia fragmentelor, fiecare ddNTP este marcat cu un fluorocrom. Amestecul de fragmente rezultate sunt sepa-rate cu ajutorul electroforezei capilare, care presupune utilizarea unui capi-lar cu un diametru de ordinul micrometrilor. O cantitate de civa micro-litri vor fi separai n gelul din capilar. Migrarea fragmentelor n gel este n dependen de mrimea lor, cele mai mici vor fi primele, iar la final cele mai mari. n ultima parte a capilarului exist o fereastr transparent prin care un fascicol laser va excita fluorocromii, iar fluorescena emis va fi captat i prezentat sub forma unei electroforegrame (Figura 9). Electrofo-regramele sunt apoi analizate i comparate cu secvena existent n bazele de date. Mrimea fragmentelor de ADN care pot fi secvenializate variaz ntre 600 i 800 pb. Pentru fragmente mai mari sau pentru matrie dificile (cu secvene repetitive) este necesar utilzarea unor kituri speciale.

    Figura 9. Electroforegrama unei secvene obinut cu ajutorul analizorului ABI Prism 310. Exprimarea genelor n sistem procariot Clonarea genelor vizeaz n principal dou obiective posibile: multipli-

    carea unui fragment ADN sau exprimarea genei clonate. Clonarea n scopul multiplicrii fragmentului este utilizat atunci cnd ADN supus analizei este de fapt un amestec de fragmente care nu pot fi separate cu ajutorul electroforezei i la care se urmrete cunoaterea secvenei. n acest scop amestecul de fragmente se cloneaz ntr-un vector de clonare, iar clonele pozitive sunt apoi secvenializate.

  • 29

    Celulele de E. coli sunt utilizate pe larg n obinerea de proteine recombi-nate. Ele pot fi numite adevrate fabrici de proteine la comand, care ns c-teodat refuz s sintetizeze proteinele comandate i de ce cele mai dese ori strine celulei bacteriene. Clonarea n scopul exprimrii genei i obinerii de protein recombinat include cteva aspecte care sunt importante pentru ex-primare. Gena codificatoare poate fi clonat direct n vectorul de exprimare. Plasmidele de exprimare conin neaprat un promotor recunoscut de ARN polimeraza celulei gazd, un situs de legare a ribosomilor (rbs), un codon START i unul STOP la capetele situsului multiplu de clonare. Foarte impor-tant n acest caz este pstrarea cadrului deschis de citire, adic mprirea exac-t pe codoni a genei de la primul codon tradus pn la ultimul. Promotorii din aceste tipuri de plasmide sunt de tip inductibil. Cel mai des utilizat inductor este IPTG (isopropil-tio-galactozid), care este un analog al galactozei. Spre exemplu, vectorii de tip pET de la Novagen asigur de obicei o supraexprimare a genelor clonate. Plasmidul pET21 conine promotorul de la fagul T7, situsul de recunoatere a ribosomilor, codonul START n situsul mul-tiplu de clonare i codonul STOP dup o etichet de 6 histidine. Dac se optea-z pentru prezena unei etichete 6His la captul C-terminal a proteinei pentru facilitarea purificrii, atunci din gen se va nltura codonul STOP. Dac aceas-t etichet nu este necesar, atunci n gen se va pstra codonul STOP i tradu-cerea se va opri nainte de etichet. Promotorul T7 nu este recunoscut de ctre ARN polimeraza de la E. coli i simpla prezen a plasmidului n celulele bac-teriene nu va sigura o exprimare a genei. Vectorii pET necesit tulpini de E. coli care conin gena pentru ARN polimeraz de la fagul T7. Aceast gen se afl sub controlul promotorului lac UV5 i a operatorului lac (Figura 10).

    Figura 10. Inhibiia exprimrii genei pentru ARN polimeraza de la fagul T7 i a genei int n celule-

    le gazd de E. coli n lipsa inductorului.

  • 30

    Operatorul lac este o secven recunoscut de ctre o protein numit represorul lac. Atunci cnd n mediu nu exist lactoz (sau analogi ai lacto-zei) represorul lac se fixeaz la operatorul lac i mpiedic transcrierea genei pe care o regleaz, care n acest caz este gena pentru T7 ARN polimeraz. n absena T7 ARN polimerazei nu va exista nici transcrierea genei int din plasmid. Represorul lac este codificat de gena lacI care se afl att n genomul bacteriei gazd ct i n plasmidul de exprimare. Agentul care induce expri-marea este un analog al galactozei IPTG. Moleculele de IPTG se fixeaz de represorul lac i cauzeaz disocierea acestuia de la operatorul lac, astfel pro-motorul lac devine accesibil pentru ARN polimeraza de E. coli care va tran-scrie gena pentru T7 ARN polimeraz. Aceasta din urm va recunoate pro-motorul T7 din plamsid i va transcrie gena int. Acest sistem de exprimare este unul foarte puternic i care poate asigura o producie de protein care va alctui pn la 50% din proteinele totale bacteriene.

    Purificarea proteinelor recombinate Proteinele recombinate pot fi purificate prin metode cromatografice.

    Pentru o purificare ct mai bun din amestecul total de proteine este nece-sar purificarea n cel puin 2 etape prin metode cromatografice diferite. Ataarea unor etichete la proteinele recombinate asigur purificarea protei-nelor ntr-o singur etap, ceea ce reduce timpul necesar i asigur randa-mente de purificare mai mari (Figura 11). Dac eticheta deranjeaz n anali-za ulterioar a proteinei, atunci se poate recurge la nlturarea acesteia prin digestie cu peptidaze. n acest scop pentru clonare i exprimare se va alege un plasmid care conine situsul pentru peptidaz, cum este spre exemplu situsul pentru trombin n cazul plasmidului pET28.

    Figura 11. Reprezentarea schematic a purificrii de proteine recombinate prin cromatografie de

    afinitate. A ncrcarea amestecului total de proteine pe coloana cu rin; B splarea coloanei cu tampon i fixarea proteinei int de rin; C eluarea proteinei int de pe coloan.

    A B C

  • 31

    2. Utilizarea clonrii de gene i exprimrii de proteine recom-binate n studii interdisciplinare

    Clonarea genelor n ultimii ani a devenit o tehnic indispensabil n la-boratoarele de biologie molecular. Una dintre aplicaiile acestei tehnici, importante nu numai pentru biologie, dar i pentru studii interdisciplinare este utilizarea ei n scopul obinerii de proteine recombinate. Clonarea ge-nelor i exprimarea lor n celule gazd reprezint o surs foarte preioas de proteine. n cele mai multe cazuri purificarea unei proteine din celulele n care aceasta se exprim n mod firesc natural prezint mai multe dificul-ti:

    cantitatea de proteine n esuturi este foarte mic, spre exemplu pentru purificarea unei proteine din bacterii este necesar o can-titate de zeci de litri de cultur bacterian, iar rezultatul purifi-crilor n cteva etape pot fi sub 100 mg de protein;

    obinerea unei cantiti mari de esut pentru purificare este aproape imposibil, spre exemplu cum este cazul unor bacterii pe care nu putem s le cultivm n condiii de laborator;

    obinerea materialului pentru purificare implic probleme etice, cum ar fi spre exemplu cazul unor proteine umane, obinerea de proteine din celule umane ar fi imposibil;

    purificarea se face n mai multe etape care necesit timp, con-sumabile i are randamente mai mici.

    Aceste dezavantaje ale purificrii direct din material biologic sunt eli-minate n cazul exprimrii genelor n celule gazd. Un mare avantaj al aces-tei metode este posibilitatea introducerii de mutaii care pot dezvlui rolul unor domenii sau aminoacizi particulari n activitatea proteinei. Prin in-termediul tehnicilor de mutagenez pot fi introduse mai multe tipuri de mutaii:

    mutaii missens care schimb un aminoacid cu altul; deleii n care poriuni ntregi din lanul polipeptidic pot fi nl-

    turate; inserii care constau n introducerea de fragmente noi n gena

    codificatoare i respectiv n proteina recombinat; fuzionrii, se pot fuziona proteine ntre ele sau regiuni ale unei

    proteine cu regiuni ale altei proteine, spre exemplu regiunea N-terminal a unei proteine de la o specie se poate fuziona cu captul C-terminal al aceleiai proteine de la o specie nrudit;

    proteinele recombinate pot fi marcate. Proteinele pot fi marcate

  • 32

    cu anumite molecule care sunt introduse n proteine n procesul lor de sintez sau pot fi fuziuni. Un exemplu n acest sens este marcarea proteinelor cu izotopi stabili sau radioactivi, n mod specific sau randomic. Un alt exemplu este marcarea proteinelor prin fuziunea lor cu proteine fluorescente, care apoi faciliteaz detecia lor.

    Clonarea genelor i exprimarea lor n sistem procariot este tehnica la

    care se apeleaz cel mai des, deoarece este mai rapid i mai puin costisi-toare. Proteinele sunt structuri cu mai multe nivele de organizare, astfel o protein are structur: primar, secundar, teriar i cuaternar. Exprima-rea genelor i sinteza proteinelor n celulele procariote asigur doar struc-tura primar exact a polipeptidului sintetizat. n unele cazuri proteinele adopt structura secundar independent dup sintez, n alte cazuri este nevoie de condiii speciale i alte proteine care contribuie la adoptarea con-formaiei proteinei active. Unele proteine att de la eucariote ct i de la procariote sintetizate n celule gazd de E. coli nu reuesc s adopte o struc-tur secundar corect, iar ca rezultat polipeptidele acumulate n citoplas-m formeaz corpi de incluziune. Exist cazuri cnd acumularea proteinei sub forma corpilor de incluziune este un avantaj. Corpii de incluziune ofer posibilitatea unei purificri printr-o singur etap n condiii denaturante. Proteinele denaturate purificate n acest mod pot fi utilizate pentru imuni-zarea de animale n scopul producerii de anticorpi. Cel mai important as-pect pentru imunizare este secvena de aminoacizi a proteinei i nu structu-ra ei secundar sau teriar. Exprimarea proteinelor sub forma corpilor de incluziune nu poate fi prezis pe baza apartenenei genei sau pe baza anali-zei structurii primare. O alt problem care poate aprea este neexprimarea genei. Cauzele neexprimrii pot fi toxicitatea proteinei asupra celulelor gazd. Un alt dezavantaj (dei n unele cazuri este un avantaj) este lipsa modificrilor post-traducere a polipeptidelor sintetizate n celule bacterie-ne. Majoritatea proteinelor de la eucariote necesit nu numai adaptri con-formaionale dar i modificri post-traducere cum ar fi fosforilri, glicozilri . a. Dac prezena acestor modificri este absolut necesar, atunci se va recurge la clonarea genei n sistem procariot i exprimarea ei n celule gazd eucariote. Lipsa modificrilor post-traducere este un avantaj atunci cnd este cunoscut funcia proteinei active i se dorete s se cu-noasc rolul gruprilor care sunt adugate dup sintez. n acest fel protei-na recombinat nu va fi modificat i se va putea deduce rolul acestor gru-pri n activitatea proteinei.

  • 33

    3. Infrastructura existent n cadrul Centrului de Biologie Mo-lecular Denumire echipament Caracteristici Instalaie de preluare i prelu-crare a imaginilor Ced Limited, Marea Britanie

    Achiziia i interpretarea imaginilor de pe geluri de poliacrilamid sau geluri de agaroz

    Instalaie de ap ultrapur, Elga-Lab Water, Marea Brita-nie

    Purificarea apei pn la o rezistivitate de 18,2 M/cm (apa MilliQ)

    Centrifug cu rcire Sigma 3K18 (4 rotoare), Sigma, Ger-mania

    Centrifugarea probelor, de la 0,2ml la 1 litru, maximum 28000xg, rcire de la temperatura camerei la 0C, rotor Eppendorf (24 tuburi), rotor 6x30ml, rotor 8x50ml i rotor 4x250ml

    Centrifug de mas Sigma 1-13, Sigma, Germania Fr rcire cu rotor Eppendorf (12 tuburi, 13000xg)

    Thermocycler, Eppendorf, Germania

    Pentru amplificarea ADN-ului prin PCR n tuburi de 0,2ml, 0,5ml i placi ELISA cu 96 de godeuri; gradient de temperatur n tub

    Thermocycler, Corbett Research, Australia

    Pentru amplificarea ADN-ului prin PCR n tuburi de 0,2ml i plci ELISA cu 96 de godeuri; gradient de tempe-ratur

    Electroporator Eppendorf, Germania

    Transformarea celulelor electrocompetente bacterii i drojdii

    Spectrofotometru UV-Vis monofascicul M301, CamSpec, Marea Britanie

    Interval de fotometrare, 198-1000 nm, rezoluie 1 nm

    Spectrofotometru Jasco V-530 dublu-fascicul cu termostatare, Jasco, Japonia

    Interval de fotometrare, 198-1000 nm, rezoluie 1 nm, cu termostatare, pentru cinetic enzimatic

    Patru instalaii electroforez proteine, Consort, Belgia

    Electroforez vertical n gel de poliacrilamid, max. 32 probe

    ase instalaii electroforeza acizi nucleici, Consort, Belgia Electroforeza orizontal n gel de agaroz, max. 48 probe

    pH-metru P901 (dou buci), Consort, Belgia

    Masurarea pH-ului, electrod combinat prevzut cu senzor de temperatur

    Congelator temperaturi foarte sczute, 70 litri, Sanyo, Japonia Congelare probe biologice la -82C

    Congelator temperaturi foarte sczute, 100 litri, Snijders Scientific, Olanda

    Congelare probe biologice la -82C

    Dou balane analitice, Scaltec, Germania

    Domeniul de msurare de la 0,1mg la 160g, autocalibrare, interfa pentru calculator i imprimant

    Dou incubatoare bacteriologi-ce, Memmert, Germania

    Incubarea culturilor bacteriene i a probelor moleculare de la temperatura camerei la 70C

    Doua bai de apa cu agitare, Memmert, Germania Incubarea probelor biologice pana la 100C, (3%)

  • 34

    Analizor Genetic ABI Prism 310, Applied Biosystems, SUA laser cu detecie pentru 5 fluorocromi

    Secvenierea fragmentelor de ADN, identificare uman i determinarea polimorfismelor genetice; electroforeza capilar la 15kV; soft-uri speciale pentru secveniere i genotipare;

    Analizor Genetic CEQ 8800 Genetic Analysis System laser cu detecie pentru 4 fluorocromi Instalaie Real Time PCR, Corbett Research, Australia

    Amplificarea ADN-ului n timp real; detecia simultan a 4 fluorocromi

    Instalaie HPLC, Jasco, Japonia Separarea probelor prin cromatografie de nalt perfor-man; gradient binar de nalt presiune i gradient cua-ternar de joas presiune

    Microscop inversat NIKON Eclipse TE2000S, Nikon, Japo-nia

    Studiul preparatelor celulare i tisulare n lumina norma-l, contrast de faz i fluorescen

    Autoclav 80l, Selecta, Spania Sterilizarea umed sau uscat a mediilor de cultur, mate-rialelor i instrumentelor Autoclav AE-75-DRY Raypa, Spania

    Ultrasonicator cu patru sonde, Sonics & Materials

    Dezintegrarea celulelor bacteriene, esuturilor animale i vegetale n volume de la 1ml pn la 1 litru

    Hota PCR cu flux laminar steril, Telstar, Spania

    Flux laminar vertical, filtru bacteriologic HEPA, ilumina-re, preparare probe PCR (4%

    Hota flux laminar biohazard 100, Coreea de Sud

    Filtru exahustare HEPA (0,3 um 99,97%), filtru HEPA (0,3 m 99,97%), prefiltru reciclabil (3-30 m); flux de aer reglabil n 9 trepte (0,35-0,5 m/s);

    4.Bibliografie 1. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., and Walter P., (2002). Molecu-

    lar Biology of the Cell, 4th edition, New York: Garland Science. 2. Berg J.M., Tymoczko J.L., and Stryer L., (2002). Biochemistry, 5th edition New York:

    W. H. Freeman Company. 3. Brown T.A., (2006). Gene Cloning and DNA Analysis: An Introduction, 5th edition,

    Wiley-Blackwell Publishing. 4. Carson S., and Robertson D., (2005). Manipulation and Expression of Recombinant

    DNA, 2nd Edition, Academic Press. 5. Glick B.R., Pasternak J.J., Patten C.L., (2009). Molecular Biotechnology: Principles

    and Applications of Recombinant DNA, 4th edition, ASM Press. 6. Glover D.M., Hames B.D., (1995). DNA Cloning: A Practical Approach: Expression

    Systems (The Practical Approach Series), 2d edition, Oxford University Press. 7. Griffiths A., Gelbart W.M., Miller J., and Lewontin R.C., (1999). Modern Genetic

    Analysis, New York: W. H. Freeman Company. 8. Griffiths A., Miller J., Suzuki D.T., Lewontin R.C., and Gelbart W.M., (2000). An

    Introduction to Genetic Analysis, 7th edition, New York: W. H. Freeman Company. 9. Lodish H., Berk A., Zipursky L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J., (2000). Mo-

    lecular Cell Biology, 4th edition, New York: W. H. Freeman Company.

  • 35

    10. McPherson M.J., and. Mller S.G., (2000). PCR, Basics: from Background to Bench, 1st edition, Springer-Verlag Telos.

    11. Metzenberg S., (2007). Working with DNA (THE BASICS (Garland Science)), 1 edition, Taylor & Francis.

    12. Popescu O., 1990. Electroforeza proteinelor n geluri de poliacrilamid, Editura Teh-nic, Bucureti.

    13. Watson J.D., Myers R.M., Caudy A.A., Witkowski J.A., (2006). Recombinant DNA: Genes and Genomes - A Short Course, 3rd Edition, W. H. Freeman Company.

  • 36

    Aplicaii ale tehnicilor de biologie molecular n studii interdisciplinare

    Asist. univ. dr. Iulia Lupan

    Cuprins

    1. Metoda enzimatic de sintez a acizilor aminai .................................................... 36 2. Tendine actuale n aplicarea bionanotehnologiilor ............................................... 57 3. Bibliografie ............................................................................................................. 60

    1. Metoda enzimatic de sintez a acizilor aminai

    Un numr mare de aminoacizi se pot obine prin sintez enzimatic, care nu se aplic la scar industrial la fel ca n fermentarea direct, din cauza costurilor prea mari a substratelor. Aceast metod capt o amploa-re mai mare pe an ce trece datorit cererii mari de aminoacizi, care nu se gsesc n natur, i de derivai ai acizilor aminai. Totui metoda enzimatic prezint unele avantaje fa de alte metode, deoarece:

    izomerii optici ai aminoacizilor se pot obine direct din substratele corespunztoare;

    se pot sintetiza D-izomeri, care nu se pot obine prin fermentare direct sau prin extracie;

    se pot obine derivai ai aminoacizilor sau aminoacizi rari; sintezele sunt uor de manipulat; cantitile produse i concentraiile sunt mai mari; necesit condiii blnde de temperatur, pH, presiune.

    La nceput, pentru producerea acizilor aminai pe cale enzimatic, se fo-loseau enzime nerecombinate produse de microorganisme, fiind stimulat sinteza lor prin diverse metode. Pentru a reduce costul sintezelor, enzimele nu se purificau i se folosea lizatul celular ce coninea enzime specifice.

    Imobilizarea enzimelor n sintezele enzimatice prezint dou avantaje importante i anume reutilizarea multipl a enzimelor costisitoare i recu-perarea substratelor rmase, folosite n exces.

    Sinteza enzimatic continu prin imobilizarea enzimelor a fost aplicat n producerea L-tirozinei cu -tirozinaz i a triptofanului cu triptofanaz, pornind de la indol, piruvat i sruri de amoniu. O surs de triptofanaz

  • 37

    poate fi lizatul brut de E .coli, la care s-a indus sinteza acestei enzime. Sinte-za continu a fost realizat prin ncorporarea enzimelor n gel de poliacrilamid. Imobilizarea asigur sinteza continu a aminoacizilor i reciclarea amoniului i piruvatului neutilizate, folosite n exces [Deconttignies-Le Marchal i colab., 1979; Fukui i colab., 1974].

    Celule imobilizate de E. coli cu o activitate mare a aspartazei au fost uti-lizate n sinteza acidului aspartic [Fusee i colab., 1981; Tosa i colab., 1973]. Aceeai metod de imobilizare a fost folosit i n sinteza alaninei cu celule de Pseudomonas dacunhae care prezentau o activitate mare a L-aspartat -carboxilazei [Fusee i Weber, 1984].

    Utilizarea de cofactori (NADH, NADPH), costisitori n sintezele enzi-matice, nu permite extinderea sintezelor la scar industrial. Acest impe-diment a cauzat folosirea sistemelor enzimatice cuplate, n care se utilizea-z enzime pentru regenerarea cofactorilor. Astfel, 3-fluoroalanina s-a obi-nut din 3-fluoropiruvat, reacie catalizat de alanin dehidrogenaz ntr-un sistem cuplat cu formiat dehidrogenaza pentru regenerarea NADH. Mediul de sintez mai conine formiat de amoniu, ionul de amoniu fiind necesar n reacia de sintez a aminoacidului, iar ionul formiat pentru reacia de rege-nerare a NADH [Oshima i colab., 1988].

    Producerea continu de L-valin folosind valin dehidrogenaza i glu-cozo dehidrogenaza pentru regenerarea NADH a fost studiat detailat [Monot i colab., 1988; Honorat-Pascal i colab., 1990]. Honorat i col. [1990] au sintetizat L-alanina i L-valina folosind sistemul cuplat de alanin dehidrogenaz, respectiv valin dehidrogenaz, cu glucozo dehidrogenaz pentru regenerarea NADH. n strategia de sintez s-au utilizat enzime pro-venite de la un singur microorganism i anume Bacillus megaterium. S-a tes-tat eficiena sintezelor n cazul folosirii lizatelor i a enzimelor purificate. Numai n cazul sintezei alaninei s-a evideniat o cretere a randamentului sintezei de la 80%, n cazul folosirii lizatului brut pn la 92%, n cazul folo-sirii fraciunilor purificate.

    Sistemul multienzimatic a fost utilizat i n sinteza L-leucinei din -cetoisocaproat, utiliznd leucin dehidrogenaz de la Bacillus stearothermophilus [Oshima i colab., 1985] i formiat dehidrogenaza de la Candida boidinii, pentru regenerarea NADH [Schtte i colab., 1976]. Utili-zarea enzimelor de la microorganismele termofile prezint avantajul c au o stabilitate mai mare.

    Producerea acidului aspartic la scar industrial s-a realizat enzimatic pornind de la fumarat i sruri de amoniu i utiliznd aspartaza ca i cata-lizator [Chibata i colab., 1976].

  • 38

    Aminoacid dehidrogenaze Aminoacid dehidrogenazele (EC 1.4.1.X) sunt enzime care fac parte din

    familia oxidoreductazelor. Aceste enzime catalizeaz eliminarea gruprii amino din L-aminoacizi cu formare de cetoacizi corespunztori, n prezen de NAD(P)+.

    Aminoacid + NAD+ + H2O -cetoacid + NADH + H+ + NH3 Majoritatea aminoacid dehidrogenazelor sunt specifice pentru

    -aminoacizi, dar exist i cteva enzime care reacioneaz i cu aminoaci-zii . Cele mai bine studiate aminoacid dehidrogenaze sunt cele care au importan industrial (fenilalanin-, leucin-, alanin-, valin- i glutamat dehidrogenaza).

    Aminoacid dehidrogenazele au fost intens studiate n vederea utilizrii lor n diverse ramuri industriale. Ele au fost folosite la construirea biosen-zorilor, care pot s monitorizeze nivelul ridicat de aminoacizi din plasma sanguin, caracteristic n unele patologii. Aceste enzime au ntrebuinare i n sinteza industrial de aminoacizi. Deoarece ele acioneaz stereospecific, enzimele produc L-izomeri ai aminoacizilor naturali puri, aceast caracte-ristic fiind foarte important pentru industria farmaceutic.

    Alanin dehidrogenaza Aminarea reductiv a cetoacizilor la L-aminoacizi n procese

    NAD(P)H-dependente este catalizat de o suprafamilie de enzime omoloa-ge de aminoacid dehidrogenaze, care include fenilalanin dehidrogenaza (PheDH), leucin dehidrogenaza (LeuDH), valin dehidrogenaza (ValDH) i glutamat dehidrogenaza (GluDH). Nu exist asemnri semnificative ntre secvenele alanin dehidrogenazelor (AlaDH) i membrii acestei familii de aminoacid dehidrogenaze, cu excepia domeniului de legare a cofactorului, care este comun pentru toate aceste enzime. Dei realizeaz unul i acelai proces biologic, alanin dehidrogenazele i suprafamilia de aminoacid dehidrogenaze au evoluat separat [Baker i colab., 1998].

    Alanin dehidrogenaza (L-alanin oxidoreductaz NAD+ dependent, 1.4.1.1) catalizeaz reversibil reacia de dezaminare a L-alaninei cu formare de piruvat.

    L-alanina + NAD+ + H2O piruvat + NADH + H+ + NH3 Alanin dehidrogenaza a fost descris de ctre Wiame i Pirard n 1955

    [Norbert i colab., 1994]. Aceast enzim a fost purificat i studiat n principal la mai multe specii din genul Bacillus. Enzima are un rol impor-tant n furnizarea energiei necesare germinrii sporilor. S-a demonstrat c n lipsa enzimei sporularea avea loc cu mari dificulti [Siranosian i colab.,

  • 39

    1993]. Alanin dehidrogenaza este o enzim oligomeric. Majoritatea enzi-melor studiate sunt hexameri, cum ar fi cele de la B. subtilis, B. cereus, B. sphaericus, B. stearothermophilus, Mycobacterium, Thermus, Anabaena. Alanin dehidrogenaza este o enzim NAD+ dependent. Mecanismele cinetice ale AlaDH au fost studiate la mai multe specii. NAD+ se leag naintea piruvatului n reacia de dezaminare oxidativ, iar NADH n reacia de aminare. AlaDH poate utiliza ca substrate n reacia de aminare att piruvatul, ct i 3-hidroxipiruvatul, cu ultimul reacia fiind mult mai lent. Un caz unic printre alanin dehidrogenazele bacteriene este cea de la Bacillus sp DSPM730 care reacioneaz n egal msur cu ambele substrate. Aceas-t enzim poate fi foarte util n sinteza de L-serin din 3-hidroxipiruvat [Nagata i colab., 1989]. Lizina din poziia 74 din secvena de aminoacizi a AlaDH de la B. subtilis este esenial n cataliz i este conservat i la alte alanin dehidrogenaze. Aminoacizii din vecintatea acestei lizine prezint o regiune conservat, dar care nu este specific altor aminoacid dehidrogenaze. [Delforge i colab., 1997].

    Leucin dehidrogenaza Leucin dehidrogenaza (EC 1.4.1.9) (LeuDH) este o oxidoreductaz

    NAD+-dependent, care catalizeaz reversibil dezaminarea L-leucinei i a unor L-aminoacizi alifatici la cetoacizii corespunztori.

    Leucina + NAD+ + H2O -cetoisocaproat + NADH + NH4+ + H+

    Echilbrul reaciei este deplasat spre formarea aminoacidului. Ca i majoritatea aminoacid dehidrogenazelor, LeuDH intervine n ca-

    tabolismul unor aminoacizi. Leucin dehidrogenazele studiate provin n mare parte de la genul Bacillus precum i de la Thermoactinomyces [Ohshima i colab., 1994], Natronobacterium magadii MS-3 [Katoh i colab., 2003].

    O mare atenie s-a acordat leucin dehidrogenazelor provenite de la mi-croorganisme mezotermofile, deoarece sunt mai stabile. Una din aceste enzime este cea de la B. stearothermophilus, a crei gen codificatoare a fost clonat, iar proteina exprimat n celule de E. coli. [Nagata i colab., 1988]. Diferenele de termostabilitate ale proteinelor totale de E. coli i proteina recombinat de LeuDH permit purificarea acesteia ntr-o singur etap, prin denaturare termic. Enzima nu-i pierde activitatea dup incubare timp de 30 min la 70C [Oka i colab., 1989]. Enzimele termostabile nu pre-zint numai avantajul termostabilitii, fiind, n general, stabile i la ali factori care afecteaz proteinele, cum ar fi enzime proteolitice, solveni or-ganici, detergeni, mediu acid sau alcalin.

    Aspartat amoniu-liaza L-aspartat amoniu-liaza (AAL) sau aspartaza (EC 4.3.1.1) catalizeaz

    reversibil transformarea acidului L-aspartic la fumarat i NH4+. Aceast

  • 40

    enzim joac un rol important n metabolsimul azotului la bacterii. Majori-tatea aspartazelor studiate au masa molecular n jur de 200 kDa i sunt alctuite din patru monomeri identici, de circa 50 kDa. Enzima este activat n prezen de ioni de Mg2+ la un pH alcalin; la pH mai mic ea nu necesit ioni de metal [Karsten i Viola, 1991].

    Metode Clonarea genelor pentru aminoacid dehidrogenaze Genele ce codific leucin dehidrogenaza de la Bacillus sterothermophilus,

    alanin dehidrogenaza de la Bacillus subtilis, glucoz dehidrogenaza de la Bacillus subtilis i aspartaza de la Escherichia coli au fost amplificate prin metoda PCR utiliznd amorse specifice. n secvena amorselor au fost in-cluse situsurile pentru enzime de restricie necesare inserrii genei n vecto-rul de exprimare. Pentru clonarea genelor ce codific leucin dehidrogenaza, alanin dehidrogenaza i aspartaza s-a utilizat vectorul de exprimare pET21b (Novagen). Acest vector ofer posibilitatea exprimrii genelor la inducere cu IPTG. Produii PCR au fost purificai din gel i digerai cu en-zimele de restricie corespunztoare (Tabel 1). Vectorii de exprimare au fost digerai cu aceleai enzime de restricie. Produii de digestie (produii PCR i vectorii) au fost separai cu ajutorul electroforezei n gel de agaroz.

    Tabelul 1. Amorsele utilizate pentru amplificarea prin PCR a genelor.

    Enzima Amorsele utilizate Organism surs Enzime

    de restricie

    Vector utilizat

    AlaDH Q08352

    5 -GAGGGATCCGATGATCATAGGGGTTCCTAAAG-3

    5 -GGTCTCGAGTATAGCACCCGCCACAGATGATT-3 Bacillus subtilis BamHI

    XhoI pET21b

    LeuDH P13154

    5 -GGTGGATCCGATGGAATTGTTCAAATATATGG-3

    5 -TATTCTCGAGTATTGCCGAAGCACCTGC-3 Bacillus

    stearothermophilus BamHI

    XhoI pET21b

    ALL (P0AC38)

    5' GGTAGGATCCGATGTCAAACAACATTCGTATCG 3'

    5' GCTACTCGAGTTACTGTTCGCTTTCATCAGTA 3' Escherichia coli NdeI

    BamHI pET21b

    GalM (P0A9C3)

    5'-GGAATTCCATATGCTGAACGAAACTCCCGCAC-3'

    5'-CGCGGATCCTCACTCAGCAATAAACTGATATTCCG-3' Escherichia coli NdeI

    BamHI pET24a

    GlucDH P12310

    5 -GGAATTCCATATGTATCCGGATTTAAAAGGAAAAG-3

    5 -CGCGGATCCTCAACCGCGGCCTGCCTGG-3 Bacillus subtilis NdeI

    BamHI pET24a

    Fragmentele ADN au fost purificate din gelul de agaroz. Pentru inse-

    rarea genelor n vectori s-a utilizat ADN ligaza, care are proprietatea de a

  • 41

    reface legturile fosfoesterice. Moleculele recombinate rezultate dup ligare (vector + gena) au fost introduse prin transformare n tulpina de Escherchia coli DH5. Secvenele genelor clonate au fost verificate prin secvenializare cu un aparat ABI Prism 310 Genetic Analyzer utiliznd kitul de secveniali-zare BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems).

    Producerea de proteine recombinate Pentru exprimarea genelor, moleculele corect recombinate au fost in-

    troduse prin transformare n tulpina de Escherichia coli BL21(DE3). Pentru obinerea de proteine recombinate s-au realizat culturi mai mari (0,5-1L). Dup ce densitatea optic (DO) la 600 nm a atins valorile de ~1, s-a indus exprimarea genelor cu izopropil- D-tiogalactopiranozid (IPTG) 1 mM. Dup cteva ore de la inducere (3-5 ore) bacteriile au fost centrifugate i pstrate la -80C pn la utilizare. Sintezele enzimatice au fost realizate cu extracte celulare bacteriene. O purificare a proteinelor recombinate ar im-plica costuri i timp suplimentar, iar orice proces biotehnologic este cu att mai valoros cu ct implic mai puine costuri. Celulele bacteriene au fost preluate n tampon Tris HCl pH=8,0 50 mM. Pereii celulelor bacteriene au fost distruse prin sonicare. Dup sonicare extractul bacterian a fost centri-fugat (20 min la 21 000 g la 4C), iar supernatantul cu proteinele solubile a fost utilizat pentru msurarea activitii enzimatice. Analiza exprimrii genelor i sintezei de proteine recombinate n celulele de E. coli a fost urm-rit cu ajutorul electroforezei n gel de poliacrilamid n condiii denaturan-te n prezen de SDS (Figura 1).

    Figura 1. Sinteza de proteine recombinate n celulele gazd de E. coli. Cu cifre sunt indicate masele moleculare ale proteinelor din markerul molecular, preum i masele moleculare ale proteinelor recombinate. Se poate observa cantitatea mare de proteine recombinate

    raportat la cantitatea de proteine totale din celulele bacteriene.

    AlaDH LeuDH AAL

    1 2 3

    42

    94 67 43 30 20,1 14,4

    1 2 3

    94

    67

    43

    30

    20,1

    42

    1 2

    94

    67

    43

    30

    20,1

    14,4

    54

  • 42

    Msurarea activitii enzimatice a enzimelor Msurtorile de activitate enzimatic a dehidrogenazelor s-au efectuat

    la 30C cu un spectrofotometru Jasco V-530 urmrindu-se scderea absorbanei NADH (reacia de aminare a cetoacizilor) sau formarea acestu-ia (reacia de dezaminare a aminoacizilor) la 340nm. La aceast lungime de und NADH prezint maximul de absorban i are un coeficient molar de extincie de 6,22 103 M-1 cm-1. Activitatea enzimatic s-a calculat dup formula:

    A=[(DO/min)/6,22]*(Vr/Vp) *FD *103 U/l

    DO/min variaia densitii optice pe minut la 340 nm Vr volumul reaciei Vp volumul probei FD factorul de diluie O unitate enzimatic (1U) corespunde formrii unui mol de produs

    ntr-un minut. Mediile de reacie pentru enzime au fost urmtoarele: a) LeuDH (leucin dehidrogenaza): cetoacid 10 mM, NADH 0,15 mM,

    NH4Cl 1 M, Tris HCl 50 mM pH 8,0 n reacia de aminare; L-leucin 10 mM, NAD 2 mM, glicocol 50 mM pH 10,5 n reacia de dezaminare

    b) AlaDH (alanin dehidrogenaza): piruvat 10 mM, NADH 0,15 mM, NH4Cl 1 M, Tris HCl 50 mM pH 8,0 n reacia de aminare; L-alanin 10 mM, NAD 2 mM, glicocol 50 mM pH 10,5 n reacia de dezaminare

    c) GDH (glucozo dehidrogenaza): glucoz 10 mM, NAD 2 mM, Tris HCl 50 mM pH 8,0

    d) GalM (galacto mutarotaza): glucoz 10 mM, NAD 2 mM, Tris HCl 50 mM pH 8,0, GDH 1 U

    e) LDH (lactat dehidrogenaza): piruvat 1 mM, NADH 0,15 mM, Tris HCl 50 mM pH 8,0

    f) AAL (aspartat amoniuliaza): acid L-aspartic 100 mM, Tris HCl 50 mM pH8,5, MgCl2 6 mM

    Pentru msurarea activitii enzimatice a aspartzei s-a urmrit forma-rea acidului fumaric la 240 nm, care are un coeficient molar de extincie la aceas lungime de und egal cu 2,54 103 M-1 cm-1.

    Pentru msurarea activitii enzimatice s-au folosit civa l de enzim purificat sau extract brut bacterian, astfel nct valorile DO/min s fie cu-prinse ntre 0,05 i 0,3. S-a ales poriunea dreptei cu activitatea cea mai mare.

    Sinteza de aminoacizi marcai cu 15N Mediul de reacie pentru sintezele de aminoacizi marcai cu 15N a con-

    inut:

  • 43

    cetoacid 100 mM 15NH4Cl 100 mM NADH 1 mM glucoz 670 mM

    Amestecul de sintez a fost ajustat la pH 8,0 cu NaOH. Reacia s-a de-clanat prin adugarea enzimelor. Sintezele de aminoacizi marcai au fost efectuate la 30C cu urmrirea pH-lui i agitare. Pe parcursul sintezei s-a urmrit consumul de NH4Cl prin metoda Berthelot. Aceast metod const n formarea unui compus de culoare, la interaciunea ionului de amoniu, a fenolnitroprusiatului i a cloraminei. Probele s-au preparat dup urmtoa-rea procedur: 10 l de prob diluat de 20 ori, 200 l de fenolnitroprusiat, 200 l de hipoclorit de sodiu i 590 l ap. Developarea culorii s-a fcut prin incubarea probelor timp de 2-3 min la 100C. S-a msurat absorbana la 623 nm. nainte de declanarea sintezelor s-a preluat o prob care a servit la alctuirea unei curbe etalon. Ca martor a servit amestecul de sintez fr clorur de amoniu (din care cauz se aduga la sfrit). n Figura 2 este prezentat curba etalon de la sinteza de [15N]-L-metionin. Pe baza curbelor etalon s-a calculat cantitatea de ion de amoniu rmas n mediul de sintez. Sintezele au fost oprite prin denaturarea termic a enzimelor, timp de 15 min la 85C.

    0

    0.2

    0.4

    0.6

    0.8

    1

    1.2

    1.4

    0 20 40 60 80 100 120

    y = 0.068852 + 0.013334x R= 0.99935

    DO

    623n

    m

    NH4Cl (% )

    Figura 2. Curba etalon de la sinteza [15N] L-Metionin.

    Purificarea aminoacizilor sintetizai Aminoacizii sintetizai au fost purificai pe o coloan cu rin schim-

    btoare de ioni Dowex 50W x 8, n forma H+. Activarea umpluturii s-a fcut prin tratare cu HCl 2N, dup care s-a splat pn la un pH neutru. Ameste-cul de sintez filtrat s-a ncrcat pe coloan i apoi s-a splat cu ap (10 vo-lume). Aminoacidul s-a eluat cu NH4OH 1M. Controlul elurii s-a fcut cu ninhidrin pentru aminoacizi. Fraciunea cu aminoacid s-a concentrat pe

  • 44

    baia de ap, dup care s-a precipitat cu etanol absolut. Precipitarea s-a lsat peste noapte, iar precipitatul obinut s-a filtrat i uscat. n continuare, ami-noacizii astfel obinui au fost supui determinrii structurii, puritii i concentraiei izotopice.

    Analiza aminoacizilor sintetizai prin spectrometrie de mas Pentru analiza calitativ prin metoda spectrometriei de mas a aminoa-

    cizilor este necesar o derivatizare a produsului de reacie. Derivatizarea, care trebuie facut la ambele funciuni polare ale moleculei de aminoacid, la carboxil i amin, s-a facut prin sililare, utiliznd metoda Das Neves i Vasconcelos, care introduce la fiecare funciune polar din molecul cte o grupare ter-butil-dimetilsilil (TBDMS). Acest tip de derivatizare are avanta-jul c, datorit substituentului ter-butil voluminos, la amin se introduce o singur grupare silil, i nu una sau dou n mod statistic, cum se ntmpl n cazul derivatizrii cu grupri trimetilsilil. Derivatizarea s-a fcut utiliznd ca reactiv N-metil-N-(ter-butil-dimetilsilil) triflouroacetamida (MTBSTFA) n calitate de donor al gruprii silil, reactivul avnd i un coninut de 1% ter-butil-dimetil-clorsilan, n calitate de catalizator. Derivatizarea s-a fcut pe cantitai de prob de ordinul 0.5-1 mg de prob, cu 150 l de acetonitril ca solvent i 50 l reactiv MTBSTFA, la 120C timp de 20 minute.

    Separarea gaz-cromatografic a produilor de sintez sub form de TBDMS-derivai s-a fcut pe o coloan capilar cu faz staionar DB5 de 30 m lungime, cu hidrogen ca i gaz purttor i cu temperatur programat ntre 55 i 250C. La ionizarea cu impact de electroni, aminoacizii sub form de TBDMS-derivai se produc n cea mai mare parte sub form de ioni prin fragmentarea moleculelor. Masele ionilor fragment fiind caracteristice fie-crui aminoacid. Prin ruperea n diferite poziii din gruparea tert-butil-dimetilsilil se formeaz ioni cu masele M-43, M-57 i M-85, iar prin ruperea legturii dintre carboxil i atomul de carbon alfa, adiacent, ia natere un fragment cu masa M-159. Pentru analize s-a utilizat un cromatograf de gaze Hewlett Packard 5840 A, iar spectrele s-au nregistrat cu un spectrometru de mas cuadrupolar HP 5985.

    Sinteza de aminoacizi marcai cu 15N Marcarea aminoacizilor cu izotopi stabili se poate realiza prin sinteze

    chimice i enzimatice. n primele etape de marcare a acizilor aminai cu izotopi stabili s-au folosit metode de sintez chimic. Aceste metode pre-zint un ir ntreg de dezavantaje, cum ar fi consumul unei cantiti mari de amoniac, randamente sczute datorit mai multor etape de sintez, ob-inerea racemicului.

  • 45

    Folosirea enzimelor n sinteze de aminoacizi marcai cu izotopi stabili prezint mai multe avantaje fa de metodele chimice, datorit faptului c decurg stereoselectiv i au randamente superioare. O metod relativ simpl i mai utilizat pentru obinerea de aminoacizi marcai cu 15N este sinteza enzimatic pornind de la cetoacizi i sruri de amoniu (15N). Reaciile de sintez sunt cuplate cu reacii de regenerare a cofactorilor costisitori.

    Majoritatea enzimelor utilizate n sinteza diverilor compui necesit coenzime (NADH sau NADP). Din cauza preului mare a acestora utiliza-rea lor n cantiti stoichiometrice nu este eficient. Pentru a evita acest fe-nomen exist cteva ci de regenerare continu a coenzimelor pe parcursul sintezelor:

    regenerarea n vivo, cu utilizare de celule n cretere. Aceast metod prezint dezavantajul manipulrii laborioase a celulelor i caracterul enantioselectiv sczut al reaciei;

    regenerarea enzimatic n vitro, cele mai utilizate enzime pentru regenerarea coenzimelor n sinteze fiind alcool dehidrogenaza i formiat dehidrogenaza (Hummel i Kula, 1989);

    regenerarea electrochimic, care const n oxidarea unui media-tor i transferul electronului la NAD(P)+. Un dezavantaj al me-todei l prezint specificitatea i viteza de regenerare reduse.

    Modalitatea cea mai eficient pentru regenerarea coenzimelor rmne metoda enzimatic. Sursele enzimelor utilizate n regenerarea coenzimelor sunt destul de variate, marea majoritate provenind de la bacterii. Piridin nucleotid transhidrogenaza de la Pseudomonas fluorescens a fost utilizat n regenerarea att a NAD ct i a NADP pentru producerea de hidromorfon [Boonstra i colab., 2000].

    Schema de sintez a aminocizilor marcai cu 15N utilizat n prezenta lucrare este reprezentat n Figura 3.

    Figura 3. Schema de sintez a acizilor aminai cu 15N. AADH aminoacid dehidrogenz

    Aminoacid dehidrogenazele catalizeaz reacia de formare a aminoaci-zilor pornind de la 15NH4Cl i cetoacizii corespunztori. Sinteza de aminoa-

    Cetoacid

    L-(15N)- aminoacid

    AADH

    NADH

    NAD+

    GDH

    Acid gluconic

    -glucoz

    GalM

    -glucoz

    15NH4Cl

  • 46

    cizi a fost cuplat cu reacia catalizat de glucozo-dehidrogenaza (GlucDH) de la B. subtilis. GlucDH a servit la regenerarea NADH, utiliznd ca sub-strat glucoza cu formare de acid gluconic. n unele sinteze s-a folosit galac-tozo-mutarotaza pentru transformarea -glucozei n -glucoz. Enzimele utilizate n sintezele de aminoacizi marcai nu au fost purificate. Enzimele recombinate, exprimate n celule de E. coli, reprezint aproximativ 50% din proteinele totale existente n lizatul bacterian. Purificarea acestora este o etap suplimentar care, n general, nu conduce la mrirea randamentului reaciei. Honorat i colab. [1990] au testat sinteza de L-alanin i L-valin cu enzime (alanin dehidrogenaz i valin dehidrogenaz) purificate i n lizat bacterian. Acest fapt nu a influenat randamentul sintezelor.

    Sinteza de [15N] L-Ala Amestecul de sintez a fost ajustat la pH 8,0. Reacia s-a declanat la

    adugarea enzimelor (115 U de leucin dehidrogenaz i 60 U de gluco-zo-dehidrogenaz). Pe tot parcursul sintezei alaninei s-a urmrit consuma-rea clorurii de amoniu prin metoda Berthelot (Figura 4 A) care este o meto-d colorimetric foarte sensibil de dozare a amoniacului. Dup purificarea aminoacidului randamentul sintezei a fost de 60%.

    Figura 4. Sinteza de [15N]-alanin. (A) Consumul. 15NH4Cl pe parcursul sintezei de [15N]-alanin. Sinteza de L-alanin marcat cu 15N s-a realizat pentru o cantitate de 8 mmol. Mediul de reacie

    utilizat a coninut: piruvat de Na 150 mM, 15NH4Cl 130 mM, NADH 1 mM, glucoz 670 mM. (B) Spectrul de mas al [15N]-Alaninei. DMTBS derivat, M = 318, cca 97 atom % 15N

    NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorur la timpul zero, nainte

    de adugarea enzimelor. Activitatea alanin dehidrogenazei din B. subtilis este inhibat de

    piruvat, constanta de inhibiie calculat de noi Ki=4,25 mM. Astfel, la con-centraii mari de substrat activitatea enzimei este redus. O soluie n acest

  • 47

    caz ar fi declanarea reaciei de sintez cu cantiti mai mari de enzim. O alt soluie poate fi adugarea piruvatului n mai multe etape. n ambele cazuri este necesar o urmrire minuioas a consumului clorurii de amo-niu. Masa molecular a alaninei fr marcare izotopic este 317. Masele fragmentelor ion ale alaninei cu coninut izotopic natural sunt m/z 274, 260, 232 i 158. Analiza spectrelor de mas a artat prezena fragmentelor ion cu o unitate mai mult dect cele menionate mai sus, ceea ce demon-streaz marcarea alaninei nu 15N (Figura 4 B).

    Sinteza de [15N]-L-Leu Leucin dehidrogenazele au specificitate pentru un numr mai mare de

    cetoacizi. Enzima are cea mai mare specificitate de substrat pentru acidul -cetoisovaleric. Specificitile de substrat ale leucin dehidrogenazei native din B. stearothermophilus sunt prezentate n Tabelul 2.

    Tabelul 2. Activitatea specific (U/mg de protein) a LeuDH din

    B. stearothermophilus n prezena diferiilor -cetoacizi

    -cetoacid LeuDH429

    Acid -cetoisovaleric 168 (100) Acid ceto--metilvaleric 46,5 (28) Acid -cetoizocaproic 36,8 (22) Acid -cetocaproic 17,4 (10) Acid -ceto--metiltiobutiric 7,8 (4,6) Acid -cetobutiric 4,7 (2,8)

    Activitatea enzimatic a fost determinat la 30C n tampon Tris-HCl 50 mM, -cetoacid 10 mM, NH4Cl 1M i NADH 0,15 mM, pH 8,0. ntre paranteze este exprimat activitatea pro-centual considernd rezultatul obinut cu acid -cetoisovaleric ca 100%. De aceste valori ale activitii enzimatice s-a inut cont n sintezele de

    aminoacizi marcai cu izotopul stabil al 15N. n sintezele de aminoacizi la care enzima are o specificitate mai mic pentru precursorul acestora, a fost necesar o cantitate mai mare de enzim.

    Mediul de reacie pentru sinteza de [15N]-leucin s-a realizat cu reacti-vii la concentraiile descrise la capitolul de materiale i metode. Pe tot par-cursul sintezei s-a urmrit consumul de NH4Cl (Figura 5 A).

    n cazul leucinei derivatizate cu dou grupri silil, masa molecular exact pentru leucin fr marcare izotopic la azot este M=359. Masele caracteristice ale ionilor fragment ale leucinei cu coninut izotopic natural au valorile m/z 316, 302, 274, i respectiv 200. n cazul aminoacizilor mar-

  • 48

    cai cu 15N, att masa molecular ct i masele ionilor fragment cresc cu o unitate de mas (Figura 5 B).

    Figura 5. Sinteza de [15N]-leucin (A) Consumul de 15NH4Cl pe parcursul sintezei de [15N]-leucin. (B) Spectrul de mas al [15N]-Leucinei. DMTBS derivat, M = 360, cca 97 atom % 15N. NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorur la timpul zero, nainte de adugarea enzimelor. Din fiecare reac-tant s-a utilizat o cantitate de 8,2 mmol. Sinteza s-a declanat cu 205 U de leucin dehidrogenaz i

    110 U de glucozo dehidrogenaz.

    Sinteza de [15N]-L-Val Mediul de reacie pentru sinteza de [15N]-valin s-a realizat cu reactivii

    la concentraiile descrise la capitolul de materiale i metode. Pe tot parcur-sul sintezei s-a urmrit consumul de NH4Cl (Figura 6 A).

    Figura 6. Sinteza de [15N]-valin. (A) Consumul de 15NH4Cl pe parcursul sintezei de [15N]-valin. (B) Spectrul de mas al [15N]-valinei. DMTBS derivat, M = 346, cca 97 atom % 15N

    NH4Cl 100% s-a considerat cantitatea de clorur la timpul zero, nainte de adugarea enzimelor. Raportul molar al reactanilor (acid -ceto isovaleric:15NH4Cl )a fost de 1:1. Din fiecare reactant s-a utilizat o cantitate de 8,0 mmol. Sinteza s-a declanat cu 200 U de leucin dehidrogenaz i 125 U de glucozo-dehidrogenaz. S-au realizat cteva sinteze, raportul reactan-

  • 49

    ilor i randamentele sintezelor sunt prezentate n Tabelul 3. Cel mai mare randament s-a constatat n cazul sintezei de 12 mmol.

    Tabelul 3. Sinteze de [15N]-L-valin

    Reactani (mmol) Randamentul sintezei (%) Acid cetoisovaleric 15NH4Cl

    3,0 3,0 79 8,0 8,0 86 12,0 12,0 92

    Viteza de reacie este, i deci i consumul de clorur de amoniu este

    foarte mare n primele minute de sintez. Astfe