Détection des dangers microbiologiques par les

méthodes normalisées ou alternatives validées,

intérêts et limites

Bertrand LOMBARD

Coordinateur Appui scientifique et technique

AFSSA-LERQAP, Maisons-Alfort

tél: 01 49 77 26 96, mél: b.lombard@afssa.fr

Titre du diaporama

Plan

• Méthodes normalisées

• Méthodes alternatives validées

• Méthodes normalisées et validées dans le

contexte de l’accréditation des laboratoires et

de la réglementation européenne

2

Titre du diaporama

MÉTHODES NORMALISÉES

3

Titre du diaporama

Pourquoi normaliser ?

• Analyse microbiologique des aliments

– Très variable

• Analyte vivant

• Nature biologique des réactifs (milieux de culture, souches, AC)

– Résultats intimement liés au principe de la méthode

• Microbiologie conventionnelle (croissance bactérienne)

• En particulier pour le dénombrement bactérien

– Pathogènes alimentaires = danger direct pour les

consommateurs

Besoin de définir des méthodes de référence

Normalisation = voie privilégiée pour définir ces

méthodes de référence (consensus)

4

Titre du diaporama

Présentation (1)

• Normalisation des méthodes d’analyse

microbiologique des aliments

o Principalement aux niveaux européen et

international

• ISO/TC 34/SC 9 « Aliments – Microbiologie »

• CEN/TC 275/WG 6 « Analyse des aliments, méthodes

horizontales – Microbiologie »

• Sous responsabilité française

o + quelques normes de routine NF ( pathogènes)

o Suivi français: Commission AFNOR V08B

« Microbiologie des aliments »

5

Titre du diaporama

Présentation (2)

• Méthodes normalisées en microbiologie des aliments

− Domaine d’application étendu = méthodes « horizontales »

Tous aliments (homme, animaux)

Environnement de transformation/stockage, production primaire

+ quelques méthodes sectorielles

− Détection/dénombrement

Bactéries surtout

+ levures/moisissures, virus, parasites

− Principe analytique

− Microbiologie conventionnelle dans la plupart des cas

large applicabilité

− Introduction de technologies nouvelles

si microbiologie conventionnelle non satisfaisante

6

Titre du diaporama

Normes générales

• BPL microbiologie des aliments (NF EN ISO 7218)

• AQ/performance milieux de culture (NF EN ISO TS 11133-1&2)

• Préparation échantillons/suspension-mère/dilutions (NF EN ISO 6887-1 à 5)

• Validation de méthodes (NF EN ISO 16140)

• Incertitude de mesure en microbiologie quantitative (XP ISO/TS 19036)

• Essais d’aptitude/microbiologie des aliments (projet EN ISO/TS 22117)

7

Titre du diaporama

Méthodes de référence pour les pathogènes (1)

• Bactéries

– Salmonella

• détection (NF EN ISO 6579)

• Dénombrement/NPP miniaturisée (projet NF EN ISO/TS 13305)

• Sérotypage (projet)

– L. monocytogenes: détection & dénombrement (NF EN ISO 11290-1&2)

– Staphylocoques coagulase positive

• Détection & dénombrement TCC+NPP (NF EN ISO 6888-1,2&3)

• + entérotoxines (projet)

– Bacillus cereus: détection & dénombrement TCC+NPP (NF EN ISO 7932, NF EN ISO 21871)

• + toxines (projet)

– Clostridium perfringens: dénombrement TCC (NF EN ISO 7937)

8

Titre du diaporama

Méthodes de référence pour les pathogènes (2)

• Bactéries (suite)

– Campylobacter: détection & dénombrement TCC (NF EN ISO 10272-1,2&3)

– Escherichia coli O157: détection (NF EN ISO 16654)

– STEC: détection (projet NF EN ISO 13136)

– Vibrio: détection (NF EN ISO/TS 21872-1&2)

– Yersinia enterocolitica: détection (NF EN ISO 10273)

– Shigella: détection (NF EN ISO 21567)

– E. sakazakii (Cronobacter spp.): détection (XP ISO/TS 22964: lait&PL)

9

Titre du diaporama

Méthodes de référence pour les pathogènes (3)

• Virus dans les aliments et eaux embouteillées

– Virus hépatite A et norovirus (projet)

• Parasites (futur)

– Trichinella

– Cryptosporidium

– Giardia

10

Titre du diaporama

MÉTHODES ALTERNATIVES

VALIDÉES

11

Titre du diaporama

Pourquoi des méthodes alternatives validées ?

• Méthodes de référence – La plupart de microbiologie conventionnelle

Méthodes lourdes (main d’œuvre) et longues ( bactérien)

─ Processus de normalisation au niveau international = long (3/4 ans)

Développement méthodes alternatives − Faisant appel aux nouvelles technologies

− Brevetées/commerciales (kits)

− Plus rapides, moins lourdes (automatisées)

• Mais les utilisateurs ont besoin de garanties sur la performance de ces méthodes Systèmes de validation/certification par tierce partie

Processus moins long que normalisation (1-2 ans) En France: Validation AFNOR des méthodes alternatives

12

Titre du diaporama

Validation AFNOR des méthodes alternatives: présentation (1)

• AFNOR Certification

1.Etude expérimentale des performances de la

méthode

– Référentiel technique = Norme NF EN ISO 16140

– 2 protocoles: méthodes qualitatives et quantitatives

– 2 phases

• Etude intra-laboratoire (laboratoire expert)

• Essai inter-laboratoires

– Evaluation des résultats: Bureau Technique

(composition paritaire)

13

Titre du diaporama

Validation AFNOR des méthodes alternatives: présentation (2)

2. Exigences assurance qualité pour fabricant de

méthode

– Base: ISO 9001

– Audits réguliers du fabricants et de la ligne de

production de la méthode

Performance de la méthode = même niveau dans

le temps

• Certification: 4 ans renouvelables

• Liste méthode validées:

www.afnor-validation.org

14

Titre du diaporama

Validation AFNOR des méthodes alternatives: liste méthodes validées (1)

• Dénombrement staphylocoques

– 3 milieux de culture

• Détection Salmonella = 25 tests validés

– 4 milieux de culture

– 15 tests immuno-enzymatiques

– 1 test hybridation moléculaire

– 5 tests PCR

• Détection E. coli O157 = 6 tests validés

– 1 milieu de culture

– 2 tests immuno-enzymatiques

– 3 tests PCR

15

Titre du diaporama

Validation AFNOR des méthodes alternatives: liste méthodes validées (2)

• Détection Listeria spp. = 10 tests validés

– 2 milieux de culture

– 6 tests immuno-enzymatiques

– 2 tests PCR

• L. monocytogenes = 22 tests validés

– Détection

• 9 milieux de culture

• 4 tests immuno-enzymatiques

• 2 tests hybridation moléculaire

• 2 tests PCR

– Dénombrement

• 5 milieux de culture

16

Titre du diaporama

MÉTHODES NORMALISÉES

ET VALIDÉES

DANS LE CONTEXTE DE

L’ACCRÉDITATION DES

LABORATOIRES ET DE LA

RÉGLEMENTATION EUROPÉENNE

17

Titre du diaporama

Accréditation des laboratoires

• Norme NF EN ISO 17025 (2005)

• Article 5.4.5 sur validation des méthodes

Valider méthodes non normalisées

Inclut méthodes alternatives

• NF EN ISO 16140 = outil de choix en

microbiologie des aliments

– Si kits validés AFNOR, pas besoin de validation

par le laboratoire utilisateur

18

Titre du diaporama

Contexte réglementaire européen (1)

• Règlement CE 2073/2005 modifié: critères

microbiologiques des aliments

– Application du règlement 852/2004 (art. 4&12)

– Applicable

• Formellement aux exploitants de la chaîne alimentaire

• Indirectement/en partie aux contrôles officiels

– Pour chaque critère microbiologique (Annexe I)

1 méthode de référence = Norme EN ISO en général

19

Titre du diaporama

Contexte réglementaire européen (2)

• Utilisation méthodes alternatives = possible

– Disposition générale (art. 5)

– Conditions

• Méthode validée/méthode de référence en Annexe I

• Si commerciale, certifiée par tierce partie

• Selon EN ISO 16140 (ou tout autre protocole similaire

internationalement reconnu)

– Si kit validé AFNOR

• OK pour autocontrôles (et contrôles officiels en France)

vérifier conformité des produits aux critères

microbiologiques du règlement 2073/2005

20

Titre du diaporama

CONCLUSION

21

Titre du diaporama

• Pourquoi utiliser les méthodes de référence

normalisées ou les kits validés ?

Réduire les sources de variation

Faciliter la reconnaissance des résultats/contrôles

• Relation client/fournisseur

• Autocontrôles/reconnaissance par DDSV (PH)

• Contrôles officiels

• Commerce international

Base fiable pour

• Accréditation des laboratoires

• Critères microbiologiques réglementaires

(règlement 2073/2005)

22