mémoire Ephe Dip Denes Eme06

MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALEET DE LA RECHERCHE

ÉCOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDESSciences de la Vie et de la Terre

MEMOIRE

Présenté par

Aurélien DENES

Pour l’obtention du diplôme de l’Ecole Pratique des Hautes Etudes

ETUDE COMPARÉE DE L’EFFET DE DEUX PROTÉASES SURLA PRODUCTION D'HYDROLYSATS DOTÉS D'ACTIVITÉS

ANTIOXYDANTE ET ANTIRADICALAIRE.

Soutenu le 29 décembre 2006 : Devant le jury suivant : - Madame Jeanine LE RHUN - Président de jury- Monsieur Alain VAN WORMHOUDT - Examinateur- Madame Fabienne GUERARD - Examinateur- Madame Rozenn RAVALLEC-PLE – Examinateur et rapporteur

Laboratoire EPHEEvolution Moléculaire et Adaptation Directeur : Dr A. Van WormhoudtStation de Biologie Marine ([email protected])BP 22529182 CONCARNEAU

Laboratoire d'accueil ANTiOX – Université de Bretagne Occidentale Directrice et Maître de stage :Pôle universitaire P.J. Helias Dr F. GuérardCreac’h Gwen ([email protected])29000 QUIMPER

RÉSUMÉ L’objectif de ce mémoire est la production d’hydrolysats de filets de lieu noir dotés d’activitésantioxydante et antiradicalaire, ceci à l’aide de protéases commerciales dont les activités enzymatiques ontété préalablement standardisées. Les hydrolysats de protéines de poisson présentent un intérêt en raison deleurs propriétés fonctionnelles et biologiques. Au cours des dernières années, un grand nombre d’hydrolysats

EPHE Banque de Monographies SVT 1

générés à partir de co-produits de la pêche ont montré diverses activités: hormonales, stimulatrices decroissance, immuno-modulatrices, anti-hypertensives, antioxydantes. La standardisation des activités enzymatiques a été mise au point sur un substrat caséine et a permisde sélectionner deux préparations enzymatiques commerciales pour la suite de l’étude : l’Alcalase® 2.4 L etl’Espérase® 8.0 L. Des hydrolyses contrôlées en réacteur enzymatique ont été réalisées sur le lieu noir dansles conditions optimales d’activité des enzymes utilisées, soit à pH 8 et 55°C. Les cinétiques ont été suiviespour différents ratios Enzyme/Substrat (E/S) par l’évaluation du degré d’hydrolyse (DH %) selon la méthodedu pH-stat. Les DH pH-stat (%) obtenus avec l’Alcalase® 2.4 L sont légèrement supérieurs à ceux obtenusavec l’Espérase® 8.0 L. Une étude comparative du calcul du DH par deux autres méthodes a montré que laméthode à l’ortho-phtaldialdéhyde (OPA) permet d’obtenir des valeurs de DH proches des valeurs du DHpH-stat, les valeurs du DH Kjeldahl étant plus élevées. Une étude mécanistique des facteurs limitants del’hydrolyse a ensuite été initiée pour expliquer l’allure des courbes d’hydrolyse obtenues. Il en ressort que lesubstrat est le principal facteur limitant de l’hydrolyse. Une légère désactivation des deux enzymes ainsiqu’une faible inhibition de ces deux enzymes par les produits de l’hydrolyse sont également observées.

Les profils chromatographiques obtenus à l’aide de l’exclusion stérique (SEC-FPLC) ont permis deconfirmer les différences de DH observées pour les deux enzymes étudiées. Comparativement à l’Espérase®

8.0 L, l’Alcalase® 2.4 L permet en effet d’obtenir une hydrolyse plus poussée et donc une proportion plusimportante en peptides de faible poids moléculaire. Les activités antiradicalaires évaluées à l’aide du test auDPPH. sont faibles (inférieures à 10 %). Inversement, les activités antioxydantes évaluées par le test au ène –acide linoléique sont élevées et se situent en moyenne entre 60 et 65 %. L’influence des paramètres del’hydrolyse (temps de réaction, ratio Enzyme/Substrat) sur les activités biologiques obtenues n’a pas pu êtremise en évidence. Cependant, les valeurs d’activité du blanc d’hydrolyse (sans enzyme) se sont avéréesnulles, on peut en conclure que les activités obtenues ici sont donc exclusivement dues à l’hydrolyseenzymatique.

Ces hydrolysats dotés activités biologiques voient leur intérêt croître et se retrouvent de plus en plus

sur des marchés en plein essor comme la nutraceutique, les aliments fonctionnels ou bien la cosmétologie.

MOTS-CLES : Hydrolyse enzymatique, degré d’hydrolyse, Alcalase® 2.4 L, Espérase® 8.0 L, activitéantioxydante, peptides, lieu noir, chromatographie d’exclusion stérique.

TABLE DES MATIERES

TABLE DES MATIERES....................................................................................................... 3LISTE DES ABREVIATIONS.............................................................................................. 5INTRODUCTION................................................................................................................... 6 ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE.............................................................................................. 8

I. La valorisation des co-produits de la pêche..................................................................... 8I.1. Etat des lieux................................................................................................................ 8I.2. Les différentes voies de valorisation des co-produits................................................ 8I.3. Les principales applications des hydrolysats............................................................ 9

I.3.1. L’alimentation......................................................................................... 9I.3.2. Les peptones.......................................................................................... 10

II. L’hydrolyse des protéines.............................................................................................. 10II.1. Les différents types d’hydrolysats enzymatiques................................................. 11

II.1.1. Les produits fermentés et les autolysats............................................... 11


II.1.2. Les hétérolysats................................................................................... 11II.2. La classification des enzymes.................................................................................. 11

II.2.1. Les endopeptidases.............................................................................. 12II.2.2. Les exopeptidases................................................................................ 12

II.3. L’utilisation d’enzymes exogènes............................................................................ 12II.3.1. Les enzymes d’origine végétale............................................................ 13II.3.2. Les enzymes d’origine animale............................................................ 13II.3.3. Les enzymes d’origine microbienne..................................................... 13

II.4. L’activité enzymatique............................................................................................. 14II.5. Caractérisation de l’hydrolysat............................................................................... 15

II.5.1. Le degré d’hydrolyse........................................................................... 15II.5.2. La caractérisation des hydrolysats par chromatographie................... 16

III. L’activité antioxydante et antiradicalaire................................................................... 17III.1. Les radicaux libres.................................................................................................. 17

III.1.1. Production endogène.......................................................................... 17III.1.2. Production exogène............................................................................ 18

III.2. Le stress oxydatif.................................................................................................... 18III.3. Les moyens de défense contre les radicaux libres................................................ 20

III.3.1. Moyens endogènes.............................................................................. 20III.3.2. Moyens exogènes................................................................................ 20

III.4. Les antioxydants..................................................................................................... 20III.4.1. Mode d’action des antioxydants......................................................... 20III.4.2. Antioxydants naturels et de synthèse................................................... 21III.4.3. Les peptides antioxydants et antiradicalaires d’origine marine......... 22

III.5. L’évaluation de la capacité antioxydante in vitro................................................. 24 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES............................................................................ 27

AAO : Activité antioxydanteAAR : Activité antioradicalaireAC50 : Concentration en protéines qui permet d’obtenir 50 % d’activité antioxydante

AGPI : Acide gras poly-insaturéASC : Aire sous la courbeASR : Analyse de surface de réponseBHA : Butylated hydroxyanisoleBHT : Butylated hydrotolueneCAT : CatalaseDH : Degré d’hydrolyseDPPH : 1,1-diphényl-2-picrylhydrazylEC : Enzyme commissionERO : Espèces Réactives de l’OxygèneE/S : Rapport enzyme sur substrat


FPC : Fish protein concentrateFPH : Fish protein hydrolysateGPX : Glutathion peroxydaseHAT : Hydrogen atom transferOPA : Ortho-PhtaldialdéhydePM : Poids moléculaireSEC : Size exclusion chromatographySET : Single electron transferSOD : Superoxyde dismutaseTCA : Acide trichloroacétiqueTNBS : Acide trinitrobenzenesulfoniqueTROLOX : Acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tetraméthylchroman-2-carboxyliqueUA : Unité arbitraireUT : Unité tyrosine

INTRODUCTION Les ressources mondiales extraites du milieu aquatique représentent plus de 130 millions de tonnespar an. Suivant les espèces considérées et le mode de transformation adopté, ces ressources générent parannée de 30 à 85 % de déchets appelés co-produits (têtes, peaux, viscères…) (FAO-Sofia 2004).

Les nouvelles contraintes de gestion des ressources halieutiques imposent d’adopter de nouvellesstratégies de valorisation des co-produits. Actuellement, ces derniers sont principalement transformés enfarine et en huile mais c’est une transformation à faible valeur ajoutée. Aussi, le circuit d’élimination des co-produits de la filière pêche et aquaculture en France a subi de fortes perturbations depuis l’année 2000,notamment liées aux répercussions des difficultés apparues dans les filières animales (encéphalopathiespongiforme bovine, dioxines). L’amélioration des performances économiques de la filière à travers unemeilleure valorisation s’avère donc nécessaire (OFIMER, 2004).

L’hydrolyse enzymatique appliquée aux co-produits marins dans le but de produire de nouveaux

actifs constitue l’une des voies possibles pour mieux valoriser ces ressources. Ce procédé permet larécupération de protéines qui conservent leur teneur en acides aminés essentiels et sont susceptibles deposséder des fonctions biologiques. Ce travail s’inscrit dans une approche innovante par rapport aux travauxantérieurs de valorisation de la biomasse d’origine marine, qui portaient principalement sur les aspectsnutritionnels et fonctionnels des hydrolysats.

Ce mémoire a donc pour objectif la production d’hydrolysats de filets de lieu noir dotés d’activités

antioxydante et antiradicalaire, ceci à partir de protéases commerciales préalablement standardisées sur unsubstrat caséine. Le choix de filets de lieu noir comme modèle se justifie par une réalité industrielle devalorisation des carcasses de poisson obtenues après les procédés de filetage.

L’hydrolyse enzymatique préalable sur un substrat caséine permet de standardiser les activités

enzymatiques des préparations commerciales utilisées avant les hydrolyses sur le lieu noir. Ainsi, les unitésd’expression de l’activité enzymatique sont établies à partir d’une même base de référence. La grandemajorité des travaux actuels sur le sujet ne relate qu’une comparaison des protéases entre elles selon le poidsou le volume utilisé, ce qui n’est pas très réaliste. En effet, les unités d’expression de l’activité enzymatiqueemployées par les différents fournisseurs varient selon les enzymes et les conditions opératoires.

Les hydrolyses sur le lieu noir ont été réalisées à partir de deux préparations commerciales :

l’Alcalase® 2.4 L et l’Espérase® 8.0 L. Leur suivi a été réalisé par l’évaluation du degré d’hydrolyse (DH %)selon la méthode du pH-stat. Cette méthode a été comparée avec celle de Kjeldahl et celle à l’ortho-phtaldialdéhyde (OPA). Une étude mécanistique des facteurs limitants de l’hydrolyse a ensuite été initiéepour expliquer l’allure des courbes d’hydrolyse obtenues.

La caractérisation des hydrolysats par chromatographie d’exclusion stérique (SEC-FPLC) a permis


d’obtenir la répartition des peptides produits suivant leur poids moléculaire. L’activité antiradicalaire a étédéterminée à l’aide du test au DPPH. et l’activité antioxydante à partir du test au ène – acide linoléique.L’influence des paramètres de l’hydrolyse (temps de réaction, ratio Enzyme/Substrat) sur ces activités a étéétudiée.

ETUDE BIBLIOGRAPHIQUE

I. La valorisation des co-produits de la pêche

I.1. Etat des lieux

Les ressources mondiales extraites du milieu aquatique représentent plus de 130 millions de tonnespar an : environ 100 millions de tonnes sont issues du milieu marin et environ 30 millions de tonnes sontissues de l’eau douce ; ces deux domaines comprenant chacun captures et aquaculture.La quantité de déchets que peuvent générer par an ces 130 millions de tonnes de ressource est estimée entre30 et 85 % suivant les espèces considérées et le mode de transformation adopté (FAO-Sofia 2004).

On nomme co-produits les déchets solides issus de la transformation de la matière première, ceux-ciincluant : les têtes, les viscères, la peau, les arêtes, la chair restante sur les carcasses, les chutes de filetage,les carapaces, les coquilles etc… En France, le tonnage brut de poissons donnant lieu à des co-produits a étéestimé à 320 000 T en 2002. Le tonnage correspondant de co-produits a été estimé à 150 000 T, soit 47 % dutonnage brut (OFIMER, 2004).

En situation de rareté durable de la ressource, il est regrettable que les co-produits soient dans leurensemble si peu valorisés. Aussi, le circuit d’élimination des co-produits de la filière pêche et aquaculture enFrance a subi de fortes perturbations depuis l’année 2000, notamment liées aux répercussions des difficultésapparues dans les filières animales (encéphalopathie spongiforme bovine, dioxines). L’amélioration desperformances économiques de la filière à travers une meilleure valorisation des co-produits générés par lesactivités de mareyage, conserverie et saurisserie est donc nécessaire (OFIMER, 2004).

I.2. Les différentes voies de valorisation des co-produits

Aujourd’hui, en France, la pêche et l’aquaculture valorisent la quasi-totalité de leurs co-produits versdes utilisations de faible valeur ajoutée : 96 % des co-produits d’origine aquatique générés en France fontl’objet d’une valorisation de masse sous forme de farine et d’huile (52 %), d’hydrolysats de protéines (21%), de hachis congelés (23 %), et divers (4 % : production d’aromes, de gélatine, de collagène, dechondroïtine-sulfate, de cuir…) (OFIMER, 2004). Les composés à forte valeur ajoutée représentent doncmoins de 10 % du marché.

Traditionnellement, la plupart des co-produits de l’industrie de la pêche a été convertie en huile ou en

farine de poisson par un procédé combinant la cuisson, la séparation des solubles et des insolubles, laconcentration des solubles et la déshydratation des insolubles (Benjakul et al., 1997). Les huiles marines,riches en acides gras essentiels, deviennent de plus en plus recherchées dans les domaines pharmaceutiques,de l'industrie cosmétique, et en tant que compléments alimentaires. Les farines ou concentrés protéiques depoisson (Fish Protein Concentrates ou FPC) possèdent de bonnes valeurs nutritives et une grande teneur enacides aminés essentiels mais sont peu solubles et possèdent peu de propriétés fonctionnelles. Ils sontcouramment utilisés en alimentation animale comme compléments protéiques mais peuvent causer desinconvénients liés à leur forte teneur en sels minéraux et nécessitent par ailleurs de gros investissements etune consommation importante d’énergie. Ils constituent donc une voie de valorisation à faible valeur ajoutée.

L’image positive des produits marins et le dynamisme de la recherche dans le secteur permettent

d’envisager un bon positionnement des filières pêche et aquaculture dans les marchés de la cosmétique, de ladiététique et de la nutraceutique. Les avancées scientifiques sur la composition chimique des co-produits eten particulier sur le process d’hydrolyse enzymatique laissent entrevoir de nouvelles voies de valorisation àplus forte valeur ajoutée : extraction de lécithines marines, de peptones (pouvant constituer des substratsazotés pour la culture bactérienne) et de nombreuses substances bioactives intéressantes (OFIMER, 2004).Ces hydrolysats de protéines de poisson (FPH ou Fish Protein Hydrolysates) peuvent être déshydratés : onobtient alors une poudre contenant une forte teneur en protéines et présentant comparativement aux FPC une


meilleure stabilité, de meilleures propriétés fonctionnelles, une meilleure solubilité dans l’eau, et des propriétés émulsifiantes. Les coûts de production sont sensiblement supérieurs dans le cas des hydrolysats etles rendements sont légèrement inférieurs en raison de l’élimination des résidus d’arêtes insolubles, mais lavaleur ajoutée est beaucoup plus élevée.

I.3. Les principales applications des hydrolysats I.3.1. L’alimentation Les hydrolysats protéiques de poisson peuvent être utilisés en alimentation humaine ou animalepour leurs propriétés aromatiques, fonctionnelles ou nutritionnelles. Ø Les hydrolysats peuvent être utilisés comme base aromatique, notamment dans les soupes de poissons

et de crustacés. Les petits peptides et les acides aminés jouent un rôle important dans la saveur duproduit.

Ø Les propriétés fonctionnelles recherchées pour la formulation d’un aliment sont la solubilité, la

dispersabilité, les capacités moussantes et émulsifiantes et le pouvoir de rétention de l’eau et desmatières grasses. Ces différentes propriétés sont dues à 3 effets distincts qui accompagnentl’hydrolyse : la diminution du poids moléculaire, l’augmentation du nombre de groupes ionisables etl’exposition de groupes hydrophobes jusqu’ici dissimulés (Panyam et Kilara, 1996).

Ø Les hydrolysats peuvent servir de compléments protéiques en alimentation animale et humaine. Ils

permettent une meilleure assimilation des acides aminés. De plus, leur teneur en acides aminésessentiels est supérieure ou égale à celle de la protéine standard du FAO/WHO (Barzana et Garcia-Garibay, 1994 cités par Diniz et Martin, 1997 b).

Ø En alimentation humaine, en 1990, Yu et al. ont démontré que l’utilisation d’hydrolysats de protéines

d’Oreochromis mossambicus dans les crackers (biscuits secs salés) améliore l'apparence, lecroustillant et la couleur. En 1992, des biscuits de poisson ont été développés pour compléter l’apporten protéines nécessaires aux enfants dans les régions économiquement pauvres sur la côte Est de lapéninsule Malaisienne (Yu et al.). En 1994, un hydrolysat d’Aristichthys nobilis séché est proposépour son utilisation comme supplément de protéine dans des produits alimentaires populaires chinoiscomme des crackers de poisson, des nouilles de poisson et des boules de poisson (Yu et al., 1994). Anoter par ailleurs, que pour la FAO, un hydrolysat de protéines de poisson utilisable dans laconsommation humaine ne doit pas contenir plus de 0,5 % de lipides (w/w) dans le produit fini.

I.3.2. Les peptones

Les peptones sont des fractions d’hydrolysats non coagulables et non précipitables à la chaleur, ce quipermet leur utilisation en microbiologie. La croissance du domaine des biotechnologies ces dernières annéesa entraîné une demande plus forte concernant les milieux de culture en microbiologie. Jusqu’à présent, lacaséine et les déchets d’abattoirs représentaient les seules principales sources de peptones de haute qualité.Les différents travaux utilisant des protéines de poisson hydrolysées dans des milieux de culture demicroorganismes font tous état d’une diminution du temps de latence ou d’une augmentation de la biomasseobtenue. Les peptones de poisson, grâce à leur bonne valeur nutritionnelle, se retrouvent aujourd’hui de plusen plus référencées dans les catalogues des fournisseurs (Dufossé et al., 1997).

II. L’hydrolyse des protéines

L’hydrolyse est une approche alternative pour réhabiliter les co-produits d’origine marine et quipermet d’obtenir à partir de ceux-ci des produits pouvant présenter de nouvelles propriétés fonctionnelleset/ou biologiques.

L’hydrolyse des protéines peut être obtenue par deux méthodes : l’hydrolyse chimique ou

enzymatique (Guérard et al., 2005).


§ L’hydrolyse des protéines par des produits chimiques forts ou des solvants (acides ou basiques) estsouvent réalisée dans des conditions drastiques : elle est améliorée à des températures, pressions etpH élevés. Une hydrolyse chimique ne peut pas être contrôlée. On obtient donc généralement unmélange d’acides aminés libres, ayant une valeur nutritionnelle réduite et de faibles propriétésfonctionnelles. Ces produits jouent alors plutôt le rôle d’exhausteurs de flaveur et de goût pour laviande, les gâteaux secs ou les soupes (Kristinsson et al., 2000a).Après acidification, l’hydrolysat acide est neutralisé, ce qui a pour conséquence la présence d’uneforte concentration en sels dans le produit final qui devient alors difficilement tolérable en bouche.L’hydrolyse acide détruit également le Tryptophane.

Dans le cas de l’hydrolyse alcaline, des réactions délétères sont observées au cours de l’hydrolysealcaline telles que la racémisation des L-acides aminés en D-AA non absorbés par l’homme, laformation de liaisons disulfures, la destruction de certains acides aminés (Cystéine, Cystine,Arginine, Méthionine). Un avantage cependant : le collagène présente une solubilité élevée enmilieu basique.

§ Lors de l’hydrolyse enzymatique, les liaisons peptidiques des protéines sont clivées en milieuaqueux, la réaction étant catalysée par des protéases. Un équivalent d’un groupement a-carboxylainsi qu’un groupe a-aminé est formé par le clivage d’un équivalent d’une liaison peptidique. Anoter que les peptides nouvellement formés peuvent être de nouveaux substrats pour l’enzyme(Adler-Nissen, 1976).

II.1. Les différents types d’hydrolysats enzymatiques

La production d’hydrolysats de protéines de poisson peut être réalisée de deux manières différentes

(Roy et Durand, 1997). D’une part, on trouve des hydrolysats traditionnels avec les produits fermentés et lesautolysats ; et d’autre part, on trouve les hétérolysats.

II.1.1. Les produits fermentés et les autolysats

Les produits fermentés et les autolysats font intervenir dans le processus de transformation les

enzymes endogènes présentes dans les produits de départ. § La fermentation est un moyen traditionnel utilisé pour conserver le poisson, puisqu’elle permet de

limiter certaines proliférations bactériennes par addition de sel ou de sucre. Elle permet en revanchele développement de bactéries lactiques. Les protéines sont hydrolysées par les enzymes endogèneset les bactéries naturellement présentes dans le mélange (Ockerman, 1992).

§ Les autolysats sont élaborés en plusieurs étapes à partir de poissons entiers ou de viscères.

L’autolyse est réalisée par les enzymes endogènes, principalement les protéases digestives (pepsine,trypsine, chymotrypsine) ainsi que par les enzymes tissulaires (enzymes lysosomales oucatepthiques).

Le produit résultant de ces deux techniques est généralement un liquide assez visqueux riche en

acides aminés libres et en petits peptides. Ce produit traditionnel est à la base de l’alimentation de certainespopulations du sud-est asiatique appréciant les aliments à goût de poisson prononcé : le Nuoc-mam ou saucede poisson saumuré (Viet-nam), le Nam-pla (Thaïlande), le Mam-tom (Chine), le Shiokara (Japon)…

II.1.2. Les hétérolysats

Les hétérolysats sont des hydrolysats obtenus à l’aide de différentes préparations enzymatiquescommerciales et dans des conditions contrôlées permettant d’améliorer les propriétés fonctionnelles du


produit tout en conservant sa valeur nutritionnelle (Shahidi, 1995). Le paragraphe II.3 nommé "l’utilisationd’enzymes exogènes" développe cette partie.

II.2. La classification des enzymes

Les enzymes utilisées pour l’hydrolyse des protéines sont classées en tant que protéases et se voientattribuer les nombres E.C 3.4. dans la classification internationale « Enzyme Commission ». Dans l’hydrolyseenzymatique, le taux de clivage des liaisons peptidiques dépend principalement de deux facteurs: laspécificité de l’enzyme et l’accessibilité aux liaisons peptidiques (Adler-Nissen, 1986). Parmi les enzymesprotéolytiques nommées protéinases, protéases, ou peptidases, on retrouve deux groupes : les endopeptidaseset les exopeptidases.

II.2.1. Les endopeptidases Elles agissent au coeur de la chaîne protéique, coupant la protéine en fragments plus petits. La liaisonentre deux acides aminés adjacents dans la séquence primaire est rompue donnant ainsi naissance à deuxpeptides. Ces enzymes sont classées selon leur mécanisme catalytique: sérine, cystéine (thiol), acideaspartique et métallo-endopeptidases. Les endopeptidases sont les enzymes les plus utilisées pour l’hydrolysedes protéines alimentaires de par leur plus large spécificité (Kristinsson et Rasco, 2000a).

II.2.2. Les exopeptidases

Ces enzymes hydrolysent les liaisons peptidiques par les extrémités libres de la chaîne protéique. Eneffet, elles ont besoin d’un groupe aminé ou carboxyle terminal libre dans le substrat pour libérer des acidesaminés ou des petits peptides (2-3 acides aminés), elles sont alors nommées respectivement aminopeptidasesou carboxypeptidases. Les exopeptidases sont classées selon leur mode d’action. Elles peuvent par ailleursêtre combinées aux endopeptidases pour réaliser une dégradation plus complète. En effet, ceci permet dedégrader les petits peptides hydrophobes à l’origine de l’amertume des hydrolysats en acides aminés libresmoins amers (Stevenson et al., 1998).

II.3. L’utilisation d’enzymes exogènes Les différentes enzymes mises en jeu lors de la préparation des hydrolysats enzymatiques sont

principalement des enzymes d’origine commerciale (enzymes exogènes), ajoutées à la préparation afind’accélérer le processus d’hydrolyse. Ce sont ces dernières qui nous intéressent ici.

L’hydrolyse accélérée utilisant une enzyme unique ou un mélange de protéases commerciales

présente de nombreux avantages tels que le contrôle de l’hydrolyse et des propriétés de l’hydrolysat, etl’utilisation d’une température de catalyse modérée (Diniz et Martin, 1996). L’hydrolyse enzymatiquepermet, en effet, d’obtenir des produits protéiques solubles avec de bonnes propriétés fonctionnelles (sansdétériorer leurs valeurs nutritives) et susceptibles d’être utilisés en alimentation humaine ou animale. Ellepermet également de contrôler la formation de peptides amers et de maintenir une qualité uniforme et unereproductibilité du produit (Liceaga-Gesualdo et al., 1999).

L’utilisation d’enzymes exogènes augmente aussi de manière significative la quantité de protéineslibérées en comparaison avec l’autolyse. Shahidi et al. (1995) rapportent que l’utilisation d’enzymesendogènes pour hydrolyser du capelan (Mallotus villosus) permet de libérer 22,6 % de protéines, alors quel’hydrolyse par l’Alcalase® 2.4 L aboutit à la libération de 70,6 % de protéines.

L’hydrolyse enzymatique est une méthode appropriée pour la préparation de peptides à façon, non

seulement à cause de la disponibilité d’enzymes à grande échelle et à des coûts de plus en plus modérés,mais aussi grâce à la grande qualité de ces produits. Un avantage très important est la possibilité de pouvoirdiriger l’hydrolyse vers des peptides particuliers souhaités en utilisant des enzymes avec des spécificitésdéterminées. L’hydrolyse enzymatique est aussi sous l’influence d’autres paramètres de contrôle tels que latempérature, le pH, le ratio Enzyme/Substrat (E/S) et le temps d’hydrolyse (Liaset et al., 2000).

II.3.1. Les enzymes d’origine végétale

Les protéases d’origine végétale les plus connues sont la papaïne, la bromélaïne, et la ficine. Ces


protéases permettent d’obtenir des hydrolysats de bonne qualité mais leur production dépend de nombreuxfacteurs externes tels que les conditions de culture, le cycle de croissance, les recommandations climatiques,ce qui peut susciter des problèmes de coût et d’approvisionnement. Ces enzymes ne sont pas spécifiques. Laficine s’avère peu stable dans le temps. La papaïne, plutôt adaptée à des protéines prédigérées, peut conduireau stade acide aminé libre et poser des problèmes d’amertume (Durand, 1982).

II.3.2. Les enzymes d’origine animale

Les enzymes d’origine animale (porcine et bovine) sont principalement la trypsine, lachymotrypsine, issues du pancréas et la pepsine, issue de la muqueuse gastrique. Ces trois enzymes sont desendoprotéases présentant des spécificités différentes. La trypsine a une affinité pour la lysine et l’arginine, lachymotrypsine pour les acides aminés aromatiques (Phe, Tyr, Trp) et la pepsine principalement pour lesacides aminés hydrophobes (Alder-nissen, 1982). La pepsine est l’enzyme d’origine animale la pluslargement utilisée. Son utilisation à pH acide présente l’avantage de limiter la contamination microbiennemais l’étape de neutralisation entraîne de hautes teneurs en cendres préjudiciables pour déboucher sur laproduction de peptones (Dufossé et al., 1997). De plus, la pepsine peut conférer un goût amer auxhydrolysats (De gero et al., 1971).

II.3.3. Les enzymes d’origine microbienne

Les enzymes microbiennes présentent plusieurs avantages par rapport aux enzymes d’origineanimale ou végétale : leurs types d’activité catalytique sont plus variés, leur stabilité face aux variations detempérature et de pH est meilleure. De ce fait, elles représentent aujourd’hui environ 90 % des enzymesproduites pour les procédés industriels. L’hydrolyse par l’Alcalase® 2.4 L a été étudiée par de nombreux auteurs et son efficacité est bien souventmeilleure que celle des autres enzymes. Quaglia et Orban (1987) ont étudié l’hydrolyse de sardine par l’Alcalase® 2.4 L, la papaïne et laneutrase dans leurs conditions optimales de pH et de température. Il s’est avéré que l’Alcalase® 2.4 L et lapapaïne permettent d’obtenir les meilleurs résultats en terme de rendement en azote. Les hydrolysatspossèdent de fortes teneurs en protéines, de bonnes valeurs nutritionnelles et une bonne solubilité. Benjakul et al. (1997) ont défini les conditions optimales pour hydrolyser des déchets de merlan parla Neutrase et l’Alcalase® 2.4 L. Cette dernière est la plus efficace et permet d’atteindre, dans ses conditionsoptimales, un degré d’hydrolyse de 60 % et un rendement en azote de 70 %. Martin et Porter (1995) ont mis au point les différents paramètres (température, temps d’hydrolyse,pH, ratio enzyme/substrat) de l’hydrolyse du capelan mâle entier par l’Alcalase® 2.4 L. Ils ont obtenu unhydrolysat riche en protéines, pauvre en lipides et à faible odeur.

Hoyle et Merritt (1994) ont hydrolysé du hareng par l’Alcalase® 2.4 L et la papaïne. L’Alcalase® 2.4L permet d’obtenir un meilleur degré d’hydrolyse avec une amertume plus faible. Diniz et Martin (1997b) ont optimisé l’hydrolyse de roussette par l’Alcalase® 2.4 L en modélisant ledegré d’hydrolyse (DH) en fonction de trois paramètres : pH, température et ratio enzyme/substrat. Un DHavoisinant les 19 % est obtenu avec un ratio enzyme/substrat de 3,6 % à 56°C et à pH 8,3. Guérard et al., en 2001 et en 2002, ont utilisé respectivement l’Alcalase® 2.4 L et l’Umamizyme®

pour l’hydrolyse de co-produits de thon tropical. Ils montrent que les deux enzymes ont une efficacité prochemais que l’Alcalase® 2.4 L présente une meilleure stabilité face à la température et une plus faible sensibilitéface à l’inhibition par les peptides solubilisés au cours de l’hydrolyse.

II.4. L’activité enzymatique

Les activités enzymatiques déclarées par les fournisseurs sont souvent obtenues dans des conditionsdifférentes des conditions opératoires utilisées par les chercheurs. Ces derniers déplorent d’ailleurs le fait queles activités enzymatiques déclarées ne le sont alors qu’à titre indicatif (Kristinsson et Rasco, 2000a).


Comparer l’activité des enzymes en fonction du volume ou du poids ajouté n’a aucune réalité. En effet,les activités enzymatiques rapportées à la quantité d’enzyme utilisée diffèrent selon les enzymes et lesconditions opératoires. Un certain nombre de méthodes ont donc été développées pour standardiser lesactivités enzymatiques à partir d’un substrat défini, et ce, avant les hydrolyses sur le substrat d’intérêt.

La méthode la plus ancienne utilise comme substrat la caséine ou l’hémoglobine. L’hydrolyse peutêtre réalisée dans les conditions de pH et de température souhaitées sauf au pHi du substrat. La déterminationde l’activité catalytique se fait par dosage (Lowry) des acides aminés Tyrosine libérés dans le surnageant aucours de l’hydrolyse. Une unité d’activité correspond alors à la quantité d’enzyme nécessaire pour produireen une minute et dans des conditions précises (pH et température) un hydrolysat dont l’absorbance à X nmest la même qu’une solution de tyrosine contenant Y µg (ou µmol) de tyrosine par mL.

Il existe également une méthode colorimétrique utilisant des peptides p-Na (para-nitroanilide) et uneméthode fluorimétrique utilisant des peptides-AMC (aminométhylcoumarine) comme substrats. L’utilisationde cette dernière méthode dépend de l’activité que l’on veut mettre en évidence (exemple : Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC pour une activité endoprotéinase ; Leu-AMC, Ala-AMC, Gly-Pro-AMC pour une activitéaminopeptidase). La difficulté est donc de choisir le substrat permettant de définir une activité enzymatiquenon spécifique. C’est une méthode utilisée par exemple pour les Sérine-protéases (Chymotrypsine, Trypsine,Elastase) et la détection d’activités aminopeptidases. Aspmo et al. (2004) déclarent que ce type de substratn’est pas optimal pour toutes les préparations enzymatiques commerciales, et en particulier pour la Neutrase.

Un substrat protéique synthétique, l’Azocoll, peut aussi être utilisé. C’est une préparation

majoritairement constituée de collagène (Kristinsson et Rasco, 2000a et b). C’est un test simple et donnantdes résultats qualitativement similaires à la caséine (Ferreira et Hultin, 1994). Ces derniers ont égalementutilisé l’Azocoll pour déterminer les caractéristiques cinétiques de l’enzyme (pH et température optimum).

En conclusion, quelle que soit la méthode choisie, le principal est d’utiliser un substrat standard et detravailler dans les conditions optimales de pH et de température de l’enzyme étudiée. Ces conditionsoptimales doivent être identiques à celles utilisées par la suite pour le substrat d’intérêt, sans quoi il devientdifficile de relier les informations obtenues ; c’est pourtant le problème majeur que l’on retrouve dans lalittérature sur le sujet. Il est également important de bien établir comment est attribuée la correspondanceactivité protéolytique/quantité de composé libéré. Cependant, les méthodes utilisant les peptides p-Na ou lespeptides-AMC permettent difficilement de déterminer l’activité protéolytique globale d’une enzyme. Laméthode Azocoll est une méthode coûteuse, non reproductible selon les lots, encore peu développée et quipose le problème de l’arrêt rapide de la réaction. La méthode utilisant comme substrat la caséine est la plusintéressante car moins contraignante que celle utilisant l’hémoglobine. C’est une méthode longue, un peu"laborieuse" mais fiable, et avec des protocoles bien définis.

II.5. Caractérisation de l’hydrolysat

Un hydrolysat enzymatique est décrit selon trois caractéristiques :

la source de protéines à l’origine de l’hydrolysat (substrat) fournit une information de base quant à lacomposition en acides aminés,

le degré d’hydrolyse (DH) est une valeur numérique (%) illustrant l’étendue de la coupure de laprotéine générée par la réaction,

le profil de poids moléculaire (PM) quantifie la proportion (%) de peptides formés en fonction de leurtaille.

II.5.1. Le degré d’hydrolyse

Différentes méthodes de mesure permettent de déterminer le degré d’hydrolyse des liaisonspeptidiques. Les différentes méthodes retrouvées dans la littérature sont, pour la plupart, basées sur troisprincipes différents :

§ le dosage de la quantité d’azote libéré (par la méthode du Kjeldahl par exemple) au cours de la


protéolyse et resté soluble en présence d’un agent précipitant, comme l’acide trichloracétique TCA(Sathivel et al., 2003),

§ la détermination des groupement és libres par dosage spectrophotométrique par l’acide

trinitrobenzesulfonique TNBS (Adler-Nissen, 1986) ou par l’o-phtaldialdéhyde OPA (Nielsen et al.,2001),

§ la titration des protons libérés par la méthode du pH-stat, basée sur le maintien d’un pH constant par

titration continue et automatique d’une base ou d’un acide. Dans cette méthode, le degré d’hydrolyseest déterminé par le nombre de liaisons peptidiques coupées (h) sur le nombre total de liaisons (htot)(Adler-Nissen, 1986). En milieu basique, pour des pH compris entre 6 et 9.5, le groupe aminé seraplus ou moins dissocié, libérant ainsi des ions H+ qui seront neutralisés par les ions OH- provenant dupH-stat. Le coefficient de dissociation du groupe aminé va donc déterminer le facteur decorrespondance entre le nombre de liaisons coupées et le nombre de moles de base utilisées pourmaintenir le pH constant. Adler-Nissen, en 1986, a établi la formule suivante concernant le degréd’hydrolyse (DH) :

DH (%) = h = B.Nb x 100 htot Mp . htot .

Avec B : quantité de base consommée (en mL) pour maintenir le pH constant, Nb : normalité de la base, Mp : masse de protéines (en g), htot : nombre total de liaisons peptidiques dans la protéine,

= (10 pH-pK) / (1 + 10pH-pK), et pK = 7.8 + ((298 – T) / (298 × T)) × 2400, avec T = température en Kelvin.

Le dosage de la quantité d’azote libéré par la méthode de Kjeldahl est relativement fastidieux et

nécessite d’importants volumes d’échantillon. Par ailleurs, celui-ci ne peut s’effectuer en continu lors duprocess d’hydrolyse. Cependant, cette méthode a été utilisée avec succès sur des protéines de poisson (Hoyleet Merritt, 1994 cités par Kristinsson et Rasco, 2000a) et sur d’autres protéines alimentaires où, pourl’hydrolyse de lactosérum par la trypsine, une bonne corrélation a été relatée avec la méthode du pH-stat(Margot et al., 1994, cités par Panyam et Kilara, 1996).

La méthode du pH-stat constitue la méthode de référence car elle est utilisée par de nombreux

auteurs pour un contrôle en continu du degré d’hydrolyse sur des protéines alimentaires. C’est une méthodesimple, rapide, reproductible et non dénaturante. En revanche, Silvestre (1997) relate que les valeurs de DHobtenues par cette méthode sont relatives et que leur exactitude doit être contrôlée par d’autres méthodestelles celles au TNBS ou à l’OPA.

La méthode au TNBS, développée par Adler-Nissen en 1979, est toujours utilisée pour déterminer le

DH lors d’hydrolyses de protéines alimentaires. La méthode à l’OPA est cependant relatée comme étant plusfacile à mettre en œuvre, plus rapide et plus sûre d’un point de vue environnemental. Elle est également plussensible, même si l’OPA manque de réactivité avec la cystéine et ne réagit pas avec la proline (Silvestre,1997).

II.5.2. La caractérisation des hydrolysats par chromatographie De nombreuses études ont été réalisées sur la séparation des protéines ou peptides par des procédés

chromatographiques. La chromatographie liquide d’exclusion de taille permet la caractérisation analytique demélanges peptidiques suivant leur poids moléculaire, elle est également utilisée à l’échelle semi-préparativeou préparative.

Les types de gels commerciaux utilisés le plus souvent pour une séparation à basse pression sont les

gels Sephadexâ (Desportes et al., 2000) et Bio-gelâ (Franek et al., 2000). Leur domaine de fractionnementdépend du type de gel et de leurs propriétés respectives, ils peuvent être utilisés dans la purification des


protéines mais aussi pour des mélanges peptidiques. La colonne de type Superdexâ Peptide HR 10-300 GL (Amersham), qui consiste en un gel d’agarose

et de dextran réticulé, a été rapportée dans diverses études depuis 1997 pour des séparations de peptides àmoyenne pression (SEC-FPLC). C’est une méthode simple et rapide et qui permet de contrôler larépétabilité de mêmes hydrolysats produits dans le temps, ceci suivant la taille de leurs peptides. Sondomaine de fractionnement est compris entre 100 et 7000 Daltons. Smyth et FitzGerald (1997) ont observéque ce gel permet une séparation performante pour les standards utilisés. Guérard et al. (2001a) ontégalement utilisé cette colonne afin de caractériser un hydrolysat de protéines de thon en utilisant un solvantcontenant 30 % d’acetonitrile et 0,1 % de TFA dilué dans l’eau. Cependant, quelques effets de rétention ontété remarqués pour des acides aminés chargés ou des peptides contenant des résidus hydrophobes, cecipouvant être expliqué par des interactions hydrophobes ou électrostatiques avec la colonne. Ces effetspeuvent être éliminés par l’augmentation de la concentration de la phase organique dans l’éluant.

III. L’activité antioxydante et antiradicalaire

III.1. Les radicaux libres

Les radicaux libres sont des espèces chimiques qui possèdent un électron non-apparié (célibataire) surleur couche orbitale externe. Ils sont susceptibles de dégrader par oxydation les molécules biologiques etseraient impliquées dans le vieillissement cellulaire et divers états pathologiques : inflammation,athérosclérose, cancer.

Les radicaux libres sont très instables de par leur configuration électronique et leur durée de vie esttrès courte (environ 10-4s). Leur réactivité réside dans le fait qu’ils recherchent un électron pour réapparierleur électron célibataire, entraînant la propagation du phénomène par création d’un nouveau radical libre. Ilse produit ainsi des réactions en chaîne qui peuvent aboutir à des dénaturations ou destructions au niveaucellulaire (Gardès-Albert, 2003). Les radicaux libres peuvent être produits par notre propre organisme aucours de réactions particulières, il s’agit de la voie endogène de production de radicaux libres. Les radicauxlibres peuvent également avoir une origine exogène liée à notre environnement.

III.1.1. Production endogène

L’oxygène que l’on respire est nécessaire aux réactions chimiques nous permettant de produire notre

énergie. C’est au cours de ce métabolisme normal de l’oxygène (réduction de l'oxygène moléculaire en eau)dans les mitochondries que la plupart des radicaux libres se forment. Le passage d’une molécule d’oxygène àdeux molécules d’eau nécessite l’action de quatre électrons: O2 + 4 e- + 4 H+ à 2 H2O.

Cependant, et jusqu’à 5 % des cas, on peut assister à une réduction incomplète de l’oxygène en eau.Cette réduction incomplète aboutit à la production de l’oxygène singulet (1O2) mais surtout de l’anionsuperoxyde (O2

l_). La dismutation de O2l_ va donner naissance au peroxyde d'hydrogène (H2O2) puis

indirectement au radical hydroxyl (OHl). L’expression « Espèces Réactives de l’Oxygène » (ERO) désigneces radicaux libres issus de l’oxygène, et les molécules non radicalaires (H2O2, HOCl, oxygène singulet)pouvant engendrer des radicaux libres.

Les radicaux libres peuvent également être produits lors de la défense antibactérienne. Les cellules

phagocytaires activées pendant la réaction inflammatoire vont libérer un anion superoxyde O2l_ . Ce

phénomène est appelé la flambée respiratoire. Les radicaux superoxydes formés peuvent alors subir eux aussi


des transformations donnant naissance aux dérivés oxygénés toxiques présentés ci-dessus.

III.1.2. Production exogène

L’organisme humain est soumis à l’agression de différents agents extérieurs capables de donner

naissance à des espèces oxygénées réactives (Favier, 2003) : · Les rayonnements UV (par l’intermédiaire d’agents photosensibilisants) et les radiations ionisantes

induisent la synthèse de radicaux libres dérivés de l’oxygène tels que O2l_, OHl, 1O2 et de molécules

génératrices de radicaux libres.

· L’oxyde d’azote (NO) et le dioxyde d’azote (NO2), des toxiques présents dans notre environnement (suie,goudron, tabac, polluants industriels) sont également responsables de la synthèse de radicaux libres. Ilssont à l’origine d’une auto-oxydation des acides gras poly-insaturés (AGPI) des alvéoles pulmonaires.

· Il a aussi été montré que l’ingestion d’alcool pouvait être à l’origine de la production de radicaux libres.Ils sont produits au cours de l’oxydation de l’acétaldéhyde, principal métabolite de l’éthanol.

· Enfin, certains médicaments anti-cancéreux comme les anthracyclines peuvent aussi générer des radicauxlibres.

III.2. Le stress oxydatif Le stress oxydatif apparaît donc quand un déséquilibre se forme dans la balance anti/pro-

oxydants. C’est seulement à ce moment que les ERO vont exercer leur action délétère sur l’organisme. Les radicaux libres sont responsables de dommages sur toutes les molécules biologiques comme les

lipides, les protéines, les acides nucléiques, ou les hydrates de carbone (Favier, 2003):

· Au niveau de l’ADN, les radicaux libres peuvent induire des effets mutagènes ou un arrêt des réplications.

· Les lipides sont une cible privilégiée des radicaux libres. Ceux-ci provoquent en effet l’oxydation desacides gras poly-insaturés (AGPI) des phospholipides membranaires (principaux constituants desmembranes des cellules), mais aussi des organites cellulaires et des noyaux. Ce phénomène est appeléperoxydation lipidique ou lipopéroxydation.

· Les radicaux libres peuvent aussi agir sur les macromolécules en provoquant des inactivations

enzymatiques, des fragmentations de ces molécules (collagène, protéoglycannes, acide hyaluronique) et laformation de dimères ou d’agrégats protéïniques dans les membranes cytoplasmiques.

Les mécanismes d’oxydation des composés insaturés biologiques (acides gras, caroténoïdes,

polyphénols…) sont souvent des réactions radicalaires avec l’oxygène moléculaire et présentent trois phasesprincipales (Huang et al., 2005).

Une phase d’initiation qui peut être due à l’intervention d’un radical hydroxyle HOl qui arrache un atome

d’hydrogène en position RH + HOl → Rl + H2O

L’arrachement du proton est facilité tant par la chaleur (agitation moléculaire) que par lesrayonnements ou les catalyseurs (métaux tels que Cu, Fe, Co, Mn, Ni…).

§ Une phase de propagation : en présence d’oxygène, il se forme un radical peroxyde (ROO•) qui

déstabilise une deuxième molécule d’AGPI et conduit à un hydroperoxyde lipidique (ROOH) et à unnouveau radical, assurant ainsi la propagation du processus :


Rl + O2 → ROOl

ROOl + RH → ROOH + Rl

§ Une phase de terminaison, où se recombinent différents radicaux formés pour aboutir à descomposés stables :

Rl + Rl → RRROOl + Rl → ROOR

ROOl + ROOl → ROOR + O2

III.3. Les moyens de défense contre les radicaux libres

III.3.1. Moyens endogènes

Le système de défense endogène aux organismes comprend : La défense enzymatique (Favier, 2003) : la supéroxyde dismutase (SOD), la glutathion peroxydase

(GPX) et la catalase (CAT). La SOD est l’une des rares enzymes à avoir un radical libre comme substrat, enl’occurrence l’anion superoxyde, O2

l_ . Le péroxyde d’hydrogène produit sera ensuite détoxifié par lacatalase et la glutathion peroxydase, empêchant ainsi la production du radical hydroxyle.

La défense non enzymatique (Nakazawa et al., 1996) : le glutathion, agent antiradicalaire, est composéde 3 acides aminés : cystéine, acide glutamique et glycine. Les deux derniers acides aminés sont produitsrapidement par l’organisme mais la cystéine est un acide aminé semi-essentiel, qui doit donc être présentdans notre alimentation. Le glutathion a, en plus de son rôle de cofacteur des peroxydases, le pouvoir decapter directement les radicaux libres, notamment OHl.

La céruloplasmine est une protéine plasmatique dont la fonction normale est de transporter le cuivre.Il a été démontré in vitro qu’elle possédait une activité de piégeage de O2

l_ et OHl.

L’acide urique, la bilirubine, l’albumine, la ferritine, la transferrine et la lactoferrine ont également unrôle d’antioxydant vis-à-vis d’OHl en agissant comme chélateurs de métaux de transition (fer et cuivre) etdonc en inhibant la réaction de Fenton. De plus, l’acide urique et la bilirubine participeraient au piégeage deO2l_, OHl et l’albumine au piégeage de OHl.

III.3.2. Moyens exogènes

Les moyens exogènes qui permettent de se défendre contre les radicaux libres nécessitent un apport

extérieur en composés que l’organisme est incapable de fabriquer. Ces composés, que l’on peut regroupersous le terme général d’"antioxydants" peuvent être de nature variée. Le paragraphe suivant y est consacré(cf § III.4).

III.4. Les antioxydants

Un antioxydant est défini comme une substance qui, ajoutée à faible dose à un produit naturellementoxydable à l’air, est capable de ralentir ou d’inhiber le phénomène d’oxydation (Park et al., 2001). Cettedéfinition peut être élargie et le terme "antioxydant" englobe ainsi toutes les substances qui protègent lessystèmes biologiques contre les effets délétères potentiels des processus ou réactions qui engendrent uneoxydation excessive (Berthou, 2002).

III.4.1. Mode d’action des antioxydants

Indépendamment de leur localisation, les antioxydants peuvent agir à deux niveaux : en prévenant la


formation de radicaux libres oxygénés ou en épurant les radicaux libres oxygénés. En complément de cettedouble ligne de défense, l’organisme est en outre capable de réparer ou d’éliminer les moléculesendommagées par l’attaque radicalaire (Gardès-Albert, 2003).

Les antioxydants préventifs ont une action stabilisatrice en décomposant par exemple les peroxydesen des produits stables de terminaison ce qui empêche directement la formation des radicaux libres. Ilspeuvent aussi chélater les catalyseurs des réactions d’oxydation tels que les ions métalliques ou bien réagiravec l’oxygène. Les piégeurs des ERO rentrent en compétition avec des radicaux déjà existants et contribuent àbloquer la phase de propagation. On différencie deux types de piégeage (Huang et al., 2005):

- le premier par libération d’un atome d’hydrogène, souvent par une structure aromatique (cas desdérivés du phénol : tocophérols, polyphénols, flavonoïdes…) :

- et le deuxième par libération d’un électron.

La combinaison de ces antioxydants préventifs et piégeurs peut générer des effets synergiques.

III.4.2. Antioxydants naturels et de synthèse

La présence d’antioxydants dans les aliments permet d’éviter le rancissement dû à l’oxydation causéepar l’oxygène, la lumière, la chaleur ou le contact de certains métaux. C’est souvent le cas des alimentsriches en lipides comme les huiles. L’oxydation peut également entraîner la formation de composéssecondaires potentiellement toxiques (Moure et al., 2001). C’est pourquoi les industriels ajoutent desmolécules dans les aliments pour augmenter leur durée de vie. Leur présence s’avère également nécessaire ausein des produits pharmaceutiques, cosmétiques ou des plastiques afin d’éviter leur dégradation.

§ Il existe plusieurs groupes d’antioxydants naturels :

- Les vitamines : la vitamine A, ou bien son précurseur le ène, la vitamine E (tocophérol) ou encore lavitamine C (acide ascorbique). On les trouve dans de nombreux fruits et légumes. Des antioxydants naturelscomme le b-carotène et le lycopène de la tomate préviennent les lésions cellulaires (Norman, 2001). - Les composés phénoliques : en effet, la plupart des antioxydants de synthèse ou d’origine naturellepossèdent des groupes hydroxyphénoliques dans leurs structures. Les composés phénoliques naturels les plusconnus sont les polyphénols comme les flavonoïdes (catéchines, flavonols, antocyanidols) et les tannins quel’on retrouve en grande quantité dans le vin. Le thé est également une source importante de composésphénoliques (Gardès-Albert, 2003). - Les oligoéléments : le sélénium, le cuivre, le manganèse, ou encore le zinc. Ils ont une valeur hautementprotectrice du fait de leur présence dans de nombreuses métallo-enzymes à action antiradicalaire.

Parmi les antioxydants d’origine naturelle, on remarque que les tocophérols présentent une faibleefficacité pour un coût de production élevé. Quant à l’acide ascorbique, il peut se comporter comme unesubstance pro-oxydante à forte concentration (Moure et al., 2001).

§ Les antioxydants de synthèse :

Dans la famille des gallates (esters de l’acide gallique), le gallate de propyle (E310) est le plus

rencontré. Les plus efficaces rencontrés par rapport à leur faible coût pour retarder l’oxydation lipidique sontle BHT (ButylHydroxyToluène) et le BHA (ButylHydroxyAnisole). Cependant, il a été montré que cesantioxydants de synthèse pouvaient être toxiques (Yu et al., 2000). En effet, le BHA convertirait certainsproduits ingérés en substances toxiques ou carcinogènes en augmentant la sécrétion des enzymesmicrosomales du foie et des organes extra-hepatiques (Barlow, 1990). Le BHT présenterait des effetscarcinogènes chez le rat (Ito et al., 1985).

De nouvelles recherches sont donc menées afin de découvrir de nouveaux antioxydants d’originenaturelle. Ainsi, de nombreuses études se sont intéressées aux propriétés antioxydantes des épices, du soja(Gibbs et al., 2004) ou de nombreux fruits ou légumes (Garcia-Alonso et al., 2004 ; Karadeniz et al., 2005).Les colorants ont également fait l’objet de recherches à ce sujet et il a été révélé que la chlorophylle a


(Lanfer-Marquez et al., 2004) ou les anthocyanines contenues dans les baies (Kähkönen et al., 2004)possédaient des propriétés antioxydantes intéressantes.

Par ailleurs, de nombreuses études ont déjà décrit l’activité antioxydante d’hydrolysats de protéinestels que la caséine du lait (Suetsuna et al., 2000a), le soja (Chen et al., 1995, 1996, 1998), les protéines dujaune d’œuf (Park et al., 2001 ; Sakanaka et al., 2004), l’albumine de blanc d’œuf (Uchida et al., 1992), lesprotéines de porc (Saiga et al., 2004).

Des études menées ces dernières années ont également démontré les propriétés antioxydantes

d’hydrolysats d’origine marine.

III.4.3. Les peptides antioxydants et antiradicalaires d’origine marine Depuis quelques années, les hydrolysats de protéine ou les extraits d’origine marine voient leur intérêt

augmenter. D’après la littérature, l’activité antioxydante / antiradicalaire semble liée à certainescaractéristiques communes des peptides bioactifs.

v La taille des peptides actifs : en effet, tous les peptides antioxydants recensés ont une taille inférieure à

20 acides aminés. v La composition en acides aminés semble jouer un rôle important sur l’expression de l’activité des

peptides actifs. Chen et al. (1995) ont isolé, dans un hydrolysat de protéines de graines de soja, sixpeptides inhibant fortement l’auto-oxydation de l’acide linoléique. Ces peptides sont composés d’acidesaminés hydrophobes (Val ou Leu) en position N-terminale et des acides aminés Pro, His, Tyr dansleurs séquences. Uchida et al. (1992) ont montré que 4 peptides sur les 6 isolés contiennent des résidusHistidine, les deux autres contiennent des résidus Tyrosine, donneurs potentiels d’électrons. Desrésultats similaires ont été obtenus par Park et al. (2001), dans un hydrolysat de lécithine de jauned’œuf : les deux peptides présentant la plus forte activité antioxydante, composés de 10 et 15 acidesaminés, contiennent chacun un acide aminé Leu en position N-terminale. Par rapport à la compositionen acides aminés, il se dégage de la littérature certaines tendances quant à l’activité antioxydante et/ouantiradicalaire des peptides actifs.

§ Les acides aminés aromatiques (Tyr, Trp, Phe) joueraient un rôle de piégage des radicaux

libres par libération d’atomes d’hydrogène (Kim et al., 2001 ; Saito et al., 2003). § Les acides amines hydrophobes (Val, Leu, Phe) favoriseraient les interactions entre peptides

et acides gras (Chen et al., 1998 ; Moure et al., 2005).

§ L’Histidine aurait une capacité à donner des atomes d’hydrogène, à piéger les radicauxperoxyles lipidiques et à chélater les ions métalliques du fait de la présence du groupementimidazole (Chan et Decker, 1994).

§ Les acides aminés basiques (Asn, Gln), du fait de leur capacité à accepter des électrons,

bloqueraient la chaîne d’oxydation (Suetsuna et al., 2000a).

§ Les acides aminés chargés (Lys, Arg), de par leur groupement amine/carbonyle,participeraient à la chélation des ions métalliques (Pena-Ramos et al., 2004 ; Gibbs et al.,2004).

§ Il est constaté également une récurrence de certaines séquences dans les peptides

antioxydants (ex : Glu-Pro-Hyp) (Kim et al., 2001).

v Cependant, l’activité antioxydante de peptides contenant des résidus His et d’autres acides aminésexcède celle de ces mêmes acides aminés libres dans un mélange aqueux (Yee et al., 1980). En effet,Yamaguchi et al. (1975) ont montré que des dipeptides présentant Tyr et Trp en position N terminale etHis et Met en position C terminale ont une meilleure activité antioxydante que les mêmes acidesaminés libres dans une solution aqueuse.Il semble donc que l’agencement des acides aminés au sein des peptides présente également une


importance. Afin d’approfondir la compréhension de ce phénomène, Chen et al. (1996) ont utilisé leplus petit peptide séquencé en 1995 (LLPHH) comme modèle afin de caractériser les propriétésantioxydantes. En effet, la délétion de la Leu en position N-terminale n’affecte pas l’activitéantioxydante. Par contre, la délétion de l’His en position C-terminale provoque la diminution del’activité, montrant ainsi que le segment HH joue un rôle majeur dans l’activité antioxydante du peptideet que l’addition de Leu ou Pro en position N-terminale augmente l’activité antioxydante. La séquenceN-terminale pourrait donc avoir un rôle clé dans l’activité de ce peptide. Le peptide synthétiséprésentant la plus forte activité antioxydante a pour séquence PHH (Pro-His-His). Le positionnementcorrect des groupements imidazoles est donc essentiel. Cependant, la relation entre la structure etl’activité des peptides contenant des acides aminés His n’est pas encore bien définie à ce jour.

En conclusion, l’étude bibliographique réalisée sur les peptides à activité antioxydante et

antiradicalaire révèle que quelques caractéristiques communes à ces peptides ont été mises en évidence.Cependant, on ne peut de manière générale établir de relation claire entre la structure de ces peptides actifs etl’activité antioxydante.

III.5. L’évaluation de la capacité antioxydante in vitro

Les antioxydants peuvent réagir à différentes étapes du procédé d’oxydation et ils peuvent avoir plusd’un mécanisme d’action, ce qui ne facilite pas leur classification (Frankel et Meyer, 2000).

Selon Huang et al. (2005), les méthodes d’évaluation de l’activité antioxydante in vitro peuvent être

divisées en deux grandes catégories suivant les réactions mises en jeu : § Les tests basés sur le transfert d’un atome d’hydrogène (HAT, Hydrogen Atom Transfer), danslequel l’antioxydant et le substrat sont en compétition pour les radicaux peroxyles ROOl:

ROOl + AH à ROOH + Al

ROOl + LH à ROOH + Ll

§ Les tests basés sur le transfert d’un électron (SET, Single Electron Transfer), dans le cadre desquelson mesure la capacité d’un antioxydant à réduire un oxydant, qui change de couleur quand il est réduit :

M(n) + e- (de AH) à AHl+ + M(n-1)

Les lipides sont les principaux constituants alimentaires vulnérables à l’oxydation, qui se traduit parune détérioration généralisée de l’aliment. La dégradation oxydative des lipides conduit à des modificationsde texture, d’odeur, de goût (évolution vers le rancissement), il s’ensuit une perte de stabilité de l’aliment,qui se répercute alors sur sa durée de conservation. Diverses méthodes de dosage de l’activité antioxydantein vitro dans des aliments ou dans des systèmes biologiques, induisent l’oxydation de lipides ou lipoprotéinesdans des conditions standardisées. L’activité antioxydante est déterminée à partir de la mesure del’inhibition de cette oxydation.

D’autres protocoles de dosage mesurent l’activité antioxydante par piégeage des radicaux libres,

c’est-à-dire l’activité antiradicalaire. En résumé, il n’existe pas de test in vitro de référence pour évaluer l’activité antioxydante d’unéchantillon, sachant de plus que cet échantillon peut présenter divers mécanismes d’action. Il faut donccombiner les réponses obtenues à l’aide de tests différents et complémentaires pour avoir une indicationsur la capacité antioxydante de l’échantillon à tester.

Les tests qui ont été réalisés dans le cadre de ce mémoire sont les suivants :

- Le test au ène – acide linoléique, basé sur la destruction oxydative du ène sous l’effet de lachaleur, de la lumière et de l’oxygène, ce qui entraîne la décoloration du ène. L’activité antioxydante estdéterminée à partir de la mesure de l’inhibition de cette oxydation (Miller, 1971). Le test au DPPHl (2,2’-diphenyl-1-picrylhydrazyl), basé sur le piégeage du radical libre stable DPPHl

par une molécule antiradicalaire, ce qui entraîne la décoloration du DPPHl (Morales et Jimenez-Perez, 2001)

L’avantage de l’utilisation combinée de ces deux différents tests réside dans leur complémentarité. En


effet, le premier est basé sur l’inhibition de la peroxydation lipidique et mesure une activité antioxydante ; ledeuxième est basé sur le piégage de radicaux libres et mesure une activité antiradicalaire. Aussi, le test auDPPHl, test rapide et facile à mettre en œuvre, s’effectue à température ambiante, ceci permettant d’éliminertout risque de dégradation thermique des molécules testées. D’autre part, le test au ène – acide linoléique aété choisi car c’est une méthode un peu laborieuse mais reproductible et fiable. Le test ORAC ( Le test au nitrobleu de tétrazolium (NBT) (Vivas et al., 1997), basé sur la réduction du tétrazoliumen bleu de formazan par les radicaux superoxides, fait aussi partie du savoir-faire du laboratoire, mais n’apas été utilisé dans le cadre de ce mémoire. Actuellement en cours de validation au laboratoire, deux nouveaux tests peuvent être cités: la mesuredu pouvoir réducteur (Jayaprakasha et al., 2001) et l’activité de chélation des ions Fe2+ (Huang, et al., 2005).Le test sur le pouvoir réducteur met en avant la capacité d’une molécule à réduire un oxydant en lui cédantun électron. Cette molécule pourra donc réduire les radicaux libres.Le test sur la chélation des ions Fe2+ quand à lui, met en avant la capacité d’une molécule à fixer les ionsFe2+. Les ions Fe2+ jouent un rôle important lors de la production des radicaux libres notamment lors de laréaction de Fenton, qui survient à chaque fois qu’une molécule d’H202 est en contact d’ions Fe2+ et qui est àl’origine de la production des radicaux hydroxyl (OH), un des radicaux les plus réactifs. Le fer joue aussi unrôle dans la phase de propagation de la lipoperoxydation ainsi que dans la formation du radical O2

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Le laboratoire développe également des tests plus évolués sur modèle cellulaire. Il s’agit de testerdeux effets des hydrolysats : le premier est leur cytotoxicité sur les cellules et le deuxième est l’effetprotecteur des hydrolysats sur les cellules soumises à un stress oxydant d’origine chimique (H2O2) ouphysique (rayonnement UV).Le test au MTT en est un exemple. Il est basé sur le clivage du sel de tétrazolium MTT en bleu de formazan(suivi par spectrophotométrie à 570 nm) par une enzyme mitochondriale, la succinate déshydrogénase. Cetteconversion a lieu dans les cellules vivantes uniquement et la quantité de formazan produite estproportionnelle au nombre de cellules présentes, le MTT est donc un indicateur de l’activité cellulaire. Laviabilité peut être testée sur différents types de cellules comme des hépatocytes de rat, des fibroblastes depoumon humain, des cellules de la muqueuse intestinale de rats, des neuroblastes humains…Ces cellules sontalors soumises à un stress oxydatif au t-BHT (tert-butylhydroperoxyde), aux "cumene hydroperoxides" ou auH2O2. Les cellules vivantes sont révélées par le bleu de Tripant (Rajapakse et al., 2005 ; Mendis et al.,2005). Le test de cytotoxicité consiste à évaluer l’impact de concentrations croissantes en échantillon sur laviabilité des cellules. Le test de l’effet protecteur consiste à examiner la réponse des cellules face à un stressquand elles ont été mises en contact avec l’échantillon. À l’heure actuelle, l’évaluation du stress oxydant sur modèle animal ou humain est peu pratiquée carces méthodes in vivo sont complexes et coûteuses. Toutefois, il existe des tests permettant d’évaluer lepotentiel global de défense antiradicalaire comme le test KRL, et d’évaluer la capacité antioxydante totale.Le test KRL est effectué sur un échantillon sanguin qui est soumis à une attaque radicalaire et on mesure letemps nécessaire à la lyse de 50 % des cellules. Ces mesures de résistance antiradicalaire sont représentativesdu potentiel global. Le test sur la capacité antioxydante totale est également effectué sur un échantillon desang. Il consiste à évaluer la capacité que possède le sang complet à inhiber la production d’espècesréactives de l’oxygène générées par un système in vitro. Selon le docteur Nataf il existe quatre marqueurspossédant un intérêt dans le dosage du stress oxydatif. Il s’agit du 8ohdG urinaire, un marqueur de ladégradation oxydative de l’ADN, du F2 alpha, un marqueur de la peroxydation lipidique, du malonyl-dialdéhyde, également un marqueur de la peroxydation lipidique dont le dosage se fait par chromatographieet de l’allantoïne, un marqueur des dommages oxydatifs dans la cellule liés à l’effort physique (Nutranews,2005).

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

ABDUL-HAMID, A., J. BAKAR, et al. (2002). "Nutritional quality of spray dried protein hydrolysate from blackTilapia (Oreochromis mossambicus)." Food Chemistry, 78: 69-74.


ADLER-NISSEN, J. (1976). "Enzymatic hydrolysis of proteins for increased solubility." Journal of Agriculturaland Food Chemistry, 24 (6): 1090-1093. ADLER-NISSEN, J. (1979). "Determination of the degree of hydrolysis of food protein hydrolysates bytrinitrobenzenesulfonic acid." Journal of Agricultural and Food Chemistry, 27 (2): 1256-1262.ADLER-NISSEN, J. (1982). "Limited enzymic degradation of proteins : a new approach in the industrialapplication of hydrolases." J. Chem. Tech. Biotechnol., 32: 138-156. ADLER-NISSEN, J. (1986). "Enzymic hydrolysis of food proteins". Elsevier Applied Science, London and New-York.AHN, C.B., Y.J. JEON, et al. (2004). "Free radical scavenging activity of enzymatic extracts from a brownseaweed Scytosiphon lomentaria by electron spin resonance spectrometry." Food Research International, 37 (3):253-258.AMAROWICZ, R. and F. SHAHIDI (1997). "Antioxidant activity of peptide fractions of capelin proteinhydrolysates." Food chemistry, 58 (4): 355-359.ANSON, M.L., (1938). J. Gen. Physiol., 22: 79-89.ASPMO, S. I., S. J. HORN, et al. (2005). "Enzymatic hydrolysis of Atlantic cod (Gadus morhua L.) viscera."Process Biochemistry, 40: 1957-1966. BAEK H. H. et CADWALLADER K. R. (1995). "Enzymatic hydrolysis of crawfish processing by-products".Journal of Food Science, 60: 929-934.BARLOW S.M. (1990). "Toxicological aspects of antioxidants used as food additives". Food Antioxidants, Ed.B.J.F. Hudson, Elsevier Applied Science, Londres, 253-307. BENJAKUL, S. and M. T. MORRISSEY (1997). "Protein hydrolysates from Pacific Whiting solid wastes." Journalof Agricultural and Food Chemistry, 45 (9): 3423-3430. CANDIDO, L.M.B. and V.C. SGARBIERI (2003). "Enzymatic hydrolysis of Nile Tilapia (Oreochromus Niloticus)myofibrillar proteins: effects on nutritional and hydrophilic properties". Journal of the Science of Food andAgriculture, 83: 937-944. CAO G., ALESSIO, H.M., et al. (1993). "Oxygen radical absorbance capacity assay for antioxidants." Free RadicalBiol. Med., 14: 303-311. CAO G., SOFIC E. et PRIOR L. R. (1997). "Antioxidant and prooxidant behavior of flavonoids : structure-activityrelationships". Free Radical Biology and Medicine, 22:749-760. CHABEAUD, A., DUTOURNIE, P., GUERARD, F., VANDENGEON, L., BOURSEAU, P., (2006). "Optimisationof the antioxidant activity of Saithe (Pollachius virens) hydrolysate using Response Surface Methodology (RSM)".Communication scientifique lors du Symposium Européen EFF (Enzymes For Food), Rennes, 2006. CHAN, K. M. and E. A. DECKER (1994). "Endogenous skeletal muscle antioxidants." Critical reviews in foodscience and nutrition, 34 (4): 403-426.CHEN, H. M., K. MURAMOTO, et alJournal of Agricultural and Food Chemistry, 43: 574-578. CHEN, H. M., K. MURAMOTO, et al. (1996). "Antioxidant activity of designed peptides based on theantioxidative peptide isolated from digests of a soybean protein." Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44:2619-2623. CHEN, H. M., K. MURAMOTO, et al. (1998). "Antioxidative properties of histidine-containing peptides designedfrom peptide fragments founf in the digests of a soybean protein." Journal of Agricultural and Food Chemistry, 46:49-53. CHUANG, W.-L., B. S. PAN, et al. (2000). "Inhibition of lipoxygenase and blood thinning effects of Mackerelprotein hydrolysate." Journal of Food Biochemistry, 24: 333-343. CHURCH, F. C., H. E. SWAISGOOD, et al. (1983). "Spectrophotometric assay using o-phtaldialdehyde fordetermination of proteolysis in milk and isolated milk proteins." Journal of Dairy Science 66: 1219-1227. CUVELIER M. E., RICHARD H. ET BERSET C. (1992). "Comparison of the antioxidant activity of some acid-phenols : structure-activity relationship." Bioscience Biotechnology Biochemistry, 56: 324-325. DE GERO, J. B. and J. B. HASDENTEUFEL (1971). "Différentes méthodes d'hydrolyse enzymatique des protéinesde poisson en vue de la fabrication de protéolysats alimentaires." Bulletin de l'Institut des Pêches Maritimes, 18:


97-116. DESPORTES C., CHARPENTIER M., et al., (2000). "Liquid chromatographic fractionation of small peptides fromwine". Journal of Chromatography A, 893 (2): 281-291. DINIZ, F. M. and A. M. MARTIN (1996). "Use of response surface methodology to describe the combined effectsof pH, temperature and E/S ratio on the hydrolysis of dogfish (Squalus acanthias) muscle." International Journal ofFood Sciences and Nutrition, 31: 419-426. DINIZ, F. M. and A. M. MARTIN (1997a). "Effects of the extent of enzymatic hydrolysis on functional propertiesof shark protein hydrolysate." Lebensmittel-Wissenschaft und Technology, 30: 266-272. DINIZ, F. M. and A. M. MARTIN (1997b). "Optimization of nitrogen recovery in the enzymatic hydrolysis ofdogfish (squalus acanthias) protein. Composition of the hydrolysates." International Journal of Food Sciences andNutrition, 48: 191-200. DINIZ, F. M. and A. M. MARTIN (1998). "Influence of process variables on the hydrolysis of shark muscleprotein." Food Science and Technology International, 4(2): 91-98. DUFOSSE L., de la BROISE D., GUERARD F. (1997). "Fish protein hydrolysates as nitrogen sources formicrobial growth and metabolite production". Recent Research Developments in Microbiology, 1: 365-381. DURAND, P. (1982). "Etude de la fraction azotée soluble de l'anchois salé au cours de la maturation." Revue desTravaux de l'Institut des Pêches Maritimes, 45 (4): 271-281. EMMONS C. L. ET PETERSON D. M. (1999). "Antioxidant activity and phenolic contents of oat groats andhulls". Cereal Chemistry, 76 (6): 902-906. FAO/World Health Organization (WHO) (1974). "Handbook on human nutritional requirements". FAO Nutr.Studies, N°28, Rome; WHO monogr. Series N° 61., Geneva. FAO-Sofia (2004), The state of world fisheries and aquaculture (SOFIA) 2004. Rome, FAO Fisheries Department. FAVIER, A. (1997). "Le stress oxydant : intérêt de sa mise en évidence en biologie médicale et problèmes poséspar le choix d'un marqueur." Annales de biologie clinique, 55 (1): 9-16. FAVIER, A. (2003). "Le stress oxydant : intérêt conceptuel et expérimental dans la compréhension des mécanismesdes maladies et potentiel thérapeutique". L’actualité chimique, novembre-décembre 2003. FERREIRA, N. G. and H. O. HULTIN (1994). "Liquifying cod fish frames under acidic conditions with a fungalenzyme." Journal of Food Processing and Preservation, 18: 87-101. FOLIN, O., and CIOCALTEU, V., (1929). J. Biol. Chem., 73, 627. FOTI, M., M. PIATTELLI, et al. (1996). "Flavonoids, coumarins, and cinnamic acids as antioxidants in a micellarsystem. Structure-activity relationship." Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44: 497-501. FRANEK F., HOHENWARTER O. et KATINGER H. (2000). "Plant protein hydrolysates : preparation of definedpeptide fractions promoting growth and production in animal cells cultures". Biotechnology Progress, 16 (5): 688-692. FRANKEL E. N. et MEYER A. S. (2000). "The problems of using one-dimensional methods to evaluate multi-dimensional food and biological antioxidants". Journal of Science and Food Agriculture, 80: 1925-1941. FULBERT, J. C. and M. J. CALS (1992). "Les radicaux libres en biologie clinique : origine, rôle pathogène etmoyens de défense." Pathologie Biologie, 40 (1): 66-77. GARCIA-ALONSO M., DE PASCUAL-TERESA S., SANTOS-BUELGA C. and RIVAS-GONZALO J.C. (2004)."Evaluation of antioxidant properties of fruits". Food Chemistry, 84: 13-18. GARDES-ALBERT, M., BONNEFONT-ROUSSELOT, D., ABEDINZADEH, Z., JORE, D. (2003). "Espècesréactives de l’oxygène : comment l’oxygène peut-il devenir toxique ?" L’actualité chimique, novembre-décembre2003. GBOGOURI, G. A., M. LINDER, et al. (2004). "Influence of hydrolysis degree on the functional properties of


salmon byproducts hydrolysates." Journal of Food Science, 69 (8): 615-622. GIBBS B.F., ZOUGMAN A., MASSE R. et MULLIGAN C. (2004). "Production and characterization of bioactivepeptides from soy hydrolysate and soy-fermented food". Food Research International, 37 (2): 123-131. GILDBERG, A. and K.A. ALMAS (1986). "Utilization of fish viscera". Food Engineering and ProcessingApplication, 2: 383-393. GILDBERG A., BATISTA I., and STROM E. (1989)."Preparation and characterization of peptones obtained by atwo-step enzymatic hydrolysis of whole fish". Biotechnology and Applied Biochemistry, 11: 413-423. GILDBERG, A. and E. STENBERG (2001). "A new process for advanced utilisation of shrimp waste." ProcessBiochemistry, 36: 809-812. GILMARTIN L. and JERVIS L. (2002). "Production of cod (Gadus morhua) muscle hydrolysates. Influence ofcombinations of commercial enzyme preparations on hydrolysate peptide size range". J. Agr. Food Chem., 50 (19):5417 – 5423.GUERARD, F., L. DUFOSSE, et al. (2001). "Enzymatic hydrolysis of proteins from yellowfin tuna (Thunnusalbacares) wastes using Alcalase." Journal of Molecular Catalysis B : Enzymatic, 11: 1051-1059. GUERARD, F., R. RAVALLEC-PLE, et al. (2001a). Enzymic solubilisation of proteins from tropical tuna usingalcalase and some biological properties of the hydrolysates. Engineering and Manufacturing for Biotechnology,Kluwer Academic Publishers, 4: 39-50. GUERARD, F., L. GUIMAS, et al. (2002). "Production of tuna waste hydrolysates by a commercial neutralprotease preparation." Journal of Molecular Catalysis B : Enzymatic, 19-20: 489-498. GUERARD, F. AND M. T. SUMAYA-MARTINEZ (2003). "Antioxidant effects of protein hydrolysates in thereaction with glucose." Journal of the American Oil Chemists Society 80 (5): 467-470. GUERARD F., SELLOS D. et Le GAL Y. (2005). "Fish and Shellfish Upgrading, Tracability". In : Advances InBiochemical Engineering/Biotechnology, Editions Springer, Le Gal et Ulber Eds, 96: 127-163. GUIMAS L. (1999). "Caractérisation et classification de protéases commerciales". Rapport interne au laboratoire. HALLIWELL, B., M. A. MURCIA, et al. (1995). "Free radicals and antioxidants in food and in vivo : what theydo and how they work." Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 35 (1&2): 7-20. HOYLE, N. T. and J. H. MERRITT (1994). "Quality of fish protein hydrolysates from Herring (Clupea harengus)."Journal of Food Science, 59 (1): 76-79.Enzymatic hydrolysis of defatted soy flour by three different proteases and their effect on the functional propertiesof resulting protein hydrolysates". Czech J. Food Sci., 20: 7–14.HUANG D., OU B, and PRIOR R.L. (2005). "The Chemistry behind Antioxidant Capacity Assays". Journal ofAgricultural and Food Chemistry, 53 (6): 1841-1856.HWANG, J. and W. KO (2004). "Angiotensin I-converting enzyme inhibitory activity of protein hydrolysates fromtuna broth." Journal of Food and Drug Analysis, 12 (3): 232-237. ITO N., FUKUSHIMA S. and TSUDA H. (1985). "Carcinogenicity and modification of the carcinogenic responsesby BHA, BHT and other antioxidants". CRC Critical Reviews in Toxicology, 15: 109-150. JAO, C. and W. KO (2002). "1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical scavenging by protein hydrolyzatesfrom tuna cooking juice." Fisheries Science, 68: 430-435. JAYAPRAKASHA, G. K., R. P. SINGH, et al. (2001). "Antioxidant activity of grape seed (Vitis vinifera) extractson peroxidation models in vitro." Food Chemistry, 73 (3): 285-290. JE, J. Y., P. J. PARK, et al. (2005). "Antioxidant activity of a peptide isolated from Alaska pollack (Theragrachalcogramma) frame protein hydrolysate)." Food Research International, 38 (1): 45-50. JEON, Y. J., H. G. BYUN, et al. (1999). "Improvement of functional properties of cod frame protein hydrolysatesusing ultrafiltration membranes." Process Biochemistry, 35: 471-478. JUN, S. Y., P. J. PARK, et al. (2004). "Purification and characterization of an antioxidative peptide from enzymatichydrolysate of yellowfin sole (Limanda aspera) frame protein." European Food Research and Technology, 219: 20-26.


KÄHKÖNEN M., VILJANEN K. and HEINONEN M. (2004). "Antioxidant activities of berry anthocyanins". Actedu colloque Pigments in Food, more than colours... Quimper, June 14-17, Ed. Laurent Dufossé, ISBN 2-9521516-0-1, 233-234. KARADENIZ F., BURDURLU H.S., KOCA N., and SOYER Y. (2005). "Antioxidant activity of selected fruitsand vegetables grown in Turkey". Turk J Agric., 29, 297-303. KAUR C. ET KAPOOR H. (2002). "Antioxidant activity and total phenolic content of some Asian vegetables."International Journal of Food Sciences and Technology, 37:153-161. KILCAWLEY, K.N., WILKINSON, M.G. and FOX, P. F. (2002). "Properties of commercial proteinasepreparations". Food Biotechnology, 16 (1): 29-55. KIM, S. K., KIM, Y. T., et al. (2001). "Isolation and characterization of antioxidative peptides from gelatinhydrolysate of Alaska Pollack skin." J. Agric. Food Chem., 49: 1984-1989. KRISTINSSON, H. G. and B. A. RASCO (2000a). "Fish protein hydrolysates: production, biochemical, andfunctional properties." Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 40 (1): 43-81. KRISTINSSON, H. G. and B. A. RASCO (2000b). "Hydrolysis of Salmon muscle proteins by an enzyme mixtureextracted from atlantic salmon (Salmo salar) pyloric caeca." Journal of Food Biochemistry, 24: 177-187. LANFER-MARQUEZ U.M., BARROS R.M.C. and SINNECKER P. (2004). "Antioxidant activity of chlorophyllsand their derivatives by the b-carotene bleaching method." Acte du colloque Pigments in Food, more than colours...Quimper, June 14-17, Ed. Laurent Dufossé, ISBN 2-9521516-0-1, 235-237. LI, S., T. SEYMOUR, et al. (1998). "Color stability and lipid oxidation of rockfish as affected by antioxidant fromshrimp shell waste." Journal of Food Science, 63 (3): 438-441. LI, L., WANG, J., et al. (2006). "Artificial neural network for production of antioxidant peptides derived frombighead carp muscles with Alacalase". Food Technol. Biotechnol., 44 (3): 441-448. LIASET, B., E. LIED, et al. (2000). "Enzymatic hydrolysis of by-products from the fish-filleting industry; chemicalcharacterisation and nutritional evaluation." Journal of the Science of Food and Agriculture, 80: 581-589. LIASET B., NORTVEDT R., LIED E. and ESPE M. (2002). "Studies on the nitrogen recovery in enzymichydrolysis of Atlantic salmon (Salmo salar, L.) frames by ProtamexTM protease". Process Biochemistry, 37: 1263-1269. LICEAGA-GESUALDO, A. M. and E. C. Y. LI-CHAN (1999). "Functional properties of fish protein hydrolysatefrom herring (Clupea harengus)." Journal of Food Science, 64 (6): 1000-1004. LOWRY, O. H., N. J. ROSEBROUGH, et al. (1951). "Protein measurement with the folin phenol reagent." Journalof Biological Chemistry, 193: 265-275. MAILLARD, M. N., M. H. SOUM, et al. (1996). "Antioxidant activity of Barley and Malt: relationship withphenolic content." Lebensm;-Wiss. U.-Technol., 29: 238-244. MARGOT, A., E. FLASCHEL, A. RENKEN (1994). "Continuous monitoring of enzymatic whey proteinhydrolysis. Correlation of base consumption with soluble nitrogen content." Process Biochemistry, 29: 257-262. MARQUEZ MORENO, M. C. and V. FERNANDEZ CUADRADO (1993). "Enzymic hydrolysis of vegetableproteins : mechanism and kinetics." Process Biochemistry, 28: 481-490.MARTIN A. M. et PORTER D. (1995). "Studies on the hydrolysis of fish protein by enzymatic treatment". In :Food flavors : generation, analysis and process influence. Elsevier Science Publishers, Charalanbous G. Ed.,Amsterdam, 1395-1404. MARTINEZ-CAYUELA M. (1995). "Oxygen free radicals and human disease". Biochimie, 77: 147-161. MENDIS, E., N. RAJAPAKSE, et al. (2005). "Investigation of jumbo squid (Dosidicus gigas) skin gelatin peptidesfor their in vitro antioxidant effects." Life Sciences, 77: 2166-2178. MENDIS, E., N. RAJAPAKSE, et al. (2005). "Antioxidant properties of a radical-scavenging peptide purified fromenzymatically prepared fish skin gelatin hydrolysate." Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53: 581-587.


MILLER, H. E. (1971). "A simplified method for the evaluation of antioxidants." Journal of the American OilChemists Society, 48: 91. MORALES, F. J. and S. JIMENEZ-PEREZ (2001). "Free radical scavenging capacity of Maillard reaction productsas related to colour and fluorescence." Food chemistry, 72: 119-125. MOURE, A., J. M. CRUZ, et al. (2001). "Natural antioxidants from residual sources." Food Chemistry, 72 (2):145-171. MOURE, A., H. DOMINGUEZ, et al. (2005). "Antioxidant properties of ultrafiltration-recovered soy proteinfractions from industrila effluents and their hydrolysates." Process Biochemistry. MULLALLY, M.M., O’CALLAGHAN, D. M., FITZGERALD, R. J., DONNELLY, W.J. and DALTON, J.P.(1994). "Proteolytic and peptidolytic activities in commercial pancreatic protease preparations and their relationshipto some whey protein hydrolysate characteristics". J. Agric. Food Chem, 42: 2973-2981. NAKAZAWA, H., C. GENKA, et al. (1996). "Pathological aspects of active oxygens / free radicals." Japanesejournal of physiology, 46 (1): 15-32. NIELSEN P. M., PETERSEN D. et DAMBMANN C. (2001). "Improved method for determining food proteindegree of hydrolysis". Journal of Food Science, 66 (5): 642-646. NILSANG, S., S. LERTSIRI, et al. (2005). "Optimization of enzymatic hydrolysis of fish soluble concentrate bycommercial proteases." Journal of Food Engineering, 70 : 571-578. NORMAN I. KRINSKY (2001). "Carotenoids as antioxidants". Nutrtion, 17, 815-817. Nutranews, (août 2005). Science, nutrition, prévention et santé. Lettre d’information éditée par la fondation pour lelibre choix (FLC). OCKERMAN H. W. (1992). "Fishery by-products". Fish Processing technology. Blackie Academic & Professional,Hall G. M. Ed., London: 155-190. OFIMER, Synthèse de l’Etude "La filière française des co-produits de la pêche et de l'aquaculture : état des lieux etanalyse", OFIMER 2004, Paris. (www.ofimer.fr). OU, B., HAMPSCH-WOODILL, M., et al. (2001). "Development and validation of an improved oxygen radicalabsorbance capacity assay using fluorescein as the fluorescent probe". Journal of Agricultural and Food Chemistry,49 : 4619-4926. PANYAM, D. and A. KILARA (1996). "Enhancing the functionality of food proteins by enzymatic modification."Trends in Food Science & Technology, 7: 120-125.PARK, P. J., W. K. JUNG, et al. (2001). "Purification and characterization of antioxidative peptides from proteinhydrolysate of lecithin-free egg yolk." Journal of the American oil Chemists Society, 78 (6): 651-656. PARK, P.-J., F. SHAHIDI, et al. (2004). "Antioxidant activities of enzymatic extracts from an edible seaweedSargassum horneri using ESR spectrometry." Journal of Food Lipids, 11 (1): 15-27. PELLEGRINI N., RE R., YANG M. ET RICE-EVANS C. (1999). "Screening of dietary carotenoids andcarotenoid-rich fruit extracts for antioxidant activities applying 2,2’-azinobis (3-ethylenebenzothiazoline-6-sulfonic)acid radical cation decolorization assay". Methods in Enzymology, 299: 379-389. PENA-RAMOS, E. A., Y. L. XIONG, et al. (2004). "Fractionation and characterisation for antioxidant activity ofhydrolysed whey protein." Journal of the Science of Food and Agriculture, 84: 1908-1918. PIHLANTO A. (2006). "Antioxidative peptides derived from milk proteins". International Dairy Journal, 16:1306-1314. PRÉ, J. (1992). "Radicaux libres et peroxydation lipidique." I. Aspects biologiques généraux. Sem. Hôpitaux Paris.68 (41):1430-1437. PRIOR, R. L., X. WU, et al. (2005). "Standardized methods for the determination of antioxidant capacity andphenolics in foods and dietary supplements." Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53 (10): 4290-4302.


http://www.ofimer.fr/

QUAGLIA, G. B. and E. ORBAN (1987). "Enzymic solubilisation of proteins of sardine (Sardina pilchardus) bycommercial proteases." Journal of the Science of Food and Agriculture, 38: 263-269. RAA, J. and A. GILBERG (1976). "Autolysis and proteolytic activity of cod viscera." Journal of Food Technology,11: 619-628. RAJAPAKSE, N., E. MENDIS, et al. (2005). "Purification and in vitro antioxidative effects of giant squid musclepeptides on free radical-mediated oxidative systems." Journal of Nutritional Biochemistry, 16: 562-569. RAJAPAKSE, N., E. MENDIS, et al. (2005). "Purification of a radical scavenging peptide from fermented musselsauce and its antioxidant properties." Food Research International, 38 (2): 175-182. RAVALLEC-PLE, R., L. GILMARTIN, et al. (2000). "Influence of the hydrolysis process on the biologicalactivities of protein hydrolysates from cod (Gadus morhua) muscle." Journal of the Science of Food andAgriculture, 80: 2176-2180. ROBAK J. ET GRYGLEWSKI R. J. (1988). "Flavonoids are scavengers of superoxide anions". BiochemistryPharmacology, 37:837-841. ROY, P. et DURAND P. (1997). "Les enzymes dans la fabrication d’aliments à base de produits de la mer".Enzymes en agroalimentaire, TEC & DOC, Lavoisier Ed.: 95-120. SAIGA, A., S. TANABE, et al. (2004). "Antioxidant activity of peptides obtained from porcine myofibrillarproteins by protease treatment." Journal of Agricultural and Food Chemistry 51: 3661-3667. SAITO, K., JIN D-H., et al. (2003). "Antioxidative properties of tripeptide libraries prepared by the combinatorialchemistry". J. Agric. Food Chem., 51: 3668-3674. SAKANAKA, S., Y. TACHIBANA, et al. (2004). "Antioxidant activity of egg-yolk protein hydrolysates in alinoleic acid oxidation system." Food Chemistry, 86 (1): 99-103. SAKANAKA, S., Y. TACHIBANA, et al. (2005). "Antioxidant properties of casein calcium peptides and theireffects on lipid oxidation in beef homogenates." Journal of Agricultural and Food Chemistry, 53 (2): 464-468. SAKANAKA, S. and Y. TACHIBANA (2006). "Active oxygen scavenging activity of egg-yolk proteinhydrolysates and their effects on lipid oxidation in beef and tuna homogenates." Food Chemistry, 95: 243-249. SANCHEZ-MORENO C., LARRAURI J. A. ET SAURA-CALIXTO F. (1998) "A procedure to measure theantiradical efficiency of polyphenols". Journal of Science and Food Agriculture, 76:270-276. SATHIVEL, S., P. J. BECHTEL, et al. (2003). "Biochemical and functional properties of Herring (Clupeaharengus) byproduct hydrolysate." Journal of Food Science 68 (7): 2196-2200. SHAHIDI, F. (1995). "Protein Concentrates from Underutilized Aquatic Species". Food Flavors: Generation.Analysis and process influence, E. S. B.V.: 1141-1451. SHAHIDI, F., HAN, X. Q. et SYNOWIECKI (1995). "Production and characteristics of protein hydrolysates fromcapelin (Mallotus villosus)." Food Chemistry, 53: 285-293. SHAHIDI, F. AND R. AMAROWICZ (1996). "Antioxidant activity of protein hydrolyzates from aquatic species."Journal of the American Oil Chemists Society 73(9): 1197-1199. SILVESTRE, M. P. C. (1997). "Review of methods for the analysis of protein hydrolysates." Food Chemistry, 60(2): 263-271. SIMONETTI P., PIETTA P. G. ET TESTOLIN G. (1997). "Polyphenol content and total antioxidant activitypotential of selected italian wines". Journal of Agriculture and Food Chemistry, 45:1152-1155. SLIZYTE, R., E. DAUKSAS, et al. (2005). "Characteristics of protein fractions generated from hydrolysed cod(Gadus morhua) by-products." Process Biochemistry 40 (6): 2021-2033. SMYTH M. et FITZGERALD R. J. (1997). "Characterization of a new chromatography matrix for peptidemolecular mass determination". International Dairy Journal, 7: 571-577. SMYTH M. et FITZGERALD R. J. (1998). "Relationship between some characteristics of WPC hydrolysates and


the enzyme complement in commercially available proteinase preparations". International Dairy Journal, 8: 819-827. SPELLMAN, D., E. McEVOY, et al. (2003). "Proteinase and exopeptidase hydrolysis of whey protein :Comparison of the TNBS, OPA and pH stat methods for quantification of degree of hydrolysis." InternationalDairy Journal 13: 447-453. STEVENSON, D.E., OFMAN, D.J., MORGAN, K.R., STANLEY, R.A. (1998). "Protease-catalysed condensationof peptides as a potential means to reduce the bitter taste of hydrophobic peptides found in protein hydrolysates".Enzyme and Microbial Technology, 22: 100-110. SUETSUNA, K., H. UKEDA, et al. (2000a). "Isolation and characterization of free radical scavenging activitiespeptides derived from casein." J. Nutr. Biochem., 11: 128-131. SUETSUNA, K. (2000b). "Antioxidant peptides from the protease digest of prawn (Penaeus japonicus) muscle."Marine Biotechnology, 2: 5-10. SUMAYA-MARTINEZ, M. T., (2004). "Valorisation d’hydrolysats de coproduits de crevettes: Etude de l’activitéantiradicalaire et antioxydante, fractionnment des substances actives et effet de la glycation". Thèse, Université deBretagne Occidentale, Quimper. SUMAYA-MARTINEZ, M. T., A. CASTILLO-MORALES, et al. (2005). "Fish protein hydrolysates from goldcarp (Carassius auratus): I. A study of hydrolysis parameters using response surface methodology." Journal of thescience of food and agriculture, 85 (1): 98-104. TAMURA H. ET YAMAGAMI A. (1994). "Antioxidative activity of monoacylated anthocyanins isolated fromMuscat Bailey A Grape." Journal of Agriculture and Food chemistry, 42(8):1612-1615. UCHIDA, K. and S. KAWAKISHI (1992). "Sequence-dependent reactivity of histidine-containing peptides withcopper (II) / ascorbate." Journal of Agricultural and Food Chemistry, 40: 13-16. VENUGOPAL, V., M. D. ALUR, et al. (1989). "Solubilization of fish proteins using immobilized microbial cells."Biotechnology and Bioengineering, 33: 1098-1103. VIEIRA, G. H. F., A. M. MARTIN, et al. (1995). "Production of protein hydrolysate from lobster (Panulirus spp)".In Food Flavour: Generation Analysis and Process Influence, ed by Charalambous G. Elsevier, Amsterdam, pp1405–1415. VIEIRA, G. H. F., A. M. MARTIN, et al. (1995). "Studies on the enzymatic hydrolysis of brazilian lobster(Panulirus spp.) processing wastes". Journal of the Science of Food and Agriculture, 69:61-65. VIVAS, N., N. S.-C. D. GAULEJAC, et al. (1997). "Influence de SO2 et de l'acide ascorbique sur l'activitéantiradicalaire des tanins, mesurée sur l'anion superoxyde. Application aux vins rouges." Vitis, 36 (2): 91-96. WANG H., CAO G. ET PRIOR R. L. (1997). "Oxygen radical absorbing capacity of anthocyanins". Journal ofAgriculture and Food Chemistry, 45 (2): 304-309. WESSEL, J., (2004). "Production d’hydrolysats de poisson dotés d’activités antioxydantes". Mémoire de DESS,Université de Bretagne Sud, Quimper. WU, H. C., H. M. CHEN, et al. (2003). "Free amino acids and peptides as related to antioxidant properties inprotein hydrolysates ok mackerel (Scomber austriascus)." Food Research International, 36: 949-957. YEE J. J., SHIPE W. F. ET KINSELLA J. E. (1980). "Antioxidant effect of soy protein hydrolysates on copper-catalyzed methyl linoleate oxidation". Journal of Food science, 45 : 1082-1083. YOSHIKAWA T., NAITO Y., MASUI K., FUJII T., BOKU Y., NAKAGAWA S., YOSHIDA N. ET KONDO M.,(1997). "Free radical-scavenging activity of Crassostera gigas extract (JCOE) ". Biomedecine andPharmacotherapy, 51 (8): 328-332. YU, S. Y. and L. K. TAN (1990). "Acceptability of crackers (‘keropok’) with fish protein hydrolysate."International Journal of Food Science and Technology, 25: 204-208. YU, S. Y. and R. KAUR (1992). "Development of fish biscuits from Round Scad (D. russelli Rupp.)." TropicalScience, 32: 289-294.


YU, S. Y. and S. FAZIDAH (1994). "Enzymic hydrolysis of proteins from Aristichthys nobilis by protease P"Amano 3." Tropical Science, 34: 381-386. YU R., MANDLEKAR S. and TONY KONG A.-N. (2000). "Molecular mechanisms of butylated hydroxylanisole-induced toxicity: induction of apoptosis through direct release of cytochrome c". Molecular Pharmacology, 58: 431-437.


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