UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Zorana Z. Lazarević

Uticaj tipa podloge na varijabilnost deformiteta

mentuma vrste Chironomus tentans Fabricus, 1805 u

testovima toksičnosti

MASTER RAD

Niš, 2018.

1

UNIVERZITET U NIŠU

PRIRODNO MATEMATIČKI FAKULTET NIŠ

DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU

Uticaj tipa podloge na varijabilnost deformiteta

mentuma vrste Chironomus tentans Fabricus,

1805 u testovima toksičnosti

Master rad

Niš, 2018.

Kandidat:

Zorana Lazarević

Br. Indeksa 174

Mentor:

Dr ĐuraĎ Milošević

2

UNIVERSITY OF NIŠ

FACULTY OF SCIENCES AND MATHEMATICS

DEPARTMENT OF BIOLOGY AND ECOLOGY

The influence of substrate type on Chironomus

tentans Fabricius, 1805 mentum deformities in

ecotoxicology tests

Master thesis

Niš, 2018

Cadidate:

Zorana Lazarević

Students Reg. No. 174

Mentor:

PhD ĐuraĎ Milošević

3

Zahvalnica

Najsrdačnije se zahvaljujem svom mentoru, dr Đurađu Miloševiću, na nesebičnoj pomoći

tokom izrade ovog master rada i tokom studiranja.

Veliko hvala i doktorantkinji Dimitriji Savić Zdravković na pomoći pri pisanju ovog rada

i strpljenju za sva moja pitanja.

Hvala i doktorantu Aci Đurđević za pomoć tokom eksperimentalne faze istraživanja.

Hvala mojim roditeljima na bezuslovnoj podršci tokom školovanja.

Hvala.

4

Biografija

Zorana Lazarević roĎena je 8. novembra 1992. godine u Pirotu. Osnovnu školu „Vuk

Karadţić“ završila je 2007. godine, a Gimnaziju u Pirotu, prirodno-matematički smer, 2011.

godine sa odličnim uspehom.

Osnovne akademske studije na Prirodno-matematičkom fakultetu u Nišu upisuje 2011.

godine na Departmanu za biologiju i ekologiju. Godine 2014. završava osnovne akademske

studije i upisuje master akademske studije na istom departmanu, smer Ekolo

5

Sažetak

U ovom radu analizirano je da li tip podloge na kojoj se uzgaja kultura Chironomus

tentans utiče na variranje oblika, veličine i deformiteta mentuma larvi. Larve su uzgajane na 5

vrsta podloge: standardna podloga, standardna podloga sa medicinskom glinom, standardna

podloga bez peska, standardana podloga bez gline i standardna podloga bez treseta Ispitivanje je

sprovedeno na uzorku od 178 mentuma. Za analizu je korišćena metoda geometrijske

morfomtrije kao najpogodnija za detekciju malih promena u veličini i obliku objekata

istraţivanja. Uočeno je da se na podlogama gde je povećana količina peska javlja veća

istrošenost zuba mentuma nego na podlogama sa manje peska. TakoĎe je uočeno da ne postoji

značajni uticaj tipa podloge na pojavu i učestalost deformiteta kod larvi hironomida.

Ključne reči: Chironomus tentas, hironoimde, larve, deformiteti mentuma, geometrijska

morfometrija, podloge, ekotoksikološki testovi

6

Abstract

In this study was analysed whether the type of substrate on which Chironomus thentans

larvae were cultivated can affect the variation of shape, size and mentum deformities. Larvae

were cultivated on 5 types of substrate: standard substrate, standard substrate with medical clay,

standard substrate without quartz sand, standard substrate without kaolin clay and standard

substrate without peat. A sample of 178 mentums was analysed. Geometric morphometry

approach was used for the analysis of structures as most suitable for detecting small variations in

size and shape. On the substrate with high amount of quartz sand mentums were more worn out

than menthums of the larvae cultivated on substrate with less amount of quartz sand. It has also

been observed that there is no significant effect of the type of substrate on the frequency of

mentum deformities in cultivated Chironomus tentan larvae.

Key words: Chironomus tentans, Chironomid, larvae, mentum deformities, geometric

morphometrics, substrate, ekotoxicity test

7

Sadržaj

1. Uvod .......................................................................................................................................................... 8

1.1 Zagadjenje akvatičnih ekosistema ...................................................................................................... 8

1.2 Biomonitoring akvatičnih ekosistema ................................................................................................ 9

1.3 Ekotoksikološki testovi ..................................................................................................................... 11

1.4 Hironomide kao model organzmi ekotoksikoloških testova ............................................................. 13

2. Ciljevi istraţivanja .................................................................................................................................. 20

3. Materijali i metode .................................................................................................................................. 21

3.1 Uzgajanje kulture Chironomus tentans ............................................................................................. 21

3.2 Postavka eksperimenta ...................................................................................................................... 23

3.3 Statistčka obrada podataka ................................................................................................................ 26

3.3.1 Geometrijska morfometrija ........................................................................................................ 26

3.3.2 Multivarijantni i univarijantni testovi (CVA i PCA) ................................................................. 28

4.Rezultati i diskusija .............................................................................................................................. 30

4.1 Vidljive promene strukture mentuma ............................................................................................... 30

4.2 Variranje oblika mentuma diskriminantnom kanonijskom analizom (CVA) ................................... 31

4.3 Variranje oblika mentuma analizom glavnih komponenti (PCA) ..................................................... 34

5. Zaključak................................................................................................................................................. 36

6. Literatura ................................................................................................................................................. 37

8

1. Uvod

1.1 Zagadjenje akvatičnih ekosistema

ZagaĎena voda je izmenjeni element ţivotne sredine koja kvantitativno i kvalitativno

odstupa od prirodnih fzičkih, hemijskih i bioloških osobina, što ograničava mogućnost njene

upotrebe i izaziva nepoţeljne posledice u vodenim ekosistemima nanoseći štete ljudskom

zdravlju i ekonomiji (S. Simić i V. Simić, 2009). ZagaĎenje vode je globalni ekološki problem

čija veličina i tip varira od jedneregije do druge (S. Simić i V. Simić, 2009).

ZagaĎenje kopnenih voda dolazi kako iz prirodnih, tako iz antropogenih izvora (S. Simić

i V. Simić, 2009). Podela izvora zagaĎenja (zagaĎivača) na tačkaste (koncentrisane) i difuzne

(rasute) je koristan korak u prepoznavanju tipa zagaĎivača, što je bitno za prevenciju i

prečišćavanje zagaĎenih voda (S. Simić i V. Simić, 2009).

Tačkaste izvore zagaĎenja (eng. point sourse pollution) je moguće lako registrovati, a

njihovo zagaĎenje je relativno jednostavno kvalitativno i kvantitativno identifkovati (S. Simić i

V. Simić, 2009). Primeri ovih tipova zagaĎenja su otpadne vode iz ureĎaja za prečišćavanje

komunalnih otpadnih voda, otpadne vode iz industrija i fabrika i drugi izvori koji direktno

ispuštaju zagaĎujuće materije u recipijent kroz cevi, kanale tj. tačkaste izvore (S. Simić i V.

Simić, 2009). Ove zagaĎivače je moguće kontrolisati zakonodavno, ali se incidenti i dalje

dešavaju (S. Simić i V. Simić, 2009).

Difuzna zagaĎenja dolaze iz difuznih izvora (eng. non point source pollution) koji ne

potiču iz jedne tačke, već su prostorno široko rasprostranjeni (S. Simić i V. Simić, 2009).

Javljaju se reĎe i u kraćim vremenskim periodima od izvora tačkastog zagaĎenja (S. Simić i V.

Simić, 2009). Nastaju kada se padavine kreću preko i kroz zemljište, noseći sa sobom zagaĎenje

koje na kraju dospeva u jezera, reke, močvare, estuare i/ili u podzemne vode (S. Simić i V.

Simić, 2009). Difuzno zagaĎenje moţe takoĎe poticati iz sedimenata istaloţenih u jezerima,

rekama, močvarama ili estuarima (S. Simić i V. Simić, 2009). Ovo zagaĎenje uključuje otpadnu

vodu sa urbanih površina (ulica, parking prostora, travnih površina, bašti i sl.), vodu koja sa

9

poljoprivrednih površina spira veštačka Ďubriva, pesticide, otpadnu vodu pri eksploataciji ruda

(spiranje vode iz jama, jalovišta i sl.) (S. Simić i V. Simić, 2009).

ZagaĎujuće materije mogu da potiču iz različitih izvora i da budu različite prirode:

1. neorganska jedinjenja;

2. neorganski nutrijenti;

3. organska jedinjenja;

4. agensi koji izazivaju bolesti;

5. sedimenti;

6. radioaktivne supstance;

7. topla voda.

Dospevanjem otpadnih voda u tokove kopnenih voda mogu se promeniti zajednice

tokova dodavanjem organskih materija (kanalizacija, ţivotinjskog porekla, iz fabrika papira, i

td.), nutrijenata (hranljivih materija) i toksičnih hemikalija (Lenat, 1993). Svaki od ovih

zagaĎivača moţe da utiče na sastav i formiranje faune (Hynes, 1960). Radi zaštite dragocenih

vodenih staništa neophodna je procena individualnog i kombinovanog efekta ovih zagaĎivača,

pri čemu je kombinacije polutanata teţe proceniti (Lenat, 1993).

1.2 Biomonitoring akvatičnih ekosistema

Ţivotna sredina predstavlja sve ono što nas okruţuje i svaka čovekova aktivnost je

direktno ili indirektno povezana sa njom. Kroz antropogenu aktivnost, čovekova sredina se

suočila sa totalno novim supstancama koje do tada nisu bile prisutne u prirodnom sistemu

(ksenobiotici, mnogi sintetički radioizotopi) i potencijalno opasnim supstancama oslobodjenim u

nezamislivim količinama u prošlosti (teški metali, prirodni radioizotopi) (Oehlmann i Markert,

1999). Praćenje stanja ţivotne sredine u cilju njenog očuvanja i sprečavanja štetnih efekata

10

ksenobiotika na celokupan ţivi svet podrazumeva skup metoda koje se mogu objediniti

terminom monitoring (Despotović, 2013). Prema definiciji Programa za ţivotnu sredinu

Ujedinjenih nacija (eng. United Nations Environmental Program – UNEP) monitoring

predstavlja svako ponovljeno merenje, sa definisanom svrhom, jednog ili više hemijskih ili

bioloških parametara, prema unapred odreĎenom rasporedu u prostoru i vremenu, koristeći

metode koje su uporedive i standardizovane (Despotović, 2013). Monitoring omogućava

kontrolu i prepoznavanje promena nastalih u spoljašnjoj sredini (Despotović, 2013). Dva

osnovna tipa monitoringa koji omogućavaju procenu rizika dejstva na organizme kao i procenu

kvaliteta ţivotne sredine su: hemijski i biološki monitoring (De Zwart, 1995; Despotović, 2013).

U biološkom monitoringu (biomonitoringu) koriste se ţivi organizmi da bi se procenilo

stanje ţivotne sredine (Despotović, 2013). Metode biološkog monitoring imaju niz prednosti jer

mere efekte u kojima biodostupnost ispitivanih jedinjenja povezuju sa njihovom koncentracijom

i toksičnošću u organizmu i omogućavaju integrisanje efekata na velikom broju jedinki

(Despotović, 2013). Biodostupnost je definisana kao količina hemijske supstance koja moţe biti

usvojena iz sredine i pri tome moţe da izazove biološki odgovor (NRC 2003). Nedostatak

metoda biološkog monitoringa je posledica teškog povezivanja uočenih efekata sa specifičnim

aspektima zagaĎenja (De Zwart, 1995; Despotović, 2013).

Van Gestel i Van Brummelen (1996) predloţili su četiri različita nivoa biomonitoringa:

Suborganizmalni nivo - na nivou biohemijskih i fizioloških procesa moguće je utvrditi

odstupanje od normalnog (zdravog) stanja korišćenjem biohemijskih tehnika. Uključuje

korišćenje biomarkera.

Organizmalni nivo - korišćenjem bioanaliza prate se preţivljavanje, rast i reprodukcija

jedinki kao krajnje tačke klasičnih laboratorijskih testova ekotoksičnosti.

Populacioni nivo - prate se efekti koji se manifestuju kao promene u genetičkoj strukturi,

starosnoj strukturi ili gustini populacije korišćenjem bioindikatora.

Ekosistemski nivo - promene u sastavu, gustini i diverzitetu vrsta mogu ukazati na efekte

zagaĎenja na biocenoze.

Bioindikator je organizam koji svojim prisustvom, odsustvom ili ponašanjem

daje informacije o uslovima u sredini u kojoj ţivi (Despotović, 2013).

11

Kontrola kvaliteta ţivotne sredine mora biti primarni zadatak pri korišćenju prirodnih

resursa kao i pri svakom drugom antropogenom dejstvu sa mogućim posledicama na stanje

ekosistema (Despotović, 2013). U prošlosti se praćenje stanja ţivotne sredine zasnivalo na

merenju fizičkih i hemijskih parametara sredine, meĎutim dobijeni podaci su govorili o stepenu

zagaĎenja, ali ništa o efektima koje zagaĎivači imaju na biološke sisteme (Despotović, 2013).

Osnovna svrha praćenja stanja ţivotne sredine jeste dobijanje dovoljnog broja pouzdanih

informacija na osnovu kojih se moţe vršiti ekološka procena rizika (eng. Ecological risk

assessment-ERA) (Despotović, 2013). OdreĎivanje stepena rizika od zagaĎenja predstavlja

proces praćenja intenziteta i mogućnosti uticaja čoveka na spoljašnju sredinu (Suter, 1993,

Despotović, 2013). Prvobitno ERA je razvijena da bi se utvrdio štetan uticaj različitih hemikalija

na spoljašnju sredinu i obezbedila kvantitativna osnova za kategorizaciju i poreĎenje različitih

oblika rizika, kao i poboljšanje razumevanja rizika (Despotović, 2013).

Vodeni ekosistemi su u stalnoj biohemijskoj dinamici, čiji intenzitet zavisi od niza

abiotičkih i biotičkih faktora koji neprekidno variraju vremenski i prostorno (S. Simić i V. Simić,

2009). Na dinamične procese u ekosistemu znatno utiču i prirodni faktori koji dospevaju iz

spoljašnje sredine (atmosferske padavine, dotok vode sa mineralnim materijama), ali i faktori

koji su rezultat aktivnosti ljudi i koji uglavnom izazivaju negativne efekte na vodene ekosisteme

(S. Simić i V. Simić, 2009). Bilo koja materija, u velikim i neprirodnim količinama, koja se naĎe

u vodi moţe da bude zagaĎujuća materija (S. Simić i V. Simić, 2009).

1.3 Ekotoksikološki testovi

Testovi ekotksičnosti (bioeseji) predstavljaju eksperimente u kojim se ispituje uticaj

hemikalija i uslova sredine na raznim test vrstama (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Oni

su neophodni za procenu rizika od novih i već postojećih hemikalija, kao i za monitoring

kvaliteta ţivotne sredine (npr. otpadnih voda, sedimenata i uzoraka tla) (Ratte, Hammers-Wirtz i

Cleuvers, 2003). U svakom testu meri se jedna ili više karakterističnih varijabli, koje se kao

subletalni efekti testa nazivaju krajnje tačake (eng. „endpoints“). Termin „endpoint“ („response

variable“) odnosi se na biološki parametar koji se meri odnosno posmatra (npr. preţivljavanje,

12

broj jaja, veličina ili teţina, nivo enzima) (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Termini

„efekat“ i „odgovor“ opisuju promene u ovim varijabljama koje se posmatraju (Ratte, Hammers-

Wirtz i Cleuvers 2003). Kod kvantitativnih varijabli (npr. mortalitet) subletalni efekt je iskazan u

vidu promena broja jedinki koje su pogoĎene, kod kontinuiranih varijabli (npr. stopa rasta)

iskazan je procentom promene prosečnog nivoa varijable, tj „endpoint“-a (Ratte, Hammers-Wirtz

i Cleuvers, 2003). I kod jednih i kod drugih tipova praćenih varijabli rezultati se uporeĎuju sa

kontrolom (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Kontrola je referentno stanje bez prisustva

polutanta tj. ksenobiotika. Kod ekotoksikoloških testova najbitnije je da se meĎusobno mogu

uporeĎivati i da se moţe proveriti tačnost nekog izvedenog testa ponovnim izvoĎenjem pod

istim, tačno definisanim uslovima. (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Zbog toga se

testovi izvode po principima Dobre Laboratorijske prakse (eng. Good Laboratory Practice)

(GLP; OECD 1998b) i koriste se internacionalno prihvaćene smernice i standardi, koje su

razvijene od strane nekoliko svetskih internacionalnih organizacija: OECD (Organisation of

Economic Cooperation and Development), CEN (Comité Européende Normalisation) i ISO

(International Organization for Standardization) (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003).

Ekotoksikološki testovi se koriste u pravnoj kontroli hemikalija i procene kvaliteta

otpadnih voda (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Stoga ekotoksikološki test mora da da

pribliţno iste rezultate u različitim laboratorijama i u istoj laboratoriji u različitom vremenu, tj.

rezultati takvih biotestova moraju biti konzistentni i ponovljivi (Ratte, Hammers-Wirtz i

Cleuvers, 2003). Da bi se dostigla visoko ponovljivost i konzistentnost uslovi testa moraju da

budu striktno regulisani (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Tako, od 1980-ih, različite

organizacije (npr. OECD, CEN, ISO, ASTM) razvijaju pravilnike za vaţne ekotoksikološke

testove u cilju standardizacije testova i metoda procene (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers,

2003). Naravno, ukoliko se test ponavlja nekoliko puta ili se sprovodi u istom trenutku na

razičitim mestima, rezultati nece biti potpuno isti zbog biološke varijabilnosti test organizama

koji su uključeni, kao i zbog odreĎenih varijabli koje je nemoguće potpuno precizno kontrolisati

(Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Najveći potencijalni izvori variranja u

ekotoksikološkim testovima su genetski i ekološki (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003).

Ekološka varijabilnost u izvodjenju ekotoksikoloških testova moţe biti smanjena

striktnim regulisanjem uslova okruţenja (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Neki

13

ekološki faktori se mogu lako kontrolisati, kao što je temperature, reţim svetlosti i tip podloge

(Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Ali postoje mnogi faktori koje je teţe kontrolisati, kao

što je snabdevanje ţivom hranom pribliţno istog kvaliteta, pri čemu ovaj faktor ima veliki uticaj

na razvoj test organizama i stoga, moguće, na efekte ekotoksikanta (Soares i Calow 1993; Ratte,

Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). U većini test sistema merena varijabilnost je kombinacija

kako genetskih, tako i ekoloških varijacija (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Da bi se

odredio nivo varijacije u konzistentnosti i ponovljivost samih testova, sprovedeni su takozvani

„kruţni testovi” (eng. „ring tests“), gde su različite laboratorije istraţivale jedno ili nekoliko

toksičnih jedinjenja, nekoliko puta (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Pokazalo se da što

je sistem sloţeniji i što je manji broj uključenih test organizama, to je obično veća varijabilnost

test sistema (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers 2003). Potrebna je velika reproduktivnost i velika

ponovljivost u toksikološkim testovima, ali, s druge strane, iz ugla praktičara i onih koji plaćaju

za njih, testovi bi trebalo da budu izvodljivi, poţeljno, u malim laboratorijama i jeftini (Bödeker

et al. 1992; Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003).

1.4 Hironomide kao model organzmi ekotoksikoloških testova

Akvatični organizmi mogu posluţiti kao dobri model sistemi za proučavanje bazičnih

procesa ćelijskih i tkivnih oštećenja, praćenih fiziološkim posledicama kao što su bolesti i

starenje, kao i imunološke reakcije na nastanak slobodnih radikala u organizmu (Despotović,

2013). Slatkovodni beskičmenjaci su dobri model organizmi za proučavanje uticaja faktora

sredine u biomonitoring studijama zbog svojih karakteristika: slabe pokretljivosti, načina ishrane,

brojnosti i veličine tela. (Despotović, 2013). Oni imaju sposobnost da u svom telu akumuliraju

znatne količine zagaĎujućih materija (Despotović, 2013). Na osnovu analize sadrţaja ovih

materija u beskičmenjacima moguće je zaključivati o kvalitetu sredine (Despotović, 2013).

S obzirom da na Zemlji ima više od pet miliona vrsta, tek veoma mali broj njih se koriste

kao test organizmi u ekološkim procenama rizika i efekta na ekosistem (Ratte, Hammers-Wirtz i

Cleuvers, 2003). Vaţni kriterijumi za izbor vrste, tj. bioindikatora, koja će biti korišćena za

ekotoksikološki test su: osetljivost, dostupnost vrste, ekološki značaj i praktični aspekti (lako

14

rukovanje i uzgajanje vrste u laboratoriji) (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Osim toga,

veoma su korisne osnovne informacije o vrsti (njena psihologija, genetika i ponašanje) za

tumačenje rezultata testova (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003).

Zbog razlike u osetljivosti izmeĎu različitih vrsta, sam izbor adekvatne vrste za

ekotoksikološki test ima velikog uticaja na ishod samog testa (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers,

2003). Uopšteno najosetljivija test vrsta ne postoji zato što osetljivost vrste zavisi od vrste agensa

kojoj je ona izloţena i ostalih uslova i parametara samog eksperimenta (od tipa podloge na kojoj

se jedinke odreĎene vrste uzgajaju). (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers, 2003). Stoga je vaţno

istraţiti nekoliko vrsta koje pokazuju različite osetljivosti (Ratte, Hammers-Wirtz i Cleuvers,

2003).

Larve familije Chironomida (Diptera) su izuzetno pogodne za biološka istraţivanja

sedimenata slatkovodnih ekosistema iz više razloga:

Većinu svog ţivota larve provode u površinskim sedimentima, gde su izloţene

uticaju toksikanata direktnim fizičkim kontaktom ili putem ingestije;

Imaju kratak ţivotni ciklus, pa je moguće u laboratoriji proizvesti deset ili više

generacija godišnje;

Izuzetno su brojne u bentosu;

Relativno su osetljive na polutante.

Iz gore navedenih razloga larve hironomida se sve više koriste kao test organizmi, tj.

bioindikatori u biološkim istraţivanjima (Giesy et al., 1988; Pascoe et al., 1990; Timmermans et

al., 1992).

Štetne supstance se akumuliraju u tkivu beskičmenjaka, pa se tako dalje, kroz lanac

ishrane prenose do riba, a na kraju i do ljudi (Hudson i Ciborowski, 1996). Na osnovu toga, larve

hironomida potencijalno igraju glavnu ulogu u bioakumulaciji i transportu štetnih supstanci

(Hudson i Ciborowski, 1996). Kako su hironomide slabo pokretni organizmi one pokazuju stanje

sedimenata tamo gde su uzorkovane (Pinder 1995; Hudson i Ciborowski, 1996). Iako je familija

hironomida velika grupa, većina istraţivanja je koncentrisana na larvama roda Chironomus

Meigen, 1803, a u okviru tog roda Chironomus tentans Fabricius, 1805 i Chironomus riparius

Meigen, 1804, dve široko rasprostranjene vrste sedimenata mekog tla (e.g., Bird et al., 1995;

15

Janssens de Bisthoven, 1998a, b; Martinez et al., 2001; Vermeulen et al., 2000; Martinez et al.,

2004; MacDonald i Taylor, 2006).

Larve hironomida u kasnijim stupnjevima često razvijaju deformitete na delovima usnog

aparata i glavene čaure, posebno na mentumu, kada su izloţene stresu ili zagaĎenju (MacDonald

i Taylor 2006). Učestalost deformiteta moţe se iskoristiti kao jako pouzdan parametar kako bi se

procenila subletalna toksičnost koja potiče od teških metala, radioaktivnosti, organofosfatnih ili

organohloridnih pesticida i ksenobiotika (Bird et al., 1995; Servia et al., 1998; Swansburg et al.,

2002; Watanabe et al., 2000; Mori et al., 1999; Vermeulen et al., 1995; Martinez et al., 2002;

MacDonald i Taylor, 2006). Kod subletalnih toksičnih delovanja dešavaju se promene u rastu,

razvoju, razmnoţavanju i ponašanju.

Decenijama je razmatrano da li bi deformiteti usnih delova potencijalno mogli biti

indikatori kod in situ biološke procene i biomonitoringa stresa izazvanog toksičnim agensima u

potocima i jezerima (Bird 1994; Gerhardt et al. 2006; Groenendijk et al. 1998; Janssens De

Bisthoven et al. 1998a; Meregalli et al. 2000; Warwick 1990; Langer-Jaesrich, Köhler i

Gerhardt, 2010). In situ označava da se pojave posmatraju na originalnom lokalitetu u okviru

pasivnog biomonitoringa. U brojnim terenskim istraţivanjima veći broj hironomida sa

deformitetima usnih delova pronaĎeno je u zagaĎenim vodotokovima (Dermott 1991;

Groenendijk et al. 1998; Janssens De Bisthoven et al. 1998a; Warwick 1990; Wiederholm 1984;

Langer-Jaesrich, Köhler i Gerhardt, 2010). Mogući razlog za to je kontaminacija

radionukleoidima, uljanim jedinjenjima, policikličnim aromatičnim ugljovodonicima (PAH),

organohlornim pesticidima, polihlorovanim bifenilima (PCB) i posebno, teškim metalima

(Janssens de Bisthoven et al., 1998b; Langer-Jaesrich, Köhler i Gerhardt, 2010). Iako se često

stresori i povećana učestalost deformiteta usnih delova poklapaju prostorno, potrebno je obratiti

paţnju na sledeće:

Kada se poveća učestalost deformiteta usnih delova, u mnogim studijama nije

pronadjena korelacija izmeĎu toksikanata i deformiteta (Bird, 1994; Dermott,

1991; Jeyasingham and Ling, 1997; Jeyasingham and Ling, 2000; Nazarova et al.,

2004; Reynolds and Ferrington, 2001);

Usled činjenice da su mnoga pomenuta jedinjenja pronaĎena in situ, u mnogim

slučajevima nije moguće uspostaviti direktnu vezu;

16

U nekim nezagaĎenim oblastima povećana učestalost deformiteta usnih delova

varira i u zavisnosti od sezone (Jeyasingham and Ling, 2000). Nekoliko studija

sugerišu da sezona (godišnje doba) ima veliki uticaj na učestalost deformiteta

(Jeyasingham and Ling, 1997; Reynolds and Ferrington, 2001; Servia et al., 2000;

Urk et al., 1992).

Ovi rezultati oteţavaju implementaciju hironomida, kao indikatora zagaĎenja, u postojeće

monitoring programe (Langer-Jaesrich, Köhler i Gerhardt, 2010).

Postoji još nekoliko ograničenja u rutinskom korišćenju hornomida za biomonitoring

(MacDonald i Taylor, 2006).

Veoma sitni detalji usnih delova mogu biti teški za uočavanje u ranim

stadijumima larvi ili kod manjih vrsta ukoliko se ne koriste posebni mikroskopi

(MacDonald i Taylor, 2006).

Vremenski zahtevna determinacija takoĎe moţe zadati poteškoće u primeni

metoda.

Različite vrste variraju u toleranciji na toksične agense (Hamilton & Saether,

1971; Hare & Carter, 1976; Wiederholm, 1984) i svojoj sklonosti da razvijaju

deformitete (Servia et al., 1998; Janssens de Bisthoven, 1998b; Vermeulen et al.,

2000; Martinez et al., 2001; Martinez, 2004).

Pored toga, situacija sa terena koji su zagaĎeni i gde postoji povećana učestalost teških

deformiteta ne moţe se bas lako reprodukovati u laboratorijskim eksperimentima (MacDonald i

Taylor, 2006). Čak i u studijama u kojima su ispitivani polutanti uspeli da izazovu povišenu

stopu deformiteta, linearna veza izloţenosti-odgovora izmeĎu zagaĎivača (ksenobiotika) i

deformiteta ipak nije pronaĎena (Dias et al., 2008; Martinez et al., 2001; Vermeulen et al.,

2000a; MacDonald i Taylor, 2006). Ova zapaţanja nisu pouzdana da bi podrţala upotrebu

deformiteta hironomida kao indikatora zagaĎenja, pogotovo zato što je moguće da su te

deformitete kod hironomida izazvali neki drugi stresori prisutni na terenu (MacDonald i Taylor,

2006).

U većini objavlenih studija korišćen je samo jedan stresor, uglavnom neki od teških

metala, kako bi se izazvao deformitet na delovima usnog aparata hironomida (Bird et al., 1995;

17

Janssens de Bisthoven et al., 2001; Janssens de Bisthoven et al., 1998b; Martinez et al., 2001;

Vermeulen et al., 2000a; MacDonald i Taylor, 2006). MeĎutim, zagaĎena područja su uglavnom

zagaĎena većim brojem supstanci (MacDonald i Taylor, 2006). Stoga je potrebno da se obezbede

konzistentniji podaci o uzročnicima deformiteta hironomida (Vermeulen et al., 2000a;

MacDonald i Taylor, 2006).

Da bi se odredilo da li je odredjeno područje, tj. lokalitet, izloţeno polutantima, moraju se

uračunati i deformiteti koji prirodno postoje kod larvi (MacDonald i Taylor, 2006). Postoji

nedostatak informacija kada je u pitanju prirodna učestalost deformiteta u sredinama koje nisu

izloţene stresu, pogotovo za vrste koje se ne koriste često u istraţivanjima, pa to oteţava

primenu ove metode biomonitoringa (van Urk et al., 1992; MacDonald i Taylor, 2006).

U isto vreme, kontaminacija sedimenata ili druga zagaĎenja mogu da eliminišu neku

vrstu potpuno (MacDonald i Taylor, 2006). Iako se potpuni nestanak odreĎene vrste moţe takoĎe

iskoristiti da bi se ukazalo na zagaĎenje, ipak komplikuje primenu deformiteta delova usnenog

aparata za preciznije odreĎivanje zagaĎenja (MacDonald i Taylor, 2006).

Nekoliko studija je pokazalo deformitete mentuma kod hironomida kao odgovor na

zagaĎenje (Warwick, 1980a, 1980b, 1991; Warwick et al., 1987; Dermott, 1991; Janssens de

Bistoven et al., 1992; Lenat, 1993; Bird, 1994), a nekoliko studija je istraţivalo korišćenje

deformiteta mentuma kao “endpoint” u ekotoksikološkim testovima (Warwick, 1980a, 1980b,

1991; Warwick et al., 1987; Dermott, 1991; Janssens de Bistoven et al., 1992; Lenat, 1993; Bird,

1994), dok su druge studije koristile vreme u uspešnost izleganja kao “endpoint” (Wentsel et al.,

1978; Hart et al., 1987). U svim ekotoksikološkim testovima koja se vrše u laboratoriji veoma je

bitan izbor supstrata prilikom postavke eksperimenta. Njegove fizičke karakteristike mogu

uticati na rast i preţivljavanje organizama i na taj način predstavljati glavni generator prirodne

varijabilnosti u ekotoksikološkim testovima (Bird, 1997). Nekoliko autora koristilo je organsku

materiju kao supstrat (Batac-Catalan and White, 1982; Kosalwat and Knight, 1987), dok su drugi

koristili mineralne supstrate (Hamilton and Saether, 1971; Hart et al., 1987; Giesy et al., 1988).

Vavrik (1988) je sugerisao da je visok stepen istrošenosti zuba i mandibula kod larvi uzgajanih

na mineralnom supstratu (pesku) moţda uticao na analizu podataka iz studije toksičnosti

sprovedene od strane Hamilton and Saether (1971) . Korišćenje grubljeg mineralnog supstrata

(pesak krupnijeg zrna) je pokazalo manju istrošenost zuba mentuma nego na drugim testiranim

18

podlogama (D. R. Hart, Beak Consultants Ltd. Brampton, Ontario, pers. comm.). Trošenje usnih

delova zbog ingestije mineralnih čestica moţe prikriti deformacije ili biti pogrešno protumačeno

kao deformitet i tako dati laţne rezultate na kraju eksperimenta (Bird, 1997).

Kod analize efekata, tj. ocene štetnosti ili odgovora organizma na delovanje nekog agensa

procenjuje se promena nastala u prirodi kao i veličina te promene. Ta promena nastala je usled

izloţenosti datoj zagaĎujućoj supstanci, tj. stresoru, pa se u tu svrhu koristi veliki broj bioloških

eseja i testova. OECD (Organizacija za ekonomsku saradnju i razvoj, eng. “Organisation of

Economic Cooperation and Development”) obezbeĎuje uputstva za biološke testove putem kojih

se testiraju hemijske supstance. Ova uputstva su podloţna izmenama i mogu biti korigovana s

vremenom od strane zemalja članica (za koje vreme će se razviti i odobriti novi ili izmenjeni

protokol zavisi najviše od dogovora zemalja). OECD testovi predstavljaju usklaĎene test metode

do kojih se došlo zajedničkom odlukom OECD saveta za medjusobno prihvatanje podataka. Ovo

znači da je moguće meĎusobno uporeĎivati i analizirati podatke različitih testova jer su svi

izraĎeni pod istim uslovima, a u skladu sa OECD uputstvima za testove i OECD principima

dobre laboratorijske prakse. Sve ovo vodi mnogo lakšoj proceni uticaja mnogih testiranih

supstanci širom sveta i mnogo lakšem i usklaĎenijem praćenju stanja ţivotne sredine

(http://www.oecd.org/ ).

Akutni i hronični testovi sa hironomidama – biljnim komarcima (ordo: Diptera, Familia:

Chironomidae) predstavljaju deo standardne procedure analize supstanici za registraciju

agrohemikalija (pod evropskom direktivom zaštite biljnih produkata 91/414/EEC), kao i biocida.

Rezultati ovih testova koriste se pri proceni rizika i uticaja na ţivotnu sredinu. OECD protokoli

koji se najviše koriste jesu 218: test sa supstancom u sedimentu- OECD, 2004a (”Sediment water

chironomid toxicity test using spiked sediment“) i 219: test sa supstancom u vodi- OECD, 2004b

(”Sediment water chironomid toxicity test using spiked water“). Od 2011. prihvaćen je i test koji

se radi u test sistemu samo sa vodom: akutni imobilizacioni test (“Chironomus sp. acute

immobilization test”). Osmišljen je i test punog ţivotnog ciklusa (prsten test), koji predstavlja

proširenje prethodnih testova. Test se ne završava sa izletanjem adulta, već se imago prebacuju u

akvarijum za razmnoţavanje, jaja polaţu u isti sistem sa test supstancom, kao onaj iz koga su se

izlegli, prati se izleganje larvi (F1 generacija), pa se one prebacuju ponovo u posude sa

supstancom i prate do izletanja. Prate se, dakle, 2 generacije (P i F1), pa se moţe pratiti uticaj na

19

reprodukciju, fekuditet i fertilitet, akumulaciju, nasledne efekte i ostale parametre (Bruns i

Weltje, 2009).

20

2. Ciljevi istraživanja

Cilj ovog istraţivanja je optimizacija postojećeg OECD Protokola za tretiranje toksičnih

supstanci u sedimentu, u pogledu smanjivanja prirodne varijabilnosti oblika mentuma,

subletalnog efekata biološkog testa. Za realizaciju ovog cilja testiran je uticaj tipa podloge na

pojavu vidljivih deformiteta mentuma kod larvi hironomida. Pored toga, analizirana je i

varijabilnost oblika mentuma na larvama izloţenim različitim tipovima podloga.

21

3. Materijali i metode

3.1 Uzgajanje kulture Chironomus tentans

Larve hironomida sakupljene su na prirodnom staništu, starom koritu reke Nišave (Slika

1). Nakon identifikacije, larve su premeštene u akvarijum i nastavljeno je uzgajanje pod

laboratorijskim uslovima, sa kontrolisanom temperaturom, aeracijom i svetlosnim reţimom.

Nakon izletanja adulta i njihovog parenja, paketi jaja koje su poloţile ţenke sakupljeni su i

izolovani u manjim akvarijumima. Na taj način stvorena je čista kultura Chironomus tentans

kojoj je bilo moguće pratiti dalje razviće od jajeta, preko larvi do adulta i koja je bila korišćena

za dalje eksperimente.

Akvarijumi za uzgoj kulture su napravljeni od komercijalno dostupnog stakla. Iznad

svakog akvarijuma, na otvoru se delom nalazi mreţasta rojilica za rojenje adulta, a ostatak je

pokriven istom vrstom mreţice. Rojilica je napravljenja od jednostavnog drvenog okvira na koji

Slika 1. Prirodno staniste Chironomus tentans sa koga su prikupljene larve

22

je postavljena najlonska mreţica. Donja strana rojilice osigurana je sunĎerastim trakicama za

izolaciju kako bi se sprečilo bekstvo adulta (Sika 2).

Populacija hironomida je formirana u staklenim akvarijumima zapremine 80 litara. Voda

u akvarijumu sastoji se iz 50% česmene vode i 50% destilovane vode (u odnosu 1:1). Dubina

vode u akvarijumu je pribliţno 15cm. Populacija se konstantno snabdeva vazduhom pomoću

vazdušnih pumpi (akvarijumskih pumpi za kiseonik). Temperatura je odrţavana na 21 ± 0,5ºC.

Fotoperiod, tj. odnos svetlosti i mraka je vaţan kod uzgajanja larvi hironomida zbog njihovog

pravilnog razvitka, a odrţavan je u odnosu 16:8 (16 sati svetlosti : 8 sati mraka, što imitira

uslove u prirodi). Ukoliko se neki od kontrolisanih parametara promeni, npr. smanji svetli period

ili se poveća temperatura u trajanju više od dva dana, izleganje adulta je odloţeno (Maier,

Kosalwat i Knight, 1990). Tvrdoća vode je 7,3 ± 0,25 °dH, provodljivost 325 μS/cm3, a pH 7,2.

Larve hironomida zahtevaju supstrat kako bi mogle da grade zaštitne kućice u koje se

zavlače. Za supstrat je korišćen celulozni papir, koji se pokazao kao najadekvatnija podloga za

uzgoj hironomida u laboratoriji. Supstrat je pripremljen na sledeći način: usitnjeni ubrus papiri se

prvo natope acetonom kako bi se uklonile nečistoće; nakon toga papir se ispira destilovanom

Slika 2. Akvarijum za uzgoj kulture hironomida u ekotoksikološkoj laboratoriji na Prirodno-

matematičkom fakultetu u Nišu

23

vodom, sve dok se potpuno ne ukloni miris acetona (najbolje je za to koristiti sito); potom se

papir kuva u destilovanoj vodi (60 min na temperaturi od 100ºC); na kraju se pomoću sita iscedi

višak vode i supstrat je spreman za korišćenje. (Slika 3)

Larve su hranjene svakodnevno TetraMin® mešavinom riblje hrane (Sastav hrane: biljni

sastojci, riba i riblji proizvodi, belančevine, ţitarice, alge, ulja, masti, školjke, minerali, šećeri,

rakovi, kvasac, lecitin). Hrana je pripremana usitnjavanjem i rastvaranjem 1g mešavine riblje

hrane u 10ml destilovane vode.

3.2 Postavka eksperimenta

Za postavku eksperimenta korišćena su sveţe izlegla jaja. Svaki paket jaja izolovan je u

zasebnu petrijevu posudu u kojoj se nalazila voda iz akvarijuma u kojoj je uzgajana kultura

(Slika 4). Na taj način omogućeno je da se zna tačno poreklo i starost jedinki, kao i da se prate

njihove aktivnosti. Biološki test sa hironomidama izveden je praćenjem smernica OECD

protokola (Organizacija za ekonomsku saradnju i razvoj, eng. “Organisation of Economic

Cooperation and Development”), tačnije OECD testa broj 218, dizajniranog za procenu uticaja

Slika 3. Larve hironomida u podlozi

24

dugotrajnog izlaganja hemikalijama, korišćenjem larvi hironomida koje ţive u sedimentu kao

model organizama (eng. “Sediment water chironomid toxicity test using spiked sediment” – Test

toksičnosti na hironomidama u sistemu sa sedimentom i vodom korišćenjem zagaĎenog

sedimenta) (OECD, 2016).

U eksperimentu je testirano je pet vrsta sedimenata:

1. Standardna podloga – 46,66g treseta rastvorenog u destilovanoj vodi, 186,66g kaolinske

gline i 700g kvarcnog peska;

2. Standardna podloga sa medicinskom glinom – 46,66g treseta rastvorenog u destilovanoj

vodi, 186,66g medicinske gline i 700g kvarcnog peska;

3. Standardna podloga bez peska – 46,66g treseta rastvorenog u destilovanoj vodi i 186,66g

kaolinske gline;

4. Standardana podloga bez gline – 46,66g treseta rastvorenog u destilovanoj vodi i 700g

kvarcnog peska;

5. Standardna podloga bez treseta – 186,66g kaolinske gline i 700g kvarcnog peska.

U staklene tegle zapremine 600ml, prečnika 8cm stavljen je sediment u sloju visine 2cm.

Na to je dodata mešavina česmenske vode (koja je prethodno dehlorisana; pH 6.52±0.4; tvrdoća

Slika 4. Paketi jaja izolovani u Petrijeve posude kako bi se pripremili za dalje korišćenje u

eksperimentu

25

7.3 °dH; provodljivost 325 μS/cm3) i destilovane vode u razmeri 1:1. Svaki od ispitivanih

sedimenata stavljen je u po 3 tegle. Po 20 jedinki, larvi hironomida prvog stupnja, 4 dana nakon

izleganja stavljeno je u svaku teglu. Temperatura vode u teglama odrţavana je na 21 ± 1ºC

pomoću vodenog kupatila, sa laganom aeracijom i 16:8 dnevno-noćnim ciklusom (Slika 5).

Hrana je pripremana svakodnevno, rastvaranjem 0,15g TetraMin® mešavine riblje hrane u 9ml

destilovane vode i u svaku teglu je dodavano 0,5ml rastvora. Nakon 8 dana larve su dostigle

četvrti stupanj. Kako bi bili sigurni da su sve jedinke dostigle četvrti larveni stupanj, eksperiment

je nastavljen do jedanaestog dana. Tada je eksperiment prekinut i larve četvrtog stupnja iz svake

tegle su prikupljene. Larve su dalje konzervirane u 70% etanolu.

Slika 5. Staklene tegle u vodenom kupatilu

26

3.3 Statistčka obrada podataka

3.3.1 Geometrijska morfometrija

U svrhu daljih morfometrijskih analiza, glave larvi hironomida su odstranjene i kuvane

15 minuta u 15% KOH na temperaturi od 100°C u, kako bi glavena čaura (gula) omekšala i bila

speremna za montiranje na mikroskopske pločice, tj. slajdove (polutrajne mikroskopske

preparate). Glavene kapsule su postavljene na mikroskopske pločice pomoću Berlez medijuma u

ventralnu poziciju (Slika 6). Mandibule su uklonjene kako ne bi smetale pri analiziranju

mentuma. Slajdovi su ostavljeni da se osuše 20 dana. Glavene kapsule, odnosno mentumi, su

ispitivani pod mikroskopom na uvećanju 200x i fotografisani (korišćen je Leica MZ16A

stereomikroskop sa 10x/21B uvećanjem na okularu i 20x na objektivu; fotografije su uslikane

pomoću kamere Leica DFC320 Digital Camera system).

Slika 6. U toku pravljenja preparata, postavljanja glave prokuvane u KOH na berlez

27

Mentum je deo usnog aparata hironomida sa centralnom simetrijom. Na njemu se nalazi

13 zuba, po 6 zuba na svakoj strani, i oni se nazivaju lateralni, dok je u centru srednji (medijalni)

zub koji ima tri dela. Morfološke varijacije mentuma analizirane su pomoću geometrijske

morfometrije. Glavni cilj geometrijske morfometrije je proučavanje varijacije oblika i veličine

struktura i njihove kovarijacije sa drugim varijablama. Morfometrija omogućava kvantitativne

opise organizama. Geometrijska morfometrija koristi skup obeleţja, tj. tačaka (“landmark”) za

opisivanje proučavanih oblika (organizama ili delova organizama). Landmark je dvo- ili

trodimenzionalna tačka koju definiše skup pravila. Analizirano je ukupno 178 mentuma

(nekoliko je polomljeno prilikom pravljena preparata i bilo neupotrebljivo za analizu). Za

kvantifikaciju variranja u veličini i obliku mentuma, digitilizovano je (odreĎeno) 29 tačaka na

svakom mentumu (Slika 7). Za digitalizaciju tačaka korišćen je tpsDig2 program (Rohlf, 2005).

Kako mentumi imaju centralnu simetriju, tačke su postavljene na sledeći način: od 1 do 8 opisuju

četiri mala lateralna zuba sa leve strane mentuma, a od 22 do 28 opisuju četiri mala zuba sa

desne strane; od 8 do 12 opisuju dva velika unutrašnja lateralna zuba na levoj strani, a tačke od

18 do 22 opisuju dva velika unutrašnja lateralna zuba sa desne strane mentuma; tačke od 12 do

18 opisuju veliki medijalni zub koji je podeljen na tri manja dela. Pomoću ovih tačaka praćene su

suptilne promene u obliku mentuma koje nisu vidljive golim okom i mogu se analizirati samo uz

pomoć datog softvera. Smatrano je da mentum poseduje deformitet ukoliko je postojao neki

dodatni zub, nedostajao neki od zuba, postojala fuzija (bili su spojeni neki zubi), ali ukoliko je na

mestu gde nedostaje zub ivica bila oštra smatralo se da je zub polomljen.

Slika 7. Pozicija 29 tačaka na mentumu hironomida

28

Uz pomoć TpsRewl softvera proverena je pozicija homologih tačaka svih mentuma

(Slika 8).

3.3.2 Multivarijantni i univarijantni testovi

Deformaciona ploča predstavlja mreţu pomoću koje moţemo da vidimo promene u

veličini i obliku mentuma. Vektori prikazuju variranje oblika (skalirano sa “Scale Factor” = -

6,0) .Najveće variranje u veličini i obliku se primećuje kod medijalnog zuba. (Slika 9)

Slika 8. CS odabranih tačaka sa vektorskim prikazom odstupanja od centralne vrednosti

Slika 9. Promena oblika mentuma prikazana na “deformacionoj mreţici”

29

Pomoću programa MorphoJ (Klingenberg, 2011) su izračunate Prokrusteove koordinate i

veličina centroida (CS). Za vizualizaciju varijabilnosti oblika mentuma primenjena je analiza

glavnih komponenti (PCA) i kanonijska diskriminantna analiza (CVA). CVA omogućava a

priori definisanje grupa (u našem slučaju tretmana na različitoj podlozi), čime se detektuju

minimalne medjugrupne razlike u obliku struktura. Ukupno je analizirano 178 jedinki podeljenih

u pet grupa na osnovu podloge na kojoj su uzgajane: standardna podloga, standardna podloga sa

medicinskom glinom, standardna podloga bez peska, standardana podloga bez gline i standardna

podloga bez treseta. S obzirom da PCA i CVA vizuelizuju obrasce varijabilnosti mentuma bez

statističkih indikacija, značajne razlike u veličini mentuma izmedju grupa su testirane primenom

analize varijanse (ANOVA) na CS (“Centroid Size”), a razlike u obliku mentuma primenom

MANOVA na svim varijablama oblika kao zavisno-promenljivim. Konačno, razlika u stopi

mortaliteta jedinki različitih tipova podloga je testirana neparametarskom analizom varijanse

(Kruskal-Wallis-ov test). Sve statističke analize uradjene su u programskom paketu

STATISTICA (Stat Soft. Inc. 7.0).

30

4.Rezultati i diskusija

4.1 Vidljive promene strukture mentuma

Nakon 11 dana, eksperiment je prekinut, a sa svakog tipa podloge je izolovan različit broj

larvi četvrtog stupnja (Tabela 1). Na standardnoj podlozi bez gline je dostignuta stopa

preţivljavanja u skladu sa protokolom (mortalitet manji od 30%). MeĎutim, Kruskal-Wallis-ov

test nije pokazao statistički značajne razlike (p>0.05) u stopi preţivljavanja izmeĎu različitih

tipova podloge. Ovakvi rezulati upućuju da glina, korišćena u istraţivanju, verovatno toksično

deluje na jedinke vrste Chironomus tentans i da zbog toga povećava nivo mortaliteta u svim

tipovima podloge gde je prisutna.

Tip podloge Standardna

podloga bez

treseta

Standardna

podloga bez

peska

Standardna

podloga sa

medicinskom

glinom

Standardna

podloga bez

gline

Standardna

podloga

Broj tretmana 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3

Broj preţivelih

larvi po

tretmanu

12

13

13

9

13

11

13

15

9

17

20

14

13

14

7

Ukupno

preţivelih larvi

38

33

37

51

34

Od ukupno178 analiziranih mentuma na 5 razlučitih tipova podloga detektovano je dva

mentuma sa vidljivim deformacijama, odsustvo jednog ili dva zuba (na standardnoj podlozi bez

treseta i standardnoj podlozi bez gline; Prilog 1). Istrošeni mentumi su se najčešće javljali u

tretmanima sa standardnom podlogom bez treseta (12) i standardnom podlogom bez gline (Prilog

2).

Postoji veliki broj publikacija na temu uticaja kontaminiranih supstrata na deformitete

delova usnog aparata kod larvi familije Chironomidae (Wiederholm, 1984; Dickman i Rygiel,

1996; Hudson i Ciborowski, 1996; De Bisthoven, Vermeulen i Ollevier, 1998; Watts i Pascoe,

1998; MacDonald i Taylor, 2006; Arambourou, Beisel, Branchu i Debat, 2012) MeĎutim, samo

jedna studija (Bird, 1997) je pratila uticaj tipa podloge na stepen deformisanosti mentuma vrste

Chironomus tentas u laboratorijskim uslovima. Rezultati su pokazali da ne postoji značajna

Tabela 1 Broj preţivelih larvi po tretmanima (tipu podloge).

31

razlika u javljanju deformisanih mentuma na četiri različita tipa podloge (papir, sitan pesak,

krupan pesak i glina). S druge strane najveći broj istrošenih mentuma je detektovan na sitnom

pesku a najmanji na krupnom pesku. Rezultati našeg eksperimenta su u skladu sa prethodnom

studijom, gde je najveći broj istrošenih mentuma izolovan na podlozi bez treseta i gline. Na

takvim podlogama je povećana količina peska što verovatno dovodi do pojačanog trošenja zuba

mentuma. Frekventnost javljanja deformisanih mentuma, kao i u studiji Bird-a (1997) nije bila

pod značajnim uticajem tipa podloge.

Statistički testovi su pokazali značajnu varijaciju u okviru uzorka. Varijacija veličine

mentuma, izračunata kao veličina centroida (CS) analiziranih varijabli (one-way ANOVA, p =

0.00), kao i varijacija oblika mentuma (multivarijantna analiza varijanse - MANOVA, na celom

setu varijabli, p = 0.00) bile su statistički značajne. Potom je izvršena dalja PCA i CVA analiza i

vizualizacija u MorphoJ softveru (Klingenberg, 2011).

Effect SS Degr. of

Freedom

MS F p

Intercept 396240142 1 396240142 14143.49 0.000000

Podloga 198991 4 49748 1.78 0.135842

Error 4846722 173 28016

Effect Test Value F Effect df Error df p

Intercept Wilks 0.000000 148541483 27 147.0000 0.000000

podloga Wilks 0.177124 3 108 586.0860 0.000000

4.2 Variranje oblika mentuma diskriminantnom kanonijskom analizom

(CVA)

Rezultati diskriminantne kanonijske analize (CVA) pokazuju duţ kojih osa se prethodno

definisane grupe razdvajaju. Ove ose maksimalizuju meĎugrupno u odnosu na unutargrupno

variranje odabranih karaktera. (Slika 10) (Ilić Milošević, 2015)

Tabela 2. One-way ANOVA, p=0.00, analiza varijacije velicine mentuma, izračunata kao veličina

centroida (CS) analiziranih varijabli

Tabela 3. Analiza varijacije oblika mentuma pomoću multivarijantne analize varijanse – MANOVA

na celom setu varijabli, p=0.00

32

CVA vizualizuje razdvajanje grupa po prvoj i drugoj kanonijskoj osi (Slika 10). Elipsama

su obuhvaćene grupe jedinki koje su uzgajane na istoj podlozi. Po prvoj kanonijskoj osi (CV1,

koja objašnjava 52.808% ukupne varijabilnosti) moţe se primetiti izdvajanje grupe jedinki koje

su uzgajane na standardnoj podlozi bez treseta (plava elipsa). Ta grupa je uglavnom u

negativnom delu CV1 ose. Najveće razdvajanje po CV1 osi je izmeĎu grupe jedinki uzgajanih na

standardnoj podlozi bez treseta i grupe jedinki uzgajanih na standardnoj podlozi sa medicinskom

glinom (ljubičasta elipsa), koja se većim delom nalazi u pozitivnom delu CV1 ose. IzmeĎu

ostalih grupa ne postoji značajno razdvajanje duţ CV1 ose i uglavnom se preklapaju.

Duţ CV2 (koja objašnjava 22.546% ukupne varijanse) ose nema značajnih razdvajanja

različitih grupa jedinki ali dolazi do velikog preklapanje grupa (Slika 10). Moţe se samo

primetiti da su jedinke iz grupe na standardnoj podlozi (ţuta elipsa) većim delom rasporedjene u

negativnom delu CV2 ose.

Slika 10. Distribucija jedinki svih grupa duţ prve i druge kanonijske ose (elipse sa 0.9 verovatnoćom

obuhvatanja podataka)

33

Ukoliko rezultate prikaţemo sa elipsama koje opisuju samo srednje vrednosti skupa,

razdvajanje medju različitim tretmanima je uočljivije (Slika 11). MeĎusobno najbliţe su jedinke

sa podloge bez gline (crvena elipsa) i bez peska (zelena elipsa), a najudaljenija od svih je grupa

sa podlogom bez treseta (plava). U centralnom delu morfoprostora i ka pozitivnom delu CV1 ose

(koja objašnjava najveći deo vrijabilnosti uzorka) grupiše se ukupno 4 grupa, dok se evidentno

podloga bez treseta izdvaja u negativni deo CV1 ose. Na osnovu vizualizacije mentuma (plavi

grafici), moţe se videti da jedinke u tom delu ose imaju kraće zube, pre svega centralni zub i

odstupaju najviše od prosečnog oblika mentuma. Ako pogedamo CV2 osu, moţemo uočiti

razdvajanje standardne podloge (ţuta elipsa) od ostalih i to u negativnom delu CV2 ose.

Na osnovu CVA analiza geometrijske morfometrije moţe se zaključiti da razlike u

tretmanima na različitim podlogama meĎu jedinkama, iako ne velike, svakako postoje. Podloge

bez gline i bez peska se nalaze u centralnom delu prostora, što dalje implicira da su mentumi tih

jedinki najpribliţniji prosečnom obliku mentuma. Kako je u ekotoksikološkim testovima

neophodno smanjiti variranje praćenog parametra (u ovom slučaju promene u obliku mentuma),

prikazani rezultati ukazuju da bi trebalo koristiti podlogu bez peska i bez gline. Ovo je u skladu i

Slika 11. CVA analiza sa prikazanim elipsama srednjih vrednosti i vizuelni prikaz oblika analiziranih

mentuma u zavisnosti od pozicije u morfoprostoru

34

sa prethodnim rezultatima gde su vidne promene mentuma (istrošenost zuba) najčešće na

podlogama gde dominira sitan pesak. Konačno, osim prikazanih analiza neophodno je raditi

dodatne provere kako bi se utvrdilo da li postoji trend promene oblika mentuma u odnosu na tip

podloge i odredila najadekvatnija podloga za izvodjenje ekotoksikoloških ispitivanja u kojima se

prati promena oblika mentuma kao indikator.

4.3 Variranje oblika mentuma analizom glavnih komponenti (PCA)

Kako bi smo ispitali kako se grupišu jedinke na osnovu oblika mentuma bez

prenaglašavanja meĎugrupnih razlika, tj. uvideli realniju sliku razlika medju ipistivanim

jedinkama, uraĎena je analiza glavnih komponenti (PCA).

Značajno razdvajanje jedinki po PC1 i PC2 osi se ne moţe uočiti, što ukazuje na veliku

sličnost svih analiziranih jedinki. (Slika 12) MeĎutim ova analiza pokazala je da je najveća

varijabilnost prisutna kod jedinki gajenih na podlozi bez treseta (najveća plava elipsa). Moţemo

zaključiti da bi najbolje bilo u testvoima dalje koristiti one podloge na kojima je uočena

najmanja varijabilnost u uzorku, tj. koje ne “izazivaju” velike promene u obliku mentuma (manje

Slika 12. PCA analiza C. Tentans uzgajanih na različitim podlogama

35

elipse). TakoĎe se moţe zaključiti da je neophodno dodatno ispitati podloge, koristiti veći broj

jedinki i sa većim brojem ponovaka, kako bi se izvršila detaljnija analiza.

36

5. Zaključak

1. Najveći broj prezivelih larvi četvrtog stupnja bio je na standardnoj podlozi bez gline.

2. Glina koja je korišćena u istraţivanju verovatno toksično deluje na jedinke vrste

Chironomus tentans pa je zbog toga povećan nivo mortaliteta u svim tipovima podloge u

kojima je prisutna glina.

3. Frekventnost javljanja deformisanih mentuma nije pod značajnim uticajem tipa podloge.

4. Na podlogama bez treseta i gline, gde je povećana količina peska, javlja se najveći broj

istrošenih mentuma zato što pesak verovatno dovodi do pojačanog trošenja zuba

mentuma.

5. Na osnovu 29 homologih tačaka standardne statističke analize za utvrĎivanje

varijabilnosti uzorka, ANOVA i MANOVA pokazale su statistički značajne razlike meĎu

jedinkama sa svih 5 podloga korišćenih u eksperimentu.

6. Na osnovu CVA analiza geometrijske morfometrije moţe se zaključiti da razlike u

tretmanima na različitim podlogama meĎu jedinkama, iako ne velike, svakako postoje.

7. PCA analiza pokazala je da je najveća varijabilnost prisutna kod jedinki gajenih na

podlozi bez treseta pa bi najbolje bilo u testvoima dalje koristiti one podloge na kojima je

uočena najmanja varijabilnost u uzorku, tj. koje ne “izazivaju” velike promene u obliku

mentuma.

37

6. Literatura

Arambourou, H., Beisel, J. N., Branchu, P., & Debat, V. (2012). Patterns of fluctuating

asymmetry and shape variation in Chironomus riparius (Diptera, Chironomidae) exposed

to nonylphenol or lead. PloS one, 7(11), e48844.

Bird, G. A. (1997). Deformities in cultured Chironomus tentans larvae and the influence of

substrate on growth, survival and mentum wear. Environmental Monitoring and

Assessment, 45(3), 273-283.

De Bisthoven, L. J., Vermeulen, A., & Ollevier, F. (1998). Experimental induction of

morphological deformities in Chironomus riparius larvae by chronic exposure to copper

and lead. Archives of environmental contamination and toxicology, 35(2), 249-256.

Dickman, M., & Rygiel, G. (1996). Chironomid larval deformity frequencies, mortality, and

diversity in heavy-metal contaminated sediments of a Canadian riverine

wetland. Environment International, 22(6), 693-703.

Hudson, L. A., & Ciborowski, J. J. (1996). Spatial and taxonomic variation in incidence of

mouthpart deformities in midge larvae (Diptera: Chironomidae: Chironomini). Canadian

Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 53(2), 297-304.

Ilić Milošević, M. M. (2015). Taksonomski status rodova i vrsta Euaphidius Mackauer i

Remaudierea Starý (Hymenoptera, Braconidae, Aphidiinae) na osnovu morfoloških i

molekularnih analiza 28S rRNK i COI gena (Doktorska disertacija, Univerzitet u

Beogradu-Biološki fakultet).

Klingenberg, C. P. (2011). MorphoJ: an integrated software package for geometric

morphometrics. Molecular ecology resources, 11(2), 353-357.

Langer-Jaesrich, M., Köhler, H. R., & Gerhardt, A. (2010). Can mouth part deformities of

Chironomus riparius serve as indicators for water and sediment pollution? A laboratory

approach. Journal of soils and sediments, 10(3), 414-422.

Lenat, D. R. (1993). Using mentum deformities of Chironomus larvae to evaluate the effects of

toxicity and organic loading in streams. Journal of the North American Benthological

Society, 12(3), 265-269.

MacDonald, E. E., & Taylor, B. R. (2006). Incidence of mentum deformities in midge larvae

(Diptera: Chironomidae) from Northern Nova Scotia, Canada. Hydrobiologia, 563(1),

277-287.

38

OECD: “Test No. 218: Sediment-Water Chironomid Toxicity Using Spiked Sediment”

(http://dx.doi.org/10.1787/9789264070264-en ).

Ratte, H. T., Hammers-Wirtz, M., & Cleuvers, M. (2003). Ecotoxicity testing. In Trace Metals

and other Contaminants in the Environment (Vol. 6, pp. 221-256). Elsevier.

Rohlf, F. J. (2005). TpsDig, digitize landmarks and outlines, version 2.05. Department of

Ecology and Evolution, State University of New York at Stony Brook

(http://life.bio.sunysb.edu/morph/).

StatSoft, Inc. STATISTICA (2004). (data analysis software system), version 7.

www.statsoft.com.

Watts, M. M., & Pascoe, D. (1998). Selection of an appropriate life-cycle stage of Chironomus

riparius Meigen for use in chronic sediment toxicity testing. Chemosphere, 36(6), 1405-

1413.

Weltje, L., Bruns, E., & AG, B. (2009). The chironomid full life-cycle test. Validation report,

First draft.

Wiederholm, T. (1984). Incidence of deformed chironomid larvae (Diptera: Chironomidae) in

Swedish lakes. Hydrobiologia, 109(3), 243-249.

39

Prilog 1. Vidljivi deformiteti mentuma na podlogama: 1 – standardna podloga bez treseta; 2 –

standardna podloga bez gline.

1 2

40

Prilog 2. Istrošeni mentumi sa podloga: 1 – standardna podloga bez treseta; 2 – standardna

podloga bez gline.

1 1

1 1 1

1 1 1

1 1 1

1

2

41

ПРИРОДНO - MАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

КЉУЧНА ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА

Редни број, РБР:

Идентификациони број, ИБР:

Тип документације, ТД: монографска

Тип записа, ТЗ: текстуални / графички

Врста рада, ВР: мастер рад

Аутор, АУ: Зорана Лазаревић

Ментор, МН: Ђурађ Милошевић

Наслов рада, НР: Утицај типа подлоге на варијабилност деформитета ментума врсте

Chironomus tentans Fabricius, 1805 у тестовима токсичности

Језик публикације, ЈП: српски

Језик извода, ЈИ: енглески

Земља публиковања, ЗП: Р. Србија

Уже географско подручје, УГП: Р. Србија

Година, ГО: 2018.

Издавач, ИЗ: ауторски репринт

Место и адреса, МА: Ниш, Вишеградска 33.

Физички опис рада, ФО:

(поглавља/страна/

цитата/табела/слика/графика/прилога)

33 стр. ; 12 слика, 3 табеле

Научна област, НО: биологија

Научна дисциплина, НД: екотоксикологија

Предметна одредница/Кључне речи, ПО: деформитети ментума, хирономиде, екотоксиколошки тестови

УДК 631.4:597.5+615.9

Чува се, ЧУ: библиотека

Важна напомена, ВН:

Извод, ИЗ: U ovom radu analizirano je da li tip podloge na kojoj se uzgaja kultura

Chironomus tentans utiče na variranje oblika, veličine i deformiteta mentuma

larvi. Larve su uzgajane na 5 vrsta podloge: standardna podloga, standardna

podloga sa medicinskom glinom, standardna podloga bez peska, standardana

podloga bez gline i standardna podloga bez treseta Ispitivanje je sprovedeno na

uzorku od 178 mentuma. Za analizu je korišćena metoda geometrijske morfomtrije

kao najpogodnija za detekciju malih promena u veličini i obliku objekata

istraţivanja. Uočeno je da se na podlogama gde je povećana količina peska javlja

veća istrošenost zuba mentuma nego na podlogama sa manje peska. TakoĎe je

uočeno da ne postoji značajni uticaj tipa podloge na pojavu i učestalost deformiteta

kod larvi hironomida.

Датум прихватања теме, ДП: 14.2.2018.

Датум одбране, ДО:

Чланови комисије, КО: Председник: Др Ана Савић, доцент

Члан: Др Милица Стојковић Пиперац, доцент

Члан, ментор: Др Ђурађ Милошевић, доцент

42

ПРИРОДНО - МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ

НИШ

KEY WORDS DOCUMENTATION

Accession number, ANO:

Identification number, INO:

Document type, DT: monograph

Type of record, TR: textual / graphic

Contents code, CC: master thesis

Author, AU: Zorana Lazarević

Mentor, MN: ĐuraĎ Milošević

Title, TI: The influence of substrate type on Chironomus tentans Fabricius, 1805 mentum

deformities in ecotoxicology tests

Language of text, LT: Serbian

Language of abstract, LA: English

Country of publication, CP: Republic of Serbia

Locality of publication, LP: Serbia

Publication year, PY: 2018

Publisher, PB: author’s reprint

Publication place, PP: Niš, Višegradska 33.

Physical description, PD:

(chapters/pages/ref./tables/pictures/graphs/appe

ndixes)

33 p. ; 12 pictures, 3 tables

Scientific field, SF: biology

Scientific discipline, SD: ecotoxicology

Subject/Key words, S/KW: mentum deformities, chironomid, ecotoxicity tests

UC 631.4:597.5+615.9

Holding data, HD: library

Note, N:

Abstract, AB: In this study was analysed whether the type of substrate on which Chironomus

thentans larvae were cultivated can affect the variation of shape, size and mentum

deformities. Larvae were cultivated on 5 types of substrate: standard substrate,

standard substrate with medical clay, standard substrate without quartz sand,

standard substrate without kaolin clay and standard substrate without peat. A

sample of 178 mentums was analysed. Geometric morphometry approach was

used for the analysis of structures as most suitable for detecting small variations in

size and shape. On the substrate with high amount of quartz sand mentums were

more worn out than menthums of the larvae cultivated on substrate with less

amount of quartz sand. It has also been observed that there is no significant effect

of the type of substrate on the frequency of mentum deformities in cultivated

Chironomus tentan larvae.

Accepted by the Scientific Board on, ASB: 2.14.2018.

Defended on, DE:

Defended Board, DB: President: PhD Ana Savić, assistant professor

Member: PhD Milica Stojković Piperac, assistant professor

Member, Mentor: PhD ĐuraĎ Milošević, assistant professor

43