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UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

ALIMENTACION Y NUTRICION HUMANATEMA: DETERMINACIN DE LA DIGESTIN IN VITRO DEL ALMIDNPROFESORA: Dra. RITVA REPO DE CARRASCOALUMNOS:Mera Oyola, lizbethJimnez Mercedes Nez Campos, Benjamn.Quispe Manrique, CarlosVereau Lezcano, Jean Paul2013-IPRACTICA 2Determinacin de la digestibilidad in vitro del almidn.

OBJETIVOS

Conocer el mtodo estndar para la hidrolisis del almidn con -amilasa y su aplicacin en productos alimenticios con el fin de conocer su grado de digestibilidad in vitro.

I. INTRODUCCIN

El almidn es uno de los componentes principales de la dieta humana y hasta hace algunos aos era considerado como un carbohidrato disponible que era completamente digerido y absorbido en el intestino delgado de los humanos. Sin embargo, se observ que una fraccin del almidn resiste la hidrlisis por las enzimas digestivas. Esta fraccin se denomina almidn resistente (AR) y fue definida por laEURESTA (European Research Project on Resistant Starch) como la suma del almidn y productos de la degradacin del almidn que no pueden ser absorbidos en el intestino delgado de individuos sanos. El almidn resistente puede ser considerado como un ingrediente que aumenta la calidad de los alimentos. Se lo llama as porque resiste a la digestin por parte de las enzimas amilolticas y llega integro al intestino donde es fermentado por las bacterias duodenales, esta resistencia a la hidrlisis puede ser explicada por varios factores como grado y tipo de cristalinidad del grano de almidn, contenido de amilosa, morfologa del grnulo, la presencia de complejos almidn-lipdico y almidn-protena, etc. Pero que en la prctica mediante el uso del mtodo que simula de forma elemental el proceso de digestin in vitro, se puede lograr cuantificar el porcentaje de almidn hidrolizado como parte del almidn disponible. El estudio de la hidrlisis enzimtica del almidn in vitro de esta prctica permite obtener una informacin relativa de la biodisponibilidad del almidn in vivo. Es por ello que en la presente prctica se realiz la determinacin de la tasa de hidrolisis del almidn de tres muestras alimenticias: galleta de soda, pur de papa y harina siete semillas, Y para ello se hidroliz con -amilasa hasta reducirlo a azucares ms simples y reportarlos como equivalentes de maltosa mediante cuantificacin por un mtodo espectrofotomtrico con DNS.

II. MARCO TERICO 2.1. Estructura de los grnulos de almidn El tamao y forma del granulo de almidn vara entre especies e incluso entre variedades. En general los grnulos de tubrculos (papa) son grandes y esfricos mientras en los cereales son pequeos y polidricos, y los de las leguminosas en forma de rin (Gallant, 1992).Los almidones de cereales presentan un patrn tipo A, mientras que los almidones de tubrculos presentan un patrn tipo B, y las leguminosas un patrn intermedio tipo C, que es producto de una mezcla de patrones tipo A y B (Gernat, 1990). Los almidones con patrn tipo B o C son ms resistentes a la digestin que los almidones tipo A (Topping y Clifton, 2001). El factor que ms influye en el tipo de patrn es la longitud de las cadenas de amilopectina, siendo ms cortas en los almidones tipo A (que presentan de 23-29 unidades de glucosa) que en los del tipo B (30-40 unidades de glucosa). Cuando los grnulos de almidn son tratados por calor, se desorganiza irreversiblemente su estructura cristalina, incrementando la susceptibilidad al ataque enzimtico por -amilasas y en consecuencia incrementando su digestibilidad (Prez y Oliva-Telles, 2002).Cuando el almidn es calentado con un exceso de humedad se produce la gelatinizacin, que consta de dos etapas. En la primera la disgregacin de los grnulos 60-70 C y la segunda a los 90 C aproximadamente el almidn pierde su estructura granular permaneciendo nicamente fragmentos de amilopectina en una solucin amilosa (Jing Ming y Sen Lin, 1990). Sin embargo, la respuesta de los almidones a diferentes condiciones de temperatura y humedad varan.

2.2. Digestin del almidn en el intestino delgadoEl almidn debe ser completamente despolimerizado a glucosa para que pueda ser absorbido en el intestino delgado. La despolimerizacin es llevada a cabo por diferentes enzimas que rompen enlaces glucosidicos (1-4) y (1-6). Las enzimas que actan en especies monogstricas son las - amilasas que rompen enlaces (1-4), liberando maltosa y dextrinas. En la digestin de almidones la saliva que contiene enzimas que no actan sobre el enlace (1-6) por que tiene poca afinidad por los enlaces terminales (Low y Longland, 1990).

2.2.1. Tamao de partcula. El tamao de partcula afecta la digestin del almidn debido a que las partculas ms pequeas (con mayor superficie especfica) facilitan la accin de las amilasas y se digieren ms rpidamente (que las partculas con mayor volumen). De esta forma un mayor grado de molido o masticacin pueden facilitar la digestin de los almidones. Liljeberg et al, 1992 estudiaron la digestibilidad in vivo del almidn de cereales molidos o enteros a partir del ndice glicmico, comprobaron que los granos enteros disminuyen el ritmo de digestin del almidn y por lo tanto reducen la digestibilidad de la dieta. En consecuencia, tambin reducen o retrasan la glicemia e insulinemia postprandial.2.2.2. Matriz proteica Los grnulos de almidn estn acompaados por otras materias vegetales que pueden inhibir el acceso de las amilasas al granulo. En algunos casos los grnulos de almidn pueden estar encapsulados en una matriz proteica y en otros casos con lpidos los cuales dificultan el accionar de la enzima restringiendo su actividad hidroltica.2.3. Almidn disponible (AD) en el haba (Vicia faba L.) El valor nutritivo del haba se ha determinado mediante la digestibilidad de sus protenas o por su aporte energtico, y su contenido de factores antinutricionales como los inhibidores de tripsina, lectinas o taninos. Hay pocos estudios acerca de la digestibilidad del almidn del haba y mucho menos como Parte de frmulas de mezclas de harinas y se han enfocado a la nutricin animal. Debido a que las habas se almacenan por tiempos largos cuando estn secas (Silva y Osorio, 2007) reportaron valores de almidn disponible 32. 9 %. (Tovar y Melito, 1996). Reportaron otros valores para leguminosas 33.4% de almidn disponible en frijol.2.4. Digestibilidad en productos trmicamente tratados.Segn (Garca, 2007) el anlisis de la hidrlisis enzimtica in vitro del almidn de productos horneados: se realiz por el mtodo de Holm et al. (1985), el cual permiti determinar la tasa de digestin del almidn trabaj con -amilasa pancretica porcina, reducindose este en azucares sealados como equivalentes de maltosa, determinados por espectrofotometra. Afirman que produce una parcial o completa destruccin de la estructura cristalina de los grnulos de almidn en el horneado lo que facilita el accionar de las enzimas. Adems al evaluar se observa la velocidad de hidrlisis dela enzima - amilasa en las harinas horneadas aumenta a medida que la temperatura de horneado de la harina se incrementa en un mismo tiempo. Recomiendan tambin el uso de las harinas horneadas por conveccin, previamente gelatinizadas en ese experimento para incrementar la disponibilidad enzimtica del almidn.

III. MATERIALES Y MTODOS

3.1. Muestra alimenticiaSe trabaj con tres muestras de alimentos ricos en almidn: Harina de 7 semillas, pur de papa y galleta de soda.

3.2. Materiales Material de vidrio: Erlenmeyer, pipetas, tubos de ensayo, etc. Micropipeta de 20-200 uL Micropipeta de 100-1000 uL

3.3. Reactivos Amilasa SIGMA TIPO IA 1200 U/mg (27 mg/ml). Diluir 56 uL de enzima con 16 ml de tampn fosfato (preparar dentro de los 30 minutos previos al comienzo de la hidrlisis). Tampn fosfato. Disolver en aproximadamente 700 mL de agua destilada 3.03 g de KH2PO4, 3.96 g de Na2 HPO4 y 0.40 g de NaCl. Llevar a pH 6.9 y aforar a 1000 ml. Solucin de DNS. Disolver 11 g de NaOH, 10 g de cido dinitrosaliclico (DNS), 2 g de fenol y 0.5 g de bisulfito de sodio en agua destilada; enrasar en una fiola de 1000 ml. Sal de Rochelle. Preparar una solucin al 40% (pv) de tartrato de sodio y potasio en agua destilada.3.4. Equipos Balanza analtica Bao mara Cocina Espectrofotmetro Vortex3.5 Procedimiento Pesar 500 mg de almidn o su equivalente en un Erlenmeyer de 150 ml. Aadir 55 ml de tampn fosfato mximo 30 minutos antes de iniciar la hidrlisis. Parael caso de harinas, la muestra debe ser cocinada antes del anlisis. Para ello, aadir 30 ml de tampn y hervir con agitacin constante durante toda la coccin. Esto puede hacerse 1 1.5 h antes de iniciar la incubacin. Colocar el Erlenmeyer en bao de agua a 47C con agitacin. Dejar que se estabilice la temperatura. En los primeros 5 minutos, y antes de adicionar la encima, tomar dos alcuotas de 200 uL de muestra y marcar como tiempo cero (0 min). Aadir 1.25 mL de al Erlenmeyer y luego incubar a 37C durante 1 hora con agitacin continua. Dentro de ese tiempo de incubacin de una hora, tomar muestra a los 5, 15, 30 y 60 minutos, las alcuotas de 200 uL sern aadidas a una galera de tubos de ensayo codificados y conteniendo las cantidades de reactivos que se muestran en el cuadro 1. Preparar un blanco de muestra (BM). Preparar un blanco-tampn (BT) para calibrar el equipo como se muestra en el cuadro 1. Hervir los tubos en un bao de agua durante 5 min. Agregar 1 ml de sal de Rochelle. Aadir 10 ml de agua destilada. Mezclar. Leer las absorbancias a 550 nm ajustando el cero de absorbancia en el espectrofotmetro con el blanco tampn.Cuadro 1: Procedimiento de la batera de trabajoMUESTRADNS (ml)MUESTRA (ul)AGUA (uL)ESTANDAR (uL)

BM0 min5 min15 min30 min60 minBT3.03.03.03.03.03.03.00.0200200200200200200 tampn5003008008008008008005005000.00.00.00.00.0

IV. RESULTADOS Y DISCUSIN

RESULTADOSCuadro 2: mg de almidn provenientes de cada muestraMuestraPeso (g)% de almidnmg de almidn

Harina 7 semillas1.369%897

Pur de papa2.580.64%2016

Galleta de soda0.677.5%465

Cuadro 3: Absorbancia de las diferentes muestras a diferentes tiemposTiempo (min)Harina 7 semillasPur de PapaGalleta de soda

R1R2PromR1R2PromR1R2Prom

00.029-0.0290.0160.0210.0190.150.160.16

50.0400.0380.0392.8962.7922.8440.3170.27440.2907

150.0400.0450.0433331.191.2371.2135

300.0960.0910.0943331.5441.5361.54

600.1190.1170.1183331.5861.6831.6345

Absorbancia del blanco de la muestra: 0.024Se utiliz la siguiente ecuacin para calcular los mg de maltosa/ml en cada muestra: Y = 0.7245X 0.0768Dnde: Y = mg de maltosa/ ml X = AbsorbanciaLuego se us la siguiente ecuacin para calcular el % de hidrlisis % hidrlisis = (mg maltosa tiempo X mg de maltosa tiempo 0 )*0.95*100/mg muestraCon los valores obtenidos de ambas ecuaciones se construy el siguiente cuadro:Cuadro 4: % de hidrlisis de las diferentes muestras a diferentes tiemposTiempo (min)Harina 7 semillasPur de papaGalleta de Soda

mg de maltosa%hidrlisismg de maltosa%hidrlisismg de maltosa%hidrlisis

00.14600.00050.13222912400.32680.0297

50.15980.00104.0314699790.14820.50720.0286

150.16540.0014--1.78100.2302

300.23570.0066--2.23160.3016

600.26890.0090--2.36200.3222

(*) Los valores de los tiempos 15 min en adelante del pur de papa fueron descartados por salirse de la escala del espectrofotmetro y se les consider como outsiders.

Figura 1: Digestibilidad del almidn de la harina de 7 semillas en el tiempo

En la figura 1 se observa una clara tendencia de subida en el % de hidrlisis a travs del tiempo lo que nos hace suponer que si se hubieran tomado ms muestras en tiempos superiores el porcentaje de hidrlisis hubiera sido superior. As mismo se observa que el porcentaje de hidrlisis en la harina de 7 semillas va aumentando linealmente a travs del tiempo con un valor de correlacin de 0.9238, muy cercano al valor de 1, lo cual nos indica lo cercano que estn los puntos experimentales a la tendencia lineal que se mencion anteriormente. En la prctica el porcentaje de hidrolisis se realiz como una medida indirecta de la digestibilidad del almidn mediante la concentracin de la maltosa. Las siete semillas (son generalmente cereales), y los almidones que presentan son de patrn tipo A, que son ms digestibles que los de la patrn B y C segn (Topping y Clifton, 2001) El factor que ms influye en el tipo de patrn es la longitud de las cadenas de amilopectina, siendo ms cortas en los almidones tipo A (que presentan de 23-29 unidades de glucosa). En la figura 1, se observa que conforme pasa el tiempo el porcentaje de hidrlisis aumenta debido al tratamiento del calor que desorganiza irreversiblemente los grnulos de almidn , incrementando la susceptibilidad al ataque enzimtico por -amilasas y en consecuencia incrementando su digestibilidad segn (Prez y Oliva-Telles, 2002).Los tamaos de partculas de los grnulos de almidn, tambin influyen a la digestibilidad, segn (Liljeberg et al, 1992) estudiaron la digestibilidad in vivo del almidn de cereales molidos y enteros, manifestndose que la digestibilidad en los molidos es ms digerible que los enteros. En la prctica se realiz digestibilidad de la harina de siete semillas con un porcentaje de almidn disponible de 69% (cuadro 2), sin embargo, en la mezcla de la harina de la siete semillas no se conoce la proporcin de la cantidad de harinas de cada unidades(haba, maz, trigo, cebada, Kiwicha, quinua) lo que esto dificulta saber el almidn disponible de cada elemento.Figura 2: Digestibilidad del almidn del pur de papa en el tiempo

Segn la ISSN 0716-8756 (1995) indica que el pur de papa posee 14.4 g de almidn/ 100gr de pur mientras que nuestro valor prctico result 32.26 g de almidn/ 100gr de pur segn su tabla de composicin del producto.The History Channel Latin America (2013) nos menciona que para obtener el polvo del pur de papas instantneo hace falta hervir las papas a 70C y posteriormente enfriarlo a 20C. De esta manera se rompe la estructura de la papa, para luego poder mezclarla fcilmente con los aditivos necesarios. Luego se calienta a 150C y, por ltimo, la masa resultante se la hace polvo para finalmente ser envasada. Por lo que podemos decir que nuestro pur ha sido pre-cocido.Muoz (1990) citado por Tarazona (1995) nos menciona que el cocimiento produce la gelatinizacin del almidn hacindose ms susceptible al ataque enzimtico durante el metabolismo ya mencionamos que para la elaboracin del pur se ha pre-cocido lo que ha facilitado su digestin con las enzimas.Tarazona (1995) nos menciona que la mayor o menor porcentaje de digestibilidad puede estar asociado al grado de gelatinizacin de los almidones durante el proceso de coccin, es deseable que este sea superior a 90% para que haya una eficiente digestin y asimilacin. Nos menciona que la digestibilidad del pur de papa es de 95.08%.Podemos observar en la figura 2 que conforme aumenta el tiempo el porcentaje de hidrlisis aumenta, a pesar que son dos puntos como se mencion anteriormente. Segn Araya (s.f) el pur de papas posee una rpida absorcin. Tambin nos menciona que el pur de papa es digerido rpidamente y su efecto glicmico es similar al de una carga equivalente de glucosa. Se podra decir que estos dos puntos tratan de interpretar esta lo que nos mencionan todos los autores, la facilidad de digestin del almidn por la enzima.Adems de los datos obtenidos al momento de realizar la prueba experimental de la digestibilidad in vitro del pur de papa se apreci el cambio a color oscuro que sufri la muestra por su reaccin con el DNS. Lo que nos indicaba la presencia de glucosa por la hidrolisis del almidn.

Figura 3: Digestibilidad del almidn de la galleta de soda en el tiempo

En el grfico se observa una clara tendencia de subida en el % de hidrlisis a travs del tiempo sin embargo a medida que la curva avanza, la pendiente de la misma disminuye. As mismo se observa que el porcentaje de hidrlisis en la galleta de soda va aumentando cuadrticamente con un valor de correlacin de 0.9489. Como este valor es cercano a 1, se entiende que la ecuacin propuesta es la ms cercana al comportamiento real de la digestibilidad del almidn de galleta de soda en el tiempo hasta llegar a un % de hidrlisis mximo donde terminar la digestin.La galleta de Soda, est compuesta por una masa cracker se caracteriza por su bajo porcentaje de azcar y grasa respecto al agua y la harina (Champ, 2003). Garca, 2007 Afirma que produce una parcial o completa destruccin de la estructura cristalina de los grnulos de almidn en el horneado lo que facilita el accionar de las enzimas. Adems al evaluar se observa la velocidad de hidrlisis de la enzima - amilasa en las harinas horneadas aumenta a medida que la temperatura de horneado de la harina se incrementa en un mismo tiempo. Lo mencionado por Garca (2007) se puede comprobar en la prctica, al observar la lnea de tendencia de la hidrlisis del almidn de la galleta de soda. Presenta una lnea de tendencia cuadrtica, que implica que debido a su composicin del almidn la mayor cantidad de hidrlisis del almidn sucede en los primeros 20 minutos, despus la hidrlisis es lenta a casi estable en el tiempo.Se puede explicar debido a las estructura de capas que presenta la galleta de soda, facilitando la digestin del almidn. Segn Fandila (2010) nos dice que el almidn es hidrolizado y absorbido en el intestino delgado, estn en funcin de su hidrlisis y absorcin en el intestino delgado. Proponiendo una clasificacin del almidn en: almidn de digestin rpida (ADR), almidn de digestin lenta (ADL) y almidn resistente (AR). ADR es aquella fraccin en que la cantidad de glucosa es liberada despus de los 20 minutos de hidrlisis. ADL es la fraccin de almidn que no es hidrolizado despus de entre 20 y 120 minutos despus de la hidrlisis. AR es la cantidad de almidn que no es hidrolizado despus de los 120 minutos de hidrolisis Segn la explicacin que nos ofrece Fandila, la galleta de soda presenta almidn de digestin rpida, como se puede observar en la figura 3, donde la mayor parte de la hidrlisis ocurre en los primero 20 minutos, teniendo su mximo a los 40 minutos. Se pude deducir que la galleta presenta almidn de fcil digestin, as como almidn de digestin lenta.

V. CONCLUSIONES -----

VI. CUESTIONARIO 1. Qu factores afectan la digestibilidad de los almidones?Existen factores intrnsecos y extrnsecos que pueden influir en los valores de digestin obtenidos (Annison y Topping, 1994). Uno de ellos es la relacin amilosa/amilopectina presente (Annison y Topping, 1994, Bjorck, 1996), almidones con niveles elevados de amilosa presentan velocidades de digestin ms bajas, sugirindose que los almidones con alto contenido de amilosa incluyen una gelatinizacin incompleta de sta durante condiciones normales de cocinado, la retrogradacin de la amilosa es otra causa que influye en las bajas velocidades de hidrlisis (Bjorck, 1996), el tamao de grnulo del almidn que algunos casos es producto del origen botnico, variedad o ecotipo y el tipo de procesamiento del alimento.

2. Qu relacin existe entre la digestibilidad in vitro del almidn y porcentaje de gelatinizacin?La gelatinizacin produce una pasta de almidn. Tambin induce un drstico aumento de la susceptibilidad del almidn a la hidrlisis de las enzimas especficas, las amilasas. Por eso un almidn gelatinizado se digiere ms rpidamente. Estas transformaciones del almidn y la modificacin de la velocidad de digestin de los carbohidratos que resulta de ellas han sido estudiadas en diversos procesos de fabricacin.

VII. BIBLIOGRAFA

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VIII. Anexos