Manual CFX Español

Sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo realManual de instrucciones

185-5095-IVD 184-5097-IVD

Revisióndelmanual:juniode2010Versióndesoftware:1.6

Copyright ©2010 Bio-Rad Laboratories, Inc. Está prohibido la reproducción de cualquier tipo, ya sea impresa o electrónica, sin contar con el consentimiento por escrito de Bio-Rad Laboratories, Inc.

Excel, Microsoft, PowerPoint, Windows, Windows Vista y Windows 7 son marcas comerciales de Microsoft Corporation. Adobe y Reader son marcas comerciales de Adobe Systems Incorporated. Cy es una marca comercial del grupo de empresas GE Healthcare. Fluor y Quasar son marcas comerciales de Biosearch Technologies, Inc. SYBR® y Texas Red son marcas comerciales de Invitrogen Corporation. Bio-Rad Laboratories, Inc. cuenta con la licencia de Invitrogen Corporation para vender reactivos que contengan SYBR® Greene I para su uso con PRC en tiempo real, sólo con fines de investigación. El resto de las marcas o nombres de productos son marcas comerciales de sus respectivos propietarios.

AVISO SOBRE LOS TERMOCICLADORES Y LOS SISTEMAS EN TIEMPO REAL DE BIO-RAD.La compra de este instrumento transfiere una inmunidad limitada no transferible contra litigios por las investigaciones internas del comprador y el desarrollo para uso en diagnósticos in vitro humanos y todos los demás campos aplicados de conformidad con una o varias patentes de EE.UU. con número 5,656,493; 5,333,675; 5,475,610 (reivindicaciones 1, 44, 158, 160-163 y 167 sólo); y 6.703.236 (reivindicaciones 1-7 sólo), o las correspondientes reivindicaciones en sus homólogos fuera de los EE.UU. que sean propiedad de Applera Corporation. No se transfiere ningún derecho de forma expresa, por implicación o impedimento bajo ninguna otra reivindicación de patente, como reivindicaciones por aparatos, reactivos, kits o métodos como los métodos de 5’nucleasa. Si desea obtener más información sobre la adquisición de licencias, puede dirigirse al Director de Licensing, Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, California 94404, EE.UU.

Este producto está protegido por una o varias de las siguientes patentes de EE.UU. o sus equivalentes en el extranjero propiedad de Eppendorf AG: Números de patente de EE.UU. 6,767,512 y 7,074,367.

Este termociclador en tiempo real cuenta con licencia protegida por la patente de EE.UU n.º 6,814,934 y las correspondientes reivindicaciones en cualquier patente canadiense homóloga propiedad de Applera Corporation, exclusivamente para investigación, diagnósticos humanos in vitro y todos los demás campos de aplicación excepto los diagnósticos in vitro veterinarios. No se transfiere ningún derecho de forma expresa, por implicación o impedimento, a ninguna de las patentes de métodos en tiempo real, incluidos, entre otros, los ensayos de 5'nucleasa, ni ninguna reivindicación de patente de algún reactivo o kit.

Las placas Bio-Rad’s Hard-Shell® está protegidas por una o varias de las siguientes patentes de EE.UU., patentes pendientes o sus homólogas en el extranjero, propiedad de Eppendorf AG: Números de patente de EE.UU.: 7,347,977, 6,340,589, 6,528,302 y, de aplicación en EE.UU., 2007246858, 20080084004, 20030180192 y 20060120927.

Información sobre el manual de instruccionesEste manual contiene información sobre cómo configurar y manejar con seguridad el sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real que ostenta la marca CE-IVD (número de catálogo 1855095–IVD). En el manual de instrucciones para investigaciones de ciencias biológicas de CFX96 y CFX384 (números de catálogo 1855095 y 1855384), encontrará información adicional sobre el software CFX Manager™.

Convenciones de redacción empleadas en este manualEn el manual se utilizan las convenciones de redacción que se muestran en la Tabla 1.

Si desea obtener información sobre las etiquetas de seguridad empleadas en este manual y en el sistema CFX96, consulte “Seguridad y cumplimiento de normativas" en la página iii.

Recursos de Bio-RadEn la Tabla 2 se enumeran los recursos de Bio-Rad y también se explica cómo encontrar lo que necesita.

Tabla 1. Convenciones empleadas en este manual.

Convención Significado

CONSEJO: Proporciona información útil e instrucciones, incluida la información explicada con más detalle en otro lugar del manual.

NOTA: Proporciona información importante, incluida información explicada con más detalle en otro lugar del manual.

¡ADVERTENCIA! Explica información muy importante acerca de algo que podría causar lesiones al investigador, daños en el instrumento o pérdida de datos.

X > Y Seleccionar X y, a continuación, Y en la barra de herramientas, en el menú o en la ventana del software.

Tabla 2. Recursos de Bio-Rad.

Recurso Contacto

Representantes locales de Bio-Rad Laboratories

Puede encontrar información y contactos locales en el sitio web de Bio-Rad. Para ello, seleccione su país en la página de inicio (www.bio-rad.com). Además, puede encontrar la oficina internacional más cercana en la contraportada de este manual.

Notas técnicas y bibliografía Visite el sitio web de Bio-Rad (www.bio-rad.com). Escriba un término de búsqueda en el cuadro Search (Buscar) y seleccione Literature (Bibliografía) para encontrar vínculos a notas técnicas, manuales y otra bibliografía.

Especialistas técnicos El departamento de asistencia técnica de Bio-Rad está formado por científicos con experiencia que proporcionan a los clientes soluciones prácticas y profesionales. Para encontrar su servicio de asistencia técnica local, póngase en contacto con la oficina de Bio-Rad más cercana. Si desea obtener asistencia técnica en Estados Unidos y Canadá, llame al 1-800-424-6723 (teléfono gratuito) y elija la opción de asistencia técnica.

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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real

Seguridad y cumplimiento de normativasPara un manejo seguro del sistema de detección CFX96 mediante PCR en tiempo real, recomendamos encarecidamente que respete las especificaciones de seguridad detalladas en esta sección y en otras secciones del manual.

El sistema CFX96 está aprobado para su uso como equipo médico de diagnóstico in vitro (IVD).

Etiquetas de advertencia de seguridadLas etiquetas de advertencia visibles en el instrumento y en este manual le advierten sobre causas de lesiones o daños. Consulte la Tabla 3 si desea saber el significado de cada etiqueta de advertencia de seguridad.

Tabla 3. Significado de las etiquetas de advertencia de seguridad.

PRECAUCIÓN: ¡Riesgo biológico! Este símbolo identifica los componentes que se han podido contaminar con materiales de riesgo biológico.

PRECAUCIÓN: ¡Peligro! Este símbolo identifica los componentes que suponen un riesgo de lesiones personales o daños al instrumento en caso de manipulación incorrecta. Siempre que aparezca este símbolo, consulte el manual para obtener más información antes de continuar.

PRECAUCIÓN: ¡Superficie caliente! Este símbolo identifica los componentes que suponen un riesgo de lesiones personales o daños al instrumento a causa de un calentamiento excesivo en caso de que el sistema no se haya utilizado correctamente.

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Advertencias de seguridad del instrumentoLas etiquetas de advertencia que se muestran en la Tabla 4 también están presentes en el instrumento y hacen referencia al uso seguro del sistema CFX96.

Cumplimiento y especificaciones para realizar un uso seguroEn la Tabla 5 se muestran las especificaciones para un uso seguro del sistema CFX96. Con esta unidad se deben utilizar cables blindados (incluidos) para garantizar el cumplimiento de los límites de la FCC de Clase A.

CUMPLIMIENTO DE NORMATIVAS

Tras haber sometido al instrumento a las pruebas pertinentes, ha demostrado que cumple con todos los requisitos aplicables de las siguientes normas electromagnéticas y de seguridad:

• IEC 61010-1:2001 (2ª Ed.), EN61010-1:2001 (2ª Ed.). Requisitos de seguridad de equipos eléctricos de medida, control y uso en laboratorio (Parte 1): Requisitos generales

• IEC 61010-2-010:2005, EN61010-2-010:2003. Requisitos de seguridad de equipos eléctricos de medida, control y uso en laboratorio. Parte 2-010: Requisitos específicos para equipos de laboratorio utilizados para el calentamiento de materiales

Tabla 4. Etiquetas de advertencia de seguridad del instrumento.

Icono Significado

Advertencia acerca del riesgo de daños personales o materiales.La utilización del sistema de detección CFX96 mediante PCR en tiempo real antes de haber leído este manual puede suponer un peligro, pues existe el riesgo de que se produzcan lesiones personales. Para un uso seguro, utilice este instrumento única y exclusivamente como se indica en este manual. Este instrumento solamente lo debe manejar personal de laboratorio cualificado con formación en el uso seguro de equipos eléctricos. Manipule siempre los componentes del sistema con precaución y también con las manos limpias y secas.

Advertencia sobre la manipulación de materiales de riesgo biológico.Cuando manipule muestras de riesgo biológico, siga las precauciones y las directrices recomendadas y, además, cumpla con la normativa local vigente específica para su laboratorio y ámbito de actuación.

Advertencia acerca del riesgo de quemaduras. Los termocicladores generan suficiente calor como para causar quemaduras graves. Lleve siempre puestas gafas de seguridad u otra protección para los ojos cuando maneje el instrumento. Permita siempre que el bloque de muestras vuelva a la temperatura de inactividad antes de abrir la tapa y retirar las muestras. Mantenga siempre la máxima distancia posible para impedir que se produzcan quemaduras accidentales.

Advertencia acerca del riesgo de explosión.Los bloques de muestras se pueden calentar lo suficiente durante el funcionamiento normal como para causar que los líquidos hiervan y exploten.

Tabla 5. Especificaciones para un uso seguro.

Requisitos para un uso seguro Especificaciones

Temperatura Para uso en interiores

Temperatura ambiente de 15–31 °C. Humedad relativa máxima del 80%, sin condensación

Altitud Hasta 2.000 metros sobre el nivel del mar

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• IEC 61010-2-081:2001+A1, EN61010-2-081:2002+A1. Requisitos de seguridad de equipos eléctricos de medida, control y uso en laboratorio. Parte 2-081: Requisitos específicos para equipos de laboratorio automáticos o semiautomáticos destinados a análisis y a otros fines (se incluye la Modificación 1)

• EN 61326-1:2006 (Clase A) Equipo eléctrico para medida, control y uso en laboratorio. Requisitos de compatibilidad electromagnética (CEM), Parte 1: Requisitos generales

• EN 61010-2-101. Requisitos de seguridad de equipos eléctricos de medida, control y uso en laboratorio. Requisitos específicos para equipo médico de diagnóstico in vitro (IVD)

• EN 61326-2-6 (Clase A) Equipo eléctrico para medida, control y uso en laboratorio. Requisitos de compatibilidad electromagnética (CEM). Parte 2-6. Requisitos específicos. Equipo médico de diagnóstico in vitro (IVD)

Este equipo genera, utiliza y puede emitir energía de radiofrecuencia y, si no se instala y utiliza de acuerdo con el manual de instrucciones, puede provocar interferencias que perjudiquen las comunicaciones por radio. El funcionamiento de este equipo en una zona residencial puede interferencias dañinas, en cuyo caso tendrá que corregir las interferencias por su cuenta.

PeligrosEl sistema de detección CFX96 mediante PCR en tiempo real está diseñado para funcionar de forma segura cuando se utiliza de la manera descrita por el fabricante. Si el sistema CFX96 o cualquiera de sus componentes asociados se utilizan de una forma no especificada por el fabricante, puede suponer un perjuicio para la protección inherente proporcionada. Bio-Rad Laboratories, Inc. no será responsable de cualquier daño causado por el uso de este equipo de una forma no especificada, o por las modificaciones del instrumento que no haya realizado Bio-Rad o un agente autorizado. Las tareas de mantenimiento y reparación del sistema CFX96 sólo las debe realizar personal de Bio-Rad.

Riesgos biológicosEl sistema CFX96 es un producto de laboratorio. No obstante, si hay muestras de riesgo biológico, respete las siguientes precauciones y cumpla las directrices locales específicas para su laboratorio y ámbito de actuación.

PRECAUCIONES GENERALES

• Siempre debe llevar guantes, batas de laboratorio y gafas de seguridad con protección lateral

• No se toque la boca, la nariz ni los ojos con las manos

• Proteja completamente cualquier corte o abrasión antes de trabajar con materiales potencialmente infecciosos

• Lávese bien las manos con agua y jabón después de haber manipulado materiales potencialmente infecciosos antes de salir del laboratorio

• Quítese el reloj y las joyas antes de trabajar en el banco

• Guarde todas los materiales infecciosos o potencialmente infecciosos en contenedores irrompibles y a prueba de fugas

• Antes de salir del laboratorio, quítese las prendas de protección

• No utilice los guantes para escribir, responder al teléfono, encender la luz ni para tocar cualquier cosa que otras personas pudieran tocar sin guantes

• Cámbiese los guantes con frecuencia. Quítese los guantes inmediatamente cuando observe que están contaminados

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• No exponga materiales que no se puedan descontaminar adecuadamente a materiales potencialmente infecciosos

• Al finalizar una operación con materiales de riesgo biológico, descontamine la zona de trabajo con un desinfectante adecuado (por ejemplo, una dilución de lejía doméstica al 1:10)

PRECAUCIONES ESPECÍFICAS

• Todas las muestras de pacientes tienen un riesgo biológico potencial y se deben manipular de acuerdo con las precauciones universales

• Durante el funcionamiento normal de este instrumento, no se expulsan sustancias de riesgo biológico

DESCONTAMINACIÓN DE LAS SUPERFICIES

¡ADVERTENCIA! Para evitar el riesgo de que se produzca una descarga eléctrica, apague y desenchufe siempre el instrumento antes de llevar a cabo procedimientos de descontaminación.

Las siguientes zonas se pueden limpiar con un desinfectante bactericida, virucida o fungicida de tipo hospitalario.

• Tapa externa y chasis

• Superficie interna y pocillos del bloque de reacción

• Panel de control y pantalla

Para preparar y aplicar el desinfectante, consulte las instrucciones proporcionadas por el fabricante del producto. Enjuague siempre el bloque de reacción y sus pocillos varias veces con agua después de haber aplicado un desinfectante. Seque bien el bloque de reacción y sus pocillos después de haberlos enjuagado con agua.

¡ADVERTENCIA! No utilice detergentes abrasivos o corrosivos ni soluciones alcalinas fuertes. Estos agentes pueden arañar las superficies y dañar el bloque de reacción, provocando la pérdida del control térmico.

ELIMINACIÓN DE MATERIALES DE RIESGO BIOLÓGICO

El sistema CFX96 no contiene materiales con riesgos químicos potencialmente peligrosos. Elimine los siguientes materiales potencialmente contaminados de acuerdo con las normas locales, regionales y nacionales para laboratorios:

• Muestras clínicas

• Reactivos

• Recipientes de reacción usados u otros consumibles que puedan estar contaminados

Peligros químicosEl sistema CFX96 no contiene materiales con riesgo químico potencial.

Peligro de explosión o inflamabilidadEl sistema CFX96 no supone un peligro fuera de lo común en relación con la inflamabilidad o la explosión cuando se utiliza de la forma correcta especificada por Bio-Rad Laboratories.

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Peligros eléctricosEl sistema CFX96 no supone un peligro eléctrico fuera de lo común para los usuarios cuando se instala y utiliza correctamente sin realizar modificaciones físicas en él y si se conecta a una fuente de alimentación con las especificaciones correctas.

TransporteAntes de mover o transportar el termociclador C1000™ o el módulo de reacción óptica CFX96, se deben llevar a cabo procedimientos de descontaminación. Mueva o transporte siempre el chasis del termociclador C1000 y el módulo de reacción óptica CFX96 en contenedores separados con los materiales de embalaje originales que protegerán el instrumento a fin de que no sufra ningún daño. Si no puede encontrar contenedores adecuados, póngase en contacto con su oficina local de Bio-Rad.

AlmacenamientoEl sistema CFX96 se puede almacenar en las siguientes condiciones:

• Rango de temperaturas comprendidas entre –20 y 60 °C

• Humedad relativa máxima del 80%

EliminaciónEl sistema de detección CFX96 mediante PCR en tiempo real contiene materiales eléctricos, por lo que no se debe desechar de la misma forma que los residuos generales y, por tanto, se debe recoger por separado de acuerdo con la Directiva de la Unión Europea 2002/96/CE sobre residuos de aparatos eléctricos y electrónicos (RAEE). Antes de desechar el dispositivo, póngase en contacto con un representante local de Bio-Rad para que le facilite instrucciones específicas aplicables a su país.

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ÍndiceInformación sobre el manual de instrucciones . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . iiRecursos de Bio-Rad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . iiSeguridad y cumplimiento de normativas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . iiiPeligros . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . v

Capítulo 1. Instalación del sistema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1Desembalaje del módulo de reacción óptica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1Requisitos del sistema. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1Descripción general del sistema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2Configuración del sistema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4Instalación del software CFX Manager . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6Archivos de software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8Ejecución de experimentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

Capítulo 2. Software CFX Manager™ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11Ventana principal del software . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11Asistente de inicio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16Panel de Detected Instruments (instrumentos detectados) . . . . . . . . . . . . . . . . . 16Ventana de Instrument Properties (propiedades de los instrumentos) . . . . . . . . . 18

Capítulo 3. Ejecución de experimentos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21Ventana para la configuración del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21Pestaña Protocolo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22Pestaña Placa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23Pestaña Iniciar ejecución . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24Ventana Run Details (Detalles de ejecución) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

Capítulo 4. Protocolos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29Ventana del editor de protocolos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29Controles del editor de protocolos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32Modo de control de temperatura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35Escritor automático de protocolos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

Capítulo 5. Placas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39Ventana del editor de placas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39Ventana de selección de fluoróforos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42Ventana para la configuración del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46Ventana del Administrador de grupos de pocillos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48Ventana de la vista de la hoja de cálculo de la placa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

Capítulo 6. Funcionamiento independiente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51Termociclador C1000 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51Creación de un experimento nuevo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53Exportación de datos para análisis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58Creación de un archivo de datos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

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Capítulo 7. Descripción general del análisis de datos . . . . . . . . . . . . . . . 61Ventana de análisis de datos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61Pestaña cuantificación. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65Configuración del análisis de datos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67Selectores de pocillos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68Gráficos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71Hojas de cálculo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

Capítulo 8. Ventanas de análisis de datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73Pestaña sobre cuantificación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73Pestaña sobre datos de cuantificación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76Pestaña de la curva de fusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78Pestaña de los datos de la curva de fusión. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79Pestaña Punto final . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79Pestaña sobre la discriminación alélica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81Pestaña sobre control de calidad . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83Pestaña sobre información de la ejecución. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84Informes de archivos de datos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

Capítulo 9. Análisis de la expresión genética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89Expresión genética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89Configuración de la placa para el análisis de expresión genética. . . . . . . . . . . . . 90Pestaña de expresión genética . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90Ventana para la configuración del experimento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96Estudio genético . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98Hoja de cálculo de los datos del estudio genético . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101Ventana sobre el informe del estudio genético . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102

Capítulo 10. Usuarios y preferencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105Inicio de sesión o selección de usuario. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105Ventana de preferencias del usuario . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106Administración de usuarios . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 113

Capítulo 11. Recursos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115Asistente de calibración. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115Mantenimiento del instrumento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117Registro de la aplicación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119Resolución de problemas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120Especificaciones técnicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 122Referencias . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124

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1 Instalación del sistemaLea este capítulo para obtener información sobre cómo configurar e instalar el sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real.

• Desembalaje del módulo de reacción óptica (a continuación)

• Requisitos del sistema (página 1)

• Descripción general del sistema (página 2)

• Configuración del sistema (página 4)

• Instalación del software CFX Manager™(página 6)

• Archivos de software (página 8)

• Ejecución de experimentos (página 8)

Desembalaje del módulo de reacción ópticaEl módulo de reacción óptica CFX96 se proporciona con los siguientes componentes:

• Módulo de reacción óptica

• Cable USB

• CD de instalación del software CFX Manager

• Manual de instrucciones

Retire todo el material de embalaje y consérvelo para utilizarlo en el futuro. Si alguno de los componentes no está o está dañado, póngase con contacto con su oficina local de Bio-Rad.

Requisitos del sistemaPara manejar el sistema CFX96, utilice las fuentes de alimentación y los cables que se indican a continuación:

• Potencia de entrada. 100–240 VCA a 50–60 Hz

• Para uso en interiores. Temperatura ambiente de 15–31°C. Humedad relativa máxima del 80%, sin condensación

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Instalación del sistema

• Cable USB. Si el sistema CFX96 va a estar controlado por un ordenador mediante un cable USB, el cable que proporciona Bio-Rad está suficientemente protegido para su uso

NOTA: Si desea consultar una lista completa de los requisitos de seguridad y cumplimiento de este instrumento, consulte la sección “Seguridad y cumplimiento de normativas" en la página iii.

Descripción general del sistemaEl sistema CFX96 incluye los dos componentes que se detallan a continuación:

• Módulo de reacción óptica. Este módulo posee un sistema óptico para recopilar datos de fluorescencia y un bloque de termociclador

NOTA: El número de serie del módulo CFX96 se encuentra en la parte trasera.

• Base del termociclador C1000™. La base C1000 incluye una interfaz de usuario para controlar el sistema cuando se ejecuta en modo independiente, además de un botón de encendido y puertos (ambos en el panel trasero) para conectarlo a un ordenador

Figura 1. Vista frontal del sistema CFX96.

Botón de apertura

LED de indicación

Panel frontal

2


Cuando se abre, el sistema CFX96 posee las características que se muestran en la Figura 2.

Figura 2. Vista interna del sistema CFX96.

¡ADVERTENCIA!No tocar la tapa interna ni el bloque: estas superficies puedenestar calientes.

• Tapa interna con placa calefactada. La tapa calefactada mantiene la temperatura de la parte superior de los consumibles para impedir la evaporación de las muestras. Evite tocarla o contaminarla de cualquier otra forma. Nunca introduzca nada por los orificios; el sistema de transmisión óptica podría resultar dañado

• Bloque. Cargue las muestras en este bloque antes de la ejecución

• Botón de cierre. Presione este botón en el interior de la tapa para cerrar la tapa motorizada

¡ADVERTENCIA! Evite que el instrumento se contamine a causa de derrames y no ejecute nunca una reacción en caso de que la tapa de la muestra esté abierta o presente alguna fuga. Si desea obtener información general sobre la limpieza y el mantenimiento del instrumento, consulte “Mantenimiento del instrumento” (página 117).

El panel trasero del chasis C1000 posee las siguientes características (Figura 3):

• Interruptor de potencia. Presione el interruptor de potencia para encender el sistema.

• Entrada de alimentación. Enchufe el cable de alimentación aquí

• Puerto Ethernet. Conecte un cable Ethernet para enviar por correo electrónico registros de ejecuciones y archivos de datos independientes

• Conexiones USB. Utilice estos puertos para conectar el sistema CFX96 a un ordenador

o a un termociclador S1000™

Botón de cierreBloque

Tapa interna con placa calefactada

3


Figura 3. Panel trasero del termociclador C1000.

¡ADVERTENCIA! Evite el contacto con la parte trasera del chasis C1000 cuando esté en funcionamiento.

Configuración del sistemaLa instalación del sistema de detección CFX96 mediante PCR en tiempo real debe realizarse en una superficie limpia, seca y nivelada con suficiente ventilación para funcionar correctamente. El sistema CFX96 se puede ejecutar de dos formas: modo autónomo o controlado por el software. Si ejecuta el sistema en el modo controlado por el software, asegúrese de que haya suficiente espacio para un ordenador durante la configuración.

Coloque la base del termociclador C1000 de forma que sea fácil acceder al interruptor de potencia que está situado en el panel trasero.

Para introducir el módulo de reacción óptica CFX96 en el hueco para el módulo de reacción del chasis C1000, siga estas instrucciones:

1. Coloque el chasis C1000 en un lugar adecuado con la barra de bloqueo bajada. Retire cualquier módulo de reacción que se haya instalado anteriormente.

2. Levante el módulo de reacción óptica por los asideros que se encuentran encima de las rejillas laterales de ventilación (Figura 4).

Figura 4. Cómo levantar el módulo de reacción óptica del chasis C1000.

Interruptor de potencia

Entrada de alimentación

Puerto Ethernet Conexiones USB

4


3. Coloque el módulo en el hueco para el módulo de reacción del chasis C1000, dejando aproximadamente 2 cm de espacio en la parte delantera. Cuando se encuentre en el hueco del chasis, el módulo óptico debería cubrir el logotipo de Bio-Rad que se encuentra en la parte frontal del hueco del chasis C1000.

4. Localice la barra de bloqueo en el otro lado del termociclador C1000 y tire de ella hacia arriba hasta que quede a ras de los laterales del hueco para el módulo. Esta acción mueve el módulo hacia delante y lo ubica en el lugar adecuado (Figura 5).

Figura 5. Bloqueo del módulo óptico en el lugar habilitado para ello.

5. Compruebe que el módulo esté totalmente colocado y de forma nivelada en la base C1000. No debería quedar ningún espacio adicional entre el módulo y la base; el espacio debe ser uniforme.

6. Conecte el cable de alimentación a la parte trasera de la base C1000 (Figura 3 en la página 4) y a una toma eléctrica de tres patillas adecuada. Presione el interruptor de potencia del panel trasero del termociclador C1000 para encender el sistema.

7. Siga las instrucciones del panel frontal del termociclador C1000 para retirar el tornillo rojo de transporte de la tapa interna calefactada (Figura 6). Gire el tornillo en sentido contrario a las agujas del reloj para sacarlo del orificio.

Figura 6. Instrucciones para retirar el tornillo de transporte.

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NOTA: Si no se retira el tornillo de transporte en este paso, el software CFX Manager lo detectará. Siga las instrucciones para retirar el tornillo (página 18).

CONSEJO: El tornillo de transporte debe estar colocado cuando se envía el módulo. Conserve este tornillo en un lugar seguro para futuros transportes.

8. Retire la placa de transporte del bloque termociclador para que éste funcione.

Instalación del software CFX ManagerEl software CFX Manager se ejecuta en un ordenador personal (PC) y es necesario para analizar los datos del sistema CFX96 y controlar el sistema en el modo controlado por el software. En la Tabla 6 se enumeran los requisitos del ordenador para el software CFX Manager (versión 1.6 o posterior).

Para instalar el software CFX Manager:

1. Asegúrese de haber iniciado sesión con privilegios administrativos. El software lo debe instalar en el ordenador un usuario con privilegios administrativos.

2. Coloque el CD del software de CFX Manager en la unidad de CD del ordenador.

3. La página de inicio del software debería aparecer automáticamente. Haga doble clic en Install Software (Instalar software) en la página de inicio del software (Figura 7).

Tabla 6. Requisitos del ordenador para la versión 1.6 o posterior del software CFX Manager

Sistema Mínimo Recomendado

Sistema operativo Windows XP Professional SP2 y posterior, Windows Vista Home Premium y posterior o Windows 7 Home Premium y posterior

Windows XP Professional SP2 y posterior, Windows Vista Professional o Windows 7 Professional

Unidad Unidad de CD-ROM Unidad de CD-RW

Disco duro 10 GB 20 GB

Velocidad del procesador

2,0 GHz 2,0 GHz

RAM 1 GB de RAM (2 GB para Windows Vista)

2 GB de RAM

Resolución de pantalla

1.024 x 768 con modo de color verdadero

1.280 x 1.024 con modo de color verdadero

USB Puerto USB 2.0 de alta velocidad Puerto USB 2.0 de alta velocidad

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Figura 7. Pantalla de instalación del software.

4. Siga las instrucciones que aparecen en pantalla para completar la instalación. Cuando haya finalizado, el icono del software CFX Manager de Bio-Rad aparecerá en el escritorio del ordenador.

5. Si la página de inicio no aparece automáticamente, haga doble clic en (Unidad de CD):\Bio-Rad CFX, abra el archivo Readme.txt y siga las instrucciones que aparecen en él. Consulte “Instalación del software de forma manual" en la página 120.

Instalación de los controladoresSi el sistema CFX96 se va a ejecutar en el Software-controlled mode (modo controlado por el software), es necesario instalar los controladores en el ordenador. Utilice únicamente el cable USB proporcionado, ya que cuenta con la protección suficiente para impedir pérdidas de datos.

Para instalar los controladores del sistema:

1. Conecte el chasis C1000 al ordenador mediante el cable USB conectado al puerto USB 2.0-A de la parte trasera del chasis (Figura 3 en la página 4) y al puerto de USB 2.0-B del ordenador.

2. Si aún no está encendido, encienda el sistema mediante el interruptor de potencia de la parte trasera del chasis C1000. Siga las instrucciones del Found New Hardware Wizard (Asistente para hardware nuevo encontrado) que se abre cuando el ordenador detecta el instrumento por primera vez.

3. En la primera pantalla, seleccione Yes, this time only (Sí, sólo esta vez) para ordenar al sistema operativo Windows que se conecte a Windows Update para buscar software. Haga clic en Next (Siguiente).

4. Indique al asistente que Install the software automatically (Instale el software automáticamente). Haga clic en Siguiente para continuar con la instalación de los controladores.

5. Haga clic en Finish (Finalizar) en la última pantalla de instalación del software cuando los controladores se hayan instalado.

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Archivos de softwareEl software CFX Manager guarda información sobre los experimentos en archivos específicos (Tabla 7):

Ejecución de experimentos

Consumibles de plástico recomendadosEl sistema CFX96 acepta tubos y placas de 0,2 ml de perfil bajo. Bio-Rad recomienda los siguientes consumibles para obtener resultados óptimos:

• MLL-9601. Placas con 96 pocillos transparentes de perfil bajo, sin faldilla

• MLL-9651. Placas con 96 pocillos blancos de perfil bajo, sin faldilla

• HSP-9601. Placas Hard-Shell® con 96 pocillos transparentes, con faldilla y color blanco

• HSP-9655. Placas Hard-Shell con 96 pocillos transparentes, con faldilla y color blanco

• TLS-0801. Tiras de 8 tubos de 0,2 ml de perfil bajo sin tapón y pocillos transparentes

• TLS-0851. Tiras de 8 tubos de 0,2 ml de perfil bajo sin tapón y pocillos blancos

• TCS-0803. Tiras de 8 tapones planos ópticos para tubos y placas de 0,2 ml

• MSB-1001. Sellos adhesivos Microseal® tipo “B” transparentes de calidad óptica

Carga del bloquePara cargar las reacciones en el bloque, siga estas sugerencias:

• Haga clic en el botón Open Lid (Abrir tapa) situado en la pestaña Start Run (Iniciar ejecución) (véase “Pestaña Iniciar ejecución" en la página 24) o presione el botón de la tapa de la parte delantera del sistema (Figura 1) para empezar a abrir la tapa motorizada

• Coloque la placa de 0,2 ml o las tiras de tubos con las tapas selladas en el bloque. Compruebe que los tubos estén completamente sellados para impedir que se produzcan fugas. Para obtener resultados óptimos, cargue volúmenes de muestra de 10–25 μl en el sistema CFX96

NOTA: Para obtener análisis de datos precisos, compruebe que la orientación de las reacciones sea exactamente la misma que la orientación del contenido

Tabla 7. Abra estos tipos de archivo con el software CFX Manager.

Tipo de archivo Extensión Cómo ver y editar el archivo

Protocolo .prcl Seleccionar en Experiment Setup (Configuración del experimento) y editar en Protocol Editor (Editor protocolos)

Placa .pltd Seleccionar en Experiment Setup (Configuración del experimento) y editar en Plate Editor (Editor de placas)

Datos .pcrd Ver y analizar en la ventana Data Analysis (Análisis de datos)

Estudio genético .mgxd Ver y analizar en la ventana Gene Study (Estudio genético)

Archivo independiente previo a los datos

.zpcr Contiene lecturas de fluorescencia de operaciones independientes que se convierten en un archivo de datos

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de los pocillos en la pestaña Plate (Placa) del software. Si lo precisa, edite el contenido de los pocillos antes, durante o después de la ejecución.

¡ADVERTENCIA! Cuando ejecute el sistema CFX96, equilibre siempre las tiras de tubo o las microplacas cortadas en los pocillos (Figura 8). Por ejemplo, si procesa una tira de tubos en la parte izquierda del bloque, coloque una tira de tubos vacía (con tapas) en la parte derecha del bloque para equilibrar la presión que aplica la tapa calefactada. Si no se equilibra la presión, la muestra se puede evaporar y, además, se pueden producir ejecuciones erróneas.

Figura 8. Equilibre las tiras de tubos o las microplacas cortadas en el bloque.

¡ADVERTENCIA! Asegúrese de que no haya nada bloqueando la tapa cuando se cierre. Aunque existe un mecanismo de seguridad para evitar que la tapa se cierre si detecta una obstrucción, no coloque nada que pueda suponer un obstáculo para cerrarla.

Cómo apagar el sistemaPara apagar el sistema CFX96, siga estas sugerencias:

• Después de ejecutar un experimento, presione el botón de apertura de la tapa de la parte delantera del sistema CFX96 para tener acceso a las muestras cargadas en el bloque termociclador

• Retire las muestras del bloque y presione el botón de cierre para cerrar la tapa del sistema CFX96

• Presione el interruptor de potencia del panel trasero del termociclador C1000 para apagar el sistema

Tira de tubos llena

Tira de tubos para equilibrar

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2 Software CFX Manager™Lea este capítulo si desea obtener información sobre cómo empezar a utilizar el software CFX Manager.

• Ventana principal del software (a continuación)

• Asistente de inicio (página 16)

• Panel de instrumentos detectados (página 16)

• Ventana de propiedades de los instrumentos (página 18)

Ventana principal del softwareEn la Figura 9. se ilustran las funciones disponibles en la ventana principal del software.

Figura 9. La ventana principal del software.

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Software CFX Manager™

Barra de menúsLa barra de menús de la ventana principal del software contiene los elementos que figuran en la Tabla 8.

Tabla 8. Elementos de la barra de menús de la ventana principal del software.

Elemento de menú

Comando Función

File (Archivo) New (Nuevo) Crear un protocolo, una placa, un experimento o un estudio genético nuevos

Open (Abrir) Abrir archivos existentes, entre otros, los relacionados con protocolos (.prcl), placas (.pltd), datos (.pcrd) y estudios genéticos (.mgxd), así como archivos de ejecuciones independientes (.zpcr)

Recent Data Files (Archivos de datos recientes)

Visualizar una lista con los diez últimos archivos de datos consultados en la que se puede seleccionar uno para que se abra en la ventana Data Analysis (Análisis de datos)

Repeat an Experiment (Repetir un experimento)

Abrir la ventana Experiment Setup (Configuración del experimento) con el protocolo y la placa de una ejecución finalizada para repetir rápidamente la ejecución

Exit (Salir) Salir del programa de software

View (Ver) Application Log (Registro de la aplicación)

Mostrar el registro de la aplicación para el software

Run Reports (Informes de ejecución)

Seleccionar un informe de ejecución de la lista para revisarlo

Startup Wizard (Asistente de inicio)

Abrir el Asistente de inicio

Experiment Setup (Configuración del experimento)

Abrir la ventana de configuración del experimento

Instrument Summary (Resumen del instrumento)

Abrir la ventana que contiene el resumen del instrumento

Detected Instruments (Instrumentos detectados)

Mostrar u ocultar el panel de instrumentos detectados

Toolbar (Barra de herramientas)

Mostrar u ocultar la barra de herramientas de la ventana principal del software

Status Bar (Barra de estado)

Mostrar u ocultar la barra de estado de la ventana principal del software

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User (Usuario) Select User (Seleccionar usuario)

Abrir la ventana de selección de usuario para cambiar el usuario del software

Change Password (Cambiar contraseña)

Cambiar la contraseña de usuario

User Preferences (Preferencias de usuario)

Abrir la ventana de preferencias del usuario

User Administration (Administración de usuarios)

Gestionar los usuarios en la ventana de administración de usuarios

Tools (Herramientas)

Dye Calibration Wizard (Asistente de calibración de tinturas)

Abrir la ventana de calibración de tinturas para calibrar un instrumento para un nuevo fluoróforo

Protocol AutoWriter (Escritor automático de protocolos)

Abrir la ventana del escritor automático de protocolos para crear un protocolo nuevo

Ta Calculator (Calculadora de Ta)

Abrir la ventana de la calculadora de Ta para calcular la temperatura de hibridación de los iniciadores

View Block Status Log (Ver registro de estado del bloque)

Mostrar el registro del bloque del termociclador

Application Data Folder (Carpeta de datos de la aplicación)

Abrir la carpeta de datos de la aplicación para ver los archivos del software

User Data Folder (Carpeta de datos de usuario)

Abrir la carpeta de datos para ver los archivos de datos, protocolos y placas

Properties All Instruments (Propiedades de todos los instrumentos)

Mostrar las propiedades de todos los instrumentos detectados, incluidos los números de serie

Zip Data and Log Files (Comprimir datos y archivos de registro)

Elegir archivos y comprimirlos en un archivo zip para almacenarlos o enviarlos por correo electrónico

Options (Opciones)

Configurar los ajustes de correo electrónico del software

Tabla 8. Elementos de la barra de menús de la ventana principal del software. (cont.)

Elemento de menú

Comando Función

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Windows (Ventanas)

Cascade (Cascada)

Organizar las ventanas del software una encima de otra

Tile Vertical (Mosaico vertical)

Organizar las ventanas del software de arriba abajo

Tile Horizontal (Mosaico horizontal)

Organizar las ventanas del software de derecha a izquierda

Close All (Cerrar todo)

Cerrar todas las ventanas abiertas del software

Help (Ayuda) Contents (Contenido)

Abrir la ayuda del software para obtener más información sobre la ejecución de PCR y PCR en tiempo real

Index (Índice) Visualizar el índice de la ayuda del software

Search (Buscar) Buscar en la ayuda del software

Gene Expression Gateway Website (Sitio web de la puerta de enlace de la expresión genética)

Abrir un sitio web para buscar información sobre cómo ejecutar experimentos de PCR y PCR en tiempo real

PCR Reagents Website (Sitio web de reactivos de PCR)

Abrir un sitio web en el que aparezcan los consumibles de Bio-Rad para reactivos de PCR y PCR en tiempo real

PCR Plastic Consumables Website (Sitio web de consumibles de plástico para PCR)

Abrir un sitio web en el que aparezcan los consumibles de Bio-Rad para experimentos de PCR y PCR en tiempo real

Software Updates (Actualizaciones de software)

Buscar actualizaciones de software de Bio-Rad

About (Acerca de) Abrir una ventana para consultar la versión de software

Tabla 8. Elementos de la barra de menús de la ventana principal del software. (cont.)

Elemento de menú

Comando Función

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Botones de la barra de herramientasHaga clic en algún botón de la barra de herramientas de la ventana principal del software (Tabla 9) para obtener acceso rápido a los comandos habituales del software.

Tabla 9. Botones contenidos en la barra de herramientas de la ventana principal del software.

Botón Nombre del botón Función

Open a Data File (Abrir un archivo de datos)

Abrir una ventana del explorador para buscar un archivo de datos (extensión *.pcrd) y abrirlo en la ventana de Data Analysis (análisis de datos) (página 61)

Open a Gene Study (Abrir un estudio genético)

Abrir una ventana del explorador para buscar un archivo de estudio genético (extensión *.mgxd) y abrirlo en la ventana de Gene Study (estudio genético) (página 99)

Create a New Gene Study (Crear un estudio genético nuevo)

Abrir la ventana de Gene Study (estudio genético) (página 99) para añadir archivos y crear un estudio nuevo

Print (Imprimir) Imprimir la ventana actual del software

Startup Wizard (Asistente de inicio)

Abrir el asistente de inicio que establece un enlace con las funciones habituales del software (página 16)


Abrir la ventana de configuración del experimento para ejecutar un experimento (página 21)

Protocol AutoWriter (Escritor automático de protocolos)

Abrir la ventana del escritor automático de protocolos para crear un protocolo nuevo (página 36)

Select User (Seleccionar usuario)

Abrir la ventana de selección de usuario para cambiar el usuario del software (véase “Inicio de sesión o selección de usuario" en la página 105)

User Preferences (Preferencias de usuario)

Abrir la ventana de preferencias del usuario (página 106)

Help (Ayuda) Abrir la ventana de ayuda del software para obtener más información sobre la ejecución de PCR y PCR en tiempo real

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Asistente de inicioLa aplicación Startup Wizard (Asistente de inicio) aparece automáticamente cuando se abre por primera vez el software CFX Manager (Figura 9). De no ser así, haga clic en el botón del Asistente de inicio que se encuentra en la barra de herramientas de la ventana principal del software.

El Asistente de inicio permite realizar las siguientes acciones:

• Create a new Experiment (Crear un experimento nuevo) (página 21). Permite configurar el protocolo y la placa para iniciar un experimento nuevo

• Repeat an Experiment (Repetir un experimento). Permite configurar un experimento con el protocolo y la placa de una ejecución que ya se haya realizado. En caso de que sea necesario, puede modificar el experimento antes de ejecutarlo

• Open a Data File (Abrir un archivo de datos) (página 61). Permite abrir un archivo de datos para analizar los resultados.

• Open a Gene Study (Abrir un estudio genético) (página 98). Permite abrir un estudio de expresión genética de varios archivos para analizar los resultados de diversos experimentos de expresión genética

• Open User Preferences (Abrir preferencias de usuario) (página 106). Permite abrir la ventana de User Preferences (preferencias del usuario) para personalizar las opciones del software

Panel de Detected Instruments (instrumentos detectados)Los instrumentos conectados aparecen en el panel Detected Instruments (Instrumentos detectados) que se ilustra en la Figura 10. En esta lista, cada instrumento aparece representado con un icono identificado con el número de serie (predeterminado).

Figura 10. Instrumentos enumerados en el panel de Detected Instruments (instrumentos detectados).

Haga clic con el botón derecho del ratón en el icono o el bloque del instrumento para seleccionar alguna de las siguientes opciones:

• View Status (Ver estado). Permite abrir la ventana Run Details (Detalles de ejecución) para comprobar el estado del bloque del instrumento seleccionado

• Flash Block Indicator (Parpadear indicador de bloque). Hace que parpadee el LED del indicador en el instrumento

• Open Lid (Abrir tapa). Permite abrir una tapa motorizada en el bloque del instrumento seleccionado

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• Close Lid (Cerrar tapa). Permite cerrar una tapa motorizada en el bloque del instrumento seleccionado

• Rename (Cambiar nombre). Permite cambiar el nombre del instrumento

• Properties (Propiedades). Permite abrir la ventana de Instrument Properties (propiedades del instrumento)

• Collapse All (Contraer todo). Permite contraer la lista de instrumentos en el panel de Detected Instruments (los instrumentos detectados)

• Expand All (Expandir todo). Permite expandir la lista de instrumentos en el panel de Detected Instruments (los instrumentos detectados)

También es posible controlar un bloque. Para ello, haga clic en un icono de bloque de instrumento del panel de instrumentos detectados y, a continuación, haga clic en algún botón del panel Selected Instrument (Instrumento seleccionado) que se ilustra en la Figura 11.

Figura 11. Botones de la parte inferior del panel de los instrumentos detectados.

• Haga clic en View Status (Ver estado) para abrir la ventana Run Details (Detalles de ejecución) a fin de comprobar el estado del bloque del instrumento seleccionado

• Haga clic en Open Lid (Abrir tapa) para abrir las tapas motorizadas del instrumento seleccionado

• Haga clic en Close Lid (Cerrar tapa) para cerrar las tapas motorizadas del instrumento seleccionado

• Haga clic en View Summary (Ver resumen) para abrir la ventana Instrument Summary (Resumen del instrumento)

En caso de que se detecte un único instrumento, el botón View Summary (Ver resumen) no aparece. Por tanto, si desea visualizar la ventana Instrument Summary (Resumen del instrumento) para un único instrumento, seleccione View > Instrument Summary (Ver > Resumen del instrumento).

Barra de estadoEn el lateral izquierdo de la barra de estado de la parte inferior de la ventana principal del software aparece el estado actual de los instrumentos. En el lateral derecho de ésta, aparece el nombre de usuario, la fecha y la hora actuales.

Haga clic en la esquina derecha de la barra de estado y arrástrela para cambiar el tamaño de la ventana principal.

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Ventana de Instrument Properties (propiedades de los instrumentos)

Para abrir la ventana Instrument Properties (Propiedades del instrumento) a fin de poder consultar información sobre algún instrumento, haga clic con el botón derecho del ratón en el icono del instrumento en cuestión del panel Detected Instruments (Instrumentos detectados) que se ilustra en la Figura 10 en la página 16.

Pestaña de Properties (propiedades)La pestaña Properties (Propiedades) muestra números de serie importantes para el instrumento conectado, entre otros, el del termociclador y el del módulo de reacción. También aparecen las versiones del firmware. El nombre predeterminado de un instrumento se corresponde con el número de serie del termociclador C1000, que aparece en muchos lugares, como en el panel Detected Instruments (Instrumentos detectados) que se ilustra en la Figura 12.

Para cambiar el nombre de un instrumento a fin de que su identificación resulte más sencilla, siga estas instrucciones:

• En la pestaña Instrument Properties (Propiedades del instrumento), escriba un nombre en el recuadro Rename (Cambiar nombre) que se encuentra en la parte superior de la pestaña y, a continuación, haga clic en el botón Rename (Cambiar nombre) para guardar el nombre nuevo

Figura 12. Ventana de Instrument Properties (propiedades de los instrumentos).

Pestaña del Shipping Screw (tornillo de transporte)La pestaña Shipping Screw (Tornillo de transporte) contiene instrucciones para instalar o extraer el tornillo rojo de transporte. Para evitar daños en los módulos de reacción óptica, instale el tornillo de transporte siempre que vaya a mover el sistema CFX96.

NOTA: Si el software detecta el tornillo de transporte, se abrirá automáticamente la ventana Instrument Properties (Propiedades del instrumento) con la pestaña del Shipping Screw (tornillo de transporte) en un primer plano. Siga las

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instrucciones adecuadas para extraer el tornillo, ya que no es posible realizar ejecuciones si este tornillo está instalado.

La información de esta pestaña cambia en función de si el tornillo de transporte está instalado o no. Por ejemplo, para instalar el tornillo de transporte, haga clic en el botón Install Shipping Screw (Instalar tornillo de transporte) y siga las instrucciones que aparecen en la pestaña (Figura 13).

Figura 13. Instrucciones para instalar el tornillo de transporte.

Pestaña de Calibrated Dyes (tinturas calibradas)Abra la pestaña Calibrated Dyes (Tinturas calibradas) para ver la lista de las placas y los fluoróforos calibrados para el instrumento seleccionado (Figura 14). Haga clic en alguno de los botones Info (Información) para consultar información detallada sobre alguna calibración.

Figura 14. Pestaña de Calibrated Dyes (tinturas calibradas) de la ventana de Instrument Properties (propiedades del instrumento).

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3 Ejecución de experimentosLea este capítulo para obtener información sobre la ejecución de experimentos con el software CFX Manager™:

• Ventana para la configuración del experimento (a continuación)

• Pestaña Protocolo (página 22)

• Pestaña Placa (página 23)

• Pestaña Iniciar ejecución (página 24)

• Ventana Detalles de ejecución (página 26)

Ventana para la configuración del experimentoLa ventana Experiment Setup (Configuración del experimento) proporciona acceso rápido a los archivos y las opciones necesarias para configurar y ejecutar un experimento. Para abrir la ventana Experiment Setup (Configuración del experimento), elija alguna de estas opciones:

• Haga clic en la opción Create a New Experiment (Crear un experimento nuevo) en el Startup Wizard (Asistente de inicio) (página 16)

• Haga clic en el botón Experiment Setup (Configuración del experimento) en la barra de herramientas de la ventana principal del software (página 21)

• Seleccione File > New > Experiment (Archivo > Nuevo > Experimento) en la barra de menús de la ventana principal del software (página 12)

La ventana de configuración del experimento contiene tres pestañas:

• Protocol (Protocolo). Haga clic en la pestaña Protocolo (Protocolo) para seleccionar un protocolo existente para ejecutarlo o editarlo, o para crear un protocolo nuevo en la ventana Protocol Editor (Editor de protocolos) (página 29)

• Plate (Placa). Haga clic en la pestaña Plate (Placa) para seleccionar una placa existente para ejecutarla o editarla, o para crear una placa nueva en la ventana Plate Editor (Editor de placas) (página 39)

• Start Run (Iniciar ejecución). Haga clic en la pestaña Start Run (Iniciar ejecución) (página 24) para revisar la configuración de la ejecución, seleccionar uno o varios bloques del instrumento y comenzar la ejecución

NOTA: Si el protocolo actualmente seleccionado en la pestaña de protocolo no incluye un paso con una lectura de placa para en análisis de PCR en tiempo

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real, la pestaña Plate (Placa) estará oculta. Para que aparezca la pestaña Plate (Placa), añada una “lectura de placa” (página 32) al menos en uno de los pasos del protocolo.

NOTA: Inicie un experimento nuevo a partir de una ejecución anterior. Para ello, seleccione File > Repeat an Experiment (Archivo > Repetir un experimento) en la barra de menús de la ventana principal del software. A continuación, seleccione el archivo de datos (.pcrd) del experimento que desee repetir.

La ventana de configuración del experimento se abre con la pestaña Protocol (Protocolo) en un primer plano (Figura 15). Para abrir otra pestaña, haga clic en ella o en los botones Prev (Anterior) y Next (Siguiente) de la parte inferior de la ventana.

Figura 15. Ventana de configuración del experimento con las pestañas Protocol (Protocolo), Plate (Placa) y Start Run (Iniciar ejecución).

Pestaña ProtocoloLa pestaña Protocol (Protocolo) muestra una vista previa del archivo de protocolo seleccionado que está cargado en la configuración del experimento (Figura 15). Los archivos de protocolo contienen las instrucciones para los pasos de temperatura del instrumento y opciones del instrumento que controlan la inclinación de la rampa y la temperatura de la tapa.

Seleccione una de las siguientes opciones para elegir un protocolo existente, crear uno nuevo o editar el protocolo que se encuentra seleccionado actualmente:

• Botón Create New (Crear nuevo). Abre la ventana del editor de protocolos para crear un protocolo nuevo

• Botón Select Existing (Seleccionar existente). Abre una ventana del explorador en la que puede seleccionar y cargar el archivo de un protocolo existente (extensión .prcl) en la pestaña Protocol (Protocolo)

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Manual de instrucciones del sistema de detección CFX96™

• Menú desplegable Express Load (Carga exprés). Le permite seleccionar de forma rápida un protocolo para cargarlo en la pestaña de protocolo

CONSEJO: Para añadir o eliminar protocolos en el menú Express Load (Carga exprés), añada archivos (extensión .prcl) a la carpeta Express Load (Carga exprés) o elimínelos de la misma. Para encontrar esta carpeta, seleccione Tools > User Data Folder (Herramientas > Carpeta de datos del usuario) en la barra de menús de la ventana principal del software.

• Botón Edit Selected (Editar selección). Abre el protocolo seleccionado actualmente en el editor de protocolos

Ejecuciones sólo de punto finalPara ejecutar un protocolo que sólo contenga un paso de adquisición de datos de punto final, seleccione Options > End Point Only Run (Opciones > Ejecuciones sólo de punto final) en las opciones de la barra de menús de la ventana Experiment Setup (Configuración del experimento). En la pestaña de protocolo se carga el protocolo de punto final predeterminado, que incluye dos ciclos de 60,0 °C durante 30 segundos. Para cambiar la temperatura del paso o el volumen de la muestra de la ejecución sólo de punto final, haga clic en la pestaña Start Run (Iniciar ejecución) y edite las opciones Step Temperature (Temperatura del paso) o Sample Volume (Volumen de la muestra).

Pestaña PlacaLa pestaña Plate (Placa) muestra una vista previa del archivo de placa seleccionado que está cargado en la configuración del experimento (Figura 16). En un experimento de PCR en tiempo real, el archivo de placa contiene una descripción del contenido de cada pocillo, el modo de exploración y el tipo de placa. El software CFX Manager utiliza estas descripciones para la recopilación de datos y los análisis.

Seleccione una de las siguientes opciones para elegir una placa existente, crear una nueva o editar la placa que se encuentra seleccionada actualmente:

• Botón Create New (Crear nuevo). Abre la ventana del editor de placas para crear una placa nueva

• Botón Select Existing (Seleccionar existente). Abre una ventana del explorador en la que puede seleccionar y cargar el archivo de una placa existente (extensión .pltd) en la pestaña de placa

• Menú desplegable Express Load (Carga exprés). Le permite seleccionar de forma rápida una placa para cargarla en la pestaña de placa

CONSEJO: Para añadir o eliminar placas en el menú Express Load (Carga exprés), añada archivos (extensión .pltd) a la carpeta Express Load (Carga exprés) o elimínelos de la misma. Para encontrar esta carpeta, seleccione Tools > User Data Folder (Herramientas > Carpeta de datos del usuario) en la barra de menús de la ventana principal del software

• Botón Edit Selected (Editar selección). Abre la placa actualmente seleccionada en el editor de protocolos

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Figura 16. Ventana de la pestaña de placa.

Pestaña Iniciar ejecuciónLa pestaña Start Run (Iniciar ejecución) (Figura 17) incluye una sección para revisar la información sobre la ejecución que está a punto de iniciarse, como los archivos de protocolo y placa seleccionados y una sección para elegir el bloque del instrumento.

• Panel Run Information (Información de la ejecución). Le permite ver el archivo de protocolo, el archivo de placa y la opción de modo de exploración para adquisición de datos seleccionados. Puede introducir notas opcionales sobre el experimento en el cuadro Notes (Notas)

• Panel Start Run on Selected Block(s) (Iniciar ejecución en bloques seleccionados). Seleccione uno o varios bloques, edite los parámetros de la ejecución (si fuera necesario) y haga clic en el botón Start Run (Iniciar ejecución) para comenzar el experimento

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Figura 17. Pestaña Start Run (Iniciar ejecución).

Para añadir o eliminar parámetros de la ejecución de la hoja de cálculo del panel Start Run on Selected Block(s) (Iniciar ejecución en bloques seleccionados), haga clic con el botón derecho del ratón en la lista y seleccione una opción en el menú que se abre. Elija el valor que desea cambiar haciendo clic en el texto del interior de la celda para seleccionarlo y, a continuación, escriba el valor nuevo en la celda o seleccione un parámetro nuevo en el menú desplegable. Los parámetros que se pueden editar son los siguientes:

• Lid Temperature (Temperatura de la tapa). Le permite ver la temperatura de la tapa. Para anular la temperatura predeterminada de la tapa, seleccione el texto y escriba una temperatura nueva

¡ADVERTENCIA! Cambiar la temperatura de la tapa puede afectar a los resultados del experimento y producir ejecuciones fallidas.

Botones para controlar el instrumentoHaga clic en los siguientes botones de la pestaña de inicio de la ejecución para manejar de forma remota los instrumentos seleccionados:

• Start Run (Iniciar ejecución). Inicia el experimento en los bloques seleccionados del instrumento

• Flash Block Indicator (Parpadear indicador de bloque). Hace que parpadee el LED del indicador en los bloques seleccionados del instrumento

• Open Lid (Abrir tapa). Abre la tapa motorizada en los bloques seleccionados del instrumento

• Close Lid (Cerrar tapa). Cierra la tapa motorizada en los bloques seleccionados del instrumento

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Ventana Run Details (Detalles de ejecución)Cuando hace clic en el botón Start Run (Iniciar ejecución), el software CFX Manager le pide que guarde el nombre del archivo de datos y, a continuación, abre la ventana Run Details (Detalles de ejecución). Revise la información de esta ventana para supervisar el progreso de una ejecución.

• Pestaña Run Status (Estado de la ejecución). Le permite revisar el estado actual del protocolo, abrir la tapa, detener una ejecución, añadir repeticiones, omitir pasos o detener la ejecución

• Pestaña Real-Time Status (Estado en tiempo real). Le permite ver los datos de fluorescencia de PCR en tiempo real a medida que se van recopilando

• Pestaña Time Status (Estado de tiempo). Le permite ver una cuenta atrás del protocolo en pantalla completa

La Figura 18 muestra las funciones de la ventana de detalles de la ejecución.

Figura 18. Ventana Detalles de ejecución.

Pestaña de estado de la ejecuciónLa pestaña Run Status (Estado de la ejecución) (Figura 18) muestra el estado actual de una ejecución en curso en la ventana de detalles de la ejecución y proporciona botones (página 27) para controlar la tapa y cambiar la ejecución en curso.

• Panel Run Status (Estado de la ejecución). Muestra el progreso del protocolo, incluido el paso actual, la repetición “Ir a” actual, la temperatura del bloque, el tiempo de retención restante para el paso actual, la temperatura de la muestra y la temperatura de la tapa y el transporte

• Botones Run Status (Estado de la ejecución). Haga clic en uno de los botones para manejar de forma remota el instrumento o interrumpir el protocolo en curso

• Panel Run Information (Información de la ejecución). Muestra detalles sobre el experimento

26


BOTONES DE LA PESTAÑA DE ESTADO DE LA EJECUCIÓNHaga clic en uno de los botones que figuran en la Tabla 10 para manejar el instrumento desde el software o cambiar la ejecución en curso. NOTA: si cambia el protocolo durante la ejecución, como por ejemplo si añade repeticiones, no se modifica el archivo de protocolo asociado con la ejecución. Estas acciones se registran en el registro de la ejecución.

Pestaña de estado en tiempo realLa pestaña Real-time Status (Estado en tiempo real) (Figura 19) muestra los datos de PCR en tiempo real que se recopilan en cada ciclo del protocolo después de las dos primeras lecturas de la placa. Esta pestaña también muestra el selector del pocillo y el texto que describe el estado del protocolo en la parte inferior de la ventana.

Tabla 10. Botones de estado de la ejecución y sus funciones

Botón Función

Abre la tapa motorizada en los instrumentos seleccionados

¡ADVERTENCIA! Al abrir la tapa durante una ejecución, se detiene la ejecución en el paso actual y los datos pueden resultar alterados.

Cierra la tapa motorizada en los instrumentos seleccionados

Añade más repeticiones al paso “Ir a” actual del protocolo. Este botón solamente está disponible cuando se está ejecutando un paso “Ir a”

Omite el paso actual del protocolo. Si omite un paso “Ir a”, el software confirma que desea omitir todo el bucle de “Ir a” y prosigue con el siguiente paso del protocolo

Hace parpadear el LED del instrumento seleccionado para identificar los bloques seleccionados

Detiene el protocolo

NOTA: esta acción se registra en el registro de la ejecución.

Reanuda un protocolo que se encuentra detenido

Detiene la ejecución antes de que finalice el protocolo

¡ADVERTENCIA! Si se detiene una ejecución de forma repentina, se pueden alterar los datos y, además, pueden producirse fallos en el experimento.

27


Figura 19. La pestaña de estado en tiempo real muestra los datos durante una ejecución.

SUSTITUCIÓN DE UN ARCHIVO DE PLACA

Durante una ejecución se puede sustituir el archivo de placa haciendo clic en el botón Replace Plate (Reemplazar placa) (Figura 19) en la pestaña Real-time Status (Estado en tiempo real). Seleccione el archivo de placa nuevo (.pltd) en la lista del explorador de Windows.

NOTA: El software CFX Manager comprueba que el modo de exploración y el tamaño de la placa del archivo de placa coinciden con la configuración de la ejecución del experimento.

CONSEJO: Sustituir un archivo de placa es especialmente útil si inicia una ejecución con un archivo de tipo Quick Plate (Placa rápida) de la carpeta Express Load (Carga exprés).

Pestaña de estado temporalLa pestaña Time Status (Estado temporal) muestra una cuenta atrás para la ejecución actual.

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4 ProtocolosLea el siguiente capítulo para obtener información sobre cómo crear y editar archivos de protocolo:

• Ventana del editor de protocolos (a continuación)

• Controles del editor de protocolos (página 32)

• Modo de control de temperatura (página 35)

• Escritor automático de protocolos (página 36)

Ventana del editor de protocolosUn protocolo ordena al instrumento que controle los pasos de temperatura, la temperatura de la tapa y otras opciones del instrumento. Abra la ventana Protocol Editor (Editor de protocolos) para crear un protocolo nuevo o editar el protocolo que se encuentra seleccionado actualmente en la pestaña Protocol (Protocolo). Cuando se haya creado o editado un protocolo en el editor de protocolos, haga clic en OK (Aceptar) para cargar el archivo del protocolo en la ventana Experiment Setup (Configuración del experimento) y ejecútelo.

¡ADVERTENCIA! Confirme siempre que el protocolo cargado es correcto en la pestaña Start Run (Iniciar ejecución) antes de comenzar la ejecución. Si realiza una ejecución con el protocolo equivocado, se podrían alterar los datos o producir una ejecución fallida.

Abrir el editor de protocolosPara abrir el editor de protocolos, elija alguna de estas opciones:

• Para crear un protocolo nuevo, seleccione File > New > Protocol (Archivo > Nuevo > Protocolo) o haga clic en el botón Create New (Crear nuevo) de la pestaña Protocol (Protocolo) (página 22)

• Para abrir un protocolo existente, seleccione File > Open > Protocol (Archivo > Abrir > Protocolo) o haga clic en el botón Open Existing (Abrir existente) de la pestaña Protocol (Protocolo) (página 22)

29

Protocolos

• Para editar el protocolo actual de la pestaña Protocol (Protocolo), haga clic en el botón Edit Selected (Editar selección) de la pestaña Protocol (Protocolo) (página 22)

CONSEJO: Para cambiar las opciones predeterminadas de la ventana del editor de protocolos, introduzca los cambios en la pestaña Protocol (Protocolo) de la ventana User Preferences (Preferencias del usuario) (página 106).

Ventana del editor de protocolosLa ventana del editor de protocolos (Figura 20) incluye las siguientes funciones:

• Barra de menús. Permite seleccionar opciones de configuración para el protocolo

• Barra de herramientas. Permite seleccionar opciones para editar el protocolo

• Protocolo. Muestra el protocolo seleccionado en una vista de gráfico (en la parte superior) y de texto (en la parte inferior). Haga clic en la temperatura o el tiempo de permanencia de la vista de gráfico o de texto de cualquier paso para introducir un valor nuevo

• Botones del editor de protocolos. Edite el protocolo haciendo clic en uno de los botones de la izquierda de la vista de texto.

Figura 20. Ventana del editor de protocolos con botones para editar protocolos.

30


Barra de menús del editor de protocolosLa barra de menús de la ventana del editor de protocolos proporciona los elementos que se muestran en la Tabla 11.

La barra de herramientas de la ventana del editor de protocolos proporciona un acceso rápido a funciones importantes. La Tabla 12 muestra las funciones de los botones de la barra de herramientas de esta ventana.

Tabla 11. Barra de menús del editor de protocolos

Elemento de menú

Comando Función

File (Archivo) Save (Guardar) Guardar el protocolo actual

Save As (Guardar como)

Guardar el protocolo actual con un nombre nuevo en una ubicación diferente

Close (Cerrar) Cerrar el editor de protocolos

Settings (Configu-ración)

Lid Settings (Configuración de la tapa)

Abrir la ventana Lid Settings (Configuración de la tapa) para cambiar o establecer la temperatura de la tapa


Gradient Calculator (Calculadora de gradiente)

Permite seleccionar el tipo de bloque para un paso de gradiente

Run-time Calculator (Calculadora del tiempo de ejecución)

Permite seleccionar el instrumento y el modo de exploración que se utilizará para calcular el tiempo estimado de la ejecución en la ventana Experiment Setup (Configuración del experimento)

Tabla 12. Botones de la barra de herramientas del editor de protocolos

Menús y botones de la barra de herramientas

Nombre Función

Save (Guardar) Guardar el archivo de protocolo actual

Print (Imprimir) Imprimir la ventana seleccionada

Insert Step (Introducir paso)

Seleccionar After (Después) o Before (Antes) para introducir un paso relativo al paso resaltado en ese momento

Sample Volume (Volumen de muestra)

Introduzca un volumen de muestra comprendido entre 0 y 50 μl. El volumen de la muestra determina el modo de control de temperatura (página 35). Introduzca cero (0) para seleccionar el modo Block (Bloque)

Run Time (Tiempo de ejecución)

Visualizar un tiempo de ejecución estimado basado en los pasos del protocolo y la pendiente de la rampa

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Protocolos

Controles del editor de protocolosLa ventana Protocol Editor (Editor de protocolos) incluye botones para editar el protocolo en la parte inferior izquierda de la pantalla. En primer lugar, seleccione y resalte un paso en el protocolo haciendo clic en él con el puntero del ratón. A continuación, haga clic en uno de los botones del editor de protocolos de la parte inferior izquierda de la ventana del editor de protocolos. La ubicación para introducir un paso nuevo Before (Antes) o After (Después) del paso seleccionado actualmente está determinada por el estado de la casilla Insert Step (Introducir paso) de la barra de herramientas.

Botón Introducir paso Para introducir un paso de temperatura antes o después del paso seleccionado actualmente:

1. Haga clic en el botón Insert Step (Introducir paso).

2. Edite la temperatura o el tiempo de retención; para ello, haga clic en el valor predeterminado en la vista de gráfico o de texto e introduzca un valor nuevo.

Añadir o eliminar una lectura de placaPara añadir una lectura de placa en un paso o eliminar una lectura de placa de un paso:

1. Seleccione el paso haciendo clic en él en la vista de gráfico o de texto.

2. Haga clic en el botón Add Plate Read to Step (Añadir lectura de placa a un paso) para añadir una lectura de placa al paso seleccionado. Si el paso ya contiene una lectura de placa, el texto del botón cambia a Remove Plate Read (Eliminar lectura de placa). Haga clic en este botón para eliminar una lectura de placa del paso seleccionado.

Botón para la introducción de gradientePara introducir un paso de gradiente antes o después del paso seleccionado actualmente, proceda como sigue:

1. Inserte un paso de gradiente de temperatura haciendo clic en el botón Insert Gradient (Insertar gradiente).

2. Edite el rango de temperaturas del gradiente haciendo clic en la temperatura predeterminada en la vista de gráfico o de texto y, a continuación, introduzca una temperatura nueva.

3. Edite el tiempo de retención haciendo clic en el tiempo predeterminado en la vista de gráfico o de texto y, a continuación, introduzca un nuevo valor temporal.

Help (Ayuda) Abrir la ayuda del software para obtener más información sobre protocolos

Tabla 12. Botones de la barra de herramientas del editor de protocolos (cont.)

Menús y botones de la barra de herramientas

Nombre Función

32


La Figura 21 muestra el paso de gradiente introducido. Las temperaturas de cada fila del gradiente aparecen en la parte de derecha de la ventana.

Figura 21. Protocolo con un paso de gradiente introducido.

Botón para la introducción de destinosPara introducir un paso Ir a antes o después del paso seleccionado actualmente, proceda como sigue:

1. Haga clic en el botón Insert GOTO (Insertar Ir a).

2. Edite el número de paso Ir a o el número de repeticiones Ir a haciendo clic en el valor predeterminado en la vista de gráfico o de texto y, a continuación, introduzca un valor nuevo.

La Figura 21 muestra un paso Ir a insertado al final del protocolo. Observe que el bucle Ir a incluye los pasos comprendidos entre el 2 y el 4.

Botón para inserción de curvas de fusiónPara introducir un paso de curva de fusión antes o después del paso seleccionado actualmente, proceda como sigue:

1. Haga clic en el botón Insert Melt Curve (Insertar curva de fusión).

2. Edite el rango de temperaturas de fusión o aumente el tiempo haciendo clic en el valor predeterminado en la vista de gráfico o de texto y, a continuación, introduzca un valor nuevo. De forma alternativa, haga clic en el botón Step Options (Opciones de paso)

33

Protocolos

para introducir el rango de gradientes en la ventana de las opciones de pasos (página 35).

NOTA: No se puede insertar un paso de curva de fusión dentro de un bucle Ir a.

NOTA: El paso de curva de fusión incluye una retención de 30 segundos al comienzo del paso que no se muestra en el protocolo.

La Figura 22 muestra un paso de curva de fusión después del paso 6.

Figura 22. Protocolo con un paso de curva de fusión introducido.

Opciones de pasoPara cambiar una opción de paso para el paso seleccionado:

1. Seleccione el paso haciendo clic en él en la vista de gráfico o de texto.

2. Haga clic en el botón Step Options (Opciones de paso) para abrir la ventana Step Options (Opciones de paso).

3. Añada o elimine opciones introduciendo o modificando un número o haga clic en una casilla de verificación.

CONSEJO: Para retener un paso para siempre (una retención infinita), introduzca cero (0.00) como valor temporal.

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La Figura 23 muestra el paso seleccionado con un gradiente de 10 °C. Observe que algunas opciones no están disponibles en un paso de gradiente. En un paso de gradiente no se puede modificar el incremento o la inclinación de la rampa.

Figura 23. Opción de paso para un gradiente.

La ventana Step Options (Opciones de paso) muestra las siguientes opciones que puede añadir o eliminar de los pasos:

• Plate Read (Lectura de placa). Marque la casilla para incluir una lectura de la placa.

• Temperature (Temperatura). Introduzca una temperatura objetivo para el paso seleccionado

• Gradient (Gradiente). Introduzca un rango de gradientes para el paso

• Increment (Incremento). Introduzca una temperatura para incrementar en el paso seleccionado; la cantidad del incremento se añade a la temperatura objetivo con cada ciclo

• Ramp Rate (Inclinación de la rampa). Introduzca una inclinación para el paso seleccionado; el rango depende del tamaño del bloque

• Time (Tiempo). Introduzca un tiempo de retención para el paso seleccionado

• Extend (Ampliar). Introduzca un valor temporal para ampliar el paso seleccionado. La cantidad ampliada se añade al tiempo de retención de cada ciclo

• Beep (Pitido). Marque la casilla de verificación para que suene un pitido al final del paso

CONSEJO: Cuando introduce un número que está fuera del rango de la opción, el software cambia el número a la entrada más próxima dentro del rango

Botón para la eliminación de pasosPara eliminar un paso en el protocolo, proceda según se indica a continuación:

1. Seleccione un paso en la vista de gráfico o de texto.

2. Haga clic en el botón Delete Step (Eliminar paso) para eliminar el paso seleccionado.

¡ADVERTENCIA! Esta acción no se puede deshacer.

Modo de control de temperaturaEl instrumento utiliza uno de los dos modos de control de temperatura para determinar el momento en el que la muestra alcanza la temperatura objetivo en un protocolo.

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Protocolos

Introduzca un volumen de muestra en el editor de protocolos para seleccionar un modo de control de temperatura:

• Modo Calculated (Calculado). Cuando introduce un volumen de muestra comprendido entre 1 y 50 μl, el termociclador calcula la temperatura de la muestra en función del volumen. Éste es el modo estándar

• Modo Block (Bloque). Cuando introduce un volumen de muestra de valor cero (0) μl, el termociclador registra la temperatura de la muestra como la misma que la temperatura medida en el bloque

Escritor automático de protocolosAbra la función Protocol AutoWriter (Escritor automático de protocolos) para escribir de forma rápida protocolos para PCR y experimentos de PCR en tiempo real. Para abrir el Escritor automático de protocolos, seleccione alguna de estas opciones:

• Haga clic en el botón Protocol AutoWriter (Escritor automático de protocolos) en la barra de herramientas de la ventana principal del software

• Seleccione Tools > Protocol AutoWriter (Herramientas > Escritor automático de protocolos) en la barra de menús de la ventana principal del software

La Figura 24 muestra un protocolo (parte inferior de la ventana) escrito por esta función.

Figura 24. Ventana del escritor automático de protocolos con un protocolo nuevo.

Creación de un protocolo con el escritor automático de protocolosLa ventana Protocol AutoWriter (Escritor automático de protocolos) utiliza información sobre su reacción a la generación automática de un archivo de protocolo. Siga estos pasos para usar el escritor automático de protocolos para crear un protocolo nuevo:

1. Haga clic en el botón Protocol AutoWriter (Escritor automático de protocolos) de la barra de herramientas para abrir la ventana Protocol AutoWriter (Escritor automático de protocolos).

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2. Introduzca la Annealing Temperature (Temperatura de hibridación) (Ta) y la Amplicon Length (Longitud del amplicón) en el panel Enter Target Values/Enzymes (Introducir valores/enzimas objetivo). Si no conoce la temperatura de hibridación de los iniciadores, haga clic en el botón Ta Calculator (Calculadora de Ta) para introducir las secuencias del iniciador y calcular la temperatura de hibridación. Si desea obtener información sobre los cálculos empleados en la Calculadora de Ta, consulte Breslauer et al. 1986.

3. Seleccione un tipo de enzima de la lista de opciones (iTaq, iProof u Other) (iTaq, iProof u Otro).

4. Añada los parámetros en el panel Additional Parameters (Optional) [Parámetros adicionales (Opcional)] si desea añadir un Gradient Range (Rango de gradientes), una temperatura para Hot Start Activation (Activación de inicio en caliente) o un tiempo para Final Extension (Extensión final) al protocolo.

5. Seleccione una velocidad del protocolo entre Standard, Fast o Ultrafast (Estándar, Rápida o Ultrarrápida) mediante la barra deslizante del panel Type (Tipo). Cuando mueve la barra deslizante, el software ajusta la duración total de la ejecución. Seleccione Real-time PCR (PCR en tiempo real) para indicar al software que recopile datos de fluorescencia.

6. Revise el protocolo en el panel Preview (Vista previa) y la duración total de la ejecución. Realice las modificaciones necesarias.

7. Haga clic en OK (Aceptar) para guardar un protocolo nuevo o haga clic en Cancel (Cancelar) para cerrar la ventana sin guardar el protocolo.

NOTA: Bio-Rad Laboratories no garantiza que la ejecución de un protocolo escrito en la ventana del escritor automático de protocolos siempre resulte en un producto de PCR.

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Protocolos

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5 PlacasLea el siguiente capítulo para obtener información sobre cómo crear y editar archivos de placas:

• Ventana del editor de placas (a continuación)

• Ventana de selección de fluoróforos (página 42)

• Controles para la carga de pocillos (página 43)

• Ventana del Administrador de grupos de pocillos (página 48)

Ventana del editor de placasLos archivos de placas contienen los parámetros de la ejecución, como el modo de exploración y los fluorórofos, así como el contenido de los pocillos e instrucciones para el instrumento sobre cómo analizar los datos. Abra la ventana Plate Editor (Editor de placas) para crear una placa nueva o editar la placa actualmente seleccionada en la pestaña Plate (Placa). Cuando haya creado o editado una placa en el editor de placas, haga clic en OK (Aceptar) para cargar el archivo de la placa en la ventana Experiment Setup (Configuración del experimento) y ejecutarlo.

Para ejecutar un experimento, debe cargar al menos un pocillo con un tipo de muestra y un flluoróforo.

CONSEJO: Haga clic en el botón Plate Loading Guide (Guía para la carga de placas) para abrir la ventana Plate Loading Guide (Guía para la carga de placas) desde la barra de herramientas y obtener así instrucciones sobre cómo cargar una placa.

Abrir el editor de placasPara abrir el editor de placas (Figura 25), elija una de estas opciones:

• Para crear una placa nueva, seleccione File > New > Plate (Archivo > Nuevo > Placa) o haga clic en el botón Create New (Crear nueva) de la pestaña Plate (Plate) (página 23)

• Para abrir una placa existente, seleccione File > Open > Plate (Archivo > Abrir > Placa) o haga clic en el botón Open Existing (Abrir existente) de la pestaña Plate (Placa) (página 23)

• Para editar la placa actual en la pestaña Plate (Placa), haga clic en el botón Edit Selected (Editar selección) de la pestaña Plate (Placa) (página 23)

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Placas

• Para abrir la placa asociada a un archivo de datos en la ventana de análisis de datos (página 61), haga clic en View/Edit Plate (Ver/Editar placa) en la barra de herramientas

Figura 25. Ventana Plate Editor (Editor de placas).

Tamaño y tipo de placaDurante el experimento, el software aplica la configuración de la placa que se detalla a continuación a todos los pocillos.

• Plate Size (Tamaño de placa). Seleccione una opción en Plate Size (Tamaño de placa) del menú Settings (Configuración) que represente el tamaño del bloque del módulo de reacción de su instrumento. Si elige el tipo de instrumento CFX96 en el menú desplegable del asistente de inicio, se cambiará el tamaño de placa predeterminado que se carga en la pestaña de placa de la ventana de configuración del experimento. En el editor de placas, seleccione el tamaño de la placa en el menú Settings (Configuración) (véase Tabla 13 en la página 41). El tamaño de la placa no se puede cambiar durante o después del experimento

• Plate Type (Tipo de placa). Seleccione Clear Wells (Pocillos transparentes) o White Wells (Pocillos blancos) en Plate Type (Tipo de placa) del menú Settings (Configuración). Asegúrese de que el fluoróforo que se utiliza en el experimento esté calibrado para el tipo de placa seleccionado

NOTA: Los instrumentos CFX96 vienen calibrados de fábrica para muchas combinaciones de tinturas fluoroescentes y placas. La calibración es específica del instrumento, la tintura y el tipo de placa. Para calibrar una combinación nueva de tintura y tipo de placa en un instrumento, seleccione Tools > Calibration Wizard (Herramientas > Asistente de calibración) (véase “Asistente de calibración" en la página 115).

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Modo de exploraciónEl sistema CFX96 excita y detecta fluoróforos en seis canales y utiliza diversos modos de exploración de adquisición de datos para recoger datos de fluorescencia durante la ejecución de un experimento.

Seleccione uno de estos modos de exploración en la barra de herramientas de la ventana Plate Editor (Editor de placas):

• All Channels (Todos los canales). Incluye los canales comprendidos entre el 1 y el 5 del sistema CFX96

• SYBR/FAM only (Sólo SYBR/FAM). Incluye solamente el canal 1 y proporciona una exploración rápida

• FRET. Incluye solamente el canal FRET y proporciona una exploración rápida

Barra de herramientas del editor de placasLa barra de herramientas del editor de placas proporciona acceso rápido a funciones importantes relacionadas con la carga de las placas:

La Tabla 13 muestra las funciones disponibles en la barra de herramientas del editor de placas.

Tabla 13. Elementos de la barra de herramientas del editor de placas.

Elemento de la barra de herramientas

Nombre Función

Save (Guardar)

Guardar el archivo de placa actual

Print (Imprimir)

Imprimir la ventana seleccionada

Zoom Aumentar o disminuir la amplificación de la vista de la placa

Scan Mode (Modo de explora-ción)

Seleccione un modo de exploración para indicar al instrumento de qué canales debe recopilar datos de fluorescencia durante una ejecución. Seleccione All Channels (Todos los canales) (predeterminado) SYBR/FAM only (Sólo SYBR/FAM) o FRET.

Well Groups (Grupos de pocillos)

Abra la ventana Well Groups Manager (Administrador de grupos de pocillos) y establezca los grupos de pocillos de la placa actual.

Help (Ayuda) Abrir la ayuda del software para obtener más información sobre las placas

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Placas

Ventana de selección de fluoróforosLa ventana de selección de fluoróforos muestra los fluoróforos que se pueden seleccionar para cargar en los controles de carga de pocillos del editor de placas. Para abrir la ventana Select Fluorophores (Seleccionar fluoróforos), haga clic en el botón Select Fluorophores (Seleccionar fluoróforos) en la parte derecha del editor de placas.

NOTA: Los fluoróforos que se muestren dependen del modo de exploración; cuando se elige el modo Sólo SYBR/FAM, en la ventana de selección de fluoróforos solamente se muestran los fluoróforos del canal 1.

NOTA: No es posible añadir o eliminar fluoróforos de esta lista; debe calibrar los nuevos fluoróforos para un instrumento con la función Calibration Wizard (Asistente de calibración) (página 115). El nuevo fluoróforo se añade a la ventana de selección de fluoróforos después de la calibración.

Haga clic en la casilla de verificación Selected (Seleccionado) junto al nombre del fluoróforo para añadir o eliminar los fluoróforos de la lista de la derecha de la ventana del editor de placas.

En este ejemplo, en la lista de fluoróforos disponibles, está seleccionada la opción SYBR (Figura 26).

Figura 26. Ventana de selección de fluoróforos.

Plate LoadingGuide (Guía para la carga de placas)

Mostrar una guía rápida sobre cómo configurar una placa y cargar los pocillos

Tabla 13. Elementos de la barra de herramientas del editor de placas. (cont.)

Elemento de la barra de herramientas

Nombre Función

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• Haga clic en el cuadro Color junto al nombre del fluoróforo y seleccione un color nuevo para representar a cada fluoróforo en la ventana del editor de placas y en los gráficos de análisis de datos

NOTA: Antes de comenzar la ejecución, el software comprueba que los fluoróforos que ha especificado en la placa estén calibrados en ese instrumento. No se puede ejecutar un experimento con una placa que contenga fluoróforos que no estén calibrados en ese instrumento.

Controles para la carga de pocillosLos archivos de placas contienen información sobre el contenido de cada pocillo cargado con una muestra para un experimento. Después de la ejecución, el software vincula el contenido con los datos de fluorescencia recopilados durante el protocolo y aplica los análisis adecuados en la ventana Data Analysis (Análisis de datos). Por ejemplo, los pocillos cargados con un tipo de muestra estándar se utilizan para generar una curva estándar.

Tenga en cuenta las siguientes pautas sobre el contenido de los pocillos:

• Target Name (Nombre del objetivo). Uno o varios objetivos objeto de interés (genes o secuencias) en cada pocillo cargado. Cada objetivo está asignado a un fluoróforo

• Sample Name (Nombre de muestra). Un identificador o condición que se corresponde con la muestra de cada pocillo cargado, como 0 h, 1 h o 2 h

Seleccione un pocillo para cargar el contenido haciendo clic con el puntero del ratón en la vista de la placa. Mantenga pulsado el botón del ratón y arrastre un cuadro para seleccionar varios pocillos. Los botones y las listas de la parte derecha de la vista de la placa incluyen todas las opciones necesarias para cargar los pocillos (Tabla 14).

Tabla 14. Opciones para cargar la placa y los pocillos en el editor de placas.

Opción Función

Tras seleccionar los pocillos, primero se debe cargar el tipo de muestra. Seleccione una opción en el menú desplegable Sample Type (Tipo de muestra) para cargar el tipo de muestra en los pocillos seleccionados: Unknown (Desconocida), Standard (Estándar), NTC (Sin control de plantilla), Positive Control (Control positivo), Negative Control (Control negativo) y NRT (Sin transcriptasa inversa).

Haga clic en un cuadro Load (Cargar) para añadir un fluoróforo a los pocillos seleccionados; cada fluoróforo se corresponde con un nombre de objetivo. Para añadir fluoróforos a la lista Load (Cargar), selecciónelos en la ventana Select Fluorophores (Seleccionar fluoróforos).

Para distinguir entre diferentes objetivos, seleccione un nombre en el menú desplegable Target Name (Nombre de objetivo) y pulse la tecla Intro para cargar el nombre del objetivo en el pocillo. Para añadir un nombre de objetivo nuevo al menú desplegable solamente de la placa actual, escríbalo en el cuadro desplegable y pulse la tecla Intro. Para eliminar un nombre de objetivo, selecciónelo, pulse la tecla Suprimir y, a continuación, la tecla Intro.

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Placas

Para el análisis de expresión genética o para distinguir entre diferentes muestras, elija un Sample Name (Nombre de muestra) en el menú desplegable para cargar el nombre de la muestra en los pocillos seleccionados. Para añadir un nombre de muestra nuevo al menú desplegable de la placa actual, escríbalo en el cuadro desplegable y pulse la tecla Intro. Para eliminar un nombre de muestra, selecciónelo en el menú, pulse la tecla Suprimir del teclado y, a continuación, la tecla Intro.

Para cargar números de replicados, los pocillos seleccionados deben incluir el mismo contenido. En caso contrario, el software desactiva este control de carga. Haga clic en el cuadro Load (Cargar) para añadir un Replicate # (N.º de replicado) a los pocillos seleccionados.

En el panel Replicate Series (Serie de replicados) puede aplicar una serie de replicados a un conjunto de pocillos seleccionados. Introduzca el Replicate Group Size (Tamaño del grupo de replicados) seleccionando un número que represente el número de muestras (pocillos) de caga grupo de replicados. Seleccione un Starting Replicate # (N.º de replicado inicial) para añadir replicados.

Puede cargar grupos de replicados con números de replicados de izquierda a derecha (Horizontal) o de arriba a abajo (Vertical).

Introduzca una concentración en los pocillos seleccionados con el tipo de muestra Standard (Estándar) editando o escribiendo un número en el cuadro Concentration (Concentración). Para aplicar la concentración a un fluoróforo del pocillo, seleccione un único fluoróforo en el menú desplegable (<All> [Todos]) en el cuadro Concentration (Concentración). Para eliminar una concentración, selecciónela, pulse la tecla Retroceso del teclado y, a continuación, la tecla Intro.

Seleccione varios pocillos con un tipo de muestra Standard (Estándar) para activar el botón Dilution Series (Serie de dilución).


Opción Función

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Haga clic en el botón Dilution Series (Serie de dilución) para introducir una serie de dilución para la concentración de muestras Standard (Estándar) y cargar una curva estándar.

Introduzca un valor de Starting Concentration (Concentración inicial) para la serie de dilución, el valor Replicates from (número de replicado inicial) y to (número de replicado final), así como Dilution Factor (Factor de dilución), es decir, la cantidad para cambiar la concentración con cada grupo de replicados). Seleccione Increasing (En aumento) para una serie de dilución que aumenta o Decreasing (En disminución) para una serie de dilución que disminuye. Por último, seleccione el fluoróforo empleado en la serie de dilución en el menú desplegable y haga clic en Apply (Aplicar).

Seleccione Tools > Show Well Notes (Herramientas > Mostrar > Notas sobre pocillos) para abrir este panel. Para introducir notas sobre uno o varios pocillos, seleccione los pocillos y escriba las notas en el menú desplegable. Todas las notas que añada aparecerán en la hoja de cálculo de la pestaña de cuantificación (página 76).

Seleccione Tools > Show Collection Name (Herramientas > Mostrar > Nombre de colección) para abrir este panel. Para introducir información sobre la colección de uno o varios pocillos, seleccione los pocillos y escriba un nombre de colección en el menú desplegable. Todos los nombres de colección que añada a los pocillos aparecerán en la ventana Gene Expression Analysis (Análisis de la expresión genética) para poder elegir entre diversas opciones de agrupamiento de muestras.

Haga clic en el botón Experiment Settings (Configuración del experimento) en la ventana Experiment Settings (Configuración del experimento) para administrar las listas de Targets (Objetivos) y Samples (Muestras) a fin de poder configurar un experimento de expresión genética.

Haga clic en el botón Clear Replicate # (Borrar n.º de replicado) para borrar los números de replicados de los pocillos seleccionados.

Haga clic en el botón Clear Wells (Borrar pocillos) para borrar permanentemente todo el contenido de los pocillos seleccionados.


Opción Función

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Placas

Ventana para la configuración del experimentoPara abrir la ventana Experiment Settings (Configuración del experimento), elija una de estas opciones:

• En el Plate Editor (Editor de placas), haga clic en el botón Experiment Settings (Configuración del experimento)

• Mientras analiza datos en la ventana Data Analysis (Análisis de datos), haga clic en el botón Experiment Settings (Configuración del experimento) en la pestaña Gene Expression (Expresión genética)

Abra la ventana Experiment Settings (Configuración del experimento) para ver o cambiar la lista de Targets (Objetivos) y Samples (Muestras) (Figura 27) o definir el grupo de muestras del análisis de expresión genética que se analizará si se han añadido Collection Names (nombres de colección) a los pocillos.

• Targets (Objetivos). Una lista de nombres de objetivos para cada reacción de PCR, como genes o secuencias de interés. Haga clic en la columna Reference (Referencia) para asignar genes de referencia en un experimento

• Samples (Muestras). Una lista de nombres de muestras que indican el origen del objetivo, como la muestra tomada a la hora (1 h) o la tomada de un sujeto específico (ratón 1). Haga clic en la columna Control para asignar la condición de control para un experimento

La Figura 27 muestra la pestaña de objetivos con la configuración del análisis visible.

Figura 27. La pestaña de objetivos en la ventana de configuración del experimento.

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La Figura 28 muestra la pestaña de muestras con la configuración del análisis visible.

Figura 28. La pestaña de muestras en la ventana de configuración del experimento.

Para ajustar las listas de estas pestañas, utilice las siguientes funciones:

• Añada un nombre de objetivo o muestra. Para ello, escríbalo en el cuadro New (Nuevo) y haga clic en Add (Añadir)

• Para eliminar un nombre de objetivo o muestra de la lista, haga clic en la casilla Select to Remove Name (Seleccionar nombre para eliminarlo) de esa fila y, a continuación, haga clic en el botón Remove checked item(s) (Eliminar elementos marcados)

• Seleccione un objetivo como referencia para el análisis de expresión genética haciendo clic en el recuadro de la columna Reference (Referencia) junto al nombre del objetivo

• Seleccione un objetivo como muestra de control del análisis de expresión genética haciendo clic en el recuadro de la columna Control junto al nombre de la muestra

Haga clic en la casilla Show Analysis Settings (Mostrar configuración del análisis) de la ventana Experiment Settings (Configuración del experimento) para ver o cambiar los parámetros de análisis que se aplican en la pestaña Gene Expression (Expresión genética).

Para ajustar los parámetros del objetivo:

• Haga clic en una celda de la columna Color para cambiar el color de los objetivos que se muestran en el gráfico de expresión genética

• Introduzca un número para la eficacia de un objetivo. El software calculará la eficacia relativa de un objetivo mediante la función Auto Efficiency (Eficacia automática) si los datos de un objetivo incluyen una curva estándar. De forma alternativa, puede escribir una eficacia determinada con anterioridad

Para configurar una muestra en la pestaña Samples (Muestras):

• Haga clic en un color de la columna Color para cambiar el color de las muestras que se muestran en el gráfico de expresión genética

• Haga clic en una casilla de la columna Show Graph (Mostrar gráfico) para que la muestra aparezca en el gráfico de expresión genética con el color seleccionado en la columna Color

47

Placas

Opción de agrupamiento de nombres de muestrasAl cargar Collection Names (Nombres de colección) en los pocillos, puede analizar las muestras en una de las cuatro configuraciones definidas por Sample Name Grouping Option (Opción de agrupamiento de nombres de muestras). Estas opciones están disponibles en el menú desplegable de la pestaña Experiment Settings (Configuración del experimento).

• Target vs. Sample (Objetivo frente a muestra)

• Target vs. Collection (Objetivo frente a colección)

• Target vs. Sample_Collection (Objetivo frente a muestra_colección)

• Target vs. Collection_Sample (Objetivo frente a colección_muestra)

Ventana del Administrador de grupos de pocillosLos grupos de pocillos dividen una sola placa en subconjuntos de pocillos que se pueden analizar de forma independiente en la ventana de análisis de datos. Una vez estén formados los grupos, seleccione uno en la ventana Data Analysis (Análisis de datos) para analizar los datos de un grupo independiente. Puede, por ejemplo, formar grupos de pocillos para analizar diferentes ejecuciones de un experimento en una placa o para analizar cada grupo de pocillos con una curva estándar diferente.

NOTA: La opción predeterminada de grupos de pocillos es All Wells (Todos los pocillos).

Crear grupos de pocillosPara crear grupos de pocillos en la ventana del administrador de grupos de pocillos, realice lo siguiente:

1. Haga clic en el botón Well Groups (Grupos de pocillos) de la barra de herramientas del editor de placas.

2. Haga clic en Add (Añadir) para crear un grupo nuevo. El menú desplegable muestra el nombre del primer grupo como Group 1 (Grupo 1).

3. Seleccione los pocillos que compondrán el grupo en la vista de la placa. Para ello, haga clic en los pocillos y arrástrelos al grupo. Los pocillos seleccionados se vuelven de color azul (Figura 29).

4. (Opcional) Cambie el nombre del grupo seleccionándolo en el menú desplegable y escribiendo un nombre nuevo.

5. (Opcional) Cree más grupos repitiendo los pasos 1 y 2.

6. (Opcional) Elimine grupos de pocillos seleccionando el nombre del grupo en la lista desplegable y haciendo clic en el botón Delete (Eliminar).

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7. Haga clic en OK (Aceptar) para terminar y cerrar la ventana, o bien haga clic en Cancelar para cerrar la ventana sin hacer cambios.

Figura 29. Color de los pocillos en la ventana del administrador de grupos de pocillos.

Ventana de la vista de la hoja de cálculo de la placaLa ventana Plate Spreadsheet View (Vista de la hoja de cálculo de la placa) muestra el contenido de una placa en el editor de placas. Para abrir la ventana Plate Spreadsheet View (Vista de la hoja de cálculo de la placa) (Figura 30), seleccione Tools > Show Spreadsheet View (Herramientas > Mostrar vista de la hola de cálculo) en la barra de menús del editor de placas.

Figura 30. Ventana de la vista de la hoja de cálculo de la placa.

Abra la vista de la hoja de cálculo para importar o exportar el contenido de los pocillos a Excel o a otro formato delimitado por tabulaciones:

49

Placas

• Haga clic en Import Template (Importar plantilla) para importar el contenido de los pocillos de un archivo delimitado por comas

• Haga clic en Export Template (Exportar plantilla) para exportar el contenido de los pocillos a un archivo Excel (formato .csv)

Ordene o edite una columna seleccionándola y realizando unas de estas acciones:

• Ordene la hoja de cálculo según los datos de una columna determinada. Para ello, haga clic en el rombo que se encuentra junto al nombre de la columna

• Edite el contenido de una columna que tenga un asterisco (*) en la parte superior haciendo clic y escribiendo en cada pocillo

NOTA: Seleccione las unidades de la curva estándar en la columna Quantity (Cantidad) abriendo el editor de placas y seleccionando Settings > Units (Configuración > Unidades) en la barra de menús. Una vez se ha ejecutado el experimento con la placa, los datos de estos estándares aparecen en el gráfico de curva estándar de la pestaña de cuantificación (ventana de análisis de datos) con las unidades que haya seleccionado. Abra la vista de hoja de cálculo para importar o exportar el contenido de la placa a Excel o a otro formato delimitado por tabulaciones.

Haga clic con el botón derecho en la hoja de cálculo para seleccionar alguna de estas opciones del menú contextual:

• Copy (Copiar). Copiar la hoja de cálculo entera

• Copy as Image (Copiar como imagen). Copiar la hoja de cálculo como un archivo de imagen

• Print (Imprimir). Imprimir la hoja de cálculo

• Print Selection (Imprimir selección). Imprimir solamente las celdas seleccionadas

• Export to Excel (Exportar a Excel). Exportar el archivo como un archivo con formato Excel

• Export to Text (Exportar a texto). Exportar el archivo como un archivo de texto

• Find (Buscar). Buscar texto en la hoja de cálculo

• Sort (Ordenar). Ordenar la hoja de cálculo seleccionando un máximo de tres columnas de datos en la ventana Sort (Ordenar)

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6 Funcionamiento independienteLea este capítulo para obtener información sobre la ejecución del sistema de detección CFX96™ mediante PCR en tiempo real en modo independiente:

• termociclador C1000™ (a continuación)

• Creación de un experimento nuevo (página 53)

• Exportación de datos para análisis (página 58)

• Creación de un archivo de datos (página 60)

Termociclador C1000El sistema CFX96 puede ejecutar experimentos de PCR en tiempo real sin un ordenador. Es posible exportar los datos de fluorescencia adquiridos durante una ejecución con una memoria USB. También puede elegir que se le envíen los datos directamente por correo electrónico si la base C1000 está conectada a Internet y se ha configurado la función de correo electrónico (consulte el manual de instrucciones del termociclador C1000 si desea obtener información sobre cómo configurar las opciones de correo electrónico). Para analizar los datos, se necesita el software CFX™ Manager.

El panel de control del termociclador C1000™ proporciona acceso a todas las funciones necesarias para ejecutar el instrumento. La Figura 31 muestra los componentes del panel de control.

Figura 31. El panel de control del termociclador C1000.

Teclas de comando

LCDTeclas alfanuméricas

Teclas de nave-gación

Tecla del escritor automático de protocolos

Puerto USB (más abajo)

Teclas de función

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Funcionamiento independiente

El panel de control contiene cinco grupos de teclas cuyas funciones se describen en la tabla Tabla 15.

Menú principalCuando se inicia el sistema CFX96, éste ejecuta un autodiagnóstico para comprobar que funciona correctamente y, a continuación, muestra el menú principal. El menú principal proporciona acceso a todas las funciones del sistema, muestra la fecha y la hora, el nombre del usuario que ha iniciado sesión, el estado del sistema, el tipo de módulo de reacción, el nombre del termociclador y cualquier termociclador conectado S1000™.

NOTA: El termociclador C1000 guarda un máximo de 20 ejecuciones de experimentos de PCR en tiempo real y marca la fecha/hora de las ejecuciones. Cuando se han almacenado 20 ejecuciones en el C1000, los datos más antiguos se eliminan al almacenar una ejecución nueva.

Tabla 15. Funciones de las teclas del panel de control

Tecla Función

TECLAS DE COMANDO

RUN (EJECUTAR) Seleccionar y ejecutar un protocolo

EDIT (EDITAR) Seleccionar y cambiar el protocolo

STATUS (ESTADO) Mostrar el estado de uno o varios protocolos en ejecución

VIEW (VER) Cambiar entre la vista de gráfico y de texto de un protocolo

TECLAS DE FUNCIÓN

F1, F2, F3 o F4 Los nombres y las funciones de los botones de las teclas de función son diferentes en cada pantalla

TECLAS ALFANUMÉRICAS

Del 1 al 9 Le permiten introducir números o letras del alfabeto. Pulse una tecla varias veces para cambiar a la letras asociadas

0, INCUBATE (INCUBAR) Introducir un cero (infinito) o iniciar una incubación instantánea

coma decimal (,) Introducir una coma decimal

signo menos (-) Introducir un signo menos

Escritor automático de protocolos

Tecla del escritor automático de protocolos

Iniciar el escritor automático de protocolos

TECLAS DE NAVEGACIÓN

Flecha hacia la DERECHA Mover el cursor hacia la derecha

Flecha hacia la IZQUIERDA Mover el cursor hacia la izquierda

Flecha hacia ARRIBA Mover el cursor hacia arriba

Flecha hacia ABAJO Mover el cursor hacia abajo

ENTER (INTRO) Confirmar una opción

BACK (VOLVER) Cancelar una función o borrar una letra, un número o una palabra

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Figura 32. Pantalla de inicio del panel frontal.

Para iniciar las funciones del menú principal, pulse las teclas de función asociadas (de F1 a F4):

• Log In (Iniciar sesión) (F1). Le permite iniciar sesión en el termociclador C1000. Cuando ha iniciado sesión, el nombre del botón cambia a Log Off (Cerrar sesión)

• Files (Archivos) (F2). Permite visualizar los archivos y las carpetas de la biblioteca de archivos

• Utilities (Utilidades) (F3). Abre el menú Utilities (Utilidades)

• New Protocol (Protocolo nuevo) (F4). Crea un protocolo nuevo

Creación de un experimento nuevo1. Seleccione New Protocol (Protocolo nuevo) (F4) en la pantalla de inicio para comenzar

(Figura 33).

Figura 33. Protocolo de PCR en tiempo real predeterminado.

2. Para cambiar la temperatura objetivo y el tiempo de retención de un paso de temperatura, pulse las teclas de flecha para navegar entre los pasos y seleccionar un parámetro (temperatura o tiempo). Pulse las teclas alfanuméricas para introducir un número nuevo para cada parámetro que resalte.

CONSEJO: Conecte un ratón de ordenador por medio del puerto USB del chasis C1000 para navegar.

53


3. (Opcional) Para introducir un paso nuevo, pulse el botón Insert (Introducir) (F1). Para eliminar un paso, pulse el botón Delete (Eliminar) (F3) (Figura 33).

4. (Opcional) Para cambiar las opciones de un paso, pulse el botón Options (Opciones) (F4) (Figura 33). En la ventana Step Options (Opciones de paso), seleccione un parámetro que desee cambiar, incluida la temperatura y el tiempo del paso o añada/elimine una lectura de placa al paso (Figura 34)

Figura 34. Ventana de opciones de paso.

NOTA: Pulse las teclas alfanuméricas para introducir un Gradient Range (Rango de gradientes) comprendido entre 1 y 24 °C.

5. El paso GOTO (Ir a) ordena al termociclador que repita una serie de pasos de forma continuada para crear los ciclos del experimento de PCR. Seleccione un paso GOTO (Ir a), pulse las teclas de flecha para seleccionarlo y, a continuación, edite el número pasos de un paso GOTO o cambie el número de repeticiones.

6. (Opcional) Para cambiar el volumen de muestra predeterminado, seleccione el cuadro de volumen de muestra (Vol) (Figura 33 en la página 53). Utilice las teclas alfanuméricas para introducir un volumen de muestra nuevo en microlitros. El volumen de muestra que introduce determina el modo de control de temperatura que se utiliza durante una ejecución.

7. (Opcional) Para cambiar la temperatura predeterminada de la tapa, seleccione el cuadro de temperatura de la tapa (Lid) y pulse las teclas de flecha (Figura 33 en la página 53). Utilice las teclas alfanuméricas para introducir una temperatura nueva. Para el sistema CFX96, utilice una temperatura de tapa de 105 °C.

NOTA: Al calentar la tapa, se evita la condensación en los recipientes de reacción sellados.

8. Cuando crea un protocolo nuevo, tiene la opción de guardarlo con un nombre. Utilice las teclas de flecha para llegar al cuadro Protocol Name (Nombre del protocolo) y pulse las teclas alfanuméricas varias veces para introducir una letra o un número y escribir un nombre nuevo de protocolo.

9. Pulse INTRO para aceptar el nombre.

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Ejecución del protocolo1. Para comenzar la ejecución, haga clic en Done (Fin) (F2) en la ventana Protocolo

(Protocolo) (Figura 33 en la página 53).

CONSEJO: De forma alternativa, pulse la tecla de comando RUN (EJECUTAR) para iniciar la ejecución sin guardar o editar el nombre del protocolo.

2. Introduzca un nombre de protocolo si todavía no lo ha hecho; o edite el nombre creado anteriormente en la ventana Protocol (Protocolo). Utilice las teclas de flecha para seleccionar una carpeta de destino (Figura 35).

Figura 35. Cómo guardar un protocolo.

3. Haga clic en Edit Filename (Editar nombre de archivo) (F1). Escriba un nombre nuevo en el cuadro y haga clic en Save (Guardar) (F2) (Figura 36).

Figura 36. Cómo escribir un nombre de protocolo nuevo.

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4. Haga clic en Run (Ejecutar) (F2) para continuar y ejecutar el protocolo (Figura 37).

Figura 37. Protocolo guardado correctamente.

5. Edite los valores de Sample Volume (Volumen de muestra) y Lid Temperature (Temperatura de la tapa). En la ejecución también se puede registrar una Sample ID (Identificación de la muestra) o un User (Usuario) (Figura 38). Haga clic en OK (Aceptar) (F1) para continuar.

Figura 38. Cómo editar el volumen de la muestra y la temperatura de la tapa.

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6. Seleccione la opción Scan Mode (Modo de exploración) para recopilar datos de fluorescencia durante una ejecución (Figura 39).

Figura 39. Modo de exploración y nombre del archivo de datos.

Los modos de exploración detectan fluoróforos en estos canales:

• All Channels (Todos los canales). Recopila datos de los canales comprendidos entre el 1 y el 5 del sistema CFX96

• SYBR/FAM only (Sólo SYBR/FAM). Recopila datos solamente del canal 1 y proporciona una exploración rápida

• FRET. Recopila datos solamente del canal FRET y proporciona una exploración rápida

7. Antes de la ejecución, se crea un nombre de archivo de datos independiente predeterminado. Si desea cambiar el nombre, utilice las teclas de flecha para llegar al cuadro Data File Name (Nombre del archivo de datos) y pulse las teclas alfanuméricas para introducir una letra o un número y escribir el nombre de un archivo de datos nuevo (.zpcr).

8. Haga clic en OK (Aceptar) (F1) para iniciar la ejecución.

Ejecución de un protocolo anteriormente guardado• Para cambiar un protocolo existente, pulse la tecla EDIT (EDITAR) para abrir la

biblioteca de archivos y seleccionar un protocolo para editarlo

• Para ejecutar un protocolo existente, pulse la tecla de comando RUN (EJECUTAR) y seleccione un protocolo anteriormente guardado de la biblioteca de archivos

Supervisión de una ejecuciónCuando comienza una ejecución, aparece la ventana de estado de la ejecución. Revise la información de esta ventana para supervisar el progreso de una ejecución.

• Estado. Pulse la tecla de comando STATUS (ESTADO) para comprobar el estado actual del protocolo, detener una ejecución en curso, cancelar una ejecución, omitir un paso o abrir el menú principal (Figura 40)

• Estado de tiempo. Pulse la tecla de comando VIEW (VER) para ver una cuenta atrás del protocolo en pantalla completa. Vuelva a pulsar la tecla VIEW (VER) para volver a la pantalla de estado.

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Figura 40. Supervisión del estado de una ejecución.

Exportación de datos para análisisCuando se termina una ejecución, es necesario transferir los datos de fluorescencia a un ordenador que esté ejecutando el software CFX Manager para analizarlos. El archivo de datos independiente se guarda automáticamente en la carpeta RT_DATA que se encuentra en la carpeta SYSTEM (sistema) (Figura 41).

Figura 41. La carpeta RT_DATA guarda ejecuciones de PCR en tiempo real.

Si se ha introducido una memoria USB en el puerto USB del termociclador C1000, los datos (.zpcr) se guardarán automáticamente en el directorio raíz de la memoria USB.

Si al final de una ejecución, no hay ninguna memoria USB en el termociclador, siga estas instrucciones:

1. Pulse el botón Files (Archivos) (F2) de la pantalla principal para acceder a las carpetas de archivos.

2. Vaya a la carpeta RT_DATA y pulse la tecla de flecha hacia la derecha para abrir la carpeta.

3. Seleccione el archivo con las teclas de flecha hacia arriba y abajo.

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4. Pulse el botón Export File (Exportar archivo) (F1) para exportar los datos de la ejecución (.zpcr) a la memoria USB (Figura 42).

Figura 42. Exportación de datos de una ejecución independiente a una memoria USB.

5. Haga clic en Yes (Sí) (F1) para confirmar la exportación.

Si lo prefiere, puede enviarse por correo electrónico los datos directamente desde el termociclador C1000 una vez se ha realizado la ejecución si configura las opciones de correo electrónico (consulte el manual de instrucciones del termociclador C1000 si desea obtener información sobre cómo configurar estas opciones).

Para enviar un correo con un archivo de datos adjuntos (.zpcr) al final de una ejecución, siga estas instrucciones:

1. Seleccione Options (Opciones) (F4) en la la pantalla Run information (Información de la ejecución) (Figura 38 en la página 56).

2. Seleccione la opción Send email notification (Enviar notificaciones por correo electrónico) con las teclas de flecha.

3. Haga clic en OK (Aceptar) (F1) para volver a la pantalla de información de la ejecución.

4. Vaya hasta el cuadro Email Address (Dirección de correo) con las teclas de flecha e introduzca la dirección de correo electrónico mediante las teclas alfanuméricas.

5. Haga clic en OK (Aceptar) (F1) para continuar ejecutando el ensayo.

Figura 43. Confirmación de la exportación a la memoria USB.

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Creación de un archivo de datosPara poder analizar los datos de ejecuciones independientes (.zpcr), el software CFX Manager los debe convertir en un archivo de datos (.pcrd). Para crear un archivo de datos a partir de una ejecución independiente:

1. Haga clic en el archivo .zpcr y arrástrelo desde el directorio de la memoria USB a la ventana principal del software; o bien seleccione File > Open > Stand-alone Run (Archivo > Abrir > Ejecución independiente) en las opciones de menú de la ventana principal del software para seleccionar el nombre del archivo.

2. En le ventana Run File Processor (Procesador de archivos de ejecución), haga clic en el botón Select Plate (Seleccionar placa) para importar el archivo de placa que el software utilizará para crear el archivo de datos (Figura 44).

Figura 44. Asignación de un archivo de placa.

NOTA: El software CFX Manager comprueba que el modo de exploración y el tamaño de la placa del archivo de placa actual coinciden con la configuración de la ejecución del experimento. Cargue un archivo Quick Plate (Placa rápida) para acceder de forma rápida a los datos de todos los pocillos.

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7 Descripción general del análisis de datosLea este capítulo para obtener información sobre el análisis de datos:

• Ventana de análisis de datos (a continuación)

• Pestaña de cuantificación (página 65)

• Configuración del análisis de datos (página 67)

• Selectores de pocillos (página 68)

• Gráficos (página 71)

• Hojas de cálculo (página 71)

Ventana de análisis de datosDurante el análisis de datos, si se cambia la forma en la que se muestran los datos al modificar el contenido de los pocillos en la ventana Plate Editor (Editor de placas), nunca cambian los datos de fluorescencia obtenidos de cada pocillo durante la ejecución. No se pueden eliminar los datos de fluorescencia después de que el módulo los haya recopilado, pero sí tiene la opción de eliminar datos de las vistas y los análisis.

Para cambiar el contenido de los pocillos después de una ejecución, abra la ventana Plate Editor (Editor de placas). Para ello, haga clic en el botón Edit/View Plate (Editar/Ver placa) que se encuentra en la parte superior de la ventana Data Analysis (Análisis de datos).

CONSEJO: Es posible añadir o editar información sobre el contenido del pocillo antes, durante y después de realizar el experimento de PCR en tiempo real. Debe asignar el modo de exploración y el tamaño de la placa antes de la ejecución, pues estos parámetros no se podrán modificar después de la misma.

El software CFX Manager™ procesa datos de PCR en tiempo real de forma automática al final de cada ejecución y, además, abre la ventana Data Analysis (Análisis de datos) para mostrar dichos datos. Elija uno de estos métodos para abrir archivos de datos existentes en la ventana de análisis de datos:

• Arrastre un archivo de datos (con extensión .pcrd) a la ventana principal del software y suéltelo

• Seleccione File > Open > Data File (Archivo > Abrir > Archivo de datos) en la ventana principal del software para seleccionar un archivo en el explorador de Windows

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Descripción general del análisis de datos

• Haga clic en el botón Data Analysis (Análisis de datos) en la barra de herramientas de la ventana principal del software para seleccionar un archivo en el explorador de Windows

• Seleccione File > Recent Data Files (Archivo > Archivos de datos recientes) para ver una lista de los diez últimos archivos de datos abiertos

En la ventana Data Analysis (Análisis de datos), aparecen nueve pestañas como máximo (Figura 45). En cada una de estas pestañas se muestran los datos analizados para un método de análisis específico:

Figura 45. Todas las pestañas que se pueden mostrar en la ventana Data Analysis (Análisis de datos).

El software sólo muestra una pestaña en la ventana Data Analysis (Análisis de datos) si se han recopilado datos en la ejecución y en caso de que estos se encuentren disponibles para este tipo de análisis.

Barra de herramientas de la ventana del análisis de datosLa barra de herramientas de la ventana Data Analysis (Análisis de datos) proporciona un acceso rápido a funciones importantes del análisis de datos. En la Tabla 16 se enumeran las funciones de los botones de la barra de herramientas.

Tabla 16. Barra de herramientas de la ventana Data Analysis (Análisis de datos)

Botón de la barra de herramientas

Nombre Función

Save (Guardar) Guardar el archivo de datos actual

Print (Imprimir) Imprimir la ventana seleccionada

Trace Style (Estilo de trazo)

Abrir la ventana del estilo de trazo

Report (Informe) Abrir un informe del archivo de datos actual

View/Edit Plate (Ver/Editar placa)

Abrir el editor de placas para ver y editar el contenido de los pocillos

Well Groups... (Grupos de pocillos...)

Seleccionar un nombre de grupo de pocillos en el menú desplegable. La opción predeterminada es All Wells (Todos los pocillos)

Help (Ayuda) Abrir el sitio de la ayuda del software para obtener información adicional sobre el análisis de datos

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Barra de menús del análisis de datosEn la Tabla 17 se enumeran las funciones de los elementos de la barra de menús.

Tabla 17. Elementos de la barra de menús en la ventana Data Analysis (Análisis de datos).

Elemento de menú

Comando Función

File (Archivo) Save (Guardar) Guardar el archivo

Save As (Guardar como) Guardar el archivo con un nombre nuevo

Repeat Experiment (Repetir experimento)

Extraer el archivo del protocolo y de la placa del experimento actual para volver a ejecutarlo

Exit (Salir) Salir de la ventana Data Analysis (Análisis de datos)

View (Ver) Run Log (Registro de ejecución) Abrir una ventana de registro de ejecución para ver el registro de ejecución de un archivo de datos

Settings (Configuración)

Analysis Mode (Modo de análisis)

Seleccionar el método Baseline Subtraction (Sustracción de valores basales) para los grupos de pocillos seleccionados en los datos

C(t) Determination Mode (Modo de determinación de C(t))

Seleccionar el modo Regression (Regresión) o Single-Threshold (Umbral sencillo) para determinar cómo se calculan los valores de C(t) para cada trazo

Baseline Thresholds (Umbrales basales)

Abrir la ventana de umbrales basales para ajustar los valores basales o el umbral

Trace Styles (Estilos de trazo) Abrir la ventana Trace Styles (Estilos de trazo)

View/Edit Plate (Ver/Editar placa)

Abrir el editor de placas para ver y editar la placa

Mouse Highlighting (Resaltado con ratón)

Activar o desactivar el resaltado simultáneo de datos con el puntero del ratón

CONSEJO: si esta función está desactivada, mantenga pulsada la tecla Control para activar el resaltado temporalmente.

Display Threshold Values (Mostrar valores de umbral)

Mostrar el valor de la línea del umbral en el gráfico

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Reports (Informes) Abrir el informe de este archivo de datos

Import Fluorophore Calibration (Importar calibración de fluoróforo)

Seleccionar un archivo de calibración para aplicarlo al archivo de datos actual

Replace Plate (Reemplazar placa)

Reemplazar el archivo de datos actual en el análisis de datos

Export All Data Sheets to Excel (Exportar todas las hojas de datos a Excel)

Exportar todas las vistas de la hoja de cálculo de cada pestaña a un archivo independiente de formato Excel

Help (Ayuda) Abrir la ayuda del software para obtener información adicional sobre el análisis de datos

Tabla 17. Elementos de la barra de menús en la ventana Data Analysis (Análisis de datos). (cont.)

Elemento de menú

Comando Función

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Pestaña cuantificaciónCada pestaña de la ventana Data Analysis (Análisis de datos) muestra los datos en gráficos y hojas de cálculo para un método de análisis específico, con un selector de pocillos en el que seleccionar los datos que desea ver. La ventana Data Analysis (Análisis de datos) se abre con la pestaña Quantitation (Cuantificación) (Figura 46) en un primer plano. Los datos del gráfico Amplification (Amplificación) de esta pestaña se deben emplear para determinar la configuración correcta de análisis para el experimento.

NOTA: El gráfico Amplification (Amplificación) muestra la fluorescencia relativa (RFU) de cada pocillo en cada ciclo. Cada trazo del gráfico representa datos de un solo fluoróforo en un pocillo.

Figura 46. Disposición de la pestaña Quantitation (Cuantificación) en la ventana Data Analysis (Análisis de datos).

NOTA: El software vincula los datos de los paneles de cada pestaña del análisis de datos. Por ejemplo, si resalta un pocillo colocando el puntero del ratón sobre el pocillo en la vista del selector, también se resaltan los datos en todos los demás paneles.

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Selector del número de pasosEl sistema CFX96™ puede obtener datos de fluorescencia en varios pasos del protocolo; el software conserva los datos obtenidos en cada paso de forma independiente. El software muestra el selector Step Number (Número de pasos) debajo del cuadro Standard Curve (Curva estándar) de la pestaña Quantitation (Cuantificación) siempre que el protocolo se componga de más de un paso para la recopilación de datos. Cuando selecciona un paso, el software aplica dicha selección a todos los datos que se muestran en la ventana Data Analysis (Análisis de datos). En la Figura 47 se indica que el número del paso para la recopilación de datos es el 3 para todos los datos.

Figura 47. Selección del número de paso en la ventana Data Analysis (Análisis de datos).

Ver grupos de pocillos en el análisis de datos

Los pocillos de una placa se pueden agrupar en subconjuntos para realizar un análisis independiente con grupos de pocillos. Al crear grupos de pocillos en la ventana Well Groups Manager (Administrador de grupos de pocillos) del editor de placas (página 48), los nombres de los grupos aparecen en la ventana Data Analysis (Análisis de datos) dentro de la lista Well Groups (Grupos de pocillos) de la barra de herramientas.

De forma predeterminada, se encuentra seleccionado el grupo de pocillos All Wells (Todos los pocillos) cuando se abre la ventana Data Analysis (Análisis de datos) por primera vez, de forma que los datos de todos los pocillos con contenido aparecen en los gráficos y en las hojas de cálculo.

En la Figura 48 aparece seleccionada la opción Group 2 (Grupo 2) en el menú Well Groups (Grupos de pocillos). En el selector de pocillos sólo aparecen cargados los pocillos contenidos en dicho grupo y los datos de estos sólo se incluyen en los cálculos del análisis de datos.

Figura 48. Ventana Data Analysis (Análisis de datos) con la opción Group 2 (Grupo 2) seleccionada.

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Configuración del análisis de datosLos datos del gráfico Amplification (Amplificación) de la pestaña Quantitation (Cuantificación) muestran la fluorescencia relativa (RFU) de cada pocillo en cada ciclo. Cada trazo del gráfico representa datos de un solo fluoróforo en un pocillo. Estos datos se utilizan para determinar los valores de C(t) de cada pocillo por cada fluoróforo. El software utiliza uno de estos dos modos para determinar los valores de C(t):

• Regression (Regresión). Este modo aplica un modelo de regresión no lineal multivariable a trazos de pocillos individuales y posteriormente utiliza este modelo para computar un valor de C(t) óptimo

• Single Threshold (Umbral sencillo). Este modo utiliza un valor de umbral sencillo para calcular el valor de C(t) basándose en el punto en el que los trazos de fluorescencia individuales cruzan el umbral

Ajuste del umbralEn el modo Single Threshold (Umbral sencillo), ajuste el umbral para un fluoróforo; para ello, haga clic en la línea de umbral del gráfico Amplification (Amplificación) y mueva el puntero del ratón en vertical. De forma alternativa, puede especificar un umbral de cruce exacto para el fluoróforo seleccionado mediante el siguiente procedimiento:

1. Seleccione Settings > Baseline Thresholds (Configuración > Umbrales basales) en la barra de menús para abrir la ventana Baseline Thresholds (Umbrales basales).

2. Ajuste el umbral de cruce (Figura 49) para el fluoróforo; para ello, haga clic en User Defined (Definido por el usuario) e introduzca un número de umbral.

Figura 49. Ventana Baseline Thresholds (Umbrales basales).

3. Haga clic en OK (Aceptar) para confirmar el cambio y cerrar la ventana.

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Configuración de los valores basalesEl software establece automáticamente los valores basales de forma individual para cada pocillo. Cuando haya seleccionado los pocillos para analizarlos, compruebe la configuración de los valores basales de los mismos. Abra la ventana Baseline Thresholds (Umbrales basales) (Figura 49) para cambiar los valores basales predeterminados de los pocillos seleccionados. Para abrir esta ventana:

1. Seleccione Settings > Baseline Thresholds (Configuración > Umbrales basales) en la ventana Baseline Thresholds (Umbrales basales).

Para ajustar el ciclo inicial y final de los valores basales de cada pocillo:

1. En el panel Baseline Cycles (Ciclos basales), seleccione uno o varios pocillos. Para ello, haga clic en el número de la fila y, a continuación, haga clic en la esquina superior izquierda para seleccionar todos los pocillos, mantenga pulsada la tecla Control para seleccionar varios pocillos de forma individual o mantenga pulsada la tecla Mayúsculas para seleccionar varios pocillos de una sola vez.

2. Ajuste el ciclo Baseline Begin (Basal inicial) y el ciclo Baseline End (Basal final) de todos los pocillos seleccionados o cambie el número de ciclo Begin (Inicial) y End (Final) en la parte inferior de la hoja de cálculo (Figura 49).

3. Haga clic en OK (Aceptar) para confirmar el cambio y cerrar la ventana.

Seleccionar el modo de análisisSeleccione el modo de análisis para determinar el método de sustracción basal para todos los trazos de fluorescencia. Seleccione Settings > Analysis Mode (Configuración > Modo de análisis) para elegir una de estas tres opciones:

• No Baseline Subtraction (Sin sustracción basal). El software muestra los datos como trazos de fluorescencia relativa. En este modo hay algunos análisis que no se pueden realizar

• Baseline Subtracted (Sustracción basal). El software muestra los datos como trazos con sustracción de los valores basales para cada fluoróforo de un pocillo. El software debe sustraer los valores basales para determinar los ciclos de umbral, crear curvas estándar y determinar la concentración de muestras desconocidas. Para generar un trazo con los valores basales sustraídos, el software ajusta la mejor línea recta a través de la fluorescencia registrada de cada pocillo durante los ciclos basales y, a continuación, sustrae los datos que mejor se ajusten de los datos de fondo sustraídos en cada ciclo

• Baseline Subtracted Curve Fit (Ajuste de curva con valores basales sustraídos). El software muestra los datos como trazos con los valores basales sustraídos y, además, suaviza la curva resultante mediante un filtro de media centrada. Este proceso se realiza de forma que cada C(t) permanezca invariable

Selectores de pocillosHaga clic en los pocillos del selector de pocillos para mostrar u ocultar datos en los gráficos o en las hojas de cálculo en toda la ventana Data Analysis (Análisis de datos):

• Para ocultar un pocillo, resáltelo y haga clic en el pocillo en cuestión. Para mostrar el pocillo, resáltelo y vuelva a hacer clic en él

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• Para ocultar varios pocillos, haga clic y arrastre un cuadro hasta que abarque los pocillos que desee seleccionar. Para mostrar esos pocillos, haga clic y vuelva a arrastrar un cuadro hasta que abarque los pocillos

• Haga clic en la esquina superior izquierda de la placa para ocultar todos los pocillos. Vuelva a hacer clic en la esquina superior izquierda para mostrar todos los pocillos.

• Haga clic al inicio de alguna columna o alguna fila para ocultar dichos pocillos. Vuelva a hacer clic en la columna o la fila para mostrar los pocillos

En el selector de pocillos solamente se pueden seleccionar los pocillos cargados con contenido (introducidos en el Plate Editor (editor de placas)). El color de estos indica si están seleccionados. Como se muestra en la Figura 50, en el selector aparecen estos tres tipos de pocillos:

• Pocillos seleccionados y cargados (azul). Estos pocillos contienen un tipo de muestra cargada Unk (desconocida). Los datos de estos pocillos aparecen en la ventana Data Analysis (Análisis de datos)

• Pocillos no seleccionados y cargados (gris claro). Estos pocillos contienen tipos de muestras cargadas Std (estándar) y Pos (positivo). Los datos de estos pocillos no aparecen en la ventana Data Analysis (Análisis de datos)

• Pocillos vacíos (gris oscuro). Estos pocillos no están cargados en la ventana Plate Editor (Editor de placas)

Figura 50. En el selector de pocillos aparecen tres colores.

Excluir los pocillos del análisis temporalmente

OPCIÓN DE CLIC DERECHO

1. Haga clic con el botón derecho del ratón en el selector de pocillos, en un trazo de fluorescencia o en un punto trazado en la curva estándar.

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2. Seleccione Exclude Well XX from Analysis (Excluir pocillo XX del análisis) en las opciones del menú.

Figura 51. Clic derecho para excluir un pocillo del análisis.

OPCIONES DEL EDITOR DE PLACAS

1. Haga clic en el botón View/Edit Plate (Ver/Editar placa) en la barra de herramientas de la ventana Data Analysis (Análisis de datos).

2. Seleccione uno o varios pocillos en la vista del selector de pocillos.

3. Haga clic en Exclude Wells in Analysis (Excluir pocillos del análisis), tal como se ilustra en la Figura 52, para excluir los pocillos seleccionados. Esta casilla de verificación se encuentra en la parte inferior de los controles del editor de placas, en el lateral derecho de la ventana.

Figura 52. Casilla de verificación Exclude Wells in Analysis (Excluir pocillos del análisis) en la parte inferior del panel.

4. Los pocillos excluidos están marcados con un asterisco (*) en la ventana Plate Editor (Editor de placas).

De forma alternativa, puede eliminar pocillos del análisis de forma permanente; para ello, borre el contenido de los pocillos en el editor de placas haciendo clic en el botón Clear Wells (Borrar pocillos).

¡ADVERTENCIA! Tendrá que volver a introducir el contenido de los pocillos que se haya borrado.

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GráficosEn cada uno de los gráficos de la ventana Data Analysis (Análisis de datos), se muestran los datos en un gráfico diferente y, además, se incluyen opciones para ajustar los datos. Si desea ampliar alguna parte del gráfico, haga clic con el ratón y arrástrelo para seleccionar la parte en cuestión. El software cambia el tamaño del gráfico y lo centra en el área seleccionada.

Elementos habituales del menú contextual para gráficosLos elementos del menú que aparecen al hacer clic con el botón derecho del ratón están disponibles para todos los gráficos. Algunos de los elementos disponibles están presentes para todos los gráficos y se pueden utilizar para cambiar la forma en la que los datos se muestran o también para exportar los datos de un gráfico con facilidad (Tabla 18).

NOTA: Los elementos de menú que hacen referencia a gráficos específicos se describen en el siguiente capítulo “Ventanas de análisis de datos" (página 73).

Hojas de cálculoLas hojas de cálculo que se muestran en el análisis de datos incluyen opciones para ordenar y transferir los datos. Ordene las columnas mediante alguno de estos métodos:

• Haga clic en alguna columna y arrástrela a una nueva ubicación de la tabla seleccionada

• Haga clic en el encabezado de la columna para ordenar los datos de forma ascendente o descendente

Para ordenar un máximo de tres columnas de datos en la ventana Sort (Ordenar), siga estos pasos:

1. Haga clic con el botón derecho en la hoja de cálculo para abrir el menú y seleccione Sort (Ordenar).

Tabla 18. Elementos del menú contextual para gráficos.

Elemento Función

Copy (Copiar) Copiar el gráfico en el portapapeles

Save Image As... (Guardar imagen como...)

Guardar la imagen del gráfico en el tipo de archivo de imagen seleccionado. Se puede elegir entre estos formatos: PNG (predeterminado), GIF, JPG, TIF o BMP

Page Setup... (Configuración de página...)

Obtener vista previa y seleccionar la configuración de la página para imprimirla

Print... (Imprimir...) Imprimir el gráfico

Show Point Values (Mostrar valores de punto)

Mostrar los valores de un punto cuando el ratón se mueve sobre un punto del gráfico.

Set Scale to Default (Volver a escala predeterminada)

Volver a la vista del gráfico predeterminada tras haberlo ampliado

Chart Options... (Opciones del gráfico...)

Abrir la ventana Chart Options (Opciones del gráfico) para modificar el gráfico mediante acciones como cambiar el título, seleccionar los límites de los ejes X e Y, mostrar las líneas de la cuadrícula y mostrar marcas de verificación secundarias en los ejes

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2. En la ventana Sort (Ordenar), seleccione el título de la primera columna que desee ordenar. Ordene los datos en orden Ascending (Ascendente) o Descending (Descendente).

3. Seleccione más de un título de columna seleccionando el título en el menú desplegable. Seleccione Ascending (Ascendente) o Descending (Descendente) para ordenar la columna en ese orden.

4. Haga clic en OK (Aceptar) para ordenar los datos o en Cancel (Cancelar) para detener la operación.

Resalte los datos en los gráficos asociados y el selector de pocillos manteniendo el puntero del ratón sobre una celda. Si hace clic en la celda, puede copiar su contenido para pegarlo en otro programa de software.

Elementos habituales del menú contextual para hojas de cálculoHaga clic con el botón derecho del ratón en cualquier hoja de cálculo para seleccionar los elementos que se muestran en la Tabla 19.

Tabla 19. Elementos del menú contextual para hojas de cálculo.

Elemento Función

Copy (Copiar) Copiar el contenido de los pocillos seleccionados en el portapapeles para poder pegarlo en una hoja de cálculo como Excel.

Copy as Image (Copiar como imagen)

Copia la vista de hoja de cálculo como un archivo de imagen para poder pegarla en un archivo que acepte archivos de imágenes, como archivos de texto, de imágenes o de hojas de cálculo

Print... (Imprimir...) Imprimir la vista actual

Print Selection... (Imprimir selección...)

Imprimir la selección actual

Export to Excel... (Exportar a Excel...)

Exportar los datos a una hoja de cálculo de Excel

Export to Text... (Exportar a texto...)

Exportar los datos a un editor de texto

Export to XML (Exportar a XML)

Exportar los datos a un archivo XML

Export to HTML (Exportar a HTML)

Exportar los datos a un archivo HTML

Find... (Buscar...) Buscar texto

Sort... (Ordenar...) Ordenar los datos de un máximo de tres columnas

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8 Ventanas de análisis de datosLea este capítulo para obtener más información sobre las pestañas de la ventana Data Analysis (Análisis de datos):

• Pestaña sobre cuantificación (a continuación)

• Pestaña sobre datos de cuantificación (página 76)

• Pestaña de la curva de fusión (página 78)

• Pestaña de los datos de la curva de fusión (página 79)

• Pestaña Punto final (página 79)

• Pestaña sobre la discriminación alélica (página 81)

• Pestaña sobre control de calidad (página 83)

• Pestaña sobre información de la ejecución (página 84)

• Informes de archivos de datos (página 85)

Pestaña sobre cuantificaciónUtilice los datos de la pestaña Quantitation (Cuantificación), ilustrada en la Figura 46 en la página 65, para establecer las condiciones del análisis de datos, incluida la configuración basal de los pocillos individuales y la configuración del umbral. La pestaña de cuantificación muestra los datos en estas cuatro vistas:

• Gráfico Amplification (Amplificación). Muestra las unidades de fluorescencia relativa (RFU) de cada pocillo en cada ciclo. Cada trazo del gráfico representa datos de un solo fluoróforo en un pocillo

• Standard curve (Curva estándar). Este gráfico sólo se muestra si el experimento incluye pocillos designados con el tipo de muestra Standard (Estándar). Muestra una curva estándar con el ciclo de umbral trazado en relación con el registro de la cantidad inicial. La leyenda muestra la Eficacia de la reacción (E) para cada fluoróforo en los pocillos con un tipo de muestra estándar

• Well Selector (Selector de pocillos). Selecciona los pocillos con los datos de fluorescencia que desee visualizar

• Spreadsheet (Hoja de cálculo). Muestra una hoja de cálculo de los datos recopilados en los pocillos seleccionados

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Ventanas de análisis de datos

Selector de fluoróforoPara seleccionar los datos del fluoróforo para visualizarlos en los gráficos y en las hojas de cálculo de la pestaña Quantitation (Cuantificación), haga clic en el selector de fluorófos debajo del gráfico Amplification (Amplificación) (Figura 53). Haga clic en el recuadro que se encuentra junto al nombre del fluoróforo para mostrar u ocultar los datos del fluoróforo en toda la ventana del análisis de datos.

Figura 53. Selector de fluoróforos con la opción FAM seleccionada.

Ventana de estilos de trazoAbra la ventana Trace Styles (Estilos de trazo) (Figura 54) para ajustar la apariencia de los trazos en los gráficos de amplificación y curva de fusión de las pestañas Quantitation (Cuantificación) y Melt Curve (Curva de fusión).

Para abrir esta ventana, siga estos pasos:

1. Seleccione un solo fluoróforo en los recuadros de selección de fluoróforos.

2. Haga clic en el botón Trace Styles (Estilos de trazo) en la barra de herramientas de la ventana de análisis de datos, o bien seleccione Settings > Trace Styles (Configuración > Estilos de trazo) en la barra de menús de la ventana de análisis de datos.

Figura 54. Ventana Trace Styles (Estilos de trazo).

Utilice las herramientas de esta ventana para ajustar la apariencia de los trazos y obtener una vista previa de los cambios en el selector de pocillos en la parte inferior de la ventana.

• Seleccione un grupo específico de pocillos con el selector de pocillos en la parte inferior de la ventana. De forma alternativa, seleccione pocillos que contengan un tipo de muestra en el menú desplegable de la columna Wells (Pocillos)

• Haga clic en el recuadro de la columna Color para seleccionar un color para los pocillos

• Seleccione un símbolo del menú desplegable de la columna Symbol (Símbolo)

• Haga clic en Show Contents (Mostrar contenido) para ver los tipos de muestra de cada pocillo; o haga clic en Show Symbols (Mostrar símbolos) para ver los símbolos seleccionados en cada pocillo

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Opción de escala logarítmicaHaga clic en la casilla Log Scale (Escala logarítmica) de la parte inferior del gráfico de amplificación para ver los trazos de fluorescencia en una escala semilogarítmica, como se muestra en la Figura 55.

Figura 55. Opción de escala logarítmica en el gráfico de amplificación.

Gráfico de curva estándarEl software crea un gráfico de curva estándar (Figura 56) en la pestaña Quantitation (Cuantificación) si los datos incluyen tipos de muestras definidos como estándar (Std) para un fluoróforo del experimento.

Figura 56. Gráfico de curva estándar.

El gráfico de curva estándar muestra la siguiente información:

• Nombre de cada curva (el nombre del fluoróforo)

• Color de cada fluoróforo

• Eficacia de la reacción (E). Utilice esta estadística para optimizar una reacción multiplex y ecualizar los datos de una curva estándar

NOTA: La eficacia de la reacción describe qué parte del objetivo se está generando con cada ciclo del protocolo. Una eficacia del 100% significa que está duplicando el objetivo en cada ciclo.

• Coeficiente de determinación, R2 (escrito comos R^2). Utilice esta estadística para determinar con qué precisión mide la línea los datos (bondad de ajuste)

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Opciones del menú contextual del gráfico

Además de las opciones habituales de menú que aparecen cuando se hace clic con el botón derecho del ratón (copiar, imprimir y exportar gráficos), en la Tabla 20 se muestran las opciones de menú que se encuentran disponibles solamente en el gráfico de amplificación.Tabla 20. Opciones del menú contextual específicas del gráfico de amplificación.

Pestaña sobre datos de cuantificaciónLa pestaña Quantitation Data (Datos de cuantificación) muestra hojas de cálculo que describen los datos de cuantificación recopilados en cada pocillo. Seleccione una de las tres opciones para mostrar los datos en diferentes formatos:

• Results (Resultados). Mostrar una vista de hoja de cálculo de los datos

• Plate (Placa). Mostrar una vista de los datos de cada pocillo como si fuera el mapa de una placa

• RFU. Seleccionar esta hoja de cálculo para mostrar las cantidades de RFU de cada pocillo en cada ciclo

CONSEJO: Haga clic con el botón derecho del ratón en cualquiera de las hojas de cálculo para ver las opciones, incluida la opción para establecer un orden.

Hoja de cálculo de resultadosSeleccione una hoja de cálculo Results (Resultados) (Figura 57) para ver los datos de cada pocillo de la placa.

Figura 57. La pestaña cuantificación con la hoja de cálculo de resultados seleccionada.

NOTA: Todos los cálculos de Std. Dev. (desviación típica) hacen referencia a los grupos de replicados asignados en los pocillos de la ventana del editor de placas. Los cálculos obtienen la media del valor de C(t) de cada pocillo del grupo de replicados.

Opción de menú Función

Show Threshold Values (Mostrar valores de umbral)

Mostrar el valor de umbral de cada curva de amplificación del gráfico

Trace Styles... (Estilos de trazo...)

Abrir la ventana Trace Styles (Estilos de trazo) para cambiar los estilos de trazos que aparecen en las pestañas Quantitation (Cuantificación) y Melt Curve (Curva de fusión)

Baseline Thresholds... (Umbrales basales...)

Abrir la ventana Baseline Thresholds (Umbrales basales) para cambiar los valores basales o los umbrales de cada fluoróforo (los cambios aparecen en el gráfico de amplificación de la pestaña de cuantificación)

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La hoja de cálculo de resultados contiene el tipo de información que se muestra en la Tabla 21.

Hoja de cálculo de la placaSeleccione la hoja de cálculo Plate (Placa) para ver un mapa de la placa de los datos de los fluoróforos de uno en uno. Seleccione cada uno de los fluoróforos; para ello, haga clic en las pestañas de la parte inferior de la hoja de cálculo. La Figura 58 muestra la hoja de cálculo de la placa como si fuera un mapa de dicha placa.

Figura 58. Hoja de cálculo de la placa en la pestaña de datos de cuantificación.

Tabla 21. Contenido de la hoja de cálculo de resultados.

Información Descripción

Well (Pocillo) Pocillo de la placa

Fluor (Fluoróforo) Fluoróforo detectado

Content (Contenido) Tipo de muestra y número de replicado

Target (Objetivo) Nombre del objetivo de amplificación (gen)

Sample (Muestra) Descripción de la muestra

Threshold Cycle (Ciclo de umbral) (C(t))

Ciclo del umbral

C(t) Mean (Media de C(t)) Media del ciclo del umbral para el grupo de replicados

C(t) Std. Dev (Desviación típica de C(t))

Desviación típica del ciclo del umbral para el grupo de replicados

Starting Quantity (Cantidad inicial) (SQ)

Cálculo de la cantidad inicial del objetivo

Log Starting Quantity (Registrar cantidad inicial)

Registro de la cantidad inicial

SQ Mean (Media de la cantidad inicial)

Media de la cantidad inicial

SQ Std. Dev (Desviación típica de cantidad inicial)

Desviación típica de la cantidad inicial

Set Point (Punto de ajuste) Temperatura de la muestra en el pocillo para un paso de gradiente

Sample Note (Nota de la muestra)

Una ronda de desnaturalización, hibridación y extensión o una ronda de hibridación y pasos de extensión de un protocolo

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Hoja de cálculo de RFUSeleccione la hoja de cálculo de RFU para ver las lecturas de RFU de cada pocillo que se hayan obtenido en cada ciclo del experimento. Seleccione los fluoróforos individuales haciendo clic en las pestañas de la parte inferior de la hoja de cálculo. El número del pocillo aparece en la parte superior de cada columna y el número de ciclo a la izquierda de las filas (Figura 59).

Figura 59. Hoja de cálculo de RFU en la pestaña de datos de cuantificación.

Pestaña de la curva de fusiónAbra la pestaña Melt Curve (Curva de fusión) (Figura 60) para determinar la temperatura de fusión (Tm) de los productos de PCR amplificados. Esta pestaña muestra los datos de la curva de fusión en estas cuatro vistas:

• Melt Curve (Curva de fusión). Muestra los datos en tiempo real de cada fluoróforo en forma de RFU por la temperatura de cada pocillo

• Melt Peak (Pico de fusión). Mostrar la regresión negativa de los datos de RFU por la temperatura de cada pocillo

• Well Selector (Selector de pocillos). Seleccionar pocillos para mostrar u ocultar los datos

• Hoja de cálculo Peak (Pico). Mostrar una hoja de cálculo de los datos recopilados en el pocillo seleccionado

NOTA: Esta hoja de cálculo solamente muestra un máximo de dos picos para cada trazo. Para ver más picos, haga clic en la pestaña Melt Curve Data (Datos de la curva de fusión) (página 79).

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Figura 60. Disposición de la pestaña curva de fusión en la ventana de análisis de datos.

Ajuste los datos de la curva de fusión mediante alguno de estos métodos:

• Haga clic en las barras de umbral en el gráfico Melt Peak (Pico de fusión) y arrástrelas para incluir picos en el análisis de datos o excluirlos del mismo

• Seleccione Positive (Positivo) en el menú desplegable Peak Type (Tipo de pico) para ver los datos de la hoja de cálculo de los picos que están por encima de la línea Melt Threshold (Umbral de fusión) o Negative (Negativo) para ver los datos de la hoja de cálculo de los picos que están por debajo de la línea Melt Threshold (Umbral de fusión)

Pestaña de los datos de la curva de fusiónLa pestaña Melt Curve Data (Datos de la curva de fusión) muestra los datos de la pestaña de la curva de fusión en diversas hojas de cálculo que contienen todos los picos de fusión de cada trazo. Seleccione una de las cuatro opciones para mostrar los datos de la curva de fusión en diferentes hojas de cálculo.

• Melt Peaks (Picos de fusión). Muestra todos los datos de cada trazo, incluidos los picos de fusión

• Plate (Placa). Muestra una vista de los datos y el contenido de cada pocillo de la placa, incluido su contenido, el nombre de la muestra, el pico 1 y el pico 2

• RFU. Muestra las cantidades de RFU en cada temperatura de cada pocillo

• –d(RFU)/dT. Muestra la tasa de variación negativa en RFU para cada pocillo a medida que cambia la temperatura (T). Éste es el primer trazado de regresión de cada pocillo de la placa

Pestaña Punto finalAbra la pestaña End Point (Punto final) para analizar las unidades de fluorescencia relativa (RFU) finales de los pocillos de muestra. El software compara los niveles de RFU de los pocillos con muestras desconocidas en relación con los niveles de RFU de los pocillos con controles negativos y clasifica las muestras desconocidas como positivas o negativas. Las muestras positivas tienen un valor de RFU superior al valor de RFU promedio de los controles negativos, más el valor de corte.

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Para analizar los datos de punto final, la placa debe contener controles negativos, ya que, de lo contrario, el software no podrá realizar la llamada. Lleve a cabo uno de estos dos tipos de protocolos:

• Ejecutar un protocolo de cuantificación. Configure un protocolo estándar. Tras haber realizado el experimento, abra la ventana Data Analysis (Análisis de datos), ajuste las opciones de análisis de datos en la pestaña Quantitation (Cuantificación) y, a continuación, haga clic en la pestaña End Point (Punto final) para elegir un ciclo de punto final

• Ejecutar un protocolo exclusivo de punto final. Cargue el protocolo End Point Only (Sólo punto final) en la pestaña Plate (Placa) de la ventana Experiment Setup (Configuración del experimento), seleccione o cree una placa y lleve a cabo el experimento

La pestaña End Point (Punto final) muestra los valores de RFU promedio para determinar si el objetivo se ha ampliado o no con el último ciclo (final). Utilice estos datos para determinar si una secuencia concreta del objetivo está presente (positivo) en alguna muestra. Los objetivos positivos tienen valores de RFU superiores al nivel de corte definido.

El software muestra los siguientes datos en la pestaña End Point (Punto final):

• Settings (Configuración). Permite ajustar la configuración del análisis de datos

• Results (Resultados). Muestra los resultados inmediatamente después de haber ajustado la configuración

• Well Selector (Selector de pocillos). Permite seleccionar los pocillos con los datos de punto final que desea ver

• Hoja de cálculo Well (Pocillo). Muestra una hoja de cálculo de los datos de RFU recopilados en los pocillos seleccionados

Figura 61. Disposición de la pestaña punto final del análisis.

La lista Results (Resultados) contiene la siguiente información:

• Lowest RFU value (Valor más bajo de RFU). El valor de RFU más bajo en los datos

• Highest RFU value (Valor más alto de RFU). El valor de RFU más alto en los datos

• Negative Control Average (Promedio de control negativo). RFU promedio de los pocillos que contienen controles negativos

• Cut Off Value (Valor de corte). Este valor se calcula mediante la suma de la tolerancia (RFU o Percentage of Range [Porcentaje del rango] que se muestra en la configuración) y la media de los controles negativos. Las muestras con RFU superiores al valor de corte

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se denominan “Positive” (Positivas). Para ajustar el valor de corte, cambie el valor de RFU o Percentage of Range (Porcentaje del rango)

El valor de corte se calcula mediante esta fórmula:

Seleccione una tolerancia mediante alguno de estos métodos:

• RFUs (predeterminado). Seleccione este método para utilizar un valor de RFU absoluto para la tolerancia. El valor mínimo de la tolerancia de RFU es 2. El máximo es el valor absoluto del valor de RFU más alto menos el valor absoluto del valor de RFU más bajo. El valor de la tolerancia de RFU predeterminado es el 10% del rango total de RFU

• Percent of Range (Porcentaje del rango). Seleccione este método para utilizar un porcentaje del rango de RFU para la tolerancia. El porcentaje mínimo del rango es 1%. El porcentaje máximo del rango es 99%. El porcentaje predeterminado del rango es 10%

Ajuste del análisis de los datos de punto finalAjuste la información que se muestra en la pestaña End Point (Punto final) mediante alguno de estos métodos:

• Elija un Fluorophore (Fluoróforo) de la lista desplegable para ver los datos

• Elija un valor en End Cycle to Average (Ciclo final para promediar) para establecer el número de ciclos que utiliza el software para calcular el promedio de RFU de punto final

• Seleccione RFUs para ver los datos en unidades de fluorescencia relativa

• Seleccione Percentage of Range (Porcentaje del rango) para ver los datos como un porcentaje del rango de RFU

Pestaña sobre la discriminación alélicaLa pestaña Allelic Discrimination (Discriminación alélica) asigna los genotipos a pocillos con muestras desconocidas por medio de la RFU o el C(t) de muestras de control positivas (Figura 62). Utilice estos datos para identificar genotipos de muestras, incluidos Alelo 1, Alelo 2, Heterocigoto, Desconocido, Control 1 o Control 2.

NOTA: Los datos para la discriminación alélica deben proceder de experimentos multiplex.

Para realizar un análisis de discriminación alélica, se necesitan los siguientes contenidos mínimos en los pocillos:

• Dos fluoróforos en cada pocillo, excepto en los pocillos que contienen controles positivos que pueden tener un solo fluoróforo

• Un fluoróforo que sea común para todos los pocillos del grupo de pocillos

Valor de corte Media de control negativo Tolerancia+=

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• Muestras de NTC (sin control de plantilla) si desea normalizar los datos

Figura 62. Disposición de la pestaña de discriminación alélica en la ventana de análisis de datos.

Ajuste de los datos para la discriminación alélicaEl software asigna automáticamente un genotipo a pocillos con muestras desconocidas según las posiciones de las barras de umbral vertical y horizontal y, a continuación, muestra las llamadas de genotipo en la vista de hoja de cálculo. Para llamar genotipos automáticamente, el software utiliza controles positivos (cuando están disponibles) o calcula los umbrales. El software utiliza un C(t) o un promedio de RFU para los controles positivos a fin de establecer automáticamente las líneas de umbral para la discriminación de los alelos.

Haga clic en las barras de umbral y arrástrelas para ajustar la posición de las mismas y, a continuación, el software ajustará automáticamente los cálculos para realizar nuevas asignaciones de genotipo:

• Si el experimento contiene tres controles en la placa, las posiciones de las barras de umbral se basan en la media y la desviación típica de la RFU o el C(t) de los controles

• Si el número de controles es inferior a tres, la posición de las barras de umbral está determinada por el valor del rango o RFU o del ciclo de umbral del fluoróforo seleccionado

Ajuste los datos de la discriminación alélica mediante cualquiera de estos métodos:

• Haga clic en las barras de umbral del gráfico Allelic Discrimination (Discriminación alélica) y arrástrelas para ajustar las llamadas en la hoja de cálculo

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• Seleccione un fluoróforo para cada eje del gráfico (X: e Y:) en las opciones de configuración de la parte inferior de la ventana

• Cambie una llamada manualmente resaltando una fila en la hoja de cálculo y, a continuación, seleccionando una opción en la lista Call Selected Alleles (Llamar alelos seleccionados) en la que se incluyen Alelo 1, Alelo 2, Heterocigoto, Desconocido, Control 1 o Control 2

• Haga clic en el botón Restore Default Thresholds (Restaurar umbrales predeterminados) para restaurar las barras vertical y horizontal a sus posiciones originales, cuya indicación queda reflejada en los números que se encuentran junto a las barras

• Seleccione C(t) Display Mode (Modo de visualización de C(t)) para ver los datos como niveles de umbral. Seleccione RFU Display Mode (Modo de visualización de RFU) para ver los datos en unidades de fluorescencia relativa en el ciclo seleccionado

• Seleccione Normalize Data (Normalizar datos) para normalizar los datos de RFU que se muestran en el gráfico y en la hoja de cálculo

La normalización cambia los datos del gráfico a un rango de 0 a 1 en ambos ejes. Para normalizar los datos, la placa debe contener pocillos con tipos de muestra sin control de plantilla (NTC) para Alelo 1 y Alelo 2. Para este trazado, los datos de RFU están normalizados para los valores de NTC como una combinación lineal de RFU específicas de Alelo 1 y Alelo 2. Este trazado es una forma eficaz de presentar los datos de RFU.

Los cálculos para la RFU normalizada siguen las fórmulas presentadas en Livak et al. (1995).

Donde:• A1 representa la RFU del Alelo 1• A2 representa la RFU del Alelo 2

• representa la RFU media

NTCA1 + A2 representa la suma de RFU para la muestra de NTC del Alelo 1 y el Alelo 2

Pestaña sobre control de calidadAbra la pestaña QC (Control de calidad) para realizar una evaluación rápida de la calidad de los datos experimentales basada en las reglas definidas en la pestaña QC (Control de calidad) de la ventana User Preferences (Preferencias del usuario) (véase “Pestaña sobre control de calidad” en la página 112).

Normalizado A1A1

A1 A2 x NTCA1 A2+ + +--------------------------------------------------------------=

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El software muestra las reglas de control de calidad que están en vigor en ese momento y la configuración que define cada regla (Figura 63). La descripción de la regla también muestra los pocillos que no cumplen una regla seleccionada.

NOTA: Puede activar o desactivar las reglas haciendo clic en la casillas de verificación que hay junto a las reglas en la columna Use Rule (Usar regla).

Figura 63. Disposición de la pestaña de control de calidad.

Pestaña sobre información de la ejecuciónLa pestaña Run Information (Información de la ejecución) (Figura 64) muestra el protocolo y otra información acerca de la ejecución de cada experimento. También puede introducir y editar las notas de la ejecución escribiéndolas en el recuadro Notes (Notas) o introduciendo y editando el identificador de los datos de la ejecución en el recuadro ID.

Figura 64. Disposición de la pestaña de información de la ejecución en la ventana de análisis de datos.

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Informes de archivos de datosLa ventana Report (Informe) (Figura 65) muestra información sobre el archivo de datos actual en la ventana de análisis de datos. Para abrir un informe, seleccione Tools > Reports (Herramientas > Informes) o haga clic en el botón Informes de la barra de herramientas de la ventana de análisis de datos.

La ventana Report (Informe) muestra estas tres secciones:

• Menú y barra de herramientas. Le permite seleccionar las opciones para dar formato, guardar e imprimir el informe o la plantilla

• Lista de opciones (parte superior izquierda de la ventana). Le permite seleccionar las opciones que desea que aparezcan en el informe

• Panel de opciones (parte inferior izquierda de la ventana). Le permite introducir información sobre una opción seleccionada

• Panel de vista previa (parte derecha de la ventana). Le permite obtener una vista previa del informe actual

Figura 65. Ejemplo de una ventana de informe para un archivo de datos.

CONSEJO: El diseño del informe puede definir el tipo de información que aparece en cualquier informe si guarda el informe como una plantilla. Seleccione Template > Save (Plantilla > Guardar) o Save As (Guardar como) para guardar el diseño del informe actual como una plantilla.

Crear un informe de análisis de datosPara crear un informe en la ventana de análisis de datos, realice lo siguiente:

1. Realice los ajustes finales en el contenido de los pocillos, los pocillos seleccionados, los gráficos y las hojas de cálculo en la ventana de análisis de datos antes de crear el informe.

2. Haga clic en el botón Report (Informe) de la barra de herramientas de la ventana de análisis de datos para abrir la ventana Report (Informe).

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3. Cambie las opciones que desea incluir en el informe. El informe se abre con las opciones predeterminadas seleccionadas. Haga clic en las casillas de verificación de la lista de opciones del informe para cambiar categorías completas u opciones individuales dentro de una categoría.

NOTA: Los datos que aparecen en el informe dependen de las opciones seleccionadas actualmente en las pestañas de la ventana de análisis de datos. Por ejemplo, un experimento de cuantificación podría no contener una curva estándar, por lo que esos datos no aparecen en la ventana de análisis de datos ni en el informe de datos.

4. Haga clic en el botón Update Report (Actualizar informe) para actualizar la vista previa del informe con todos los cambios que se hayan realizado.

5. Imprima o guarde el informe. Haga clic en el botón Print (Imprimir) de la barra de herramientas para imprimir el informe actual. Seleccione File > Save (Archivo > Guardar) para guardar el informe como un archivo con formato PDF (archivo de Adobe Acrobat Reader), MHT (documento de Microsoft) o MHTML (documento de Microsoft) y seleccione la ubicación en la que desea guardarlo. Seleccione File > Save As (Archivo > Guardar como) para guardar el informe con un nombre nuevo o en otra ubicación.

6. (Opcional) Cree una plantilla de informe con la información que desee. Para guardar la configuración del informe actual en una plantilla, seleccione Template > Save (Plantilla > Guardar) o Save As (Guardar como). La próxima vez que desee crear un informe nuevo solamente necesita cargar la plantilla de informe.

Categorías de informes de análisis de datosUn informe puede incluir cualquiera de las opciones de cada categoría que se describen en la Tabla 22, en función del tipo de datos que contenga la ventana de análisis de datos.

Tabla 22. Categorías de informes de análisis de datos en la lista de opciones.

Categoría Opción Descripción

Header (Encabezado) Título, subtítulo y logotipo del informe

Report Information (Información del informe)

Fecha del experimento, nombre del usuario, nombre del archivo de datos, ruta del archivo de datos y grupo de pocillos seleccionado

Notes (Notas) Notas sobre el informe de datos


Run Information (Información de la ejecución)

Incluye la fecha del experimento, el nombre del usuario, el nombre del archivo de datos, la ruta del archivo de datos y el grupo de pocillos seleccionado

Protocol (Protocolo) Vista de texto de los pasos y las opciones del protocolo

Plate Display (Visualización de placa)

Muestra una vista de la placa con información sobre cada pocillo

Quantitation (Cuantificación)

Analysis Settings (Configuración del análisis)

Incluye el número del paso en el que se recopilaron los datos, el modo de análisis y el método de sustracción basal


Amplification Chart (Gráfico de amplificación)

Copia del gráfico de amplificación de los experimentos que incluyen datos de cuantificación

Standard Curve Chart (Gráfico de curva estándar)

Copia del gráfico de curva estándar

Data (Datos) Hoja de datos con los datos de cada pocillo

Gene Expression (Expresión genética)


Incluye el modo de análisis, los datos de los gráficos, la opción de escala y el error del gráfico

Chart (Gráfico) Copia del gráfico de expresión genética

Target Names (Nombres de objetivos)

Gráfico de los nombres

Sample Names (Nombres de las muestras)

Gráfico de los nombres


Melt Curve (Curva de fusión)


Incluye el número de paso de fusión y la configuración de las barras de umbral

Melt Curve Chart (Gráfico de curva de fusión)

Copia del gráfico de curva de fusión

Melt Peak Chart (Gráfico de pico de fusión)

Copia del gráfico de pico de fusión


Allelic Discrimination (Discriminación alélica)


Incluye el modo de visualización, los fluoróforos, el ciclo, los umbrales y los datos normalizados

Chart (Gráfico) Copia del gráfico de discriminación alélica


End Point (Punto final)


Incluye el fluoróforo, los ciclos finales para promediar, el modo, el valor más bajo de RFU, el valor más alto de RFU y el valor de corte


Tabla 22. Categorías de informes de análisis de datos en la lista de opciones. (cont.)

Categoría Opción Descripción

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9 Análisis de la expresión genéticaLea este capítulo para obtener información sobre cómo realizar análisis de expresión genética:

• Expresión genética (a continuación)

• Configuración de la placa para el análisis de expresión genética (página 90)

• Pestaña de expresión genética (página 90)

• Ventana para la configuración del experimento (página 96)

• Estudio genético (página 98)

• Ventana sobre el informe del estudio genético (página 102)

Expresión genéticaCon el uso de controles altamente cualificados en sus reacciones, puede realizar un experimento de expresión genética para normalizar las diferencias relativas en una concentración objetivo entre muestras. Por norma general, se utilizan los niveles de mensaje de uno o varios genes de referencia para normalizar los niveles de expresión de un gen objeto de interés. Los genes de referencia tienen en cuenta las diferencias de carga u otras variaciones representadas en cada muestra, y no se deben regular en el sistema biológico que esté sujeto al estudio.

Abra la pestaña Gene Expression (Expresión genética) para evaluar las diferencias entre las reacciones de PCR de dos o más pocillos. Puede evaluar, por ejemplo, los números relativos de genomas virales o los números relativos de secuencias transfectadas en una reacción de PCR. La aplicación más común de los estudios de expresión genética es la comparación de la concentración de ADNc en más de una reacción para calcular los niveles de ARN mensajero de estado estable.

El software calcula el nivel de expresión relativa de un objetivo con alguna de las siguientes situaciones:

• Nivel de expresión relativa de una secuencia objetivo (Objetivo 1) en relación con otro objetivo (Objetivo 2). Por ejemplo, la cantidad de un gen en relación con otro gen bajo el mismo tratamiento de la muestra

• El nivel de expresión relativa de una secuencia objetivo de una muestra comparado con el mismo objetivo bajo diferentes tratamientos de la muestra. Por ejemplo, la cantidad relativa de un gen en relación a él mismo en diferentes condiciones temporales, geográficas o de desarrollo

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Análisis de la expresión genética

Configuración de la placa para el análisis de expresión genética

Para realizar un análisis de expresión genética, el contenido de los pocillos debe incluir lo siguiente:

• Dos o más objetivos. Los dos objetivos que representen diferentes genes o secuencias amplificados en sus muestras

• Dos o más objetivos de referencia. Al menos un objetivo debe ser un objetivo de referencia para expresiones normalizadas. Asigne todos los objetivos de referencia en la ventana Experiment Settings (Configuración del experimento) (página 46) para analizar los datos en el modo Normalized Expression (Expresión normalizada) (C(t)). Los experimentos que no contengan una referencia se deben analizar en el modo Relative Expression (Expresión relativa) (C(t))

• Muestras comunes. Sus reacciones deben incluir muestras comunes (se requieren dos como mínimo) para ver los datos trazados en la pestaña Gene Expression (Expresión genética). Estas muestras representan diferentes tratamientos o condiciones de cada una de las secuencias objetivo. Asigne una muestra de control (opcional) en la ventana Experiment Settings (Configuración del experimento) (página 46)

Los requisitos de la configuración de la expresión genética en el editor de placas dependen de si los contenidos de la reacción son PCR uniplex con un fluoróforo en las reacciones o PCR multiplex con más de un fluoróforo en las reacciones.

En la Figura 66 se ilustra un ejemplo del contenido mínimo de los pocillos para un experimento de expresión genética uniplex.

Figura 66. Ejemplo del contenido de los pocillos para un experimento de expresión genética uniplex.

En la Figura 67 se ilustra un ejemplo del contenido mínimo de los pocillos para un experimento de expresión genética multiplex.

Figura 67. Ejemplo del contenido de los pocillos para un experimento de expresión genética multiplex.

Pestaña de expresión genéticaEn la pestaña Gene Expression (Expresión genética) de la ventana Data Analysis (Análisis de datos) aparecen los objetivos de expresión relativa en estas dos vistas:

• Gráfico de expresión genética. Muestra los datos de PCR en tiempo real como una expresión normalizada (C(t)) o una cantidad relativa (C(t))

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• Hoja de cálculo. Muestra una hoja de cálculo de los datos de la expresión genética

CONSEJO: Haga clic con el botón derecho del ratón en cualquier gráfico u hoja de cálculo para ver las opciones. Haga clic en el botón View/Edit Plate (Ver/Editar placa) en el editor de placas y cambie el contenido de los pocillos de la placa.

.

Figura 68. Disposición de la pestaña de expresión genética en la ventana de análisis de datos.

CONSEJO: Haga clic con el botón derecho en el gráfico para seleccionar las opciones del menú contextual. Seleccione Sort (Ordenar) en este menú para reorganizar el orden de los nombres de los objetivos y las muestras en el gráfico.

Expresión genética normalizada

Para normalizar datos, utilice el nivel de expresión medida de uno o varios genes de referencia (objetivos) como factor de normalización. Los genes de referencia son objetivos no regulados en el sistema biológico objeto de estudio, como actina, GAPDH o Histona H3.

Para configurar un análisis de expresión genética normalizada (C(t)), siga estos pasos:

1. Abra un archivo de datos (extensión .pcrd).

2. Consulte los datos de la pestaña Quantitation (Cuantificación) en la ventana Data Analysis (Análisis de datos). Realice los ajustes necesarios en los datos, como cambiar el umbral y el modo de análisis.

3. Haga clic en la pestaña Gene Expression (Expresión genética).

4. Elija un control en la pestaña Samples (Muestras) de la ventana Experiment Settings (Configuración del experimento). Si se asigna un control, el software normaliza las cantidades relativas de todos los genes a la cantidad de control, que se establece en 1.

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5. Seleccione los genes de referencia de este experimento en la pestaña Target (Objetivo) de la ventana Experiment Settings (Configuración del experimento). El análisis de expresión genética requiere que entre los objetivos de sus muestras haya una referencia.

6. Seleccione la opción Normalized Expression (C(t)) (Expresión normalizada) si todavía no está seleccionada y, a continuación, consulte los niveles de expresión en la pestaña Gene Expression (Expresión genética).

Cantidad relativaSeleccione Relative Quantity (C(t)) (Cantidad relativa) en el menú desplegable de los controles del gráfico de la pestaña Gene Expression (Expresión genética) para realizar un análisis de cantidad relativa (C(t)). Por definición, los datos del análisis de cantidad relativa (C(t)) no están normalizados. Este método se utiliza para cuantificar muestras que no incluyen ningún gen de referencia (objetivos). Por norma general, el investigador confía en una de las siguientes consideraciones a la hora de configurar el experimento:

• Cada muestra representa la misma cantidad de la plantilla en cada muestra biológica, posiblemente la misma masa de ARN o ADNc en cada pocillo

• Cualquier variación en la cantidad de muestra biológica cargada se normalizará después de la ejecución mediante algún método de análisis de datos fuera del software. Por ejemplo, un investigador podría elegir dividir el valor de cantidad relativa por el factor normalizador, posiblemente la masa de ácido nucleico cargado por cada muestra o el número de células a partir de las que se aisló el ácido nucleico

Ajuste de los datos de la expresión genéticaTras seleccionar el método de análisis, ajuste los datos que observa en la pestaña Gene Expression (Expresión genética). Para ello, cambie las opciones de configuración que se encuentran a la derecha del gráfico.

DATOS DE GRÁFICO

Las opciones de datos del gráfico le permiten presentar los datos en el gráfico mediante alguna de las dos opciones que se detallan a continuación:

• Relative to control (Relativos al control). Realiza un gráfico con el eje en una escala de 0 a 1. Si asigna un control en el experimento, seleccione esta opción para visualizar rápidamente la regulación hacia arriba y la regulación hacia abajo del objetivo

• Relative to zero (Relativos a cero). Realiza un gráfico de los datos con el origen en cero

OPCIONES DEL EJE X

Las opciones del eje X le permiten seleccionar los datos del eje x del gráfico de expresión genética:

• Target (Objetivo). Seleccione esta opción para escribir los nombres de los objetivos en el eje X

• Sample (Muestra). Seleccione esta opción para escribir los nombres de las muestras en el eje X

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OPCIONES DEL EJE Y

Las opciones del eje Y le permiten mostrar el gráfico de expresión genética en alguna de estas tres escalas:

• Linear (Lineal). Seleccione esta opción para mostrar una escala lineal

• Log 2 (Logaritmo 2). Seleccione esta opción para evaluar muestras en un rango dinámico amplio

• Log 10 (Logaritmo 10). Seleccione esta opción para evaluar muestras en un rango dinámico muy amplio

OPCIONES DE ESCALA

Seleccione Normalized Gene Expression (C(t)) (Expresión genética normalizada) para activar las opciones de escala en el gráfico de expresión genética. Seleccione una de estas opciones de escala para calcular y presentar los datos de la forma que mejor se adapte a su diseño experimental:

• Unscaled expression (Expresión sin escala). Esta opción presenta la expresión de gen normalizada sin escala

• Highest expression (Expresión más alta). Establece la escala de la expresión genética normalizada en la más alta de cada objetivo, dividiendo el nivel de expresión de cada muestra entre el nivel más alto de expresión de todas las muestras. Esta opción de escala utiliza la fórmula de escala más alta

• Lowest expression (Expresión más baja). Recalcula la expresión genética normalizada de cada objetivo dividiendo el nivel de expresión de cada muestra entre el nivel más bajo de expresión de todas las muestras. Esta opción de escala utiliza la fórmula de escala más baja

TIPO DE ERROR

Seleccione una opción para los cálculos de tipo de error (barras de error) en el gráfico Gene Expression (Expresión genética):

• Standard Error of the Mean (Error típico de la media, SEM). Es el valor predeterminado

• Standard Deviation (Desviación típica, Std Devs)

MULTIPLICADOR DE LA BARRA DE ERROR DEL GRÁFICO

Seleccione un multiplicador para las barras de error del grafico de expresión genética. Seleccione uno de los siguientes enteros: 1 (predeterminado), 2 ó 3. El tipo de multiplicador cambia al seleccionar el tipo de error:

• SEM para error típico de la media

• Std Devs para desviaciones típicas

VALOR DE ESTABILIDAD DEL OBJETIVO

Abra esta ventana siempre que se utilice más de 1 gen de referencia. El software calcula dos parámetros de calidad para los genes de referencia:

• Coefficient of Variation (CV) (Coeficiente de variación) de las cantidades relativas de genes de referencia normalizados. Los valores de CV más bajos denotan una mayor estabilidad

• M-value (Valor M). Una medida de la estabilidad de la expresión genética de referencia

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Opciones del menú contextual del gráfico de expresión genéticaHaga clic con el botón derecho del ratón en cualquier hoja de cálculo para seleccionar los elementos que se muestran en la Tabla 23.

Hoja de cálculo de expresión genéticaEn la Tabla 24 se describe la información que aparece en la hoja de cálculo de expresión genética.

Tabla 23. Elementos del menú contextual.

Elemento Función

Copy (Copiar) Copiar el gráfico en el portapapeles

Save as Image (Guardar como imagen)

Guardar el gráfico de la vista de gráfico como un archivo de imagen. El tipo de imagen predeterminado es PNG. Los otros tipos de archivo de imagen que se pueden elegir son GIF, JPG, TIF y BMP

Page Setup... (Configuración de página...)

Seleccionar la configuración de una página para imprimirla

Print... (Imprimir...) Imprimir la vista de gráfico

Show Point Values (Mostrar valores de punto)

Mostrar la cantidad relativa de cada punto del gráfico cuando se coloca el cursor sobre dicho punto

Set Scale to Default (Volver a escala predeterminada)

Devolver la vista de gráfico a su configuración predeterminada después de haberla ampliado

Chart Options... (Opciones del gráfico...)

Abrir la ventana de opciones del gráfico para modificarlo

Sort... (Ordenar...) Cambiar el orden en que aparecen las muestras o los objetivos en el eje X del gráfico

User Corrected Std Devs (Desviaciones típicas corregidas por el usuario)

Calcular las barras de error mediante la fórmula de desviación típica corregida

Use Solid Bar Colors (Utilizar colores sólidos en las barras)

Mostrar barras sólidas en el gráfico

x-axis labels (Etiquetas del eje X)

Seleccionar entre visualizar las etiquetas del eje X en horizontal o en ángulo

Tabla 24. Descripción de la información que aparece en la pestaña Gene Expression (Expresión genética) de la hoja de cálculo.


Target (Objetivo) Nombre del objetivo (gen amplificado) seleccionado en la ventana de configuración del experimento

Sample (Muestra) Nombre de la muestra seleccionada en la ventana de configuración del experimento

Ctrl Muestra de control cuando el nombre de la muestra se define como un control en la ventana de configuración del experimento

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Opción para la visualización de detallesAl hacer clic en la casilla de verificación Show Details (Mostrar detalles), esta información también se muestra en la Tabla 25.

Expression (Expresión) Normalized Gene Expression (C(t)) (Expresión genética normalizada) o Relative quantity (C(t)) (Cantidad relativa) en función del modo seleccionado

Expression SEM (o SD) (SEM o SD de la expresión)

Error típico de la media o desviación típica, en función de la opción seleccionada

Corrected Expression SEM (o SD) (SEM o SD corregida de la expresión)

Valor corregido del error típico de la media (SEM) o desviación típica (SD) de la expresión relativa, en función de la opción seleccionada

Mean (C(t)) (Media de C(t)) Media del ciclo de umbral

C(t) SEM (o SD) (SEM o SD de C(t))

Error típico de la media o desviación típica del ciclo de umbral, en función de la opción seleccionada

Tabla 25. Información de la hoja de cálculo de expresión genética con la opción Show Details (Mostrar detalles) seleccionada.


Data Set (Conjunto de datos) Datos de fluorescencia de un fluoróforo en el archivo de datos

Relative Quantity (Cantidad relativa)

Cálculo de la cantidad relativa de las muestras

Relative Quantity SD (Desviación típica de la cantidad relativa)

Cálculo de la desviación típica de la cantidad relativa

Corrected Relative Quantity SD (Desviación típica de la cantidad relativa corregida)

Cálculo de la desviación típica de la cantidad relativa corregida

Unscaled Expression (Expresión sin escala)

Cálculo de la expresión sin escala

Unscaled expression SD (Desviación típica de la expresión sin escala)

Cálculo de la desviación típica de la expresión sin escala

Corrected Unscaled expression SD (Desviación típica corregida de la expresión sin escala)

Cálculo de la desviación típica corregida de la expresión sin escala

Expression (Expresión) Nivel de expresión relativa

Wells (Pocillos) Número de pocillo de la placa

Tabla 24. Descripción de la información que aparece en la pestaña Gene Expression (Expresión genética) de la hoja de cálculo. (cont.)


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Ventana para la configuración del experimentoPara abrir la ventana de configuración del experimento, haga clic en el botón Experiment Settings (Configuración del experimento) de la pestaña Gene Expression (Expresión genética). En esta ventana puede abrir o cambiar la lista de Targets (Objetivos) y Samples (Muestras), seleccionar genes de referencia y muestras de control o definir el grupo de muestras del análisis de expresión genética que se analizará si se han añadido nombres de colección a los pocillos (Figura 69).

Figura 69. Ventana de configuración del experimento con la pestaña de objetivos seleccionada.

Para ajustar las listas en estas pestañas, utilice las siguientes funciones:

• Añada un nombre de objetivo o muestra. Para ello, escríbalo en el recuadro New (Nuevo) y, a continuación, haga clic en Add (Añadir)

• Para eliminar un nombre de objetivo o muestra de la lista, haga clic en la casilla Select to Remove Name (Seleccionar nombre para eliminarlo) de esa fila y, a continuación, haga clic en el botón Remove checked item(s) (Eliminar elementos marcados)

• Seleccione un objetivo como referencia para el análisis de expresión genética haciendo clic en el recuadro de la columna Reference (Referencia) junto al Name (nombre) del objetivo

• Seleccione un objetivo como una muestra de control para el análisis de expresión genética haciendo clic en el recuadro de la columna Control junto al nombre de la muestra

Opción de agrupamiento de nombres de muestras

Al cargar Collection Names (Nombres de colección) en los pocillos, se pueden analizar las muestras en una de las cuatro configuraciones definidas por Sample Name Grouping Option (Opción de agrupamiento de nombres de muestras). Estas opciones están disponibles en el menú desplegable de la pestaña Experiment Settings (Configuración del experimento).

• Target vs. Sample (Objetivo frente a muestra). En los cálculos de la expresión genética sólo se utiliza el nombre de la muestra del pocillo

• Target vs. Collection (Objetivo frente a colección). En los cálculos de la expresión genética sólo se utiliza el nombre de colección de pocillos

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• Target vs. Sample_Collection (Objetivo frente a muestra_colección). Se combinan el nombre de la muestra y de la colección para formar un solo nombre, que se utiliza en los cálculos

• Target vs. Collection_Sample (Objetivo frente a colección_muestra). Se combinan el nombre de la colección y de la muestra para formar un solo nombre, que se utiliza en los cálculos

Mostrar configuración del análisis en configuración del experimentoHaga clic en la casilla Show Analysis Settings (Mostrar configuración del análisis) de la ventana Experiment Settings (Configuración del experimento) para ver o cambiar los parámetros de análisis que se aplican en la pestaña Gene Expression (Expresión genética):

• Haga clic en una celda de la columna Color para cambiar el color de los objetivos que se muestran en el gráfico de expresión genética

• Introduzca un número para la eficacia de un objetivo. El software calculará la eficacia relativa de un objetivo mediante la función Auto Efficiency (Eficacia automática) si los datos de un objetivo incluyen una curva estándar. De forma alternativa, puede escribir una eficacia determinada con anterioridad

En la Figura 70 se ilustra la eficacia de todos los objetivos, que aparece al seleccionar la opción Auto Efficiency (Eficacia automática).

Figura 70. Pestaña de objetivos de la ventana de configuración del experimento con la pestaña de configuración del análisis seleccionada.

Para configurar una muestra en la pestaña Samples (Muestras):

• Haga clic en un color de la columna Color para cambiar el color de las muestras que se muestran en el gráfico de expresión genética

• Haga clic en una casilla de la columna Show Chart (Mostrar gráfico) para que la muestra aparezca en el gráfico de expresión genética con el color seleccionado en la columna Color

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Estudio genéticoCree un estudio genético para comparar datos de expresión genética de uno o varios experimentos de PCR en tiempo real utilizando un calibrador entre ejecuciones para normalizar los datos entre los experimentos. Cree un estudio genético añadiendo datos de uno o varios archivos (extensión .pcrd) al estudio en cuestión; el software los agrupará en un único archivo (extensión .mgxd).

NOTA: Para poder crear un estudio genético, lo datos para la expresión genética deben incluir una muestra común en todos los archivos de datos. El software utiliza la muestra común para normalizar los datos entre los experimentos. Seleccione los nombres de las muestras seleccionadas en la ventana Experiment Settings (Configuración del experimento) (página 46).

NOTA: El número máximo de muestras que puede analizar en un estudio genético está limitado por el tamaño de la memoria RAM y la memoria virtual del ordenador.

Calibración entre ejecuciones del estudio genéticoTodos los datos contenidos en el estudio genético están normalizados mediante el calibrador entre ejecuciones para calcular el valor de C(t) medio más pequeño. Cuando los archivos de datos del estudio genético incluyen más de un calibrador entre ejecuciones, el calibrador con el valor de C(t) medio más pequeño se convierte en el calibrador entre ejecuciones dominante. El calibrador dominante se utiliza para ajustar todos los valores de C(t) en el estudio genético.

Para encontrar el calibrador entre ejecuciones, el software calcula la media de los valores de C(t) de todos los calibradores entre ejecuciones de un objetivo determinado (gen) y utiliza un algoritmo de varios niveles para determinar el calibrador entre ejecuciones dominante dentro de todos los datos. El algoritmo para encontrar el calibrador entre ejecuciones incluye la siguiente jerarquía:

1. El calibrador dominante se establece en el objetivo con el número mayor de grupos de replicados en una comparación de parejas dada.

2. Si varios objetivos tienen el mismo número de grupos de replicados, el calibrador dominante será el objetivo con el rango de valores de C(t) más pequeño en las comparaciones de parejas. El rango se examina comparando el valor absoluto de la diferencia entre el C(t) máximo y mínimo para los calibradores entre ejecuciones de un objetivo determinado.

3. Si hay varios objetivos con un rango idéntico de valores de C(t), se elige como calibrador dominante el que tenga el objetivo con el menor valor absoluto de C(t) medio de las muestras del calibrador entre ejecuciones elegibles.

4. Si hay varios objetivos con valores absolutos idénticos de C(t) medio, el calibrador dominante será el grupo de replicados con el menor C(t).

NOTA: El primer archivo de datos que se importe al estudio genético servirá siempre como archivo central en las comparaciones de parejas durante la calibración entre ejecuciones.

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Ventana del estudio genéticoLa ventana Gene Study (Estudio genético) contiene dos pestañas:

• Pestaña Study Setup (Configuración del estudio). Haga clic en esta pestaña para gestionar los experimentos de un estudio genético. Aunque añada o elimine archivos de datos de un estudio genético, no se modifican los datos originales de ese archivo

• Pestaña Study Analysis (Análisis del estudio). Haga clic en esta pestaña para ver los datos de expresión genética de los experimentos combinados

La Figura 71 muestra la ventana de estudio genético.

Figura 71. Ventana de estudio genético.

Pestaña Study Setup (Configuración del estudio)Antes de importar datos a un estudio genético, realice las siguientes acciones en la ventana Data Analysis (Análisis de datos):

• Compruebe que las muestras que contienen el mismo contenido tienen el mismo nombre. En un estudio genético, el software asume que los pocillos con el mismo nombre de muestra o de objetivo contienen las mismas muestras

• Ajuste los valores basales y de umbral (C(t)) en la pestaña Quantitation (Cuantificación) para optimizar los datos de cada experimento antes de añadirlos a un estudio genético

• Seleccione el grupo de pocillos que desea incluir en el estudio genético

La pestaña de configuración del estudio (Figura 71) muestra una lista de todos los experimentos del estudio genético.

• Añadir experimentos. Haga clic en el botón Add Data Files (Añadir archivos de datos) para seleccionar un archivo desde una ventana del explorador. Para añadir experimentos de forma rápida a un estudio genético, arrastre los archivos de datos (extensión .pcrd) a la ventana Gene Study (Estudio genético)

• Eliminar experimentos de este estudio genético. Seleccione uno o varios archivos de la lista y haga clic en Remove (Eliminar)

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• Añadir notas acerca del estudio genético. Escriba los comentarios que desee añadir sobre los archivos y el análisis de este estudio genético en el cuadro Notes (Notas).

La pestaña de configuración del estudio muestra los archivos de datos del estudio genético, como se describe en la Tabla 26.

Pestaña de análisis del estudioLa pestaña de análisis del estudio muestra los datos de todos los experimentos añadidos al estudio genético. Abra esta pestaña para optimizar los datos y seleccionar estas opciones para el gráfico de expresión genética:

• Mode (Modo). Seleccione Normalized Expression (C(t)) (Expresión normalizada) o Relative Quantity (C(t)) (Cantidad relativa)

• Graph Data (Gráfico de datos). Seleccione Relative to normal (Relativos a los normales) o Relative to control (Relativos al control) en el gráfico

• x-axis options (Opciones del eje X). Le permite seleccionar las etiquetas del eje X del gráfico, incluido Sample (Muestra) o Target (Objetivo)

• y-axis options (Opciones del eje Y). Le permite cambiar las etiquetas del eje Y del gráfico, incluido Linear (Lineal), Log 2 (Logaritmo 2) o Log 10 (Logaritmo 10)

• Scaling Options (Opciones de escala). Elija entre el valor Highest (más alto), el valor Lowest (más bajo) o deje los datos Unscaled (sin escala). Esta opción solamente está disponible cuando las muestras no contienen controles

• Graph Error (Error del gráfico). Le permite seleccionar el multiplicador para las barras de desviación típica del gráfico entre ±1, 2 o 3

• Botón Experiment Settings (Configuración del experimento). Elija las opciones de visualización de los objetivos y las muestras de la ventana de configuración del experimento

• Casilla de verificación Show Details (Mostrar detalles). Haga clic en Show Details (Mostrar detalles) para añadir más columnas a los datos del gráfico

Tabla 26. Pestaña de configuración del estudio en la ventana de estudio genético.

Título de la columna Descripción

File Name (Nombre de archivo)

Nombre del archivo de datos del experimento (extensión .pcrd)

File Folder (Carpeta de archivos)

Directorio en el que se guardan los archivos de datos de cada experimento del estudio genético

Date Created (Fecha de creación)

Fecha en la que se obtuvieron los datos de la ejecución

Well Group Name (Nombre de grupo de pocillos)

Nombre del grupo de pocillos que se seleccionó cuando se añadió el archivo al estudio genético

CONSEJO: para analizar un grupo de pocillos en el estudio genético, ese grupo debe estar seleccionado en la ventana de análisis de datos antes de importar el archivo en el estudio genético.

Step (Paso) Paso del protocolo que incluyó la lectura de la placa para obtener los datos de PCR en tiempo real

Grid View (Vista de cuadrícula)

Abre un mapa de la placa con los datos de cada experimento incluido en el estudio genético

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Al resaltar una muestra en el gráfico de expresión genética, se resalta la celda correspondiente en la hoja de cálculo que hay debajo del gráfico (Figura 72).

Figura 72. Pestaña de análisis del estudio en la ventana de estudio genético.

Hoja de cálculo de los datos del estudio genéticoLa hoja de cálculo de la ventana de estudio genético muestra información sobre cada objetivo y cada muestra del estudio genético (Figura 72).

La Tabla 27 describe la información que se muestra en la hoja de cálculo de estudio genético.

Tabla 27. Información de la hoja de cálculo en la pestaña de análisis del estudio.


Target (Objetivo) Nombre del objetivo (gen amplificado) seleccionado en la ventana de configuración del experimento

Sample (Muestra) Nombre de la muestra seleccionada en la ventana de configuración del experimento

Ctrl Muestra de control cuando el nombre de la muestra se define como un control en la ventana de configuración del experimento

Expression (Expresión) Normalized Gene Expression (C(t)) (Expresión genética normalizada) o Relative Quantity (C(t)) (Cantidad relativa), en función del modo seleccionado

Expression SEM (o SD) (SEM o SD de la expresión)

Error típico de la media o desviación típica, en función de la opción seleccionada

Corrected Expression SEM (o SD) (SEM o SD corregida de la expresión)

Valor corregido del error típico de la media (SEM) o desviación típica (SD) de la expresión relativa, en función de la opción seleccionada

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Mostrar datos detalladosHaga clic en la casilla de verificación Show Details (Mostrar detalles) para ver información adicional. La hoja de cálculo añade la información en las columnas que se enumeran en Tabla 28.

Ventana sobre el informe del estudio genéticoAbra la ventana Gene Study Report (Informe del estudio genético) para organizar los datos del estudio genético en un informe. Para crear un informe de estudio genético, siga estos pasos:

1. Ajuste los datos y los gráficos del informe de estudio genético como precise antes de crear un informe.

2. Seleccione Tools > Reports (Herramientas > Informes) para abrir la ventana Gene Study Report (Informe del estudio genético).

3. Haga clic en las casillas de verificación de la lista de opciones del informe para seleccionar y eliminar opciones de visualización de los datos.

Mean (C(t)) (Media de C(t)) Media del ciclo de umbral

C(t) SEM (o SD) (SEM o SD de C(t))

Error típico de la media o desviación típica del ciclo de umbral, en función de la opción seleccionada

Tabla 28. Información añadida a la hoja de cálculo cuando se selecciona la opción de mostrar detalles.


Data Set (Conjunto de datos) Datos de fluorescencia de un fluoróforo en un archivo de datos

Relative Quantity (Cantidad relativa)

Cálculo de la cantidad relativa de las muestras

Relative Quantity SD (Desviación típica de la cantidad relativa)

Cálculo de la desviación típica de la cantidad relativa

Corrected Relative Quantity SD (Desviación típica de la cantidad relativa corregida)

Cálculo de la desviación típica de la cantidad relativa corregida

Unscaled Expression (Expresión sin escala)

Cálculo de la expresión sin escala

Unscaled expression SD (Desviación típica de la expresión sin escala)

Cálculo de la desviación típica de la expresión sin escala

Corrected Unscaled expression SD (Desviación típica de la expresión sin escala corregida)

Cálculo de la desviación típica corregida de la expresión sin escala

Expression (Expresión) Expresión relativa

Wells (Pocillos) Número del pocillo de la placa

Tabla 27. Información de la hoja de cálculo en la pestaña de análisis del estudio. (cont.)


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4. Haga clic en el botón Update Report (Actualizar informe) para actualizar el panel de vista previa del informe. Este panel muestra una vista del informe.

5. Imprima o guarde el informe. Haga clic en el botón Imprimir de la barra de herramientas para imprimir el informe actual. Seleccione File > Save (Archivo > Guardar) para guardar el informe como un archivo con formato PDF (archivo de Adobe Acrobat Reader), MHT (documento de Microsoft) o MHTML (documento de Microsoft) y seleccione la ubicación en la que desee guardarlo. Seleccione File > Save As (Archivo > Guardar como) para guardar el informe con un nombre nuevo o en otra ubicación.

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10 Usuarios y preferenciasLea este capítulo para obtener más información sobre cómo administrar los usuarios del software y sus preferencias:

• Inicio de sesión o selección de usuario (a continuación)

• Ventana de preferencias del usuario (página 106)

• Configuración de notificaciones por correo electrónico (página 107)

• Administración de usuarios (página 113)

Inicio de sesión o selección de usuarioEl software CFX Manager™ administra varios usuarios y sus preferencias. El usuario actual que ha iniciado sesión en el software se muestra en la parte superior de la ventana principal del software (Figura 73).

Figura 73. Nombre del usuario mostrado.

El software CFX Manager controla quién inicia sesión en el software mediante el cuadro de diálogo Login (Inicio de sesión) (Figura 74). Si en la ventana User Administration (Administración de usuarios) existen dos o más usuarios, cuando se inicia el software se abre automáticamente el cuadro de diálogo Login (Inicio de sesión).

Figura 74. Cuadro de diálogo de inicio de sesión.

Inicie sesión en el software o cambie de usuario siguiendo estos pasos:

1. Abra el cuadro de diálogo Login (Inicio de sesión) si todavía no está abierto; para ello, haga clic en Select User (Seleccionar usuario) en la barra de herramientas o seleccione User > Select User (Usuario > Seleccionar usuario) en la barra de menús.

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Usuarios y preferencias

2. Haga clic en un nombre de la lista desplegable User Name (Nombre de usuario). El nombre predeterminado es “Admin” (administrador).

3. Escriba una contraseña en el cuadro Password (Contraseña).

4. Haga clic en OK (Aceptar) para cerrar el cuadro de diálogo de inicio de sesión y abrir el software.

5. Para añadir un usuario y contraseña nuevos, póngase en contacto con su administrador del software.

Cambiar una contraseñaPara cambiar una contraseña, siga estos pasos:

1. Seleccione User > Change Password (Usuario > Cambiar contraseña) en el menú de la ventana principal del software para abrir el cuadro de diálogo Change Password (Cambiar contraseña).

2. Escriba la contraseña anterior en el cuadro Old Password (Contraseña anterior).

3. Escriba la contraseña nueva en los cuadros New Password (Contraseña nueva) y Confirm New Password (Confirmar contraseña nueva).

4. Haga clic en OK (Aceptar) para confirmar el cambio.

Ventana de preferencias del usuarioEl software CFX Manager registra las preferencias de cada usuario que inicia sesión en el software. Para cambiar de las preferencias del usuario, abra la ventana User Preferences (Preferencias del usuario) mediante alguno de estos métodos:

• Haga clic en el botón User Preferences (Preferencias del usuario) en la barra de herramientas de la ventana principal del software

• Seleccione User > User Preferences (Usuario > Preferencias del usuario) en la barra de menús de la ventana principal del software

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• Haga clic en una de las pestañas (Figura 75) para ver y cambiar las preferencias

Figura 75. Ventana de preferencias del usuario con pestañas.

Pestaña de correo electrónicoSeleccione la pestaña Email (Correo electrónico) (Figura 75) para introducir las direcciones de correo electrónico que desea que reciban confirmación de la realización de una ejecución. El software puede enviar un archivo de datos o un informe adjunto con el correo electrónico cuando se marcan las casillas de verificación que se encuentran junto a estas opciones.

CONFIGURACIÓN DE NOTIFICACIONES POR CORREO ELECTRÓNICO

Haga clic en el botón Configure Outgoing Email (Configurar correo saliente) para abrir la ventana Options (Opciones) (Figura 76) para configurar el servidor SMTP y enviar un correo de prueba desde el ordenador. Introduzca los siguientes datos:

• SMTP Server Name (Nombre del servidor SMTP). El nombre del servidor SMTP que le haya proporcionado su proveedor de servicios de Internet

• Port (Puerto). El número de puerto del servidor SMTP que le haya proporcionado su proveedor de servicios de Internet; suele ser 25

• Use SSL (Utilizar SSL). Especifique si desea utilizar el protocolo de Capa de Conexión Segura. Algunos servidores SMTP requieren que se utilice este protocolo y otros no

• Use Default “From” Address (Utilizar dirección de remite predeterminada). Esta opción normalmente se puede dejar marcada (estado predeterminado). No obstante, algunos servidores SMTP requieren que todo el correo enviado tenga una dirección de remite perteneciente a un determinado dominio, es decir, <nombre>@SuEmpresa.com. Si este fuera el caso, deje sin marcar esta casilla y escriba una dirección de remite válida en el campo “From” (De)

• Authentication Required (Autenticación necesaria). Muchos servidores SMTP requieren autenticación. Si ese es su caso, esta casilla debe estar marcada y es necesario introducir un nombre de usuario y una contraseña en los campos User Name (Nombre de usuario) y Password (Contraseña), respectivamente

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• Test email (Correo de prueba). Para probar la configuración del correo electrónico, introduzca una o varias direcciones de correo en el cuadro de texto Test Email Address (Direcciones para correo de prueba). Si escribe varias direcciones, sepárelas con una coma. A continuación, haga clic en el botón Test Email (Correo de prueba)

Figura 76. Opciones para configurar el correo electrónico.

NOTA: Algunos servidores de SMTP no admiten archivos adjuntos y otros sí los admiten, pero con determinadas restricciones de tamaño. Si utiliza el software CFX Manager para enviar por correo electrónico archivos de datos o informes, le recomendamos que compruebe si su servidor admite el envío de archivos adjuntos marcando la casilla Test Attachment (Probar adjuntos) y establezca el tamaño de los archivos adjuntos en MB en el campo Attachment Size (Tamaño del archivo adjunto) con un máximo de 5 megabytes (MB) o más.

Pestaña ArchivosSeleccione la pestaña Files (Archivos) para ver una lista de las ubicaciones predeterminadas para abrir y guardar archivos. Haga clic en el botón “...” que se encuentra a la derecha de cada cuadro para abrir una ventana del explorador y buscar una carpeta.

• Default folder for file creation (Carpeta predeterminada para la creación de archivos). Seleccione una carpeta predeterminada en la que desea guardar los archivos nuevos. Seleccione una ubicación para cada tipo de archivo: Protocol (Protocolo), Plate (Placa), Data (Datos) o Gene Study (Estudio genético)

• File Selection for Experiment Setup (Selección de archivos para la configuración del experimento). Seleccione los archivos de protocolo y placa predeterminados que aparecen cuando abre la ventana Experiment Setup (Configuración del experimento)

• Data File Prefix (Prefijo de los archivos de datos). Defina el texto inicial del nombre de los archivos de datos

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Pestaña ProtocoloSeleccione la pestaña Protocol (Protocolo) en la ventana User Preferences (Preferencias del usuario) para especificar la configuración predeterminada de un archivo nuevo de protocolo en la ventana Protocol Editor (Editor de protocolos):

• Protocol Editor (Editor de protocolos). Establezca la configuración predeterminada que aparece en el editor de protocolos. Seleccione un volumen de muestra predeterminado para describir el volumen de las muestras de los pocillos y seleccione una temperatura de apagado de la tapa

• Protocol AutoWriter (Escritor automático de protocolos). Le permite seleccionar la configuración predeterminada que aparece en el escritor automático de protocolos

Pestaña PlacaSeleccione la pestaña Plate (Placa) en la ventana User Preferences (Preferencias del usuario) (Figura 77) para especificar la configuración predeterminada de un archivo nuevo de placa en la ventana Plate Editor (Editor de placas):

• Plate Type (Tipo de placa). Seleccione el tipo de placa predeterminado

• Plate Size (Tamaño de placa). Seleccione el tamaño de placa predeterminado

• Units (Unidades). Seleccione las unidades utilizadas para describir la concentración de la plantilla inicial de los pocillos que contienen estándares

• Scientific Notation (Notación científica). Seleccione la notación científica para ver las unidades de concentración en dicha notación

• Scan Mode (Modo de exploración). Seleccione un modo de exploración predeterminado

• Fluorophores (Fluoróforos). Haga clic en las casillas de verificación para seleccionar los fluoróforos predeterminados que aparecen en los controles de carga de los pocillos de la ventana Plate Editor (Editor de placas)

• Libraries (Bibliotecas). Introduzca el nombre de los objetivos y las muestras utilizados en los experimentos. Estos nombres aparecen en las listas de la pestaña Targets

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(Objetivos) y Samples (Muestras) de la ventana Experiment Settings (Configuración del experimento).

Figura 77. Pestaña Placa en la ventana de preferencias del usuario.

Pestaña Análisis de datosSeleccione la pestaña Data Analysis (Análisis de datos) en la ventana User Preferences (Preferencias del usuario) para especificar la configuración predeterminada de los datos que aparecen en la ventana Data Analysis (Análisis de datos).

Figura 78. Pestaña de análisis de datos en la ventana de preferencias del usuario.

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5. Para los datos de cuantificación, elija las siguientes opciones:

• Analysis Mode (Modo de análisis). Seleccione el método predeterminado de revestimiento de la base para el modo de análisis. Elija entre Baseline Subtracted Curve Fit (Ajuste de curva con sustracción basal), No Baseline Subtraction (Sin sustracción basal) o Baseline Subtracted (Sustracción basal)

• C(t) Determination Mode (Modo de determinación de C(t)). Seleccione entre el modo Regression (Regresión) o Single Threshold (Umbral sencillo) para determinar cómo se calculan los valores de C(t) para cada trazo de fluorescencia

• Log View (Vista logarítmica). Seleccione On (Activar) para mostrar un gráfico semilogarítmico de los datos de amplificación. Seleccione Off (Desactivar) para mostrar un gráfico lineal

Para los datos de discriminación alélica, elija las siguientes opciones:

• Display Mode (Modo de visualización). Seleccione RFU para ver los datos como un gráfico de las RFU o seleccione Threshold Cycle (Ciclo de umbral) para mostrar un gráfico de los ciclos de umbral

• Normalize Data (Normalizar datos). Este opción solamente está disponible cuando se selecciona RFU. Seleccione No para mostrar datos no normalizados. Seleccione Yes (Sí) para normalizar los datos de la muestra de control

Para los datos de punto final, elija las siguientes opciones: Seleccione el número de ciclos finales con los que extraer la media al realizar los cálculos de punto final

• PCR. Introduzca el número de ciclos de PCR para extraer la media de los ciclos finales para datos de cuantificación (el valor predeterminado es 5)

• End Point Only Run (Ejecución sólo de punto final). Introduzca el número de ciclos de ejecución sólo de punto final con los que extraer la media de los ciclos finales para datos de punto final (el valor predeterminado es 2)

Pestaña de expresión genéticaSeleccione la pestaña Gene Expression (Expresión genética) en la ventana User Preferences (Preferencias del usuario) para especificar la configuración predeterminada de un archivo nuevo de datos de expresión genética:

• Relative to (Relativo a). Seleccione un control o cero. Para que el gráfico de los datos de la expresión genética comience en 1 (relativo al control), seleccione Control. Cuando asigna una muestra de control en la ventana de configuración del experimento, el software calcula de forma predeterminada los datos en relación a ese control. Seleccione Relative to zero (Relativo a cero) para ordenar al software que ignore el control, que es la opción predeterminada cuando no se ha asignado una muestra de control en la ventana de configuración del experimento

• X-Axis (Eje X). Traza el gráfico del objetivo o de la muestra en el eje X

• Y-Axis (Eje Y). Elija entre las opciones de escala Linear (Lineal), Log 2 (Logaritmo 2) o Log 10 (Logaritmo 10) para el eje Y del gráfico

• Scaling (Escala). Seleccione una opción de escala para el gráfico. Puede dejar el gráfico sin escala; o bien elegir una opción de escala entre Highest value (Al valor más alto) y Lowest value (Al valor más bajo)

• Method (Método). Establezca el modo de análisis predeterminado, como expresión normalizada (Ct) o expresión relativa (Ct)

• Error Bar (Barra de error). Seleccione entre Std Dev. para desviación típica o Std. Error Mean para el error típico de la media

• Std Devs (Desviación típica). Seleccione el multiplicador de desviación típica para trazar las barras de error. El valor predeterminado es 1, pero puede cambiarlo a 2 o 3

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Pestaña sobre control de calidadSeleccione la pestaña QC (Control de calidad) en la ventana User Preferences (Preferencias del usuario) para especificar las reglas de control de calidad que hay que aplicar a los datos del módulo de análisis de datos. El software valida los datos en función de las pruebas habilitadas y los valores asignados (página 112).

Figura 79. Pestaña de control de calidad en preferencias del usuario.

Especifique si desea añadir valores de corte y habilitar las siguientes reglas de control de calidad:

• Negative control with a C(t) less than XX (Control negativo con un C(t) inferior a XX). Introduzca un valor de corte de C(t)

• NTC (no template control) with a C(t) less than XX (Sin control de plantilla con un C(t) inferior a XX). Introduzca un valor de corte de C(t)

• NRT (no reverse transcriptase control) with a C(t) less than XX (Sin control de transcriptasa inversa con un C(t) inferior a XX). Introduzca un valor de corte de C(t).

• Positive control with a C(t) greater than XX (Control positivo con un C(t) superior a XX). Introduzca un valor de corte de C(t)

• Unknown without a C(t) (Desconocido sin C(t))

• Standard without a C(t) (Estándar sin C(t))

• Efficiency greater than XX (Eficacia superior a XX). Introduzca un valor de corte de eficacia que se calcula para la curva estándar

• Efficiency less than XX (Eficacia inferior a XX). Introduzca un valor de corte de eficacia que se calcula para la curva estándar

• Std Curve R^2 less than XX (Curva estándar R^2 inferior a XX). Introduzca un valor de corte R^2 para la curva estándar

• Replicate group C(t) Std Dev greater than XX (Desviación típica de C(t) de grupo de replicados superior a XX). Introduzca una desviación típica del valor de corte que se calcula para el grupo de replicados

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Administración de usuariosAbra la ventana User Administration (Administración de usuarios) en la ventana principal del software:

• Seleccione Users > User Administration (Usuarios > Administración de usuarios)

• Haga clic en el botón User Administration (Administración de usuarios) en la barra de menús

Si inicia sesión como administrador, abra la ventana User Administration (Administración de usuarios) para administrar los usuarios y sus derechos:

• Manage Users (Administrar usuarios). Añada o elimine usuarios y asigne a cada uno una función (Role)

• Manage Rights (Administrar derechos). Cambie los derechos para las funciones de los usuarios: Principal, Operator (Operador) o Guest (Invitado)

NOTA: Esta ventana sólo la pueden editar los usuarios que sean administradores. Los demás usuarios únicamente la pueden ver.

Para asignar una función a cada usuario, selecciónela de la lista de funciones en la ventana User Administration (Administración de usuarios) (Figura 80). En este ejemplo, el usuario Guest (Invitado) está autorizado para guardar archivos.

Figura 80. Ventana de administración de usuarios con tres usuarios.

Añadir y eliminar usuarios del softwareLos administradores del software son los únicos que pueden añadir y eliminar usuarios. Para añadir usuarios del software en el panel Manage Users (Administrar Usuarios), siga estos pasos:

1. Escriba un nombre de usuario en el campo User Name (Nombre de usuario) para el usuario nuevo.

2. Seleccione una función en el campo Role. Las funciones restringen los derechos de cada usuario. La función predeterminada es Principal.

3. (Opcional) Introduzca un nombre completo y una contraseña para el usuario nuevo en los campos Full Name (Nombre completo) y Password (Contraseña).

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4. Haga clic en OK (Aceptar) para abrir un cuadro de diálogo y confirmar que desea cerrar la ventana.

5. Haga clic en Yes (Sí) para cerrar el cuadro de diálogo y la ventana.

Para eliminar a un usuario del software, siga estos pasos:

1. En el panel Manage Users (Administrar usuarios), haga clic en la casilla Delete (Eliminar) de cada usuario de la lista que desee eliminar.



NOTA: La lista de usuarios del software siempre debe incluir un administrador.

Asignar derechos a funciones de usuariosLa ventana de administración de usuarios proporciona acceso a las funciones y los derechos de los usuarios. El software incluye estas cuatro funciones:

• Administrator (Administrador) (Obligatoria). Todos los administradores tienen todos los derechos. Estos derechos no se pueden modificar. El administrador también puede añadir o eliminar usuarios del software y cambiar los derechos de cada función

• Principal. De forma predeterminada, los usuarios principales tienen todos los derechos

• Operator (Operador). De forma predeterminada, los operadores tienen todos los derechos, excepto omitir ciclos y crear un estudio genético

• Guest (Invitado). De forma predeterminada, los invitados no tienen derechos y, por tanto, sólo pueden leer archivos

Para especificar los derechos de cada función, siga estos pasos. Los administradores del software son los únicos que pueden cambiar los derechos de las funciones:

1. En el panel Manage Rights (Administrar derechos), haga clic en las casillas debajo de las funciones para añadir o eliminar los derechos. Haga clic en uno o varios derechos de la lista. Para cambiar todos los derechos de todas las funciones a sus valores predeterminados, haga clic en Restore Default Rights (Restaurar derechos predeterminados).



Para ver las funciones y los derechos que se encuentran establecidos actualmente, seleccione User > User Administration (Usuario > Administración de usuarios). Póngase en contacto con un administrador del software para que modifique la configuración, los derechos y las funciones de los usuarios que aparecen en la ventana de administración de usuarios. Los usuarios de tipo Principal, Operator (Operador) o Guest (Invitado) solamente pueden ver sus propias configuraciones, derechos y funciones.

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11 Recursos

Lea este capítulo para obtener más información sobre los recursos para el sistema de detección CFX96™ en tiempo real:

• Asistente de calibración (a continuación)

• Mantenimiento del instrumento (página 117)

• Registro de la aplicación (página 119)

• Resolución de problemas (página 120)

• Especificaciones técnicas (página 122)

• Referencias (página 124)

Asistente de calibraciónEl sistema CFX96 viene calibrado de fábrica para los fluoróforos utilizados con mayor frecuencia en placas de pocillos transparentes y blancos (Tabla 29).

El sistema CFX96 también incluye un canal dedicado a la química de FRET. Este canal no necesita calibración de tinturas específicas.

Para abrir el asistente de calibración y calibrar el sistema CFX96 mediante PCR en tiempo real:

1. Seleccione un instrumento en el panel Detected Instruments (Instrumentos detectados).

2. Seleccione Tool > Calibration Wizard (Herramientas > Asistente de calibración) para abrir la ventana y calibrar combinaciones de tinturas y placas nuevas (Figura 81).

Tabla 29. Fluoróforos calibrados de fábrica y canales.

Fluoróforos Canal

FAM, SYBR® Green I 1

VIC, HEX, TET, CAL Gold Fluor 540 2

ROX, Texas Red, CAL Fluor Red 610 3

Cy5, Quasar 670 4

Quasar 705 5

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Recursos

La Figura 81 muestra un ejemplo de ventana de calibración de tinturas.

Figura 81. Ventana del asistente de calibración de tinturas.

Calibración del sistema CFX96Para calibrar el sistema CFX96 en la ventana de calibración de tinturas:

1. En el panel Calibrate New (Calibrar nuevo) o Existing Fluorophores (Fluoróforos existentes), seleccione el fluoróforo que desea calibrar en la lista desplegable. Si el nombre del fluoróforo no aparece en la lista, escríbalo en el cuadro para añadirlo a la lista.

2. Seleccione el tipo de placa. Si el tipo de placa no aparece en la lista, escriba el nombre en el cuadro para añadirlo.

3. Seleccione un canal para el fluoróforo.

4. Haga clic en Add to Plate (Añadir a la placa) para agregar el fluoróforo. Para vaciar la placa, haga clic en Clear Plate (Vaciar placa) y se eliminarán todos los fluoróforos.

5. (Opcional) Repita los pasos comprendidos entre el 1 y el 6 para añadir cada uno de los fluoróforos que prevé calibrar para la placa.

6. Cuando termine de añadir fluoróforos, haga clic en View Plate (Ver placa) para abrir la pantalla Dye Plate (Placa de tinturas). Utilice esta ventana como guía para cargar tinturas en la placa.

7. Prepare una placa de 96 pocillos para la calibración de una tintura; para ello, pipetee la solución de tintura en cada pocillo siguiendo el patrón que se muestra en la pantalla Pure Dye Plate (Placa de tintura pura). Llene 4 pocillos con 50 μl (para una placa de 96 pocillos) de solución de tintura de 300 nM por cada fluoróforo. Observe que al menos la mitad de la placa contiene pocillos vacíos.

8. Selle la placa mediante el método de sellado que empleará en su experimento.

116


9. Coloque la placa de calibración en el bloque y cierre la tapa. Haga clic en Calibrate (Calibrar) y, a continuación, en OK (Aceptar) para confirmar que la placa se encuentra en el bloque.

10.Cuando el software CFX Manager™ finalice la calibración, aparecerá un cuadro de diálogo. Haga clic en Yes (Sí) para terminar la calibración y abrir la pantalla Dye Calibration Viewer (Visor del calibrador de tinturas).

11.Haga clic en OK (Aceptar) para cerrar la ventana.

Mantenimiento del instrumentoEl sistema CFX96 incluye un sistema de transmisión óptica sensible y un bloque de muestras que se deben calentar y enfriar en muy poco tiempo. La contaminación de estos componentes puede interferir con el termociclado y la recopilación de datos.

¡ADVERTENCIA! Nunca permita que se ejecute una reacción con la tapa abierta o con fugas. Los reactivos se podrían escapar y manchar el bloque, la tapa interna y el cabezal óptico del sistema de transmisión. Un exceso de suciedad puede atenuar la señal y la contaminación de la fluorescencia puede crear una señal de fondo excesiva. El sistema de transmisión óptica solamente lo pueden limpiar ingenieros de servicio de Bio-Rad debidamente formados.

Evite la contaminación del sistema CFX96 mediante las siguientes sugerencias:

• Limpie siempre el exterior de cualquier contenedor antes de colocarlo en el bloque

• Nunca ejecute una reacción con el sello abierto, suelto, perforado o dañado de cualquier forma, pues se podría contaminar el bloque, la tapa interna y el sistema óptico

• Nunca ejecute una reacción de PCR o de PCR en tiempo real con reactivos volátiles que pudieran explotar y contaminar el bloque, la tapa interna y el sistema óptico

• Limpie el bloque y la tapa interna de forma regular para evitar la acumulación de suciedad, materiales biopeligrosos o soluciones fluorescentes (página 117)

• Nunca limpie ni toque el sistema óptico que se encuentra detrás de los orificios de la placa calefactada de la tapa interna (Figura 82 en la página 118)

• Limpie la tapa externa y la base del termociclador C1000™ de forma periódica (si desea obtener más información, consulte el manual de instrucciones del termociclador C1000)

Limpieza del módulo de reacción ópticaEl bloque de la reacción óptica y la base del termociclador C1000 se deben limpiar de forma periódica para eliminar cualquier resto o suciedad que pudiera interferir con su correcto funcionamiento. Limpie los restos y los líquidos derramados en cuanto los detecte con un paño suave y sin pelusas que esté humedecido con agua. La limpieza del instrumento permite que éste funcione con precisión. Si desea obtener más información sobre cómo limpiar la base C1000, consulte el manual de instrucciones del termociclador C1000.

¡ADVERTENCIA! Nunca utilice soluciones de limpieza que sean corrosivas para el aluminio. Evite arañar la superficie del hueco para el módulo de reacción C1000. Las arañazos y los daños en esta superficie interfieren con el control térmico preciso.

117

Recursos

¡ADVERTENCIA! Nunca vierta agua u otras soluciones en el hueco para el módulo de reacción C1000. Los componentes mojados pueden provocar una descarga eléctrica cuando se enchufa el termociclador.

Limpie el módulo de reacción óptica del sistema CFX96 en cuanto detecte restos, suciedad o contaminación en el bloque o en la tapa interna. Cualquier suciedad puede afectar a la capacidad del bloque para cambiar de temperatura rápidamente y recopilar datos de fluorescencia precisos. Para limpiar el módulo de reacción, siga estas pautas: Siga estas sugerencias de limpieza:

¡ADVERTENCIA! Para evitar el riesgo de que se produzca una descarga eléctrica, retire siempre el módulo de reacción de la base del termociclador o desenchufe la base antes de limpiar el instrumento.

¡ADVERTENCIA! Nunca toque ni permita que ninguna solución toque el sistema óptico que se encuentra detrás de los orificios de la placa calefactada de la tapa interna (Figura 82).

Figura 82. Orificios de la placa calefactada en la tapa interna.

• Limpie la superficie externa. Utilice un paño suave o un pañuelo de papel húmedo para limpiar los derrames de la carcasa exterior. Si fuera necesario, utilice una solución de jabón suave y enjuague la superficie con un paño húmedo. Limpie la tapa para evitar la corrosión

• Limpie las aletas de refrigeración. Elimine el polvo con un cepillo blando o un paño suave. Retire el exceso de polvo que se encuentre muy incrustado en las rejillas de ventilación con un aspirador. Utilice agua y un paño suave y sin pelusas para limpiar los restos que se hayan adherido a las aletas. Evite arañar la superficie. Si fuera necesario, utilice una solución de jabón suave y enjuague bien para eliminar por completo los residuos. La limpieza de las aletas mejora el calentamiento y el enfriamiento precisos de las muestras

NOTA: Nunca utilice soluciones de limpieza que sean corrosivas para el aluminio, como la lejía o los limpiadores abrasivos.

• No se recomienda el uso de aceite en los pocillos. Si se utilizara aceite, los pocillos se deben limpiar a fondo y con frecuencia. Retire el aceite cuando esté descolorido o sucio. Utilice una solución de etanol al 95% para limpiar el aceite. No permita que el aceite se acumule en el bloque

Nunca toque nada detrás de estos orificios.

Bloque (96 pocillos)

118


• Limpie los pocillos del bloque. Limpie los derrames inmediatamente para impedir que se sequen. Utilice pipetas de plástico desechables con agua (recomendado), etanol al 95% o una dilución de 1:100 de lejía en agua. Utilice también un paño suave y sin pelusas o una toallita de papel y agua para limpiar el bloque. Enjuague siempre los pocillos con agua varias veces para eliminar todo rastro de productos de limpieza

¡ADVERTENCIA! Nunca limpie el bloque con soluciones alcalinas fuertes (jabón fuerte, amoniaco o lejía concentrada). Nunca utilice soluciones de limpieza corrosivas o abrasivas. Estos productos de limpieza pueden dañar el bloque e impedir un control térmico preciso.

¡ADVERTENCIA! La lejía, el etanol o el jabón que quede en los bloques puede corroerlos y destruir plásticos durante una ejecución. Después de la limpieza, enjuague siempre los pocillos a fondo con agua para eliminar todo rastro de productos de limpieza.

¡ADVERTENCIA! Nunca caliente el bloque después de haber añadido una solución limpiadora. De lo contario, el bloque, el módulo de reacción y la base del termociclador se dañarán.

• Limpie la tapa interna. Utilice agua y un paño suave y sin pelusas para limpiar los restos y las soluciones de la superficie de la tapa interna. Nunca utilice detergentes abrasivos ni materiales ásperos que arañen la superficie. La limpieza de la tapa interna mejora el calentamiento y el enfriamiento precisos de las muestras.

Registro de la aplicaciónAntes de una nueva ejecución, el instrumento inicia una prueba autodiagnóstica para comprobar que está funcionando de acuerdo a las especificaciones. El software registra los resultados de esta prueba en el archivo de Run log (Registro de ejecución) y Application log (Registro de la aplicación). Si observa algún problema en uno o varios experimentos, abra los registros de aplicación y de ejecución para averiguar dónde se originó el problema.

El software CFX Manager registra la información sobre el estado de un instrumento durante una ejecución en el Application Log (Registro de la aplicación) (Figura 83). Utilice estos registros para rastrear eventos que hayan tenido lugar en instrumentos y en el software a fin de resolver problemas.

Para abrir el registro de la aplicación en la ventana principal del software, seleccione View > Application Log (Ver > Registro de la aplicación).

Figura 83. Ejemplo de un archivo de registro de eventos.

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Recursos

Resolución de problemasPor lo general, los problemas de comunicación entre el software y el instrumento se pueden resolver reiniciando el ordenador y el sistema. Asegúrese de guardar todo el trabajo en curso antes de reiniciar.

NOTA: Compruebe que el ordenador tiene suficiente RAM y espacio libre en el disco duro. El tamaño mínimo de RAM es 2 GB y el espacio libre mínimo en el disco duro es de 20 GB.

Instalación del software de forma manualSi lo necesita, instale el software de forma manual siguiendo estas instrucciones:

1. Introduzca el CD del software.

2. Haga clic con el botón derecho del ratón en el icono del CD del software y seleccione Explorar para abrir la ventana del CD.

3. Haga doble clic en la carpeta CFX_Manager para abrirla y, a continuación, haga doble clic en setup.exe para abrir el asistente de instalación del software.

4. Siga las instrucciones del asistente para instalar el software y, a continuación, haga clic en Finish (Finalizar).

Instalación de los controladores de forma manualSi lo necesita, instale los controladores de forma manual siguiendo estas instrucciones:

1. Introduzca el CD del software. Si el CD no está disponible, busque la carpeta de controladores en la ruta C:\Archivos de programa\Bio-Rad\Drivers en el disco duro.

2. Haga clic en el botón Drivers (Controladores) de la pantalla de instalación del software (Figura 84).

3. Haga clic en la carpeta BaseUnit para abrirla.

4. Si su ordenador tiene Windows XP, haga doble clic en BioRadC1000DriverInstall.exe para abrir la ventana de instalación. Si su ordenador tiene Windows Vista, haga clic con el botón derecho del ratón en BioRadC1000DriverInstall.exe y seleccione Ejecutar como administrador para abrir la ventana de instalación.

Figura 84. Ventana de instalación del controlador.

Cuando la instalación haya finalizado, la ventana de instalación se cierra.

120


Opciones ante un corte de energíaAnte un corte de energía, el instrumento y el ordenador se apagarán. Si el corte de energía es breve, el instrumento reanudará la ejecución del protocolo, pero el corte de energía quedará reflejado en el registro de la aplicación. En función de la configuración del ordenador y el tiempo que dure el corte de energía, el instrumento y el software intentarán continuar la ejecución si el paso del protocolo lo permite:

• Si el protocolo se encuentra en un paso sin lectura de placa, el protocolo continúa ejecutándose en cuanto el instrumento vuelva a recibir energía

• Si el protocolo se encuentra en un paso con una lectura de la placa, el instrumento espera a que el software se reinicie y reanuda la comunicación para recopilar los datos. En esta situación, el protocolo solamente continúa si el ordenador no ha cerrado el software. Cuando el ordenador y el software vuelvan a iniciarse, el protocolo continuará

Si desea abrir una tapa motorizada bloqueada en un módulo de reacción para retirar las muestras durante un corte de energía, siga estos pasos para retirar la placa de bloqueo:

1. Retire el módulo de reacción del chasis C1000 presionando hacia abajo la barra de bloqueo de la base C1000.

2. Coloque el módulo en la parte delantera de un escritorio de forma que la parte trasera del módulo sobresalga 5 cm del borde del escritorio como se muestra en la Figura 85.

Figura 85. Manipulación del módulo óptico para retirar la placa de bloqueo.

3. Retire con una llave Allen los dos tornillos grandes que se encuentran debajo del borde delantero del módulo de reacción (debajo del botón para abrir la tapa). No retire los dos tornillos pequeños que se encuentran en el borde frontal del módulo. Debe oír como el pestillo se suelta en el interior del módulo. La Figura 86 muestra los dos tornillos grandes.

Figura 86. Retire estos tornillos para desbloquear el módulo óptico.

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Recursos

4. Presione la tapa del módulo de reacción para abrirla. Observe que el pestillo (de plástico oscuro) ya no está sujeto. Retire las muestras del bloque.

5. Vuelva a montar el módulo de reacción con la tapa abierta. Coloque de nuevo el pestillo y fíjelo con los tornillos grandes. La Figura 87 muestra el pestillo colocado.

Figura 87. Pestillo del módulo óptico.

Especificaciones técnicasDimensiones y peso

Electricidad

Condiciones de funcionamiento

Tamaño (An. x Pr. x Al.) 33 x 46 x 36 cm (13 x 18 x 14")

Peso 21 kg (47 lb)

Tensión 100–240 V

Frecuencia 50-60 Hz

Consumo de energía 850 vatios

Tipo de fusible 10 A

General Para uso en interiores

Temperatura Temperatura ambiente de 15 a 31 °C

HumedadHumedad relativa máxima del 80% (sin condensación)

AltitudHasta 2.000 metros sobre el nivel del mar

Nivel de ruido Cumple las especificaciones 61010-1

Grado de contaminación 2

Clase de instalación 2

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Termociclador

Temperatura

Óptica

Software

Sistema

Chasis Chasis C1000

Inclinación máx. de la rampa 5 °C/seg

Inclinación media de la rampa 3,3 °C/seg

Amplitud del gradiente programable

1-24 °C

Rango de gradientes operativos

0-100 °C

Método de calentamiento y enfriamiento

Peltier

Tapa Calienta hasta 105 °C

Rango 0-100 °C

Precisión ±0,2 °C de la temperatura programada a 90 °C

Uniformidad ±0,4 °C a los 10 segundos de alcanzar 90 °C

Excitación 6 LED filtrados

Detección 6 fotodiodos filtrados

Rango de longitudes de onda de excitación/emisión

450–730 nm

Sensibilidad Detecta 1 copia de la secuencia objetivo en el ADN de genoma humano

Rango dinámico 10 órdenes de magnitud

Sistemas operativos Windows XP, Windows Vista o Windows 7

Análisis multiplex Hasta 5 objetivos por pocillo

Con licencia para PCR en tiempo real

Sí

Capacidad para muestras 96 pocillos

Tamaño de las muestras 1–50 μl (se recomiendan 10–25 μl)

Comunicaciones USB 2.0

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Recursos

ReferenciasBreslauer KJ et al. (1986). Predicting DNA duplex stability from the base sequence. Proc Nat Acad Sci 83, 3746–50.

Livak JL et al. (1995). Towards fully automated genome-wide polymorphism screening. Nature Genetics 9, 341–342.

Pfaffl MW (2001). A new mathematical model for relative quantification in real-timeRT-PCR. Nucleic Acids Research 29(9), 2002–2007.

Vandesompele J, et al. (2002). Accurate normalization of real-time quantitativeRT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. Genome Biology 3(7), 1–12.

Aviso sobre derechos de autor de Minpack (1999), Universidad de Chicago. Todos los derechos reservados

Se permite la redistribución y el uso en forma de código fuente y binaria, con o sin modificaciones, siempre que se cumplan las siguientes condiciones:

1. Las redistribuciones del código fuente deben conservar el aviso anterior sobre los derechos de autor, la lista de condiciones y la siguiente renuncia de responsabilidad.

2. Las redistribuciones en forma binaria deben reproducir el aviso anterior sobre los derechos de autor, la lista de condiciones y la siguiente renuncia de responsabilidades en la documentación o cualquier otro material que se proporcione con la distribución.

3. Toda documentación para el usuario final incluida con la redistribución, si procede, deberá incluir el siguiente reconocimiento:

Este producto incluye software desarrollado por la Universidad de Chicago, como agente del laboratorio Argonne National Laboratory.

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Life ScienceGroup

10-0661 0610 Sig 1109

Bio-Rad Laboratories, Inc.

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