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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
CENTRO DE ENERGIA NUCLEAR NA AGRICULTURA
MAIARA CURTOLO
Mapeamento de QTL para qualidade de frutos de citros utilizando
marcadores DArT-seq
Piracicaba
2016
1
MAIARA CURTOLO
Mapeamento de QTL para qualidade de frutos de citros utilizando
marcadores DArT-seq
Versão revisada de acordo com a Resolução CoPGr 6018 de 2011
Dissertação apresentada ao Centro de Energia
Nuclear na Agricultura da Universidade de São
Paulo para obtenção do título de Mestre em
Biologia na Agricultura e no Meio Ambiente
Área de Concentração: Genética e Biologia
Molecular de Plantas
Orientador: Prof. Dr. Antonio Vargas de Oliveira
Figueira
Piracicaba
2016
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AUTORIZO A DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER
MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE
QUE CITADA A FONTE.
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Seção Técnica de Biblioteca - CENA/USP
Curtolo, Maiara
Mapeamento de QTL para qualidade de frutos de citros utilizando marcadores
DArT-seq / Maiara Curtolo; orientador Antonio Vargas de Oliveira Figueira. - - Versão
revisada de acordo com a Resolução CoPGr 6018 de 2011. - - Piracicaba, 2016.
68 f. : il.
Dissertação (Mestrado – Programa de Pós-Graduação em Ciências. Área de
Concentração: Biologia na Agricultura e no Ambiente) – Centro de Energia Nuclear na
Agricultura da Universidade de São Paulo.
1. Frutas cítricas 2. Mapeamento genético 3. Marcador molecular I. Título
CDU (575.116.4 + 577.21) : 634.3
3
AGRADECIMENTOS
Ao Dr. Antonio Vargas de Oliveira Figueira pela orientação, oportunidade e por
acreditar na minha capacidade e no meu crescimento profissional e pessoal.
Agradeço imensamente a Dra. Mariângela Cristofany Yaly pela ajuda, confiança,
amizade. Pela sua boa vontade e incentivo.
Ao Dr. Rodrigo Gazaffi e também ao Dr. Marco Aurélio Takita pelos ensinamentos e
auxílio na realização desse trabalho.
A todos os colegas de trabalhos, em especial, Fabio, Karina, Thiago e Nicolas, por toda
ajuda, colaboração e amizade.
Ao Centro de Energia Nuclear na Agricultura da USP, pela oportunidade de realização
do curso de Mestrado.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, pela concessão
da bolsa de mestrado e pelo apoio financeiro para a realização desta pesquisa.
Ao Instituto Agronômico de Campinas, por colocar à disposição a área experimental e
o laboratório de biotecnologia do Centro de Citricultura “Sylvio Moreira”.
E a todos que direta ou indiretamente colaboraram para a concretização desse trabalho.
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RESUMO
CURTOLO, M. Mapeamento de QTL para qualidade de frutos de citros utilizando
marcadores DArT-seq. 2016. 68 f. Dissertação (Mestrado) – Centro de Energia Nuclear na
Agricultura, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2016.
A incorporação de novas ferramentas biotecnológicas aos programas de melhoramento de citros
oferece inúmeras possibilidades. Os marcadores DArTTM (Diversity Arrays Technology),
combinados à técnica de sequenciamento de última geração, apresentam boa aplicabilidade na
construção de mapas genéticos de alta resolução e no mapeamento de QTL (Quantitative Trai
Loci). Assim, este estudo teve como objetivo construir um mapa genético integrado de tangor
‘Murcott’ e laranja ‘Pera’ usando os marcadores moleculares do tipo DArT_seqTM e localizar
QTLs para doze caracteres de qualidade de frutos. A partir de um cruzamento controlado entre
tangor ‘Murcott’ e laranja ‘Pera’, realizado no banco de germoplasma de Citros do Centro de
Citricultura "Sylvio Moreira", Instituto Agronômico de Campinas, localizado em
Cordeirópolis-SP, em 1997. Foi obtida uma família de 350 indivíduos híbridos, dos quais 278
foram selecionados para avaliação das características de fruto em 2012. No presente trabalho,
esses 278 indivíduos foram genotipados usando os marcadores DArTseqTM. Para construir o
mapa integrado foi utilizado o programa OneMap e foram considerados apenas os marcadores
que não apresentaram desvio de segregação mendeliana. A razão de verossimilhança foi
utilizada para a formação de grupos de ligação, além da informação genômica obtida a partir
do genoma sequenciado de Citrus sinensis L. Osbeck disponível em
(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/index.php). O mapa parcialmente integrado foi composto de
661 marcadores, ligados em 13 grupos, que correspondem ao número haplóide de cromossomos
da espécie, com cobertura genômica de 2.774 cM. De acordo com as análises de mapeamento
por intervalo composto e os resultados do teste de permutação, um total 19 QTLs foram
identificados, tendo em conta as características de fruto analisadas: peso (g), diâmetro (cm),
altura (cm), relação diâmetro / altura, espessura da casca (cm), número de gomos, teor de
sólidos solúveis (°Brix), acidez titulável (%), rendimento de suco (%), número de sementes,
valor do índice tecnológico (IT) e número estimado de frutos por caixa. O mapa genético
integrado foi comparado com o genoma (pseudochromosomes) de Citrus sinensis e sintenias
foram claramente identificadas. A análise mais aprofundada das regiões genômicas (QTLs)
apresentando os maiores valores de LOD score permitiu identificar a presença de genes
candidatos que podem estar associados com as características analisadas.
Palavras-chaves: Mapa integrado. Variedades copa. Sintenia.
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ABSTRACT
CURTOLO, M. QTL mapping for fruit quality in Citrus using DArT-seq markers. 2016.
68 f. Dissertação (Mestrado) – Centro de Energia Nuclear na Agricultura, Universidade de São
Paulo, Piracicaba, 2016.
The incorporation of new biotechnological tools to citrus breeding programs provides many
new possibilities. The DArT markers (Diversity Arrays Technology), combined with Next-
Generation Sequencing presents good applicability in the construction of high resolution
genetic maps and QTL mapping. This study aimed to construct an integrated genetic map of
‘Murcott’ tangor and ‘Pera’ sweet orange using the DArTseqTM molecular markers, and localize
QTL for twelve fruit quality traits. A controlled cross between ‘Murcott’ tangor and ‘Pera’ sweet
orange was conducted at the Citrus Germplasm Bank at the "Sylvio Moreira" Citrus Centre of
Agronomic Institute, located in Cordeirópolis-SP in 1997.A family with 350 hybrid individuals
was obtained, from which 278 were selected for evaluation of fruit traits in 2012. In this study,
the 278 F1 individuals were genotyped using the DArTseqTM markers. To build the integrated
map, we used the OneMap program and considered all DArT loci that showed no segregation
deviation. The likelihood ratio was used for formation of linkage groups, besides the genomic
information obtained from the available Citrus sinensis genome sequence
(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/index.php). The partially integrated map contained 661
markers linked in 13 linkage groups, with genomic coverage of 2,774 cM, the map is saturated
and represent the species haploid chromosome number. According to the analyses using
"Composite Interval Mapping" (CIM) and the results of the permutation test, a total of 19 QTL
were identified for the 12 fruits characteristics analyzed: diameter (cm), height (cm), ratio of
H/D, weight (g), rind thickness (cm), segments per fruit, total soluble solids ((°Brix), Acidity
(%), Juice content (%), number of seeds, ratio of total soluble solids /acidity and number of
fruits per box. The genome sequence (pseudochromosomes) of Citrus sinensis L. Osbeck was
compared to the genetic map, and sinteny was clearly identified. Further analysis of the map
regions with the highest LOD score enabled the identification of the presence of genes that
could be associated with the characteristics. The genome sequences allowed identification of
genes that may respond for phenotypic traits in Citrus.
Keywords: Integrated map. Scionvarieties. Sinteny.
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SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 11
2 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................................................... 14
2.1 Citricultura no Brasil .......................................................................................................... 14
2.2 Botânica, genética e melhoramento de citros ..................................................................... 15
2.3 Marcadores Moleculares, mapas genéticos e identificação de QTLs ................................. 17
2.4 Características de qualidade dos frutos...............................................................................20
3 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 23
3.1 Objetivo Geral .................................................................................................................... 23
3.2 Objetivos Específicos ......................................................................................................... 23
4 METODOLOGIA ................................................................................................................ 24
4.1Material Vegetal ................................................................................................................... 24
4.1.1 Extração do DNA total .................................................................................................... 24
4.2 Genotipagem ....................................................................................................................... 25
4.3 Construção do mapa de ligação integrado .......................................................................... 26
4.4 Analises fenotípicas – caracterização dos frutos ................................................................ 27
4.5 Análises Estatísticas ............................................................................................................ 28
4.6 Mapeamento de QTL .......................................................................................................... 28
4.7 Análise comparativa entre o mapa de ligação integrado e a montagem do genoma .......... 28
4.8 Conteúdo gênico nos intervalos de QTLs detectados.........................................................28
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................................... 30
5.1 Avaliações das características físico-químicas dos frutos .................................................. 30
5.2 Estudos genéticos ............................................................................................................... 35
5.2.1 Genotipagem DArTseqTM ................................................................................................ 35
5.2.2 Construção do mapa genético .......................................................................................... 38
5.2.3 Mapeamento de QTL utilizando o software FullsibQTL ................................................. 42
5.3 Análise comparativa entre o mapa de ligação e o genoma de C. sinensis .......................... 49
5.4 Conteúdo gênico nos intervalos de QTLs detectados ......................................................... 53
6 CONCLUSÕES.................................................................................................................... 56
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................... 57
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1 INTRODUÇÃO
A laranja doce (Citrus sinenis L. Osbeck) é uma das frutas mais consumidas do mundo,
seja na de forma de frutos in natura, suco concentrado e congelado (FCOJ - frozen concentrated
orange juice) ou suco pasteurizado (NFC - not from concentrate).
Em 2013, a produção do Brasil foi de 17 milhões de toneladas, o que equivale a 430 mil
caixas de 40,8 kg (IBGE, 2013), representando 36% da produção mundial da fruta in natura.
Desse total de frutos, 70% foram esmagados para a fabricação de suco concentrado, valor este,
responsável por 57% de todo o suco produzido no mundo (CITRUSBR, 2014). A China,
segundo maior produtor da fruta in natura, foi responsável por 14,7% da produção mundial e
os Estados Unidos, segundo maior produtor de FCOJ (Suco de Laranja Concentrado e
Congelado), correspondendo 30,1% desse mercado.
De forma geral, o gênero Citrus apresenta características biológicas que torna o processo
de melhoramento genético longo e desafiador. Por se tratar de espécies propagadas
vegetativamente, de modo geral as cultivares de interesse agronômico apresentam grande
complexidade genética devido à alta heterozigosidade, o que dificulta a obtenção de variedades
a partir de cruzamentos, devido à grande segregação nas características de frutos que devem
manter padrões varietais rígidos para atender ao consumo in natura e à indústria. A natureza
poliembriônica das sementes, aliada à presença de óvulos e grãos de pólen estéreis, e a
existência da incompatibilidade gametofítica presentes em algumas variedades representam
barreiras genéticas adicionais. Por se tratar de espécie arbórea perene, os citros requerem longo
período juvenil, antes de florescer e produzir frutos (FROST; SOOST, 1968; GROSSER;
GMITTER, 1990; FEBRES, 2007; MACHADO et al., 2011).
Em função desses obstáculos genéticos e botânicos a grande maioria das variedades
existentes atualmente é originária da seleção de plantas que sofreram mutações naturais e foram
selecionadas de acordo com as características desejáveis aos programas tradicionais de
melhoramento de citros. Os objetivos dos programas visam à obtenção de variedades de porta-
enxertos e copas resistentes às doenças, pragas e mais adaptados a condições abióticas adversas,
combinados à produção de frutos de qualidade. Neste contexto, os marcadores moleculares
podem auxiliar no melhoramento da cultura, uma vez que eles detectam variações existentes no
genoma, e permitem acessar informações a respeito do controle genético da herança de
características importantes, tais como os caracteres relacionados com a qualidade de frutos,
diminuindo assim o tempo necessário para a obtenção de novas variedades.
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Em Citrus, diversos marcadores moleculares (RAPD - Random Amplified Polymorphic
DNA, AFLP - Amplified Fragment Length Polymorphism, SSR - Simple Sequence Repeat)
foram utilizados, permitindo a caracterização genética de um grande número de genótipos por
meio de procedimentos relativamente simples e rápidos. No entanto, o número de marcadores
polimórficos identificados era insuficiente para cobertura eficiente do genoma e mapeamento
dos nove grupos de ligação correspondentes ao número haplóide de cromossomos em citros.
Assim, um maior número de marcadores polimórficos e progênies avaliadas representaria um
grande avanço visando à identificação de locos de características quantitativas (QTL-
Quantitative Trait Loci). Tal estratégia auxilia no entendimento da arquitetura das
características sob análise, bem como na clonagem de regiões associadas a características de
importância agronômica e na seleção assistida por marcadores moleculares (ZHANG et al.,
2015).
Desenvolvida há mais de 15 anos, a tecnologia DArT (Diversity Arrays Technology)
(JACCOUD et al., 2001) satisfaz os requisitos de custo competitivo, de rendimento e de
cobertura do genoma. Esta tecnologia é baseada em duas abordagens para a geração dos
marcadores moleculares. A primeira plataforma, desenvolvida em 2001 (JACCOUD et al.,
2001) é baseada na metodologia de hibridização de fragmentos em um microarranjo. Com o
advento da tecnologia de genotipagem por sequenciamento de nova geração ou NGS (Next
Generation Sequencing), surgiu uma variante dos marcadores DArT de microarranjo, os
chamados marcadores DArTseq, os quais se diferem pela genotipagem via sequenciamento
(KILIAN et al., 2005; SANSALONI et al., 2011).
Os DArTseq têm sido utilizados como marcadores moleculares altamente polimórficos
e reprodutíveis para um grande número de plantas e animais, e em relação à primeira
abordagem, esta apresenta algumas vantagens como a geração de maior densidade de
marcadores por análise (dezenas de milhares de marcadores) (CRUZ et al., 2013). Desta forma,
a sua utilização favorece a detecção de QTLs, contribuindo para a compreensão dos
mecanismos genéticos envolvidos nas características quantitativas. Além disso, apresentam
também grande potencial para estudos de diversidade e mapeamento, já que é independe de
informações prévias do genoma do organismo a ser estudado (JACCOUD et al., 2001).
A tecnologia DArTseq tem se mostrado eficiente e de uso crescente por ter cumprido de
forma eficiente os requisitos como transferibilidade entre genótipos da mesma espécie,
cobertura do genoma e já foram aplicados para mais de 40 espécies de planta, incluindo Citrus
(SANSALONI, 2011; MAURICIO, 2013). Em 2012, o Centro de Citricultura do Instituto
Agronômico – IAC iniciou os trabalhos utilizando marcadores DArTseq, que possibilitaram os
13
estudos da diversidade e mapeamento genético em citros. Com a utilização destes marcadores,
foi superado o problema relativo ao baixo número de marcadores de DNA com sequências
conhecidas desenvolvidos previamente por meio de outras tecnologias.
Desta forma a utilização dos marcadores DArTseq permitiriam a identificação de maior
número de polimorfismos na progênie e com isso, tornou possível construir um mapa genético
saturado, facilitando assim a detecção de QTLs associados às características de qualidade de
frutos em citros.
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2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Citricultura no Brasil
As primeiras plantas cítricas foram introduzidas no Brasil por intermédio dos
portugueses, que trouxeram mudas da Espanha, logo no início da colonização (NEVES; JANK,
2006). Por apresentar melhores condições de cultivo em relação ao centro de origem, a cultura
logo se desenvolveu ao longo do território nacional (SWINGLE; REECE, 1967; SOOST;
CAMERON; 1975; DONADIO; MOURÃO FILHO; MOREIRA, 2005). Devido às
características climáticas, às condições edáficas e à proximidade com o mercado consumidor,
a região centro-sul do Brasil foi o local onde a citricultura teve maior desenvolvimento. O
estado de São Paulo é reconhecido até hoje como o responsável pela maior concentração da
produção brasileira, com aproximadamente 74,2% da produção nacional de laranjas, que
corresponde a cerca de 13 milhões de toneladas, ocupando uma área de 446 mil ha. Outros
estados, como Bahia, Minas Gerais, Pará, Paraná e Rio Grande do Sul, contribuem para o
agronegócio dos citros com a produção, além de laranjas, também de tangerinas e de lima ácida
‘Tahiti’ (IBGE, 2013).
Segundo Neves (2010), o Brasil lidera (acima de 70%) as exportações de suco
concentrado no mercado internacional. Internamente, valores expressivos também são
alcançados, visto que a laranja representa 49% de toda a produção de frutas no país. Em 2013,
a produção do Brasil foi de 17milhões de toneladas, o que equivale a 430 mil caixas de 40,8 kg
(IBGE, 2013), representando 36% da produção mundial da fruta in natura. Desse total de frutos,
70% foram esmagados para a fabricação de suco concentrado, valor este, responsável por 57%
de todo o suco produzido no mundo (CITRUSBR, 2014). A China, segundo maior produtor da
fruta in natura, foi responsável por 14,7% da produção mundial e os Estados Unidos, segundo
maior produtor de FCOJ (Suco de Laranja Concentrado e Congelado), correspondendo 30,1%
desse mercado.
Com a expansão da citricultura, surgiram diversos problemas fitossanitários. Estima-se
que mais de 60% dos custos de produção de citros no Brasil estejam relacionados ao controle
de pragas e doenças. Neste contexto, o uso e a diversificação de porta-enxertos tem sido uma
importante ferramenta na formação de novos pomares que enfrentam problemas relacionados à
deficiência hídrica, doenças e quanto à qualidade dos frutos (SCHÄFER, 2001; DONADIO;
MOURÃO FILHO; MOREIRA, 2005).
15
2.2 Botânica, genética e melhoramento de citros
Diversos sistemas de classificação taxonômica para o gênero Citrus têm sido
apresentados. De acordo com a classificação de Swingle (1967), o gênero Citrus pertence à
família Rutaceae, subfamília Aurantioideae, tribo Citreae, subtribo Citrinae, que também inclui
os gêneros Poncirus, Fortunella, Microcitrus, Eremocitrus, Clymenia, Severinia,
Pleiospermium, Burkillanthus, Limnocitrus, Hesperetusa, Citropsis e Atalantia.
No gênero Citrus, verifica-se a ocorrência da apomixia facultativa, onde ocorre a
coexistência da reprodução sexual e apomítica. Assim nas espécies de citros o nível de apomixia
é variável. De forma geral, as laranjas doces, laranja Azeda, tangerina Ponkan
(C. reticulata Blanco), os tangelos (C. reticulata Blanco x C. paradisi Macf) e os citranges (C.
sinensis x P. trifoliata) apresentam altas taxas de poliembrionia. Na maioria das vezes os limões
verdadeiros possuem número reduzido de embriões nucelares (OLIVEIRA et al., 2014).
Algumas espécies são monoembriônicas, produzindo apenas o embrião sexual, como é
o caso das cidras (C. medica L.), toranjas (C. grandis Osbeck), C. clementina,
C. tangerina, C. temple, C. nobilis e C. halimii (BARRETT; RHODES, 1976; SCORA;
KUMAMOTO, 1983) ou produzindo apenas embriões nucelares, como alguns citranges
(C. sinensis Osbeck x P. trifoliata Raf.) e tangelos (C. reticulata Blanco x C. paradisi Macf.).
As sementes monoembriônicas que produzem apenas o embrião sexual, não são utilizadas como
porta-enxertos, pois apresentam alta variabilidade na progênie e pouca uniformidade nos
plantios, no entanto, são muito úteis nos programas de melhoramento genético, uma vez que
não é necessário realizar a seleção do embrião zigótico dos nucelares (DAVIES; ALBRIGO,
1994).
Geralmente, as espécies de Citrus são alógamas e sexualmente compatíveis
possibilitando o cruzamento entre si e com gêneros afins, inclusive com produção de híbridos
interespecíficos e intergenéticos (CAMERON; FROST, 1968; BARRET, 1985). A grande
maioria das espécies de Citrus é diplóide, contendo 2n=18 cromossomos (GUERRA et al.,
1997, 2000). Em geral, o gênero possui um genoma relativamente pequeno. A estimativa do
tamanho do genoma da laranja doce é de 367 Mb/genoma haplóide (XU et al., 2012).
O melhoramento de citros é complexo e demorado, em razão de limitações biológicas
das espécies, tais como a elevada heterozigosidade, natureza poliembriônica das sementes, ciclo
reprodutivo longo, esterilidade, incompatibilidade e depressão por endogamia (GROSSER;
GMITTER JUNIOR, 1990). Esses fatores, somados às características botânicas do gênero e à
baixíssima variabilidade genética existente principalmente entre as variedades de laranjas
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doces, limitam a obtenção de novas variedades por meio dos programas tradicionais de
melhoramento genético de citros via hibridação (MACHADO et al., 2005; SOUZA et al., 2012).
Essas características tornam pequena a probabilidade de reunir boas combinações de genes em
um híbrido de sucesso, além do fato de haver pouca informação existente sobre o controle
genético das características (OLIVEIRA, 2014). Assim, o desenvolvimento de uma nova
variedade, pode demorar de 10 a15 anos (XIUXIN, 2005).
O melhoramento genético de plantas busca obter variedades que combinem diversas
características, dentre as quais se destaca a resistência a fatores bióticos e abióticos, associados
a condições de adaptação e produtividade. Na citricultura, o foco é a obtenção de novas
variedades de copas com alta produtividade e que apresentem frutos atrativos comercialmente,
com maior produção de sólidos solúveis totais (SST) por área cultivada, maior porcentagem de
suco por fruto e ampliação do período de colheita. Os programas de melhoramento também
buscam porta-enxertos resistentes a pragas e doenças, tolerantes a climas adversos e
compatíveis com as variedades de copa (GROSSER; GMITTER JUNOR, 2005; GROSSER et
al., 1998; SOOST; CAMERON, 1975; SPIEGEL-ROY; GOLDSCHMIDT, 2008).
Na busca pelo lançamento de variedades comerciais, o melhoramento de Citrus se
baseia em abordagens tradicionais tais como, seleção clonal, hibridação sexual, mutagênese
induzida e manipulação da ploidia, e em algumas alternativas como a transformação genética,
variação somaclonal e hibridação somática. No entanto, a grande parte das variedades cítricas
comerciais atuais surgiu em decorrência de algum tipo de mutação natural. Durante anos, a
seleção de mutações espontâneas foi o método de melhoramento mais usado na citricultura,
onde buscam-se mutações promissoras que ocorreram naturalmente em variedades
estabelecidas (AGUSTÍ, 2003). Em contrapartida, a mutação induzida requer o tratamento de
propágulos (sementes ou gemas) com método mutagênico (químico ou físico), e por isso é
aleatório e demanda tempo para seleção, entre outros desafios (quimerismos, estabilidade, etc.).
A hidridação sexual seguido de seleção é um método clássico para combinar características
favoráveis de genitores contrastantes, a partir da seleção de híbridos com combinações
superiores, que serão perpetuadas pela propagação assexuada (vegetativa). A manipulação de
ploidia é o método mais utilizado para a obtenção de variedade com frutos sem sementes
(plantas triplóides). A alteração da ploidia pode ocorrer de forma natural, onde os materiais
mono, tri, tetra, penta e octoplóides podem ter origem sexual ou somática e acontecer por
processos naturais, ou serem induzidos artificialmente, geralmente pelo uso de colchicina, ou
também mediante ao resgate de embriões (ZENG et al., 2006).
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Mais recentemente, métodos que envolvem o uso de ferramentas biotecnológicas têm
sido desenvolvidos e utilizados no melhoramento da cultura para superar as barreiras
relacionadas à biologia do gênero Citrus (FEBRES, 2007). Dentre elas podemos citar a
transformação genética, em que é possível introduzir genes de interesse, sendo o transgene da
mesma ou de outras espécies. Um dos problemas enfrentados por este método é que por utilizar
a cultura de tecido como forma de obtenção das plantas transformadas, a taxa de regeneração
da planta transgênica geralmente pode ser baixa (CARDOSO et al., 2010). Outra limitação se
refere a questões de biossegurança e aceitação pelo consumidor. A variação somaclonal
também é um método que pode dar origem a plantas mutantes; no entanto, as alterações surgem
do resultado de diferenças genéticas pré-existentes em células somáticas cultivadas in vitro, ou
induzidas pelo cultivo in vitro, e tendem a ser instáveis (KUMAR et al., 2010).
No melhoramento de citros a hibridação somática possui vantagens sobre a hibridação
sexual, pois permite a combinação de dois genomas complementares, a introdução de alguns
cromossomos ou organelas de uma espécie para outra espécie a ser melhorada, tornando
possível a transferência de um conjunto total de genes taxonomicamente semelhantes ou
distantes, além de permitir a combinação de citoplasmas diferentes na mesma célula e a fusão
assimétrica de protoplastos, onde a célula “selvagem” tem o núcleo fragmentado antes da fusão,
combinando características desejáveis sem perda significativa do vigor como pode ocorrer na
hibridização sexual (BASSAN et al., 2010).
Ainda há desafios relativos ao melhoramento de citros, porém, parte das limitações pode
ser superada com o advento das ferramentas biotecnologias. Neste contexto, os marcadores
moleculares também representam uma importante ferramenta a ser utilizada no melhoramento
dos Citrus (CRISTOFANI; MACHADO, 1999; MACHADO et al., 2005), uma vez que eles
possibilitam a seleção precoce de plantas nucelares e zigóticas de progênies resultantes de
cruzamentos controlados, a caracterização de acessos de bancos de germoplasma, obtenção de
fingerprints de cultivares (SCHINOR et al., 2011), estudos de relações filogenéticas entre
espécies e gêneros, construção de mapas genéticos de alta cobertura genômica e na localização
de genes de interesse econômico e de QTLs de expressão (OLLITRAULT et al., 2012; LIU et
al., 2013), gerando um grande volume de informações que podem tornar mais eficiente o
melhoramento de plantas cítricas.
2.3 Marcadores Moleculares, mapas genéticos e identificação de QTLs
Apesar de existirem vários tipos de marcadores moleculares (RFLP - Restriction
18
Fragment Length Polymorphisms; RAPD Random Amplified Polymorphic DNA; AFLP
(Amplified Fragment Length Polymorphism; e Microssatélite ou SSR - Simple Sequence
Repeats), a maioria gera um número relativamente baixo de polimorfismos ao longo do
genoma, o que dificulta a construção de mapas de ligação e, consequentemente, a detecção de
regiões relacionadas com características agronomicamente importantes. Neste caso,
atecnologia DArT (Diversity Arrays Technology) (JACCOUD et al., 2001), satisfaz os
requisitos de custo, rendimento e de cobertura do genoma. A técnica de obtenção dos
marcadores DArT busca detectar grande número de variações genéticas dentro do genoma
estudado, utilizando plataformas de microarranjos ou de sequenciamento para a análise de
polimorfismo de DNA (JACCOUD et al., 2001). Os marcadores DArT baseados na
metodologia de microarranjo são obtidos por meio da redução da complexidade do genoma a
partir da digestão do DNA genômico com enzimas de restrição (KILIAN et al., 2005). Os
fragmentos resultantes da clivagem do DNA com enzimas de restrição de cortes raro e frequente
são utilizados para a construção de uma biblioteca que irão compor o microarranjo. O DNA a
ser analisado é, então, marcado com fluorescências que são identificadas a partir da leitura em
equipamento apropriado, detectando a presença ou ausência de hibridização de fragmentos ao
microarranjo (JACCOUD et al., 2001).
Com o advento da tecnologia de genotipagem por sequenciamento de nova geração ou
NGS (Next Generation Sequencing), surgiu uma variante dos marcadores DArT de
microarranjo, os chamados marcadores DArTseq, os quais se diferem pela genotipagem via
sequenciamento (KILIAN et al., 2005; SANSALONI et al., 2011). Nesta abordagem, as
sequências resultantes da clivagem pelas enzimas de restrição são sequenciadas e alinhadas com
um genoma de referência da espécie e detectados os polimorfismos a partir da comparação das
sequências (SANSALONI et al., 2011). Neste procedimento é identificada a presença/ausência
de fragmentos em comum entres as amostras sob análise, além de permitir a detecção de
variações, ou seja, SNPs (Single Nucleotide Polymorphism). Assim, os DArTseq fornecem duas
classes de marcadores, dominantes baseados na presença/ausência de fragmentos e
codominantes, os SNPs. Sendo assim os marcadores obtidos por meio de técnicas de
sequenciamento de alto rendimento, tais como as DArTseq, permitem construir mapas de
ligação com alta densidade de marcadores moleculares para diversas culturas (DEOKAR et al.,
2014).
Visando à construção de mapas genéticos, diversos programas têm sido desenvolvidos,
como Linkage 1 (SUITER et al., 1983), Mapmaker (LANDER et al., 1987), Gmendel (LIU;
KNAPP, 1992), JoinMap (STAM, 1993), Multimap (MATISE et al., 1994), Outmap
19
(BUTCHER et al., 2002), AntMap (IWATA; NINOMIYA, 2006) e mais recentemente OneMap
(MARGARIDO et al., 2007). JoinMap e OneMap são exemplos de programas que permitem
utilizar, simultaneamente, marcadores de diversas classes e com grande volume de dados.
As espécies de Citrus apresentam características que dificultam a construção de mapas
genéticos (OLIVEIRA, 2013). A impossibilidade de obtenção de linhagens homozigóticas,
associadas à dificuldade de se obter gerações mais avançadas, a sobreposição de gerações, o
grande período necessário para completar o ciclo reprodutivo, a expressão de caracteres ao
longo de idades especificas dificultam a construção de populações apropriadas ao mapeamento.
Sendo assim, a maior parte das populações de mapeamento envolve populações F1 de irmãos
completos resultante de cruzamento biparental entre indivíduos heterozigotos.
Já foram publicados 26 mapas genéticos desenvolvidos em citros nos últimos 25 anos
por diversos grupos de pesquisa no mundo, a partir da utilização de vários tipos de marcadores
moleculares, tais como: RAPD (GMITTER JUNIOR et al., 1996;OLIVEIRA;
CRISTOFANI;MACHADO, 2004; GULSEN et al., 2010; GARCÍA; ASÍNS; CARBONELL,
2000), RFLP, AFLP (LURO et al., 1995; OLIVEIRA et al., 2004; DALKILIC et al., 2005;
OLIVEIRA et al., 2007), SSR (KIJAS et al., 1997; RUIZ; ASINS, 2002; CHEN et al., 2007;
RAGA et al., 2012) e SNP (OLLITRAULT et al., 2012). A partir dos mapas desenvolvidos,
diversas informações foram obtidas para a cultura de Citrus. No entanto, os mapas construídos
anteriormente possuem poucos marcadores posicionados aos mapas (baixa saturação), o que
prejudica a detecção de regiões relacionadas ao controle de características de interesse
agronômico (QTL) e a correlação entre os mapas construídos. A integração dos mapas
construídos é essencial, pois deverá permitir o desenvolvimento de um mapa de referência para
um genótipo modelo, o qual deve incluir um conjunto de marcadores altamente polimórficos
que podem ser mapeados em várias populações e, assim, permitir a comparação e combinação
de mapas diferentes (SOUZA et al., 2013).
Existem várias metodologias disponíveis para detecção e estimativa das regiões de
interesse (ou QTLs). Os modelos propostos por Weller (1986), Lynch e Walsh (1998), Stuber;
Edwards e Wendel (1987) possibilitam a detecção de QTL sem a necessidade de um mapa de
ligação, o que dificulta a localização da região identificada no genoma. Posteriormente, os
modelos propostos por Lander e Botstein (1989), Zeng (1994) e Jansen e Stam (1994), tornaram
necessária a disponibilidade de um mapa de ligação, permitindo a localização do QTL. No
entanto, os métodos ainda não são indicados para o estudo direto das interações epistáticas.
A maioria dos modelos foi desenvolvida apenas com populações resultantes de
linhagens homozigóticas, ou seja, de populações F2, retrocruzamento e linhagens endogâmicas
20
recombinantes. Diante da impossibilidade de obter linhagens homozigoticas em Citrus, a
alternativa foi utilizar a metodologia do pseudo-testcross, em que apenas os marcadores com
segregação 1:1 são considerados (GRATTAPAGLIA; SEDEROFF, 1994), sendo excluídos os
demais. Segundo Souza et al. (2013), tradicionalmente, a construção de mapas genéticos de
populações F1, envolvem a estratégia pseudo-testcross, em que são construídos dois mapas, uma
para cada genitor, e apenas marcadores que segregam na proporção de 1:1 são consideradas.
Considerando modernas tecnologias de marcadores disponíveis, marcadores que segregam em 3:1
(dominantes), 1:2:1 (codominantes), e 1:1:1:1 (codominantes), para além de 1:1, podem ser usados
para integrar mapas de ligação individuais dos genitores a partir da genotipagem da população
F1(SOUZA et al., 2013).
Em citros existem vários estudos de mapeamento, a maioria para identificar QTL
ligados à resistência a doenças, tais como a tristeza dos citros (GMITTER JUNIOR et al., 1996;
DENG et al., 1997; FANG et al., 1998; CRISTOFANI et al., 1999),a clorose variegada dos
citros (CVC) (OLIVEIRA et al., 2004), a mancha marrom de alternaria (DALKILIC et al.,
2005), a gomose de Phytophthora (SIVIERO et al., 2006) além de caracteristicas como a
apomixia (GARCIA et al.,1999), resistência ou a susceptibilidade ao frio (CAI et al., 1994;
MOORE et al., 2000), juvenilidade (RAGA et al., 2012), vigor e acidez da fruta (GMITTER
JUNIOR et al., 1996), peso, tamanho de frutos e número de sementes (GARCÍA et al., 2000).
A utilização das informações obtidas com o mapeamento genético tradicional e com o
mapeamento físico do genoma deve facilitar a caracterização de genes e de regiões do genoma
relacionadas com a expressão fenotípica, dando subsídios para a clonagem de genes desejáveis
(ROCHA et al., 2003), tais como os genes relacionados com as características dos frutos em
citros.
2.4 Características de qualidade dos frutos
Existe uma ampla diversidade genética em características das frutas entre espécies
cítricas, como laranja, toranja, pomelo, tangerina, limão e cidra (GOLDENBERG et al., 2014).
Na comercialização de frutos cítricos de diferentes cultivares, são necessárias algumas
características requeridas pelo mercado, como coloração adequada da casca, tamanho
apropriado do fruto, casca fina, gomos com paredes delicadas, suco com adequado teor de
sólidos solúveis e acidez, aroma, pequeno número de sementes, resistência ao transporte e boa
conservação (PIO, 1992; BOTEON, 1999).
De acordo com Oliveira (2014), tendo como alvo características relacionadas à
qualidade dos frutos na citricultura, o foco do melhoramento genético de citros é a obtenção
21
genótipos que produzam frutas saborosas, fáceis de descascar, de colorações intensas tanto da
casca quanto da polpa, coloração do suco, com alto teor de sólidos solúveis, acidez equilibrada
e sem sementes.
Para o processamento, a principal característica é sua qualidade organoléptica,
representada pelo sabor, aroma, textura, cor e seu valor nutritivo (CARVALHO; NOGUEIRA,
1979). O sabor dos frutos de citros é determinado pela quantidade de sólidos solúveis e acidez
total titulável no suco. O valor da relação entre essas características (sólidos solúveis
totais/acidez total titulável) é um indicativo da maturidade dos frutos (JACKSON, 1991;
BALDWIN, 1993; COSTA, 1994). O teor de sólidos solúveis aumenta e os de ácidos diminuem,
durante o crescimento e maturação dos frutos (BARTHOLOMEW; SINCLAIR, 1943). A razão
do teor de sólidos solúveis totais (°Brix) pela percentagem de acidez titulável é mais
popularmente conhecida como ratio (SST/ATT). Nesta razão, quanto menor o valor resultante,
mais ácido é o suco, e vice-versa (MORETTI, 1984; KIMBALL, 1991). Sendo assim o teor de
sólidos solúveis (°Brix), acidez e o ratio são características usadas para determinação da
maturação (CHITARRA; CAMPOS, 1981; NOGUEIRA, 1987; RUSSO, 1987). O rendimento
industrial é dado pelo índice tecnológico, representado pelas características físicas e químicas
do fruto, além de indicador da maturidade, e pode ser utilizado como indicador da qualidade do
fruto (SINCLAIR, 1984; SOULE; GRIERSON, 1986). O índice tecnológico é calculado pelo
rendimento em suco (%) x sólidos solúveis totais (°Brix) x peso da caixa padrão industrial de
citros (40,8 kg)/10.000, expresso em quilograma de sólidos solúveis totais por caixa(DI
GIORGI et al., 1990).
Em estudos que abordam as características que conferem qualidade em citros, Genú e
Pedrazzi (1981) determinaram que o teor de sólidos solúveis totais (SST) mínimo para que o
fruto possa ser considerado maduro é de 9,0 °Brix. Pereira et al. (2006) observaram que os
teores mínimos de SST adequados para a colheita de laranjas e tangerinas devem situar-se em
torno de 9,0 a 10,0 °Brix, e verificaram ainda que a acidez em frutos de laranjas e tangerinas
maduras deve estar entre 0,5 e 1,0%. Agustí e Almela (1991) relataram a importância da razão
(ratio) entre o teor de sólidos solúveis totais e acidez total titulável (SST/ATT), como sendo a
principal característica para indicar o ponto de maturação comercial de frutos cítricos.
Algumas características morfológicas dos frutos, como o tamanho do fruto de cada
espécie são determinadas por fatores genéticos. Os frutos são classificados de acordo com os
seguintes intervalos: muito grandes de 110 a 170 mm de diâmetro, e geralmente apenas as
toranjas chegam a ter este tamanho; grandes de 50 a 130 mm, e nesta classe encontram-se os
pomelos e cidras; médios de 50 a 90 mm, laranjas doces, azedas, limões, tangerinas e satsumas;
22
pequenos de 40 a 60 mm, destacando as tangerinas ‘Cleopatra’ e Poncirus trifoliata; e muito
pequenos com menos de 40 mm, calamondin e kumquat (AGUSTÍ et al., 1996). Apesar de
haver uma tendência no tamanho dos frutos, há uma margem de variação bastante ampla para
a mesma variedade. Assim, árvores jovens produzem frutos de maior tamanho, com casca mais
grossa e rugosa. Geralmente, quando o tamanho do fruto é maior do que o tamanho típico
encontrado, evidencia-se a presença de caracteres indesejáveis (casca grossa e rugosa, pouco
rendimento de suco) (AGUSTÍ et al., 1996).
O peso individual dos frutos e o número de frutos por árvores também são características
importantes na colheita. Entretanto, o número de frutos por árvore, apresenta relação negativa
com o peso e tamanho dos frutos, ou seja, um número muito elevado de frutos pode resultar em
frutos pequenos e consequentemente de peso reduzido (GOLDSCHIDT; MONSELISE, 1977;
GUARDIOLA et al., 1982; AGUSTÍ; ALMELA, 1991).
A ausência de sementes é uma característica altamente desejável, uma vez que existe
grande preferência do mercado consumidor por frutos apirênicos (OLIVEIRA et al., 2005).
Porém, poucas variedades possuem a habilidade natural para produzir frutos sem sementes
(partenocárpicos) com ou sem polinização (FROST; SOOST, 1968).
23
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
O presente trabalho teve como objetivo detectar locos controladores de características
quantitativas (QTLs) associados às características dos frutos em uma progênie F1 obtida do
cruzamento entre tangor ‘Murcott’ (TM) x laranja ‘Pera’ (LP).
3.2 Objetivos Específicos
1. Construção do mapa genético integrado de tangor ‘Murcott’ e laranja ‘Pera’ utilizando
marcadores DArTseq;
2. Identificação e análises de QTLs para as características dos frutos da progênie
segregante entre tangor ‘Murcott’ (TM) x laranja ‘Pera’ (LP);
3. Estudo da sintenia a partir da análise comparativa entre o mapa de ligação integrado
e o genoma de laranja doce (http://citrus.hzau.edu.cn/orange/index.php);
4. Localização de genes nos intervalos dos QTLs detectados.
24
4 METODOLOGIA
4.1 Material Vegetal
Para a formação da população de mapeamento foram escolhidos genitores com carate-
rísticas contrastantes e complementares. Assim, o genitor tangor ‘Murcott’ se caracteriza por
apresentar frutos achatados, grande número de sementes, razoável facilidade de descasque e
resistência a CVC (clorose variegada dos citros), causada pela bactéria Xylella fastidiosa e a
leprose, causada pelo vírus da leprose dos citros (Citrus leprosis virus – CiLV). Já o genitor
laranja ‘Pera’ (LP) apresenta fruto com maior quantidade de polpa, mais alongado, com casca
aderente, acidez e teor de sólidos solúveis adequados ao mercado comercial de suco, mas sus-
cetível a CVC e a leprose. Na primavera de 1997, foi realizado o cruzamento controlado entre
tangor ‘Murcott’ (Citrus reticulata Blanco × C. sinensis (L.) Osb.) e laranja ‘Pera’
(C. sinensis (L.) Osb.) do banco de germoplasma de citros no Centro de Citricultura “Sylvio
Moreira”do Instituto Agronômico - IAC, situado em Cordeirópolis-SP.
Para a obtenção da população de mapeamento, os embriões zigóticos foram
identificados pela utilização de marcadores SSR (Oliveira et al., 2002). No total,
350 indivíduos híbridos foram identificados, dos quais 278 foram selecionados aleatoriamente
para compor a progênie de mapeamento.
Para a avaliação das características de fruto, os híbridos e genitores foram enxertados
em limão ‘Cravo’ (C. limonia Osbeck). O experimento foi estabelecido em 2004 no Centro de
Citricultura Sylvio Moreira do Instituto Agronômico (IAC), em Cordeirópolis – SP (22°32’ S e
47°27’ O, altitude de 639 m), com clima do tipo Cwa (clima temperado úmido com inverno
seco e verão quente), segundo a classificação de Köppen. O solo do ensaio é do tipo Latossolo
Vermelho distrófico típico. A média de precipitação pluvial anual é de 1.375,3 mm, e a
temperatura média anual é de 20,2 °C, sendo a média das máximas igual a 27,5 °C, e a das
mínimas 14,5 °C. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente ao acaso, com três
repetições clonais, e espaçamento 6 x 3 m.
4.1.1 Extração do DNA total
O DNA total foi extraído de folhas frescas de acordo com a metodologia descrita por
Murray e Thompson (1980), com modificações propostas por Machado et al. (1996).
Aproximadamente 2 g de folhas frescas foram lavadas e trituradas em almofariz com nitrogênio
25
líquido até a obtenção de um pó fino, que foi transferido para tubos. Em seguida, foram
adicionados 700 µL de tampão de extração (1% CTAB; 0,7 M NaCl; 100 mM Tris-HCl pH 7,5;
10 mM EDTA; 2% sarcosil; 2% mercaptoetanol) e os tubos foram incubados
a 60 °C por 30 min. Após o resfriamento, foi adicionado ao extrato o mesmo
volume de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1), e os tubos foram agitados por 3 min,
seguido de centrifugação por 8 min a 13.400 g. O sobrenadante foi então transferido para um
novo tubo e homogeneizado com mesmo volume de CTAB 10% (10% CTAB; 0,7 M NaCl), e
clorofórmio/álcool isoamílico (24:1). Os tubos foram novamente centrifugados por 8 min a
13.400 g. O sobrenadante foi então transferido para um novo tubo e a ele, foi adicionado igual
volume de tampão de precipitação (1% CTAB; 50 mM Tris-HCl pH 7,5; 10 mM EDTA), o qual
foi levemente misturado, seguido de 30 min em repouso e, posteriormente, centrifugado por 5
min a 9.300 g. Após a centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o sedimentado (pellet) foi
dissolvido em 80 µL de TE com alta concentração de NaCl (1 M NaCl; 10 mM Tris-HCl pH
7,5; 1 mM EDTA) a 65°C até completa dissolução. Posteriormente, após resfriamento, o DNA
foi precipitado com 160 µL de etanol 100% e incubado a - 20°C por 12 h, centrifugado por 6
min a 9.300 g. O DNA obtido foi dissolvido em 80 µL de H2O MilliQ contendo 10 µg µL-1 de
RNAse para a eliminação completa de contaminação por RNA.
4.2 Genotipagem
O DNA foi enviado para a empresa Diversity Arrays Technology Pty Ltd (DArT P/L),
Austrália, onde a genotipagem foi realizada utilizando o método DArT, que se baseia na redução
da complexidade do genoma utilizando digestão por enzimas de restrição combinada com
sequenciamento de nova geração (NGS), técnica denominada DArTseqTM. As enzimas de
restrição utilizadas para a obtenção dos marcadores DArTseq foram PstI e TaqI, seguido de
sequenciamento. Adaptadores específicos para PstI e 96 códigos de barras distintos foram
ligados aos fragmentos de restrição. Os produtos resultantes foram amplificados e a qualidade
analisada. As amostras foram sequenciadas em equipamento Illumina Hiseq2000. Os
adaptadores Pstl incluíam um iniciador de sequenciamento de tal modo que as sequências foram
sempre lidas a partir dos sítios PstI. As sequências (arquivos FASTQ) resultantes foram filtradas
para a qualidade, com um nível de corte de 90% de confiança. As sequências
foram alinhadas com genoma de referência de tangerina ‘Clementina’
(www.phytozome.net/clementine). A partir deste procedimento, cerca de 30.000 marcadores
relacionados com a população de 278 indivíduos resultantes do cruzamento de tangor ‘Murcott’
26
e laranja ‘Pera’, foram obtidos. Os marcadores DArTseq foram codificados como "0", se
ausente, ou "1", se presente, sendo denominados como dominantes. Todos os marcadores foram
analisados na descendência híbrida para os padrões de segregação Mendeliana esperados para
uma progênie F1.
4.2 Construção do mapa de ligação integrado
Para a construção do mapa integrado foram considerados todos os locos DArTseq que
não apresentaram desvio da segregação Mendeliana esperada, 1:1 [heterozigóticos para o
genitor masculino (oo x ao) ou para o genitor feminino (ao x oo)] ou 3: 1 (ao x ao). Os
marcadores selecionados para a construção do mapa foram codificados seguindo a notação
proposta por Wu et al. (2002) e foi empregado o software OneMap (Margarido et al., 2007),
que se baseia na abordagem multipontos utilizando o modelo oculto de Markov. Para a
construção do mapa foram considerados LOD score = 8 e fração máxima de recombinação de
0,3. A informação genômica obtida a partir do genoma sequenciado de Citrus sinensis,
disponível em http://citrus.hzau.edu.cn/orange/index.php foi considerada na construção dos
grupos de ligação.
Após a formação dos grupos, foi realizada uma ordenação prévia dos marcadores,
usando o algoritmo de RCD (Rapid Chain Delineation– DOERGE 1996) a fim de remover os
marcadores redundantes, ou seja, aqueles que apresentaram uma fração de recombinação igual
a zero. Em seguida, foram analisados os marcadores dentro de cada grupo de ligação. Nos
grupos de ligação com um número reduzido de marcadores com segregação 3:1 (menos de 10
marcadores), a integração entre marcadores do tipo D1 e D2 não foi eficiente. Nestes casos,
foram obtidos dois tipos de grupos de ligação, um com marcadores de 1:1 (polimórficos para
Tangor ‘Murcott’) e 3:1, codificados como "a", e grupos com marcadores 1:1 (polimórficos
para ‘Pera’) e 3:1, denominados como "b".
O procedimento de ordenação dos marcadores em cada grupo foi realizado através da
amostragem de um conjunto de marcadores que continha informação genômica. Usando a busca
exaustiva; a melhor ordem foi obtida, escolhendo aquela com maior valor de probabilidade,
através do comando COMPARE do software OneMap. Outros marcadores foram inseridos nos
grupos de ligação, através do comando TRY do mesmo software, de acordo com a posição mais
provável. As distâncias do mapa em centiMorgan (cM) entre os diferentes locos foram
estimadas pela função de mapeamento de Kosambi (1943), a partir da conversão das
frequências de recombinação.
27
4.4 Analises fenotípicas – caracterização dos frutos
A colheita e a avaliação para as características dos frutos foram realizadas em julho de
2012 pela equipe do Centro de Citricultura. Para as análises, os frutos foram colhidos na porção
externa da copa, na faixa compreendida entre 1,0 e 2,0 m do solo e em toda a extensão do
perímetro da planta. Os frutos foram enviados ao Laboratório de Qualidade e Pós-Colheita do
Centro de Citricultura Sylvio Moreira do Instituto Agronômico - IAC.
A massa total dos frutos foi obtida a partir da pesagem de três amostras com cinco frutos
de cada genótipo, em balança de precisão da marca Filizola® com capacidade de 15 kg, com
sensibilidade 5 g. As determinações de altura e diâmetro do fruto foram realizadas através da
leitura direta de amostra de cinco frutos por genótipo, com auxílio de uma escala graduada, em
centímetros, sendo posteriormente calculada a relação altura/diâmetro (A/D). Já o número de
frutos por caixa representa o número de frutos necessário para atingir o peso padrão de uma
caixa (40,8 kg), obtido dividindo-se o valor de 40,8 kg pelo peso médio dos frutos.
O número de sementes e gomos por fruto foi avaliado após o corte do fruto ao meio e
contagem direta. A facilidade de descascar foi avaliada subjetivamente numa
escala de 1 (difícil) a 3 (fácil) por três avaliadores. Os dados apresentados correspondem a
média de 3 frutos de cada repetição de cada genótipo (3 repetições por genótipo).
As avaliações químicas dos frutos foram realizadas a partir de cinco frutos de cada
repetição de cada genótipo.O rendimento de suco foi determinado, após esmagamento de
amostras de cinco frutos na extratora OIC (Organização Internacional Centenário) modelo
OTTO 1800 (filtro com diâmetro interno = 26,11 mm; comprimento = 265 mm; furos de
diâmetro = 0,6 mm; área de vazão = 20%), e estimado por meio da relação massa do suco/massa
do fruto e expresso em porcentagem. O teor de sólidos solúveis totais (SST) foi determinado
com refratômetro digital, e os resultados expressos em °Brix. A acidez foi
obtida por titulação de 25 mL de suco, com uma solução 0,3125 N NaOH e fenolftaleína como
indicadora. Foi calculada a relação sólidos solúveis/acidez (ratio). Essa relação indica o estádio
de maturação dos frutos cítricos.
O valor do Índice Tecnológico (IT) foi obtido a partir da seguinte formula: IT =
rendimento em suco (%) x sólidos solúveis totais (°Brix) x peso da caixa padrão industrial de
citros (40,8 kg)/10.000, expresso em kg de sólidos solúveis totais por caixa, proposta por Di
Giorgi et al.(1990).
28
4.5 Análises Estatísticas
Histogramas de distribuição das médias de todas as variáveis e os valores de correlação
de Pearson foram obtidos no Software R cran, (versão 3.1.3). As análises de variância e teste
de comparação de médias foram realizadas utilizando o programa SASM-Agri (CANTERI et
al., 2001).
4.6 Mapeamento de QTL
Para realizar o mapeamento de QTL, foi empregada a abordagem descrita por Gazaffi
et al. (2014), que realiza o mapeamento por intervalo composto (CIM – Composite Interval
Mapping; ZENG et al., 1994) no âmbito de mapa genético integrado. Para aplicar o CIM,
cofatores foram incluídos no modelo para controlar os QTLs localizados fora do intervalo de
mapeamento. Para declarar se o QTL era significativo, foi obtido o valor de LOD score crítico
utilizando um nível de significância de 0,95 e 1.000 permutações (CHURCHILL; DOERGE,
1994), de acordo com a proposta de Chen e Storey (2006).
4.7 Análise comparativa entre o mapa de ligação integrado e a montagem do genoma
Foi realizada a análise comparativa entre o mapa de ligação integrado construído no
presente estudo com o genoma de referência de Citrus. Para que fosse possível esta comparação,
todas as sequências dos marcadores ancorados no mapa integrado foram alinhadas com o
genoma, a partir do blastn, onde somente o resultado do primeiro melhor alinhamento, com
base no E-value, foi utilizado para a comparação. Com o intuito de
facilitar a visualização dos resultados dos alinhamentos obtidos, de modo a permitir a
identificação de sintenias, foi gerada uma visualização gráfica a partir a plataforma
http://mkweb.bcgsc.ca/tableviewer/. A avaliação da ordem dos marcadores no mapa de ligação
com a posição física dos marcadores no genoma foi estimada alinhando-se os nove grupos de
ligação com os pseudocromossomos de laranja doce.
4.8 Conteúdo gênico nos intervalos de QTLs detectados
Para analisar o conteúdo gênico nos intervalos dos QTLs detectados, os marcadores que
flaqueavam cada região identificada, foram alinhados com as sequências do genoma de Citrus
29
sinensis e suas posições foram determinadas. Esta posição foi considerada com uma coordenada
para que fosse então possível buscar na plataforma de dados http://citrus.hzau.edu.cn/orange/
os genes localizados dentro de cada intervalo e suas respectivas funções.
30
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Avaliações das características físico-químicas dos frutos
As características físico-químicas foram obtidas dos frutos produzidos pelos genitores
e pelos 278 indivíduos híbridos da família derivada do cruzamento entre tangor ‘Murcott’ e
laranja ‘Pera’ (Anexo A). Um exemplo dos frutos dos genitores está representado na Figura 1,
assim como um exemplo da diversidade fenotípica obtida na população segregante (Figura 2).
A relação entre altura e diâmetro dos frutos (A/D) é uma característica que pode
evidenciar se o fruto possui características similares a um dos genitores. Desta forma, frutos
com relação próxima a 1 apresentam forma arredonda, valores superiores a 1, formato oval
(laranja ‘Pera’) e inferiores, frutos mais achatados (tangor ‘Murcott’) (PACHECO et al., 2014).
Silva et al. (2009) analisando variedades de tangerinas e de híbridos constataram que a relação
A/D apresentou valores menores que 1, visto que os frutos apresentavam frutos achatados.
Figura 1 - Frutos dos genitores da progênie utilizada para constituir o mapa genético integrado
de (A) tangor ‘Murcott’ (Citrus reticulata Blanco × C. sinensis (L.) Osb.) e (B) laranja ‘Pera’
(C. sinensis)
31
Dentre a população de mapeamento, foram obtidos indivíduos com grande diversidade
em relação às características analisadas (Figura 2). É possível visualizar híbridos com diferentes
formatos, quantidades de sementes, espessuras e coloração de casca, quantidade e cor de polpa.
Figura 2 - Amostra da variabilidade fenotípica dos frutos de indivíduos da família derivada
do cruzamento entre tangor ‘Murcott’ x laranja ‘Pera’
Foram avaliadas as características de fruto: peso, altura, diâmetro, A/D, espessura da
casca, número de gomos, número de sementes, facilidade de descasque, rendimento do suco
(%), acidez, teor de sólidos solúveis totais (°Brix), ratio (SST/ATT), índice tecnológico e
número de frutos por caixa. As frequências de distribuição das médias para os valores dessas
características avaliadas ajustaram-se a uma distribuição normal (Figura 3). Os valores máximo
e mínimo, média e coeficiente de variação (%) para os caracteres peso, altura, diâmetro, A/D,
espessura da casca, número de gomos, número de sementes, facilidade de descasque,
rendimento, acidez, sólidos solúveis, ratio (SST/ATT), índice tecnológico e número de frutos
por caixa estão apresentados na Tabela 1.
Para algumas características, a variabilidade foi bastante evidente. Os frutos
apresentaram grandes diferenças em relação ao valor mínimo e máximo de peso dos
frutos (g), que variou de 36,8 a 353g. Da mesma forma, o número de gomos dos frutos oscilou
entre 8 a 21 gomos por frutos, assim como número de sementes, que variou de
0 a 44 sementes por fruto. O ratio, relação entre sólidos solúveis totais e acidez titulável total
(SST/ATT), variou de 2 a 31 e o número de frutos por caixa variou de 115 a 1108 (Tabela 1).
32
Para o rendimento de suco também foi observada variação dentre os híbridos analisados de 19,5
a 60,1%.
Para as demais características, houve variação mais discreta entre os valores. Para a
característica altura dos frutos, a variação foi de 3,5 a 8,8 cm; já para o diâmetro dos frutos, o
valor mínimo foi de 4,4 e máximo de 9,7 cm, e a relação altura e diâmetro (A/D) apresentou
variação limitada, sendo entre 0,7 a 1,2. Para a espessura da casca, os valores variaram
de 0,1 a 1,4 cm. Foi verificada também uma variação limitada para acidez dos frutos, no teor
de sólidos solúveis e no índice tecnológico, que variam de 0,3 a 2,8; 6,9 a 15,9; 0,7
a 3,2 respectivamente.
Em geral, a variabilidade dos dados obtidos (Coeficiente de variação = CV) se manteve
pequena, inferior a 25 % (Tabela 1), com exceção do número de sementes que foi a
característica que apresentou mais heterogeneidade de dados, com coeficiente de variação de
26,1 %. A partir dos valores obtidos para as 12 características dos frutos, foi estimada a
correlação de Pearson entre elas (Tabela 2).
Tabela 1 - Valor mínimo, valor máximo, média e coeficiente de variação (%) para as variáveis
peso (g), altura (cm), diâmetro (cm), A/D, espessura da casca (cm), número de gomos, número
de sementes, facilidade de descasque, rendimento (%), acidez (%), sólidos solúveis, ratio,
índice tecnológico e número de frutos por caixa na progênie F1 de tangor ‘Murcott’ e laranja
‘Pera’.
Característica Valor
mínimo
Valor máximo Média Coeficiente de
Variação (%)
Peso (g) 36,8 353,0 157,4 15,1
Altura (cm) 3,5 8,8 6,2 7,7
Diâmetro (cm) 4,4 9,7 6,9 6,1
A/D 0,7 1,2 0,9 5,6
Espessura de casca (cm) 0,1 1,4 0,4 23,9
Número de gomos 8,0 21 11,0 10,1
Número de sementes 0,0 44 17,0 26,1
Facilidade de descasque 1,0 3,0 1,7 7,7
Rendimento de suco (%) 19,5 60,1 45,4 8,4
Acidez (%) 0,3 2,8 1,2 17,0
Sólidos Solúveis 6,9 15,9 10,6 8,7
Ratio 2,0 31,0 9,0 19,4
Índice Tecnológico 0,7 3,2 1,97 12,4
Números de frutos por caixa 115 1108 273,8 20,9
33
Figura 3 - Frequências de distribuição das médias para os valores de peso (g), altura (cm), largura ou diâmetro (cm), relação altura/largura A/D,
espessura da casca (cm), número de gomos e sementes, facilidade de descasque (Valores de 1= difícil a 3= fácil), rendimento de suco (%), acidez
(ATT), teor de sólidos solúveis (SST), Ratio (SST/ATT), valor de índice tecnológicos (IT) e número de frutos por caixa da população segregante
contendo 278 indivíduos, e valores dos frutos obtidos dos genitores tangor ‘Murcott’ e laranja ‘Pera’ indicados pelas setas.
34
Tabela 2 -Valores de correlação de Pearson, coeficiente de determinação (R), entre todas as características avaliadas [peso (g), altura – A (cm),
diâmetro – D (cm), relação A/D, espessura da casca (cm), número de gomos e sementes, facilidade de descasque (Valores de 1= difícil a 3= fácil),
rendimento de suco (%), acidez, teor de sólidos solúveis (SST), Ratio (SST/ATT), valor de índice tecnológicos (IT) e número de frutos por caixa]
para valores obtidos de frutos derivados dos 278 indivíduos híbridos da população ‘Murcott’ x ‘Pera’.
Peso Altura Diâmetro A/D Espessura da
casca
Número de
gomos
Número de
sementes
Facilidade de
descasque
Rendimento
de suco Acidez
Sólidos Solúveis
(TSS)
Ratio Índice
tecnológico
IT
Número de frutos por
caixa
Peso 1 0,81** 0,88** 0,19** 0,05 0,05 -0,1* -0,1* -0,14** 0,12** -0,2** -0,34** 0,07 -0,12**
Altura 1 0,76** 0,58** 0,12* -0,02 -0,11** -0,11** -0,11** 0,03 -0,1* -
0,349** -0,02 -0,19**
Diâmetro 1 0,04 0 0,06 -0,11** -0,11** -0,11** 0,14** -0,27** -0,33** 0,13** -0,1**
A/D 1 0,14** -0,05 -0,03 -0,03 -0,05 -0,1* 0,12** -0,15** -0,16** -0,16**
Espessura da casca 1 -0,02 -0,04 -0,04 -0,17** -
0,21** -0,04 -0,03 0,01 -0,17**
Número de gomos 1 0,08* 0,08* -0,17** -0,06 -0,09* -0,08 0,08* -0,07
Número de sementes 1 0,1* -0,19** 0,04 0,02 0,03 0,01 0,04
Facilidade de descasque 1 -0,19** 0,04 0,02 0,03 0,01 0,04
Rendimento de suco 1 -0,02 0,01 0,08 0 0,02
Acidez 1 0,03 0,05 0,01 0,73**
Teor de Sólidos Solúveis
1 0,17** -0,81** 0,14
Ratio 1 0,2** 0,7**
Índice Tecnológico 1 0,14**
Número de caixa por
frutos 1
*valor de p< 0,05 ** valor de p< 0,01
35
As características que apresentaram valor de p significativo para correlação são
estatisticamente dependentes (Tabela 2). Assim, podemos inferir que a característica diâmetro
está positivamente relacionada com a altura, ou seja, quanto maior o diâmetro do fruto, maior
será sua altura. Garcia et al. (2000) observaram alta correlação entre o peso de frutos e o número
de sementes em citros. Entretanto, neste estudo, a correlação entre estas características se
manteve baixa (-0,1), provavelmente devido a grande variação do número de sementes
encontrada na progênie resultante do cruzamento ‘Murcott’ x ‘Pera’.
Houve correlação negativa significativa entre peso, altura do fruto, diâmetro dos frutos,
espessura da casca e número de gomos com o teor de sólidos solúveis. Viana et al. (2003)
também evidenciaram a ocorrência de correlações negativas entre os sólidos solúveis e
características físicas dos frutos, como altura, diâmetro e espessura da casca. Neste caso, em
que existe correlação negativa entre as variáveis estudadas, para a seleção de novos híbridos
torna-se necessária a utilização de estratégias para que o melhoramento de uma característica
não altere as demais negativamente.
5.2 Estudos genéticos
5.2.1 Genotipagem DArTseqTM
Os marcadores DArTseq desenvolvidos permitiram a genotipagem da população através
de milhares de marcadores ao longo de todo o genoma. Após rigorosos processos seletivos
baseados em diversos parâmetros de qualidade (Call rate) foi exportado um total de 27.960
marcadores DArTseq. Foram encontrados altos níveis de desvios de segregação (64,5%) para
os marcadores, que foram então excluídos (18.006) das análises, restando 9.939 marcas
DArTseq que não apresentaram desvios de segregação.
Em seguida, foi conduzida análise para verificar a fração de recombinação entre
marcadores. Para tanto, procedeu-se uma ordenação preliminar, sendo utilizado o algoritmo
RCD (rapid chain delineation; DOERGE, 1996). Com a ordenação preliminar, foi possível
remover marcadores que estavam distanciados com fração de recombinação nula. Com isso
foram disponibilizados 932 marcadores DArTseq para a construção do mapa.
Os marcadores exclusivos para cada um dos genitores apresentaram segregação 1:1,
assim, do total, 932 marcadores utilizados para a construção do mapa integrado,
394 segregaram para o genitor tangor ‘Murcott’, 378 a partir do genitor laranja ‘Pera’ e
160 marcadores em heterozigose foram comuns para ambos os genitores e apresentaram
36
segregação na proporção 3:1, perfazendo 17,2 % do total de marcadores mapeados. Esta
condição se torna um desafio para a obtenção de um mapa de ligação integrado, por duas razões:
primeiro, o número reduzido de marcadores com segregação 3:1, que são essenciais para a
integração entre os marcadores segregantes 1:1 para tangor ‘Murcott’ e ‘Pera’. Em segundo
lugar, os marcadores com segregação 3:1 são marcadores dominantes e, consequentemente,
menos informativos para a integração do que marcadores codominantes com segregação 1:2:1
e 1:1:1:1 (WU et al., 2002; GARCIA et al., 2006; OLIVEIRA et al., 2008).
O número de marcadores obtidos nas diferentes espécies varia de acordo com a base
genética e a abordagem empregada. Este fato pode ser evidenciado quando se compara o
número de marcadores obtidos no presente estudo (27.960) com o número de marcas obtidas
por Sansaloni et al. (2010), ao caracterizar uma população de eucalipto (7.680 marcadores
DArT). Gulsen et al. (2010), ao utilizarem diversas classes de marcadores SRAP (Sequence-
Related Amplified Polymorphism), SSR (Simple Sequence Repeats), ISSR (Inter-Simple
Sequence Repeat), POGP (Peroxidase Gene Polymorphism), RGA (Resistant Gene Analog) e
RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) em progênie segregante de Citrus, obtiveram
609 marcadores. Desta forma, evidencia-se a eficiência da tecnologia DArtseqTM, empregada
no presente trabalho, na obtenção de um grande número de marcadores.
Uma possível explicação para a elevada quantidade de marcadores com frequência de
recombinação zero pode ser resultado do tamanho da população empregada no procedimento
(278 indivíduos). No entanto, em comparação com trabalhos anteriores, onde foram utilizadas
populações com 52 ( LURO et al., 1995), 57 (KIJAS et al., 1997; MOORE, GUY e WEBER,
2000), 60 (JARRELL et al., 1992;CAI et al., 1994), 65 (DURHAM et al., 1992; GMMITTER
JR et al., 1996; DENG et al ., 1997), 72 (DALKILIÇ et al., 2005), 80 (GARCIA et al.,
1999;GARCIA, ASINS e CARBONELL, 2000; RUIZ e ASINS, 2002; SIVIEIRO et al., 2006),
87 (OLIVEIRA et al., 2004), 94 (OLIVEIRA, CRISTOFANI e MACHADO, 2004), 97 (CHEN
et al., 2007), 143 (BASTIANEL et al., 2009), 151 (RAGA et al., 2012) e 164 (GULSEN et al.,
2010 ) indivíduos, o presente estudo possui tamanho amostral relativamente grande (278).
Porém, se marcadores DArtseq detectam polimorfismos fisicamente próximos, pode-se sugerir
que mais indivíduos devam ser analisados para formar uma população de estudo, de forma que
seja possível detectar recombinações entre os marcadores. Neste cenário, com o advento de
tecnologias high-throughput sequencing, o desafio de obter um grande número de marcadores
na progênie foi superado, e agora o problema seria aumentar o tamanho da população utilizada.
Em espécies perenes arbóreas, assim como os citros, esta dificuldade é ainda maior, uma vez
que é necessária grande área experimental. No entanto, os marcadores que apresentaram
37
frequência de recombinação nula podem ser úteis em estudos utilizando a estratégia de
mapeamento por associação, em que o número de meioses ao longo de várias gerações, permite
encontrar recombinantes entre alguns desses marcadores.
Distorções de segregação também foram encontradas na maioria dos estudos anteriores
de mapeamento em citros (OLIVEIRA et al., 2008; RAGA et al.,2012). Utilizando marcadores
AFLP, observaram-se 61,5% de desvio de segregação para marcadores de laranja ‘Pera’
utilizando a mesma progênie do presente estudo (OLIVEIRA et al., 2007). Desvios de
segregações semelhantes (65%) foram encontrados no desenvolvimento de um mapa integrado
para uma população F2 em eucalipto utilizando marcadores DArT (SANSALONI et al., 2010).
Os altos níveis de distorção estão associados tanto com o tipo de marcador utilizado no estudo,
bem como com as espécies. Os possíveis responsáveis pela segregação distorcida em citros em
nível gamético e zigótico são a presença de fatores letais recessivos, o favorecimento de alguns
alelos na seleção gamética ou o aborto do embrião (RUIZ; ASINS, 2003). Já em relação ao
marcador utilizado, a tecnologia DArTseq possibilita a identificação de um grande número de
marcadores ao longo de todo o genoma de espécie; no entanto, a população de mapeamento do
estudo em questão, assim como a população de Eucaliptus (SANSALONI et al., 2010), possui
um tamanho relativamente pequeno em vista ao número de marcadores obtidos, sendo assim
um grande volume de marcas não foram polimórficas.
A exclusão de marcas que não aderiram ao teste X2 devido ao desvio da segregação
Mendeliana esperada pode comprometer a formação dos grupos de ligação e a saturação de
regiões com baixa densidade de marcas. Entretanto, caso estas marcas fossem inseridas na
análise de ligação, tanto a falta de acurácia na determinação das distâncias de mapa, quanto à
probabilidade de ocorrência do erro Tipo I (rejeição da hipótese nula) seriam muito maiores
(CLOUTIER; CAPPADOCIA; LANDRY, 1997).
Para a obtenção de um mapa integrado é importante dispor de um grande número de
marcadores com segregação 3:1 (GARCIA et al., 2006). Com o objetivo de verificar a
performance de marcadores DArT na construção de mapas para eucalipto, Sansaloni et al.
(2010) mapearam 811 marcas, sendo que 442 segregaram exclusivamente nos genitores e
369 segregaram na proporção 3:1, possibilitando assim a construção do mapa integrado que
depende de marcadores comuns aos genitores (3:1).
38
5.2.2 Construção do mapa genético
De acordo com a metodologia adotada para a construção do mapa, foi necessário reduzir
o número de marcadores para que fosse possível utilizar programa OneMap
(Figura 4).
Figura 4 - Fluxograma da redução do número de marcadores DArTseq ao longo da construção
do mapa de ligação tangor ‘Murcott’ e laranja ‘Pera’
Este estudo foi o primeiro a mapear marcadores DArtseq em citros utilizando a
metodologia proposta por Wu et al. (2002). Porém, devido à ausência de marcadores 3:1
suficientes em alguns grupos, foram formados grupos de ligação de tangor ‘Murcott’ (a) ou
laranja ‘Pera’ (b). O mapa genético integrado possui 13 grupos de ligação, refletindo os nove
cromossomos, que representam o número haplóide da espécie. O tamanho dos grupos variou
de 40,48 cM (LG9) a 484,73 cM (LG1a), com um tamanho total de 2774,29 cM (Figura 1,
Tabela 1) e as distâncias entre os marcadores dos diferentes grupos de ligação variou de 0,1 a
38,45 cM, com uma distância média de 4,38 cM entre marcadores.
39
Tabela 3 - Número de marcadores distribuídos em nove grupos de ligação de acordo com a
segregação mendeliana
Grupo de
Ligação
Número de Marcadores
DArTseq
Marcadores
C
Marcadores
D1
Marcadores
D2
Tamanho
(cM)
Grupo 1a 56 1 55 0 484,73
Grupo 1b 68 0 0 68 120,92
Grupo 2 74 17 38 19 204,77
Grupo 3 81 17 37 27 307,30
Grupo 4a 39 0 39 0 159,41
Grupo 4b 23 2 0 21 72,69
Grupo 5 109 24 44 41 423,30
Grupo 6a 29 10 19 0 109,63
Grupo 6b 32 10 0 22 150,39
Grupo 7a 33 5 28 0 230,40
Grupo 7b 60 4 0 56 428,51
Grupo 8 38 17 14 7 162,98
Grupo 9 19 19 0 0 40,48
Total 661 109 274 261 2774,29
*D1, D2 e C marcadores codificados de acordo com o manual do programa OneMap. D1: marcadores com
segregação 1:1 para o genitor tangor ‘Murcott’; D2: marcadores com segregação 1:1 oriundos do genitor
laranja ‘Pera’; e C: marcadores que apresentaram segregação 3:1, ou seja, estavam presente em ambos
genitores da população de mapeamento.
40
Figura 5 - Mapa de ligação integrado construído no software OneMap. Com 13 grupos de ligação e tamanho total de 2.774,29 cM. Grupos de
ligação com “a”- tangor ‘Murcott’ e “b”- laranja ‘Pera’. Marcadores C em preto, D1em azul e D2 em vermelho.
100043365|F|0100047706|F|0100121025|F|0100009817|F|0100044072|F|0100048683|F|0100042598|F|0100007494|F|0100016074|F|0100021513|F|0100026956|F|0100010108|F|0100033543|F|0100136377|F|0100033816|F|0100015653|F|0100013968|F|0100019114|F|0100020764|F|0100024581|F|0100023165|F|0100026747|F|0100037191|F|0100013760|F|0100035549|F|0100014668|F|0100079182|F|0100026230|F|0100025204|F|0100034235|F|0100006195|F|0100023733|F|0100033701|F|0100056695|F|0100092263|F|0100130000|F|0100024306|F|0100036921|F|0100048623|F|0100152131|F|0100024678|F|0100036978|F|0100067889|F|0100029341|F|0100030619|F|0100047536|F|0100032731|F|0100066868|F|0100004885|F|0100034793|F|0100038429|F|0100040644|F|0100053933|F|0100055606|F|0100060945|F|0100031447|F|0
1a
100036308|F|0100030477|F|0100036253|F|0100138027|F|0100092012|F|0100054539|F|0100180740|F|0100022734|F|0100042241|F|0100045318|F|0100035012|F|0100050067|F|0100013717|F|0100052202|F|0100081197|F|0100026896|F|0100190220|F|0100054901|F|0100035256|F|0100030403|F|0100048834|F|0100050777|F|0100057275|F|0100046790|F|0100039428|F|0100048771|F|0100024888|F|0100016923|F|0100058991|F|0100051903|F|0100044040|F|0100063551|F|0100046361|F|0100017685|F|0100021350|F|0100047352|F|0100038507|F|0100038628|F|0100059476|F|0100081837|F|0100047690|F|0100051250|F|0100048635|F|0100022542|F|0100039911|F|0100018022|F|0100044863|F|0100028716|F|0100008878|F|0100071277|F|0100041028|F|0100198628|F|0100018948|F|0100062508|F|0100072566|F|0100035771|F|0100042667|F|0100058224|F|0100176861|F|0100038518|F|0100201564|F|0100067719|F|0100133284|F|0100053472|F|0100067197|F|0100051426|F|0100016171|F|0100035956|F|0
1b
100127072|F|0100041304|F|0100049416|F|0100053019|F|0100023586|F|0100027164|F|0100030003|F|0100047634|F|0100049170|F|0100052363|F|0100005393|F|0100010655|F|0100048020|F|0100015968|F|0100032019|F|0100178883|F|0100033643|F|0100031642|F|0100023287|F|0100022752|F|0100038366|F|0100192535|F|0100021344|F|0100038927|F|0100022759|F|0100038792|F|0100106070|F|0100030419|F|0100012707|F|0100131736|F|0100051917|F|0100063215|F|0100017682|F|0100037372|F|0100033171|F|0100019780|F|0100017387|F|0100168007|F|0100008127|F|0100034641|F|0100122609|F|0100051658|F|0100049547|F|0100044707|F|0100045193|F|0100027833|F|0100042899|F|0100132096|F|0100203143|F|0100007832|F|0100172963|F|0100007398|F|0100096700|F|0100002668|F|0100160311|F|0100019782|F|0100030733|F|0100025561|F|0100095610|F|0100124699|F|0100020689|F|0100015129|F|0100189388|F|0100055320|F|0100029986|F|0100060935|F|0100032422|F|0100058317|F|0100035564|F|0100019944|F|0100015786|F|0100124039|F|0100022302|F|0100083499|F|0
2
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3
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4a
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4b
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6a
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6b
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7b
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9
0
20
40
60
80
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320
340
360
380
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420
440
460
480
41
No mapa obtido no presente estudo, foram encontrados em média de 0,12 e 0,56
marcadores/cM. Os grupos de ligação, LG1a e LG1b apresentaram a menor e maior densidade,
respectivamente, com uma distância média de 1,7 e 8,6 cM entre os marcadores. Ollitrault et
al. (2012) construíram um mapa de referência de Clementina (961 marcadores e 1084,1 cM).
Os autores verificaram que o tamanho dos grupos de ligação variou de 87,5 cM (LG9) a 186,3
cM (LG3); LG7 e LG8 apresentaram uma densidade relativamente baixa de marcadores, com
uma média de 0,45 e 0,52 marcadores/cM, respectivamente. Em média, cerca de um marcador
por cM foi encontrado nos outros grupos de ligação do mapa de Clementina que foi considerado
como de média densidade. Seguindo este conceito, também podemos considerar o mapa
integrado de tangor ‘Murcott’ e laranja ‘Pera’ como de média densidade, já que desde os 932
marcadores disponíveis para construir o mapa, a apenas 661 foram efetivamente posicionados
nos grupos de ligação.
No que diz respeito à extensão do mapa, o tamanho do genoma de citros foi estimado
entre 1500 e 1700 cM (LANDER et al., 1987; JARREL et al., 1992). Neste estudo, utilizando
a função Kosambi (1943), o mapa integrado obtido apresentou 2774,29 cM, superando, assim,
os demais mapas obtidos para citros. A principal razão para extensão do mapa seria a presença
dos quatro grupos (1, 4, 6 e 7) onde não foi possível a completa integração, devido ao número
reduzido de marcas com segregação 3:1. Desta forma, a construção de um único grupo de
ligação não iria fornecer resultados consistentes, portanto, optou-se pela estratégia de separação
em dois grupos com a integração entre os marcadores D1 e C e marcadores D2 e C. Para
aumentar a integração das marcas neste mapa, é necessária a inclusão de marcadores
codominantes, especialmente com segregação 1:2:1 e 1:1:1:1, que podem ser encontrados em
outros sistemas de marcadores moleculares, tais como SNP e SSR, que provavelmente
integrarão esses quatro grupos, reduzindo o comprimento mapa.
Mapas genéticos para o tangor ‘Murcott’ e laranja ‘Pera’ foram previamente obtidos
com base em RAPD e marcadores AFLP por Oliveira et al. (2007), usando a estratégia pseudo-
testcross. Garcia et al. (2006) relataram que a estratégia de usar o mapa integrado, que inclui
marcadores com diferentes segregações, fornece vantagens sobre a dupla estratégia pseudo-
testcross. Estas vantagens incluem maior saturação devido à utilização de marcadores com
diferentes classes de segregação e, em particular, facilita a detecção de QTL. De acordo com
Carlier (2006), à medida que a cobertura de um mapa genético aumente, o número de grupos
de ligação se aproxima do número haplóide de cromossomos para a espécie e o número de
marcadores não ligados se aproxima de zero.
42
5.2.3 Mapeamento de QTL utilizando o software FullsibQTL
O mapeamento de QTL foi realizado para as seguintes características: peso (g), altura
(cm) diâmetro (cm), relação de altura/diâmetro, espessura da casca (cm) número de gomos,
número de sementes, facilidade de descasque, rendimento de suco (%), acidez total titulável
(%), teor de sólidos solúveis totais, relação de sólidos solúveis/acidez ou ratio, índice
tecnológico e número de frutos por caixa. De acordo com a análise feita pelo método do
Mapeamento por Intervalo Composto (CIM) e o LOD Score crítico obtido pelo teste de
permutação (Tabela 3), considerando-se todas as características analisadas, um total de 19 QTL
foram detectados em 7 grupos de ligação (Figura 6, Tabelas 4 e 5). Não foi possível detectar
QTL associados às características peso dos frutos e espessura da casca. O índice tecnológico
(TI) foi a característica que apresentou o maior número de QTLs (5 QTLs).
De forma geral, os valores de LOD score críticos calculados foram elevados, variando
de 4,76 (Sólidos Solúveis) a 10,77 (espessura da casca). Já os LOD score dos QTLs detectados
variaram de 4,60 a 16,44, evidenciando regiões consistentes. Os valores de variação fenotípica
(R2) explicada pelos QTLs se mantiveram baixos, variando de 0,04% a 9,7%, o que indica a
natureza poligênica dessas características. Como a maioria dos marcadores possui segregação
1:1, esta também foi a segregação mais presente nos QTLs detectados (encontrada em 7 dos 19
QTLs). Porém, outros tipos de segregação, tais como 1:2:1, 3:1 e 1:1:1:1 também foram
identificadas, o que é uma vantagem do mapeamento de QTL em um mapa genético integrado,
uma vez que estes QTLs não iriam ser encontrados em abordagem duplo pseudo-testcross
(SOUZA et al., 2013; GAZAFFI et al., 2014).
43
Tabela 4 - Valores de LOD score críticos resultantes do teste de 1000 permutações no software
FullsibQTL e número de QTLs identificados para as diversas características físico-químicas de
frutos estudadas.
Característica Teste de permutação/LOD
score
Número de QTLs
Peso 7,03 0
Altura (A) 5,25 2
Diâmetro (D) 5,48 1
A/D 5,36 1
Espessura da casca 10,77 0
Número de gomos 6,22 1
Número de sementes 5,20 2
Facilidade de Descasque 6,49 1
Rendimento de suco 5,41 2
Acidez (ATT) 7.49 1
Sólidos Solúveis Totais (SST) 4,76 1
Ratio 6,48 1
Índice Tecnológico 5,76 5
Frutos por caixa 6,68 1
44
Figura 6. Mapeamento de QTL para o tamanho dos frutos (altura, diâmetro, relação entre
altura/diâmetro e número de frutos por caixa), características internas (número de gomos,
número de sementes, fácilidade de descaque e rendimento de suco) e de qualidade (acidez,
sólidos solúveis, ratio (acidez titulável/sólidos solúveis) e índice tecnológico.
45
Tabela 5 - QTLs identificados para as características de fruto peso (g), altura (cm), diâmetro (cm), relação A/D, espessura da casca (cm), número
de gomos e sementes, facilidade de descasque, rendimento de suco, acidez, teor de sólidos solúveis, ratio, índice tecnológico e número de frutos
por caixa
Característica G.L cM Marcadores flanqueadores LOD p LOD q LOD pq LOD Seg. R2
Altura 4b 54 100084126|F|0-100027978|F|0 7.96 -0.020 0.02 0.25 6.32 -0.06 0.21 1:1 2,0
Altura 5 331 100081813|F|0-100037856|F|0 5,38 -0.075 1.23 0.04 0.44 0.13 3.04 1:2:1 1,58
Diâmetro 8 32,25 100020211|F|0 5,95 0,14 3,78 -0,12 2,97 0,02 0,13 1:2:1 9.7
A/D 4b 52,23 100084126|F|0 5,87 0,02 0,67 0,01 2,41 -0,00 0,14 1:1 3,8
Frutos por caixa 8 32,25 100020211|F|0 10,90 -19,63 5,04 14,51 2,88 -11,2 1,62 3:1 9,7
Número de gomos 5 315,12 100013979|F|0 10,23 0,3 4,16 -0,39 5,9 -0,25 2,8 3:1 1,7
Número de sementes 3 148,90 100059880|F|0 5,23 1,91 3,68 1,90 2,54 1,59 2,06 3:1 1,8
Número de sementes 8 30,42 100039927|F|0 5,86 0,48 0,33 1,36 2,46 -1,21 1,9 1:2:1 9,3
Facilidade de descasque 3 126,49 100029799|F|0 16,43 -0,18 2.5 0,41 12,1 0,06 0,47 1:1:1:1 2,6
Rendimento de suco 3 121,71 100032263|F|0 6,58 1,17 1,57 -1,86 4,23 -0,46 0,29 1:2:1 0,7
Rendimento de suco 6b 0,0 100034495|F|0 7,63 -0,46 0,11 2,29 7,47 NA NA 1:1 1,1
Acidez 6b 130,73 100040907|F|0 8,43 -0,0 0,0 0,07 2,55 -0,08 3,03 1:2:1 4,0
Sólidos Solúveis 5 311,68 100065152|F|0 5,2 0,17 0,94 0,19 1,37 -0,3 3.32 3:1 2,0
Ratio 6b 100 100020025|F|0-100077391|F|0 7,74 0,18 0,35 -0,37 1,40 0,76 3,5 1:2:1 7,2
Índice Tecnológico 4 116,15 100044015|F|0 5,7 0,1 5,7 NA NA NA NA 1:1 0,04
Índice Tecnológico 5 340,0 100034974|F|0-100104371|F|0 12,47 0,05 1,36 0,08 4,5 -0,11 7,37 1:1:1:1 1,7
Índice Tecnológico 6b 34,0 100084924|F|0-100033965|F|0 8,26 0,05 1,73 0,1 5,47 0,11 4,69 1:1:1:1 3,4
Índice Tecnológico 7 83,51 100036043|F|0 5,87 0,07 2,74 0,06 2,25 0,09 3,13 3:1 1,8
Índice Tecnológico 8 73,53 100043537|F|0 5,97 -0,09 5,32 0,05 1,52 0,05 1,56 1:2:1 8,7
G.L=grupo de ligação, cM= posição em centimorgan do QTL identificado, LOD=LOD score, p= efeito para o genitor ‘Murcott’, q=efeito
para o genitor laranja ‘Pera’, pq=efeito da interação dos genitores da população de mapeamento, Seg= segregação do QTL, R2= variação
fenotípica explicada em expresso em percentual.
46
As características altura, diâmetro, relação entre altura/diâmetro e número de frutos por
caixa foram relacionadas com o tamanho dos frutos. Para estas características, foram
identificados cinco QTLs, nos grupos de ligação 4b (54 cM e 52,23 cM), 5 (331 cM) e 8 (32,25
cM). Considerando a altura dos frutos, dois QTL foram mapeados com padrão de segregação
1:1 (LG4b a 54 cM) e outro com segregação 1:2:1 (LG 5 em 331 cM) explicando 3,58% da
variação fenotípica (R2). O primeiro QTL apresentou um efeito aditivo do genitor ‘Pera’ e o
segundo, um efeito significativo aditivo de tangor ‘Murcott’ e também de dominância. Ao
considerar o mapeamento de QTL para diâmetro dos frutos, apenas um QTL foi encontrado
(LG8 a 32,25 cM), explicando 9,7% da variação fenotípica, com ambos os genitores mostrando
efeitos aditivos significativos, gerando um QTL com padrão de segregação 1:2:1. Para a relação
altura/diâmetro um único QTL foi mapeado no LG 4b a 52,23 cM, que responde por 3,8% da
variação fenotípica, e seu padrão de segregação 1:1 resultou em um efeito aditivo significativo
do genitor ‘Pera’. Além deste, outro QTL foi mapeado no LG 8 a 32,25 cM para o número de
frutos por caixa, que apresentou um valor de R2 de 9,7% e segregação 3:1, uma vez que todos
os seus efeitos genéticos foram significativos.
Deve-se notar que a altura e a relação altura/diâmetro tem uma correlação significativa
de 0,58 (Tabela 2). Isto também é evidenciado pelo resultado de mapeamento de QTL, uma vez
que partilham um QTL comum, separados por apenas 1,77 cM, ambos com padrão de
segregação 1:1, e com efeito significativo para o genitor ‘Pera’. No entanto, isto não se verifica
com a altura/diâmetro e o diâmetro, em que a correlação é de 0,04. Provavelmente, pode-se
sugerir que a relação altura/diâmetro reflete mais a variação observada da característica altura
do que diâmetro.
Outra comparação pode ser feita entre o número de frutos por caixa e o diâmetro dos
frutos, que apresentam uma correlação significativa de -0,10. Estas características partilham um
QTL no LG8 em 32,25 cM, com efeito aditivo de tangor ‘Murcott’ e também do genitor ‘Pera’,
a principal diferença é o sinal de ambos os genitores, ou seja, quando, para a característica
diâmetro, for encontrado um efeito positivo, um efeito significativo negativo será encontrado
para o número de frutos por caixa.
Seis QTLs para as características de frutos (número de gomos, número de sementes,
facilidade de descaque e rendimento de suco) foram mapeados nos grupos de ligação 3 (121,71
cM, 126,49 cM e 148,90 cM), 5 (315,12 cM), 8 (30,42 cM) e 6b (0,0 cM). Para o número de
gomos, apenas um QTL foi mapeado no LG 5 a 315,12 cM, com um valor de R2 de 1,7% e
segregação 3:1, devido aos três efeitos significativos encontrados. Para a facilidade de
descasque, um QTL foi detectado no LG 3 a 126,49 cM, explicando 2,6% de variação fenotípica
47
e apresentando 1:1:1:1 como padrão de segregação. Para o número de sementes, dois QTL
foram identificados, no LG 3 a 148,90 cM e no LG 8 a 30,42 cM, sendo responsável por 11,1%
da variação fenotípica quando considerados conjuntamente. O primeiro mostrou padrão de
segregação 3:1 e o segundo 1:2:1 devido ao efeito aditivo do genitor ‘Pera’ e também do efeito
significativo de dominância. Para o rendimento de suco, dois QTL foram mapeados, um sobre
LG 3 a 121,71 cM, com padrão de segregação 1:2:1 e outro no LG 6b a 0,0 cM, com segregação
de 1:1 devido ao efeito aditivo significativo para o genitor ‘Pera’.
Para as características de qualidade dos frutos (acidez, sólidos solúveis, ratio ou acidez
sólidos solúveis/acidez titulável, e índice tecnológico) foram identificados 8 QTLs. Foi
mapeado um QTL para a acidez no grupo de ligação 6b a 130,73 cM, com padrão de segregação
1:2 1 devido ao efeito aditivo do genitor ‘Pera’ e também do efeito de dominância, sendo
responsável por 4% da variação fenotípica. Para o teor de sólidos solúveis, outro QTL foi
detectado no grupo de ligação 5 a 311,68 cM, com valor de R2 de 2% e com segregação de 3:1,
já que todos os efeitos genéticos foram significativos. Considerando o ratio (sólidos
solúveis/acidez titulavel), uma única região foi detectada no LG 6b a 100 cM, com padrão de
segregação 1:2:1 devido ao efeito significativo aditivo do genitor ‘Pera’ e também do efeito de
dominância, este QTL explicou 7,2% da variação fenotípica. Para índice Tecnológico, foram
identificados cinco QTLs, no LG 4 a 116,15 cM, LG 5 a 340 cM, LG 6b em 34 cM,
LG 7 de 83,51 cM e LG 8 a 73,53 cM, explicando em conjunto 15,64% da variação do
fenotípica. O QTL localizado no LG 4 possui LOD score de 5,7 e o menor valor de R2 observado
para todos os caracteres, com 0,04%, e apenas um efeito aditivo significativo do genitor
‘Murcott’, segregando na proporção 1:1. O segundo QTL mapeado para o índice tecnológico
no LG 5 teve o mais alto pico com um LOD score de 12,47 e um valor de R2 de 1,7%, este QTL
possui segregação de 1:1:1:1 com efeito aditivo significativo para os genitores e também para
a dominância. O QTL mapeado no grupo de ligação 6b apresenta um LOD score de 8,26 e um
valor de R2 de 3,4 %, com efeitos aditivos dos genitores ‘Murcott’ e ‘Pera’ e um efeito
significativo de dominância que resulta em um padrão de segregação 1:1:1:1. O primeiro e
único QTL detectado no grupo de ligação 7 apresentou LOD score de 5,87 e um valor de R2 de
1,8%, segregando na proporção de 3:1. O último QTL detectado para o índice tecnológico foi
localizado no grupo de ligação 8 com LOD score de 5,97, um R2 de 8,7 e com padrão de
segregação de 1:2:1.
Considerando todos estes QTL, algumas comparações podem ser observadas. A
facilidade de descasque e o rendimento de suco apresentam uma correlação de -0,19, o que
também se reflete no mapeamento de QTL; por exemplo, no LG3 para as duas características
48
foram detectados QTL espaçados por 4,78 cM. Os efeitos genéticos para ambos os genitores
estão em repulsão, sugerindo que a seleção para o mesmo sentido destas características é um
desafio devido à sua ligação e / ou efeito pleiotrópico. Outra comparação é o número de
sementes e o diâmetro dos frutos (correlação de -0,11), que tem um QTL em comum no LG6b,
espaçados por 2,25 cM, com o mesmo padrão de segregação (1:2:1), porém com efeitos
divergentes. Aqui, o único efeito genético que está presente em ambas características é a
aditividade do genitor ‘Pera’ em fase de repulsão. Para tangor ‘Murcott’, o efeito aditivo é
significativo apenas para o diâmetro, já o de dominância está presente somente no QTL para o
número de sementes.
Considerando o número de gomos e o teor de sólidos solúveis (correlação de -0,09),
pode-se encontrar QTLs para as duas características no LG7 espaçados por 5,44 cM. Neste
caso, todos os três efeitos genéticos são significativos, e os efeitos para tangor ‘Murcott’ e para
a dominância estão em fase de ligação; por outro lado, os efeitos do genitor ‘Pera’ estão em
repulsão.
O índice tecnológico (TI) foi obtido a partir da seguinte fórmula: TI = teor de sumo (%)
x sólidos solúveis totais (Brix) x peso da caixa da indústria de citros padrão (40,8 kg) / 10000.
No entanto, uma comparação direta entre estas características não é possível, assim como QTLs
próximos não foram encontrados. Por exemplo, no LG5 apresenta um QTL para sólidos
solúveis e também para o índice tecnológico, mas espaçados por 28,27 cM. Isto também ocorre
em LG6b, em que QTLs são espaçados por 34 cM.
Em suma, o mapeamento de QTL para todas as características indica mais de dois QTLs
detectados para cada característica, com exceção de IT (cinco QTL). Além disso, as proporções
estimadas de variação fenotípica (R2) explicadas pelos QTLs mapeados neste estudo tiveram
valores baixos, sendo o maior valor R2 foi de 9,7%. Budahn et al. (2009) relataram que QTLs
de maior efeito são responsáveis por mais de 45% da variação fenotípica, o que não é observado
aqui. Todos estes resultados indicam claramente o fato de que estas características são
controladas por muitos genes e o efeito individual de um desses genes no fenótipo é pequena.
No entanto, um maior número de QTLs para as características não foi identificado, talvez
devido ao tamanho relativamente pequeno da população (278 indivíduos), o que pode
influenciar na quantidade de recombinações identificadas pelos marcadores DArtseq e
consequentemente no número de QTLs detectados.
Por um lado, isso mostra a complexidade das características associadas à produção e /
ou qualidade dos frutos, no entanto, regiões comuns foram encontradas para diferentes
características nos LG5 (311,68 - 315,12 cM), LG6b (32,25 cM), LG 7 (311-315,12 cM). Essas
49
correlações não eram fortes, mas ainda assim significativas, podendo assim ser sugerido como
regiões candidatas para futuros estudos para uma melhor compreensão dessas características.
Vale a pena notar que a comparação entre os QTLs mapeados neste estudo com outros
é difícil, porque a maioria das características mapeadas neste estudo não foram investigadas
anteriormente. O mapa obtido neste estudo é o primeiro integrado com marcadores DArTseq.
Outros fatores que fazem a comparação dos resultados um desafio são os genitores das
populações e as metodologias utilizadas, uma vez que não são comparáveis.
5.3 Análise comparativa entre o mapa de ligação e o genoma de C. sinensis
Foi então realizada a comparação entre as sequências dos marcadores do mapa com o
genoma de C. sinensis. A partir da visualização gráfica dos resultados do blastn (Figura 18), foi
possível verificar que basicamente que todos os grupos de ligação apresentam completa sintenia
com o genoma de referência utilizado, com exceção de marcadores que foram localizados no
cromossomo Un (Chr unassigned) ou aqueles que não estavam presentes no genoma de
C.sinensis (Chr N).
50
Figura 7 - Comparação dos grupos de ligação construídos com o genoma de C. sinensis,
disponível em: http://citrus.hzau.edu.cn/orange/. Posicionadas à esquerda as siglas LG
representam os grupos de ligação construídos (LG1a, LG1b, LG2, LG3, LG4a, LG4b, LG5,
LG6a, LG6b, LG7a, LG7b, LG8, LG9), os quais representam o mapa integrado da população
‘Pera’ x ‘Murcott’. Os grupos de ligações com “a” (tangor ‘Murcott’) e “b”(laranja ‘Pera’) se
referem a grupos parcialmente integrados. Já as abreviações Chr (Chr1, Chr2, Chr3, Chr4, Chr5,
Chr6, Chr7, Chr8, Chr9), ilustram os cromossomos do genoma de referência utilizado. O Chr
Un (Chr unassigned) é um segmento do genoma de referência onde estão todas as sequências
que não foram posicionadas nos pseudocromossomos. O Chr N representa todas as sequências
que não foram alinhadas no genoma de Citrus sinensis
51
Dentre as sequências, 69,3% foram localizadas nos cromossomos de correspondência,
9,97% foram localizadas no Chr Un, e 20,7% das sequências dos marcadores não foram
encontrados no genoma de referência utilizado (Chr N), o que revela que o mapa de ligação
construído contém sequências que anteriormente não estavam posicionadas no genoma de
referência.
Uma análise abrangente do projeto do genoma de laranja doce (Citrus sinensis)
proposta por Xu et al., (2012) mostrou que 87,3% do genoma estimado de laranja foi coberto.
75% das sequência montadas do genoma foram ancoradas aos nove grupos de ligação com os
marcadores genéticos correspondentes utilizados, os outros 15% foram não atribuído aos nove
grupos de ligação. Nesta parte, o estudo das sequências Un que foram distribuídas dentros os
treze grupos que representam os nove cromossomos podem contribuir para montagem do
genoma de referência.
Uma vez que o mapa se mostrou sintênico com o genoma, foi possível analisar a co-
linearidade entre as sequências presentes no genoma da laranja doce e o mapa de ligação inte-
grado construído no presente trabalho (Figura 8).
52
Figura 8 - Comparação entre as posições dos marcadores dispostos nos grupos de ligação do mapa integrado e pseudocromossomos de C. sinensis
(Chr). Os grupos de ligações obtidos neste estudo estão representados por 1a, 1b, 2, 3, 4a, 4b, 5, 6a, 6b, 7a, 7b, 8 e 9, os Chr1, Chr2, Chr3, Chr4,
Ch5, Ch6, Chr7, Chr8, Chr9 representam os cromossomos do genoma de C. sinensis. As linhas que horizontais que ligam os grupos e os
cromossomos representam a ordenação e colinearidade dos marcadores ancorados no mapa com as sequências do genoma.
53
A análise comparativa do genoma de C. sinensis e o mapa de ligação mostraram uma
colinearidade significativa. No entanto, evidenciam-se eventos de rearranjo cromossômico,
tanto inversões e translocações. Os grupos de ligação 1, 2, 8 e 9 apresentaram total colinearidade
com o genoma de referência, ou seja, a ordem dos marcadores ancorados é a mesma que se
encontra nas sequências do genoma. Já nos demais grupos, 3, 4, 5, 6 e 7, foram localizadas
regiões onde ocorreram inversões e mudança na ordem dos marcadores, possivelmente devido
á recombinação ocorrida nos gametas dos genitores da população. Esta análise comparativa só
é possível quando há disponibilidade do genoma sequenciado da espécie, ou marcadores
comuns entre os diferentes mapas de ligação (THUMMA et al., 2010).
5.4 Conteúdo gênico nos intervalos de QTLs detectados
Os marcadores DArTseqTM, que flanquearam os QTLs detectados para as características
estudadas, foram então posicionados na atual versão do genoma de referência de Citrus
(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/) e suas coordenadas foram usadas para buscar os genes
presentes nos intervalos. No total, 19 regiões foram analisadas quanto ao conteúdo gênico,
somando 17 modelos gênicos. Em média, foi obtido um modelo gênico por QTL detectado. O
QTL detectado para a alturados frutos no grupo de ligação 5 foi o que apresentou maior
conteúdo gênico presumível (2), dentre os demais analisados. Por outro lado, não foram
identificados genes no genoma referência nas regiões dos QTLs para o rendimento de suco e
para o índice tecnológico (Tabela 6).
54
Tabela 6 - QTLs detectados para cada característica e os modelos gênicos preditos observados
nos intervalos genômicos correspondentes na versão atual do genoma de referência de Citrus
sinensis
Características GL Gene Função
Altura 4b Cs4g03340 Mitochondrial outer membrane protein porin of 36
kDa
Altura 5
orange1.1t011
58
Cs5g13910
HAT family dimerisation domain containing protein,
expressed;Putative AC transposase; Putative AC9
transposase
Putative uncharacterized protein
Diâmetro 8 Cs8g03420 Branched-chain-amino-acid aminotransferase 2,
chloroplastic
A/D 4b Cs4g03340 Mitochondrial outer membrane protein porin of 36
kDa
Número de
gomos 5
orange1.1t008
27 N.D.
Número de
sementes 3 Cs3g07490 DNA polymerase epsilon catalytic subunit A
Número de
sementes 8 Cs8g02790
Putative uncharacterized protein Sb01g041340;Actin-
depolymerizing factor 5; Actin-depolymerizing factor
(Fragment); Putative actin-depolymerizing factor 8;
Actophorin; Cofilin; Cofilin-1B; Cofilin-1A;
Cofilin/actin-depolymerizing factor homolog; Cofilin-
4; Destrin
Facilidade de
descasque 3 Cs3g07400
Transposable element protein, putative,
Retrotrans_gag
Rendimento
de suco 3 N.D.
Rendimento
de suco 6b Cs6g02380
Serine carboxypeptidase-like 29;Virulence-related
protein Nf314;Similar to Hordeum vulgare
carboxypeptidase D
Acidez 8 Cs6g07720
Mitogen-activated protein kinase-binding protein 1;
WD repeat-containing protein 62; Echinoderm
microtubule-associated protein-like 5;Novel protein
similar to vertebrate mouse mitogen-activated protein
kinase binding protein 1-like (MAPKBP1) (Fragment)
Sólidos
Solúveis 5 N.D.
Ratio 6b Cs6g07610
Putative acetyl co-enzyme A carboxylase
carboxyltransferase alpha subunit;Acetyl-coenzyme A
carboxylase carboxyl transferase subunit alpha,
chloroplastic; Acetyl-coenzyme A carboxylase carboxyl
transferase subunit alpha
IT 4 Cs4g03200
Probable xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase
protein 23; Xyloglucan
endotransglucosylase/hydrolase protein 22;
Brassinosteroid-regulated protein BRU1 Continua
55
Conclusão
Tabela 6 - QTLs detectados para cada característica e os modelos gênicos preditos observados
nos intervalos genômicos correspondentes na versão atual do genoma de referência de Citrus
sinensis
IT 5 Cs5g14460
Coiled-coil domain-containing protein 94 homolog;
Coiled-coil domain-containing protein 94; Cell cycle
control protein cwf16; Protein CWC16;Synaptic
vesicle transporter SVOP and related transporters
(Major facilitator superfamily) (ISS)
IT 6b Cs6g01810
IT 8 Cs7g05440
Lectin protein kinase family protein, putative,
expressed;G-type lectin S-receptor-like
serine/threonine-protein kinase SD2-5; Probable
receptor-like protein kinase At5g20050
IT 8
Frutos por
caixa 6b Cs8g03420
Branched-chain-amino-acid aminotransferase 2,
chloroplastic; Branched-chain-amino-acid
aminotransferase 6; Putative branched-chain-amino-
acid aminotransferase 7
A co-localização de QTLs tem sido utilizada principalmente em espécies florestais,
como em Pinus taeda (BROWN et al., 2003), Pinus pinaster (POT et al., 2006) e
Picea glauca (PELGAS et al., 2011; PETROLI, 2013), como uma maneira de sugerir possíveis
genes candidatos ou para validar genes candidatos de forma indireta. No entanto, esta
abordagem pode apontar para diversos genes, com funções conhecidas ou desconhecidas
(GION et al., 2011).
No presente trabalho, por exemplo, foram identificadas sequências em regiões QTLs
associadas com o índice tecnológico (IT), com elevada homologia com a enzima xiloglucano
endotransglicosilase/hidrolase (XTH) (Tabela 6). Esta enzima estaria relacionada com o
processo de amadurecimento de frutos de morango (OPAZO et al., 2010). O IT, do presente
trabalho, está relacionado com o amadurecimento da fruta, pois é baseado no conteúdo solúvel
sólido e de suco. Assim, este gene e outros relacionados com esta função podem ser bons
candidatos para análise funcional visando ao melhoramento de citros.
56
6 CONCLUSÕES
Os marcadores DArTseq, assim como a estratégia de mapeamento utilizada, possibilitou
a construção do mapa integrado para tangor ‘Murcott’ e laranja ‘Pera’, que representa o número
haploide de cromossomos da espécie e alta cobertura genômica.
Devido às restrições operacionais do programa utilizado (OneMap) não foi possível
utilizar os 9.939 marcadores DArTseq para a construção do mapa integrado.
Através do estudo de sintenia e colinearidade, foi possível concluir que o mapa
construído, possui alta sintenia e colinearidade com o genoma de referência utilizado.
Dentre as características estudadas, foi possível identificar 19 QTLs. Apenas para as
características peso e espessura da casca não foram detectados QTLs.
A co-localização entre QTLs para os intervalos dos mesmos, sugere a existência de
regiões genômicas possivelmente relacionadas com as características analisadas. Esta
abordagem contribuiu para identificar genes candidatos para as características quantitativas
relacionadas à qualidade dos frutos de citros.
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