Aus dem Institut für Anatomie und Zellbiologie der Universität Würzburg Lehrstuhl für Anatomie II

Vorstand: Professor Dr. med. D. Drenckhahn

Lokalisierung und Charakterisierung von Zellkontaktproteinen im olfaktorischen Epithel

INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung der Doktorwürde der

Medizinischen Fakultät der

Bayerischen Julius-Maximilians-Universität zu Würzburg vorgelegt von

Anna Sofia Meier-Stiegen aus Hamburg

Würzburg, August 2004

Referent: Prof. Dr. med. E. Asan Korreferent: Prof. Dr. med. D. Drenckhahn Dekan: Prof. Dr. med. S. Silbernagl Tag der mündlichen Prüfung: 25. Januar 2005 Die Promovendin ist Assistenzärztin

Die Einsicht oder Ansicht, dass das Vollkommene und die Wissenschaft

Stückwerk ist, darf niemanden daran hindern, doch stets weiterzubauen

und eben doch das Mögliche zu erreichen.

(Hermann Hesse, unveröffentlichte Briefe)

Inhaltsverzeichnis

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung 1

1.1 Topographie und Morphologie der Riechschleimhaut 2

1.2 Interzellularkontakte der Riechschleimhaut 9

1.3 Die Familie der Cadherine 13

1.4 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit 14

2. Material 15

2.1 Geräte und übrige Materialien 15

2.2 Chemikalien 15

2.3 Puffer 16

2.4 Antiseren 16

2.5 Größenstandard 19

2.6 Peptid 86-2 19

3. Methoden 20

3.1 Perfusion von Geweben 20

3.2 LR-White-Einbettung 20

3.3 Epon-Einbettung 21

3.4 Trimmen 21

3.5 Semidünnschnitte 22

3.6 Lichtmikroskopie 22

3.7 Ultradünnschnitte 22

3.8 Kontrastierung von Ultradünnschnitten 22

3.9 Immunelektronenmikroskopie 23

3.10 Silberverstärkung nach Danscher 23

3.11 Herauslösen von Epon aus Semidünnschnitten 24

3.12 Fluoreszenzimmunhistochemie 24

3.13 Herstellung eines Peptidantikörpers 25

3.13.1 Koppelung von Peptid an KLH 25

3.13.2 Aufbereitung von Dialyseschläuchen 25

3.13.3 Dialyse der Lösung von KLH-gekoppeltem Peptid gegen PBS 26

3.13.4 Immunisierung eines Kaninchens 26

Inhaltsverzeichnis

3.13.5 Aufbereitung und Testung des Immunserums 27

3.13.6 Affinitätsreinigung des Immunserums 27

3.14 Amidoschwarz-Proteinbestimmung 28

3.15 Bradford-Proteinbestimmung 29

3.16 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page) 29

3.17 Immunreplikanalyse (Western-Blot) 30

4. Ergebnisse 33

4.1 Darstellung von Proteinen der Zonula occludens im olfaktorischen

Epithel 33

4.2 Darstellung von Proteinen der Zonula adherens im olfaktorischen

Epithel 35

5. Diskussion 56

6. Zusammenfassung 64

7. Literaturverzeichnis 65

Danksagung und Lebenslauf

Einleitung 1

1. Einleitung

Zellen eines Organismus bilden Kontakte zu zellulären und extrazellulären

Komponenten ihrer Umgebung aus, um vielfältigste Funktionen in so unterschiedlichen

Bereichen wie der Entwicklung von Zellen und Geweben, der Gerinnung und der

Immunantwort zu erfüllen (Vaughn et al., 1996; Petruzzelli et al., 1999). Im Verlauf der

letzten Jahre konnten zahlreiche Erkenntnisse über die daran beteiligten

Kontaktproteine gewonnen werden. Insbesondere die Möglichkeit, diese

Kontaktproteine auf molekularer Ebene zu charakterisieren, erlaubte deren Einteilung in

die Familie der Cadherine, der Immunglobuline, der Integrine und der Selektine

(Petruzzelli et al., 1999).

Eine der interessantesten Aufgaben der Kontaktproteine ist ihre Beteiligung an der

Entwicklung des zentralen Nervensystems. Hierbei sind von besonderer Bedeutung die

Proteine der Cadherin-Superfamilie. Sie wurden als Bestandteile von Synapsen

identifiziert und scheinen als solche an Bildung und Plastizität synaptischer

Verbindungen beteiligt zu sein (Suzuki et al., 1997; Tang et al., 1998; Manabe et al.,

2000; Tanaka et al., 2000).

Ein einzigartiger Abschnitt des zentralen Nervensystems ist das olfaktorische System.

Die ersten Neurone der Riechbahn sind bipolare Sinneszellen, die in der

Riechschleimhaut, einem Neuroepithel, lokalisiert sind. Sie sind die einzigen Neurone,

die in unmittelbarem Kontakt zur Außenwelt stehen. Durch die Ausbildung

epitheltypischer Kontakte zu umgebenden Zellen sind sie an der Epithelbarriere

beteiligt. Sie differenzieren sich aus neuronalen Vorläuferzellen, die im basalen

Kompartiment des olfaktorischen Epithels gelegen sind. Diese Basalzellen besitzen ein

Leben lang die Fähigkeit zur Zellteilung und Differenzierung. Damit verbunden ist das

Wachstum und die Zielfindung von Axonen sowie die Ausbildung synaptischer

Verbindungen.

Aufgrund dieser hohen Plastizität ist das Riechepithel ein ideales Modell zur

Untersuchung von Zellkontakten insbesondere der Nervenzellen (Miragall et al., 1994;

Alenius et al., 1997).

Einleitung 2

1.1 Topographie und Morphologie der Riechschleimhaut

Die Riechschleimhaut des Nagers (Pars olfactoria tunicae mucosae nasi) hat eine Fläche

von ungefähr 62 mm2 und kleidet beidseits die obere Hälfte der Nasenscheidewand und

der lateralen Nasenwand sowie das Nasendach aus (Mendoza, 1993). Ihre Abgrenzung

zur respiratorischen Schleimhaut (Pars respiratoria tunicae mucosae nasi) ist unscharf.

Es finden sich auch versprengte Anteile des mehrreihigen Flimmerepithels inmitten des

sensorischen Epithels (Shipley et al., 1995).

Die Riechschleimhaut besitzt ein mehrreihiges Epithel. Es setzt sich aus folgenden

Zelltypen zusammen: Stützzellen (SZ), Sinneszellen (olfaktorische Neurone, ON),

Basalzellen (BZ), Mikrovillizellen (MV) sowie Zellen des Ausführungsganges der

Bowmanschen Drüsen (AZ). Eine Basalmembran bildet die Grenze zur Lamina propria.

In deren Bindegewebe sind zahlreiche Blutgefäße, die tubuloazinösen Bowmanschen

Drüsen sowie die von olfaktorischen Schwannzellen umgebenen Fila olfactoria (=

gebündelte Axone der Sinneszellen) enthalten. Letztere bilden zusammengenommen

den Nervus olfactorius (Mendoza, 1993).

Die Zellkörper der verschiedenen Zelltypen der Riechschleimhaut liegen in Schichten

übereinander. Von basal nach apikal findet sich die Basalzellschicht, die

Sinneszellschicht und die Stützzellschicht. Zellkörper der Mikrovillizellen liegen in der

oberflächlichen Sinneszellschicht und der Stützzellschicht. Die Zellkörper der Zellen

des Ausführungsganges der Bowmanschen Drüsen durchziehen das olfaktorische

Epithel vertikal (Abb. 1.1.1).

Einleitung 3

Abb. 1.1.1: Das olfaktorische Epithel.

Links ein mit Methylenblau gefärbter Semidünnschnitt, rechts ein schematischer

Longitudinalschnitt durch das olfaktorische Epithel der Ratte (aus Asan, E. in:

Benninghoff-Drenckhahn, 2004). MV: Mikrovillizellen; SC: Stützzellen; ON:

olfaktorische Neurone; B: Basalzellen; AZ: Ausführungsgangszellen; LP: Lamina

propria; Maßstab linkes Bild: 20 µm.

Aufgrund ihrer typischen Lage und Morphologie können die einzelnen Zelltypen der

Riechschleimhaut meist in licht- und elektronenmikroskopischen Gewebepräparaten

erkannt werden. Darüberhinaus ist ihre Identifizierung durch charakteristische

Zytoplasma- und Plasmamembranproteine mit immunhistochemischen Methoden

möglich.

Stützzellen sind säulenförmige Zellen. Basal erreichen sie die Basalmembran, apikal

mit ihrem Mikrovillisaum das Lumen der Nasenhöhle. Ihr Kernniveau liegt über dem

der Sinneszellen. Das apikale Zytoplasma ist reich an glattem endoplasmatischen

Retikulum, das in parallel liegenden Lamellen angeordnet ist (Mendoza, 1993). Basal

finden sich zahlreiche lipofuszinähnliche lamellierte dichte Körperchen lysosomaler

Natur, welche die Riechschleimhaut makroskopisch gelbbräunlich erscheinen lassen

(Drenckhahn et al., 1994). Apikal sind die Stützzellen untereinander und mit

benachbarten Dendriten der Sinneszellen durch Zellkontakte verbunden, die

elektronenmikroskopische Charakteristika von Zonulae occludentes, Zonulae

Einleitung 4

adherentes und Desmosomen aufweisen (Mendoza, 1993). Stützzellen besitzen das für

sie typische Intermediärfilament Zytokeratin 18 (CK-18) (Abb. 1.1.2; Drenckhahn et al.,

1994).

Basalzellen finden sich dicht über der Basalmembran. Es werden zwei Gruppen

unterschieden, rundliche und horizontale (Mendoza, 1993). Rundliche Basalzellen

haben einen euchromatinreichen Kern und, im Gegensatz zu horizontalen Basalzellen,

keine Tonofilamente oder Ribosomen. Rundliche Basalzellen unterliegen ständiger

mitotischer Aktivität. Erst vor kurzem konnte gezeigt werden, daß rundliche Basalzellen

neuronale Stammzellen sind (Jang et al., 2003). Während der Differenzierung ihrer

Tochterzellen zu olfaktorischen Neuronen wandert der Zellkörper nach apikal, der

Zellkern wird euchromatinreicher, der Dendrit erstreckt sich entlang der Stützzellen zur

Oberfläche des olfaktorischen Epithels und das Axon bahnt sich seinen Weg durch die

Basalmembran in die Lamina propria (Morrison et al., 1992). Horizontale Basalzellen

sind polygonal, haben einen heterochromatinreichen Kern und zahlreiche

Tonofilamente (Drenckhahn et al., 1994). Sie umgeben die zur Lamina propria

ziehenden intraepithelialen kleinen Faszikel der Sinneszell-Axone (Mendoza, 1993).

Ihre Funktion ist letztlich nicht geklärt.

Die Zellen des Ausführungsganges der Bowmanschen Drüsen haben einen

kuboidalen Zellkörper. Dessen Längsachse verläuft parallel zur Richtung des

Ausführungsganges. Seine luminale Plasmamembran enthält zahlreiche Mikrovilli (aus

Asan, E. in: Benninghoff-Drenckhahn, 2004) Die Ausführungsgangzellen sind

epithelialer Herkunft und CK-18 positiv (Abb. 1.1.2). Ihre basolaterale Plasmamembran

enthält Na+/K+-ATPase. Die Bowmanschen Drüsen produzieren den Riechschleim. Es

wird vermutet, daß Zellen der Drüsen oder des Ausführungsganges Stammzellen der

epithelialen Zellen des olfaktorischen und des respiratorischen Epithels sind (Jang et al.,

2003).

Einleitung 5

Abb. 1.1.2: Stützzellen, Mikrovillizellen und Zellen des Ausführungsgangs der Bowmanschen

Drüsen.

Inkubation eines longitudinalen Semidünnschnitts durch das olfaktorische Epithel mit

CK-18-Antikörper und Gam-Cy3. AZ: Ausführungsgangszelle; MV: Mikrovillizelle;

SZ: Stützzelle; Maßstab: 20 µm; (Abbildung: E. Asan).

Die Sinneszellen der Riechschleimhaut sind bipolare Neurone. Ihr Dendrit, der reich an

Mitochondrien und Miktrotubuli ist, zieht geradewegs oder gewunden nach apikal. Im

Bereich des Epithelsaumes ist er kolbenförmig zum 1 bis 2 µm im Durchmesser großen

dendritischen Kolben („olfactory knob“) aufgetrieben. Darin befinden sich

Basalkörperchen, aus denen ca. 10 bis 25 Riechgeißeln hervorgehen. Diese besitzen in

ihrem Anfagsteil ein typisches 9 x 2 + 2-Mikrotubulusskelett. Mit zunehmender Länge

nimmt die Anzahl der Mikrotubuli jedoch ab (Moran et al., 1982). Zwischen

benachbarten Sinneszellen und Stützzellen sind auf Höhe der Riechkolben Zellkontakte

bandförmig angeordnet. Der Zellkörper der Neurone liegt unter dem der Stützzellen.

Basal entspringt das 0,1 bis 0,7 µm im Durchmesser große Axon. Es wird oftmals von

Fortsätzen der Stützzellen umgeben. Intraepithelial bilden mehrere Axone kleine

Faszikel, die, von Ausläufern der horizontalen Basalzellen umhüllt, die Basalmembran

durchbrechen und sich in der Lamina propria zu größeren Bündeln sammeln. Diese

erreichen über die Lamina cribrosa des Os ethmoidale die Schädelhöhle, wo sie als N.

olfactorius zum Bulbus olfactorius ziehen (Morrison et al., 1992). Alle Sinneszellen

Einleitung 6

sind reich an β-Tubulin, da sie ein Mikrotubulussystem haben, welches den Dendriten,

den Zellkörper und das Axon durchzieht. Zudem findet sich in ihrer basolateralen

Memban Na+/K+-ATPase, die unter anderem nach Aktionspotentialen das

Ruhemembranpotential wieder herstellt (Abb. 1.1.3).

Eine Besonderheit olfaktorischer Sinneszellen ist das olfaktorische Markerprotein OMP

(Margolis, 1972; Abb. 1.1.3). Es findet sich ausschließlich in Dendrit, Zellkörper und

Axon reifer olfaktorischer Neurone (Morrison et al., 1992). Dabei handelt es sich um

ein niedrigmolares saures Protein, das möglicherweise trophische Funktionen hat

(Drenckhahn et al., 1994).

Abb. 1.1.3: Sinneszellen des olfaktorischen Epithels.

Inkubation von longitudinalen semidünnen Folgeschnitten durch das olfaktorische

Epithel mit OMP-Antikörper (links) und β-Tubulin-Antikörper (rechts). OMP-

Antikörper markieren Zilien, Dendriten, Zellkörper und Axone der olfaktorischen

Neurone, β-Tubulin-Antikörper hauptsächlich Zilien, Dendriten und Axone; Maßstab:

10 µm; (Abbildung: E. Asan).

Mikrovillizellen sind regelmäßig vorkommende Bestandteile des olfaktorischen

Epithels. Ihr Verhältnis zu Sinneszellen beträgt 1:10 bis 1:20. Ihre birnenförmigen

Zellkörper sind apikal lokalisiert. Sie besitzen einen apikalen Fortsatz, von dem

ausgehend die namensgebenden Mikrovilli in das Lumen der Nasenhöhle ragen. Ihr

Einleitung 7

Zytopolasma ist relativ arm an Organellen. Meist werden zwei Typen unterschieden.

Viele Mikrovillizellen haben einen ca. 0,4 bis 0,6 µm dünnen basalen axon-ähnlichen

Fortsatz (Morrison et al., 1992).

Abb. 1.1.4: Mikrovillizelle.

Ultradünner Longitudinalschnitt durch das apikale olfaktorische Epithel. Pfeil: Apikaler

Zellkontakt. MV: Mikrovilluszelle; SZ: Stützzelle; Maßstab: 1 µm.

Mikrovillizellen sind epithelialer Herkunft und synthetisieren das Intermediärfilament

Zytokeratin 18. Sie zeigen deutliche Immunreaktivität gegenüber Ankyrin in ihrer

basolateralen Plasmamembran (Abb. 1.1.5). Bei Mikrovillizellen vom Typ 1 findet sich

Villin im Bereich der apikalen Mikrovilli sowie der basolateralen Plasmamembran.

Mikrovillizellen vom Typ 2 sind reich an Na+/K+-ATPase, die in der basolateralen

Plasmamembran lokalisiert ist. Morphologische und immunhistochemische Befunde

legen eine Identifizierung von Mikrovillizellen vom Typ 1 als Bürstenzellen nahe,

welche möglicherweise chemosensitive Funktion haben (Hofer et al., 1999). Die

Aufgabe der Mikrovillizellen vom Typ 2 ist nicht geklärt. Mikrovillizellen vom Typ I

und II unterscheiden sich in ihrem Gehalt an einzelnen Proteinen (Tab. 1.1.1; Asan et

al., 1999).

Einleitung 8

Abb. 1.1.5: Mikrovillizelle.

Inkubation eines longitudinalen Semidünnschnitts durch das olfaktorische Epithel mit

Ankyrin-Antikörper und Gam-Cy3; Maßstab: 10 µm.

Mikrovillizellen Typ I

(Bürstenzellen)

Mikrovillizellen Typ II

Ankyrin + ++

β-Tubulin (+) (+)

Cytokeratin 18 (CK 18) ++ ++

E-Cadherin ++ ++

Na+/K+-ATPase (+) ++

Villin ++ -

Tab. 1.1.1: Immunreaktivität der Mikrovillizellen vom Typ I und II.

Erscheinungsbild der Zellgrenzen und Interzellularkontakte im histologischen

Schnittbild

Im Longitudinalschnitt stellen sich die Zellgrenzen zwischen allen Zelltypen als mehr

oder weniger longitudinale Streifen dar (Abb. 1.1.6). Das Schema der Zellgrenzen im

Tangentialschnitt beruht zunächst auf theoretischen Überlegungen und Literaturangaben

(Abb. 1.1.6). Es basiert auf der Beobachtung, dass Dendriten im Bereich ihres apikalen

Endes durch Stützzellen teilweise oder vollständig eingehüllt werden (Mendoza, 1993;

Miragall et al., 1994; Hussar et al., 2002). Sollte dies auch der Fall für die apikalen

Enden der Mikrovillizellen sein, deren Durchmesser im Vergleich zu dem der Dendriten

größer ist, könnte sich im apikalen Tangentialschnitt ein Bild für die Zellgrenzen wie

Einleitung 9

unten gezeigt ergeben: Zellgrenzen zwischen Stützzellen hätten eine polygonale Form,

Zellgrenzen zwischen Stützzellen und Mikrovillizellen wären in Form größerer Kreise

zu erwarten, Zellgrenzen zwischen Stützzellen und Dendriten in Form kleinerer Kreise.

Da die Ausführungsgangszellen das Epithel longitudinal durchziehen, wären im

Tangentialschnitt die Kontakte zwischen Stützzellen und Ausführungsgangszellen als

sehr große Kreise, die Kontakte zwischen Ausführungsgangszellen als radiäre Linien

innerhalb dieser Kreise zu erwarten (siehe auch Abb 4.2.11).

Abb. 1.1.6: Schematische Darstellung der Markerproteine und der möglichen Topographie

der Zellgrenzen für die Zelltypen des olfaktorischen Epithels.

Schema eines Longitudinalschnittes und eines apikalen Tangentialschnittes durch das

Riechepithel. Gelb: Cytokeratin 18; rot: Na+/K+-ATPase; grün: β-Tubulin oder OMP;

hellblau: Villin; dunkelblau: Ankyrin; (Abbildung: E. Asan).

1.2 Interzellularkontakte der Riechschleimhaut

Das elektronenmikroskopische Bild der Riechschleimhaut zeigt im apikalen Bereich

typische epitheliale Interzellularkontakte. Dabei können der Barrierenkontakt Zonula

occludens („tight junction“) sowie die Adhäsionskontakte Zonula adherens und Macula

adherens (Desmosom) identifiziert werden. Die Kombination aus Zonula occludens,

Einleitung 10

Zonula adherens und Macula adherens wird Haft- oder Schlußleistenkomplex genannt

(Drenckhahn et al., 1994). Lateral finden sich zudem Puncta adherentia.

Alle Interzellularkontakte weisen vergleichbare Strukturen auf. Transmembranproteine

bilden extrazellulär homo- oder heterotypische Zell-Zell-Kontakte aus. Intrazellulär sind

sie mit zytoplasmatischen Plaqueproteinen verbunden, welche den Kontakt zum

Zytoskelett herstellen, regulatorische Funktionen haben und an der Signaltransduktion

beteiligt sind (Balda et al., 2003).

Die Zonula occludens ist der am meisten apikal gelegene epitheliale

Interzellularkontakt, der die Zellmembran in eine apikale und eine basolaterale Domäne

unterteilt. Dies ist Voraussetzung sowohl für die Entstehung als auch für die

Aufrechterhaltung der physiologischen Funktionen eines epithelialen Gewebes. Hierzu

gehören die Zellpolarität, die intramembranäre Diffusionsbarriere, die semipermeable

parazelluläre Diffusionsbarriere und der selektive transzelluläre Transport (Creijido,

1999; Balda et al., 2000). Erst vor kurzem wurde die Zonula occludens mit Vorgängen

wie der Regulierung von Zelldifferenzierung und Zellproliferation in Zusammenhang

gebracht. Dies scheint über die Modulierung bekannter Signaltransduktionsvorgänge zu

erfolgen (Li et al., 2000; Reichert et al., 2000; Vietor et al., 2001).

Elektronenmikroskopische Aufnahmen von Gefrierbrüchen zeigen, daß die Zonula

occludens aus einem Netzwerk an Leisten besteht (Staehelin, 1973). Deren

Molekularstruktur war bis vor kurzem kaum bekannt. Mittlerweile sind drei

Transmembranproteine identifiziert: Occludin (Abb. 1.2.1), die Claudine und die JAMs

(„junctional adhesion molecules“) (Van Itallie et al., 1997; Martin-Padura et al., 1998;

Kubota et al., 1999). Alle drei Proteine vermitteln Interzellularkontakte. Occludin und

die Claudine sind funktionelle Bestandteile der semipermeablen parazellulären

Diffusionsbarriere (Balda et al., 2003). Die Transmembranproteine stehen im

Zytoplasma mit Adaptorproteinen der MAGUK-Familie („membrane-associated

guanylate kinases“), den Proteinen mit PDZ-Domäne („PSD-95, Discs large A, ZO-1

homology“; Abb. 1.2.1) und zahlreichen Regulatorproteinen und Proteinen der

Signaltransduktion wie Proteinkinasen, Proteinphosphatasen, kleinen und

heterotrimeren GTP-bindenden Proteinen und Regulatoren der Transkription in Kontakt

Einleitung 11

(Tsukita et al., 2001; Gonzalez-Mariscal et al., 2003). Die Zonula occludens hat

Beziehung zum Aktin-Zytoskelett (Balda et al., 2003).

Abb. 1.2.1: Zonula occludens und Zonula adherens, vereinfachtes Schema (Abbildung: D.

Drenckhahn).

Die Zonula adherens ist einer der bedeutendsten Interzellularkontakte (Balda et al.,

2003). Sie ist basal der Zonula occludens gelegen und umgibt gürtelförmig die

apikolaterale Plasmamembran. Die Transmembranproteine der Zonula adherens sind die

klassischen Cadherine E-Cadherin, N-Cadherin, P-Cadherin, R-Cadherin, und B-

Cadherin (Gumbiner, 1996; Petruzzelli et al., 1999). Sie sind unter anderem über β-

Catenin oder das nahe verwandte Plakoglobin (γ-Catenin) mit α-Catenin verbunden.

Zum Zytoskelettprotein F-Aktin stellt α-Catenin entweder einen direkten oder einen

indirekten Kontakt über die Aktin-bindenden Proteine α-Actinin oder Vinculin her

(Abb. 1.2.1). Sowohl die klassischen Cadherine als auch die Aktin-bindenden Proteine

sind zelltypspezifisch (Itoh et al., 1999; Nagafuchi, 2001; Pokutta et al., 2002). Vor

kurzem wurde auch Nektin als Transmembranprotein der Zonula adherens identifiziert.

Es steht über Afadin/AF-6 mit dem Aktin-Zytoskelett in Verbindung (Takai et al.,

2003).

In epithelialen Geweben bilden Zonulae adherentes erste Interzellularkontakte aus, in

deren Folge Zonulae occludentes und Maculae adherentes entstehen (Gumbiner et al.,

1988; Adams et al., 1996). Sie stabilisieren und verändern Gewebestrukturen (Mooseker

et al., 1984), regulieren die parazelluläre Permeabilität (Madara et al., 1987; Madara,

Einleitung 12

1987; Madara et al., 1988) und können kleinere epitheliale Defekte schließen (Bement

et al., 1993). Proteine, die mit der Zonula adherens assoziiert sind, sind an der

Regulation der Genexpression und an der Signaltransduktion beteiligt (Balda et al.,

2003).

Puncta adherentia sind kleine, fleckförmige Adherenskontakte. Ihre molekulare

Struktur entspricht der der Zonula adherens.

Im Gegensatz zur Zonula adherens, die in jeder Zelle vorkommt, findet sich die Macula

adherens (Desmosom) in Epithelzellen, den Glanzstreifen der Herzmuskelzellen,

Arachnoidalzellen und follikulär dendritischen Retikulumzellen des Lymphknotens. Sie

ist nicht in Form eines Gürtels, sondern einer im Durchmesser 0,1 bis 0,5 µm2 großen

Fläche basal der Zonula adherens angeordnet (Drenckhahn et al., 1994). Als

Haftproteine werden die Transmembranproteine der Desmogleine (Dsg1, Dsg2, Dsg3)

und Desmocolline (Dsc1, Dsc2, Dsc3) unterschieden, die zu den desmosomalen

Cadherinen gehören. Zytoplasmatisch sind sie über Plakoglobin und Plakophiline mit

Desmoplakin und wahrscheinlich weiteren Proteinen der Plakin-Familie (Plektin,

Envoplakin, Periplakin) verbunden. In diese zytoplasmatischen Plaques strahlen Bündel

von Intermediärfilamenten ein (Ishii, 2003).

Desmosomale Cadherine können antigene Ziele von Autoimmunerkrankungen sein,

deren Symptome die Bedeutung der Proteine bezüglich der Ausbildung von Zell-Zell-

Kontakten und der Aufrechterhaltung epithelialer Integrität deutlich machen.

Autoantikörper gegen Dsg1 rufen Pemphigus foliaceus hervor, Autoantikörper gegen

Dsg3 verursachen Pemphigus vulgaris (Amagai, 1999), Dsc1 ist Ziel des IgA-

Pemphigus (Hashimoto et al., 1997), und der paraneoplastische Pemphigus wird durch

Autoantikörper gegen Proteine der Plakin-Familie und Dsg3 verursacht (Amagai et al.,

1998). Zudem ist Dsg1 Ziel des Exfoliatin A, ein von Staphylococcus-aureus-Stämmen

der Phagengruppe II gebildetes Toxin, das die Impetigo contagiosa und das

staphylogene Lyell-Syndrom auslöst (Amagai et al., 2000).

Einleitung 13

1.3 Die Familie der Cadherine

Die Familie der Cadherine besteht aus der Gruppe der klassischen Cadherine, der

Desmogleine, der Desmocolline, der Protocadherine, der CNR („cadherin-related

neuronal receptor“)-Proteine, der Fat-Proteine, der Cadherine mit sieben

Transmembrandomänen und der Ret-Tyrosinkinasen. Die ca. 80 bekannten Cadherine

sind Transmembranproteine. Die einzelnen Gruppen unterscheiden sich zum einen in

der Anzahl der extrazellulären Domänen, zum anderen in der Aminosäuresequenz der

transmembranären und zytoplasmatischen Domäne (Yagi et al., 2000).

Am längsten bekannt und am intensivsten untersucht ist die Gruppe der klassischen

Cadherine. Dabei handelt es sich um transmembranäre Glykoproteine, die

kalziumabhängig Zell-Zell-Kontakte herstellen (Magee et al., 1991; Grunwald, 1993).

Gewöhnlich treten gleiche (homophile Kontakte) und nur ausnahmsweise ungleiche

(heterophile Kontakte) Vertreter der Proteingruppe miteinander in Kontakt. Die

klassischen Cadherine setzen sich aus fünf extrazellulären Domänen, einer

transmembranären Domäne und einer zytoplasmatischen Domäne zusammen

(Grunwald, 1993). Im Bereich der ersten extrazellulären Domäne befindet sich bei

verschiedenen Cadherinen (u.a. E-Cadherin, N-Cadherin) die Aminosäuresequenz HAV

(Histidin-Alanin-Valin), welche möglicherweise an der Ausbildung der

Transinteraktion der Cadherine beteiligt ist. Der C-Terminus jeder extrazellulären

Domäne enthält eine Bindungsstelle für Kalziumionen. Diese scheinen durch

Stabilisierung der Struktur des Cadherins den Zell-Zell-Kontakt indirekt zu beeinflussen

(Vaughn et al., 1996). Interzellularkontakte werden wahrscheinlich durch Cadherin-

Dimere vermittelt. Der Interzellularkontakt wird nach derzeitiger Vorstellung durch

einen „linear zipper“ hergestellt, in dem sich die Cadherin-Dimere wie ein

Reißverschluß ineinanderfügen (Shapiro et al., 1995a; Shapiro et al., 1995b).

Desmogleine und Desmocolline besitzen eine den klassischen Cadherinen sehr ähnliche

extrazelluläre Domäne, unterscheiden sich aber deutlich in der Aminosäuresequenz

ihrer zytoplasmatischen Domäne (Ishii, 2003).

Auf der Suche nach neuen Gruppen der Cadherine wurden aus dem Gehirn von Ratten

Proteine isoliert, die aus sechs bis sieben extrazellulären Domänen, einer

transmembranären Domäne und einer zytoplasmatischen Domäne aufgebaut sind (Sano

Einleitung 14

et al., 1993; Yagi et al., 2000). Da die extrazellulären Domänen Ähnlichkeiten mit den

klassischen Cadherinen aufwiesen, wurde die Gruppe „Protocadherine“ genannt. Die

zytoplasmatische Domäne unterscheidet sich jedoch deutlich (Sano et al., 1993).

Protocadherine bilden homotypische Interzellularkontakte aus. Bislang sind keine

Proteine bekannt, die intrazellulär mit ihnen in Verbindung stehen. Protocadherine sind

an der Embryogenese beteiligt (Yagi et al., 2000).

Die Gruppe der mit den Cadherinen verwandten neuronalen Rezeptoren CNR

(„cadherin-related neuronal receptor“) hat wie die Protocadherine sechs extrazelluläre

Domänen, eine transmembranäre Domäne und eine zytoplasmatische Domäne, die mit

der Tyrosinkinase Fyn interagiert (Kohmura et al., 1998). Fyn ist an der Regulation von

Struktur und Funktion des Gehirns beteiligt (Yagi et al., 2000).

1.4 Zielsetzung der vorliegenden Arbeit

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Lokalisierung und Charakterisierung von

Proteinen der Barrieren- und Adhäsionskontakte im olfaktorischen Epithel. Hierzu

wurde die Riechschleimhaut der Ratte für immunhistochemische, licht- und

elektronenmikroskopische sowie biochemische Experimente aufbereitet. Das Gewebe

wurde mit Antikörpern inkubiert, die gegen Transmembranproteine und

zytoplasmatische Plaqueproteine der Zellkontakte gerichtet waren. Durch die

gleichzeitige Detektion spezifischer Markermoleküle der verschiedenen Zelltypen des

olfaktorischen Epithels wurde die genaue zelltypspezifische Zusammensetzung der

Zellkontakte dargestellt.

Material 15

2. Material

2.1 Geräte und übrige Materialien

Elektronenmikroskop EM 109 Zeiss, Jena

Elektronenmikroskop LEO AB912 Omega LEO, Oberkochen

Fluoreszenzmikroskop BH2-RFCA Olympus, Hamburg

Fotolaborchemikalien Whatman, Göttingen

Hyperfilm ECL Amersham Biosciences, Freiburg

Nitrozellulosemembran Amersham, Braunshweig

Plastikreaktionsgefäß Eppendorf, Hamburg

Schneidemaschine für Semidünnschnitte Reichert-Jung, Nussloch

Schwarz-Weiß-Filme TMAX 400 Kodak, Rochester, USA

Semi-Dry-Blot-Gerät Kreuz, Reiskirchen

Spektralphotometer Beckmann, Palo Alto, USA

Tischzentrifuge 5415 C Eppendorf, Hamburg

Ultracut E Reichert-Jung, Nußloch

Vakuumblot-Gerät Typ V jr. Schleicher und Schuell, Dassel

2.2 Chemikalien

Amidoschwarz Serva, Heidelberg

Ampuwa Fresenius Kabi, Bad Homburg

Blei (II)-zitrat-3-hydrat Merck, Darmstadt

BSA (Bovine Serum Albumine) 10% Serva, Heidelberg

CWFS (cold water fish skin) Sigma, Deisenhofen

Epon Serva, Heidelberg

GLA (Glutaraldehyd) 25% Roth, Karlsruhe

Glyzerin Roth, Karlsruhe

KLH Calbiochem-Novabiochem,

Nottingham

LR-White Agar Scientific, Berkshire

Material 16

Magermilchpulver Molkerei Feldental

Methylenblau Chroma, Stuttgart

Natriummethanolat Fluka, Steinheim

N-Propylgallat Serva, Heidelberg

(3,4,5-Trihydroxybenzoesäurepropylester)

Ponceau S Sigma, Deisenhofen

SDS (Natriumdodecylsulfat) Applichem, Darmstadt

Serva-Blau G 250 (Coomassie) Serva, Heidelberg

Tween 20 Roth, Karlsruhe

Uranylazetatdihydrat MERCK, Darmstadt

2.3 Puffer

PBS (phosphate buffered saline) 137 mM NaCl

2,7 mM KCl

8,1 mM Na2HPO4

1,5 mM KH2PO4

2.4 Antiseren

Erstantikörper:

α-Actinin-Antikörper, polyklonal Institut für Anatomie und

Zellbiologie, Würzburg

α-Catenin-Antikörper, monoklonal BDTL, Heidelberg

Ankyrin-Antikörper, polyklonal Institut für Anatomie und

Zellbiologie, Würzburg

β-Tubulin-Antikörper, monoklonal Sigma, Deisenhofen

β-Catenin-Antikörper, monoklonal BDTL, Heidelberg

CK-18-Antikörper, monoklonal Progen, Heidelberg

E-Cadherin-Antikörper, monoklonal STL

Material 17

Na+/K+-ATPase-Antikörper, polyklonal Institut für Anatomie und

Zellbiologie, Würzburg

N-Cadherin-Peptidantikörper, polyklonal Sigma, Deisenhofen

N-Cadherin-Fusionsprotein-Antikörper, polyklonal s. Fannon et al., 1996

Occludin-Antikörper, polyklonal Zymed, San Francisco, USA

Pan-Cadherin-Antikörper, polyklonal Sigma, Deisenhofen

ZO-1-Antikörper, monoklonal Biotrend, Köln

Zweitantikörper:

Garat-Cy3 (= goat-anti-rat Cy3): Jackson ImmunoResearch

Cy3 (Cyanine)-konjugiertes Ziege-anti-Ratte-IgG Laboratories, West Grove,

USA

Garb-Cy2 (= goat-anti-rabbit Cy2): Jackson ImmunoResearch

Cy2 (Cyanine)-konjugiertes Ziege-anti-Kaninchen IgG Laboratories, West Grove,

USA

Garb-Cy 3(= goat-anti-rabbit Cy3): Jackson ImmunoResearch

Cy3 (Indocarbocyanine)-konjugiertes Ziege-anti- Laboratories, West Grove,

Kaninchen IgG USA

Gam-Cy 2(= goat-anti-mouse Cy2): Jackson ImmunoResearch

Cy2 (Cyanine)-konjugiertes Ziege-anti-Maus IgG Laboratories, West Grove,

USA

Gam-Cy 3(= goat-anti-mouse Cy3): Jackson ImmunoResearch

Cy3 (Indocarocyanine)-konjugiertes Ziege-anti- Laboratories, West Grove,

Maus IgG USA

Material 18

Garb-Au 10 nm (goat-anti-rabbit Au 10 nm): Sigma, Deisenhofen

mit einem 10 nm-Goldpartikel konjugiertes Ziege-anti-

Kaninchen IgG

Garb-Au 5 nm (goat-anit-rabbit Au 5 nm) Sigma, Deisenhofen

mit einem 5 nm-Goldpartikel konjugiertes Ziege-anti-

Kaninchen IgG

Garb-Au US (goat-anti-rabbit Au ultrasmall): Aurion, Wageningen

mit einem 0,8 nm ultrasmall-Goldpartikel konjugiertes

Ziege-anti-Kaninchen IgG

Gam-Au 10 nm (goat-anti-mouse Au 10 nm): Sigma, Deisenhofen

mit einem 10 nm-Goldpartikel konjugiertes Ziege-anti-

Maus IgG

Gam-Au 5 nm (goat-anti-mouse Au 5 nm): Sigma, Deisenhofen

mit einem 5 nm-Goldpartikel konjugiertes Ziege-anti-

Maus IgG

Gam-Au US (goat-anti-mouse Au ultrasmall): Aurion, Wageningen

mit einem 0,8 nm ultrasmall-Goldpartikel konjugiertes

Ziege-anti-Maus IgG

Garb-HRP-POX (goat-anti-rabbit HRP-POX): Sigma, Deisenhofen

mit Meerettich-Peroxidase konjugiertes Ziege-anti-

Kaninchen-IgG

Gam-HRP-POX (goat-anti-mouse HRP-POX): Sigma, Deisenhofen

mit Meerettich-Peroxidase konjugiertes Ziege-anti-

Maus-IgG

Material 19

2.5 Größenstandard

Eichproteine, biotinyliert (EPH-Marker) Roche, Mannheim

(200 kDA; 116,3 kDa; 97,4 kDa; 66,2 kDa; 45 kDa)

2.6 Peptid 86-2

Aminosäuren 4 bis 22 der ersten extrazellulären Domäne des N-Cadherin der Maus

Aminosäuresequenz: KNLSLRYSVTGPGADQPPTG

Peptidsynthese durch das Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften, Abteilung für

Physiologische Chemie I

Methoden 20

3. Methoden

3.1 Perfusion von Geweben

Fixiertes Gewebe: 4 erwachsene männliche Wistar-Ratten aus eigener Zucht wurden in

Ätheranästhesie über die Aorta ascendens zunächst kurz mit Vorspüllösung perfundiert.

Daraufhin wurden sie 14 min lang perfusionsfixiert. Die dafür verwendete Lösung

setzte sich für eine anschließende Epon-Einbettung (2 Ratten) aus 2 % Glutaraldehyd

und 0,6 % Paraformaldehyd, für eine anschließende LR-White-Einbettung (2 Ratten)

aus 0,1 % Glutaraldehyd und 2 % Paraformaldehyd in PBS zusammen.

Nun wurde möglichst viel des knöchernen Nasenskeletts entfernt, die Riechschleimhaut

zusammen mit unterliegendem Gewebe en bloc herauspräpariert und in ca. 5 mm dicke

Gewebeblöcke unterteilt. Diese wurden für 2 h bei 4°C in der entsprechenden

Perfusionslösung postfixiert.

Vorspüllösung:

0,5 % (w/v) Procainhydrochlorid, 6250 IE Heparin, in PBS

Gefriergetrocknetes Gewebe: Vier erwachsene männliche Wistar-Ratten wurden in

Äthernarkose dekapitiert, die Riechschleimhaut wie oben beschrieben präpariert, sofort

in mit flüssigem Stickstoff gekühltes Isopentan eingefroren und in flüssigen Stickstoff

überführt. Die gefrorenen Präparate wurden für 12 h bei -90°C, -40°C, -20°C, 0°C und

20°C im Vakuum bei 10-5 Torr gefriergetrocknet, danach bei 20°C für 48 h bei 10-3 Torr

in Epon eingebettet und anschliessend in Gelatinekapseln bei 60°C für 24 h-48 h

ausgehärtet.

3.2 LR-White-Einbettung

Das postfixierte Material für die LR-White-Einbettung (3.1) wurde dreimal 10 min lang

in PBS (2.3) gewaschen und für jeweils 5 min in 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %,

90 % und 96 % Ethanol entwässert. Nach dreimal 10 min 100 % Ethanol wurde 60 min

lang in LR-White inkubiert. Die Gewebeblöcke wurden in frischem LR-White auf dem

Schüttler über Nacht bei 4°C gelagert. Nun wurde erneut LR-White gewechselt. Die

Methoden 21

Präparate wurden in Gelatinecups eingebettet und zwei bis drei Tage lang bei 4°C mit

UV-Licht bestrahlt. Sie wurden für die Immun-Elektronenmikroskopie (3.11) benötigt.

3.3 Epon-Einbettung

Fixiertes Gewebe: Die Gewebeblöcke wurden aus der Perfusionslösung genommen

(3.1) und 1 h lang in 0,01 M PBS (2.3) gespült. Nach Osmierung mit 1 % (w/v) OsO4 in

0,1 M PBS für 1 h wurde mit destilliertem Wasser gespült und jeweils 15 min lang mit

30 %, 50 % und 70 % Ethanol entwässert. Nun wurde für maximal 3 h in 2 % (v/v)

Uranylacetatdihydrat in 70% Ethanol blockkontrastiert. Es folgte eine Behandlung mit

70 %, 80 %, 90 % und 96 % Ethanol für jeweils 15 min. Mit 100 % Ethanol wurde

zweimal 30 min inkubiert. Anschließend wurde zweimal 30 min mit Propylenoxid

behandelt. Über Nacht (12 h) wurden die Gewebeblöcke in ein Gemisch aus zwei Teilen

Propylenoxid und einem Teil Epon gelegt. Nachdem sie zweimal 2 h lang mit Epon

inkubiert worden waren, wurden sie eingebettet und polymerisierten bei 55°C - 65°C 48

h lang aus. So behandeltes Gewebe wurde für die Lichtmikroskopie an

Semidünnschnitten (3.7) und für die elekronenmikroskopische Beurteilung der

Ultrastruktur des Riechepithels (3.10) verwendet.

Gefriergetrocknetes Gewebe: Das gefriergetrocknete Gewebe wurde mit Epon

infiltriert und wie oben beschrieben polymerisiert. Gefriergetrocknetes und in Epon

eingebettetes Gewebe wurde für die Immunfluoreszenzuntersuchungen an

Semidünnschnitten verwendet.

3.4 Trimmen

Bevor von dem eingebetteten Gewebe (3.2; 3.3) Semi- (3.5) oder Ultradünnschnitte

(3.6) angefertigt werden konnten, mußte das quader- oder zylinderförmige

Harzblöckchen an einer seiner kleinen Flächen unter einer Lupenlampe mit einer

Rasierklinge eben angeschnitten werden, bis Gewebe auf der Oberfläche erschien.

Methoden 22

3.5 Semidünnschnitte

Das getrimmte Gewebeblöckchen wurde in eine Schneidemaschine für

Semidünnschnitte (2.1) eingespannt. Es wurden 1 µm dicke Schnitte angefertigt. Diese

wurden in einen Tropfen destillierten Wassers auf einem Deckglas gegeben und auf

einer Heizplatte 3 h lang getrocknet.

3.6 Lichtmikroskopie

Um einen schnellen Überblick über die Struktur eines Gewebeschnittes zu bekommen,

wurden Semidünnschnitte (3.5) mit Methylenblau überschichtet und ca. 30 s auf einer

Heizplatte angefärbt. Nachdem der Farbstoff mit PBS (2.3) abgewaschen worden war,

wurden die Präparate getrocknet und mit Entellan eingedeckt.

3.7 Ultradünnschnitte

Das getrimmte Gewebeblöckchen (3.4) wurde in eine Schneidemaschine für

Ultradünnschnitte (2.1) eingespannt. Die ca. 100 nm dicken Schnitte wurden mit Hilfe

eines Wimpernhaares auf ein mit Formvar beschichtetes Nickelnetzchen aufgespannt.

Anschließend wurden sie luftgetrocknet.

3.8 Kontrastierung von Ultradünnschnitten

Ultradünnschnitte (3.7) von in LR-White (3.2) oder Epon (3.3) eingebetteten Präparaten

werden kontrastiert, um Gewebestrukturen sichtbar zu machen. Dazu wurde eine

Glasplatte mit Parafilm bezogen, worauf entsprechend der Anzahl der Netzchen ein

Tropfen 2 % (w/v) Uranylacetatdihydrat in H2O gegeben wurde. Jedes Präparat wurde

mit der Schnittseite nach unten 20 min lang auf einen dieser Tropfen gelegt.

Anschließen wurden die Netzchen mit destilliertem Wasser gewaschen und mit

Filterpapier vom Rand her vorsichtig getrocknet. Nun wurden sie für 7 min in einem

Tropfen 0,2 % (w/v) Bleizitrat inkubiert. Nach erneutem Spülen mit destilliertem

Methoden 23

Wasser und Absaugen der Flüssigkeit mit Filterpapier wurden die Ultradünnschnitte

luftgetrocknet.

3.9 Immun-Elektronenmikroskopie

Ultradünnschnitte (3.7) von in LR-White eingebettetem Gewebe (3.2) wurden 15 min

lang in je einem Tropfen 0,05 M Glycin-Puffer in PBS inkubiert. Daraufhin wurden sie

für 30 min in einen Blockpuffer gegeben. Dreimal 5 min lang wurden sie in

Inkubationspuffer gewaschen. Die Netzchen wurden mit 20 µl in PBS verdünnten

Primär-Antikörpers (2.4) in einer feuchten Kammer bei 4°C über Nacht gelagert.

Nachdem sie für sechsmal 5 min mit Inkubationspuffer gespült worden waren, wurden

sie in 20 µl des in PBS verdünnten Sekundär-Antikörpers (2.4) in einer feuchten

Kammer 2 h lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Präparate wurden erneut für

sechsmal 5 min mit Inkubationspuffer gewaschen. Sie wurden dreimal 5 min lang in

PBS (2.3) gelegt, bevor sie für 5 min mit 2 % (v/v) Glutaraldehyd in PBS postfixiert

wurden. Sie wurden 5 min lang in PBS und für fünfmal 2 min in Ampuwa gespült.

Die verwendeten Sekundär-Antikörper waren mit Goldpartikeln gekoppelt, welche

unterschiedlich groß waren, 10 nm, 5 nm und 0,8 nm. 0,8 nm große sogenannte

Ultrasmall-2.-Antikörper mußten versilbert werden (3.10), um unter dem

Elektronenmikroskop sichtbar zu werden. Dieses wurde durchgeführt, bevor alle

Präparate kontrastiert (3.8) wurden.

Blockpuffer:

5 % (v/v) BSA-c, 0,1 % (v/v) CWFS, 5 % (v/v) NGS, in PBS

Inkubationspuffer:

1 % (v/v) BSA-c, 0,05 % (v/v) NaN3 in PBS

3.10 Silberverstärkung nach Danscher

Die wie unter 3.7 beschrieben vorbereiteten Ultradünnschnitte wurden lichtgeschützt in

je einen Tropfen der Gebrauchslösung zur Silberverstärkung gelegt. Nach sechsmal 5

min waschen in Ampuwa wurden die Präparate 45 min lang in Ampuwa belassen.

Methoden 24

Anschließend wurden sie mit destilliertem Wasser gespült und getrocknet. Sie konnten

nun kontrastiert (3.8) werden.

Gebrauchslösung:

60 % (v/v) Lösung A, 10 % (v/v) Lösung B, 15 % (v/v) Lösung C, 15 % (v/v) Lösung D

Lösung A = Schutzkolloid :

1 % (w/v) Gummi Arabicum in Aqua dest.

Lösung B = Puffer:

25 % (w/v) Zitronensäure, 23,6 % (w/v) Natriumzitrat in Aqua dest.

Lösung C = Entwickler:

5,7 % (w/v) Hydrochinon in Aqua dest.

Lösung D = Silbersalzlösung:

7,2 % (w/v) Silberlaktat in Aqua dest.

3.11 Herauslösen von Epon aus Semidünnschnitten von gefriergetrocknetem Gewebe

Semidünnschnitte (3.5) von gefriergetrocknetem, in Epon eingebettetem Gewebe

wurden der Reihe nach mit Na-Methanolat (6 min), Methanol/Toluol (5 min), Aceton

(zweimal 5 min), destilliertem Wasser (5 min) und PBS (5 min) (2.3) behandelt

(Drenckhahn et al., 1986). Nun war das nachfolgende Inkubationsschritte der

Fluoreszenzimmunhistochemie (3.12) störende Epon-Harz (3.3) herausgelöst. Die

Präparate wurden bis zur Weiterbehandlung in PBS belassen.

3.12 Fluoreszenzimmunhistochemie

Bei der Fluoreszenzimmunhistochemie wird ein bestimmtes Protein mit Hilfe eines

spezifischen 1.-Antikörpers (2.4) detektiert. An dessen FC-Abschnitt bindet ein 2.-

Antikörper (2.4), der mit einem fluoreszierenden Agens gekoppelt ist. Dieses leuchtet

bei Bestrahlung mit Licht einer entsprechenden Wellenlänge auf. Somit können unter

dem Fluoreszenzmikroskop die gesuchten Strukturen auf dunklem Grund sichtbar

gemacht werden.

Methoden 25

Nachdem das Epon aus den Semidünnschnitten herausgelöst worden war (3.11), wurden

die Deckgläser kurz in destilliertem Wasser gespült und mit ca. 20 µl des mit PBS (2.3)

verdünnten 1.-Antikörpers bedeckt. Die Präparate wurden bei 4°C über Nacht in einer

feuchten Kammer inkubiert (Goldman, 1963). Anschließend wurde sechsmal 5 min lang

mit PBS gespült und 20 µl des mit PBS verdünnten 2.-Antikörpers aufgetragen. Die

Gewebeschnitte wurden so in einer feuchten Kammer für 3 h bei Raumtemperatur

gelagert. Erneut wurde sechsmal 5 min lang mit PBS gewaschen. Die Deckgläser

wurden mit einem Papiertuch getrocknet, ohne das Gewebe zu beschädigen. Nun wurde

ein Tropfen 1,5 % (w/v) N-Propylgallat in 60 % Glyzerin in H2O auf einen Objektträger

gegeben und das Präparat mit der leeren Seite nach außen luftblasenfrei darauf gelegt.

3.13 Herstellung eines Peptidantikörpers

Injiziert man Fremdprotein in die Blutbahn eines Tieres, produziert es bei intaktem

Immunsystem dagegen gerichtete wirtsspezifische Antikörper. Diese können nach

Aufreinigung des entnommenen Blutes für immunhistochemische Versuche verwendet

werden.

3.13.1 Koppelung von Peptid an KLH

Da anzunehmen ist, dass das eingesetzte Peptid (2.6) aufgrund seiner geringen Größe

im Wirtstier nicht immunogen wirkt, wurde es als Hapten an KLH gekoppelt.

Die folgenden Angaben beziehen sich auf 1 mg Peptid. 1 mg Peptid wurde mit 1 mg

KLH in 967,6 µl PBS (2.3) auf Eis gelöst. 1 ml 2,5 % (v/v) Glutaraldehyd wurde

langsam hinzugetropft. Der Ansatz wurde 1 h lang bei 4°C inkubiert. Anschließend

wurden 10 mg Na-Borhydrid dazugegeben und erneut für 1 h inkubiert. Um

Verunreinigungen zu entfernen,) wurde die Lösung gegen PBS dialysiert (3.13.3).

3.13.2 Aufbereitung von Dialyseschläuchen

Ein Dialyseschlauch wurde nach Bedarf zugeschnitten und in einem Erlenmeyerkolben

in destilliertem Wasser mit einer Spatelspitze EDTA 3 min lang aufgekocht. Dieses

Methoden 26

wurde zweimal mit frischem Medium wiederholt. Die Schläuche konnten nun eingesetzt

werden. Sie konnten auch nach Zugabe von 0,05 % (w/v) NaN3 in PBS (2.3) bei 4°C

aufbewahrt werden.

3.13.3 Dialyse der Lösung von KLH-gekoppeltem Peptid gegen PBS

Ein entsprechend vorbereiteter (3.13.2), mit der Lösung von KLH-gekoppeltem Peptid

(3.13.1) gefüllter und an seinen Enden mit Klemmchen verschlossener Dialyseschlauch

wurde bei 4°C gegen drei Liter PBS (2.3) dialysiert. Dies erfolgte über 48 h, wobei PBS

am ersten Tag viermal, am zweiten Tag zweimal gewechselt wurde. Die dialysierte

Lösung wurde nun in ein Plastikreaktionsgefäß überführt und bis zu ihrer Verwendung

bei –20°C gelagert.

3.13.4 Immunisierung eines Kaninchens

Um die Antikörperproduktion und –gewinnung so effektiv wie möglich zu gestalten,

erfolgte die Immunisierung des Wirtstieres nach einem genau vorgegebenen Zeitplan.

Zunächst wurde dem unbehandelten Kaninchen Blut aus der Ohrvene abgenommen, um

sogenanntes Präimmunserum zu erhalten. Damit prüfte man unspezifische Antigen-

Antikörper-Reaktionen mit dem Zielgewebe, die nicht mit der spezifischen

Immunisierung zusammenhingen.

Drei Wochen nach der subkutanen Injektion einer Immunisierungslösung wurde eine

Boosterlösung subkutan injiziert. Zwei Wochen später wurde aus einer Ohrvene Blut

abgenommen, das Serum wurde analysiert (3.13.5). Es schloß sich ein Rhythmus aus

einer Boosterung nach einer Woche und einer Blutentnahme zwei Wochen später an,

der mehrmals wiederholt wurde.

Immunisierungslösung:

20 % (v/v) PAO compl. (Fluka, Hannover), 30 % (v/v) PBS, 50 % (v/v) Peptidlösung

Boosterlösung:

20 % (v/v) PAO incompl. (Fluka, Hannover), 80 % (v/v) Peptidlösung

Methoden 27

3.13.5 Aufbereitung und Testung des Immunserums

Das entnommene Blut wurde zentrifugiert (Tischzentrifuge 5415 C, 14000 g, 10 min,

Raumtemperatur) und das Serum abpipettiert. In einer Verdünnung von 1:10 in PBS

(2.3) wurde es auf Test- und Kontrollgewebe aufgetragen (3.8) und somit der Erfolg der

Immunisierung überprüft. Positives Serum wurde in Plastikreaktionsgefäße gefüllt und

bei –20°C aufbewahrt.

3.13.6 Affinitätsreinigung des Immunserums

Die Affinitätsreinigung diente der Extraktion hochaffiner Peptid-Antikörper aus dem

Serum des Kaninchen. Dazu wurde natives Peptid (2.8) mit Hilfe des Dot-Blots auf

einer Nitrozellulosemembran (2.1) immobilisiert und mit Immunserum (3.13.5)

inkubiert, das im Verhältnis 1:30 mit PBS (2.3) verdünnt worden war. Durch Waschen

mit PBS wurden verunreinigende Bestandteile entfernt, so daß nur mehr Antigen-

Antikörper-Komplexe (= natives Peptid-Peptidantikörper-Komplexe), die an der

Nitrozellulosemembran hafteten, verblieben. Nach Hitzeablösung wurde der

Peptidantikörper ausgetestet (3.12) und bei –20°C gelagert.

Zunächst wurde eine Nitrozellulosemembran (2.1) mit PBS (2.3) befeuchtet und in ein

Vakuumblot-Gerät (2.1) eingespannt, dessen Vertiefungen mit PBS und Peptid-PBS-

Lösung in einer Konzentration von 1 mg/ ml beschickt wurden. Nach Anschließen einer

Wasserstrahlpumpe floß das Gemisch über die Nitrozellulosemembran ab, wobei das

Peptid haften bliebt. Es wurde zweimal mit PBS nachgespült. Anschließend wurde die

Nitrozellulosemembran in Ponceau S angefärbt. Der Farbstoff, der Peptid markiert,

wurde mit PBS entfernt. Unspezifische Proteinbindungsstellen wurden über Nacht in

einer Magermilchlösung abgesättigt. Es wurde dreimal 5 min lang mit 0,05 % (v/v)

Tween 20 in PBS gewaschen. Die so präparierte Nitrozellulosemembran konnte in 0,05

% (w/v) NaN3 in PBS bei 4°C gelagert werden.

Ponceau S-Lösung:

0,5 % (w/v) Ponceau S; 3 % (w/v) Trichloressigsäure in H2O

Methoden 28

Magermilchlösung:

5 % (w/v) Magermilch; 0,05 % (v/v) Tween 20 in PBS

Die vorbereitete Nitrozellulosemembran wurde in ein sialinisiertes Glasgefäß gegeben

und zweimal mit PBS (2.3) gewaschen. Daraufhin wurde sie mit Immunserum (3.13.5),

das im Verhältnis 1:30 mit PBS verdünnt worden war, bei 4°C über Nacht auf dem

Schüttler inkubiert. Es wurde erneut zweimal mit PBS gespült. 450 µl PBS wurden

hinzugefügt. Im 55,6°C-Wasserbad lösten sich nach 10 min die Peptidantikörper von

den auf der Nitrozellulosemembran fixierten nativen Peptiden. Die Flüssigkeit wurde

sofort in ein frisches silaniertes Plastikreaktionsgefäß (2.1) abgehoben, um die erneute

Ausbildung von Antigen-Antikörper-Komplexen bei niedrigeren Temperaturen zu

verhindern. Die Konzentration des Peptidantikörpers konnte photometrisch gegen den

Leerwert PBS bei einer Wellenlänge λ=280 nm bestimmt werden (E 1,35 = 1 mg/ ml

IgG). In einer Verdünnung von 1:10 mit PBS wurde Test- und Kontrollgewebe

inkubiert (3.12). Der gereinigte Peptidantikörper wurde bei –20°C aufbewahrt.

3.14 Amidoschwarz-Proteinbestimmung (Dieckmann-Schuppert et al., 1997)

Eine Zellulose-Azetat-Folie (2.1) wurde in ca. 1 cm2 große Felder eingeteilt. Maximal

10 µl einer Verdünnung definierter Mengen von BSA (Standardproben) und der zu

analysierenden Proteinproben, welche in SDS-Probenpuffer gelöst waren, wurden auf

jeweils zwei Bereiche aufgetragen und in einem kalten Luftstrom getrocknet. Die Folie

wurde auf einem Schüttler zunächst 10 min lang mit Färbelösung, anschließend mit

Entfärber behandelt, bis der Hintergrund weiß erschien. Nachdem sie in einem kalten

Luftstrom getrocknet worden war, wurden die einzelnen Felder ausgeschnitten und in

beschriftete Plastikreationsgefäße (2.1) gegeben. Unter Zugabe einer Auflöselösung

löste sich die Folie im 50°C-Wasserbad nach 30 min auf. Die durchmischten Proben

wurden in Plastikküvetten umgefüllt und bei einer Wellenlänge von 620 nm gegen den

Leerwert Probenpuffer gemessen. Mit Hilfe der Standardproben wurde eine Eichkurve

erstellt, aus der der Gehalt der Proteinproben abgelesen werden konnte.

Auflöselösung:

80 % (v/v) Ameisensäure; 10 % (v/v) Essigsäure; 10 % (v/v) Trichloressigsäure

Methoden 29

Entfärbelösung:

47,5 % (v/v) Methanol; 47,5 % (v/v) Aqua dest.; 5 % (v/v) Eisessig

Färbelösung:

0,5 % (w/v) Amidoschwarz; % (v/v) Methanol; 45 % (v/v) Aqua dest.; 10 % (v/v) Eisessig

2-fach SDS-Probenpuffer:

250 mM Tris/HCl (pH 6,8); 4 % (w/v) SDS; 20 % (v/v) Glycerin; 100 mM Dithiothreitol; 0,16 % (w/v)

Bromphenolblau in H2O

3.15 Bradford-Proteinbestimmung

Jeweils 20 bis 100 µl der Leerwert-, BSA-Standard- und Proteinproben wurden in einer

Plastikküvette mit 1 ml des Bradford-Reagenz 10 min lang bei Raumtemperatur

inkubiert. Bei einer Wellenlänge von 595 nm erfolgte die photometrische Auswertung

in der Reihenfolge Leerwertprobe – BSA-Standard-Proben in absteigender

Konzentration – Proteinproben. Mit Hilfe der Leerwert- und BSA-Standard-Proben

wurde eine Eichgerade erstellt, mit der der Gehalt der Proteinproben ermittelt werden

konnte.

Bradford-Reagenz:

20 % (v/v) Protein Assay Cat. 500-0006 in Aqua dest.

BSA-Standard-Proben:

1 %/ 0,75 %/ 0,5 %/ 0,25 %/ 0,1 % (w/v) BSA in PBS

Leerwertprobe:

PBS (2.3)

Proteinproben:

1 % (v/v) Proteinlösung in PBS und 0,25 % (v/v) Proteinlösung in PBS

3.16 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-Page) (Laemmli, 1970)

Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurde nach dem Verfahren von Laemmli

(1970) durchgeführt. Dabei erfolgt aufgrund der denaturierenden Eigenschaften von

Methoden 30

Natrium-Dodecylsulfat (SDS) die Auftrennung der Proteine im elektrischen Feld allein

nach ihrem Molekulargewicht.

Das SDS-Polyacrylamidgel wurde zwischen zwei senkrechte Glasplatten gegossen (9

cm x 6 cm x 0,8 cm). Es setzte sich aus einem Trenngel und einem Sammelgel

zusammen. Die Polyacrylamidkonzentration des Trenngels betrug 7,5 % (w/v), die des

Sammelgels 5 % (w/v).

Die Proteinproben (Proteinmenge 80 µg) wurden 5 min bei 95°C erhitzt und auf das Gel

aufgetragen. Die Proteinauftrennung erfolgte bei einer Spannung von 80 V im

Sammelgel und von 200 V im Trenngel. Die Elektrophorese wurde beendet, wenn die

Lauffront des Bromphenolblaus (SDS-Probenpuffer) das Ende des Gels erreicht hatte.

Anschließend wurden die Proteine auf Nitrozellulose elektrotransferiert (3.17).

7,5 % Trenngel:

7,275 % (w/v) Acrylamidlösung (30 % {w/v}[Roth, Karlsruhe]); 0,225 % (w/v) Bisacrylamidlösung (2 %

{w/v}[Roth, Karlsruhe]); 6,75 % (v/v) Glycerin; 375 mM Tris/HCl (pH 8,8); 0,1 % (w/v) SDS; 0,05 %

(v/v) TEMED; 0,05 % (w/v) Ammoniumperoxodisulfat (APS)

5 % Sammelgel:

4,85 % (w/v) Acrylamidlösung (30 % {w/v}[Roth, Karlsruhe]); 0,15 % (w/v) Bisacrylamidlösung (2 %

{w/v}[Roth, Karlsruhe]); 125 mM Tris/HCl (pH 6,8); 0,1 % (w/v) SDS; 0,2 % (v/v) TEMED; 0,1 %

(w/v) Ammoniumperoxodisulfat (APS)

2-fach SDS-Probenpuffer:

250 mM Tris/HCl (pH 6,8); 4 % (w/v) SDS; 20 % (v/v) Glycerin; 100 mM Dithiothreitol; 0,16 % (w/v)

Bromphenolblau

Elektrophoresepuffer, pH 8,3:

25 mM Tris; 172 mM Glycin; 0,1 % (w/v) SDS

3.17 Immunreplikanalyse (Western-Blot)

Nach der Auftrennung der Proteine in der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese

wurden die Proteine mit Hilfe des Semi-dry-Verfahrens auf eine Nitrozellulosemembran

(2.1) übertragen (Burnette, 1981). Dazu wurden Gel und Nitrozellulosemembran

Methoden 31

zwischen puffergetränkte Filterpapiere geschichtet und luftblasenfrei auf die

Graphitelektroden einer Laufkammer gelegt.

Der Transfer der Proteine erfolgte 90 min lang bei einer Stromstärke von 0,8 mA pro 1

cm2 SDS-Polyacrylamidgel. Bei einer Größe des Minigels von 9 cm x 6 cm entsprach

dies einer Stromstärke von 43 mA. Der Erfolg des Transfers wurde überprüft, indem die

Proteinbanden reversibel durch Ponceau S-Lösung rot angefärbt wurden (Salinovich et

al., 1986). Die spätere Immunfärbung der Proteinproben wurde dadurch nicht

beeinträchtigt. Die mit Ponceau S angefärbte Laufspur der Eichproteine (EPH-Marker,

2.5) wurde abgetrennt und getrocknet.

Anodenpuffer I:

0,3 M Tris; 20 % (v/v) Ethanol in H2O

Anodenpuffer II:

25 mM Tris; 20 % (v/v) Ethanol in H2O

Kathodenpuffer:

25 mM Tris; 0,725 % (w/v) Aminocapronsäure; 20 % (v/v) Ethanol in H2O

Ponceau S-Lösung:

0,5 % (w/v) Ponceau S; 3 % (w/v) Trichloressigsäure in H2O

Die Nitrozellulosestreifen wurden zunächst in einer Magermilchlösung bei 4°C über

Nacht inkubiert. Hierdurch wurden unspezifische Proteinbindungsstellen abgesättigt.

Nach Entfernen der Magermilchlösung und Waschen mit 0,05 % (v/v) Tween 20 in

PBS wurden die Nitrozellulosemembranen bei 4°C über Nacht mit einem Erstantikörper

(2.4) auf einem Schüttler inkubiert. Dieser wurde in Magermilchlösung nach Angaben

des Herstellers verdünnt. Nach Entfernung des ungebundenen Primärantikörpers mit

0,05 % (v/v) Tween 20 in PBS (dreimal 5 min) folgte die Inkubation mit dem

jeweiligen Zweitantikörper (2.4) in einer Verdünnung entsprechend den Angaben des

Herstellers in Magermilchlösung bei Raumtemperatur für 90 min. Die

Nitrozellulosestreifen wurden anschließend wie oben beschrieben gewaschen und für

die ECL-Entwicklung eingesetzt.

Methoden 32

Magermilchlösung:

5 % (w/v) Magermilch; 0,05 % (v/v) Tween 20 in PBS

Die an den Zweitantikörper gekoppelte Meerrettichperoxidase (POX) katalysiert unter

Reduktion von H2O2 die Redox-Reaktion des ECL-Systems, in deren Verlauf Luminol

zur Chemolumineszenz angeregt wird. Luminol kehrt direkt nach seiner Oxidation aus

seinem angeregten Zustand in den Grundzustand zurück und emittiert dabei Photonen,

die mit einem Röntgenfilm (2.1) nachgewiesen werden können.

Die Nitrozellulosemembranen wurden für 1 min in einer frisch angesetzten ECL-

Lösung (ECL I und II im Verhältnis 1:1) bei Raumtemperatur inkubiert und

luftblasenfrei in eine Klarsichtfolie eingeschlagen. Anschließend wurden sie in einer

Filmkassette auf einem Röntgenfilm (Hyperfilm ECL) je nach Intensität des Signals 10

s bis 60 s exponiert. Nach Sichtbarwerden der Banden (Schwarzfärbung) wurde der

Röntgenfilm zur Dokumentation entwickelt, fixiert und getrocknet.

ECL I-Lösung:

2,5 mM Luminol (Fluka, Deisenhofen); 0,04 mM p-Coumaric-Acid (Sigma, Deisenhofen); 0,1 M

Tris/HCL (pH 8,5)

ECL II-Lösung:

0,02 % (w/v) H2O2; 0,1 M Tris/HCl (pH 8,5)

Ergebnisse 33

4. Ergebnisse

Die Zellen des olfaktorischen Epithels bilden typische epitheliale Kontakte aus. Hierzu

gehören Zonula occludens, Zonula adherens, Macula adherens und Punctum adherens.

Zonula occludens, Zonula adherens und Macula adherens bilden als Haft- oder

Schlußleistenkomplex die Grenzstruktur zwischen apikaler und basolateraler

Plasmamembran. Puncta adherentia sind lateral lokalisiert.

4.1 Darstellung von Proteinen der Zonula occludens im olfaktorischen Epithel

Durch Darstellung von ZO-1 in einem tangentialen Semidünnschnitt durch das apikale

olfaktorische Epithel wurde ein typisches Muster der apikalen Zonulae occludentes

sichtbar (Abb. 4.1.1). Es entsprach der in der Einleitung beschriebenen vermuteten

Topographie der apikalen Zellgrenzen. Danach markieren polygonale Formen Stützzell-

Stützzell-Kontakte, größere Kreise Stützzell-Mikrovillizell-Kontakte und kleinere

Kreise Stützzell-Neuron-Kontakte. Die Intensität der Immunfluoreszenz für ZO-1 war

in allen Zellkontakten gleich stark.

Abb. 4.1.1: ZO-1 Immunreaktivität in einem apikalen Tangentialschnitt durch das

olfaktorische Epithel.

Die ZO-1-Immunreaktivität stellt die apikalen Zonulae occludentes dar.

Polygonale Formen: Stützzell-Stützzell-Kontakte (Pfeilspitze); größere Kreise:

Ergebnisse 34

Stützzell-Mikrovillizell-Kontakte (großer Pfeil); kleinere Kreise: Stützzell-

Neuron-Kontakte (kleiner Pfeil); Maßstab: 10 µm.

Durch Behandlung von Folgeschnitten mit Antikörpern gegen Occludin und ZO-1

wurde deutlich, daß die Lokalisation von Occludin und ZO-1 sehr ähnlich war.

Allerdings kamen die verschiedenen Zellkontakte nicht in der gleichen

Immunfluoreszenzintensität zur Darstellung (Abb. 4.1.2 und 4.1.3): Die

Immunfluoreszenz für Occludin in Stützzell-Neuron-Kontakten (kleine Kreise) war

geringer als in Stützzell-Stützzell-Kontakten (polygonale Formen) (Abb. 4.1.2).

Abb. 4.1.2: Occludin (links) und ZO-1 (rechts) in tangentialen Folgeschnitten durch das

olfaktorische Epithel. Maßstab: 5 µm.

In mit Occludin (grün) und ZO-1 (rot) doppelmarkierten longitudinalen

Semidünnschnitten war die relativ intensivste Occludin- und ZO-1-Immunreaktivität in

den gelb-orange fluoreszierenden Zellkontakten zwischen Ausführungsgangszellen zu

erkennen (Abb. 4.1.3).

Ergebnisse 35

Abb. 4.1.3: Occludin- (grün) und ZO-1-Immunreaktivität (rot) in einem

Longitudinalschnitt durch das olfaktorische Epithel. Maßstab: 10 µm.

Tabelle 4.1.1 zeigt zusammenfassend die Immunreaktivitätsintensität der beiden

Proteine in Zonulae occludentes zwischen verschiedenen Zellen des olfaktorischen

Epithels.

Kontakt Occludin ZO-1

Stützzelle-Stützzelle ++ ++

Stützzelle-Mikrovillizelle ++ ++

Ausführungsgangszelle-

Ausführungsgangszelle

+++ ++

Stützzelle-Neuron + ++

Tab. 4.1.1: Vergleich der Immunfluoreszenzintensität von Occludin und ZO-1 in

Zonulae occludentes zwischen verschiedenen Zelltypen des olfaktorischen

Epithels.

4.2 Darstellung von Proteinen der Zonula adherens im olfaktorischen Epithel

Das typische Transmembranprotein epithelialer Adhärenskontakte ist E-Cadherin. Ein

typisches neuronales klassisches Cadherin ist N-Cadherin, das auch das Cadherin der

Ergebnisse 36

Adhärenskontakte des Herzmuskels ist. Adhärenskontakte enthalten neben

Transmembranproteinen unter anderem die zytoplasmatischen Plaqueproteine α-

Catenin, β-Catenin und α-Actinin.

Während der Herzmuskel kein E-Cadherin enthält, besitzen Epithelien wie

beispielsweise das Dünndarmepithel kein N-Cadherin.

Lokalisation von E-Cadherin im olfaktorischen Epithel

Um zu prüfen, ob E-Cadherin im olfaktorischen Epithel vorkommt, wurde eine

Immunreplikanalyse durchgeführt (3.17). Dabei wurden Gewebeproben des

olfaktorischen Epithels (Positivprobe) und des Herzmuskels (Negativprobe) mit dem

Primär-Antikörper E-Cadherin und dem Sekundär-Antikörper Gam-HRP-POX

IgG/IGM inkubiert (Abb. 4.2.1).

Abb. 4.2.1: Nachweis von E-Cadherin im olfaktorischen Epithel.

Herzmuskel-Gewebe (HM), das kein E-Cadherin exprimiert, diente als Negativprobe.

Die Bande in der Spur des olfaktorischen Epithels bei 120 kDa entsprach der

molekularen Masse von E-Cadherin. Im Herzmuskel (Negativprobe) wurde kein Protein

detektiert. Damit waren die Spezifität des Antikörpers für E-Cadherin in der

Immunreplikanalyse sowie die Anwesenheit von E-Cadherin im olfaktorischen Epithel

nachgewiesen.

Ergebnisse 37

Ein longitudinaler (Abb. 4.2.2) und ein tangentialer (Abb. 4.2.3) Semidünnschnitt der

Riechschleimhaut wurde mit dem Primär-Antikörper E-Cadherin und dem Sekundär-

Antikörper Gam-Cy3 inkubiert.

Abb. 4.2.2: Einfachmarkierung (oben) für E-Cadherin (grün) und Doppelmarkierung (unten)

für E-Cadherin (grün) und Na+/K+-ATPase (rot) in einem Longitudinalschnitt

durch das olfaktorische Epithel. Maßstab: 5 µm.

In Longitudinalschnitten (Abb. 4.2.2) waren im gesamten olfaktorischen Epithel kräftig

fluoreszierende längsverlaufende Streifen zu erkennen, die im Bereich der luminalen

Oberfläche in einem noch intensiver fluoreszierenden Punkt endeten.

Doppelmarkierungen für Na+/K+-ATPase, dem Markerprotein für Membranen von

olfaktorischen Neuronen und Mikrovillizellen, zeigten, daß die Immunreaktivität von E-

Cadherin im Bereich der apikalen und lateralen Stützzell-Stützzell-, Stützzell-

Mikrovillizell- und Stützzell-Ausführungsgangszell-Kontakte lokalisiert waren und

damit wahrscheinlich die Zonulae adherentes sowie die Puncta adherentia zwischen

diesen Zellen markierten.

Zellkontakte zwischen Stützzellen und Sinneszellen, deren Membranen relativ stark

Na+/K+-ATPase-reaktiv waren, zeigten eine außerordentlich schwache E-Cadherin-

Imunfluoreszenz (Abb. 4.2.2).

Ergebnisse 38

Tangentialschnitte bestätigten die kräftige E-Cadherin-Immunreaktivität der Stützzell-

Stüzzell-Kontakte (polygonale Formen).

Abb. 4.2.3: E-Cadherin-Immunreaktivität im olfaktorischen Epithel.

Schräger Tangentialschnitt, der den Bereich der Zonulae adherentes (Pfeil) und

der Puncta adherentia (Pfeilspitze) zwischen Stützzellen zeigt. Maßstab: 5 µm.

Um eine Kreuzreaktivität des E-Cadherin-Antikörpers mit anderen eventuell im

olfaktorischen Epithel vorhandenen Cadherinen auszuschließen, wurden ein

Semidünnschnitt des Dünndarmepithels (Positivprobe) und des Herzmuskels

(Negativprobe) mit dem Primär-Antikörper gegen E-Cadherin und dem Sekundär-

Antikörper Gam-Cy3 inkubiert (keine Abbildung; 3.12). Das Bild des für E-Cadherin

positiven und N-Cadherin negativen Dünndarmepithels zeigte deutlich markierte

Zellgrenzen, während im E-Cadherin negativen und N-Cadherin positiven Herzmuskel

keine immunhistochemische Reaktion nachzuweisen war. Auch für diese Methode war

damit die Spezifität des Antikörpers für E-Cadherin nachgewiesen.

Zur detaillierten ultrastrukturellen Lokalisation wurde ein Ultradünnschnitt der

Riechschleimhaut mit dem Primär-Antikörper E-Cadherin und dem Sekundär-

Antikörper Gam-US inkubiert und durch Versilberung verstärkt (Abb. 4.2.4; 3.10). Es

fand sich eine Lokalisation der Goldkonjugate im Bereich von Zonulae adherentes

ausschließlich zwischen Stützzellen und Stützzellen, nicht zwischen Stützzellen und

Dendriten der Sinneszellen.

Ergebnisse 39

Abb. 4.2.4: E-Cadherin–Immunogoldlokalisierung im olfaktorischen Epithel.

Inkubation eines longitudinalen (links) und eines tangentialen (rechts) Ultradünnschnitts

des olfaktorischen Epithels mit E-Cadherin-Antikörper und Gam-US. D: Dendrit; E-

cad: E-Cadherin; SC: Stützzelle (supporting cell); Maßstab: 200 nm.

Die Ergebnisse der Untersuchungen zur Lokalisation von E-Cadherin im olfaktorischen

Epithel belegen, dass E-Cadherin das Transmembranprotein der Adherenskontakte

zwischen den epithelialen Zellen ist.

Das Cadherin der Neurone im olfaktorischen Epithel

Da E-Cadherin offensichtlich nicht das Cadherin der Zonulae adherentes der Stützzell-

Sinneszell-Kontakte ist, wurde im nächsten Schritt untersucht, ob eventuell N-Cadherin

das neuronale Cadherin sein könnte. Zur Lokalisierung von N-Cadherin wurde zunächst

ein handelsüblicher Peptidantikörper eingesetzt (2.4). Dieser zeigte jedoch mehrfach in

immunhistochemischen Reaktionen weder im olfaktorischen Epithel noch im

Herzmuskel (Positivprobe) eine Reaktion. Zum Nachweis des Transmembranproteins

neuronaler Zellen wurden deshalb Pan-Cadherin-Antikörper (2.4), Antikörper gegen ein

N-Cadherin-Fusionsprotein (Fannon et al., 1996) und selbsthergestellte Antikörper

gegen ein spezifisches Peptid aus der Sequenz von N-Cadherin (2.6) eingesetzt.

Der Pan-Cadherin-Antikörper war gegen 24 Aminosäuren des C-Terminus von N-

Cadherin gerichtet. Da die Sequenz dieses Abschnitts hoch konserviert ist, sollte der

Antikörper mit verschiedenen Cadherinen unterschiedlicher Spezies reagieren.

Ergebnisse 40

Das Ergebnis einer Immunreplikanalyse mit dem Pan-Cadherin-Primär-Antikörper und

dem Sekundär-Antikörper Garb-HRP-Pox (3.17) zeigte Abb. 4.2.5. Die Spur des

Herzmuskels (Positivprobe) zeigte eine Bande bei 130 kDa, die Spur des olfaktorischen

Epithels wies eine etwas breitere und geringfügig schneller laufende Bande auf.

Abb. 4.2.5: Pan-Cadherin- und E-Cadherin-Immunreaktivität im olfaktorischen

Epithel.

Immunreplikanalyse des olfaktorischen Epithels (OE) und des Herzmuskels

(HM) mit Pan-Cadherin-Antikörper und Garb-HRP-Pox sowie E-Cadherin-

Antikörper und Gam-HRP-POX.

N-Cadherin hat eine molekulare Masse von 130 kDa. Im Herzmuskel wurde

offensichtlich N-Cadherin mit Pan-Cadherin-Antikörper nachgewiesen. Im

olfaktorischen Epithel wurde durch Pan-Cadherin-Antikörper eine etwa gleich große

Bande markiert. Eine zusätzliche Bande mit der apparenten molekularen Masse von E-

Cadherin (120 kDa) war unter den gewählten Bedingungen nicht eindeutig abgrenzbar

(Abb. 4.2.5).

Ein longitudinaler (Abb. 4.2.6) und ein tangentialer (Abb. 4.2.7) Semidünnschnitt der

Riechschleimhaut wurde mit Primär-Antikörpern Pan-Cadherin/ β-Tubulin und den

Sekundär-Antikörpern Garb-Cy3/Gam-Cy2 inkubiert (3.12). Die Darstellung von β-

Tubulin diente der eindeutigen Identifizierung der Dendriten der Sinneszellen.

Ergebnisse 41

Abb. 4.2.6: Pan-Cadherin- (rot) und β-Tubulin-Immunreaktivtät (grün) in einem

Longitudinalschnitt durch das olfaktorische Epithel.

Maßstab: 5 µm.

Abbildung 4.2.6 zeigt apikal kräftig bzw. schwach fluoreszierende Punkte. Die β-

Tubulin-Immunreaktivität der Dendriten wurde apikal von der Pan-Cadherin-

Immunreaktivität begrenzt, dies deutete darauf hin, daß Pan-Cadherin-Reaktionen

Stützzell-Neuron-Kontakte markierten. Die polygonale Form der Pan-Cadherin-

Immunreaktivität zeigte, dass das durch Pan-Cadherin-Antikörper markierte Cadherin

auch in Stützzell-Stützzell-Kontakten lokalisiert war. Schwache Punkte im Bereich der

lateralen Zellgrenzen stellten Puncta adherentia dar. Basal nahm die Dichte der

Markierungen zu. Hier sind die Basalzellen gelegen.

Aufgrund der typischen Formen der unterschiedlichen Zonulae adherentes und der β-

Tubulin-Immunreaktivtät der Dendriten ließen sich im doppelimmunreagierten

Tangentialschnitt (Abb. 4.2.7) die Pan-Cadherin-Immunreaktivitäten den Stützzell-

Stützzell- und den Stützzell-Neuron-Kontakten zuordnen. Im Gegensatz zu

fluoreszenzimmunhistochemischen Reaktionen des olfaktorischen Epithels mit einem

Antikörper gegen E-Cadherin wurden Zellgrenzen zwischen Stützzellen und

Ergebnisse 42

Mikrovillizellen (größere Kreise im Tangentialschnitt), Kontakte im Bereich der

Ausführungsgänge der Bowmanschen Drüsen (longitudinale Linien im

Longitudinalschnitt) sowie Kontakte des respiratorischen Epithels nicht dargestellt.

Abb. 4.2.7: Pan-Cadherin- (rot) und β-Tubulin-Immunreaktivität (grün) in einem

Tangentialschnitt durch das olfaktorische Epithel.

Pfeil: Stützzell-Stützzell-Kontakt (polygonale Form); Pfeilspitze: Stützzell-Neuron-

Kontakt (kleiner Kreis); die β-Tubulin-Immunreaktivität markiert die Dendriten der

Sinneszellen. Maßstab: 5 µm.

Semidünnschnitte des Herzmuskelgewebes (Positivprobe) und Dünndarmepithels

(Negativprobe) wurden mit Pan-Cadherin-Antikörper inkubiert, um dessen relative

Spezifität gegenüber E-Cadherin in immunhistochemischen Untersuchungen zu

überprüfen (keine Abbildung; 3.12). Die Glanzstreifen des Herzmuskels stellten sich

deutlich dar, während im Dünndarmepithel, das große Mengen an E-Cadherin

exprimiert, keine Immunreaktivität nachzuweisen war. Unter den gewählten

Gewebebehandlungs- und Immunreaktionsbedinungen wurde E-Cadherin offenbar

durch Pan-Cadherin-Antikörper in situ praktisch nicht detektiert.

Um das durch Pan-Cadherin-Antikörper dargestellte Cadherin in den Zellen der

Riechschleimhaut genauer lokalisieren zu können, wurde ein Ultradünnschnitt mit dem

Pan-Cadherin-Antikörper und dem Sekundär-Antikörper Gam-US inkubiert und die

Goldpartikel durch Silberintensivierung verstärkt (Abb. 4.2.8; 3.10). Markierungen

Ergebnisse 43

fanden sich in den Stützzell-Dendrit- und, weniger dicht, in den Stützzell-Stützzell-

Kontakten.

Abb. 4.2.8: Pan-Cadherin-Immunreaktivität im olfaktorischen Epithel.

Inkubation von tangentialen Ultradünnschnitten des olfaktorischen Epithels mit Pan-

Cadherin-Antikörper (Pancad) und Gam-US. D: Dendrit; SC: Stützzelle (supporting

cell). Pfeile: Goldpartikel im Kontaktbereich zwischen Dendrit und Stützzelle;

Pfeilspitze: Goldpartikel im Kontaktbereich zwischen Stützzelle und Stützzelle.

Maßstab: 400 nm.

Das spezifische Lokalisationsmuster der Adherensproteine im olfaktorischen Epithel

wurde durch zusätzliche Untersuchungen von Doppelimmunreaktivitäten weiter

dokumentiert.

Longitudinale (Abb. 4.2.9) und schräge Semidünnschnitte (Abb. 4.2.10) wurden mit den

Primär-Antikörpern E-Cadherin und Pan-Cadherin sowie den Sekundär-Antikörpern

Gam-Cy3 und Garb-Cy2 inkubiert (3.12).

Ergebnisse 44

Abb. 4.2.9: E-Cadherin- (rot) und Pan-Cadherin-Immunreaktivität (grün) in einem

Longitudinalschnitt durch das olfaktorische Epithel.

Doppelinkubation mit E-Cadherin-/ Pan-Cadherin-Antikörper und Gam-Cy3/ Garb-Cy2

(rot/ grün). Maßstab: 10 µm.

Abbildung 4.2.9 zeigte apikal gelb fluoreszierende (doppelmarkierte) Streifen und

kleinere grüne (Pan-Cadherin-reaktive) bzw. größere rote (E-Cadherin-reaktive) Kreise,

welche den Zonulae adherentes zwischen Stützzellen und Stützzellen, Stützzellen und

Neuronen sowie Stützzellen und Mikrovillizellen entsprachen.

Abb. 4.2.10: E-Cadherin- (rot) und Pan-Cadherin-Immunreaktiviät (grün) in einem

Schrägschnitt durch das olfaktorische Epithel.

Ergebnisse 45

Doppelinkubation mit E-Cadherin-/ Pan-Cadherin-Antikörper und Gam-Cy3/ Garb-Cy2

(rot/ grün). Maßstab: 5µm.

Im Schrägschnitt (Abb. 4.2.10) waren apikal grün bzw. gelb und rot fluoreszierende

Halbkreise und Kreise zu sehen. Es handelte sich hierbei um die Zonulae adherentes

zwischen Stützzellen und Neuronen bzw. zwischen Stützzellen und Stützzellen sowie

zwischen Stützzellen und Mikrovillizellen.

Sowohl im Longitudinal- als auch im Schrägschnitt waren die E-Cadherin-reaktiven

lateralen Puncta adherentia zwischen Stützzellen und Mikrovillizellen deutlich als rote

Punkte erkennbar. Zudem waren grüne und gelbe punktförmige

Immunfluoreszenzmarkierungen zu erkennen, die den Puncta adherentia zwischen

Stützzellen und Neuronen bzw. zwischen Stützzellen entsprachen.

Ein wichtiger Nebenbefund dieser Untersuchungen war, dass apikal keine direkten

Kontakte zwischen einzelnen Neuronen, zwischen einzelnen Mikrovillizellen, zwischen

Neuronen und Mikrovillizellen, zwischen Neuronen und Ausführungsgangszellen oder

zwischen Mikrovillizellen und Ausführungsgangszellen zu beobachten waren. Sowohl

Neurone als auch Mikrovillizellen waren offensichtlich, zumindest in ihrem apikalen

Bereich, immer vollständig von Stützzellen eingehüllt. Dieser Befund wurde durch

elektronenmikroskopische Untersuchungen bestätigt (Abb. 1.1.4).

Abb. 4.2.11: E-Cadherin- (rot) und Pan-Cadherin-Immunreaktiviät (grün) in einem

Tangentialschnitt durch das olfaktorische Epithel.

Doppelinkubation mit E-Cadherin-/ Pan-Cadherin-Antikörper und Gam-Cy3/ Garb-Cy2

(rot/ grün). Pfeil: Ausführungsgang. Maßstab: 10 µm.

Ergebnisse 46

Intraepitheliale Schrägschnitte von Ausführungsgängen zeigen die erwartete

Immunfluoreszenz von E-Cadherin in Form größerer Kreise (Stützzell-

Ausführungsgangszell-Kontakt) und radiärer Streifen (Ausführungsgangszell-

Ausführungsgangszell-Kontakt)

Um die Zuordnung der Immunreaktivitäten zu den unterschiedlichen Zellkontakten zu

belegen, wurden Doppelinkubationen mit den Antikörpern gegen ZO-1 und Pan-

Cadherin durchgeführt. In Abb. 4.2.12 ist die differentielle Lokalisation der beiden

Proteine deutlich zu erkennen und belegt, daß die ZO-1-Immunfluoreszenz die apikalen

Zonulae occludentes, die Pan-Cadherin-Immunfluoreszenz die direkt darunter

gelegenen Zonulae adherentes markiert.

Abb. 4.2.12: ZO-1- (grün) und Pan-Cadherin-Immunreaktivität (rot) in einem

Longitudinalschnitt durch das olfaktorische Epithel.

Doppelinkubation mit ZO-1-/ Pan-Cadherin-Antikörper und Garat-Cy2/ Garb-Cy3

(grün/ rot). Maßstab: 5 µm.

Sowohl das apparente Molekulargewicht (130 kDa) als auch die Lokalisation

vorwiegend in neuronalen Kontakten deuteten darauf hin, dass es sich bei dem durch

Pan-Cadherin-Antikörper detektierten Cadherin um N-Cadherin handeln könnte. Dazu

wurden mit spezifischen Antikörpern weitere Untersuchungen durchgeführt.

Ergebnisse 47

In der Immunreplikanalyse (3.17) von Proteinen des olfaktorischen Epithels mit Hilfe

eines Antikörpers gegen ein Fusionsprotein aus der ersten extrazellulären Domäne von

N-Cadherin (Aminosäure 1-108; Dr. D.R. Colman) wurde ein Bandenmuster gefunden,

das in etwa dem der Immunreplikanalyse mit Pan-Cadherin-Antikörper entsprach.

Ein Schrägschnitt durch die Riechschleimhaut wurde mit dem Primär-Antikörper gegen

das N-Cadherin-Fusionsprotein und dem Sekundär-Antiköper Garb-Cy3 inkubiert (Abb.

4.2.13; 3.12). Die apikal gelegenen schwach fluoreszierenden Streifen bzw. Halbkreise

entsprachen den Zonulae adherentes zwischen Stützzellen und Stützzellen bzw.

zwischen Stützzellen und Sinneszellen. Puncta adherentia wurden nicht dargestellt.

Abb. 4.2.13: N-Cadherin-Immunreaktivität in einem Tangentialschnitt durch das

olfaktorische Epithel.

Inkubation mit N-Cadherin-Fusionsprotein-Antikörper und Garb-Cy3.

Maßstab: 10 µm.

Zum Ausschluß einer Kreuzreaktivität des Antikörpers gegen das N-Cadherin-

Fusionsprotein mit E-Cadherin wurden Semidünnschnitte des Herzmuskels

(Positivprobe; Abb. 4.2.14) und Vomeronasalorgans (Positivprobe; keine Abbildung)

sowie des Dünndarmepithels (Negativprobe; keine Abbildung) mit N-Cadherin-

Fusionsprotein-Antikörper und dem Sekundär-Antikörper Garb-Cy3 inkubiert (keine

Abbildung; 3.12). Im Herzmuskel und Vomeronasalorgan zeigten sich spezifische

Ergebnisse 48

Antigen-Antikörper-Reaktionen, im Dünndarmepithel wurden keine Strukturen

markiert. Der N-Cadherin-Fusionsprotein-Antikörper zeigte also unter unseren

Untersuchungsbedingungen keine Kreuzreaktivität mit E-Cadherin.

Abb. 4.2.14: N-Cadherin-Immunreaktivität in einem Semidünnschnitt durch das Herzmuskel-

Gewebe. Beachte die intensive Immunreaktivität der Glanzstreifen.

Inkubation mit N-Cadherin-Fusionsprotein-Antikörper und Garb-Cy3. Maßstab: 10 µm.

Um weiter zu untersuchen, ob N-Cadherin im olfaktorischen Epithel lokalisiert war,

wurde zudem ein Peptidantikörper (2.8) hergestellt (3.13). Er war gegen die

Aminosäuren 4 bis 22 der ersten extrazellulären Domäne des N-Cadherin der Ratte

gerichtet, die nahe der Bindungsdomäne lokalisiert sind. Diese Peptidsequenz erfüllte

folgende Kriterien:

a) Sie war 19 Aminosäuren lang und damit groß genug, um als Antigen erkannt zu

werden.

b) Sie hatte mit den Aminosäuren Arginin (R), Asparagin (N), Asparaginsäure (D),

Glutamin (Q), Serin (S), Threonin(T) und Tyrosin (Y) hydrophilen Charakter,

war also wasserlöslich.

c) Sie hatte einen Lysin-Rest (K), über den sie als Hapten an ein Trägermolekül

(z.B. KLH) gekoppelt werden konnte.

d) Sie wies keine Glykosylierungsstellen auf, welche die Aminosäurenstruktur

gestört hätten.

e) Sie enthielt keine Bindungsstellen für Cadherine oder Kalziumionen, so daß sie

einer Antigen-Antiköper-Reaktion frei zugänglich war.

f) Sie wies kaum Homologien auf, die Kreuzreaktivität zeigen konnten.

Ergebnisse 49

Das Peptid wurde über Glutaraldehyd an KLH gekoppelt (3.13.1) und gegen PBS

dialysiert (3.13.3).

Als Wirtstiere dienten zwei Kaninchen. Nachdem das Präimmunserum an

Semidünnschnitten des olfaktorischen Epithels und des Herzmuskels keine

unspezifischen Antigen-Antikörper-Reaktionen zeigte (keine Abbildung; 3.13.4), wurde

die Immunisierung wie unter 3.13.4 beschrieben durchgeführt. Das durch regelmäßige

Blutentnahmen gewonnene Immunserum wurde an Semidünnschnitten der

Riechschleimhaut (Testprobe) und des Herzmuskels (Positivprobe) untersucht (3.13.5)

und bei Nachweis einer spezifischen Antigen-Antikörper-Reaktion affinitätsgereinigt

(3.13.6). Als die optimale Antikörperkonzentration erreicht war, wurden die Wirtstiere

geschlachtet und deren gesamtes Blut verarbeitet (3.13.5; 3.13.6).

Nach Inkubation einer Immunreplikanalyse (3.17) mit dem N-Cadherin-

Peptidantikörper und dem Sekundär-Antikörper Garb-HRP-Pox zeigte sich in der Spur

des olfaktorischen Epithels keine Bande, in der Spur des Herzmuskel-Gewebes eine

Bande bei 130 kDa (Abb. 4.2.15). Diese war schwächer als die Banden, die durch den

Antiköper gegen Pan-Cadherin und den Antikörper gegen das N-Cadherin-

Fusionsprotein im Herzmuskel markiert wurden.

Abb. 4.2.15: Immunreaktivität des N-Cadherin-Peptidantikörpers im olfaktorischen

Epithel und im Herzmuskel.

Ergebnisse 50

Inkubation einer Immunreplikanalyse des olfaktorischen Epithels (OE) und des

Herzmuskels (HM) mit N-Cadherin-Peptidantikörper und Garb-HRP-Pox.

Trotz zahlreicher Inkubationen (3.12) wurde mit dem N-Cadherin-Peptidantikörper

keine Immunreaktivität im olfaktorischen Epithel beobachtet (keine Abbildung). Im

Herzmuskel konnten Glanzstreifen regelmäßig dargestellt werden (Abb. 4.2.16). Auch

im Vomeronasalorgan konnten Interzellularkontakte nachgewiesen werden (Abb.

4.2.17).

Abb. 4.2.16: Immunreaktivität des N-Cadherin-Peptidantikörpers in einem Semidünnschnitt

durch den Herzmuskel.

Inkubation mit N-Cadherin-Peptidantikörper und Garb-Cy3. Maßstab: 10 µm.

Abb. 4.2.17: Immunreaktivität des N-Cadherin-Peptidantikörpers in einem

Longitudinalschnitt durch das Vomeronasalorgan.

Inkubation mit N-Cadherin-Peptidantikörper und Garb-Cy3. Maßstab: 5 µm.

Ergebnisse 51

Der N-Cadherin-Peptidantikörper detektierte somit spezifisch N-Cadherin. Entweder

war die Sensitivität des Peptidantikörpers für eine Detektion von N-Cadherin in der

Riechschleimhaut zu gering, oder das N-Cadherin-Epitop, gegen das der

Peptidantikörper gerichtet war, war dem Peptidantikörper nicht zugänglich. Alternativ

könnte das durch Pan-Cadherin- und den N-Cadherin-Fusionsprotein-Antikörper

detektierte Cadherin der olfaktorischen Neurone in der durch den Peptidantikörper

detektierten Sequenz Unterschiede zu N-Cadherin aufweisen.

Lokalisation von Cateninen

Das zytoplasmatische Plaqueprotein α-Catenin besteht aus 906 Aminosäuren. Drei

Sequenzabschnitte sind dem zytoplasmatischen Plaqueprotein Vinculin sehr ähnlich. α-

Catenin liegt als Homodimer in Lösung vor. Es dissoziiert und bildet ein Heterodimer

mit β-Catenin (Pokutta et al., 2002).

Längs- (Abb. 4.2.18) und Schrägschnitte (Abb. 4.2.19) wurden mit dem α-Catenin-

Antikörper und dem Sekundär-Antikörper Gam-Cy3 inkubiert (3.12).

Abb. 4.2.18: α-Catenin-Immunreaktivität in einem Längsschnitt durch das

olfaktorische Epithel. Maßstab: 10 µm.

Ergebnisse 52

Apikal zeigten sich kräftig und schwach fluoreszierende Streifen, welche den Zonulae

adherentes zwischen Stützzellen und Stützzellen sowie zwischen Stützzellen und

Neuronen entsprachen. Schwache fluoreszierende Punkte im Bereich der lateralen

Zellgrenzen markierten Puncta adherentia. Von basal nach apikal zogen schwach

fluoreszierende tubuläre Strukturen, welche den Ausführungsgängen der Bowmanschen

Drüsen entsprachen.

Abb. 4.2.19: α-Catenin-Immunreaktivität in einem Schrägschnitt durch das

olfaktorische Epithel.

Großer Pfeil: Apikale Zellkontakte; mittelgroßer Pfeil: Intraepitheliale

Stützzell-Dendrit-Kontakte; kleiner Pfeil: Stützzell-Stützzell-Kontakte.

Maßstab: 10 µm.

In Abbildung 4.2.19 erkannte man apikal lokalisierte kräftig fluoreszierende Kreise, die

aufgrund ihres Durchmessers in aufsteigender Reihenfolge den Zonulae adherentes

zwischen Stützzellen und Neuronen, zwischen Stützzellen und Mikrovillizellen sowie

zwischen Stützzellen und Stützzellen zugeordnet werden können.

β-Catenin besteht aus einem 149 Aminosäuren langen N-Terminus, der die

Bindungsstelle für α-Catenin enthält, einer 515 Aminosäuren langen Zwischendomäne,

in der die Bindungsstelle für Cadherine und Transkriptionsfaktoren der Familie der T-

Zell-Faktoren gelegen ist, und einem 119 Aminosäuren langen C-Terminus. β-Catenin

ist Teil der Zonula und des Punctum adhaerens und Aktivator der Transkription der

wnt-Signaltransduktionskette (Pokutta et al., 2002; Gumbiner, 1993).

Ergebnisse 53

Eine Längs- (Abb. 4.2.20) und ein Schrägschnitt (Abb. 4.2.21) wurde mit dem Primär-

Antikörper gegen β-Catenin und dem Sekundär-Antikörper Gam-Cy3 inkubiert (3.12).

Abb. 4.2.20: β-Catenin-Immunreaktivität in einem Schrägschnitt durch das

olfaktorische Epithel. Maßstab: 10 µm.

Abb. 4.2.21: β-Catenin-Immunreaktivität in einem Schrägschnitt durch das olfaktorische

Epithel.

Großer Pfeil: Apikale Zellkontakte; mittelgroßer Pfeil: Intraepitheliale Stützzell-

Dendrit-Kontakte; kleiner Pfeil: Stützzell-Stützzell-Kontakte. Maßstab: 10 µm.

Ergebnisse 54

Die Verteilung des β-Catenins entsprach der des α-Catenins (siehe oben).

Die Doppelinkubation eines Tangentialschnitts durch das olfaktorische Epithel mit den

Pan-Cadherin- und β-Catenin-Antikörpern belegt die Kolokalisation der beiden Zonula-

adherens-Proteine (gelbe Fluoreszenz) und bestätigt damit die Identifizierung der durch

den Pan-Cadherin-Antikörper markierten Strukturen als Zonulae adherentes bzw.

Puncta adherentia (Abb. 4.2.22).

Abb. 4.2.22: Pan-Cadherin- (grün) und β-Catenin-Immunreaktivität (rot) in einem

Tangentialschnitt durch das olfaktorische Epithel.

Doppelinkubation mit Pan-Cadherin-/ β-Catenin-Antikörper und Garb-Cy3/ Gam-Cy2

(rot/ grün). Maßstab: 5 µm.

Lokalisation von α-Actinin

α-Actinin vermittelt den Kontakt der zytoplasmatischen Plaqueproteine mit dem Aktin-

Zytoskelett sowie die Verbindung zwischen Aktinfilamenten (Gumbiner, 1993).

Ein tangentialer Semidünnschnitt der Riechschleimhaut wurde mit dem Primär-

Antikörper gegen α-Actinin und dem Sekundär-Antikörper Garb-Cy3 inkubiert (Abb.

4.2.23; 3.12).

Ergebnisse 55

Abb. 4.2.23: α-Actinin-Immunreaktiviät in einem Tangentialschnitt durch das

olfaktorische Epithel. Maßstab: 5 µm.

Apikal gelegene kräftig fluoreszierende Kreise entsprachen nach ihrem Durchmesser

geordnet in absteigender Reihenfolge den Zonulae adherentes zwischen Stützzellen und

Stützzellen, Stützzellen Mikrovillizellen sowie Stützzellen und Neuronen.

Diskussion 56

5. Diskussion

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden die Zellkontaktproteine des olfaktorischen

Epithels lokalisiert und charakterisiert. Hierzu wurden Zellen und Zellkontakte der

Riechschleimhaut immunhistochemisch, licht- und elektronenmikroskopisch sowie

biochemisch identifiziert und einander zugeordnet.

Das olfaktorische Epithel ist ein einzigartiger Abschnitt des Nervensystems. Es hat eine

Fläche von ungefähr 62 mm2 und kleidet beidseits das obere Drittel der

Nasenscheidewand aus. Das Neuroepithel enthält neben den epithelialen Stützzellen,

Mikrovillizellen vom Typ 1 und Typ 2, Zellen des Ausführungsganges der

Bowmanschen Drüsen und horizontalen Basalzellen die neuronalen Sinneszellen und

rundlichen Basalzellen. Die Zellkörper der verschiedenen Zellen liegen in Schichten

übereinander. Von basal nach apikal finden sich Basalzellen, Sinneszellen, Stützzellen

und Mikrovillizellen vom Typ 1 und 2. Die Zellkörper der Zellen des

Ausführungsganges der Bowmanschen Drüsen durchziehen die Riechschleimhaut

vertikal (Mendoza, 1993).

Die neuronalen Sinneszellen sind bipolare Neurone. Ihr Dendrit reicht mit jeweils 5 bis

20 Zilien in das Lumen der Nasenhöhle. Die olfaktorischen Sinneszellen sind damit die

einzigen Neurone, die in direktem Kontakt mit der Außenwelt stehen (Drenckhahn et

al., 1994; Mori et al., 1995). Zudem sind sie die einzigen sensorischen Neurone, die in

Form eines Epithels und nicht eines Ganglions organisiert (Miragall et al., 1994) und

somit an der Ausbildung einer Epithelbarriere beteiligt sind.

Elektronenmiskroskopische Untersuchungen haben gezeigt, dass die Epithelbarriere aus

Zonulae occludentes, Zonulae adherentes und Desmosomen zwischen den

unterschiedlichen Zelltypen des olfaktorischen Epithels aufgebaut wird. Ein Ziel der

vorliegenden Arbeit war es, die Lokalisation von Zellkontakt-assoziierten Proteinen in

den für Neurone ungewöhnlichen Zonulae occludentes (Occludin, ZO1) sowie in

Zonulae adherentes (Cadherine, Catenine, α-Actinin) zu untersuchen. Voraussetzung

dafür war, dass die verschiedenen Zelltypen sowie ihre Zellgrenzen zueinander

erkennbar waren und dass homotypische (Stützzelle-Stützzelle) sowie die verschiedenen

möglichen heterotypischen Zellkontakte (Stützzelle-Neuron, Stützzelle-Mikrovillizelle,

Stützzelle-Ausführungsgangszelle) eindeutig identifiziert werden konnten. Durch

Diskussion 57

Anwendung unterschiedlicher Kombinationen von Antikörpern gegen Markerproteine

und Zellkontaktproteine gelang es in der vorliegenden Arbeit, das morphologische

Erscheinungsbild der Zellkontakte der verschiedenen Zelltypen zu dokumentieren. Im

apikalen Transversalschnitt konnten polygonale Formen als Kontakte zwischen

Stützzellen, kleinere Kreise als Kontakte zwischen Stützzellen und Neuronen

(Dendriten) und größere Kreise als Kontakte zwischen Stützzellen und Mikrovillizellen

identifiziert werden. Kontakte zwischen Stützzellen und Ausführungsgangszellen sowie

zwischen Ausführungsgangszellen waren als longitudinale Linien im

Longitudinalschnitt bzw. als intraepitheliale Punkte im Tangentialschnitt zu erkennen.

Diese Morphologie der Zellkontakte fand sich sowohl in der immunhistochemischen

Darstellung der Zonula-occludens- als auch der Zonula-adherens-Proteine. Eine

wichtige Beobachtung war, dass Stützzellen alle anderen Zelltypen kontaktieren und

umhüllen, während direkte apikale Kontakte zwischen einzelnen Neuronen oder

einzelnen Mikrovillizellen nicht beobachtet wurden. Stützzellen scheinen also sowohl

Neurone als auch Mikrovillizellen zu isolieren und damit zumindest bezüglich der

Neurone ähnliche Eigenschaften zu haben wie Gliazellen. Die Tatsache, dass

Mikrovillizellen wie die Neurone komplett eingehüllt werden, könnte auf eine rezeptive

Funktion dieser Zellen hindeuten. Zumindest bei Mikrovillizellen vom Typ II

unterstützt die starke Na+/K+-ATPase-Reaktivität der basolateralen Membranen diese

Hypothese.

Durch Toxine in der Atemluft oder Infektionen kann es zu einem massiven Untergang

der olfaktorischen Neurone kommen. Ein Verlust des Riechsinnes wird vermieden,

indem olfaktorische Neurone zeitlebens durch Proliferation von rundlichen Basalzellen

regeneriert werden (Doucette, 1990). Während ihrer Differenzierung zu reifen

Sinneszellen wandert der Zellkörper nach apikal, der Zellkern wird euchromatinreich.

Der Dendrit erstreckt sich entlang der Stützzellen zur Oberfläche des olfaktorischen

Epithels und bildet neue Interzellularkontakte zur Aufrechterhaltung der Epithelbarriere

aus. Das Axon bahnt sich seinen Weg durch die Basalmembran in die Lamina propria

(Morrison et al., 1992) und wächst in den Fila olfactoria zu spezifischen Glomeruli des

Bulbus olfactorius aus, wo neue synaptische Verbindungen zu den Zielneuronen

ausgebildet werden.

Diskussion 58

Es ist unklar, über welche Mechanismen olfaktorische Neurone das zielgerichtete

Wachstum ihrer Axone steuern. Auch die zonale Projektion wird durch Faktoren

bestimmt, deren molekulare Struktur kaum bekannt ist (Levai et al., 2003). Hierzu

gehören der Geruchsrezeptor (Mombaerts et al., 1996; Wang et al., 1998; Rodriguez et

al., 1999) und Zellkontaktproteine, z.B. das olfaktorische Zell-Adhäsions-Molekül

OCAM (cell adhesion molecule) (Yoshihara et al., 1997). OCAM wurde erstmals von

Yoshihara et al. (1997) beschrieben. Es handelt sich um ein Zellkontaktprotein aus der

Familie der Immunglobuline. Sinneszellen, die OCAM exprimierten, projizieren auf

Mitral- und Büschelzellen, die ebenfalls OCAM enthielten. Die Struktur des

Zellkontaktproteins ähnelt am ehesten NCAM. Im Gegensatz zu OCAM wird jedoch

NCAM im Bereich des gesamten zentralen Nervensystems exprimiert. Eine

Immunglobulin-ähnliche Struktur wurde auch für die Zellkontaktproteine apCAM und

Fasciclin II gefunden, die der Familie der NCAMs von Aplysia und Drosophila

angehören (Yoshihara et al., 1997). apCAM und Fasciclin II werden von bestimmten

Neuronen exprimiert und kontrollieren das Auswachsen von Axonen. Lang anhaltende

Stimulation der Neurone führt zu einer Verminderung der Anzahl von apCAM und

Fasciclin II durch Internalisierung oder Konformationsänderung (Bailey et al., 1992;

Mayford et al., 1992; Yoshihara et al., 1993). Zugleich nimmt die Anzahl synaptischer

Verbindungen deutlich zu (Yoshihara et al., 1997). Die Tatsache, daß OCAM nach

Bindung eines Geruchsmoleküls an einen Geruchsrezeptor nicht mehr nachweisbar ist,

legt die Vermutung nahe, daß es nicht nur bezüglich seiner Struktur, sondern auch

bezüglich seiner Funktion apCAM und Fasciclin II ähnelt (Yoshihara et al., 1997).

Neuere Untersuchungen haben ergeben, daß die Expression von OCAM in den

Dendriten der Sinneszellen Informationen über das Auswachsen der Axone vermittelt

(Treloar et al., 2003). OCAM-ähnliche Eigenschaften scheint das von Alenius et al.

(1997) beschriebene Immunglobulin RNCAM (Rb-8 neural cell adhesion molecule)zu

haben. Desweiteren scheinen die Zellkontaktproteine N-Cadherin, NCAM und L1 am

Auswachsen von Axonen beteiligt zu sein (Doherty et al., 1995; Doherty et al., 2000;

Kamiguchi et al., 2000; Utton et al., 2001). Cadherine könnten also neben ihrer

Bedeutung für die olfaktorische Epithelbarriere auch wichtige Funktionen für die

axonale Zielfindung im olfaktorische Epithel haben.

Diskussion 59

Der Kontakt zwischen der präsynaptischen Membran der Sinneszelle und der

postsynaptischen Membran der Mitral- oder Büschelzelle wird über klassische

Cadherine und Catenine vermittelt (Yamagata et al., 1995; Fannon et al., 1996; Uchida

et al., 1996). Die Transmembranproteine wurden zusammen mit den zytoplasmatischen

Plaqueproteinen symmetrisch angeordnet und direkt an das aktive Zentrum der Synapse

angrenzend lokalisiert (Uchida et al., 1996). Aufgrund ihrer besonderen

Bindungseigenschaften wird vermutet, daß Cadherine nach dem Schlüssel-Schloß-

Prinzip zielgerichtete interneuronale Verbindungen herstellen (Yagi et al., 2000). Im

Bereich des aktiven Zentrums kleiner und unreifer Synapsen wurden Proteine der CNR-

Familie identifiziert (Kohmura et al., 1998). Diese Zellkontaktproteine sind mit der

Tyrosinkinase Fyn assoziiert. Neben der Bildung synaptischer Bindungen scheinen sie

an der Signaltransduktion beteiligt zu sein (Yagi et al., 2000). Auch Proteine der

Protocadherin-Familie finden sich im Bereich von Synapsen. Arcadlin wurde mit

Synaptophysin, einem präsynaptischen Markerprotein, kolokalisiert. OL-Pc scheint in

funktionellen Einheiten wie zum Beispiel den Kernen des olfaktorischen Systems

exprimiert zu werden. Die Vielfalt synaptischer Bindungen beruht auf der Kombination

dieser einzelnen Zellkontaktproteine. N-Cadherin stellt nicht nur eine synaptische

Bindung her. Das Transmembranprotein ist an Vorgängen der synaptischen Plastizität

beteiligt. Tanaka et al. (2000) beschrieben, daß nach Depolarisation der präsynaptischen

Plasmamembran und Fusion der präsynaptischen Vesikel N-Cadherin lateralwärts

diffundierte. Zudem war eine Fraktion von N-Cadherin bis zwei Stunden nach der

Depolarisation gegen Proteasen resistent und lag als Monomer vor (Yagi et al., 2000).

Zellkontaktproteine, unter anderem Cadherine, scheinen somit nicht nur an der

Ausbildung epitheltypischer Kontakte, sondern im olfaktorischen System wie in

anderen Abschnitten des Nervensystems auch an axonalem Wachstum, axonaler

Zielfindung sowie an Synaptogenese und synaptischer Plastizität beteiligt zu sein.

Aufgrund seiner hohen Plastizität ist das olfaktorische Epithel ein ideales Modell zur

Untersuchung der Rolle von Zellkontaktproteinen bei den beschriebenen Vorgängen

(Miragall et al., 1994; Yoshihara et al., 1997). Voraussetzung für derartige

Untersuchungen ist zunächst die Analyse der Expression solcher Zellkontaktproteine,

z.B. der Cadherine, insbesondere in olfaktorischen Neuronen. Neben der Darstellung

der Lokalisation von Kontaktproteinen war es daher ein weiteres Ziel der vorliegenden

Diskussion 60

Arbeit, die von den verschiedenen Zelltypen des olfaktorischen Epithels exprimierten

Cadherine zu bestimmen.

Proteine der Zonulae occludentes im olfaktorischen Epithel

Die Zonula occludens besteht unter anderem aus den Transmembranproteinen Occludin,

verschiedenen Claudinen und dem zytoplasmatischen Plaqueprotein ZO-1 (1.2). Im

Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Semidünnschnitte des Riechepithels mit

Antikörpern sowohl gegen Occludin als auch gegen ZO-1 inkubiert (Abb. 4.1.1 – 4.1.3).

Beide Proteine waren in allen Zonulae occludentes des olfaktorischen Epithels

lokalisiert. Das Vorkommen von Occludin in Neuronen war bereits beschrieben worden

(Hussar et al., 2002), das Verteilungsmuster des Proteins konnte jedoch hier erstmals

gezeigt werden. Während die ZO1-Immunfluoreszenz in allen Zellkontakten gleich

stark erschien, war die relative Occludin-Immunreaktivität in epithelialen

Interzellularkontakten (Stützzelle-Stützzelle, Stützzelle-Mikrovillizelle, Stützzelle-

Ausführungsgangszelle) stärker ausgeprägt als in epithelial-neuronalen

Interzellularkontakten (Stützzelle-Sinneszelle). Wahrscheinlich ist Occludin in

epithelial-neuronalen Interzellularkontakten geringer konzentriert ist als in epithelialen

Interzellularkontakten, was auf eine unterschiedliche molekulare Komposition der

Zonulae occludentes zwischen den verschiedenen Zelltypen und auf unterschiedliche

Barriereeigenschaften der jeweiligen Interzellularkontakte hinweist (McCarthy et al.,

1996; Hirase et al., 1997; Balda et al., 2000). Eine Untersuchung der verschiedenen

Claudine des olfaktorischen Epithels muss zur genaueren Charakterisierung der

molekularen Zusammensetzung der verschiedenen Zonulae occludentes noch

durchgeführt werden.

Proteine der Zonulae adherentes im olfaktorischen Epithel

Die Zonula adherens epithelialer Zellen enthält das Transmembranprotein E-Cadherin.

Ein typisches Transmembranprotein der Zonula adherens neuronaler Zellen ist das N-

Cadherin. Die zytoplasmatischen Plaqueproteine und Proteine des Zytoskeletts

unterscheiden sich nicht.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden Semidünnschnitte des olfaktorischen

Epithels mit E-Cadherin- und Pan-Cadherin-Antikörpern inkubiert. Durch den E-

Diskussion 61

Cadherin-Antikörper stellten sich Zonulae adherentes und Puncta adherentia zwischen

epithelialen Stützzellen, Mikrovillizellen und Zellen des Ausführungsganges der

Bowmanschen Drüsen dar (Abb. 4.2.2; Abb. 4.2.3). Pan-Cadherin-Antikörper zeigten in

den Zonulae adherentes zwischen Stütz- und Sinneszellen stärkere, in den Zonulae

adherentes und Puncta adherentia zwischen Stützzellen schwächere Immunreaktivität.

Dies bedeutet, dass epitheliale Stützzellen und Neurone einen Interzellularkontakt auf

der Basis von Cadherinen ausbilden. Da Pan-Cadherin-Antikörper gegen einen Teil der

intrazellulären Domäne von N-Cadherin gerichtet sind, in unseren Gewebepräparaten E-

Cadherin nicht detektieren und in Immunreplikanalysen eine Bande detektieren, die

ähnliche Laufeigenschaften wie N-Cadherin aufweist, ist anzunehmen, dass das

Cadherin der Stützzell-Sinneszell-Kontakte N-Cadherin oder ein N-Cadherin-ähnliches

Cadherin ist.

Mit Hilfe der Doppelinkubation konnte gezeigt werden, daß sich die Immunreaktivität

für E-Cadherin- und Pan-Cadherin-Antikörper im Bereich der Zonulae adherentes

zwischen Stützzellen überlagerten (Abb. 4.2.9; Abb. 4.2.10). Ein heterophiler Kontakt

zwischen E-Cadherin und anderen Cadherinen, insbesondere N-Cadherin, wurde bislang

nicht beschrieben, sondern im Gegenteil durch in vitro Experimente wiederlegt

(Takeichi, 1995; Gumbiner, 1996; Yap et al., 1997). Eine Erklärung für unsere Befunde

ist, dass Stützzellen sowohl E-Cadherin als auch N-Cadherin bzw. ein N-Cadherin-

ähnliches Cadherin exprimieren, während die übrigen epithelialen Zellen (Mikrovilli-

und Ausführungsgangszellen) ausschließlich E-Cadherin und die Neurone

ausschließlich N-Cadherin oder das N-Cadherin-ähnliche Cadherin bilden. Je nach

Bindungspartner wird in Stützzellen offensichtlich E-Cadherin in die Membrandomänen

lokalisiert, die in Kontakt mit anderen epithelialen Zellen stehen, N-Cadherin oder das

N-Cadherin-ähnliche Cadherin in die Membrandomänen, die in Kontakt zu Neuronen

stehen, und möglicherweise beide Cadherine in die Membrandomänen zwischen

Stützzellen. Als Mechanismus für die Lokalisierung der verschiedenen Cadherine in den

spezifischen Membrandomänen ist vorstellbar, dass die in der basolateralen Membran

der Stützzellen zunächst frei beweglichen Cadherine durch homophile Bindung an die

jeweiligen Cadherine der Kontaktzelle immobilisiert, konzentriert, und damit

immunhistochemisch detektierbar werden. Eine Stabilisierung dieser Lokalisierung

erfolgt anschließend sekundär über eine Koppelung an das Aktin-Zytoskelett durch die

Diskussion 62

peripheren Membranproteine der Zonulae adherentes (s.o.). Ähnliche spezifische

Lokalisationsmuster in Membrandomänen wurden für E-Cadherin bzw. N-Cadherin in

hippocampalen Neuronen gezeigt (Fannon et al., 1996). Die stabilisierende Wirkung des

Aktin-Zytoskeletts durch Cadherine vermittelte Zellkontakte konnte kürzlich

nachgewiesen werden (Baumgartner et al., 2003).

Das Cadherin der olfaktorischen Neurone

Um das Cadherin der Neurone genauer zu charakterisieren, führten wir Untersuchungen

mit N-Cadherin-spezifischen Antikörpern durch. In der Immunreplikanalyse detektierte

der N-Cadherin-Fusionsprotein-Antikörper im olfaktorischen Epithel eine etwa gleich

laufende Bande wie im Herzmuskel. In situ war mit diesem Antikörper in Zonulae

adherentes zwischen Stütz- und Sinneszellen sowie zwischen Stützzellen eine relativ

schwache Immunfluoreszenz zu beobachten. Der N-Cadherin-Peptidantikörper, den wir

gegen eine in der unmittelbaren Nähe der putativen HAV-Bindungsdomäne von N-

Cadherin gelegene Aminosäuresequenz generiert hatten und der sowohl im Herzmuskel

als auch im Vomeronasalorgan Zonulae adherentes markierte, zeigte im olfaktorischen

Epithel zum einen in der Immunhistochemie keine Reaktion und detektierte zum

anderen in der Immunreplikanalyse kein Protein. Eine mögliche Erklärung für diese

Beobachtungen wäre, dass Stützzellen und Sinneszellen nicht N-Cadherin, sondern ein

mit N-Cadherin eng verwandtes Cadherin exprimieren. Ein relativ hoher Grad an N-

Cadherin-Homologie, besonders in der intrazellulären Domäne dieses Cadherins,

könnte erklären, warum die epithelial-neuronalen Zonulae adherentes durch den gering

spezifischen Pan-Cadherin-Antikörper gut, durch den gegen die gesamte erste

extrazelluläre Domäne des N-Cadherin gerichteten N-Cadherin-Fusionsprotein-

Antikörper weniger gut, und durch den hochspezifischen N-Cadherin-Peptidantikörper

gar nicht detektiert wurde. Eine weitere Möglichkeit wäre, dass die olfaktorischen

Neurone und Stützzellen zwar N-Cadherin synthetisieren, dass aber die erste

extrazelluläre Domäne bzw. die Aminosäuresequenz in der Nähe des putativen HAV-

Bindungsmotivs durch die ausgebildete Zonula adherens den Antikörpern im

Riechepithel nicht zugänglich ist. Ein ähnliches Phänomen wurde bei einer

Tumorzelllinie beobachtet (Schmelz et al., 1998).

Diskussion 63

Eine genaue Identifizierung des Cadherins der olfaktorischen Neurone ist nur durch In-

situ-Hybridisierung der Cadherin-mRNA möglich. Diese Untersuchungen müssen in

zukünftigen Studien durchgeführt werden.

Zytoplasmatische Proteine der Zonulae adherentes

α-Catenin und β-Catenin konnte in allen Zonulae adherentes dargestellt werden, die

durch Cadherin-Immunreaktivitäten detektierbar waren. Die Anbindung an das Aktin-

Zytoskelett scheint daher keine Unterschiede zu anderen epithelialen Zellkontakten

aufzuweisen.

Schlußfolgerungen

Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit haben eine Reihe neuer Erkenntnisse

bezüglich der Zellkontakte des olfaktorischen Epithels der Ratte erbracht. Die genaue

Charakterisierung des Erscheinungsbildes der verschiedenen Interzellularkontakte im

histologischen Schnitt ermöglichte die spezifische Zuordnung der Immunreaktivitäten

für die einzelnen Zellkontaktproteine. Es wurde nachgewiesen, dass Stützzellen alle

übrigen Zelltypen des olfaktorischen Epithels umhüllen. Dies bedeutet, dass zumindest

im Bereich des apikalen Epithels sowohl Neurone als auch Mikrovillizellen

untereinander und voneinander isoliert sind. Es konnte erstmals die Verteilung des

Zonula-occludens-Proteins Occludin im Riechepithel dargestellt werden. Bei der

Charakterisierung der molekularen Zusammensetzung der Zonulae adherentes zwischen

unterschiedlichen Zelltypen wurde beobachtet, dass Stützzellen zwei verschiedene

Cadherine synthetisieren: E-Cadherin wird für Zellkontakte zu epithelialen Zellen

benötigt (Mikrovillizellen, Ausführungsgangszellen), ein neuronales Cadherin für

Zellkontakte zu neuronalen Zellen (Sinneszellen) und beide Cadherine für Zellkontakte

zwischen Stützzellen. Es gibt Hinweise, dass es sich bei dem neuronalen Cadherin um

N-Cadherin handeln könnte, eine genaue Identifizierung muss in zukünftigen

Untersuchungen erfolgen.

Zusammenfassung 64

5. Zusammenfassung

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Lokalisierung und Charakterisierung von

Zellkontaktproteinen im olfaktorischen Epithel. Hierzu wurde die Riechschleimhaut der

Ratte für immunhistochemische, elektronenmikroskopische und biochemische

Experimente aufbereitet. Nachdem das Erscheinungsbild der verschiedenen

Interzellularkontakte im histologischen Schnitt charaktersisiert worden war, wurde

durch die Detektion von Transmembranproteinen, zytoplasmatischen Plaqueproteinen

und spezifischen Markermolekülen die genaue zelltypspezifische Zusammensetzung der

Zellkontakte dargestellt.

Die Untersuchungen haben eine Reihe neuer Erkenntnisse erbracht. Erstmals wurde

nicht nur das Vorkommen, sondern auch die Verteilung des Zonula-occludens-Proteins

Occludin dargestellt. Es wurde nachgewiesen, dass alle Zelltypen in der apikalen

Riechschleimhaut von Stützzellen umhüllt werden. Sowohl Neurone als auch

Mikrovillizellen sind somit untereinander und voneinander getrennt. Es wurde

beobachtet, dass Stützzellen zwei verschiedene Cadherine synthetisieren: E-Cadherin

für Zellkontakte zu epithelialen Zellen (Mikrovillizellen, Ausführungsgangszellen), ein

neuronales Cadherin, möglicherweise N-Cadherin, für Zellkontakte zu neuronalen

Zellen (Sinneszellen) und beide Cadherine für Zellkontakte zwischen Stützzellen.

Literaturverzeichnis 65

7. Literaturverzeichnis

Adams, C. L., Nelson, W. J., and Smith, S. J. (1996): Quantitative analysis of cadherin-

catenin-actin reorganization during development of cell-cell adhesion. J Cell Biol 135,

1899-911.

Alenius, M., and Bohm, S. (1997): Identification of a novel neural cell adhesion

molecule-related gene with a potential role in selective axonal projection. J Biol Chem

272, 26083-6.

Amagai, M., Nishikawa, T., Nousari, H. C., Anhalt, G. J., and Hashimoto, T. (1998):

Antibodies against desmoglein 3 (pemphigus vulgaris antigen) are present in sera from

patients with paraneoplastic pemphigus and cause acantholysis in vivo in neonatal mice.

J Clin Invest 102, 775-82.

Amagai, M. (1999): Autoimmunity against desmosomal cadherins in pemphigus. J

Dermatol Sci 20, 92-102.

Amagai, M., Matsuyoshi, N., Wang, Z. H., Andl, C., and Stanley, J. R. (2000): Toxin in

bullous impetigo and staphylococcal scalded-skin syndrome targets desmoglein 1. Nat

Med 6, 1275-7.

Asan, E. (2004): Geruchssystem. In: Benninghoff-Drenckhahn, Anatomie, 16. Auflage,

Band 2, D. Drenckhahn (Herausgeber), Elsevier, Urban und Fischer, S. 746-754.

Asan, E., Höfer, and Drenckhahn, D. (1999): Immunzytochemische Charakterisierung

von Mikrovillizellen des olfaktorischen Epithels. Ann Ant, 67.

Bailey, C. H., Chen, M., Keller, F., and Kandel, E. R. (1992): Serotonin-mediated

endocytosis of apCAM: an early step of learning-related synaptic growth in Aplysia.

Science 256, 645-9.

Literaturverzeichnis 66

Balda, M. S., and Matter, K. (2000): Transmembrane proteins of tight junctions. Semin

Cell Dev Biol 11, 281-9.

Balda, M. S., Flores-Maldonado, C., Cereijido, M., Matter, K. (2000): Multiple domains

of occludin are involved in the regulation of paracellular permeability. Journal of

Cellular Biochemistry 78, 85-96

Balda, M. S., and Matter, K. (2003): Epithelial cell adhesion and the regulation of gene

expression. Trends Cell Biol 13, 310-8.

Baumgartner, W., Golenhofen, N., Grundhofer, N., Wiegand, J., Drenckhahn, D.

(2003): Ca2+ dependency of N-cadherin function probed by laser tweezer and atomic

force microscopy. J Neurosci 23, 11008-14

Bement, W. M., Forscher, P., and Mooseker, M. S. (1993): A novel cytoskeletal

structure involved in purse string wound closure and cell polarity maintenance. J Cell

Biol 121, 565-78.

Borisy, F. F., Ronnett, G. V., Cunningham, A. M., Juilfs, D., Beavo, J., and Snyder, S.

H. (1992): Calcium/calmodulin-activated phosphodiesterase expressed in olfactory

receptor neurons. J Neurosci 12, 915-23.

Breer, H., Wanner, I., and Strotmann, J. (1996): Molecular genetics of mammalian

olfaction. Behav Genet 26, 209-19.

Burnette, W. N. (1981): "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from

sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and

radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Anal Biochem 112,

195-203.

Literaturverzeichnis 67

Cepek, K. L., Shaw, S. K., Parker, C. M., Russell, G. J., Morrow, J. S., Rimm, D. L.,

and Brenner, M. B. (1994): Adhesion between epithelial cells and T lymphocytes

mediated by E-cadherin and the alpha E beta 7 integrin. Nature 372, 190-3.

Chen, T. Y., and Yau, K. W. (1994): Direct modulation by Ca(2+)-calmodulin of cyclic

nucleotide-activated channel of rat olfactory receptor neurons. Nature 368, 545-8.

Creifido, M (1991): Tight junctions, CRC Press Inc., Boca Raton, FL

Dear, T. N., Boehm, T., Keverne, E. B., and Rabbitts, T. H. (1991): Novel genes for

potential ligand-binding proteins in subregions of the olfactory mucosa. Embo J 10,

2813-9.

Dieckmann-Schuppert, A., and Schnittler, H. J. (1997): A simple assay for

quantification of protein in tissue sections, cell cultures, and cell homogenates, and of

protein immobilized on solid surfaces. Cell Tissue Res 288, 119-26.

Doherty, P., Williams, E., and Walsh, F. S. (1995): A soluble chimeric form of the L1

glycoprotein stimulates neurite outgrowth. Neuron 14, 57-66.

Doherty, P., Williams, G., and Williams, E. J. (2000): CAMs and axonal growth: a

critical evaluation of the role of calcium and the MAPK cascade. Mol Cell Neurosci 16,

283-95.

Doucette, R. (1990): Glial influences on axonal growth in the primary olfactory system.

Glia 3, 433-49.

Drenckhahn, D., and Franz, H. (1986): Identification of actin-, alpha-actinin-, and

vinculin-containing plaques at the lateral membrane of epithelial cells. J Cell Biol 102,

1843-52.

Literaturverzeichnis 68

Drenckhahn, D., Zenker (1994): Benninghoff, Anatomie. Urban und Schwarzenberg,

15. Auflage, S. 784-790.

Drenckhahn, D. (Herausgeber): Benninghoff-Drenckhahn, Anatomie, 16. Auflage, Band

1 und 2, Elsevier, Urban und Fischer, München.

Fannon, A. M., Sherman, D. L., Ilyina-Gragerova, G., Brophy, P. J., Friedrich, V. L.,

Jr., and Colman, D. R. (1995): Novel E-cadherin-mediated adhesion in peripheral nerve:

Schwann cell architecture is stabilized by autotypic adherens junctions. J Cell Biol 129,

189-202.

Fannon, A. M., and Colman, D. R. (1996): A model for central synaptic junctional

complex formation based on the differential adhesive specificities of the cadherins.

Neuron 17, 423-34.

Gonzalez-Mariscal, L., Betanzos, A., Nava, P., and Jaramillo, B. E. (2003): Tight

junction proteins. Prog Biophys Mol Biol 81, 1-44.

Grunwald, G. B. (1993): The structural and functional analysis of cadherin calcium-

dependent cell adhesion molecules. Curr Opin Cell Biol 5, 797-805.

Gumbiner, B., Stevenson, B., and Grimaldi, A. (1988): The role of the cell adhesion

molecule uvomorulin in the formation and maintenance of the epithelial junctional

complex. J Cell Biol 107, 1575-87.

Gumbiner, B. M. (1993): Proteins associated with the cytoplasmic surface of adhesion

molecules. Neuron 11, 551-64.

Gumbiner, B. M. (1996): Cell adhesion: the molecular basis of tissue architecture and

morphogenesis. Cell 84, 345-57.

Literaturverzeichnis 69

Hashimoto, T., Kiyokawa, C., Mori, O., Miyasato, M., Chidgey, M. A., Garrod, D. R.,

Kobayashi, Y., Komori, K., Ishii, K., Amagai, M., and Nishikawa, T. (1997): Human

desmocollin 1 (Dsc1) is an autoantigen for the subcorneal pustular dermatosis type of

IgA pemphigus. J Invest Dermatol 109, 127-31.

Hirase, T., Staddon, J. M., Saitou, M., Ando-Akatsuka, Y., Itoh, M., Furuse, M.,

Fujimoto, K., Tsukita, S., Rubin, L. L. (1997): Occludin as a possible determinant of

tight junction permeability in endothelial cells. Journal of Cell Science 110, 1603-1613

Hofer, D., Asan, E., and Drenckhahn, D. (1999): Chemosensory Perception in the Gut.

News Physiol Sci 14, 18-23.

Holbrook, E. H., Szumowski, K. E., and Schwob, J. E. (1995): An immunochemical,

ultrastructural, and developmental characterization of the horizontal basal cells of rat

olfactory epithelium. J Comp Neurol 363, 129-46.

Hussar, P., Tserentsoodol, N., Koyama, H., Yokoo-Sugawara, M., Matsuzaki, T.,

Takami, S., Takata, K. (2002): The glucose transporter GLUT1 and the tight junction

protein occludin in nasal olfactory mucosa. Chem Senses 27, 7-11

Ishii, K. (2003): Greater diversity of desmosomal cadherins. J Invest Dermatol 120, ix-

x.

Itoh, M., Furuse, M., Morita, K., Kubota, K., Saitou, M., and Tsukita, S. (1999): Direct

binding of three tight junction-associated MAGUKs, ZO-1, ZO-2, and ZO-3, with the

COOH termini of claudins. J Cell Biol 147, 1351-63.

Jang, W., Youngentob, S. L., and Schwob, J. E. (2003): Globose basal cells are required

for reconstitution of olfactory epithelium after methyl bromide lesion. J Comp Neurol

460, 123-40.

Literaturverzeichnis 70

Kamiguchi, H., and Lemmon, V. (2000): IgCAMs: bidirectional signals underlying

neurite growth. Curr Opin Cell Biol 12, 598-605.

Kohmura, N., Senzaki, K., Hamada, S., Kai, N., Yasuda, R., Watanabe, M., Ishii, H.,

Yasuda, M., Mishina, M., and Yagi, T. (1998): Diversity revealed by a novel family of

cadherins expressed in neurons at a synaptic complex. Neuron 20, 1137-51.

Kramer, R. H., and Siegelbaum, S. A. (1992): Intracellular Ca2+ regulates the

sensitivity of cyclic nucleotide-gated channels in olfactory receptor neurons. Neuron 9,

897-906.

Kubota, K., Furuse, M., Sasaki, H., Sonoda, N., Fujita, K., Nagafuchi, A., and Tsukita,

S. (1999): Ca(2+)-independent cell-adhesion activity of claudins, a family of integral

membrane proteins localized at tight junctions. Curr Biol 9, 1035-8.

Laemmli, U. K. (1970): Cleavage of structural proteins during the assembly of the head

of bacteriophage T4. Nature 227, 680-5.

Lazard, D., Zupko, K., Poria, Y., Nef, P., Lazarovits, J., Horn, S., Khen, M., and Lancet,

D. (1991): Odorant signal termination by olfactory UDP glucuronosyl transferase.

Nature 349, 790-3.

Lee, K. H., Wells, R. G., and Reed, R. R. (1987): Isolation of an olfactory cDNA:

similarity to retinol-binding protein suggests a role in olfaction. Science 235, 1053-6.

Levai, O., Breer, H., and Strotmann, J. (2003): Subzonal organization of olfactory

sensory neurons projecting to distinct glomeruli within the mouse olfactory bulb. J

Comp Neurol 458, 209-20.

Li, D., and Mrsny, R. J. (2000): Oncogenic Raf-1 disrupts epithelial tight junctions via

downregulation of occludin. J Cell Biol 148, 791-800.

Literaturverzeichnis 71

Madara, J. L. (1987): Intestinal absorptive cell tight junctions are linked to cytoskeleton.

Am J Physiol 253, C171-5.

Madara, J. L., Moore, R., and Carlson, S. (1987): Alteration of intestinal tight junction

structure and permeability by cytoskeletal contraction. Am J Physiol 253, C854-61.

Madara, J. L., Stafford, J., Barenberg, D., and Carlson, S. (1988): Functional coupling

of tight junctions and microfilaments in T84 monolayers. Am J Physiol 254, G416-23.

Magee, A. I., and Buxton, R. S. (1991): Transmembrane molecular assemblies regulated

by the greater cadherin family. Curr Opin Cell Biol 3, 854-61.

Manabe, T., Togashi, H., Uchida, N., Suzuki, S. C., Hayakawa, Y., Yamamoto, M.,

Yoda, H., Miyakawa, T., Takeichi, M., and Chisaka, O. (2000): Loss of cadherin-11

adhesion receptor enhances plastic changes in hippocampal synapses and modifies

behavioral responses. Mol Cell Neurosci 15, 534-46.

Margolis, F. L. (1972): A brain protein unique to the olfactory bulb. Proc Natl Acad Sci

U S A 69, 1221-4.

Martin-Padura, I., Lostaglio, S., Schneemann, M., Williams, L., Romano, M., Fruscella,

P., Panzeri, C., Stoppacciaro, A., Ruco, L., Villa, A., Simmons, D., and Dejana, E.

(1998): Junctional adhesion molecule, a novel member of the immunoglobulin

superfamily that distributes at intercellular junctions and modulates monocyte

transmigration. J Cell Biol 142, 117-27.

Matsunami, H., Miyatani, S., Inoue, T., Copeland, N. G., Gilbert, D. J., Jenkins, N. A.,

and Takeichi, M. (1993): Cell binding specificity of mouse R-cadherin and

chromosomal mapping of the gene. J Cell Sci 106 ( Pt 1), 401-9.

Literaturverzeichnis 72

Mayford, M., Barzilai, A., Keller, F., Schacher, S., and Kandel, E. R. (1992):

Modulation of an NCAM-related adhesion molecule with long-term synaptic plasticity

in Aplysia. Science 256, 638-44.

McCarthy, K. M., Skare, I. B., Stankewich, M. C., Furuse, M., Tsukita, S., Rogers, R.

A., Lynch, R. D., Schneeberger, E. E. (1996): Occludin is a functional component of the

tight junction. Journal of Cell Science 109, 2287-2298

Mendoza, A. S., and Kuhnel, W. (1991): Postnatal changes in the ultrastructure of the

rat olfactory epithelium: the supranuclear region of the supporting cells. Cell Tissue Res

265, 193-6.

Mendoza, A. S. (1993): Morphological studies on the rodent main and accessory

olfactory systems: the regio olfactoria and vomeronasal organ. Anat Anz 175, 425-46.

Miragall, F., Krause, D., de Vries, U., and Dermietzel, R. (1994): Expression of the

tight junction protein ZO-1 in the olfactory system: presence of ZO-1 on olfactory

sensory neurons and glial cells. J Comp Neurol 341, 433-48.

Mombaerts, P., Wang, F., Dulac, C., Chao, S. K., Nemes, A., Mendelsohn, M.,

Edmondson, J., and Axel, R. (1996): Visualizing an olfactory sensory map. Cell 87,

675-86.

Mooseker, M. S., Bonder, E. M., Conzelman, K. A., Fishkind, D. J., Howe, C. L., and

Keller, T. C., 3rd (1984): Brush border cytoskeleton and integration of cellular

functions. J Cell Biol 99, 104s-112s.

Moran, D. T., Rowley, J. C., 3rd, and Jafek, B. W. (1982): Electron microscopy of

human olfactory epithelium reveals a new cell type: the microvillar cell. Brain Res 253,

39-46.

Literaturverzeichnis 73

Morrison, E. E., and Costanzo, R. M. (1992): Morphology of olfactory epithelium in

humans and other vertebrates. Microsc Res Tech 23, 49-61.

Nagafuchi, A. (2001): Molecular architecture of adherens junctions. Curr Opin Cell

Biol 13, 600-3.

Nef, P., Heldman, J., Lazard, D., Margalit, T., Jaye, M., Hanukoglu, I., and Lancet, D.

(1989): Olfactory-specific cytochrome P-450. cDNA cloning of a novel neuroepithelial

enzyme possibly involved in chemoreception. J Biol Chem 264, 6780-5.

Petruzzelli, L., Takami, M., and Humes, H. D. (1999): Structure and function of cell

adhesion molecules. Am J Med 106, 467-76.

Pokutta, S., and Weis, W. I. (2002): The cytoplasmic face of cell contact sites. Curr

Opin Struct Biol 12, 255-62.

Redies, C., and Takeichi, M. (1993): Expression of N-cadherin mRNA during

development of the mouse brain. Dev Dyn 197, 26-39.

Reichert, M., Muller, T., and Hunziker, W. (2000): The PDZ domains of zonula

occludens-1 induce an epithelial to mesenchymal transition of Madin-Darby canine

kidney I cells. Evidence for a role of beta-catenin/Tcf/Lef signaling. J Biol Chem 275,

9492-500.

Ressler, K. J., Sullivan, S. L., and Buck, L. B. (1994): Information coding in the

olfactory system: evidence for a stereotyped and highly organized epitope map in the

olfactory bulb. Cell 79, 1245-55.

Rodriguez, I., Feinstein, P., and Mombaerts, P. (1999): Variable patterns of axonal

projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system. Cell 97, 199-208.

Literaturverzeichnis 74

Salinovich, O., and Montelaro, R. C. (1986): Reversible staining and peptide mapping

of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-

polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem 156, 341-7.

Sano, K., Tanihara, H., Heimark, R. L., Obata, S., Davidson, M., St John, T., Taketani,

S., and Suzuki, S. (1993): Protocadherins: a large family of cadherin-related molecules

in central nervous system. Embo J 12, 2249-56.

Schleicher, S., Boekhoff, I., Arriza, J., Lefkowitz, R. J., and Breer, H. (1993): A beta-

adrenergic receptor kinase-like enzyme is involved in olfactory signal termination. Proc

Natl Acad Sci U S A 90, 1420-4.

Shapiro, L., Fannon, A. M., Kwong, P. D., Thompson, A., Lehmann, M. S., Grubel, G.,

Legrand, J. F., Als-Nielsen, J., Colman, D. R., and Hendrickson, W. A. (1995a):

Structural basis of cell-cell adhesion by cadherins. Nature 374, 327-37.

Shapiro, L., Kwong, P. D., Fannon, A. M., Colman, D. R., and Hendrickson, W. A.

(1995b): Considerations on the folding topology and evolutionary origin of cadherin

domains. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 6793-7.

Staehelin, L. A. (1973): Further observations on the fine structure of freeze-cleaved

tight junctions. J Cell Sci 13, 763-86.

Suzuki, S., Sano, K., and Tanihara, H. (1991): Diversity of the cadherin family:

evidence for eight new cadherins in nervous tissue. Cell Regul 2, 261-70.

Takai, Y., and Nakanishi, H. (2003): Nectin and afadin: novel organizers of intercellular

junctions. J Cell Sci 116, 17-27.

Takeichi, M. (1995): Morphogenetic roles of classic cadherins. Curr Opin Cell Biol 7,

619-27.

Literaturverzeichnis 75

Tanaka, H., Shan, W., Phillips, G. R., Arndt, K., Bozdagi, O., Shapiro, L., Huntley, G.

W., Benson, D. L., and Colman, D. R. (2000): Molecular modification of N-cadherin in

response to synaptic activity. Neuron 25, 93-107.

Tang, L., Hung, C. P., and Schuman, E. M. (1998): A role for the cadherin family of

cell adhesion molecules in hippocampal long-term potentiation. Neuron 20, 1165-75.

Treloar, H. B., Gabeau, D., Yoshihara, Y., Mori, K., and Greer, C. A. (2003): Inverse

expression of olfactory cell adhesion molecule in a subset of olfactory axons and a

subset of mitral/tufted cells in the developing rat main olfactory bulb. J Comp Neurol

458, 389-403.

Tsukita, S., Furuse, M., and Itoh, M. (2001): Multifunctional strands in tight junctions.

Nat Rev Mol Cell Biol 2, 285-93.

Uchida, N., Honjo, Y., Johnson, K. R., Wheelock, M. J., and Takeichi, M. (1996): The

catenin/cadherin adhesion system is localized in synaptic junctions bordering

transmitter release zones. J Cell Biol 135, 767-79.

Utton, M. A., Eickholt, B., Howell, F. V., Wallis, J., and Doherty, P. (2001): Soluble N-

cadherin stimulates fibroblast growth factor receptor dependent neurite outgrowth and

N-cadherin and the fibroblast growth factor receptor co-cluster in cells. J Neurochem

76, 1421-30.

Van Itallie, C. M., and Anderson, J. M. (1997): Occludin confers adhesiveness when

expressed in fibroblasts. J Cell Sci 110 ( Pt 9), 1113-21.

Vassar, R., Chao, S. K., Sitcheran, R., Nunez, J. M., Vosshall, L. B., and Axel, R.

(1994): Topographic organization of sensory projections to the olfactory bulb. Cell 79,

981-91.

Literaturverzeichnis 76

Vaughn, D. E., and Bjorkman, P. J. (1996): The (Greek) key to structures of neural

adhesion molecules. Neuron 16, 261-73.

Vietor, I., Bader, T., Paiha, K., and Huber, L. A. (2001): Perturbation of the tight

junction permeability barrier by occludin loop peptides activates beta-

catenin/TCF/LEF-mediated transcription. EMBO Rep 2, 306-12.

Wang, F., Nemes, A., Mendelsohn, M., and Axel, R. (1998): Odorant receptors govern

the formation of a precise topographic map. Cell 93, 47-60.

Yagi, T., and Takeichi, M. (2000): Cadherin superfamily genes: functions, genomic

organization, and neurologic diversity. Genes Dev 14, 1169-80.

Yamagata, M., and Sanes, J. R. (1995): Lamina-specific cues guide outgrowth and

arborization of retinal axons in the optic tectum. Development 121, 189-200.

Yap, A. S., Brieher, W. M., and Gumbiner, B. M. (1997): Molecular and functional

analysis of cadherin-based adherens junctions. Annu Rev Cell Dev Biol 13, 119-46.

Yoshihara, Y., Katoh, K., and Mori, K. (1993): Odor stimulation causes disappearance

of R4B12 epitope on axonal surface molecule of olfactory sensory neurons.

Neuroscience 53, 101-10.

Yoshihara, Y., Kawasaki, M., Tamada, A., Fujita, H., Hayashi, H., Kagamiyama, H.,

and Mori, K. (1997): OCAM: A new member of the neural cell adhesion molecule

family related to zone-to-zone projection of olfactory and vomeronasal axons. J

Neurosci 17, 5830-42.

Danksagung

Frau Prof. Dr. Asan danke ich für die Überlassung des Themas und für ihre engagierte

Betreuung sowie ihre ständige Bereitschaft zur Diskussion und Unterstützung der

Arbeit. Besonders bedanken möchte ich mich auch bei Prof. Dr. Drenckhahn für seine

freundliche Unterstützung.

Weiterhin möchte ich mich bei allen Mitarbeitern des Instituts für Anatomie und

Zellbiologie für ihre Hilfsbereitschaft bedanken.

Lebenslauf Name Anna Sofia Meier-Stiegen Geburtsdatum 25. Januar 1975 Geburtsort Hamburg Konfession evangelisch-lutherisch Schulbildung 1981-1985 Grundschule Wasserburg am Inn 1985-1989 Luitpold-Gymnasium Wasserburg am Inn 1989-1991 Johanneum Lüneburg 1991-1994 Luitpold-Gymnasium Wasserburg am Inn 01. Juli 1994 Abiturprüfung Stipendium für Hochbegabte nach dem

Bayerischen Begabtenförderungsgesetz Praktika 10/1994 Archäologisches Praktikum Germanisches

Nationalmuseum Nürnberg 11/1994–03/1995 Pflegepraktikum Kreiskrankenhaus Wasserburg am Inn Universitäre Ausbildung 04/1995-10/2001 Studium der Humanmedizin (Universität Würzburg) 18. März 1997 Ärztliche Vorprüfung 24. März 1998 Erster Abschnitt der ärztlichen Prüfung 04. April 2000 Zweiter Abschnitt der ärztlichen Prüfung 17. Oktober 2001 Dritter Abschnitt der ärztlichen Prüfung Gesamtnote gut Famulaturen 04/1998 Chirurgie (Missionsärztliche Klink Würzburg) 09/1998 Pädiatrie (Kinderklinik am Mönchberg Würzburg) 10/1998 Dermatologie (Dres. Schubert, Frank, Beck-Bohlen,

Kristen, Würzburg) 03/1999 Pädiatrie (Universität Köln) 09/1999 Innere Medizin (Medizinische Poliklinik der Universität

Würzburg) Praktisches Jahr 04/2000-08/2000 Medizinische Poliklinik der Universität Würzburg 08/2000-12/2000 Chirurgische Universitätsklinik Würzburg 12/2000-03/2001 Pädiatrische Universitätsklinik Würzburg Ärztin im Praktikum Innere Medizin 11/2001-04/2003 Medizinische Poliklinik der Universität Würzburg Assistenzärztin Innere Medizin 08/2003-03/2004 Klinikum Straubing seit 04/2004 Krankenhaus Barmherzige Brüder Regensburg