Listeria monocytogenes

Jarmila Pazlarová

Ústav biochemie a mikrobiologie

FPBT, VŠCHT

Nařízení Komise (ES) č. 2073/2005 ze dne 15.11. 2005 o mikrobiologických

kriteriích pro potraviny

• Platnost od 1.1.2006• Salmonella sp.• Listeria monocytogenes• Enterobacter sakazakii• Escherichia coli – indikátor fekálního znečistění• Koagulázopozitivní stafylokoky• Enterobacteriacae

Kriteria bezpečnosti potravin

• Potraviny určené k přímé spotřebě pro kojence a potraviny určené k přímé spotřebě pro zvláštní léčebné účely

• Nepřítomnost v 25 g EN/ISO 11290-1• Potraviny určené k přímé spotřebě, které podporují růst

L.monocytogenes, jiné než pro kojence a pro zvláštní léčebné účely

• 100 KTJ/g EN/ISO 11290-2

produkty uvedené na trh během doby údržnosti

Kriteria bezpečnosti potravin

• Potraviny určené k přímé spotřebě, které nepodporují růst L.monocytogenes, jiné než pro kojence a pro zvláštní léčebné účely

• 100 KTJ/g EN/ISO 11290-2

Historický úvod• Murray v roce 1926:

– Bacterium monocytogenes– krevní monocyty králíků – Patogen lidí a zvířat

• Pirie v roce 1940:– Listeria monocytogenes

– Joseph Lister

• Od roku 1980– foodborn pathogen

Potraviny určené k přímé spotřebě, které nepodporují růst

L.monocytogenes

výrobky s pH < 4,4 nebo aw < 0,92 výrobky s pH < 5,0 a aw < 0,94 výrobky s dobou údržnosti pod 5 dní je-li to vědecky opodstatněné, i jiné

výrobky

• Rod Listeria se člení do 6 druhů: L. monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri, L. ivanovii, a L. grayi. L. grayi a L. ivanovii mají dva poddruhy,které se obtížně rozlišují.

• Současné taxonomické studie tohoto rodu jako patogeny uvádějí L. ivanovii a L. monocytogenes (myši, ovce a další zvířata).

• Pouze L. monocytogenes je původce humánních listerios.

• Listeriosy vyvolané infekcí L. ivanovii a nebo L. seeligeri, jsou u lidí vyjímečné.

Listeria monocytogenes Scanning EM showing Flagella

Základní údaje - výskyt

Gram-pozitivní bakterie, pohyblivá pomocí bičíku. Některé studie udávají, že 1-10% lidí může být přenašečemi L. monocytogenes ve střevním traktu.

• Celkem bylo nalezeno 37 kmenů u savců, jak u domácích, tak u divokých. U ptáků bylo nalezeno 17 druhů a pravděpodobně jsou druhy přenášené rybami a měkýši.

• Byla izolovaná z půdy, siláže a dalších přírodních zdrojů.

• L. monocytogenes je značně odolná, přežívá zhoubné účinky mrazu, vysušení a horka velice dobře na to, že se nejedná o sporotvorný druh.

• Většina kmenů L. monocytogenes je patogenní.

Gramovo barvení

morfologie

Asociace s potravinami

• L. monocytogenes bývá spojovaná s potravina-mi jako je syrové mléko, špatně pasterizované mléko, sýry (typy zrajících měkkých sýrů), zmrzlina, syrová zelenina, fermentované klobásy ze syrového masa, syrová a vařená drůbež, syrové maso (všech typů), a syrové a uzené ryby.

• Schopnost růstu při teplotách kolem 3°C umožňuje množení v chlazených potravinách.

Odolnost listerií Listerie jsou bakterie s širokým rozmezím teplot,

při kterých si zachovávají plně vitální funkce od 0 do 50 °C

Při teplotě 20 °C se v potravinách množí od aw 0,93 –0,95

Toleruje hodnoty pH v rozsahu 4,3 – 9,6

Přežívá v potravinách s koncentrací soli 10 %

Bakterie mléčného kvašení a bakteriociny inhibují růst listerií

Infekční dávka

• Infekční dávka L. monocytogenes není přesně určena. Zřejmě se mění v závislosti na kmenu a citlivosti nemocného.

• Z případů vyvolaných syrovým nebo špatně pasterizovaným mlékem bylo odvozeno, že bezpečná dávka u citlivých osob je méně než 1,000 bakterií.

• L. monocytogenes může pronikat gastrointestinálním epithelem. Jakmile bakterie vstoupí do monocytů, makrofágů, nebo polymorfonukleárních leukocytů, hostitele nastává její růst a následná septikémie.

• Její intracelulární přítomnost v fagocytujících buňkách jí dovoluje přístup do mozku a transplacentální migraci do plodu u těhotných žen.

• Pathogenese L. monocytogenes spočívá v její schopnosti přežívat a množit se ve fagocytárních buňkách hostitele.

Bakteriální virulence

• Virulence – porovnatelný stupeň patogenity

• A. LD50 – míra virulence, počet mikroorganismů nezbytných k usmrcení 50% pokusných zvířat nebo buněk v kultuře.

• B. ID50 - míra virulence, počet mikroorganismů nezbytných k vyvolání infekce u 50% pokusných zvířat nebo buněk v kultuře.

• C. LD50 bakterie A u králíka je 1000 organismů, zatímco pro bakterii B 5000 organismů.

• Která bakterie je více virulentní?

PatogenezePatogenezeprotein gen poznámkaPrfA prfA regulační protein operonuPIPLC plcA fosfolipázaLLO hlyA hemolyzinActA actA aktinIntA inlA internalin

Metody detekce

• Standardní normovaná metoda: (ČSN ISO 10560 a ČSN ISO 11290-1)

• - selektivní pomnožení (25g) v polovičním Fraserově bujonu, 225m, 30 °C, 24 h

• - sekundární pomnožení ve Fraseru s plným obsahem inhibičních složek 37 °C, 48 h

• - identifikace na dvou pevných selektivních médiích, inkubace 37°C, 48 h

• -výběr 5 charakteristických kolonií a vyočkování na chromogenní medium typu ALOA a TSAYE (Trypticase soja agar, extract yeast) inkubace 37 °C,24 h

- další konfirmační testy : Gramovo barvení,CAMP test, API Listeria test,

Průkaz LMPrůkaz LM

Půda ALOA

Stanovení počtu LM

Christie-Atkins-Munch-Peterson (CAMP) test

• Provedení testu: kultury α-hemolytického Staphylococcus aureus a Rhodococcus equi se načárkují paralelně na misku s krevním agarem. Testované kultury pak se nanášejí v pravém úhlu ke kulturám S. aureus a R. Equi.

• Po inkubaci při 35° C po 24-48 h, se na miskách hledá hemolýza. Hemolytická reakce L. monocytogenes a L. seeligeri je zesílená v zonách ovlivněných nárůstem S. aureus.

• Ostatni druhy zůstávají nehemolytické. Reakce L. monocytogenes je častěji optimální za 24 h než po 48 h.

• Je doporučeno použít kontrolní kmeny Listeria spp. na dalším agaru s ovčí krví. Misky s krevním agarem (beraní erythrocyty) by měly být co nejčerstvější.

Provedení CAMP testu• CAMP test. Na krevní agar s propranými ovčími erytrocyty

samostatnou čarou naočkujte testovací kultury S. aureus a R. equi, a to navzájem rovnoběžně v opačných polovinách misky. Je zapotřebí inokulovat tenkou čarou a rovnoměrně pomocí kličky vedené kolmo k misce.

• Testované kmeny naočkujte podobně, každý samostatnou čarou a navzájem rovnoběžně, ve směru kolmém na očkovací čáry testovacích kultur tak, že se čar očkovaných testovacími kulturami nedotýkají, ale jsou od nich vzdálené asi 1-2 mm. Na jednu misku lze očkovat několik testovaných kmenů (nejčastěji 3 testované kmeny na jednu misku krevního agaru). Současně naočkujte kontrolní kultury L. monocytogenes, L. innocua a L. ivanovii. Takto naočkované misky krevního agaru inkubujte v termostatu s teplotou udržovanou na 37°C po dobu 18-24 hodin.

CAMP test

MALDI TOF - RESULTS

174 = 170

MALDI TOF - RESULTS

Trojúhelník onemocnění: kompatibilní interakce mezi patogenem a hostitelem končí nemocí při vhodných vnějších podmínkách. Nejsou-li

všechny podmínky splněny, nemoc nepropukne.

Oportunní patogen• Cílové populační skupiny pro listeriosu jsou: • Těhotné ženy/plod - perinatální a neonatální infekce; • Imunokompromisní pacienti po ošetření

kortikosteroidy, protirakovinými léky, pacienti po transplantacích orgánů,nemocní AIDS;

• Pacienti s rakovinou –zvláště s leukémií; • Méně často také - diabetici, astmatici, lidé s cirrhosou

a ulcerativní kolitidou; • Senioři; • Zdraví lidé - podle některých zpráv i normální, zdraví

lidé mohou být nakaženi. Při epidemii ve Švýcarsku, kdy vehikulem byl sýr ze syrového mléka onemocněli jinak zdraví lidé, jednalo se vysoké koncentrace L.monocytogenes.

onemocnění

• Listeriosa je označení pro skupinu zdravotních poruch a potíží vyvolaných L. monocytogenes.

• Povaha onemocnění:Listeriosa je klinicky definovaná v případě, že organismus je izolován z krve, cerebrospinálního moku nebo z jiných za normálních podmínek sterilních míst (např. placenta, fetus).

Infekční cyklus 1• Primární místo infekce je střevní epitel, kde bakterie

napadá nefagocytující buňky pomocí mechanismu „zipování“.

• Vstup je stimulován vazbou listeriového internalinu (Inl) do hostitelské buňky adhezními faktory jako E-cadherin nebo Met.

• Tato vazba aktivuje některé Rho-GTPasy, které následně váže a stabilizuje Wiskott Aldrich Syndrome Protein (WASp). WASp tak může vázat komplex Arp2/3 a slouží jako bod nukleace aktinu. Následná polymerace aktinu rozpíná buněčnou membránu kolem bakterie, která je pohlcena.

• Hlavním účinkem vazby internalinu je využití připojovacího mechanismu hostitele k internalizaci bakterie.

Infekční cyklus 2

• L. monocytogenes může také napadat fagocytující buňky (např. makrofágy) ale k invazi do nefagocytujících buněk stačí internaliny.

• Po internalizaci musí bakterie opět uniknout z vakuoly/fagosomu dříve než dojde k fúzi s lysosomem.

• Dva hlavní faktory virulence, které únik umožňují jsou listeriolysin O (LLO – kódovaný hly) a fosfolipasa-c B (plcB). Sekrece LLO a PlcB rozruší membránu vakuoly a dovolí bakterii proniknout do cytoplasmy, kde se může množit.

Průnik L. monocytogenes do hostitelské buňky

• Za adhezi L. monocytogenes k hostitelské buňce jsou zodpovědné povrchové proteiny Ami, bakteriální adhezin, který se váže na fibronektin sliznic a povrchový protein p104, internalin A a internalin B slouží k průniku do buňky indukcí fagocytózy, fosfolipázy, fosfatidylinositol-specifická fosfolipáza C a fosfatidylcholin-specifická fosfolipáza C, společně listeriolysin O, který tvoří póry v buněčné membráně vazbou na cholesterol v ní obsažený, naruší stěnu lysozomu a umožní buňce dostat se do cytoplasmy, kde se množí. Listeriolysin a fosfolipázy jsou zároveň cytolytickými toxiny, hemolyziny.

• Baktérie produkuje také Zn2+dependentní proteázu, která působí jako exotoxin, povrchový protein LMaA je zřejmě zodpovědný za indukci pozdní hypersenzitivity a povrchový komplex Ei, izolovaný z buněčné stěny, je strukturou i účinky pozoruhodně podobný endotoxinům gramnegativních bakterií - L. monocytogenes je jediná grampozitivní bakterie, která je tvoří.

Virulenceinternalin

Listeriolysin, lecitinasa

Aktinová vlákna

Faktory virulence jsou umístěny v lecithinasovém operonu a jejich transkripce ke regulována transkripčním aktivátorem PrfA.

Internalizace listerií savčí buňkou

Infekční cyklus 3

• Po průniku do cytoplasmy L. monocytogenes použije aktin hostitele podruhé.

• ActA proteiny spojené se starým buněčným pólem bakterie (jako bacillus, L. monocytogenes tvoří septum ve středu buňky, a tak má vždy jeden nový pól a jeden starý ) jsou schopné vazby komplexu Arp2/3 a tak indukují nukleaci aktinu ve specifické oblasti povrchu bakterie.

• Polymerace aktinu pohání bakterii cíleně k membráně hostitele. Takto vzniklý výčnělek může pak být internalizován sousední buňkou, za tvorby vakuoly s dvojitou membranou, ze které bakterie unikne použitím LLO a PlcB.

Listeria monocytogenes

• L. monocytogenes tvoří biofilmy na nejrůznějších typech povrchů.• Některé kmeny obsahují luxS gen, který je odpovědný za tvorbu

biofilmu.• luxS kóduje S-ribosylhomocysteinasu, která katalyzuje hydrolýzu S-

ribosylhomocysteinu na homocystein a 4,5-dihydroxy-2,3-pentadion (DPD), která je prekursorem autoinduktoru 2 (AI-2).

• AI-2 byl nalezen jako jeden z autoinduktorů regulujících bioluminiscenci u V.harveyi a dále byla AI-2 podobná aktivita dete- kována v supernatantu mnoha bakterií (G+ i G-).

• Orthology luxS byly identifikovány rovněž u mnoha bakterií(G+ i G-).• AI-2 je „universální jazyk“ pro mezidruhovou komunikaci

Schéma tvorby biofilmu

•

Provedení experimentu

• Studium tvorby biofilmu Listeria monocytogenes : kultura rostla ná BHI 37 oC , 24h OD600 nm – 1,0, 100x naředěny čerstvým BHI, 0,5 ml aplikováno na 24 jamkovou polystyrenovou destičku.

• Kultivace 1- 2 dny 37 oC staticky. Jamky 3x promyty 0,5 ml redest. vodou. Kvantitativní vyhodnocení: 0,1% krystal. violeť. Destička se 1h suší - 65 oC. Vyhodnocení: plate reader BioTec.

• Množství biofilmu – průměr adsobance (OD595) extrahované violeti ze dvou nezávislých pokusů, každý po 3 paralelách.

Listeria monocytogenes - biofilm

Lineární mapa genomické DNA obklopující luxS L.monocytogenes

Známé a předpověděné ORF a jejich orientace. ORF lmo1285 a lmo 1285 kódují hypotetické proteiny podobné B.subtilis YneS a YneT. Lmo1291protein podobný B.subtilis acyltransferase (Yrhl protein.)

Mikroskopické analýzy prokázaly, že biofilm pokrývá lépe a více plochy z PVC, než z nerezové oceli.

Na PVC vzniká biofilm již po 2 h kontaktu.

Interakce mezi bakteriálními buňkami a anorganickým nosičem jsou závislé na hydrofobitě nebo hydrofilitě sledovaného povrchu.

I když metod ke studiu je celá řada, použití mikrotitračních destiček je velmi výhodné a reprodukovatelně porovnatelné.

Kmen 39503 - vysoká tvorba biofilmu na nerezové plošce - A, na PVC - C.

Kmen 35584 - nízká tvorba biofilmu na nerezové plošce - B,

na PVC - D

Úsečka – 8,6 μm

Tvorba biofilmu u L.monocytogenes

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0,05

0,06

0,07

0,08

Lm 52 Lm 53 Lm 54 Lm 55 Lm 56 Lm 57 Lm 58 Lm 59 Lm 60 Lm 169 Lm 170 Lm 171

A620

25°C

37°C

0

1

2

3

4

5

Glas Gummi Nirosta Glas Gummi Nirosta

Ent. faecalis.

E. coli

St. aureus

L.innocua

Cleaning Cleaning+acidic desinfection

Adherence to abiotic surfaces

Glass rubber stainless steel Glass rubber stainless steel

log CFU

Výsledky studie MIKROMON1999-2003

0

2

4

6

8

10

12

Zelenina

mraž

ená

Lahů

dkov

ésa

láty

Cukr

ářsk

évý

robk

y

Mas

névý

robk

y

Zelenina

osta

tní

Mléčn

évý

robk

y

Rybí

výro

bky

proc

ento

poz

itivn

ích

Pulsní gelová elektroforéza -PFGE

• PFGE je elektroforetická metoda použitelná i k separaci dlouhých úseků DNA – při separaci se používá změny elektrického proudu během elektroforézy.

• K provedení je nutná speciální aparatura, která je schopná střídat elektrické pole mezi dvěma páry elektrod orientovaných pravoúhle, případně třemi páry elektrod sestavených do šestiúhelníku.

• Separace probíhá převážně na základě rozdílné velikosti molekul. Kratší molekuly putují gelem výrazně rychleji než molekuly velké.

Moderní metody identifikace Pulzní gelová elektroforéza (PFGE)

Jaký typ vyvolal epidemii?

• Pulsotypy ze všech izolátů dodaných do Národní referenční laboratoře v Brně byly jednoho typu.

Comparison of serovar 4b distribution among large and small cheese making facilities

Statistically significant, p<0.05, Kolmogoroff Smirnoff, T-test

0

5

10

15

20

25

30

small-scale large-scale

%

Nálezy L. monocytogenes v potravinách v členských zemích EU (EFSA)

Potravina Pozitivní vzorky2003

Pozitivní vzorky2004

Výrobky z hovězího masa 0-48 % 0-11 %Výrobky z vepřového masa 0-28 % 0-6 %Výrobky z drůbežího masa 0-40 % 0-32 %Výrobky z dalších druhů masa 0-29 % 0-22 %Sýry 0-13 % 0-5 %Syrové mléko 0-100 % 0.03 %Další mléčné výrobky 0-0.6 % -Rybí výrobky 0-29.6 % 0-13.2 %Ovoce a zelenina 0-33 % 0-1.3 %

Rizikové skupiny sýrů

Sýry s plísní uvnitř hmoty (Niva, Gorgonzola, Roquefort): pH 4.9, NaCl 4 %

Sýry s plísní na povrchu – typ Camembert: pH 4.6-4.8, NaCl 3.5%

Sýry zrající pod mazem (Romadur, Ol. tvarůžky): pH 5.2-5.4, NaCl do 5%

DěkujiDěkuji za pozornostza pozornost