Page 1 of12

(page number not for citation purposes)

Lipidi u zdravlju i bolesti ^Me

Otvoreni pristup

Istraivanje

Svojstva za sniavanje holesterola Ganoderma lucidum in vitro, ex vivo i kod hraka i minijaturnih svinja

ABerger*1,2, D Rein1,3, E Kratky1, I Monnard1, H Hajjaj1'4, I Meirim1, C

Piguet-Welsch1, J Hauser1,5, K Mace1 and P Niederberger1

Adresa: 1Nestl Research Center, Lausanne 26, 1000, Switzerland, 2Paradigm Genetics, Research Triangle Park, NC 27709-4528, USA, 3BASF Plant Science Holding GmbH,

Agricultural Center, BPH-Li 555, Limburgerhof, 67114, Germany, 4Univerity des Sciences et de Technologie de Lille, B.P. 179, Villeneuve d'Ascq Cedex, 59653, France and 5University of Lausanne, Institut de Biologie Cellulaire et de Morphologie, 1015, Lausanne, Switzerland

Email: A Berger* - aberger@paragen.com; D Rein - dietrich.rein@basf-ag.de; E Kratky - elenanm@earthlink.com; I Monnard -

irina.monnard@rdls.nestle.com; H Hajjaj - H_hajjaj@yahoo.com; I Meirim - Isabelle.Meirim@rdls.nestle.com; C Piguet-Welsch -

Cristal.Piguet-Welsch@rdls.nestle.com; J Hauser - jonas.hauser@ibcm.unil.ch; K Mace - catherine.mace@rdls.nestle.com; P Niederberger -

peter.niederberger@rdls.nestle.com * Corresponding author

Objavljeno: 18. februara 2004.godine Zaprimljeno: 22. januara 2004.godine . Primljeno: 18. februara 2004.godine

Lipidi u zdravlju i bolesti 2004,3 :2

lanak je dostupan na stranici: http://www.lipidworld.eom/content/3/l/2

2004 Berger et al; po licenci BioMed Central Ltd. lanak otvorenog tipa: Verbatim kopiranje i redistribucija lanka je dozvoljena u svim medijima za bilo koju svrhu, uz uslov da je ovo obavjetenje

naglaeno zajedno sa originalnom URL adresom lanka.

Abstrakt

Uvod: Postoji obnovljeni interes za medicinska svojstva gljiva. Prouavali smo svojstva za smanjenje holesterola

Ganoderma lucidum (Gl), poznate medicinske vrste.

Rezultati: Organske frakcije koje sadre oksidirane dervirate lanosterola su inhibirale sintezu holesterola u hepatocitima

T9A4. Kod hraka, 5% Gl nije utjecao na LDL ; ali je smanjio ukupni nivo holesterola (TC) 9.8%, i HDL 11.2%. Gl (2.5 i 5%) su

imali uinka na nekoliko fekalno neutralnih sterola i unih kiselina. Obje doze Gla su smanjile hepatiku mokrosomalnu

ex-vivo HMG-CoA reduktaznu aktivnost. Kod minijaturnih svinja, 2.5 Gl je smanjilo TC, LDL- i HDL holesterol 20,27, odnosno

18% ((P < 0.05) ; poveali fekalni holesterol i hoprostanol i smanjili holate.

Zakljuci: OSveukupno, Gl ima potencijal da smanji LDL holesterol in vivo kroz razne mehanizme. Slijedei koraci su:

potpuna karakterizacija bioaktivnih komponenti u lipidskim rastvorljivim/nerastvorljivim frakcijama; procjena bioaktivnosti

izoliranih frakcija; i ispitivanje svojstava sniavanja ljudskog holesterola. Zamiljene su inovativne nove vrste hrane i lijekova

koje sadre Gl i sniavanju holesterol.

Pozadina

U narodnoj kineskoj medicini Kampo, medicinska svojstva

gljiva su poznata od 1200 p.n.e. [1]. U skorijim godima, javio

se interes za svojstva gljiva koja smanjuju holesterol, to je

ukljuivalo i gljive Ganoderma ludicum (Reishi-, Longevity-,

ili Fantom gljiva, Biladi Top, Young-zhi, Kralj trava, Ling Zhi

na Kineskom, Saru-no-koshikake i Mannendake na

Japanskom jeziku) [2,3], Pleurotus ostreatus (bukovaa) [4-8],

Volvariella volvacea [9], Agaricus bis-porus (ampinjon) [10],

Agaricus campestris [11], Auricu-laria auricula (Judino uho),

Tremella fuciformis [12,13], Grifola frondosa (Maitake gljiva)

[14,15], Lentinus erodes (itake) i izolirane frakcije [14,16], i

Polyporus confluens (Ningyotake) [17].

http://www.biomedcentral.com/http://www.biomedcentral.com/info/about/charter/mailto:aberger@paragen.commailto:dietrich.rein@basf-ag.demailto:elenanm@earthlink.commailto:irina.monnard@rdls.nestle.commailto:H_hajjaj@yahoo.commailto:Isabelle.Meirim@rdls.nestle.commailto:Cristal.Piguet-Welsch@rdls.nestle.commailto:jonas.hauser@ibcm.unil.chmailto:catherine.mace@rdls.nestle.commailto:peter.niederberger@rdls.nestle.comhttp://www.lipidworld.com/content/3/1/2

http://www.lipidworld.com/content/3/1/2

Page 2 of 12

(page number not for citation purposes)

Lipids in Health and Disease 2004, 3

U ranijim djelima Kaneda i Tokuda su prouavali svojstva

smanjenja holesterola ekstrakta etera, vode i etanola iz

klobuka i struka Lentinus edodes, Auricularia polytrichia,

Flammulina velutipes, i Agaricus bis-porus. Veina ovih studija

se izvodila na pacovima. Svojstva za smanjenje holesterola

gljive Cordyceps sinensis su prouavana na ljudima [19].

Mi emo se fokusirati na Gl , bitnu medicinsku gljivu koja pripada porodici Ganodermataceae i koja je prouavana

zbog mnogih zanimljivih zdravih svojstava, koja ukljuuju

svojstva za borbu protiv tumora, protiv upala i protiv

agregacije trombocita [20-27]

http://kyotan.com/lectures/lectures. Zapravo, kompletne knjige, simpoziji i organizacije (npr. Gonoderma Institut za

meunarodna istraivanja, New York) i mnoge terapije su

posveene Gl gljivi. Jo jedan primjer njene vanosti dolazi iz

vremena stare Kine gdje je oboava boginja Reishi (Reishi

senshi) koja je podarivala zdravlje, ivot i vjenu mladost.

Kao to je opisano, Gl je povremeno prouavana zbog njenih svojstava za borbu protiv holesterola i hipotenzinih

svojstava izraen kod pacova [2] i zeeva [28],, ali nije

istraena u vie fiziolokim modelima [29] holesterola kakve

su minijaturne svinje. Pretpostavlja se da Gl moe sniziti

holesterol kod ljudi, ali istraivanja nisu nadgledana niti

prikladno opisana [24] http://www.gano therapyusa.com/DXN/docs/whatis.htm.

Minijaturne svinje su svejedi, kao i ljudi i njihovi

metabolizmi lipida i stroida, digestivna i kardiovaskularna

fiziologija su jako sline onima kod ljudi [30-32]; dok

nasuprot ljudi, glodari mogu nositi veinu holesterola u

HDL frakcijama sve dok nisu nahranjeni hranom visokozasienom mastima i holesterolom koji mogu ugasiti

LDL receptore [29].

Tabela 1: Priblina analiza Nafag 924 test ishrana za hrke1

Komponente Gl koje mogu sniziti holesterol nisu poznate, ali

mogu ukljuiti glukane ganoderanog tipa [22,33,34],

hetero--gikane, komplekse glukan-proteina (ksiloglukani,

uronske kiselinski--glukani), druga vlakna, lektine [25], terpenoid triterpene [35-38], ergostanske sterole [39], i visoko

oksidirane ganoderonske kiselinske tipove, lanostanoidne

triterpene [38-42]. Komponente vlakana Gl gljive mogu imati

uinka na absorpciju holesterola i recikliranje une kiseline,

dok lipofilini komponenti mogu utjecati na sintezu

holesterola.

Gl moe utjecati na sintetu holesterola na izvreni

3-hidroksi-3-metilglutaril koenzim A reduktaza (HMG-CoA

reduktaza) korak limitiranja mjere; ili na potonju lanosterol

14-metil demetilazu: cikokrom P-450 demitalzni

(P-45014DM) korak [43,44], katalizirajui korak limitiranja

mjere u konverziji lanosterol-holesterola. U vrstama koje

nisu Gl gljive, inhibicija skvalenske sintetaze zaragoznskim

kiselinskim metabolitima gljiva je zabiljeena kod primata

[45]. Ovdje smo testirali uinke Gl na metabolizam

holesteroma kod elija ljudske jetre T9A4, na modelu manjih

ivotinja, tj. hrka, i na modelu veih ivotinja, minijaturne

svinje koja imaju razliitu distribuciju lipoproteinskog

holesterola od hrka. ivotinjski modeli su hranjeni

ishranom koja je sadravala holesterol to je opisano u

Tabelama 1 i 2.

Rezultati

Aktivni sastojci u Gl i in vitro aktivnostima

Organske i vodene faze Gl nisu sadravale HPLC-primjetne

razine lovastatina. Organski ekstrakovana faza je snano

1Nafag 924 potpuna ishrana za hrke je iz Eberle Nafag AG, Gossau, vicarska. Detaljni sastojci ishrane nisu prikazani. Metabolizirana energija je procijenjena na 3111 kcal/kg ishrane. Ishrana lovastatinom je bila identina kontrolnoj ishrani, ali je sadravala 2 mg/100 g ishrani lovastatina. Gl, G. lucidum.

Komponente Kontrola Teina %

Karbihodrati (razliitosti) 31.8 31.0 30.

3

krob 23.6 23.0 22.

5

Grubi protein 15.6 15.2 14.

8

Voda 8.0 7.8 7.6

Grube masti 4.4 4.3 4.2

Pepeo 4.7 4.6 4.5

Gruba vlakna 3.5 3.4 3.3

Esencijalne aminokiseline 3.4 3.3 3.2

Ekstrakt Gl 0.0 2.5 5.0

Vitaminski mix (ukljuuje kolin) 2.4 2.3 2.3

Minerali (Ca, P, Mg, K, Na) 2.3 2.2 2.2

Elementi u tragovima 0.3 0.3 0.3

http://www.lipidworld.com/content/3/1/2http://kyotan.com/lectures/lectureshttp://www.ganotherapyusa.com/DXN/docs/whatis.htmhttp://www.ganotherapyusa.com/DXN/docs/whatis.htm

http://www.lipidworld.com/content/3/1/2

Page 3 of 12

(page number not for citation purposes)

Lipids in Health and Disease 2004, 3

Tabela 2: Sastojci za ishranu minijaturnih svinja prilikom testiranja1

KOmponente (g/100 g hrane, kao osnova za hranjenje) Teina % Kontrola ili 2.5% Gl

ito (do 100%) 26.6

Penica 29.8

Svinska masnoa2 9.0

Obrok od soje (44%; sadri proteine soje) 8.5

Dodatni proizvodi za peenje 8.5

Neslani, topljeni puter3 4.5

Mjeavina aminokiselina4 3.4

Mjeavina minerala5 2.8

Celuloza6 (kontrola) ili Gl7 2.5

Obrok od kanole (uljana repica) 2.5

Obrok od peradi 1.7

Holesterol8 0.1

Mjeavina vitamina (ukljuuje kolin)9 0.1

Mjeavina elemenata u tragovima10 0.02

ispoljava biosintezu holesterola (ID50 = 1.3 g/mL, relativnu

za 0.4 lovastatina), dok je vodena faza bila neaktivna (ID50 >

330). Razni visoko oksidirani lanostanoidni tritepeni, i

32-metil- i 26-okso steroli su pronaeni u organskim fazama,

i vjerovano su doprinijeli inhibiciji sinteze holesterola. 20%

EtOAc/heksanske frakcije je sadravalo ganoderal A; i 50%

EtOAc/heksan je sadravalo ganoderole-A i B, i

ganoderonsku kiselinu Y.

Teina tijela i organa i unos hrane kod hraka

Teina tijela je varirala od 68.7-70.8 do 83.2-86.4 g za

eksperimentalne grupe D1, odnosno D18, bez znaajnih

razlika u odnosu na kontrolne grupe, na D1, D18 ili D18

minus D1. Relativna teina jetre i slijepog crijeva (g

organ/100 g teine tijela) su bile 2.77-2.84, odnosno 0.52-0.56

za razliite grupe, bez znaajnih razlika u odnosu na

kontrole grupe. Dnevni unos hrane je bio 7.1-7.8 g

hrane/prosjek kroz D1-16; nije bilo znaajnih razlika u

odnosu na kontrolne grupe.

Holesterol i triaciglicerol kod hraka

Poetni nivoi D1 TC nisu bili razliiti meu grupama, dok su

bili razliiti u D2 TAG (Tabela 3). Gl na 2.5 i 5.0% je smanjio

D18 TAG (vjerovatno zbog D1TAG razliitih poetnih

vrijednosti). Gl na 2.5% nije smanjio D18 TC, LDL ili HDL. Sa

5.0% Gl, postojao je statistiki trend (P < 0.10) da se smanji TC

i HDL; LDL nije bio promjenjen. Slino veim dozama Gla,

lovastatin je smanjio D18 TC i HDL, ali nije LDL. LDL/HDL

odnos nije bio statistiki razliit za tretmane ishrane u

odnosu na kontrolnu grupu.

Fekalne une kiseline i neutralni sretoli kod hraka

Gl (2.5%) je poveao fekalne une kiseline i

ksenodeoksiholate (Tabela 4). Obje doze Gla su poveale

koprostalnol 3-jedan, dok je, 5% Gla smanjilo kolestanol.

Lovastatin nije imao znaajan uinak na une kiseline ili

ispitane neutralne sterole.

Ex vivo hepatina HMG-CoA reductazna aktivnost kod

hraka

Lovastatin nije imao uinka na de-fosforilatnu aktivnost, i

fosforilatna aktivnost nije ispitana (Tabela 5). U nedostatku

NaF (inhibitora fosfataze) i u prisustvu 2.5 i 5% Gl ,

3-hidroksi-metilgluratil-CoA reduktazna aktivnost u

hepatinim mikrosomima hraka (pmol/min/g/ jetra) je bila

smanjena 2.1, odnosno 1.5 puta, u odnosu na kontrolu. U

prisustvu NaF, 2.5% i 5% Gl je smanjio HMG-CoA reduktaze

3.5, odnosno 1.9 puta, u odnosu na kontrolu.

'Hranu je posebno pripremila Kliba (Kaiseraugst, vicarska) kao ishranu bogatu mastima i holesterolom 2604. Ukoliko nije posebno naglaeno, zalihe su dole iz kompanije Kliba.

Priblina analiza ishrane minijaturnih svinja (bez %): karbohidrati kao slobodni ekstrakti azota 46.6, grubi protein 15.9, voda 11.1, grube masti 16.8, pepeo (sa vitaminima) 5.1, gruba

vlakna 4.6. Ukupna i probavljiva energija ishrane je procijenjena na 3985 i 3776 kcal/kg.2Centravo Schweinefett B 90, Centravo AG, Cirih, vicarska. Sastojala se od 98% masnoe, 5%

slobodnih masnih kiselina, 9% polinezasienih masnih kiselina, zatienih antioksidansima. 3Migros Genossenschafts-Bund SA, Cirih, vicarska. 82% masnoa, 0.5% protein, 0.5%

karbohidrate. 4Po 100 g ishrane, sastojalo se od 1.06% arginina, 0.75% lisina, 0.26% metionina, 0.56% metionina + cistin, 0.20% triptofana, i 0.57% treonine [78]. 5Po 100 g ishrane,

sastojalo se od 0.80% kalcija, 0.70% fosfora, 0.19% natrija, 0.63% kalija, 0.20% magnezija, and 0.26% hlorida. 6Vitacel LC 200 Cellulose, J. Rettenmaier & Sohne (JRS), GMBH + Co,

Rosenberg, Holzmuhle 1, Njemaka. 0.3% sulfatnog pepela, pH 5.0-7.5, 300 M duine vlakana. 7Champitec, Payerne, vicarska. Pripremljeno kao to je opisano u tekstu. Svinje koje

nisu dobile ekstrakt Gl, dobile su kontrolnu ishranu i 80 mg lovastatin/svinja/dan u pola jabuke. 8Fluka 26740, Fluka Holding AG, Buchs, vicarska. 97% ista. 9Roche Vitamins Ltd, Basel,

vicarska. U mg/100 g ishrana se sastojala od 0.4 vitamina A (800 IU), 2.0 vitamina D3 (80 IU), 10.5 vitamina E, 0.3 vitamina K3, 1.2 vitamina Bh 0.8 vitamina B2, 3.0 nikotinske kiseline,

2.0 pantotenonske kiseline, 0.' Folne kiseline, 0.7 vitamina B6, 0.0034 vitamina B'2, 0.02 biotina, 65.' koline, and 2.0 vitamian C. '0U mg/'00 g ishrana se sastojala od 1.1 bakra (mg/kg), 7.6

cinka, 11.0 eljeza, 0.05 joda, 5.0 mangana, and 0.03 seleniuma. Gl, G. lucidum.

http://www.lipidworld.com/content/3/1/2

http://www.lipidworld.com/content/3/1/2

Lipids in Health and Disease 2004, 3

Tabela 3: Holesterol u plazmi i triacigliceriol kod hraka tretiranih sa G. lucidum i lovastatinom (mmol/L)

Grupa TC TC TAG TAG VLDL LDL HDL LDL/HDL DI DI8 DI DI8 DI8 DI8 DI8 DI8

Kontrola 3.57 3.48 I.I0 I.08 0.22 0.5I 2.75 0.I9 Lovastatin 3.39 3.I6a I.07 0.98 0.I8a* 0.48 2.50a 0.I9 Gl (2.5%) 3.46 3.40 0.64a 0.90a 0.I8 0.53 2.69 0.20 Gl (5%) 3.34 3.I4a* 0 . 8 9 a * 0 . 9 2 a 0.20 0.49 2.44a* 0.20

TC, ukupni holesterol; TAG, triacilglicerol; VLDL, LDL, HDL, veoma nisko-, nisko-, i visoka gustina lipoproteina; D, dan; LOVA, 20 mg/kg ishrana. Vrijednosti predstavljaju 6 ivotina. aZnaajna

razlika od kontrole (P < 0.05 or *P < 0.10), students, nespareni, jednostruko vezani,t-test, jednake promjene.

Tabela 4: Fekalne une kiseline in neutralni steroli kod hraka tretiranih sa G. lucidum i lovastatin (nmol/g suhe fekalije/d)

une kiseline Neutralni steroli

Grupa C LC DC CDC UDC Ukupni BA COP-ol COP-3-one CHOL erol CHOL anol Ukupni NS

Kontrola I5.0 I4.3 I0.7 5.I I.7 46.7 II.5 ND 7.2 I8.4 37.I

Lovastatin I5.0 I2.8 II.6 6.2 I.6 47.I I2.0 ND 6.7 I8.9 37.6

Gl (2.5%) I6.9 I6.2 I4.3 8.5a I.9 57.8a II.7 4.2a 7.7 I6.9 40.6

Gl (5%) I2.2 I3.9 I2.0 6.4 I.4 45.8 I2.0 7.8a 7.0 I4.Ia 4I.0

Fekalije su se kvantitativno skupljanje zavretkom eksperimenta (D18). C, kolat;LC, likoholat; DC, deoksiholat; CDC, kenodeoksiholat, UDC, Ursodeoksiholat; COP, koprostan; CHOL,

koloest; BA, une kiseline; NS, neutralni steroli. ND, nije zapaeno. Vrijednosti predstavljaju 6 determinatoria. aZnaajna razlika od kontrole (P < 0.05), student nespareni, dvostruk ovezani

t-test, jednake promjene. Statistiki trendovi (P < 0.10) su postojali u setu podataka.

Tabela 5: Aktivnost HMG-CoA reductaze na hepatike mikrosome hraka (pmol [14C]mevalonolakton/min/mg microsomalni protein)

Grupa Aktivnost-NaF Ukupna aktivnost+NaF

Kontrola I2.36 9.30

Lovastatin I3.34 ND

Gl (2.5%) 5.86a 2.66a

Gl (5%) 8.08a 4.86a

Konsultirati tekst za metodoloke detalje. [l4C]mevalonate je promijenjen u [l4C]mevalonolakton uz 10 M HCl prije koraka TLC. Gore navedene vrijednosti su ispravljenje za oporavak (15-63%)

uz [3H]mevalonat. G. lucidum, a ne lovastatin je inhibirao ex vivo sintezu bez obzira da je li je oporavak bio zagrantovan, rezultati su izraeni u gramima po teini jetre; [l4C]mevalonolacton

se prvo izdvojio u organski rastvor i onda primjenio na TLC ploe [79] radije nego da se koriste vodeni ekstrakti direktno na TLC determinacije.a Znaajno odudara od kontrole, student

nespareni, dvostruko vezani test, jednake promjene (P < 0.05). ND, nije utvreno.

Odnos frakcionalne sinteze holesterola kod hraka

Kod hraka, vrijednosti FSR u odnosu na 24 sata (atom % poveanje D17-18) su bili 1.68 0.20, 1.91 0.16,

1.75 0.36, i 2.29 0.05 (znaenje n = 6, 1 SEM) za kontrolu, lovastatin, 2.5%, odnosno 5% Gl. Vrijednosti

se nisu statistiki razlikovale od kontrole.

Tjelesna teina minijaturnih svinja

Tjelesna teina minijaturnih svinja se poveala ekvivalentno sa Gl i lovastinom 19.0-26.9 kg u trajanju od

D1-28. Sline teine u odnosu na godine su zamijeene kod eksperimentalno hranjenih Gttingen

minijaturnih svinja[46].

Holesterol i tiacilglicerol kod minijaturnih svinja

Eskeprimentalna ishrana je poveala TC 27-30% od D1 do D14 (Tabela 6). U Gl hranjenoj grupi, TC je

znaajno opao na 12.5% od D14 do D21, ali ne dalje od D21 do D29; opadanje TC iz D14-29 je bilo 20%(P <

0.01). Lovastatin nije znaajno smanjio TC u D14-21 (P > 0.13),D 21-29 niti D14-29; ali se TC smanjio >10%

kod dvije svinje od D14-21.

http://www.lipidworld.com/content/3/1/2

http://www.lipidworld.eom/eontent/3/1/2

Page 5 of 12

(page number not for citation purposes)

Lipids in Health and Disease 2004, 3

Tabela 7: Fekalne une kiseline i neutralni steroli kod minijaturnih svinja tretiranih sa G. lucidum ilovastatinom (nmol/g dry feces)

une kiseline Neutralni steroli

Nije bilo znaajne razlike u TAG i VLDL sa Gl ili

lovastatinom (Tabela 6). Meutim, VLDL je manji

lipoproteinski dio. Lovastatin nije ima znaajnog uinka na

LDL ili HDL; Gl je smanjio LDL 26% i HDL 16% (P < 0.01;

D14 vs 29). Gl nije statistii utjecala na LDL/HDL budui da

su se oba pojedinana parametra smanjila od D14-29.

Fekalne une kiseline i neutralni steroli kod minijaturnih

svinja

Ishtrana bogata visokm holesterolom je smanjila

ksenodeoksiolate; poveala koprostanol, koprostan 3-jedan, i

holesterol od D1-14 (P < 0.05 ili < 0.10; Tabela 7). Gl je

poveao kolestanol (D14 vs 29; P < 0.10).

Diskusija

Aktivni sastojci u Gl i in vitro aktivnost

Kao to je opisano, lovastatin nije detektovan u naim

preparatima Gl gljive. Suprotno tome, statinske mjeavinke

su naene u bukovaama [47] i Chrysosporium pannorum [48].

Meutim, otkrili smo oksidirani molekule lanosterola kao

to su 32-metil- i 62-okso steroli, ganoderoli-A i B, ganoderonska kiselina , i ganoderali A i B u organskom

sloju. Organski sloj je snano inhibirao biosintetzu

holesterolu iz acetata. Slini ili identini okisidirani

lanosteroidi su prethodno zapaeni u Gl [38-42], i

ustanovljeno je da su inhibirali konverziju

24,25-dihidrolano-terola na holesterola na lanosterolu 14 -dimetilaz koraka [49-51], i takoer da indirektno inhibiraju

HMG-CoA aktivnost reduktaze [51]. injenica da je vodena

faza Gl bila neuinkovita za inhibiranje sinteze holesteola

(ID50 > 330) sugerie da su hidrofilne molekule kao to su

glukani i vlakna Gl nisu utjecali na konverziju acetata u

holesterol. Meutim, takve molekule mogu utjecati na upijanje holesterola i recikliranje ucane kiseline.

Ex vivo hepatina HMG-CoA reduktaza i postotak sinteze

holesterola kod hraka

Posmatrana inhibicija ex-vivo HMG-CoA aktivnosti

reduktaze kod hraka tretiranih sa Gl gljivama kod hraka je

posmatrana i kod pacova sa Gl tretmanom[51], i sa istim

lanosterolnim analogima [44,52]. Na manjak uinka sa

lovostatinom (4.3 mol/kg tjelesne teine) kontrastira

rezultatima sa vezanim statinom, simvastatinom, gdje su

10,30, i 60 mol/kg tjelesne teine /dan poveali ex-vivo

hepatinu HMG-CoA aktivnost reduktaze 2,7, odnosno 50

puta [53]. Lovastatin moe imati drugaije uinke na

HMG-CoA reduktazu i druge enzime od simvastatina, ali to

nije ispitano u datoj studiji.

Poznato je da analogi lanosterola kao oni pronaeni u Gl

inhibiraju prevod HMG-CoA reduktaze mRNK, i takoer

mogu ubrzati degradaciju proteina [44,52]. Gl takoer moe

utjecati na biosintetzu holesterola u kasnijim biosintetikim

koracima kao to je konverzija lanosterola [51], to e indirektno inhibirati HMG-CoA aktivnost reduktaze, kao to

je uvieno za statine kod minijaturnih svinja [53].

Zabiljeeno je da je represija lanosterol 14 -dimetilaznog

koraka moe rezultirati u akumulaciji

3-hidroksi-lanost-8-en-32-al, poznatog prevoditeljskog

regulatora nanie HMG-CoA reduktaze [54].

Kad bi Gl imao direktan fiziki utjecaj na aktivnost

HMG-CoA reduktaze, to implicira da bi ak i nakon posta od

16 sati Gl komponente kod hraka jo uvijek bile vezane za

enzime tokom procedure analize [55]. Nakon posta od 16

sati, lovastatin se moe ukloniti iz enzima to e odgovarati manjku primjeen ujecaja lovastina na ex-vivo aktivnost

HMG-CoA reduktaze. Zbog uklanjana ovog lijeka,

primjeeno je da drugi statini poveavaju ex-vivo aktivnost

HMG-CoA reduktaze [56]. Hepatina ex-vivo aktivnost

HMG-CoA reduktaze i kompletnog tjelesnog holesterola

FSR su potpuno razliiti tipovi mjera. Nije jasno zato Gl i lovastatin ne utjeu na FSR holesterol kod hraka. U

principu, stanje nisko zasienog visokog holesterola koje se

postiglo posebnom ishranom je trebalo dovesti do visokih

enogenih procenata sinteze holesterola, to bi moglo biti

inhibirano Gl gljivama i lovastatinom. Mogue je da su se Gl

i lovastatin raspali u mjeavini prehrane. Da bi se testirala ova hipoteza, izdvojili smo Gl i lovastatin iz pohranjene

ishrane nakon zavretka eksperimenta i nismo nali razlike u

analiziranim bioaktivnim sastojcima kada smo ih poredili sa

originalnim poetnim materijama (prije dodatka u ishranu;

podaci nisu pokazani).

Holesterol i triacilglicerol kod hraka i minijaturnih svinja

Hrci su hranjeni ishranom baziranom na niskom

holesterolu bez dodatnih egzogenih holesterola ili zasienih

masti. Pod ovim uvjerima, nije bilo dovoljno holesterola da

se redistribuira holesterol iz HDL u LDL dio [29]. Zbog

ovoga je hrcima 5% Gl i lovastatina smanjeno na D18 TC i

HDL, ali nije smanjne LDL [57,58].

Koritenjem iste vrste hrane, oktriveno je da lovastatin

smanjuje HDL kod hraka; samo kada je dodana zasiena

mast u hranu, i LDL i HDL su smanjeni [57]. Jo jedan od

faktora koji su doprinijeli manjku jaih uinaka na hrke je

totalnog manjka uinka na minijaturne svinje moe biti taj da

Grupa TC TC TC TC TAG TAG TAG TAG VLDL VLDL LDL LDL HDL HDL LDL/HDL LDL/HDL

DI DI4 D2I D29 DI DI4 D2I D29 DI4 D29 DI4 D29 DI4 D29 DI4 D29

Gl (2.5%) 2.47a 3.2Ibc 2.8I 2.58 0.53 0.57 0.80 0.69 0.07 0.09 I.45c I.08 I.69c I.42 0.88 0.79

Lovastatin 2.36a 3.00 2.44 2.8I 0.50 0.60 0.59 0.7I 0.I0 0.09 I.40 I.29 I.50 I.43 0.95 0.9I

Tabela 6: Holesterol plazme i triacilglicerol kod minijaturnih svinja tretiranih G. lucidum ilovastatinom (mmol/L)

Lovastatin se davao u koliinama od 80 mg/da. Izmeu D1-14, sve svinje su hranjene ishranom bogatom visokim holesterolom i mastima; od D15-29, svinje su dobile ili ekstrakt G.

lucidum (Gl) ili lovostatin. Isti statistiki rezultati su dobiveni za svih 10 svinja u poreenju izmeu D1-14. Svinje su se nasumice odrabrale da prime ili Gl ili lovastatin prije poetka

studije. Student's, spareni, jednostruko vezani, i t-test, su se koristili za statistika poreenja. Statistik znaajne promjene (P < 0.05, jednostruko vezanog testa) parametara holesterola

su prikazani: aDI vs. I4; bD 14 vs. 2I; cDI4 vs. 29. Skraenice: pogledati Tabelu 3. Postojao je znaajan trend za 2.5% Gl da smanji odnos LDL/HDL u DI4-29 (P < 0.II, jednostruko vezano

testiranje).

Sve svinje (DI) I.98 0.86 0.66a 2.4Ia 0.I0a I.73a* 0.96

Sve svinje (DI4) I.98 I.33 0.I6 3.75 0.I7 2.96 0.9I

Gl (DI4) I.98 I.6I 0.I4 3.6I 0.I8 3.37 0.87b*

Gl (D29) I.98 0.8I 0.I6 4.44 0.I5 3.I5 I.22

Lovastatin (DI4) I.98 0.99 0.I9 3.92 0.I5 2.44 0.96

Lovastatin (D29) I.98 I.23 0.I8 3.28 0.I6 2.34 I.I4

Grupa NCT C CDC COP-ol COP-3-one CHOL eroi CHOL anol

Fekalije su skupljene Dl, 14 i 29. Kvantitativno skupljanje fekalija nije bilo mogue, sto su rezultati izraeni po gramu fekalija. Skraenice: pogledati Tabelu 4, osim NCT, 23- nor

kolanat 5,7,12 triol. Spareni, dvostruko vezani student t-test, jednake promjene su procijenile uinke ishrane sa visokim holesterolom i mastima, izmeu D1-14 (10 minijaturnih

svinja); uinci Gl ili lovastatina izmeu D15-29 (5 minijaturnih svidnja/grupa) su sljeei: aDl vs 14, za sve minijaturne svinje zajedno (P < 0.00l).bDl4 vs 29 (P < 0.05). *0.05 < P < 0.1,

za ukazivanje statistikih trendova.

http://www.lipidworld.eom/eontent/3/1/2

http://www.lipidworld.eom/eontent/3/1/2

Page 6 of 12

(page number not for citation purposes)

Lipids in Health and Disease 2004, 3

je doza lovastatina bila nedovoljna. Hrcima je data doza od

2 mg lovastatina/100 g prehrane to je priblino 4.3mol

lovastatina/ kg tjelesne teine. Himber et al. [57] su tretirali

hrke sa 25 mol lovastatina/kg tjelesne teine, to je

smanjilo HDL; ili 50 mol to je smanjilo LDL i HDL[57].

Morand et al.[53] su otkrili da 20-200mol simvastatina/kg

tjelesne teine je bio dovoljan da smanji LDL. Ma et al. [59] su

smanjili lipoproteine kod hraka sa 100 mg lovastatina/ 100 g

prehrane/dan, to je takoer moda bilo pogreno. Doza od

24-42 mg je dovoljna da smanji lipoproteine kod Hyde Park

minijaturnih svinja [60]. Bez obzira na to, vrsta svinja koje

smo mi koristili su moda manje agresivno odgovorile na

lovastatin (M. Huff, Lina komunikacija, decembar 2000.

godine). Kod Gottingen minijaturnih svinja, doza od 80 mg

simvastatina je smanjila LDL, dok je 240 mg smanjilo LDL i

HDL [53]; simvastatin je vie uinkovit kod svinja neko

lovastatin u slinim reimina ishrane [61,62].

Redukcija TAG sa Gl gljivama je mogua zbog niih D1 TAG

vrijednosti kod Gl grupa u odnosu na kontrolnu. TAG redukcije kod hraka se obino deavaju pod uvjetima veeg

unosa zasienih masti [6,63]. U jedinoj drugoj revidiranoj

studiji koja ispituje smanjenje osobina holesterola Glom kod

manjih ivotinja, prah 5 dijetskih teinskih% osuenih Reishi

gljiva je smanjio TC kod SHR pacova; uinci na VLDL, LDL i

HDL nisu prouavani [2]. Kada su se koristili uvjeti hranjenjem holesterolom visokih masnoa kod minijaturnih

svinja, Gl inducirana inhibicija sinteze holesterola bi trebala

rezultirati u manjem prisustvu hepatilnog holesterola za

sintezu lipoproteina. Zauzvrat, to ima potencijalni uinak

redukcije plazma VLDL sekreta holesterola, redukciju LDL

direktnog luenja; i mogue smanjenje VLDL-LDL konverzije [64,65]. U datoj studiji, nismo posmatrali razlike u

nivoima TAG ili VLDL kod svinja hranjenih ili Gl gljivama ili

lovastatinm, meutim ovaj uinak je moda predvien jer je

VLDL grupa predstavljala samo mali dio lipoproteina i/ili se

desila efikasna VLDL-LDL konverzija. Redukcije LDL i HDL

uz pomo Gl su postojane uz vie doze statina [53].

Fekalne eluane kiseline i neutralni steroli kod hraka i

minijaturnih svinja

Kod hraka, Gl je povisio fekalne eluane kiseline i

kenodeoksikolate, dok su obje doze povisile koprostanol

3-jedan; 5% doze je smanjilo kolestanol zbog nejasnih

razloga. Poveanje fekalnih kenodeoksikolata vjerovatno

ukazuje da je produkcija ili recikliranje kenodeoksikolata

bila poveana.

Plazmeni nivoi kolestanola su pozivitno povezani sa

absorpcijom holesterola [66]; dok smanjenje fekalnog

kolestanola moe indicirati da je plazmeni kolestanol bio

povien i da je bila poviena absorpcija holesterola. Kod

minijaturnih svinja, Gl je poveavao fekalni kolestanol,

suprotno od onoga to se desilo kod hraka hranjenih sa 5%

Gl. Koprostanol i koprostanol 3-jedan su bakterijski

proizvodi holesterola, koji su povieni kada je fekalni

holesterol

povien, ili kada je prominjena flora probavnog sistema [67].

Budui da se nivoi fekalnog holesterola ili koprostanola nisu

promijenili nijednom dozom Gl, nije jasno zato se koprostanol 3-jedan akumulirao.

une soli mogu imati razne funkcije i mogu djelovati kao

sredstva za pranje, aktivatori proteina kinaze C i

fosfatidilinositol-3 kinaze; i mogu biti vani regulatori gena

[68,69]. Kenodeoksikolat, deoksi-lat i njihovi glicini i taurini

konjugiraju i mogu dovesti do faresoid X receptor/retinoid X receptora (FXR/RXR)-inducirane aktivacije probavne

eluane kiseline koja vee transkripciju proteina (I-BABP), i

supresiju CYP7RNK i proteinskih nivoa (FXR sprijeava

jetrene X receptore (LXR)-inducirane transaktivacijom

CYP7). CYP7 regulie izvrni korak klasine sinteze une

kiseline. Sveukupno, poveani fekalni nivoi kenodeoksikolata mogu znaiti da je manje

kenodeoksikodala prisutno za aktivaciju FXRa. Manje

aktivacije FXRa bi vodilo do manjeg recikliranja une

kiseline i manje inhibicije sinteze une kiseline, vie

hepatinog holesterola bi se konvertovalo u unu kiselinu i

smanjio bi se holesterol plazme.

Sveukupno, mogue je da fibrozne i/ili lipofiline sterolinske

molekule u Gl mijenjaju absorpciju i recikliranje unih

kiselina i neutralnih sterola, to vodi do promijenjenje

fekalne akumulacije. Monitoring neutralnih steola i une

kiseline, i kvantificiranje konjugiranih i dekonjugiranih

unih kiselina bi trebalo da pomogne razjasniti moguu

vanost posmatranih radnji.

Poreenje in vitro, ex vivo i in vivo rezultata

U datoj studiji, in vitro eksperimenti su izvreni sa

podijeljenim Gl ekstraktima, dok su ex-vivo i in vivo

eksperimenti koristili nepromijenjeni Gl. Nepromijenjeni Gl

sadri fibrozne komponente, koju mogu djelovati na unu

kiselinu i absorpciju i reciklau neutralnih sterola. Fibrozni

sastojci takoer mogu natetiti unosu lipofilinih

komponenti, kao to su one koje inhibiraju in vitro sintezu

holesterola. Dodatna sloenost jeste da lipofiline

komponente kao to su ergostani steroli [39] mogu djelovati

na eluanu kiselinu i neutralni nivoe sterole. Stoga, teko je

direktno porediti nae in vitro i in vivo rezultate. Hranjenje

podijeljenim i nepromijenjenim gljivama moe doprinjeti

otkrivanju in vivo bioaktivnih komponenti kao to je to

uraeno za bukovae [70].

Zakljuak i glavni rezulati

U saetku, otkriveno je da Gl ima potencijal sniavanja

holesterla u in vitro, ex-vitro studijama, i to na dva ivotinjska

modela, uz neke razlike izmeu modela ivotinja. Mogue je da oksidirani lanosterolni derivati u Gl (djelomice

okarakterizani u datoj studiji) mogu doprinjeti smanjenju

holesterola tako to smanjuju sintezu holesterola (promjene

u in vitro i ex-vitro , ali ne na itavom tijelu, sinteza

holesterola je prisutna u datoj studiji). Fibrozni sastojci i

glukani u Gl su vjerovatno odgovorni za posmatrani alteracije fekalno neutralnih sterola i unih kiselina kod

obje vrste ivotinja, u konanici djelujui na absorbciju

holesterola i recikliranje unih kiselina i doprinosei

smanjenju holesterola. Sljedei koraci jestu ispitivanje

svojstava smanjenja holesterola raznih doza promijenjenih i

nepromijenjenih, hemijski okarakterisanih Gl komponenti u placebo-kontrolisanoj klinikoj studiji. Eksperimenti na

ivotinjama trebaju takoer koristiti podijeljenje materijale i

idealno, razjasniti mehanizme djelovanje svake bioaktivne

komponente. Pozitivni rezultati smanjenja holesterola u

takvim studijama e osvijetliti put za dodavanje Gl gljive

novim lijekovima i hranam za smanjenje holesterola, kao i u kombinaciji sa drugim sastojcima i lijekovima.

Materijali i metode

Materijali

Gl je iz Fermenta SA, Payerne, vicarska. Gljive su uzgajane

po odreenoj formuli piljevine, penine slame i zrnevlja prosoa. Substrakt je sterilisan na 90C u trajanju od 48 sati,

onda inkubiran sa materijalom Gl sijemena iz Mycotec Srl

(Cernier, Neuchtel).

Kultivacija se deava uz kontrolisanu temperaturu, svjetlo,

vlagu i koncentraciju karbon dioksida. Ljudske hepatozne elije T8A4 [71] su uzgajane u materijalu LCM seruma na

uslovima od 3.5% CO2 na 37C. Lovastatin je kupljen kao 20

mg Mevacor tableta (MSD Chibropharm GmbH, Haar,

Njemaka). HMG-CoA reduktaza,

DL-3-Glutaril-3-[14C]-HMG-CoA (2216 MBq/ mmol),

R-[5-3H] mevalonska kiselina amonijska so (1443 MBq/mmol), (2070 MBq/mmol) su iz Amersham (Upsala,

vedska). -3-HMG-CoA (hladni) i teni koktel za treprenje

su od Sigma (Buchs, vicarska). Materijal LCM elija je iz

Biofluids (Rockville, MD). 5-kolestan-3-ol, 5--kolestan i

2,3-nor-5-kolaniacid-3,7,12-triol su iz Steraloids, Inc.

(Newport, Rhode Island); drugi stereoidi su iz Sigma, i Calbiochem (La Jolla, Kalifornija). Metanolski HCL i Sylon

HTP su iz Supelco (Buchs, vicarska). Cobas Bio

autosampler je iz Hoffman-La Roche (Basel, vicarska) i

reagenti su iz Roche Diagnostics (Rotkreuz, vicarska).

Ukupna oprema za kolesterol 352 i oprema tricilglicerol 336

su iz Sigma kompanije. Deuterijum je iz Cambridge Isotope Laboratories (Andover, MA). Zn katalist je iz Biochemical

laboratories (Univerzitet u Bloomingtonu, IN).

Kromatografija tankog sloja silikonskog gela (TLC) je iz

Merck Eurolab (Dietkon, vicarska). Reagensi za analizu

Coomassie Plus-200 protein,a i frakcija V albumina goveeg

seruma su iz Pierce kompanije (Rockford, Illinois). Sve druge hemikalije su iz Sigma kompanije.

Priprema Gl za in vitro testiranje

http://www.lipidworld.eom/eontent/3/1/2

http://www.lipidworld.eom/eontent/3/1/2

Page 7 of 12

(page number not for citation purposes)

Lipids in Health and Disease 2004, 3

Plodna tijela iz gl (20 g) su osuena, samljevana i trapljena u

0.4 L MeOH/H2O (4:1,v/v) na sobnoj temperaturi u trajnaju

od 3 dana. Mjeavina se filtrirala, isparila, ponovno

rastvorila u H2O, ukiselila do pH3 vrijednosti sa 3M HCl,

ekstrahirala 3x sa 150 mL etil acetata, i organska faza je

isparila pod vakumom na 300C, ponovno rastvorila u 10 mL

MeOH, i suila sa Na2SO4, za analize HPLC i in vitro

testiranje.

Hemijska analiza Gl

Prisustvo lovostalina u Gl je odreeno koritenjem HPLC uz

Nucleosil 100-5 C18 kolonu (250 c 4 mm; Mach-erey-Nagel,

Oesingen, vicarska) i sa Lichrospher 100 RP-18 post

kolonom (Merck, Glattbrugg, vicarska). Sovent A je bio

H3PO4/H2O (1:2000, po volumenu); solvent B je bio

acetonitril. Dijeljenje je zapoeto linearnim gradijentom od

95% A, 5% B, dostiui 50% A, 50% B za 45 minuta, 30% A,

70% B za 46 minuta, 10% A, 90% B za 48 minuta i 0% A i

100% B za 50 minuta; nastavljeno je isokratino 4 minute.

Poetno stanje je odrano 6 minuta prije ponovnog

uravnoteenja; mlaz je bio 1 mL/min. Detektor je bio G1315

A, detektor serije 1100 (Hewlett Packard, Meyrin,vicarska);

upijanje se biljeilo na 254 nm. Nakon selektivne ekstrakcije i

purifikacije razliitim adsorbentima i solventima, ganoderoli

ganoderina kiselina su zapaeni od strane masenog

spektometra i NMR (detalji e biti posebno objavljeni).

In vitro aktivnost ekstrakta Gl

Ljudske hepatine elije T9A4 su uzgajanje u LCM

serumskom materijalu 3.5% CO2 na 37C. elije su prosiranje

na ploama 24-well i na spajanju, inkubirane sa

1mM14C-acetat (1mCi/nmol) u trajanju od 20 sati ekstrakti

gljiva. Lipidi su izvaeni iz elija inkubiranjem 2x sa 1.5 mL

hesana/isopropanola (3:2 po volumenu) u trajanju od 30

minuta na sobnoj temperaturi. Kombinirani organski

ekstrakti su sueni pod N2, ponovno rastvoreni u heksanu, i

odvojeni TLCom sa heksani/dietil eter/acetinom kiselinom

(75:25:1 po volumenu). Sinteza holesterola se utvrdila

mjerenjem inkorporacije 14C iz acetata u holesterol.

Radioaktivnost se mjerila instantnim slikanjem i izraena je

kao procenat kontrole.

Primjena Gla i lovastatina hrcima

Mujaci Golden Syrican hraka (Harlan, UK), 3-4 sedmice

stari, 4060 grama teki su drani pojedinani u kavezima

Macrolon tipa 3 u 12 smjenjujuih perioda svjetlosti i tame.

Tokom 3 sedmice

prije tretmana, hranjeni su Nafag 924 kompletnom ishranom za hrke (3132/20, Eberle Nafag AG, Gossau, vicarska;

Tabela 1). Slijedei randomiziranje tjelesne teine, grupe su se sastojale od 6 hraka/ grupe su primale ili : Nafag ishranu

(kontrola), Nafag mijeanu sa 2 mg lovostatina/100 g ishrane

(pretvorenu u prah uz teni N2); ili Nafag mijeanu sa 2.5 ili

5% suenih Gl. Hrci cu hranjeni eksperimentanom ishranom

17 dana. Lovostatin je inhibitor HMG-CoA reduktaze [72], i

koriten je za pozitivnu kontrolu. Unos hrane je biljeen svaki dan, a teina tijela se mjerila sedmino. Fekalije su se

skupljale za D15-18. Hrcima je podkono ubrizgano 250L

D2O na D17 i ubijeni pod anestezijom sa isofurlanom na D18.

Slijedei post od 16 sati, D1 (0.5 mL) i D18 krv (>3 mL) su

uzeti iz retroorbitalnih upljina, odnosno srane vene, i

prebaeni u EDTA tube. Plazma se pripremila centrifugom na 1500 g, 15 min, na 40C. Plazma, i hepatina i tkiva slijepog

crijeva su pohranjena na -800C. Zahvati na ivotinjama su

autorizovani od strane Service Vtrinaire du Canton de

Vaud, Switzerland, protokol 1247.

Primjena Gla i lovostatina na minijaturnim svinjama

Devet enki i jedan mujak Gottingen minijaturnih svinja

(Jrg Farm in Bern vicarska; Minipig-Primrzucht, Auswill,

vicarska) starih 6-12 mjeseci (18-20 kg) sa bijelim (7) i crnim

(3 minijaturne svinje) koloracijama, su drane u

spremnicima od 30 m2 uz normalni ciklus svjetlosti i mraka,

na sobnoj temperaturi. enke su odabrane jer imaju manje

modifikacija lipida koji su povezani sa godinama i manju

koncentraciju lipida od mujaka. Jedan mujak je grekom

dostavljen, meutim ukupan holesterol (TC), lipoproteini,

une kiseline i neutralni steroli su bili slini ostalim

svinjama. Minijaturne svinje su se nausmice rasporedice po

teini u dvije odvojene grupe i oznaile plastinom oznakom

na uhu, hranile dva puta dnevno 11 dana komercijalnom

hranom za svinje u prahu (Hrana 574, Minipig-Primrzucht).

Tokom etiri uzastopna dana prilagodbe, minijaturne

svidnje su hranje prilagoenom mjeavinom hrane i

poveanim koliinama prakastog hiperkolesteromine

kontrolne hrane (posebna ishrana 2604, Kliba, Kaiseraugst,

vicarska; Tabela 2) od 0% do 100% u koracima od 25 %,

osmiljenoj po planu Burnett et al. [64,74], to je bilo shodno

nutricionistikim potrebama Gottingen minijaturnih svinja

[75]. Tokom slijedee dvije sedmice (D15-D29), grupe su

hranjenje kontrolnom hiperholesteroleminom dijetom

prethodno smijeanom sa 2.5% ekstrakta Gl ; ili

hiperholestetominom ishranom plus 80 mg

lovastatina/svinja/dan (u etiri tablete od 20 mg) [53], svinje

su runo hranjene svako jutro, stavljenje u pola jabuke. Radi

prilagodbe, na D12-14, minijaturne svinje su dobile pola

jabuke bez lovastatina. Studija je bila slijepa jer su ishrane

kodirane, i oznaka za ekstrakt gljive je bila "Nestl Special

Fiber". Unos hrane je bio 3.5% tjelesne teine po danu

(bazirano na prosjenoj teini grupe), podeavao se

sedmino kako bi se pruio dovoljan, ali ne prekomjeran broj

kalorija [64,65,75]. Hrana se dijelila u 07:00 i 15:00 sati i

linerano irila na istu cementiranu povrinu kako bi se

omoguilo pojedinano hranjenje. Destilovana voda se

davala ad libitum. Igrake i ljudski kontakt je pruen kako bi

se izbjegla dosada. Uzorci krvi od posta od 16 sati (10 mL;20

mL na D29) su spremljeni u EDTA tube na D1,15,22,28, i 28 iz

prednje uplje vene. Plazma je pripremljena centrifugom kao

to je opisano za hrke, i pohranjena na -800C. Uzimanje krvi

je zapoeto u 08:00 slijedei injekciju intramiinog

relaksanta Dormicum (Hoffmann La Roche, Basel,

vicarska), onda sredstvo za umirenje Stresnil (Janssen Pharmaceuticals, Beerse, Belgija). Nakon skupljanja krvi na

D1, 15 i 29, minijaturne svinje su izolirane na maksimalno 2

sata radi prikupljanja individualnih fekalija. Neke

minijaturne svinje nisu vrile nudu u tom periodu, dok su

druge vrile nudu ponovo po povratku u grupe. Stoga,

jutarnje prikupljanje fekalija je bilo kvalitativno. Fekalije su

se skladitile na -400C uz N2. Tjelesna teina se mjerila

sedmino, a unos hrane svako jutro. Minijaturne svinje su

donirane Univerzitetu u enevi nakon zavretka studije.

Zahvati na ivotinja su autorizirani od strane Service

Vtrinaire du Canton de Geneve, vicarska, protokol 1315,

autorizacija 31.1.1014/1719/1.

Mjerenje holesterola i triacilglicerola kod hraka i

minijaturnih svinja

Ukupni holesterol plazme i triacilgliceroli su mjereni

koritenjem posebne opreme i Roche Cobas Bio

autosamplera. Lipoptoteini plazme su razdvojeni

koritenjem HPLC razdvanja na osnovu veliine kao to je

prethodno opisano [63].

Mjerenje odnosa sinteze frakcijskog holesterola kod hraka

i minijaturnih svinja

Mjerenja vodom i holesterom deutrij bogaena su vrena uz

pomo Finnigan Thermoquest Delta XL plus izotopskog

masnog spektometra (Bremen, Njemaka) kao to je

prethodno opisano [76,77]. Odnos frakcijske sinteze (FSR)

slobodnog holesterola je izraunat iz uzoraka plazme

skupljenih 24 sata nakon to je ubrizgana potkona injekcija

deutrium oksida : FSR (u % dio/dan) = 100 x (bogaenje

holesterola/ (bogaenje vodom) x 0.478)). Zbog tehnikih

razloga, nije bilo dovoljno vrijednosti u eksperimentima na

minijaturnim svinjama da bi se proizveli konkretni rezultati.

Mjerenje ekalne une kiseline i neutralnih sterola kod

hraka i minijaturnih svinja

Fekalni neutralni steroli i une kiseline su izvaene iz

lifoliziranih fekalija, dekonjugirane, derivatizirane uz Sylon

HTP i analizirane uz gasnu kronomatografiju prethodno

opisanu uz unutarnje standarde: 5--kolestan iz neutralnih

sterola; 2,3-nor 5 -kolanik kiselina-3,7,12-triol za une

kiseline [63].

http://www.lipidworld.eom/eontent/3/1/2

http://www.lipidworld.eom/eontent/3/1/2

Page 8 of 12

(page number not for citation purposes)

Lipids in Health and Disease 2004, 3

Hepatozna ex-vivo mjerenja reduktaze HMG-CoA kod

hraka

Svjea jetra (300 mg) je uzeta nakon posta od 16 sati iz

hraka, isjeckana makazama i homogenizirana sa 0.4 mL bufera (50 nM KH2PO4, 0.1 surkoze, 50 mM KCl, 50 mM

NaCl, 30 mM EDTA i 2 MM dithiotreitol, 50 mM NaF) uz

Potter-Elvehjem S homogenizator sa 400 opm/5 udara, na

ledu, po Conde et al. [55]. NaF inhibira defosforilaciju

HMG-CoA reuktaze inaktivirajui fosforoproteinsku

fosfatazu, to prouzrokuje ukupnu fosforilatiziranu aktivnost HMG-CoA reduktaze. Nakon pranja

homogenizatora sa 0.2 mL pufera, homogenat se

centrifugirao na 10000 g, 15 minuta, na 40C. Supernatant je

decantiran, 0.4 mL hladnog pufera dodano, i tuba je

ponovno stavljena i ponovo centrifugirana. Odvojeni

post-mitohondrijski supernatanti su se vrtili na 1.5 mL utracentrifugalnim tubama na 150000 opm, 10 minuta na 4C

u Sorvall Discoverz M 150 mikro ultracentrifugi ((Kendro

Laboratory Products SA, Carouge-Geneva, vicarska), i

mikrosomalne frakcije su spremljene na -800C. Mikrosomalni

proteini (200g, 10-18L) su prethodno inkubirani na 37C u

kupatilu za mijeanje, onda su inkubirani 15 minuta sa 50L rastvora substrata (pufer plus 90mM glukoza-6-fosfata, 72

mM EDTA, 9mM NADP, 6.2 nmol hladnog HMG-CoA (0.12

mM), 1.3 nmol [14C]HMG-CoA (0.0025 MBq), 0.3 IU

glukoza-6-fosfata, dehidrogenaza, i 0.024 MBq

[3H]meval-onske kiselne kao povratni standard). Nakon 15

minuta, reakcija je okonana uz 25L 10 M HCL, onda inkubirana 30 minuta na 37C za konverziju

mevalonat-mevaloolakton. Slijedei centrifugu na 1000 g, 1

minut, na 4C da se uklone denaturisani proteini, supernatant

se dodao na aktivirane (1 sat, 105C) TLC ploe, razvijene u

svjeem benzen-acetonu (1:1 po volumenu),mevalonolaktoni

region je sastrugan (na osnovu migracije hladnih standarda i rendgenskih zraka film vizualizacije; Rf 0.42-0.5), i

radioaktivnost se mjerila u koktelu treperenja od 10 mL.

Statistika

Razlike izmeu grupa su testirane parnim/neparnim,

jednostranim/dvostranim, student t-testovima, jednakim

promjenama, kao to je prikladno za razliita mjerenja.

Statistiki znaaj se izraavao u odnosu na kontrolu P < 0.05

osim ako nije naznaeno drugaije

Lista skraenica

D, dan; FPLC, tena kromatografija brzih proteina; GC gasna

kromatografija; Gl ili G. Ludidum, Ganoderma lucidum; HMG-CoA 3-hidroksi-3-metilglutaril koenzim A; HPLC,

tena kromatografija pod visokim pritiskom; TLC

kromatografija tankog sloja; TAG tiacilglicerol; TC, ukupni

holesterol.

Doprinosi autora

AB je napisao i sastavio veinu manuskripta, bio je

odgovoran za studije na minijaturnim svinjama, i sluio je

kao voa projekta za istraivanje holesterola na ivotinjama.

DR je razvio metode za mjerenje lipoproteina holesterola, i

bio je odgovoran za studije na hrcima. EK; I. Monnard i JH

su sudjelovali u studijama na ivotinjama, i razvili su

metode za neutralne sterole, une kiseline i ex vivo mjerenja.

HH je razvio metode za hemijsku analizu Gl.I. Meirim i CPW

su razvili metode za odnose sinteze holesterola. KM je dio

odgovaran za in vitro bioloka testiranja ekstrakta Gl.

P.Niederberger je vodio kompletan projekat.

Priznanja Autori se ele zahvaliti P. Weber iz Champiteca za dobavljanje Gl; D. Isler iz Klibae za

pripremanje posebne ishrane za minijaturne svinje; P. Bidaut i P. Bonfills iz Univerziteta u

enevi za brigu i hranjenje minijaturnih svinja, i pomo sa protokolom eksperimenta;J.-L.

Sanchez-Garcia ili asistiranje sa vaenjem krvi minijaturnih svinja;M. Gyger za predoenje

veterinarskih protokola; Jedinici za brigu o ivotinjama Nestle centra za istraivanje za

pomo sa eksperimentima na hrcima; M. Huff sa Univerziteta u Zapadnom Ontariju za

korisne diskusije u vezi ishrane minijaturnih svinja i doziranja lovastatina: Ellegaard

Gottingen Minipigs ApS, Dalmose, Danska, za pruanje informacija o Gorringen

minijaturnim svinjama; i na kraju D. Mutchu, B. Germanu, J.-R. Nesseru, i O. Ballervreu za

dinamine diskusije u vezi sa modelima istraivanja holesterola kod ivotinja.

Reference

1. Borchers AT, Stern JS, Hackman RM, Keen CL, Gershwin ME: Mushrooms, tumors,

and immunity. Proc Soc Exp Biol Med 1999, 221:281-293.

2. Kabir Y, Kimura S, Tamura T: Dietary effect of Ganoderma lucidum mushroom on

blood pressure and lipid levels in spontaneously hypertensive rats (SHR). J Nutr

Sci Vitaminol (Tokyo) 1988, 34:433-438.

3. Li Khva Ren, Vasil'ev AV, Orekhov AN, Tertov VV, Tutel'ian VA: [Anti-atherosclerotic

properties of higher mushrooms (a clinico-experimental investigation)]. Vopr Pitan

1989:16-19.

4. Opletal L, Jahodar L, Chobot V, Zdansky P, Lukes J, Bratova M, Soli-chova D,

Blunden G, Dacke CG, Patel AV: Evidence for the anti-hyperlipidaemic activity of the

edible fungus Pleurotus ostreatus. Br J Biomed Sci 1997, 54:240-243.

5. Bobek P, Ozdin L, Galbavy S: Dose- and time-dependent hypoc-holesterolemic

effect of oyster mushroom (Pleurotus ostreatus) in rats. Nutrit ion 1998,

14:282-286.

6. Bobek P, Galbavy S: Hypocholesterolemic and antiatherogenic effect of oyster

mushroom (Pleurotus ostreatus) in rabbits. Nahrung 1999, 43:339-342.

7. Cheung PC, Lee MY: Fractionation and characterization of mushroom dietary fiber

(nonstarch polysaccharides) as potential nutraceuticals from sclerotia of Pleurotus

tuber-regium (Fries) singer. J Agric Food Chem 2000, 48:3148-3151.

8. Gunde-Cimerman N, Plemenitas A: Hypocholesterolemic activity of the genus

Pleurotus (Fr.) Karst. (Agaricales s.l., Basidiomycetes). Int J Medicinal

Mushrooms 2001, 3:A9I.

9. Cheung PC: Plasma and hepatic cholesterol levels and fecal neutral sterol excretion

are altered in hamsters fed straw mushroom diets. J Nutr 1998, 128:1512-1516.

10. Fukushima M, Nakano M, Morii Y, Ohashi T, Fujiwara Y, Sonoyama K: Hepatic LDL

receptor mRNA in rats is increased by dietary mushroom (Agaricus bisporus) fiber

and sugar beet fiber. J Nutr 2000, 130:2151-2156.

11. Beynen AC, Fielmich AM, Lemmens AG, Terpstra AH: Farm-grown mushrooms

(Agaricus campestris) in the diet of rats do not affect plasma and liver cholesterol

concentrations. Nahrung

I996, 40:343-345.

12. Cheung PCK: The hypocholesterolemic effect of extracellular polysaccharide from the submerged fermentation of

mushroom. Nutr Res 1996, 16:1953-1957.

13. Cheung PCK: The hypocholesterolemic effect of two edible mushroom: Auricularia

auricula (Tree-ear) and Tremella fuci-formis (White-jelly leaf) in

hypercholesterolemia rats. Nutr Res 1996, 16:1721-1725.

14. Kabir Y, Yamaguchi M, Kimura S: Effect of shiitake (Lentinus edo-des) and maitake

(Grifola frondosa) mushrooms on blood pressure and plasma lipids of

spontaneously hypertensive rats. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo) 1987,

33:341-346.

15. Kubo K, Nanba H: The effect of maitake mushrooms on liver and serum lipids.

Altern Ther Health Med 1996, 2:62-66.

16. Sugiyama K, Yamakawa A, Saeki S: Correlation of suppressed linoleic acid

metabolism with the hypocholesterolemic action of eritadenine in rats. Lipids 1997,

32:859-866.

17. Sugiyama K, Kawagishi H, Tanaka A, Saeki S, Yoshida S, Sakamoto H, Ishiguro Y:

Isolation of plasma cholesterol-lowering components from ningyotake (Polyporus

confluens) mushroom. J Nutr Sci Vitaminol (Tokyo) 1992, 38:335-342.

18. Kaneda T, Tokuda S: Effect of various mushroom preparations on cholesterol levels

in rats. J Nutr 1966, 90:371-376.

19. Shao G: [Treatment of hyperlipidemia with cultivated Cordyceps a double-blind,

randomized placebo control trial]. Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi (Chin J Integ

Med) 1985, 5:642-665.

20. Tao J, Feng KY: Experimental and clinical studies on inhibitory effect of Ganoderma

lucidum on platelet aggregation. J Tongji Med Univ 1990, 10:240-243.

21. Chang ST: Ganoderma - the leader in production and technology of mushroom

neutraceuticals. In: Recent advances in Gano-derma lucidum research

Edited by: Kim B-K, Kim YS. Seoul, Korea: The Pharmaceutical Society of

Korea; 1995:43-52.

22. Chen AW, Miles PG: Biomedical research and the application of the mushroom

nutriceuticals from Ganoderma lucidum. In: Mushroom Biology and Mushroom

Products Edited by: Royse DJ. University Park, PA: The Pennsylvania

State University; 1996:161-175.

23. Mizuno T: Oriental medicinal tradition of Ganoderma lucidum (Reishi) in China. In:

Ganoderma lucidum Edited by: Mizuno T, Kim BK. Seoul, Korea: II-Yang

Pharm. Co. Ltd; 1996:101-106.

24. Sun-Soo T: Effective dosage of the extract of Ganoderma lucidum in the treatment

of various ailments. In: Mushroom Biology and Mushroom Products Edited by:

Royse DJ. University Park, PA: The Pennsylvania State University;

1996:177-185.

25. Wasser SP, Weis AL: Therapeutic effects of substances occur-ring in higher

Basidiomycetes mushrooms: a modern perspective. Crit Rev Immunol 1999,

19:65-96.

26. Chang ST, Buswell JA: Medicinal Mushrooms - A Prominent Source of Nutriceuticals

for the 21st century. Current Topics in Nutraceutical Research 2003,

1:257-280.

27. Shiao MS: Natural products of the medicinal fungus Gano-derma lucidum:

occurrence, biological activities, and phar-macological functions. Chem Rec 2003,

3:172-180.

28. Lee SY, Rhee HM: Cardiovascular effects of mycelium extract of Ganoderma

lucidum: inhibition of sympathetic outflow as a mechanism of its hypotensive action.

Chem Pharm Bull (Tokyo) 1990, 38:1359-1364.

29. Rein D, Monnard I, German JB, Berger A: Screening of cholesterol absorption and

synthesis inhibiting food ingredients in hamster models. FASEB J 2000, I4:A250.

30. Cevallos WH, Holmes WL, Myers RN, Smink RD: Swine in atherosclerosis research

- Development of an experimental animal model and study of the effect of dietary

fats on cholesterol metabolism. Atherosclerosis 1979, 34:303-317.

31. Clarkson T, Shively C, Weingand K: Animal Models of diet-Induced Atherosclerosis.

In: Use of Animal Models for Research in Human Nutrit ion Volume 6.

Edited by: Beynen A, West C. Basel: Karger; 1988:56-82.

32. Fadden K, Hill MJ, Latymer E, Low G, Owen RW: Steroid metabo-lism along the

gastrointestinal tract of the cannulated pig. Eur J Cancer Prev 1999, 8:35-40.

33. Hikino H, Ishiyama M, Suzuki Y, Konno C: Mechanisms of hypogly-cemic activity of

ganoderan B: a glycan of Ganoderma luci-dum fruit bodies. Planta Med 1989,

55:423-428.

34. Bao X, Duan J, Fang X, Fang J: Chemical modifications of the

(I-->3)-alpha-D-glucan from spores of Ganoderma lucidum and investigation of their

physicochemical properties and immu-nological activity. Carbohydr Res 2001,

336:127-140.

35. Zhu M, Chang Q, Wong LK, Chong FS, Li RC: Triterpene antioxidants from

Ganoderma lucidum. Phytother Res 1999, 13:529-53 1.

36. Wu TS, Shi LS, Kuo SC: Cytotoxicity of Ganoderma lucidum trit-erpenes. J Nat

Prod 2001, 64: II2I-II22.

37. Gao JJ, Min BS, Ahn EM, Nakamura N, Lee HK, Hattori M: New trit-erpene

aldehydes, lucialdehydes A-C, from Ganoderma luci-dum and their cytotoxicity

against murine and human tumor cells. Chem Pharm Bull (Tokyo) 2002,

50:837-840.

38. Luo J, Zhao YY, Li ZB: A new lanostane-type triterpene from the fruiting bodies of

Ganoderma lucidum. J Asian Nat Prod Res 2002, 4: I29-134.

39. Ma J, Ye Q, Hua Y, Zhang D, Cooper R, Chang MN, Chang JY, Sun HH: New

lanostanoids from the mushroom Ganoderma lucidum. J Nat Prod 2002, 65:72-75.

http://www.lipidworld.eom/eontent/3/1/2http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1046/j.1525-1373.1999.d01-86.xhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1046/j.1525-1373.1999.d01-86.xhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10460691http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=3236086http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=3236086http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9624732http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1016/S0899-9007(97)00471-1http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1016/S0899-9007(97)00471-1http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1002/(SICI)1521-3803(19991001)43:5%3c339::AID-FOOD339%3e3.3.CO;2-Xhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1002/(SICI)1521-3803(19991001)43:5%3c339::AID-FOOD339%3e3.3.CO;2-Xhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1021/jf000382shttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1021/jf000382shttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9732312http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9732312http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10958806http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10958806http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9008834http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9008834http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1016/S0271-5317(96)00218-7http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1016/S0271-5317(96)00218-7http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1016/S0271-5317(96)00218-7http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1016/0271-5317(96)00191-1http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1016/0271-5317(96)00191-1http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=3443885http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=3443885http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=8795938http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9270978http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9270978http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=1291638http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=6005929http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=6005929http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=2098581http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9987601http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9987601http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1002/tcr.10058http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1002/tcr.10058http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=12900937http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=2393962http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=518741http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=518741http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=518741http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10091041http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10091041http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=2682700http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1016/S0008-6215(01)00238-5http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1016/S0008-6215(01)00238-5http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=11689183http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10479768http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1021/np010115whttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1021/np010115whttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1248/cpb.50.837http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1248/cpb.50.837http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=12045343http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=12067158http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=11809071

http://www.lipidworld.eom/eontent/3/1/2

Page 9 of 12

(page number not for citation purposes)

Lipids in Health and Disease 2004, 3

40. Komoda Y, Shimizu M, Sonoda Y, Sato Y: Ganoderic acid and its derivatives as

cholesterol synthesis inhibitors. Chem Pharm Bull I989, 37:53I -533.

41. Mizushina Y, Takahashi N, Hanashima L, Koshino H, Esumi Y, Uzawa J, Sugawara

F, Sakaguchi K: Lucidenic acid O and lactone, new terpene inhibitors of eukaryotic

DNA polymerases from a basidiomycete, Ganoderma lucidum. Bioorg Med Chem

I999,

7:2047-2052.

42. Ha TB, Gerhauser C, Zhang WD, Ho-Chong-Line N, Fouraste I: New lanostanoids

from Ganoderma lucidum that induce NAD(P)H:quinone oxidoreductase in cultured

murine hepatoma cells. Planta Med 2000, 66:68I-684.

43. Walker KA, Kertesz DJ, Rotstein DM, Swinney DC, Berry PW, So OY, Webb AS,

Watson DM, Mak AY, Burton PM et ab Selective inhibition of mammalian lanosterol

14 alpha-demethylase: a possible strategy for cholesterol lowering. J Med Chem

I993,

36:2235-2237.

44. Frye LL, Leonard DA: Lanosterol analogs: dual-action inhibitors of cholesterol biosynthesis. Crit Rev Biochem Mol Biol I999,

34:I23-I40.

45. Bergstrom JD, Dufresne C, Bills GF, Nallin-Omstead M, Byrne K: Discovery,

biosynthesis, and mechanism of action of the zarago-zic acids: potent inhibitors of

squalene synthase. Annu Rev Microbiol I995, 49:607-639.

46. Bollen P, Ellegaard L: The Gottingen minipig in pharmacology and toxicology.

Pharmacol Toxicol I997, 80(Suppl 2):3-4.

47. Gunde-Cimerman N, Cimerman A: Pleurotus fruiting bodies con-tain the inhibitor of

3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase-lovastatin. Exp Mycol I995, 19:

I-6.

48. Ogawa H, Hasumi K, Sakai K, Murakawa S, Endo A: Pannorin, a new

3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor produced by

Chrysosporium pannorum. J Antibiot (Tokyo) I99I,

44:762-767.

49. Morisaki M, Sonoda Y, Makino T, Ogihara N, Ikekawa N, Sato Y: Inhibitory effect of 15-oxygenated sterols on cholesterol syn-

thesis from 24,25-dihydrolanosterol. J Biochem (Tokyo) I986,

99:597-600.

50. Aoyama Y, Yoshida Y, Sonoda Y, Sato Y: 7-Oxo-24,25-dihydro- lanosterol: a novel lanosterol 14 alpha-demethylase (P-

M) inhibitor which blocks electron transfer to the oxy-

ferro intermediate. Biochim Biophys Acta 1987, 922:270-277.

51. Sonoda Y, Obi N, Onoda M, Sakakibara Y, Sato Y: Effects of 32-oxy-genated

lanosterol derivatives on 3-hydroxy-3-methylglu-taryl coenzyme A reductase activity

and cholesterol biosynthesis from 24,25-dihydrolanosterol. Chem Pharm Bull

(Tokyo) 1992, 40:2796-2799.

52. Trzaskos JM, Magolda RL, Favata MF, Fischer RT, Johnson PR, Chen HW, Ko SS,

Leonard DA, Gaylor JL: Modulation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase by

15 alpha-fluorolanost-7-en-3 beta-ol. A mechanism-based inhibitor of cholesterol

biosynthesis. J Biol Chem 1993, 268:22591-22599.

53. Morand OH, Aebi JD, Dehmlow H, Ji YH, Gains N, Lengsfeld H, Him-ber J: Ro

48-8.071, a new 2,3-oxidosqualene:lanosterol cyclase inhibitor lowering plasma

cholesterol in hamsters, squirrel monkeys, and minipigs: comparison to simvastatin.

J Lipid Res 1997, 38:373-390.

54. Ness GC, Gertz KR, Holland RC: Regulation of hepatic lanosterol 14

alpha-demethylase gene expression by dietary cholesterol and cholesterol-lowering

agents. Arch Biochem Biophys 2001, 395:233-238.

55. Conde K, Roy S, Freake HC, Newton RS, Fernandez ML: Atorvasta-tin and

simvastatin have distinct effects on hydroxy methyl-glutaryl-CoA reductase activity

and mRNA abundance in the guinea pig. Lipids 1999, 34:1327-1332.

56. Del Puppo M, Rauli S, Galli Kienle M: Inhibition of cholesterol synthesis and hepatic

3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase in rats by simvastatin and pravastatin.

Lipids 1995, 30:1057-1061.

57. Himber J, Missano B, Rudling M, Hennes U, Kempen HJ: Effects of

stigmastanyl-phosphocholine (Ro 16-6532) and lovastatin on lipid and lipoprotein

levels and lipoprotein metabolism in the hamster on different diets. J Lipid Res

I995, 36:1567-1585.

58. Krause BR, Princen HM: Lack of predictability of classical animal models for

hypolipidemic activity: a good time for mice? Atherosclerosis 1998, 140:15-24.

59. Ma PT, Gil G, Sudhof TC, Bilheimer DW, Goldstein JL, Brown MS:

Mevinolin, an inhibitor of cholesterol synthesis, induces mRNA for low density

lipoprotein receptor in livers of hamsters and rabbits. Proc Natl Acad Sci U S A

1986, 83:8370-8374.

60. Huff MW, Telford DE: Regulation of low density lipoprotein apoprotein B metabolism

by lovastatin and cholestyramine in miniature pigs: effects on LDL composition and

synthesis of LDL subfractions. Metabolism 1989, 38:256-264.

61. Tikkanen MJ: Statins: within-group comparisons, statin escape and combination

therapy. Curr Opin Lipidol 1996, 7:385-388.

62. Knopp RH: Drug treatment of lipid disorders. N Engl J Med 1999, 341:498-51 I.

63. Berger A, Gremaud G, Baumgartner M, Rein D, Monnard I, Kratky E, Geiger W, Burri

J, Dionisi F, Allan M, Lambelet P: Cholesterol-low-ering properties of amaranth grain

and oil in hamsters. Int J Vitam Nutr Res 2003, 73:39-47.

64. Burnett JR, Wilcox LJ, Telford DE, Kleinstiver SJ, Barrett PH, Newton RS, Huff MW,

Barrett P: Inhibition of HMG-CoA reductase by atorvastatin decreases both VLDL

and LDL apolipoprotein B production in miniature pigs. Arterioscler Thromb Vasc

Biol I997, 17:2589-2600.

65. Burnett JR, Wilcox LJ, Telford DE, Kleinstiver SJ, Barrett PH, Newton RS, Huff MW:

The magnitude of decrease in hepatic very low density lipoprotein apolipoprotein B

secretion is determined by the extent of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A

reductase inhibition in miniature pigs. Endocrinology I999, 140:5293-5302.

66. Miettinen TA, Strandberg TE, Gylling H: Noncholesterol sterols and cholesterol

lowering by long-term simvastatin treatment in coronary patients: relation to basal

serum cholestanol. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2000, 20:I340-I346.

67. Collinder E, Cardona ME, Kozakova H, Norin E, Stern S, Midtvedt T: Biochemical

intestinal parameters in pigs reared outdoors and indoors, and in germ-free pigs. J

Vet Med A Physiol Pathol Clin

Med 2002, 49:203-209.

68. Edwards PA, Kast HR, Anisfeld AM: BAREing it all: the adoption of LXR and FXR and their roles in lipid homeostasis. J Lipid Res

2002, 43:2-I2.

69. Davis RA, Miyake JH, Hui TY, Spann NJ: Regulation of cholesterol- 7alpha-hydroxylase: BAREly missing a SHP. J Lipid Res 2002,

43:533-543.

70. Bobek P, Ozdin L, Kuniak L: The effect of oyster mushroom (Pleurotus ostreatus), its ethanolic extract and extraction res-

idues on cholesterol levels in serum, lipoproteins and liver of

rat. Nahrung I995, 39:98-99.

71. Pfeifer AM, Cole KE, Smoot DT, Weston A, Groopman JD, Shields PG, Vignaud JM, Juillerat M, Lipsky MM, Trump BF et ab Simian virus 40 large

tumor antigen-immortalized normal human liver epithelial cells express hepatocyte

characteristics and metabolize chemical carcinogens. Proc Natl Acad Sci U S A

I993,

90:5I23-5I27.

72. Askenazi M, Driggers EM, Holtzman DA, Norman TC, Iverson S, Zimmer DP, Boers

ME, Blomquist PR, Martinez EJ, Monreal AW et al.: Integrating transcriptional and

metabolite profiles to direct the engineering of lovastatin-producing fungal strains.

Nat Biotechnol 2003, 21:150-156.

73. Berlin E, Khan MA, Henderson GR, Kliman PG: Influence of age and sex on

composition and lipid fluidity in miniature swine plasma lipoproteins.

Atherosclerosis I985, 54:I87-203.

74. Burnett JR, Wilcox LJ, Telford DE, Kleinstiver SJ, Barrett PH, Newton RS, Huff MW:

Inhibition of ACAT by avasimibe decreases both VLDL and LDL apolipoprotein B

production in miniature pigs. J Lipid Res 1999, 40: I3I7-I328.

75. Ritskes-Hoitinga J, Bollen PJA: Nutrition of (Gttingen) minipigs: facts, assumptions

and mysteries. Pharmacol Toxicol 1997, 80(Supl II):5-9.

76. Gremaud G, Piguet C, Baumgartner M, Pouteau E, Decarli B, Berger

A, Fay LB: Simultaneous assessment of cholesterol absorption and synthesis in humans using on-line gas chromatography/

combustion and gas chromatography/pyrolysis/isotope-ratio

mass spectrometry. Rapid Commun Mass Spectrom 2001,

15:1207-1213.

77. Gremaud G, Dalan E, Piguet C, Baumgartner M, Ballabeni P, Decarli B, Leser ME, Berger A, Fay LB: Effects of non-esterified stanols in a liquid emulsion on cholesterol absorption and synthesis in

hypercholesterolemic men. Eur J Nutr 2002, 41:54-60.

78. Nutrient Requirements for Swine - 10th Revised Edition. Washington, D. C.:

National Research Counci l/National Academy of Science (NRC/NAS);

1998.

79. Shapiro JD, Nordstrom LJ, Mitschelen JJ, Rodwell VW, Schimke RT: Micro assay for

3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase in rat liver and in L-cell fibroblast.

Biochim Biophys Acta 1974, 370:369-377.

Publish with BioMed Central and every scientist

can read your work free of charge

"BioMed Central will be the most s ignif icant development for

disseminating the results of biomedical research in our l ifetime."

Sir Paul Nurse, Cancer Research UK

Your research papers will be:

available free of charge to the entire biomedical community

peer reviewed and published immediately upon acceptance

cited in PubMed and archived on PubMed Central

yours you keep the copyright

Submit your manuscript here:

http://www.biomedcentral.com/info/publishing_adv.asp

o

BioMedcentral

450,

http://www.lipidworld.eom/eontent/3/1/2http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=2743504http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=2743504http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10530954http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1055/s-2000-8647http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1055/s-2000-8647http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=11105584http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=8340925http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=8340925http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10333389http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10333389http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1146/annurev.mi.49.100195.003135http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1146/annurev.mi.49.100195.003135http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1146/annurev.mi.49.100195.003135http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1146/annurev.mi.49.100195.003135http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9249853http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1006/emyc.1995.1001http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1006/emyc.1995.1001http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=7614366http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=1880066http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=1880066http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=1880066http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=3700366http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=3700366http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=3318933http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=3318933http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=1464112http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=1464112http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=1464112http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=7693673http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=7693673http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=7693673http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9162756http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9162756http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9162756http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1006/abbi.2001.2590http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1006/abbi.2001.2590http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1006/abbi.2001.2590http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1006/abbi.2001.2590http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10652993http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10652993http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10652993http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=8569435http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=8569435http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=7595080http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=7595080http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=7595080http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1016/S0021-9150(98)00141-5http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1016/S0021-9150(98)00141-5http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=3464957http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=3464957http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=2918845http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=2918845http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=2918845http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9117143http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9117143http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1056/NEJM199908123410707http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1056/NEJM199908123410707http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=12690910http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=12690910http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9409231http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9409231http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1210/en.140.11.5293http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1210/en.140.11.5293http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1210/en.140.11.5293http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1210/en.140.11.5293http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10807752http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10807752http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10807752http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1046/j.1439-0442.2002.00407.xhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1046/j.1439-0442.2002.00407.xhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=12069263http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=11792716http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=11792716http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=11907135http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=11907135http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=7898579http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=7898579http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=7898579http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=7898579http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=46667http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=46667http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=46667http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=46667http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1038/nbt781http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1038/nbt781http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=12536215http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=3986017http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=3986017http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10393217http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10393217http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9249854http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=9249854http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1002/rcm.365http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1002/rcm.365http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1002/rcm.365http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1002/rcm.365http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1007/s003940200008http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1007/s003940200008http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1007/s003940200008http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1007/s003940200008http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1016/0005-2744(74)90098-9http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=10.1016/0005-2744(74)90098-9http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&dopt=Abstract&list_uids=4441486http://www.biomedcentral.com/http://www.biomedcentral.com/info/publishing_adv.asphttp://www.biomedcentral.com/