70
Universitatea de Medicină şi Farmacie “Iuliu Haţieganu” Cluj-Napoca Facultatea de Medicină LUCRARE DE LICENŢĂ Îndrumator ştiinţific: Conf. Dr. Alina Elena Parvu Conf. Dr. Alexandru Irimie Absolvent: Ciurdariu Sergiu-Ioan 2010

Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Embed Size (px)

Citation preview

Page 1: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Universitatea de Medicină şi Farmacie “Iuliu Haţieganu” Cluj-Napoca

Facultatea de Medicină

LUCRARE DE LICENŢĂ Îndrumator ştiinţific: Conf. Dr. Alina Elena Parvu Conf. Dr. Alexandru Irimie

Absolvent: Ciurdariu Sergiu-Ioan

2010

Page 2: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Universitatea de Medicină şi Farmacie “Iuliu Haţieganu” Cluj-Napoca

Facultatea de Medicină

LUCRARE DE LICENŢĂ “EVALUAREA SINTEZEI DE OXID

NITRIC ȘI A STRESULUI OXIDATIV ÎN TUMORILE RECTALE”

Îndrumator ştiinţific: Conf. Dr. Alina Elena Parvu Conf. Dr. Alexandru Irimie

Absolvent: Ciurdariu Sergiu-Ioan

2010

Page 3: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

I

Cuprins

ITRODUCERE 1

CAPITOLUL 1 1.Fiziopatologia neoplaziilor 2 1.1Etiopatogeneza neoplaziilor. 3

1.2Teorii patogenetice în neoplazii. 6

1.2.1 Factorul genetic în apariţia neoplaziilor. 6

1.2.2 Ereditatea în patogeneza cancerelor. 7

1.2.3 Agenţi carcinogeni chimici. 8

1.2.4 Efectele radiaţiilor ionizante. 9

1.2.5 Virusurile oncogenice. 9

1.2.6 Implicarea sistemului imunitar în oncogeneză 10

1.3 Fiziopatologia cancerului de colon 11

CAPITOLUL 2

2.Oxidul nitric 13

2.1Sinteza oxidului nitric. 14

2.2 Acțiunea NOS. 14

2.2.1Structura NOS. 14

2.2.2 NO-sintetazele(NOS). 15

2.3 Efecte fiziologice ale oxidului nitric. 18

2.3.1 Rolul imunitar al NO. 18

2.3.2 Acţiunea asupra musculaturii netede. 18

2.3.3 Oxidul nitric şi inflamaţia 19

2.3.4 NO şi efetele sale asupra sistemului nervos. 19

2.3.5 Importanţa NO în uciderea germenilor patogeni. 20

2.3.6 NO şi longevitatea. 20

2.4 Implicarea oxidului nitric în fiziopatologia neoplaziilor. 21

Page 4: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

II

CAPITOLUL 3

3.Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale 24

3.1 Scopul studiului 25

3.2 Materiale şi metode 25

3.2.1 Grupurile de studiu 25

3.2.2 Reactivii folosiţi. 26

3.2.3 Determinarea nitriţilor 27

3.2.4 Determinarea răspunsului antioxidativ total (TAR). 28

3.2.5 Determinarea statusului oxidativ total . 30

3.2.6 Indicele de stres oxidativ. 31

3.2.7 Analiza statistică. 31

3.3 Rezultate 32

3.3.1 Analiza demografică a pacienților. 32

3.3.2 Analiza generală a lotului de studiu. 32

3.3.3 Analiza sublotului de femei 35

3.3.4 Analiza sublotului de bărbați 38

3.3.5 Analiza pe grupe de vârstă 41

3.4 Discuții 51

Concluzii 58

Bibliografie 60

Page 5: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Introducere

1

Introducere

Cancerul colorectal se află pe primele locuri în lista incidenței cancerelor în lume.Din

acest motiv,anual se revizuiesc metodele de screening și recomandările de diagnostic și

tratament

.Proporțional cu incidența cancerului colorectal s-au dezvoltat și studiile referitoare la

mecanismele celulare și moleculare implicate în patogeneza acestui tip de cancer.

Se știe că diverși factori pot să influențeze incidența cancerului colorectal.Printre

aceștia cei mai frecvent menționați sunt obezitatea,antecedentele familiale,vârsta,inactivitatea

fizică,consumul de alcool și alimentația.

Studiile efectuate în ultimii ani au pus în evidență diverși factori de risc

moleculari.Printre cei mai studiați factori de risc implicați la nivel molecular se găsesc cei

implicați în stresul oxidativ.

Având în vedere aceste aspecte,studiul de față și-a propus evaluarea unor parametrii ai

stresului oxidativ în tratamentul cancerului colorectal,respectiv după tratamentul chirurgical

și înainte și după tratamentul combinat radioterapie și chimioterapie.

Alegerea acestor etape terapeutice ca și momente de studiu s-a făcut pornind de la

constatarea că stresul oxidativ acționează diferit în diferite etape ale canncerogenezei,ceea ce

obligă la descrierea unor indicatori care să fie adaptați pentru fiecare stadiu evolutiv al bolii.

În urma studiului se dorește a se evalua posibilitatea ca acești parametri ai stresului

oxidativ urmăriți să fie în viitor folosiți ca șă parametri de screening în evaluarea

postchirurgicală a pacienților cu cancer colorectal operat.

Page 6: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

2

Capitolul 1

Fiziopatologia neoplaziilor

Page 7: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 1 Fiziopatologia neoplaziilor

3

1.1Etiopatogeneza neoplaziilor.

Neoplaziile reprezintă o problemă de o covârşitoare importanţă in sănătatea mondială

la momentul actual.De aceea cunoaşterea etiopatogenezei acestui tip de afecţiuni este

esenţială[2,3].

Neoplaziile rezultă din alterări ale proceselor de creştere şi diferenţiere celulară,din

acestea rezultând ţesutul canceros.Acesta creşte în mod necontrolat şi autonom datorită lipsei

regulatorilor creşterii şi dezvoltării celulare în ţesutul neoplazic[1].

Există o varietate deosebită a a proceselor de cancerogeneză în funcţie de localizarea

neoplaziei,însă multe din caracterele acestora sunt totuşi comune.Principalele trăsaturi

comune sunt legate de multiplicarea factorilor care intervin în oncogeneză şi de trecere unei

perioade lungi de timp între prima influenţă şi apariţia bolii propriu-zise.Se disting factori

interni şi externi[4].

La început,rezultatul acţiunii factorilor externi şi interni este apariţia prin transformare

sau mutaţie a unei celule care are potenţialul de a deveni canceroasă.Acesta este faza de

iniţiere a oncogenezei.Sunt necesare intervenţii suplimentare pentru a-i permite acestei celule

să se modifice şi să se multiplice pentru a forma o clonă cu potenţial canceros.Aceasta este

faza de promoţie.Factorii care favorizează prima fază a oncogenezei sunt numiţi iniţiatori iar

cei care o favorizează pe cea de-a doua sunt numiţi promotori.Oncogeneza are o evoluţie de

lungă durată,începând cu influenţa exercitată de factorii cancerigeni si apariţia primei celule

canceroase,care se multiplică apoi excesiv.Pentru început avem de-a face cu o fază

asimptomatică,faza preclinică.Când tumora va atinge greutatea de un gram,care corespunde

existenţei unui miliard de celule neoplazice ea va deveni decelabilă[6,8]].

Celulele canceroase apar ca şi rezultat al mutaţiilor care au ,loc în timpul procesului de

diferenţiere celulară.Când mutaţia apare la începutul procesului de diferenţiere avem de-a face

cu o tumoră slab diferenţiată şi cu malignitate crescută,în timp ce în cazul apariţiei mutaţiei

mai târziu in acelaşi proces tumora este mai bine diferenţiată şi cu o malignitate de nivel mai

scăzut.Lipsa unei bune diferenţieri celulare în ţesutul neoplazic este denumită prin termenul

anaplazie.Celulelor canceroase le lipseşte funcţionalitatea normală,şi de asemenea nu mor la

acelaşi termen cu celulele normal diferenţiate ale aceluiaşi organ sau sistem.Apar modificări

ale funcţionalităţii şi caracteristicilor acestor celule,cum ar fi alterări ale inhibiţiei de

contact,lipsa adeziunii celulare,defecte ale comunicării intercelulare,exprimarea unor antigeni

tisulari modificaţi sau elaborarea de enzime care facilitează şi participă la procesele de invazie

şi metastazare[2,3].

Page 8: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 1 Fiziopatologia neoplaziilor

4

Inhibiţia de contact reprezintă oprirea procesului de creştere celulară când două celule

de tipuri diferite intră în contact.Aceasta nu se aplică insă şi la celulele neoplazice,care cresc

indiferente la contactul cu ţesuturile înconjurătoare sănătoase.Celulele tumorale produc

antigeni care nu sunt sintetizaţi în mod normal de către celulele corpului uman,aceşti antigeni

putând fii folosiţi ca şi markeri tumorali.În cadrul tumorilor se produc anumite enzime(în

special proteaze şi glicozidaze) care au rolul de a degrada matricea extracelulară şi de a o

dezorganiza favorizând astfel procesul de invazie tumorală[1,5].

Tumorile maligne au proprietatea de a creşte prin infiltrarea şi invazia ţesuturilor

înconjurătoare.Datorită lipsei unei clare demarcaţii între tumoră şi ţesuturile sănătoase

înconjurătoare extirparea lor prin metode chirurgicale este mult îngreunată[22].

Prin termenul de metastază se înţelege dezvoltarea unei tumori secundare la distanţă

de tumora primară.Metastaza prezintă multe din caracteristicile tumorii în care şi-a avut

originea.Este astefel posibil să determinăm localizarea tumorii primare prin intermediul

caracteristicilor celulare ale metastazelor date de aceasta.Metastazarea are loc prin intermediul

circulaţiei limfatice şi sanguine.Astfel,în cazul în care metastazarea are loc prin intermediul

căii limfatice celulele tumorale invadează la început ganglionii limfatici situaţi proximal de

localizarea primară.O dată ajunse în circulaţie unele celule canceroase se ataşează la elemente

figurate sanguine din fluxul sanguin,formănd emboli tumorali.După aceea celulele trebuie să

părăsească sistemul circulator,să strabată matricea extracelulară pentru a pătrunde în ţesutul

ţintă.O dată ajunse în ţesutul ţintă celulele neoplazice secretă factorul angiogenetic tumoral

care ajută la apariţia vaselor de neoformaţie în tumoră[2,6,9].

Rata creşterii atât în ţesuturile normale cât şi în cele canceroase depinde de numărul de

celule care trec prin ciclul celular sau se divid la un moment dat,durata ciclului celular şi

numărul de celule care sunt pierdute prin moarte celulară comparativ cu cele care sunt

produse.Numărul celulelor tumorale angajate la un moment dat în ciclul celular este de obicei

foarte mare comparativ cu situaţia celulelor normale.Durata ciclului celular la celulele

canceroase nu este sesizabil mai scăzută decăt la celulele obişnuite,însă moartea celulelor

canceroase nu are loc programat.Există un procentaj foarte mare de celule neoplazice care

sunt active în cadrul ciclului celular,celulelor tumorale lipsidu-le factorul de creştere care le-

ar opri în faza de repaos a ciclului celular(G0)[3,5].

Fracţia de creştere într-un ţesut reprezintă numărul celulelor în diviziune supra

numărul celulelor în stare de rapaos.Timpul de dublare reprezintă perioada de timp necesară

dublării numărului de celule din respectivul ţesut.Cu cât este fracţia de creştere mai mare cu

atât mai scurt este timpul de dublare.În momentul în care celulele normale ating vârsta adultă

Page 9: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 1 Fiziopatologia neoplaziilor

5

este atins un echilibru între naşterea şi moartea celulară.În schimb celulele canceroase îşi

continuă diviziunea până când creşterea le este inhibată de lipsa unei circulaţii

corespunzătoare şi a nutrienţilor.O tumoră este de obicei imposibil de detectat până când nu

îşi dublează volumul de 30 de ori şi conţine mai mult de un miliard de celule.După 35 de

dublări de volum populaţia de celule tumorale atinge 1 trilion,număr în general suficient

pentru a ucide organismul gazdă[9].

Din punct de vedere clinic,manifestările iniţiale ale cancerului se referă la locaţia

primară a afectiunii.Creşterea tumorală afectează vasele sanguine cauzând apariţia de

ulceraţii,necroze,sângerări care pot evolua până la hemoraguii.De exemplu în cancerul

colorectal un prim semnal de alarmă este apariţia scaunelor sanguinolente.În celulele

canceroase se produc adeseori toxine şi enzime care au proprietatea de a distruge ţesuturile

din jur,afectând de asemenea şi procesele de vindecare tisulară[1].

Prin invazia structurilor înconjurătoare şi prin creşterea lor necontrolată,tumorile

comprimă adesea structurile adiacente,ca de exemplu diferite viscere sau vase sanguine.În

stadiile avansate cancerele devin dureroase,managmentul durerii fiind o problemă esenţială în

terapia formelor incurabile şi terminale de neoplazii[21].

De-alungul creşterii şi dezvoltării tumorale apar tulburări ale metabolismului

glucidic,lipidic şi proteic.Astfel,în multe tipuri de neoplazii apare caşexia,adică scăderea

accentuată în greutate ce apare însoţita de pierderi ale ţesutului grăsos şi scădere a nivelului

proteinelor din organism.Caşexia nu poate fi explicată doar prin reducerea poftei de mâncare

şi tulburări ale analizatorului gustativ care însoţesc neoplaziile şi sunt uneori accentuate şi de

tratamentele de care au parte pacienţii.Se pare că este vorba de anumiţi factori produşi fie de

tumora malignă,fie de organismul gazdă care acţionează fie direct asupra centrilor

hipotalamici ai saţietăţii sau în mod indirect prin lezarea unor ţesuturi care astfel eliberează

substanţe anorexigene.Prima citokină asociată pierderilor metabolice a fost caşectina,care mai

târziu s-a dovedit a avea aceeaşi structură ca şi factorul de necroză tumorală(TNF),o citokină

secretată de către macrofage ca şi răspuns la proliferarea tumorală.TNF acţionează asupra

centrilor saţietăţii şi suprimă secreţia de lipoprotein-lipază,enzimă care ajută la eliberarea

acizilor graşi din lipoproteine,astfel încât acesteaacţionează asupra centrilor saţietăţii şi

suprimă secreţia de lipoprotein-lipază,enzimă care ajută la eliberarea acizilor graşi din

lipoproteine,astfel încât acestea să poată fi utilizate de ţesuturi,prin aceste efecte Tnf având un

rol puternic anorexigen.O altă citokină secretată de macrofage,interleukina-1(IL-1) are şi ea

abilitatea de a contribui la iniţierea caşexiei[2,11,12].

Page 10: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 1 Fiziopatologia neoplaziilor

6

Pe lăngă semnele şi simptomele pe care boala canceroasă le produce în situl de origine

şi în organele unde apar determinări secundare mai apar manifestări ale cancerului în zone

care nu sunt direct afectate de neoplazie,aceste manifestări fiind de o mare diversitate şi

purtând numele generic de sindroame paraneoplazice[4].

Carcinogeneza se referă atât la aspectele moleculare ale apariţiei şi multiplicării

celulelor neoplazice cât şi la dezvoltarea şi răspândirea prin organism a masei

tumorale.Cancerele nu au cum să aibă o singură cauză ci mult mai probabil apar ca efect al

interacţiunii dintre diferiţi factori carcinogenetici sau ca efect al expunerii repetate la un

anumit agent carcinogenetic.Au fost descoperiţi şi studiaţi multiplii factori de risc ai

cancerului,care ar putea avea un rol cauzal în declanşarea bolii,constituindu-se diferite teorii

patogenetice ale neopalaziilor[1,3,20].

1.2Teorii patogenetice în neoplazii.

Referitor la neoplazii există în medicina actuală numeroase teorii care încearcă să

lămurească apariţia şi răspândirea acestor afecţiuni,unele dintre cele mai grave şi

controversate patologii cu care se confruntă omenirea în această eră[6].

Dintre factorii de risc,care au un rol deosebit de important în iniţierea apariţiei

cancerelor au fost menţionate vârsta,factorul genetic,ereditatea,factorii carcinogeni chimici şi

ambientali,viruşii cu rol în oncogeneză şi defectele imunologice[5].

Marea majoritate a neoplaziilor(76%)apar la persoane cu vârsta de la 75 de ani în

sus.În Statele Unite ale Americii se estimează o dublare a cazurilor de cancer până în 2050

datorită îmbătrânirii populaţiei[1].

Variabilitate în incidenţa şi prognosticul cancerelor se întâlneşte şi referitor la

rasă,zonă geografică sau nivel socio-economic.Factorii de mediu,precum şi expunerea la

diferite toxine şi alţi factori referitori la dietă au o contribuţie evidentă,deşi încă incomplet

explicată în oncogeneză[2].

1.2.1 Factorul genetic în apariţia neoplaziilor.

Cauzele majorităţii cancerelor rămân necunoscute,însă cercetările în domeniul

biologiei moleculare au început să deceleze căi complexe care duc la creşterea celulelor

canceroase,a tumorilor şi metastazarea.S-au descoperit legături între proliferarea celulară

anormală şi mutaţii ale unor secvenţe de ADN care duc la expresia anormală a

Page 11: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 1 Fiziopatologia neoplaziilor

7

protooncogenelor sau la deleţia unor gene supresoare tumorale.Majoritatea tumorilor prezintă

diferite anormalităti cromozomiale cum ar fi deleţii,inversaţii,translocaţii sau duplicaţii[5,7].

Achiziţia unei singure mutaţii genetice nu poate să transforme celule normale în celule

canceroase,această transformare părând să necesite activarea mai multor gene independente

mutante.Proto-oncogenele sunt importante pentru o creştere şi proliferare normală a celulelor

organismului sănătos.Ele sunt implicate în procesul de oncogeneză prin apariţia unei mutaţii

la nivelul ţesutului ţintă,aceasta transformând proto-oncogena în oncogenă[17,18].

Anti-oncogenele au rolul de a opri proliferarea celulară în cadrul tumorilor.În

momentul în care aceste celule sunt inactivate dispare semnalul genetic care inhibă

proliferarea cauzând astfel debutul creşterii neregulate a celulei.Una din genele supresoare ale

cancerului care a fost identificată este gena p53,localizată pe braţul scurt al cromozomului

17.Mutaţia acestei gene este implicată în dezvoltarea neoplaziilor pulmonare,de sân şi

colon.De asemenea gena p53 pare să fie iniţiatoarea apoptozei celulelor tumorale afectate de

radio- şi chimioterapie[14].

Transformare celulelor normale în celule canceroase trece prin trei stadii-

iniţierea,promoţia şi progresia.Iniţierea implică dozele necesare ale unui agent

carcingenetic,care acţionând asupra celulelor le face susceptibile la transformarea

malignă.După acţiunea acestui agent carcinogenetic schimbările în genomul celulei sunt

ireversibile.Promoţia cuprinde inducerea unei creşteri neregulate şi accelerate ale celulelor

trecute prin faza de iniDupă acţiunea acestui agent carcinogenetic schimbările în genomul

celulei sunt ireversibile.Promoţia cuprinde inducerea unei creşteri neregulate şi accelerate ale

celulelor trecute prin faza de iniţiere prin intermediul diferitelor substanţe chimice şi a unor

factori de creştere.Celulele care au trecut prin faza ireversibilă de iniţiere pot parcurge faza de

promoţie chiar şi după perioade foarte lungi de latenţă.Unii carcinogeni chimici sunt numiţi

carcinogeni compleţi deoarece pot să iniţieze precum să şi promoveze transformarea

neoplazică.În faza de progresie celulele tumorale îşi însuşesc schimbări ale fenotipului care le

permit să aibă capacitatea de a invada,de a metastaza şi de a prezenta o dezvoltare autonomă

şi o crescută instabilitate la nivelul cariotipului[8,9,10].

1.2.2 Ereditatea în patogeneza cancerelor.

O predispoziţie ereditară a fost descoperită în aproximativ 50 de tipuri de cancer.De

exemplu cancerul de sân are o importantă componentă ereditară,apărând mult mai frecvent la

femei care au mai avut cazuri în familie.Procentul de pacienţi oncologici care mai au o rudă

Page 12: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 1 Fiziopatologia neoplaziilor

8

de gradul 1 afectată de boală este de 10%,la cei care au doi membrii ai familiei afectaţi este de

15%,iar la cei cu trei membrii ai familiei bolnavi procentul urcă la 30%.În cazul femeilor de

peste 65 de ani cu istoric familial de cancer de sân riscul urcă până la 50%[7,19].

Există unele tipuri de cancer care se transmit prin mecanism autozomal dominant.De

exemplu,predispoziţia pentru retinoblastom este transmisă prin acest tip de

mecanism.Ameninţarea genetică în retinoblastom este ridicată,95% dintre purtătorii genei

dezvoltând cel puţin o formaţiune tumorală.Un alt exemplu de acest fel este reprezentat şi de

polipoza adenomatoasă familială a colonului,în care gena este de asemenea transmisă prin

mecanism autozomal dominant.La aceşti pacienţi se pot dezvolta sute de polipi

adenomatoşi,unii dintre aceştia evoluând inevitabil către malignitate[10].

1.2.3 Agenţi carcinogeni chimici

Din cele peste şase milioane de elemante chimice identificate până în ziua de azi se

estimează că mai puţin de 1000 au fost examinate pentru a li se descoperi eventualul caracter

carcinogen.Agenţi chimici carcinogeni pot fi împărţiţi în două grupe,direcţi şi indirecţi.Cei

direcţi nu necesită activere pentru a deveni carcinogeni,în timp ce ceilalţi cunoscuţi ca şi

procarcinogeni sau iniţiatori sunt capabili de carcinogeneză doar după conversia

metabolică.Din aceste substanţe chimice se formează specii cu reactivitate crescută,care

acţionează asupra materialului genetic al celulei ţintă cauzând mutaţii ale celulei sau alterări

în sinteza de enzime şi proteine de structură modificând replicarea celulei.Acţiunea agenţilor

carcinogeni este augmentată de anumite substanţe numite promoteri,care singure nu ar avea

efect carcinogen,dar astfel uşurează acţiunea carcinogenilor propriu-zişi prin creşterea sintezei

de ADN,accelerând dezvoltarea materialului genetic şi dăunând bunei comunicări

intercelulare[11,13].

Fumul de ţigară conţine atât procarcinogeni cât şi elemente promotoare,fiind direct

asociat cu cancerele de laringe şi pulmonar şi contribuind la apariţia cancerelor

esofagiene,pancreatice,renale ale colului uterin şi vezicii urinare.Anumite elemente din

dietă,ca de exemplu anumite hidrocarburi policiclice sunt transformate în agenţi carcinogeni

dacă sunt gătite prin refolosirea uleiului.[13]

Page 13: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 1 Fiziopatologia neoplaziilor

9

Cancerul de colon se asociază cu un consum ridicat de grăsimi,proteine şi carne de vită

împreună cu un consum deficitar de fibre .O dietă bogată în grăsimi creşte nivelul acizilor

biliari primari din materiile fecale.Aceştia sunt transformaţi de flora bacteriană a colonului în

acizi biliari secundari,care par a fii promoteri tumorali[14].

Efectele procarcinogene ale elementelor chimice sunt de obicei dependente de

doză,crescând direct proporţional cu doza şi timpul de expunere.Unii agenţi chimici pot

acţiona în colaborare cu alţi carcinogeni,cum ar fi radiaţiile ionizante sau viruşii.În general

trec undeva înter 5 şi 30 de ani de la momentul expunerii la agentul cancerigen şi până la

apariţia propriu-zisă a bolii[14].

1.2.4 Efectele radiaţiilor ionizante.

Efectele acestui tip de agenţi carcinogeni au fost foarte bine investigate la

supravieţuitorii atacurilor cu bombe atomice de la Hiroshima şi Nagasaki.Cele mai răspândite

neoplazii la acestă populaţie au fost leucemiile şi epitelioamele maligne,rata mortalităţii

leucemiei la supravieţuitorii atacurilor nucleare fiind de 30 de ori mai ridicată decât valorile

normale[13,16].

Tipul de cancer care se dezvoltă ca urmare a acţiunii radiaţiilor ionizante depinde de

doza de radiaţii,de sexul persoanei şi de vârsta la care a avut loc iradierea.Perioada dintre

momentul expunerii şi aparitia neoplaziei este în relaţie cu vârsta individului.De exemplu

dacă un copil este expus radiaţiilor înainte de naştere,acesta prezintă un risc crescut de a

dezvolta leucemii în primii 2,3 ani de viaţă,perioada de latenţă crescând la 5-10 ani în cazul

expunerii postnatale[8,11]

Asocierea între expunerea directă la radiaţiile solare şi cancerele de piele este

cunoscută de mai bine de 100 de ani.Efectele razelor ultraviolete este aditiv şi trece o lungă

perioadă de timp între expunere şi momentul în care cancerul poate să fie diagnosticat[13].

1.2.5 Virusurile oncogenice.

Virusurile sunt mici particule conţinătoare de material genetic(ADN sauARN) care

pătrund în celula gazdă unde se încorporează în materialul genetic al acesteia.O mare parte a

Page 14: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 1 Fiziopatologia neoplaziilor

10

virusurilor au fost relaţionate cu producerea de neoplazii la animale,însă la om puţine au putut

fi incriminate de participare în carcinogeneză.Printre acestea se numără virusul

papilloma(HPV),virusul Epstein-Barr(EBV),virusul hepatitei B(HBV) şi virusul leucemiei cu

limfocite T de tip 1(HTLV-1)[16].

Există mai mult de 60 de tipuri diferite de HPV,din punct de vedere genetic.Unele din

acestea s-au dovedit a fii implicate în producerea cancerului de col uterin.Este vorba de HPV

tip 16 şi 18 şi mai rar tipurile 31,33,35 şi 51.Ele au fost descoperite în 85% din cazurile de

cancer scuamos de col şi precursori ai acestuia(displazia severă şi carcinomul in situ)[16]..

EBV,membru al familiei virusurilor herpetice ezuri este implicat în producerea a patru

tipuri de neoplazii:limfom Burkitt,cancer de nazofaringe,limfomul cu limfocite B la

imunosuprimaţi şi în unele cazuri de limfom Hodgkin[1]

HBV,agentul etiologic al hepatitei B este implicat şi în apariţia cirozei şi a

carcinomului hepatocelular.Mecanismul exact prin care virusul contribuie la apariţia

carcinomului nu a putut fi încă decelat însă se pare că este un rezultat al distrugerii şi

regenerării prelungite a ficatului produse prin acţiunea HBV[1]

1.2.6 Implicarea sistemului imunitar în oncogeneză

Există tot mai multe dovezi care certifică participarea sistemului imunitar în lupta

împotriva răspândirii cancerului în organism.Imunoterapia este folosită pentru a augmenta

răspunsul imun general al pacientului şi asfel a creşte distrugerea ţesutului tumoral[18].

Dezvoltarea neoplaziilor ar putea fi asociată cu deficienţe ale sistemului

imunitar,cum ar fi de exemplu la pacienţii cu boli care afectează imunitatea(SIDA asociată cu

apariţia sarcomului Kaposi) sau la cei care au organe transplantate şi primesc tratament

imunosuprimant[21].

Practic capacitatea de a eradica celulele canceroase este prezentă la toate celulele

componente ale sistemului imunitar,aici menţionând limfocitele T şi B,anticorpii,macrofagele

şi celulele NK.Limfocitele T sunt direct implicate în uciderea celulelor tumorale şi de

asemenea au rolul de a activa celelalte componente ale sistemului imunitar[22,23].

Page 15: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 1 Fiziopatologia neoplaziilor

11

Un sistem imunitar slăbit uşurează procesele de creştere şi răspândire ale tumorilor în

organism[22].

1.3 Fiziopatologia cancerului de colon

Cancerul de colon reprezintă a doua cauză de mortalitate prin neoplazii în Statele

Unite ale Americii.Marea majoritate a cancerelor de colon sunt adenocarcinoame,care tind să

formeze fie mase tumorale voluminoase fie leziuni de formă inelară,constrictive[23].

Aproximativ 85% dintre cancerele colorectale prezintă pierderea funcţiei uneia sau

mai multor antioncogene(p53,APC sau DCC) prin apariţia diferitelor mutaţii spontane

asociate cu instabilitate cromozomială şi aneuploidie.Un procent de 15% din cazuri apar la

pacienţii cu instabilitate microsatelită,datorită inactivării genelor reparatoare ale ADN-

ului.Marea majoritate a cazurilor apar la pacienţi cu vârsta peste 50 de ani,vârful de incidenţă

apărând în jurul vârstei de 70 de ani[25].

Factorii ereditari sunt implicaţi în producerea a 20-30% din totalul cancerelor

colorectale.Riscul este proporţional cu numărul şi vârsta rudelor de gradul 1 bolnave de

cancer de colon[24,27].

În cazul pacienţilor suferinzi de afecţiuni inflamatorii intestinale,cum ar fi rectocolita

ulcerohemoragică sau boala Crohn riscul de apariţie a cancerului apare la 7-10 ani după

declanşarea bolii inflamatorii.Tratamentul cu agenţi 5-ASA şi folaţi este asociat cu o scădere

a riscului de neoplazie la aceşti pacienţi[26,30].

Un important factor de risc în cancerul colorectal este prezenţa polipozelor

ereditare,respectiv polipoza familială,sindromul Gardner,sindromul Turcot,pacienţii cu aceste

tipuri de afecţiuni prezentând risc crescut de apariţe a neoplasmului şi sindromul Peutz-

Jeghers,cu un risc moderat[23,28].

Adenocarcinoamele de colon prezintă o creştere lentă şi pot fi prezente perioade lungi

de timp fără a fi detectate,deoarece rămân asimptomatice.Unele dintre tumorile acestea pot fi

totuşi detectate prin apariţia de sângerări oculte în materiile fecale.Simtomele depind de

localizarea carcinomului.În cazul prezenţei neoplaziei pe colonul drept,hemoragiile cronice

Page 16: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 1 Fiziopatologia neoplaziilor

12

pot să producă anemie feriprivă,manifestă prin oboseală şi slăbiciune.Obstrucţia în acest caz

este rar întâlnită,datorită diametrului crescut al colonului drept şi a consistenţei lichide a

materiilor fecale care îl străbat.Uneori pot apărea dureri abdominale necaracteristice,dar

prezenţa acestora nu este raportată decât de o parte a pacienţilor,alţii fiind complet

asimptomatici[33,34]

Leziunile colorectale stângi sunt adesea circumferenţiale,inelare.Deoarece aici

diametrul intestinal este mai scăzut iar consistenţa materiilor fecale este mai tare,apar

simptome obstructive,însoţite de durere abdominală colicativă şi uneori de modificări

semnificative ale defecaţiei obişnuite a pacientului.Perioadele de constipaţie alternează de

multe ori cu perioade în care este prezentă diareea.În scaune se poate observa sânge

uneori,dar nu se produc de obicei sângerări însemnate cantitativ,putându-se constata prezenţa

sângelui doar la suprafaţa scaunului[31,32]

Cea mai frecventă clasificare a cancerelor rectale este clasificarea Duke[2](tabelul I).

Tabelul I-Clasificarea Duke a cancerelor colorectale

Pacienţii cu boala în stadiile Duke A şi B pot fii trataţi eficient chirurgical.

Cancerele rectale mai pot fi clasificate şi prin intermediul clasificării TNM[2](tabelul

II).

Tabelul II-Clasificarea T M a cancerelor colorectale

Stagiu Clasificare T M

I T1-2, N0, M0

IIA T3, N0, M0

IIB T4, N0, M0

IIIA T1-2, N1, M0

IIIB T3-4, N1, M0

IIIC T(oricare), N2, M0

IV T(oricare), N(oricare), M1

Page 17: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

13

Capitolul 2

Oxidul nitric

Page 18: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 2 Oxidul nitric

14

2.Oxidul nitric

2.1Sinteza oxidului nitric.

Oxidul nitric(NO) este prezent în multe ţesuturi ale organismului uman,unde acţionează

ca moleculă de semnalizare,asigurând reglarea multor procese fiziopatologice.Sinteza oxidului

nitric se face din molecula aminoacidului l-arginină cu ajutorul enzimelor din familia

sintetazelor oxidului nitric(NOS)(fig 2.1.1)[35].

Aceste enzime(NOS) convertesc l-arginina în citrulină,în urma procesului rezultând oxid

nitric.Oxigenul şi NADPH-ul sunt cofactori necesari procesului[37,43].

Figura 2.1.1-Sinteza oxidului nitric

2.2 Acțiunea �OS

2.2.1Structura �OS

Proteina NOS funcţională este un dimer format din două subunităţi identice.Fiecare

subunitate conţine câte 3 domenii-domeniul reductazei,domeniul ligandului de calmodulină şi

domeniul oxigenazei[36,41].

Domeniul reductazei conţine FAD şi FMN şi are rolul de a transfera electroni de la

NADPH la domeniul oxigenazei de pe subunitatea opusă a dimerului[41].

Legarea calmodulinei este necesară pentru activitatea tuturor tipurilor de NOS,deoarece

detectează modificările nivelului calcemic intracelular,funcţia sa exactă fiind însă diferită la

fiecare din cele trei izoforme de NOS(fig 2.2.1-Structura generală a NOS)[48].

Page 19: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 2 Oxidul nitric

15

Domeniul oxigenazei conţine situsul de legare al tetrahidrobiopterinei,hemului şi

argininei,şi catalizează conversia l-argininei la citrulină şi NO[39].

Figura 2.2.1-Structura generală a �OS

2.2.2 �O-sintetazele(�OS)

NOS sunt un grup de enzime care efectuează sinteza oxidului nitric din atomul de

nitrogen terminal al l-argininei,în prezenţa oxigenului şi a cofactorilor NADPH(nicotinamid-

adenin-dinucleotid-fosfat),FAD(flavin-adenin-dinucleotid),FMN(flavin-mononucleotid),hem şi

tetrahidrobioptrină[35].

NOS au fost descoperite în 1980 de către Furchgott,şi de atunci se clasifică în:

-NOS neuronală(NOS1)

-NOS inductibilă(NOS2)

-NOS endotelială(NOS3)

Cele trei izoforme ale NOS prezintă unele diferenţe legate de funcţia individuală a

fiecăreia.Reglarea transcripţională şi post-transcripţională a activităţii catalitice este distinctă

pentru fiecare dintre izoforme[41].

Page 20: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 2 Oxidul nitric

16

n�OS(�OS1)

Enzima nNOS este prezentă în sistemul nervos central şi periferic şi în muşchii

scheletici.Deşi nNOS este considerată a fi o enzimă constitutivă,exprimarea ei este influenţată de

către anumiţi stimuli psihologici,ca de exemplu stresul[38].

Sintetaza neuronală a oxidului nitric este asociată cu proteina post-sinaptică de

densitate(PSD-95) la nivelul membranei neuronale.Ca răspuns la creşterea nivelului de calciu

intracelular nNOS reacţionează cu calmodulina[48].Complexul calciu-calmodulină,în combinaţie

cu BH4 se leagă de nNOS,inducându-i acesteia translocaţia către citoplasmă.Defosforilarea

nNOS prin calcineurină iniţiază producţia de oxid nitric.NO activează apoi guanilil-ciclaza şi

diferitele reacţii reglate de către cGMP(fig 2.2.2-acţiunea nNos).nNOS este apoi inactivată de

către proteinkinaza A sau C prin fosforilare[38].

Figura 2.2.2-acţiunea n�os

i�OS(�OS2)

Această izoformă a fost iniţal izolată din citoplasma macrofagelor unde activitatea ei

apărea ca răspuns la unii stimuli cum ar fi acţiunea endotoxinelor sau a citokinelor

proinflamatorii.Acum enzima a fost descoperită ca exprimându-se într-un număr mare de celule

ale organismului[39,43].

Page 21: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 2 Oxidul nitric

17

La nivelul macrofagelor NO este generat de iNOS,ca urmare a expunerii la anumite

citokine cum ar fi de exemplu interferonul(IFN).Receptorii pentru IFN transmit semnalul prin

intermediul JAK(Janus kinaze) şi STAT(transductori de semnal şi activatori ai transmisiei).După

activarea STAT asociaţi aceştia trec printr-un proces de translocaremajungând la nucleu unde

cresc expresia factorului de transcripţie IRF-1 care se leagă de regiunea din ADN-ul celular cu

rol de promoter al iNOS,pentru a creşte exprimarea respectivei gene.iNOS nu este dependentă de

creşterea nivelului de calciu intracelular pentru a se putea activa(Figura 2.2.3-activarea iNOS

(11).Gena iNOS se află sub control transcripţional,care este influenţat de mecanisme de control

care influenţează stabilitatea mARN,degradarea proteinelor,translaţia şi disponibilitatea

substraturilor şi cofactorilor.Oxidul nitric produs de către macrofage este o moleculă efectoare cu

rolul de a ucide sau inactiva celulele ţintă[40,44].

În anumite patologii avem de-a face cu o supraproducţie de NO prin intermediul

iNOS,ca de exemplu în şocul septic.Excesul de NO duce la scăderea severă a presiunii arteriale

şi disfuncţii ale unor organe.Având atât rol de imunomediator cât şi de moleculă efectoare oxidul

nitric poate avea şi efecte benefice cât şi efecte dăunătoare,în funcţie de circumstanţe[47].

Figura 2.2.3-Activarea i�OS

Page 22: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 2 Oxidul nitric

18

e�OS(�OS3)

Enzima eNOS se găseşte în endoteliul vascular,în cardiomiocite şi în epiteliul

pulmonar,la nivelul membranei bazale a microtubulilor ciliari[36].

În vasele de sânge NO produs prin intermediul eNOS are rol de vasodilatator,reglând

fluxul sanguin şi presiunea arterială,în timp ce la nivel cardiac influenţează contractilitatea[45].

Calmodulina legată este necesară pentru activarea eNOS,iar legarea ei are loc la

creşterea concentraţiei de calciu intracelular.Cercetări recente au relevat rolul esenţial al eNOS în

procesele de angiogeneză şi vasculogeneză(de novo)[51,62].

În sistemul cardiovascular eNOS are un rol protector.De asemenea eNOS are un rol de

protecţie faţă de ischemia cerebrală,păstrând fluxul sanguin cerebral.În ateroscleroză şi

inflamaţii,concentraţia scăzută de NO previne moartea prin apoptoză a celulelor

endoteliale,astfel contribuind la păstrarea integrităţii endoteliului[45,52].

2.3 Efecte fiziologice ale oxidului nitric.

Pe lângă efectul cunoscut de a produce vasodilataţie,oxidul nitric mai are şi alte efecte

fiziologice în organism.Este vorba de implicarea în apoptoză,rolul în relaţie cu sistemul

imunitar,sistemul nervos,relaxarea muşchiilor netezi,angiogeneză şi sarcină[44,45,46].

2.3.1 Rolul imunitar al �O.

Macrofagele activate prin acţiunea citokinelor pot produce oxid nitric în concentraţie

mare pentru ca acesta să acţioneze asupra celulelor ţintă,cum ar fi de exemplu celulele tumorale

sau bacteriile.Oxidul nitric acţionează în celulele ţintă prin interacţiunea cu ciclul

Krebs,întrerupând sinteza ADN-ului şi perturbând funcţia mitocondriilor[49].

2.3.2 Acţiunea asupra musculaturii netede.

NO relaxează musculatura netedă a tractului gastrointestinal,astfel contribuind la buna

desfaşurare a mişcărilor peristaltice intestinale.Deficitul de oxid nitric la acest nivel este implicat

Page 23: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 2 Oxidul nitric

19

în anumite afecţiuni care se manifestă prin lisa peristaltismului normal,ca de exemplu boala

Hirschprung,achalazia, sau pseudoobstrucţia cronică intestinală[44,45].

Oxidul nitric are rol de inhibitor al contracţiei la nivelul musculaturii uterine.Astfel,la

apropierea momentului naşterii,secreţia de NO scade[48].

2.3.3 Oxidul nitric şi inflamaţia

Inflamaţia în vasele de sânge este inhibată prin acţiunea NO produs de eNOS de a opri

exocitoza de mediatori ai inflamaţiei din celulele endoteliale.Exocitoza din alte tipuri de

celule,cum ar fi limfocitele T ar putea să fie şi ea blocată prin intervenţia NO[47].

Oxidul nitric poate acţiona şi ca mediator în anumite procese inflamatorii,prin stimularea

efectelor ciclooxigenazelor şi stimularea producţiei de eicosanoizi pro-inflamatorii.Anumiţi

factori cu implicare în procesul inflamator,cum sunt interferonul gamma,interleukinele,alfa-TNF

şi LPS(factor de virulenţă bacterian proinflamator) pot stimula producţia de NO prin intermediul

iNOS[47].

2.3.4 �O şi efetele sale asupra sistemului nervos.

La nivelul sistemului nervos,oxidul nitric are rolul de transmiţător de semnal al

neuronilor nonadrenergici şi noncolinergici.În accidentele vasculare se pare că prezenţa de NO

în exces contribuie la afectarea neuronală ce apare ca şi consecinţă a AVC[42].

Unii neuroni parasimpatici de tip motor folosesc şi ei NO ca şi neurotransmiţător,mediind

probabil acţiunile NO care influenţează erecţia sau peristaltismul intestinal[48].

Hemoglobina transportă NO deodată cu oxigenul,descărcarea lor în ţesuturi având loc

simultan.Celulele medullei oblongata reacţionează în cazul scăderii severe a aportului de

oxigen,datorită sensibilităţii lor la oxidul nitric,cauzând o respiraţie cu frecvenţă si amplitudine

mărite[49].

S-au efectuat studii experimentale pe animale de laborator pentru a se vedea ce efect are

oxidul nitric asupra creierului.S-a demonstrat astfel legătura dintre NO şi stimularea receptorilor

NMDA implicaţi în învăţare şi memorare.La nivelul sinapselor NO poate să îşi augmenteze

efectul,deorece eliberarea sa într-o sinapsă afectează şi sinapsele din vecinătate.La şobolanii

Page 24: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 2 Oxidul nitric

20

cărora le-au fost inoculaţi inhibitori ai NOS s-au văzut încetiniri ale achiziţiei răspunsului

condiţionat[50].

2.3.5 Importanţa �O în uciderea germenilor patogeni

NO contribuie la uciderea agenţilor patogeni în lizozomii macrofagelor.La şoarecii cărora

le-a fost sistată abilitatea de a sintetiza NO în macrofage s-a descoperit creşterea susceptibilităţii

la infecţii produse de bacterii intracelulare.Celulele t-helper de tip 1 au proprietatea de a secreta

oxid nitric[62].

Bacteriile comensale din faringe transformă nitraţii ingeraţi prin hrană în nitriţi.În

stomac,cu ajutorul sucului gastric din aceşti nitriţi este generat NO,care distruge aproape în

totalitate bacteriile din hrană[64,65].

2.3.6 �O şi longevitatea

Atât deficienţa cât şi excesul de oxid nitric sunt dăunătoare bunei funcţionari a

organismului,având implicări în multiple stări patologice.Tonusul vascular este influenţat

puternic de nivelul oxidului nitric,un deficit în acest sens fiind asociat hipertensiunii.Funcţia

endotelială anormală are şi ea printre manifestări un nivel scăzut al NO,iar această disfuncţie

endotelială apare în patologiile aterogene:hipertensiune,diabet zaharat,hiperlipidemii[47].

Nitraţii exogeni sunt folosiţi în terapia afecţiunilor coronariene.Este vorba de

nitroglicerină,isosorbid dinitrat şi mononitrat,sau nitroprusiat care sunt toate metabolizate în oxid

nitric.Din punctul de vedere al aparatului respirator oxidul nitric poate fi folosit în tratamentul

hipertensiunii pulmonare persistente a nou-născutului,la concentraţii de 10-40 ppm.De

asemenea şi-ar putea demonstra utilitatea în tratamentul vasoconstricţiei pulmonare din hernia

diafragmatică concenitală,hipertensiunea pulmonară primară sau sindromul de detresă

respiratorie.Trebuie însă acţionat cu grijă deoarece inhalarea NO în concentraţii mai mari poate

fii toxică[39].

Page 25: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 2 Oxidul nitric

21

În concluzie,oxidul nitric a fost demonstrat a fii un transmiţător endogen care îndeplineşte

diferite roluri fiziologice.Asta în ciuda faptului că pentru mult timp oxidul nitric a fost considerat

a fi un produs nociv de combustie[48].

Se efectuează în prezent cercetări privitoare la reglarea secreţiei de NO şi a sintetazelor

sale(NOS),iar concluziile acestora ar trebui să ducă la completarea cunoştinţelor referitoare la

rolul jucat de oxidul nitric în patogeneza a diferite afecţiuni.Studiul oxidului nitric se poate

dovedi eficient şi în înţelegerea rolului jucat de alte micromolecule ce funcţionează ca

biotransmiţători[37].

2.4 Implicarea oxidului nitric în fiziopatologia neoplaziilor.

Toate cele trei tipuri de NOS au fost detectate în celulele tumorale în cursul diverselor

studii,dar rolul oxidului nitric în biologia tumorală nu este încă nici pe departe complet

elucidat[46].

Dintre efectele oxidului nitric activitatea citotoxică a acestuia şi participarea la

neoformaţia vasculară au importanţă în biologia neoplaziilor.Angiogeneza este un proces de

maximă importanţă pentru creştere şi dezvoltarea neoplaziilor,în timp ce efectul citotoxic al

oxidului nitric poate contribui la eradicarea celulelor tumorale care apar în organism[46].

Cercetările efectuate au relvat atât efecte de promovare cât şi efecte inhibitorii asupra

dezvoltări cancerelor.Mutaţiile antioncogenei p53 au efecte adverse asupra organismului gazdă

prin creşterea producţiei de NO.Există şi o ipoteză conform căreia oxidul nitric ar induce mutaţii

ale oncogenelor myc şi p21 iar astfel ar ajuta la progresia tumorală[61,63].

Însă s-au descoperit şi efecte antitumorale al NO,care ar produce moartea celulelor

tumorale prin citotoxicitatea sa.Mecanismele posibil implicate în acest proces sunt afectarea

directă a ADN-ului,inhibarea sintezei de ADN,inhibiţia ribonucleotid-reductazei şi alte efecte

toxice intracelulare[67].

Prima formă de NOS implicată în uciderea celulelor canceroase mediată de macrofage a

fost iNOS.iNOS a fost detectată mai ales în macrofagele peritumorale şi intratumorale.De

asemenea eNOS a fost descoperită în cancerul de sân invaziv.Este posibil ca oxidul nitric generat

prin activarea eNOS să contribuie la supravieţuirea celulelor neoplazice în diferite condiţii de

Page 26: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 2 Oxidul nitric

22

stres,ca de exemplu hipoxia.Prezenţa oxidului nitric şi a NOS a mai fost demonstrată şi în cazul

altor localizări,de exemplu:carcinomul ductal,de colon,de creier,al capului şi gâtului,carcinomul

cu celule renale,cancerul esofagului,pulmonar,de vezică,prostată,gastric sau cel cu localizare

ginecologică[59].

Cercetările în domeniul cancerului de cap şi gât s-au concentrat pe carcinomul epitelial

scuamos din această localizare.Cercetările lui Rosbe au demonstrat prezenţa izoformelor de NOS

la acest carcinom,iar Brennan a descoperit o exprimare crescută a iNOS în aceste tumori.Gallo a

efectuat cercetări pe acelasi tip de carcinom,concluzionând existenţa unui rol important al iNOS

generator de NO pentru angiogeneza tumorală şi de aemenea şi pentru metastazare[59].

Expresia diferitelor NOS este crescută atât în tumori benigne(adenom pleomorf) cât şi în

tumori maligne(adenocarcinoame).În cancerul oral invaziv s-a sugerat existenţa unui rol al iNOS

în transformarea malignă al displaziei epiteliale[59].

În cancerul colorectal s-a constatat o creştere a exprimării iNOS în comparaţie cu

mucoasa normală,existând de asemenea o corelaţie între acest nivel crescut al iNOS şi

metastazarea tumorei.Cercetările lui Ahn şi Oshima au demonstrat o relaţie cauză-efect specifică

între creşterea exprimării genei pentru iNOS şi cancerul colorectal.Tumorile derivate din

adenocarcinoame colorectale modificate în laborator pentru a produce continuu oxid nitric au o

vascularizaţie evident mai bogată şi sunt mai invazive decât celelalte[23,25].

În legătură cu neoplaziile,oxidul nitric prezintă aşadar un caracter dual.Această moleculă

are atât rol de promoţie tumorală cât şi de inhibiţie a dezvoltării neoplaziei.Se pare că apariţia

unuia sau altuia dintre aceste efecte este în relaţie directă cu concentraţia NO[59].

La concentraţii crescute oxidul nitric inhibă creşterea şi proliferarea tumorală,în timp ce

prezenţa unor concentraţii scăzute ale oxidului nitric creşterea cancerului este stimulată[61].

Supraproducţia de NO endogen ar cauza citotoxicitate la nivelul tumorei,ar induce

apoptoza celulelor canceroase şi ar avea rol de prevenţie a angiogenezei tumorale.În schimb

oxidul nitric produs în microambientul tumorei,în concentraţie mult mai mică,joacă un rol

important în angiogeneza tumorală şi dilatarea vaselor de sânge care deservesc tumora[61].

Page 27: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 2 Oxidul nitric

23

Reglarea creşterii tumorii,care se poate face fie de către oxidul nitric însuşi,precum şi

printr-un inhibitor al producerii sale ar putea aduce beneficii utile pentru eficienţa terapiei

anticancerose[59,64].

Page 28: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

24

Capitolul 3

Evaluarea sintezei de oxid nitric și a

stresului oxidativ în tumorile rectale

Page 29: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

25

3.1 Scopul studiului

Interesul pentru studiul stresului oxidativ a crescut exponențial în ultimele două

decade,unul dintre motive fiind acela că efecele speciilor reactive ale oxigenului sunt duale,pe

de o parte benefice iar pe de altă parte dăunătoare.

Efectele benefice sunt determinate de implicarea speciilor reactive de oxigen în

fiziologia celulară ca răspuns la hipoxie.Efectele nocive ale speciior reactive de oxigen sunt

determinate de către producerea lor în exces,ceea ce induce leziuni moleculare și celulare.

În condiții fiziologice,efectele nocive sunt contracarate de către acțiunea substanțelor

cu rol antioxidant.

În condiții patologice,cel mai studiat efect al speciilor reactive ale oxigenui este efectul

mutagen,deoarece acesta poate să fie un bioindicator al carcinogenezei.Una dintre etapele

critice ale oncogenezei este reprezentată de către mutațiile survenite în ADN.Se pare că

leziunile oxidative ale ADN sunt legate de inițierea transformărilor maligne.

Un alt mecanism de implicare a speciilor reactive ale oxigenului în cancerogeneză este

reprezentat de către implicarea lor în semnalizare,pe calea proliferării celulare.

În concluzie,leziunile,mutațiile și alterarea expresiei genice din ADN reprezintă

procese cheie în fiziopatologia cancerogenezei.

Stresul oxidativ este implicat de asemenea și în tratamentul neoplaziilor,prin

toxicitatea indusă în timpul radioterapiei.

Având toate acestea în vedere,studiul de față și-a propus determinarea unor parametrii

de stres oxidativ la pacienții cu cancer colorectal operat,înainte și după tratamentul combinat

constând în radioterapie și chimioterapie,pentru a evalua dacă acești parametri pot să fie

utilizați ca parametri de screening în monitorizarea postchirurgicală.

3.2 Materiale şi metode

3.2.1 Grupurile de studiu

Sângele recoltat pe anticoagulant EDTA a fost a fost centrifugat la 5000g X min, timp

de 10 minute. Supernatantul a fost prelevat şi păstrat la -80°C până la citirea probelor.

Pacienţii incluşi în grupul de studiu au fost selectaţi pe baza criteriilor de includere

respeciv de excludere:

Page 30: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

26

Criterii de includere:

- pacienţi diagnosticaţi cu cancer gastric confirmat la Institutul Oncologic

Profesor Doctor I. Chiricuţă, Cluj Napoca, în stadiul postoperator.

- pacienţi care au urmat radioterapie şi chimioterapie; radioterapia s-a efectuat

folosind acceleratorul liniar în doze de 50 Gray administrate în 25 de fracţiuni

şi chimioterapia a constat în administrarea de acid folinic şi 5 fluoro-uracil

- consimţământul informat al pacienţilor de a fi incluşi în lotul de studiu

- acordul Comisiei de Etică al Universităţii de Medicină şi Farmacie „Iuliu

Haţieganu”, Cluj Napoca

Criterii de excludere:

- cancer colorectal inoperabil

- refuzul pacienţilor de a participa în studiu

- boli sistemice grave ( colagenoze, hepatite cronice, ciroze, insuficienţă renală,

insuficienţă cardiacă, deficite imune)

- alte tipuri de neoplazii

- tratamente ce pot influenţa stressul oxidativ şi sinteza de oxid nitric

Conform acestor criterii au fost selecţionaţi 30 de pacienţi.

3.2.2 Reactivii folosiţi.

Sulfat de amoniu feros, orto-dianisidin dihidroclorhidrat ( 3-3V-dimetoxibenzidina,

analogol hidrosolubil al vitaminei E ( Trolox; 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcroman-2-acid

carboxilic) a fost de la Sigma-Aldrich Chemical Co. Toate chimicalele au fost de grad ultra

pur şi s-a folosit reactiv de tip I apă deionizată.

Trolox-ul a fost dizolvat în tampon de fosfat ( 10mm, pH 7,4 ).Xylenol orange [ o-

cresosulfonftaleina-3,3-bis (metiliminodiacetat de sodiu )], diclorhidrat de orto dianisidină (

3-3'-dimetoxibenzidină), sulfat feros de amoniu, hidrogen peroxid ( H2O2), acid sulfuric, acid

clorhidric, glicerol, au fost achiziţionate de la Sigma Co. Şi Meck Co. Toate chimicalele au

fost de grad ultra pur şi s-a folosit reactiv de tip I apă deionizată.

Page 31: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

27

3.2.3 Determinarea nitriţilor

Serul, prelevat de la pacienţi, a fost deproteinizat înainte de analiza metabolitului NO.

Deproteinizarea s-a făcut cu un amestec de metanol/dietileter. După deprotenizare serul a fost

centrifugat 10 minute la 5000 Xg şi supernatantul a fost utilizat pentru determinarea nitriţilor

şi nitraţilor serici.

Nivelurile de nitrat/nitrit au fost măsurate folosind metoda Griess. Pe scurt, 100µl de

VCl3 au fost adăugaţi la 100µl de probă, urmată imediat de adăugarea reactivului Griess (

50µl sulfanilamidă + 50µl dihidroclorid de etilendiamină). După ce au fost ţinute 30-45 min la

temperatura camerei, la întuneric, a fost măsurată absorbţia la 540nm cu ajutorul unui

spectrofotometru (CECIL 3021). [ ] Calcularea concentraţiei de nitriţi şi nitraţi s-a făcut

utilizând o curbă standard obţinută prin diluţii succesive de nitrit de sodiu şi s-a exprimat în

milimol/L.[68]

Curba standard pentru nitriți

Page 32: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

28

3.2.4 Determinarea răspunsului antioxidativ total (TAR).

Principiul metodei

O soluţie standard a unui complex de Fe2+ şi o-dianisidină reacţonează cu o soluţie

standard de hidrogen peroxid ( H2O2) printr-o reacţie de tip Fenton, rezultând ionul OH-.

Acesta oxidează moleculele de o-dianisidină la culoarea galben-maronie a radicalilor

dianisidil la pH scăzut[69].

Reacţia de oxidare progresează între radicalii dianisidil şi se dezvoltă în continuarea

reacţii de oxidare. Antioxidanţii din probe supresează reacţiile de oxidare şi formarea culorii.

Aceste reacţii pot fi monitorizate prin spectrofotometrie(tabel III)[69].

Reactivii metodei:

Reactivul 1

Soluţia Clark şi Lubs ( 75 mM, pH 1,8 ) a fost preparatăî după cum urmează: 5.591 g

de KCl a fost dizolvată în 1000 ml de apă deionizată (concentraţia finală a fost de 75 mM).

Gradul de reactiv de reactiv acid clorhidric ( 36,5%, 6,41 ml) a fost diluat cu 1000 ml cu apă

deionizată ( concentraţie finală, 75mM).

Soluţia preparată de KCl (800 ml) a fost amestecată cu 200 ml soluţie de HCl sub un

pH metru (pH final, 1,8). Diclorhidratul de ortodianisidină (3,17 g) a fost dizolvat în această

soluţie (concentraţia finală a fost de 10.0 mM), şi ulterior 0.01764 g de Fe(NH4)2(SO4)2-6H2O

a fost dizolvat în această soluţie (concentraţia finală, 45 AM). (ATENŢIE: o-dianisidina este o

substanţă demonstrată toxică şi carcinogenetică. Asiguraţi-vă că folosiţi mănuşi de cauciuc şi

purtaţi mască facială ţn momentul manipulării acestei substaţe.).

Reactivul astfel preparat a fost folosit ca Reactiv 1 în textul testului. Acest reactiv este stabil

pentru cel puţin 6 luni la 4°C.

Reactivul 2

Soluţia de hidrogen peroxid (7,5 mM) a fost preparată dupa cum urmează: 0,641 ml

soluţie de H2O2 comercială (35%, Merck) a fost diluată în 1000 ml cu soluţie Clarck and

Page 33: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

29

Lubs. Concentraţia de hidrogen peroxid a fost confirmată spectrofotometric prin absorbţie la

240nm. Această soluţie este stabilă pentru cel putin 1 lună la 4°C.

Tabelul III

Volumul

reactivului 1

800 µl [reactiv 1: o-dianisidină(10 mM),ionul feros (45 AM) în

soluţia Clarck şi Lubs (75 mM, pH 1,8)]

Volumul

probei

29 µl (ser sau alte fluide, pure sau soluţii de complexe de

antioxidanţi)

Volumul

Reactivului 2

40 µl [reactivul 2: H2O2 (7,5 mM) în soluţia Clarck şi Lubs]

Lungimea de undă 444 nm

Punctul de citire

Măsurarea la punctul de sfârşit. Prima absorbţie este luată inainte

amestecarea R1 cu R2 (ca probă control) şi ultima absorbţie este

luată când reacţia ajunge la o linie de platou (aproape 3-4 min după

amestecare)

Tipul de calibrar Linear

Rezultatele se exprimă raportat o curbă standard trasată cu diluţii consecutive de trolox

(milimol trolox Equiv./L).

Curba standard trasată cu trolox

Page 34: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

30

3.2.5 Determinarea statusului oxidativ total .

Principiul metodei:

Oxidanţii prezenti în probe oxidează complexul ion feros-o-dianisidină la ion feric. Reacţia de

oxidare este consolidată de moleculele de glicerină, care sunt prezente din abundenţă în

mediul de reacţie. Ionul feric formează un complex colorat cu xylenol orange într-un mediu

acid. Intensitatea culorii, care poate fi determinată spectrofotometric(tabel IV), este legată de

cantitatea totală de molecule de oxidanţi prezente în probe. Evaluarea se calibrează cu apă

oxigenată şi rezultatele se exprimă în unităţi micromolare de echivalenţi/litru de apă oxigenată

(µmol H2O2 Equiv./L)[69].

Reactivii folosiţi:

Reactivul 1

Reactivul 1 a fost preparat prin dizolvarea 114 mg de xylenol orange şi 8,18 g de NaCl în 900

mL de soluţie de H2SO4, ,25 mM. 100 ml de glicerol au fost adăugaţi în soluţie. Reactivul

final a fost compus din 150 µM xilenol orange, 140 mM NaCl şi 1,35 M glicerol. Valoarea

pH-ului reactivului este stabilă cel puţin 6 luni la 4 grade Celsius..

Reactivul 2

Reactivul 2 a fost preparat prin dizolvarea a 1,96 g de sulfat de amoniu feros şi 3,17 g de

diclorhidrat de o-dianisidină în 1000ml de soluţie de H2SO4, 25 mM. Reactantul final a fost

constituit din 5 mM sulfat de amoniu feros şi 10 mM diclorhidrat de o-dianisidina. Acest

reactiv este stabil pentru cel puţin 6 luni la temperatura de 4 grade Celsius.

Page 35: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

31

Tabel IV

Volumul

reactivului 1

900µl (reactivul 1: xilenol orange 150µM, NaCl 140 mM şi glicerol 1,35

M în 25 mM de soluţie de H2SO4 , pH 1,75)

Volumul

probei

140 µl (ser sau alte fluide, pure sau soluţii de complexe de antioxidanţi)

Volumul

reactivului 2

44 µl (reactivul 2: ion feros 5mM şi 10 mM o-dianisidina în 25 mM de

soluţie de H2SO4

Lungimea de

undă

Principala lungime de undă 560 nm, secundara lungime de undă 800 nm

(Biocromatic)

Punctul de citire

Măsurarea la punctul de sfârşit. Prima absorbţie este luată inainte

amestecarea R1 cu R2 (ca probă control) şi ultima absorbţie este luată

când reacţia ajunge la o linie de platou (aproape 3-4 min după amestecare)

Tipul de

calibrare

Linear

3.2.6 Indicele de stres oxidativ.

Un alt parametru calculat a fost OSI(indicele de stres oxidativ).Acesta se calculează

făcând raportul dintre capacitatea oxidativă totală și capacitate antioxidativă

totală(TOS/TARx100)[69].

3.2.7 Analiza statistică.

Toate rezultatele au fost exprimate ca medii ± SEM. Comparaţia loturilor a fost

efectuată cu testul ANOVA. O valoare p mai mică decât 0.05 a fost considerată a fi

semnificativă. Analiza corelaţiilor dintre parametrii s-a realizat cu testul Pearson.

Analiza statistica a fost relizată cu programul SPSS 18.0[69].

Page 36: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

32

3.3 Rezultate. 3.3.1 Analiza demografică a pacienților.

În lotul de studiu au fost selecționți conform criteriilor de includere/excludere treizeci

de pacienți cu cancer colorectal operat dintre care treisprezece au fost femei iar șaptesprezece

bărbați.Pentru fiecare parametru studiat grupul a fost subîmpărțit în funcție de sex și categorii

de vârstă.

Deși numărul paciențiilor din subgupe nu a fost statistic semnificativ,fiind sub 30 de

pacienți/subgrupă,am făcut o analiză preliminară și a acestor subgrupe.(Tabel 3.1)

Tabel 3.1 Datele demografice ale lotului de studiu TOTAL FEMEI/BĂRBAȚI Nr pacienți total 30 13/17 40-50 ani 6 2/4 50-60 ani 7 3/4 60-70 ani 11 3/8 70-80 ani 6 2/4

3.3.2 Analiza generală a lotului de studiu.

La pacienții din grupul de studiu,statusul oxidativ total(TOS) a scăzut foarte

semnificativ după tratamentul combinat,radioterapie și chimioterapie(p˂0,01)(fig 3.3.1).

Page 37: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

33

Statusul oxidativ total

0

50

100

150

200

250

300

TOS1 TOS2

mic

rom

oliH

2O

2e

qu

iv./L

p<0,001

Figura 3.3.1 Statusul oxidativ total

Răspunsul antioxidativ total(TAR) al pacienților din studiu nu a fost influențat

semnificativ de către terapia combinată(p˃0,05)(fig 3.3.2).

Răspunsul antioxidativ total

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

TAR1 TAR2

mil

imo

li T

rolo

x E

qu

iv./

L

p>0,05

Figura 3.3.2 Răspunsul antioxidativ total

Page 38: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

34

La pacienții din lotul de studiu indicele de stres oxidativ(OSI) a scăzut semnificativ

după tratament(p˂0,001,fig 3.3.3)

Indicele de stres oxidativ

0

2

4

6

8

10

12

14

16

OSI1 OSI2

p<0,001

Figura 3.3.3 Indicele de stres oxidativ

Oxidul nitric total

102

104

106

108

110

112

114

116

GRIESS1 GRIESS2

mic

rom

oli

/L

p<0,01

Figura 3.3.4 Oxidul nitric total

Page 39: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

35

Cantitatea de nitriți și nitrați serici ai paciențiilor din studiu au scăzut semnificativ

după radioterapie și chimioterapie(p˂0,001)(fig 3.3.4).

Corelațiile dintre cei trei parametri au fost nesemnificative atât înainte cât și după

tratament(r²˂0,5).

3.3.3 Analiza sublotului de femei

La grupul de femei din studiu statusul oxidativ total a scăzut foarte

semnificativ(p˂0,001)(fig 3.3.5).

Status oxidativ total-feminin

0

50

100

150

200

250

300

350

TOS1 TOS2

mic

rom

oli

H2O

2E

q./

L

p<0,001

Figura 3.3.5 Statusul oxidativ total la femei

La femeile din grupul de studiu,răspunsul antioxidativ total nu s-a modificat

semnificativ(p˃0,05)(fig 3.3.6).

Page 40: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

36

Răspuns antioxidativ total feminin

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

TAR1 TAR2

mm

oli

Tro

lox e

q./

L

p>0,05

Figura 3.3.6 Răspusul antioxidativ total la sexul feminin

În cazul pacienților din sublotul de sex feminin nivelul indicelui de stres oxidativ a

înregistrat o scădere semnificativă(p˂0,001,fig 3.3.7)

Cantitatea totală de nitrați și nitrați la pacienții de sex feminin a crescut ușor după

tratamentul combinat radioterapie și chimioterapie(p˂0,05)(fig 3.3.8).

Page 41: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

37

Indicele de stres oxidativ-feminin

0

5

10

15

20

25

OSI1 OSI2

p<0,001

Figura 3.3.7 Indicele de stres oxidativ-feminin

Oxidul nitric total-feminin

107,5

108

108,5

109

109,5

110

110,5

111

111,5

112

112,5

113

GRIESS1 GRIESS2

mic

rom

oli

/L

p<0,05

Figura 3.3.8 Oxidul nitric total la sexul feminin

Page 42: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

38

Corelații semnificative s-au sesizat doar înainte de tratament între statusul oxidativ

total și cantitatea totală de nitrați și nitriți(r²=-0,77).

3.3.4 Analiza sublotului de bărbați

La sublotul de bărbați statusul oxidativ total a scăzut foarte semnificativ după

tratamentul combinat radioterapie și chimioterapie.(p˂0,001)(fig 3.3.9)

Statusul oxidativ total-masculin

0

50

100

150

200

250

300

350

TOS1 TOS2

mic

rom

oli

mo

li H

2O

2 E

q/L

p<0,001

Figura 3.3.9 Statusul oxidativ total la bărbați

Răspunsul antioxidativ total nu a prezentat modificări semnificative din punct de

vedere statistic la pacienții de sex masculin participanți la studiu.(p˃0,05)(fig 3.3.10).

La pacienții de sex masculin indicele de stres oxidativ(OSI) s-a diminuat semnificativ

după tratamentul combinat radioterapie și chimioterapie(p˂0,001,fig 3.3.11).

Page 43: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

39

Raspunsul antioxidativ total-masculin

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

TAR1 TAR2

mm

oli

Tro

lox E

q/L

p>0,05

Figura 3.3.10 Răspunsul antioxidativ total la bărbați

Indicele de stres oxidativ-masculin

0

2

4

6

8

10

12

14

osi1 osi2

p<0,001

Figura 3.3.11 Indicele de stres oxidativ-masculin

Page 44: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

40

În ceea ce privește cantitatea de nitriți și nitrați s-a înregistra o reducere ușoară a

cantității acestora după tratamentul combinat.(p˂0,05)(fig 3.3.12).

Oxidul nitric total-masculin

0

20

40

60

80

100

120

140

GRIESS1 GRIESS2

mic

rom

oli

/L

p<0,05

Figura 3.3.12 Oxidul nitric total la bărbați

Nu au existat corelații semnificative între cei trei parametri la sublotul de bărbați,nici

înainte și nici după tratament.( r²˂0,5).

Page 45: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

41

3.3.5 Analiza pe grupe de vârstă

3.3.5.1 Grupa 40-50 de ani

La pacienții cu vârste cuprinse între 40 și 50 de ani statusul oxidativ total a scăzut

semnificativ după efectuarea tratamentului combinat(p˂0,001)(fig 3.3.13).

Răspunsul antioxidativ total nu a prezentat modificări semnificative după tratament la

pacienții cu vârstele cuprinse în intervalul 40-50 de ani(p˃0,05)(fig 3.3.14).

Status oxidativ total 40-50 ani

0

100

200

300

400

500

600

TOS1 TOS2

mic

rom

oli

H2O

2 E

q/L

Figura 3.3.13 Statusul oxidativ total 40-50 de ani

Page 46: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

42

Raspuns antioxidativ total-40-50 ani

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

TAR1 TAR2

mm

oli

Tro

lox E

q/L

.

p>0,05

Figura 3.3.14 Răspuns antioxidativ total 40-50 de ani

În cazul pacienților făcînd parte din grupa de vârstă 40-50 de ani am avut de-a face cu

un nivel semnificativ mai scăzut al indicelui de stres oxidativ(OSI)(p˂0,001)(fig 3.3.15)

Indicele de stres oxidativ 40-50 ani

0

5

10

15

20

25

30

osi1 osi2

p<0,001

Figura 3.3.15 Indicele de stres oxidativ la 40-50 de ani

Page 47: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

43

Oxidul nitric total-40-50 ani

0

20

40

60

80

100

120

140

GRIESS1 GRIESS2

mic

rom

oli

Eq

/L. p<0,05

Figura 3.3.16 Oxidul nitric total 40-50 de ani

Nitriții și nitrații au înregistrat o creștere ușor semnificativă la această categorie de

vârstă.(p˂0,05)(fig 3.3.16)

În ceea ce privește corelațiile dintre parametri înainte de tratament acestea au fost

nesemnificative din punct de vedere statistic(r²˂0,5),iar după tratament între TOS și

TAR(r²=0,84) și între TAR și GRIESS(r²=0,68) corelațiile au fost semnificative.

3.3.5.2 Grupa 50-60 de ani

La pacienții cuprinși în studiu a căror vârstă a fost cuprinsă între cincizezi și șaizeci de

ani statusul oxidativ total a prezentat o scădere ușor semnificativă după tratamentul

oncologic.(p˂0,05)(fig 3.3.17).

Răspunsul antioxidativ total nu a prezentat modificări semnificative la această grupă

de vârstă după tratamentul combinat radioterapie și chimioterapie(p˃0,05)(fig 3.3.18).

Page 48: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

44

Statusul oxidativ total 50-60 ani

0

50

100

150

200

250

TOS1 TOS2

mic

rom

oli

H2O

2 E

q/L

.

p<0,05

Figura 3.3.17 Statusul oxidativ total 50-60 de ani

Raspunsul antioxidativ total 50-60 ani

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

TAR1 TAR2

mm

oli

Tro

lox E

q/L

.

p>0,05

Figura 3.3.18 Răspunsul antioxidativ total 50-60 de ani

Pacienții din grupa de vârstă 50-60 de ani au prezent din punct de vedere al indicelui

de stres oxidativ o scădere semnificativă din punct de vedere statistic(p˂0,01)(fig 3.3.19).

Page 49: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

45

Indicele de stres oxidativ 50-60 ani

0

2

4

6

8

10

12

OSI1 OSI2

p<0,01

Figura 3.3.19 Indicele de stres oxidativ 50-60 de ani

Oxidul nitric total 50-60 ani

108,4

108,45

108,5

108,55

108,6

108,65

108,7

GRIESS1 GRIESS2

mic

rom

oli

/L. p>0,05

Figura 3.3.20 Oxidul nitric total 50-60 de ani

În cazul acestei categorii de vârstă nitriții și nitrații totali nu au prezentat modificări

semnificative din punct de vedere statistic.(p˃0,05)(fig 3.3.20).

Page 50: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

46

Din punct de vedere al corelațiilor,acestea nu au fost semnificative înainte de

tratament(r²˂0,5).După tratament însă TOS și TAR(r=0,6) și GRIESS și TAR(r²=-0,6) s-au

corelat ușor semnificativ.

3.3.5.4 Grupa 60-70 de ani

La pacienții aparținând grupei de vârstă 60-70 de ani statusul oxidativ total a prezentat

o scădere foarte semnificativă după tratamentul combinat(p˂0,001)(fig 3.3.21).

La aceiași pacienți răspunsul antioxidativ total nu a prezentat modificări

importante(p˃0,05)(fig 3.3.22).

Statusul oxidativ total 60-70 ani

0

50

100

150

200

250

TOS1 TOS2

mic

rom

oli

H2O

2 E

q/L

Figura 3.3.21 Statusul oxidativ total 60-70 ani

Page 51: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

47

Raspunsul antioxidativ total 60-70 ani

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

TAR1 TAR2

mm

oli

Tro

lox E

q/L

.

p>0,05

Figura 3.3.22 Răspunsul antioxidativ total 60-70 de ani

La pacienții din încadrați în categoria 60-70 de ani indicele de stres oxidativ(OSI) a

prezentat o scădere semnificativă(p˂0,01)(fig 3.3.23)

Indicele de stres oxidativ 60-70 de ani

0

2

4

6

8

10

12

14

OSI1 OSI2

p<0,01

Figura 3.3.23 Indicele de stres oxidativ 60-70 de ani

Page 52: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

48

Oxidul nitric total 60-70 ani

102

104

106

108

110

112

114

116

118

GRIESS1 GRIESS2

mic

rom

oli

/L.

p<0,05

Figura 3.3.24 Oxidul nitric total 60-70 de ani

Cantitatea de nitiți și nitrați serici la această grupă de vârstă a scăzut ușor semnificativ

din punct de vedere statistic după terapie.(p˂0,05)(fig 3.3.24).

La grupa de vârstă 60-70 de ani corelațiile au fost nesemnificative din punct de vedere

statistic atât înainte cât și după tratament(r²˂0,5).

3.3.5.4 Grupa 70-80 de ani

În cazul pacienților din lotul de studiu cu vârsta cuprinsă între 70 și 80 de ani statusul

oxidativ total s-a modificat foarte semnificativ după tratamentul oncologic,prezentând o

importantă scădere(p˂0,001)(fig 3.3.25).

Cu privire la răspunsul antioxidativ total putem afirma că acesta nu a prezentat

modificări semnificative după terapie.(p˃0,05)(fig 3.3.26).

Page 53: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

49

Statusul oxidativ total 70-80 ani

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

TOS1 TOS2

mic

rom

oli

H2O

2 E

q/L

.

p<0,001

Figura 3.3.19 Statusul oxidativ total 70-80 de ani

Raspunsul antioxidativ total 70-80 ani

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

TAR1 TAR2

mm

oli

Tro

lox E

q/L

.

p>0,05

Figura 3.3.20 Răspunsul antioxidativ total 70-80 de ani

Page 54: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

50

În ceea ce privește grupa de vârstă 70-80 de ani,pacienții aparținând aici au prezentat

un nivel semnificativ scăzut al indicelui de stres oxidativ(OSI)(p˂0,01)(fig 3.3.27)

Indicele de stres oxidativ 70-80 ani

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

OSI1 OSI2

p<0,01

Figura 3.3.27 Indicele de stres oxidativ 70-80 ani

Oxidul nitric total 70-80 ani

0

20

40

60

80

100

120

140

160

GRIESS1 GRIESS2

mic

rom

oli

/L. p>0,05

Figura 3.3.28 Oxidul nitric total 70-80 de ani

Nitriții și nitrații totali nu s-au modificat semnificativ la categoria de vârstă peste 70 de

ani în urma terapiei combinate(p˃0,05)(fig 3.3.28).

Page 55: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

51

Înainte de terapia combinată radioterapie și chimioterapie au existat corelații

semnificative statistic între TOS și GRIESS(r²=-0,92).După tratamentul combinat au existat

corelații între GRIESS și TAR(r²=0,79).

3.4 Discuții

Rezultatele obținute în urma studiului efectuat au relevat faptul că statusul oxidativ

total a prezentat o scădere semnificativă după asocierea tratamentului combinat radioterapie și

chimioterapie la tratamentul chirurgical.Având în vedere faptul că rolul TOS este de a aprecia

în ansamblu toți produșii oxidați ca urmare a stresului oxidativ,scăderea TOS reprezintă un

indice global de reducere a stresului oxidativ,fără a ne oferi indicații particulare asupra

componentei specifice care a determinat această scădere[74].

Este important de semnalat faptul că scăderea TOS a fost prezentă la toți pacienții care

au fost luați în studiu,indiferent de modul în care au fost aceștia grupați ,indiferent de grupa

de sex sau vârstă din care au făcut parte[77].

Datele din literatură referitoare la implicarea speciilor reactive ale oxigenului în

patologie au evidențiat caracterul dual al acestora în ceea ce privește implicarea lor în

cancerogeneză[77].

Pe de o parte speciile reactive ale oxigenului(ROS) formate intracelular pot să

acționeze ca mesageri secundari care induc și mențin fenotipul oncogenic la nivelul celulelor

de tip canceros[77].

Pe de altă parte,referitor la aceleași specii reactive ale oxigenului s-a constatat că pot

induce apoptoza la nivel celular și astfel pot să aibă și un rol de oprire a proliferării

tumorale[76,77].

Se pare că cele două efecte contradictorii ale speciilor reactive ale oxegenului în relație

cu proliferarea tumorală depind de balanța ROS și momentul în care are loc acțiunea lor

raportat la stadiul oncogenezei[77].

Page 56: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

52

S-a constatat că o creștere a stresului oxidativ raportată la momentul oncogenezei

poate să determine cel puțin trei tipuri de răspuns.O creștere ușoară a stresului oxidativ poate

avea un efect adjuvant asupra proliferării tumorale.Dacă apare o creștere moderată este

posibilă apariția mutagenezei,iar o creștere marcată a stresului oxidativ poate produce un efect

de stimulare a apoptozei și a necrozei celulare(fig3.4.1)[77].

Figura 3.4.1 .ivelul SO în relație cu oncogeneza[77]

Principalele mecanisme identificate ca având o implicare în efectul procarcinogen al

speciilor reactive ale oxigenului ar fi prima dată efectul mutagen care este produs prin

modificări produse de ROS la nivelul ADN.Pe lângă efectul mutagen pe ADN speciile reacive

ale oxigenului(ROS) mai acționează și prin reacții cu speciile reactive ale azotului(RNS).Din

aceste reacții se formează peroxinitriții,care la rândul lor sunt impicați în modificări la nivelul

ADN producând mutații[74].

Page 57: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

53

Speciile reactive ale oxigenului mai sunt de asemenea implicate în carcinogeneză prin

reacția de peroxidare a lipidelor.Odată trecute prin acest proces,lipidele peroxidate pot avea și

ele efect mutagen.Acesta este practic un efect mutagen indirect al ROS[77].

Pe lângă aceste mecanisme prin care ROS sunt implicate în oncogeneză mai există

implicări ale stresului oxidativ și în etapa terapeutică.Radioterapia poate să fie de asemenea

un mecanism de creștere a producției de specii reactive ale oxigenului la nivel celular[71,72].

S-a constatat că în timpul radioterapiei atât celulele iradiate cât și cele neiradiate suferă

modificări genetice.Printre mecanismele implicate în această patogenie se numără și stresul

oxidativ.Producerea stresului oxidativ secundar tratamentului cancerului prin radioterapie

reprezintă un mecanism cu toxicitate crescută.De aceea,practic scăderea nivelului speciilor

libere ale oxigenului indusă de radioterapie ar putea să fie o metodă de protecție împotriva

efectelor secundare ale radioterapiei[70,71].

Chimioterapia are în general ca efect o creștere a stresului oxidativ cu scopul de a

crește citotoxicitatea.Asocierea dintre chimioterapie și radioterapie poate genera stres oxidativ

în cantități mai mari decât necesar ,ceea ce ar induce leziuni secundare nedorite[72].

Având în vedere toate acestea,evoluția stresului oxidativ înainte și după terapia

combinată radioterapie și chimioterapie la pacienții luați în studiu reprezintă un rezultat

favorabil prin reducerea semnificativă a statusului oxidativ total[74].

Având în vedere că în stresul oxidativ efectul final este dependent de balanța dintre

speciile reactive ale oxigenului și mecanismele antioxidante în cadrul studiului nostru am

evaluat pe lângă statusul oxidativ total și răspunsul antioxidativ total(TAR).În ceea ce privește

efectul răspunsului antioxidativ total în legătură cu cancerul s-a constatat că multe dintre

efectele biologice ale antioxidanților nu sunt legate doar de capacitățile de neutralizare ale

radicalilor liberi,ci sunt determinate de capacitatea antioxidanților de a modula căi de

semnalizare intracelulară[77].

Page 58: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

54

Cele mai importante mecanisme intracelulare modulate de către substanțele

antioxidante în cancer sunt:-reglarea ciclului celular

-inhibarea proliferării neoplazice

-inducerea apoptozei

-inhibarea dezvoltării tumorale și a angiogenezei

-inhibarea inflamației

-stimularea unor enzime de detoxifiere

-blocarea NF-kB[74]

Au fost efectuate studii în cadrul cărora a fost analizată specificitatea anumitor

molecule antioxidante.Astfel cercetările privind superoxid-dismutaza(SOD) au relevat faptul

că aceasta nu are acțiune directă,ci acționează indirect,prin reducerea speciilor reactive de

oxigen(ROS).Alte studii efectuate au evidențiat că antioxidanții cu mobilitate mică sunt însă

direct implicați[77].

Implicarea substanțelor cu efect antioxidant în cancer,deși inițial se considera a avea

un efect antitumoral,s-a constatat că poate să fie și protumorală.Deoarece speciile reactive ale

oxigenului în cantități mari determină apoptoza celulelor tumorale,reducerea ROS prin

administrarea excesivă de antioxidanți poate să stimuleze supraviețuirea celulelor lezate,care

au potențial de proliferare neoplazică.Astfel administrarea substanțelor antioxidante poate să

și stimuleze cancerogeneza,în loc să o blocheze[77].

Din toate acestea putem trage concluzia că antioxidanții pot să fie utili sau nocivi,în

funcție de mai mulți factori.Acești factori sunt concentrația în care se administrează

substanțele antioxidante,mediul în care are loc acțiunea lor și stadiul evolutiv al

cancerogenezei[74].

Din acest motiv am considerat foarte util și chiar necesar să determinăm și răspunsul

antioxidativ total(TAR) la pacienții incluși în studiu[74,77,79].

Page 59: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

55

Faptul că în cadrul rezultatelor obținute la toți pacienții nu s-a înregistrat o modificare

semnificatică a răspunsului antioxidativ total după tratamentul combinat radioterapie și

chimioterapie,având în vedere că statusul oxidativ total a înregistrat o scădere remarcabilă

rezultatul obținut poate fi considerat unul favorabil[74].

În același timp acest rezultat ne permite să afirmăm că scăderea statusului oxidativ

total nu s-a realizat prin acțiunea de neutralizare a speciilor reactive ale oxigenului(ROS) de

către substanțele cu rol antioxidant[79].

Am considerat util să calculăm și valoarea indicelui de stres oxidativ(OSI) pentru lotul

general de studiu,precum și pentru subcategoriile în care au fost împărțiți pacienții în funcție

de sex și vâstă[80].

Scăderea indicelui de stres oxidativ după tratament la grupul total,precum și la

celelalte subgrupe în funcție de sex și vârstă confirmă faptul că stresul oxidativ(SO) s-a redus

semnificativ postterapeutic[80].

Având în vedere implicarea stresului oxidativ în patologie(inclusiv în fiziopatologia

cancerelor colorectale) acest rezultat reprezintă un element pozitiv în evoluția

postterapeutică[80].

O altă moleculă implicată prin intermediul stresului oxidativ,dar și prin acțiune directă

în patologia cancerului este și oxidul nitric.(NO).Rolul oxidului nitric în modificarea

supraviețuirii tumorale este o temă destul de controversată[23,32,25,73].

S-a constatat că efectul moleculei de oxid nitric depinde de:- concentrația acesteia

-localizare

-momentul secreției

-tipul celular

-statusul redox al celulei

Concluzia generală a fost însă că cele mai importante sunt modificările post-

translaționale induse de oxidul nitric și că oxidul nitric poate să fie un factor reglator atât în

cancerogeneză cât și în chimioterapia neoplaziilor[73].

Page 60: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

56

Aceste date ne-au determinat să asociem la statusul oxidativ total(TOS) și răspunsul

antioxidativ total(TAR) evaluarea sintezei de oxid nitric prin dozarea nitriților și a nitraților

serici.

La pacienții incluși în studiu s-au înregistrat scăderi semnificative a sintezei de oxid

nitric.

În ceea ce privește distribuția pe sexe reducerea sintezei de oxid nitric s-a înregistrat

predominant la sexul masculin.Aceasta se poate atribui faptului că majoritatea cazurilor care

au participat la studiu erau pacienți de sex masculin[32].

Un alt aspect interesant a fost că la pacienții incluși în categoria de vârstă 40-50 de ani

s-a constatat o ușoară creștere a sintezei de oxid nitric,în timp ce la grupa între 60 și 70 de ani

s-a constatat scăderea sintezei de NO.

Aceste rezultate trebuie să le interpretăm cu precauție având în vedere numărul mic de

pacienți incluși în studiu.

Studiile referitore la implicarea oxidului nitric în cancer au relevat aspecte diferite.În

general concentrațiile crescute ale NO produse de expresia crescută a iNOS stimulează

apoptoza[32,34,73].

În cancerul colorectal s-a constatat un deficit de exprimare a iNOS,ceea ce produce o

reducere a apoptozei și prin aceasta favorizează proliferarea tumorală.Pe de altă parte s-a

observat că creșterea sintezei de oxid nitric în celulele endoteliului vascular promovează

angiogeneza,ceea ce ar stimula creșterea tumorală și metastazarea[23,25].

Un alt mecanism indirect prin care este stimulată angiogeneza tumorală este activarea

ciclooxigenazei prin acțiunea peroxinitriților formați în cadrul reacției dintre oxidul nitric și

speciile reactive libere ale oxigenului[73].

Page 61: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

57

Alt aspect particular care a fost constatat în cancerul colorectal a fost faptul că la

pacienți diferiți există nivele diferite de sinteză a oxidului nitric.Acest fapt se datorează

polimorfismului iNOS(NOS inductibilă).Au fost identificate patru feluri de iNOS prezente la

pacienții cu cancer colorectal[23,25].

Aceste constatări pot explica parțial diferențele prezente la lotul luat în studiu,diferențe

legate de sex și respectiv de vârstă[23,25].

Unul din factorii de reglare ai expresiei iNOS este și hypoxia inucible factor-1(HIF-

1).De aceea,în perspectivă.analiza sintezei de oxid nitric în cancerul colorectal ar implica

identificarea atât la nivel tumoral cât și peritumoral al HIF-1,iNOS și COX[81].

O altă consecință a creșterii sintezei de oxid nitric în legătură cu cancerul colorectal

este reprezentat de către efectul pe care molecula de NO o are asupra metaloproteinazelor

matriceale.Aceste enzime au proprieatea de a distruge matricea celulară,prin aceasta

favorizând procesul de metastazare[82].

Având în vedere aceste mecanisme,scăderea sintezei de oxid nitric la pacienții aflați în

studiu reprezintă un alt motiv de apreciere pozitivă,deoarece scăderea nivelului de nitriți și

nitrați ar reduce și distrucția matricei celulare prin acțiunea metaloproteinazelor(MMP)[82].

Page 62: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

58

Concluzii

Pe baza rezultatelor obținute în urma studiului și a datelor din literatură am

ajuns la următoarele concluzii:

1.Terapia combinată radioterapie și chimioterapie aplicată postchirurgical în cancerul

colorectal determină reducerea semnificativă a TOS(statusul oxidativ total),parametru

care cuantifică totalitatea moleculelor oxidate de către speciile reactive ale

oxigenului(ROS).

2.Reducere TOS(statusul oxidati total) nu a fost influențată de sexul sau de vârsta

pacienților.

3.Terapia combinată radioterapie și chimioterapie aplicată după tratamentul

chirurgical în cancerul colorectal nu a modificat semnificativ TAR (răspunsul

antioxidativ total),indiferent de sex sau grupă de vârstă.

4.Faptul că TAR (răspunsul antioxidativ total) nu s-a modificat semnificativ în urma

tratamentului indică faptul că scăderea TOS(statusul oxidativ total) nu s-a datorat

neutralizării ROS (speciilor reactive ale oxigenului )de către AO(antioxidanți).

5.Terapia combinată radioterapie și chimioterapie care a urmat tratamentului

chirurgical al cancerului colorectal a determinat o scădere semnificativă a sintezei de

.O(oxid nitric),ceea ce reprezintă o modificare favorabilă în contextul scăderii

TOS(statusul oxidativ total).

6.Diferențele legate de sex și grupe de vârstă în ceea ce privește sinteza de .O(oxid

nitric) constatată la pacienții din grupul de studiu ar putea să fie explicată parțial prin

existența polimorfismului i.OS.

Page 63: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Capitolul 3 Evaluarea sintezei de oxid nitric și a stresului oxidativ în tumorile rectale

59

7. În ansamblu,rezultatele obținute confirmă faptul că înțelegerea rolului stresului

oxidativ și al oxidului nitric la nivel molecular în cancerul colorectal are implicații

profunde în terapia anticanceroasă,contribuind la un diagnostic și tratament

patogenetic mai complex al acestuia.

Page 64: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Bibiliografie

60

Bibliografie

1.McPhee Stephen J, Papadakis Maxine A.,Tierney Lawrence M., Current Medical Diagnosis

& Treatment 2008, 2007 The McGraw-Hill Lange-oncology

2.Moasser Mark M.,in McPhee Stephen J., Ganong, William F., Pathophysiology of Disease:

An Introduction to Clinical Medicine, 5th Edition, 2006 McGraw-Hill, Neoplasia: 90-114.

3. Ciro M et al: Profiling cancer. Curr Opin Cell Biol 2003;15: 213.

4. DeVita VT et al: Cancer: Principles and Practice of Oncology, 6th ed. Lippincott Williams

& Wilkins, 2001.

5. Eng C et al: Genetic testing for cancer predisposition. Annu Rev Med 2001;52:371.

6. Hanash S: Integrated global profiling of cancer. Nat Rev Cancer 2004;4:638.

7. Mendelsohn J et al: The Molecular Basis of Cancer, 2nd ed. WB Saunders, 2001.

8. Peltomaki P: Deficient DNA mismatch repair: A common etiologic factor for colon cancer.

Hum Mol Genet 2001;10: 735.

9. Trosko J.E.,Ruch R.J., Gap junctions as targets for cancer chemoprevention and

chemotherapy, Curr. Drug Target. 3

(2002) 465–482.

10.Guyton K.Z., Kensler T.W., Oxidative mechanisms in carcinogenesis,

Br. Med. Bull. 49 (1993) 523–544.

11. Ames B.N.,Gold L.S., Too many rodent carcinogens — mitogenesis

increases mutagenesis, Science 249 (1990) 970–971.

12. Trush M.A., Kensler T.W., An overview of the relationship

between oxidative stress and chemical carcinogenesis, Free Rad.

Biol. Med. 10 (1991) 201–209.

13. Hengartner M.O., The biochemistry of apoptosis, Nature 407

(2000) 770–776.

14. Oren M., Decision making by p53: life, death and cancer, Cell Death Differ. 10 (2003)

431–442.

15. Trosko J.E., The role of stem cells and gap junctional intercellular

communication in carcinogenesis, J. Biochem. Mol. Biol.

Page 65: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Bibiliografie

61

36 (2003) 43–48.

16. Trosko J.E., Chang C.C., Madhukar B.V., Dupont E., Oncogenes,

tumor suppressor genes and intercellular communication

in the oncogeny as partially blocked ontogeny hypothesis, in:

O.H. Iversen (Ed.), New Frontiers in Cancer Causation, Taylor

& Francis, Washington, DC, 1993, pp. 181–197.

17. American Cancer Society. Estimated new cancer cases and deaths by sex for all sites,

United States, 2000 (table).. Accessed March 13, (2001).

18. Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Edited by Johns Hopkins University and

developed for the World Wide Web by the National Center for Biotechnology Information

(NCBI), OMIM#137215.

19. Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Edited by Johns Hopkins University and

developed for the World Wide Web by the National Center for Biotechnology Information

(NCBI), OMIM*192090.

20. FERRI FRED F. , 2008 Ferri's Clinical Advisor. Instant Diagnosis and Treatment, 2008

MOSBY ELSEVIER, SECTION I

21. Silbernagl Stefan, Lang Florian, Color Atlas of Pathophysiology,2000,14-16

22.Ghidirim Nicolae,Actualităţi în epidemiologia,etiopatogeneza,diagnosticul,tratamentul şi

profilaxia tumorilor maligne.Tratamentul complicaţiilor cancerului gastric.

23.Fransen K. ,Elander N. ,Soderkvist P. ,Nitric oxide synthase 2 (NOS2) promoter

polymorphisms in colorectal cancer , Cancer Letters 225 (2005) 99–103

24.Thomas Hundley R. ,Basil R. , Nitric Oxide-Donating Aspirin Inhibits Colon Cancer Cell

Growth via Mitogen-Activated Protein Kinase Activation , The Journal of Pharmacology and

Experimental Therapeutics (2006) 316:25–34

25.Liu Q., Chan S.T.F. , Ratha M., Nitric oxide induces cyclooxygenase expression and

inhibits cell growth in colon cancer cell lines, Carcinogenesis (2003) vol.24 no.4 pp.637±642

Page 66: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Bibiliografie

62

26.Whitlock E.P., Lin J.S., Liles E., Beil T.L., Fu R. , Screening for Colorectal Cancer: A

Targeted, Updated Systematic Review for the U.S. Preventive Services Task Force, Ann

Intern Med. (2008) ;149:638-658.

27.Hoensch H., Groh B., Edler L., Kirch W., Prospective cohort comparison of flavonoid

treatment in patients with resected colorectal cancer to prevent recurrence, World J

Gastroenterol (2008); 14(14): 2187-2193

28.Abdulkareem F.B., Abudu E.K., Awolola N.A., Elesha S.O.,Rotimi O., Akinde O.R.,

Atoyebi A.O., Adesanya A.A., Daramola A.O., Banjo A.A.F., Anunobi C.C., Colorectal

carcinoma in Lagos and Sagamu, Southwest Nigeria: A histopathological review, World J

Gastroenterol (2008); 14(42): 6531-6535

29.Malila N., Oivanen T., Malminiemi O., Hakama M., Test, episode, and programme

sensitivities of screening for colorectal cancer as a public health policy in Finland:

experimental design, BMJ (2008);337:2261

30.Merlin F., Prochilo T., Tondulli L., Kildani B., Beretta G.D. , Colorectal cancer treatment

in elderly patients: an update on recent clinical studies, Clinical Colorectal Cancer (2008),

Vol. 7, No. 6, 357-363

31.Smith R.A., Cokkinides V., Brawley O.W., Cancer screening in the United States, 2009: a

review of current american cancer society guidelines and issues in cancer screening, CA

CANCER J CLIN (2009);59:27-41

32.Cianchi F., Cortesini C., Fantappie` O., Messerini L., Schiavone N., Vannacci A., Nistri

S., Sardi I., Baroni G., Marzocca C., Perna F., Mazzanti R., Bechi P.,Masini E., Inducible

Nitric Oxide Synthase Expression in Human Colorectal Cancer - Correlation with Tumor

Angiogenesis , American Journal of Pathology, (2003) Vol. 162, No. 3, 793-801

33.Fortes R.C., Recôva V.L., Melo A.L., Novaes M.R.C.G. , Effects of dietary

supplementation with medicinal fungus in fasting glycemia levels of patients with colorectal

cancer: a randomized,double-blind, placebo-controlled clinical study, Nutr Hosp.(

2008);23(6):591-598

Page 67: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Bibiliografie

63

34.Xu W., Liu L.Z, Loizidou M., Ahmed M., Charles I.G., The role of nitric oxide in cancer,

Cell Research (2002); 12(5-6):311-322

35.Nazarewicz R.R.,Zenebe W.J, A. Parihar, S.K. Larson, E. Alidema, J. Choi, P.Ghafourifar,

Tamoxifen induces oxidative stress and mitochondrial apoptosis

via stimulating mitochondrial nitric oxide synthase, Cancer Res. 67 (2007)

1282–1290.

36.Lin S, Fagan K.A, Li K.X, Shaul P.W., Cooper D.M, Rodman D.M, Sustained endothelial

nitric-oxide synthase activation requires capacitative Ca2+ entry. J Biol Chem.2000;275(24):

17979-17985.

37. Van Faassen, E. E.; Vanin, A. F. (eds); ‘Radicals for life: The various forms of Nitric

Oxide.’ Elsevier, Amsterdam 2007.

38. Raines K.W, Cao G.L, Porsuphatana S, Tsai P, Rosen G.M, Shapiro P. Nitric Oxide

inhibition of ERK1/2 activity in cells expressing neuronal nitric-oxide synthase. J Biol Chem.

2004; 279,3933-3940.

39. Miljkovic D, Trajkovic V. Inductible nitric oxide synthase activation by interleukin-17.

Cytokine Growth Factor Rev. 2004;15(1):21-32.

40. Hsieh J.S, Wang J.Y, Lin S.R, et al. overexpression of inductible nitric oxide synzhase in

gastric mucosa of rats with portal hypertension: correlation with gastric mucosal damage. J.

Surg Res. 2003; 115, 24-32.

41. Alderton W.K., Cooper CE, Knowles RG. Nitric oxide synthases: structure, function and

inhibition. Biochem J. 2001 Aud 1; 357(Pt3): 593-615.

42. Zokomori H, Oda M, Ogi M, Kamegaya Y, Tsukda N, Ishii H. Endothelial nitric oxide

synthase and caveolin-1 are co-localized in sinusoidal endothelial fenestrae. Live. 2001 Jun;

21; 198-206.

43.Gong L, Pitari G.M, Schultz S, Waldman S.A. Nitric oxide signaling: systems integration

of oxygen balance in defense of cell integrity. Curr Opin Hematol. 2004; 7-14.

44. Abu-Soud H.M, Hazen S.L. Nitric oxide is a physiological substrate for mammalian

peroxidases. J Bio Chem. 2000;275(48): 37524-37532

45. Schor K, Woditsch I, Strobach H, Schroder H. Interaction between nitric oxide and

prostacyclin in myocardial ischemia and endothelial cell cultures. Basic Res Cardiol. 1991;

86(Suppl 2); 117-25.

46. Stamler J.S., Singel DJ, Loscalzo J, Biochemistry of nitric oxide and its redox-activated

forms. Science. 1992;258: 1898-902.

Page 68: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Bibiliografie

64

47. Taylor BS, Alarcon LH, Billiar TR. Inductible nitric oxide syntase in the liver: regulation

and function. Biochemistry (Mosc) 1998 Jul; 63(7): 766-81.

48. Tottrup A, Glavind EB, Svane D. Involvment of the L-arginine-nitric oxide pathway in

internal anal sphincter relaxation. Gastroenterolgy. 1992; 102: 409-15.

49. Rajfer J, Aronson WJ, Bush PA, Dorey FJ, Ignarro LJ. Nitric oxide as a mediator of

relaxation of the corpus cavernosum in response to nonadrenergic, noncholinergic

neurotranmission. N Engl J Med. 1992;326:90-4.

50. Dawson TM, Dawson VL, Snyder SH. A novel neuronal messenger molecule in brain: the

free radical, nitric oxide. Ann Neurol. 1992;85:2284-90.

51. Busse R, Mulsch A. Calmodulin-dependent nitric oxide sythesis in endothelial cytosol is

mediated bz calmodulin. FEBS Lett. 1990; 265:133-6.

52. Benyo Z, Kiss J, Syabo C, Csaki C, Kovach AG. Importace of basal nitric oxide synthesis

in regulation of myocardial blood flow. Cardiovas Res. 1991;25:700-3.

59.Jenkins D.C.,Charles I.G.,Thomsen L.L., Moss D.W., Holmes L.S., Baylis S.A., P.

Rhodes, K. Westmore, P.C. Emson, S. Moncada, Roles of nitric oxide in tumor growth, Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 92 (1995) 4392–4396

60.Schonhoff C.M., Matsuoka M.,Tummala H., M.A. Johnson, A.G. Estevez, R. Wu, A.

Kamaid, K.C. Ricart, Y. Hashimoto, B. Gaston, T.L. Macdonald, Z. Xu, J.B. Mannick, S-

nitrosothiol depletion in amyotrophic lateral sclerosis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103 (2006)

2404–2409.

61.Wiseman H,Halliwell B., Damage to DNA by reactive oxygen and nitrogen

species: role in inflammatory disease and progression to cancer, Biochem. J.

313 (Pt 1) (1996) 17–29.

62. Handy D.E.,Loscalzo J., Nitric oxide and posttranslational modification of the vascular

proteome: S-nitrosation of reactive thiols, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 26 (2006) 1207–

1214.

63.Jeannin J.-F.,Leon L., Cortier M., Sassi N.i, C. Paul,Bettaieb A., Nitric oxide induced-

resistance or sensitization to death in tumor cells, Nitric oxide 19 (2008) 158–163.

64. KRISHNA MT, CHAUHAN AJ, FREW AJ, HOLGATE ST. Toxicological mechanisms

underlying oxidant pollutant-induced airway injury. Rev Environ Health 1998; 13: 59-71.

65. LEE WL, DOWNEY GP. Neutrophil activation and acute lung injury. Curr Opin Crit

Care 2001; 7: 1-7.

Page 69: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Bibiliografie

65

66.Shigenaga M.K.,Gimeno C.J.,Ames B.N.,Urinary 8-hydroxy-2-deoxyguanosine as a

biological marker of in vivo oxidative DNA damage, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86 (1989)

9697–9701.

67.Halliwell B.,Gutteridge J.M.C., Free Radicals in Biology and Medicine, 3rd ed., Oxford

University Press, 1999.

68.Miranda KM, Espey MG, Wink DA. A rapid, simple spectrophotometric method for

simultaneous detection of nitrate and nitrite. Nitric Oxide. 2001 Feb;5(1):62-71.

69.Asghar Muhammad Nadeem (2009) Oxidative Stress Status Evaluation at Chemical and

Biochemical Levels using Novel/Improved and Contemporary Methods. PhD thesis, Govt.

College University, Lahore.

70.Azzam E.I.,de Toledo S.M.,Little J.B., “Stress Signaling from Irradiated to Non-Irradiated

Cells”, Current Cancer Drug Targets, 2004, 4, 53-64

71.AzzamE.I.,Little J.B., “The radiation-induced bystander effect:evidence and significance”,

Human & Experimental Toxicology (2004) 23: 61-/65

72.Azzam E.I.,de Toledo S.M.,Little J.B., “Oxidative metabolism, gap junctions and the

ionizing radiation-induced bystander effect”, Oncogene (2003) 22, 7050–7057,

73.Leon L.,Jeannin J. F.,Bettaieb A.,“Post-translational modifications induced by nitric oxide

(NO): Implication in cancer cells apoptosis”, Nitric Oxide 19 (2008) 77–83,

74.Valko .M.,Rhodes C.J.,Moncola J.,Izakovic M.,Mazura M., “Free radicals, metals and

antioxidants in oxidative stress-induced cancer”, Chemico-Biological Interactions 160 (2006)

1-40,

76.de Toledo S. M.,Azzam E.I., “Adaptative and bystander responses in human and rodent

cell cultures exposed to low level ionizing radiation: the impact of linear energy transfer.”,

Dose-Response, 4(4):291–301, 2006,

77.Valko M.,Leibfritz D.,Moncola J.,Cronin M.T.D.,Mazura M., Telser J.,”Free radicals and

antioxidants in normal physiological functions and human disease”, The International Journal

of Biochemistry & Cell Biology 39 (2007) 44–84

Page 70: Licenta Ciurdariu Sergiu-Ioan

Bibiliografie

66

78.Heller A, “Apoptosis-Inducing High CNO Concentrations Are Not Sustained Either in

Nascent or in Developed Cancers”, ChemMedChem 2008,3,1493 – 1499

79.Palmieri B.,Sblendorio V.,”Oxidative stress detection: what for?”, Eur Rev Med Pharmacol

Sci 2006; 10 (6): 291-317

80.Hamra M.,Harma Me.,Ozcan E.,”Increased oxidative stress in patients with hydatiform

mole”, Swiss Med Wkly 2003; 13 3: 563 –566

81.Yu X.J.,Cui L.,Zhang Q.,Cheng H.,Ji P.,”Expression of NOS and HIF-1 in human

colorectal carcinoma and implication in tumor angiogenesis”,World J Gastroenterol 2006

August 7;12(29):4660-4664

82.Yu B.,Dong X.S.,Sun W.,Yang Y,”Effect of a nitric oxide synthase inhibitor NG-nitro-L-

arginine methyl ester on invasion of human colorectal cell line SL-174-T”, World J

Gastroenterol 2005;11(40):6385-6388