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LIBERTAÇÃO, POR DIFERENTES ESTÍMULOS, DA NORADRENALINA ENDÓGENA E DE AMINAS EXÓGENAS INCORPORADAS PELO TERMINAL SIMPÁTICO PORTO 1988

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LIBERTAO, POR DIFERENTES ESTMULOS, DA NORADRENALINA ENDGENA E DE AMINAS EXGENAS INCORPORADAS

PELO TERMINAL SIMPTICO

PORTO 1988

& +1 4 4 +1 A R T E S G R F I C A S

DANIEL FILIPE DE LIMA MOURA

LIBERTAO, POR DIFERENTES ESTMULOS, DA NORADRENALINA ENDGENA E DE AMINAS EXGENAS INCORPORADAS

PELO TERMINAL SIMPTICO

DISSERTAO DE CANDIDATURA AO GRAU DE DOUTOR APRESENTADA FACULDADE DE MEDICINA DA UNIVERSIDADE DO PORTO

PORTO 1988

O trabalho experimental e a execuo grfica foram subsidiados pelo Instituto Nacional de Investigao Cientfica

Art.0 48., 3."-A Faculdade no responde pelas doutrinas expendidas na dissertao.

(Regulamento da Faculdade de Medicina do Porto, 29 de Janeiro de 1931 -Decreto n. 19337)

CORPO CATEDRTICO DA

FACULDADE DE MEDICINA DO PORTO

Doutor Alexandre Alberto Guerra Sousa Pinto Doutor Amndio Gomes Sampaio Tavares Doutor Antnio Alberto Falco de Freitas Doutor Antnio Augusto Lopes Vaz Doutor Antnio Carvalho de Almeida Coimbra Doutor Antnio Fernandes da Fonseca Doutor Antnio Fernandes Oliveira Barbosa Ribeiro Braga Doutor Antnio Germano Pina da Silva Leal Doutor Antnio Lus Tom da Rocha Ribeiro Doutor Antnio Manuel Sampaio Arajo Teixeira Doutor Artur Manuel Giesteira de Almeida Doutor Cndido Alves Hiplito Reis Doutor Carlos Rodrigo de Magalhes Ramalho Doutor Carlos Sampaio Pinto de Lima Doutor Casimiro gueda de Azevedo Doutor Celso Renato Paiva Rodrigues da Cruz Doutor Daniel dos Santos Pinto Serro Doutor Eduardo Jorge Cunha Rodrigues Pereira Doutor Fernando de Carvalho Cerqueira Magro Gomes Ferreira Doutor Francisco de Sousa L Doutor Joo da Silva Carvalho Doutor Joaquim Germano Pinto Machado Correia da Silva Doutor Joaquim de Oliveira Costa Maia Doutor Jos Augusto Fleming Torrinha Doutor Jos Carvalho de Oliveira Doutor Jos Fernando Barros Castro Correia Doutor Jos Manuel Costa Mesquita Guimares Doutor Jos Manuel Gonalves Pina Cabral Doutor Jos Pinto de Barros Doutor Levi Eugnio Ribeiro Guerra Doutor Lus Antnio Mota Prego Cunha Soares de Moura Pereira Leite Doutor Manuel Augusto Cardoso de Oliveira Doutor Manuel Fonseca Pinheiro Coelho Hargreaves Doutor Manuel Machado Rodrigues Gomes Doutor Manuel Maria Paula Barbosa Doutor Manuel Miranda Magalhes Doutor Manuel Teixeira Amarante Jnior Doutora Maria da Conceio Fernandes Marques Magalhes Doutor Mrio Jos Cerqueira Gomes Braga Doutor Norberto Teixeira Santos

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Doutor Serafim Correia Pinto Guimares Doutor Valdemar Miguel Botelho Santos Cardoso Doutor Victor Manuel Oliveira Nogueira Faria Doutor Walter Friedrich Alfred Osswald

Professores Jubilados

Doutor Abel Jos Sampaio da Costa Tavares Doutor Albano dos Santos Pereira Ramos Doutor Antnio Martins Gonalves de Azevedo Doutor Carlos Ribeiro da Silva Lopes Doutor Eduardo Esteves Pinto Doutor Joo Costa Doutor Joaquim Jos Monteiro Bastos Doutor Jos Ruiz de Almeida Garrett Doutor Jlio Machado de Sousa Vaz Doutor Manuel Jos Bragana Tender Doutor Manuel Sobrinho Rodrigues Simes

Professores Honorrios

Doutor Maurice Mercadier Doutor Ullrich Georg Trendelenburg Doutor Victor Antnio Augusto Nunes de S Machado

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Aos Professores

JOS RUZ DE ALMEIDA GARRETT

Je me suis assez vite aperue que (c'tait) la vie d'un grand homme. De l, plus de respect de la vrit, plus d'attention, et, de ma part, plus de silence.

MARGUERITE YOURCENAR, Mmoires d'Hadrien

WALTER FRIEDRICH ALFRED OSSWALD

A man for all seasons

ROBERT WHITTINTON, Vulgaria

SERAFIM CORREIA PINTO GUIMARES

O sonho ver as formas invisveis Da distncia imprecisa, e, com sensveis Movimentos da esp'rana e da vontade,

Buscar na linha fria do horizonte... Os beijos merecidos da Verdade

FERNANDO PESSOA, Mensagem

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INDICE

Introduo

Mtodos

Preparao dos rgos isolados

Carregamento com aminas exgenas

Perifuso

Estimulao do nervo hipogstrico

Extraco das catecolaminas dos tecidos e lquidos

Doseamento cromatogrfico

Doseamento cintilomtrico

Auto-radiografias de luz

Descrio e anlise estatstica dos resultados

Frmacos utilizados

Resultados

Acumulao de adrenalina no canal deferente

Acumulao de adrenalina na veia safena

Acumulao de noradrenalina tritiada

Libertao de adrenalina por estimulao transmural do canal deferente

Libertao de noradrenalina tritiada por estimulao transmural do canal deferente

Libertao de adrenalina por estimulao do nervo hipogstrico

Libertao de adrenalina pelo io potssio

Libertao de adrenalina pela tiramina

Influncia da inibio dos receptores pr-sinpticos o, na libertao de noradrenalina endgena e tritiada do canal deferente por estimulao transmural

Auto-radiografias

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Discusso

0 "efeito istopo"

Libertao de aminas exgenas diferentes utilizando o mesmo estmulo libertador

Libertao da mesma amina exgena utilizando diferentes agentes libertadores

Relao entre a acumulao tecidual de uma amina exgena e a sua libertao

Relao entre a acumulao tecidual de uma amina exgena e o teor em noradrenalina endgena

Localizao da noradrenalina tritiada por auto-radiografia

Efeito do bloqueio a sobre a libertao da noradrenalina exgena e da noradrenalina endgena

Efeito da libertao da adrenalina recentemente incorporada sobre a libertao de noradrenalina endgena

Resumo

Summary

Bibliografia

Agradecimentos

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Introduo

A curiosidade torna-se Cincia quando aceita uma regra: s vale a pena colo-car perguntas quando for possvel planear experincias que lhes dem resposta. Os surtos de progresso farmacolgico que vm habitualmente na esteira dos mtodos ou modelos experimentais novos, mostram bem que a imaginao um recurso abundante dos farmacologistas e que, em cada poca, o desenvolvimento dos conhecimentos sobretudo dificultado pelos limites dos mtodos. O que se sabe da libertao do mediador endgeno nos terminais adrenrgicos ilustra bem este fenmeno.

Um facto cientfico reconhecido h vrios decnios o de que a noradrenalina uma substncia responsvel pelas respostas obtidas com a estimulao dos nervos simpticos. A sua identificao como neurotransmissor foi conseguida pela anlise das aces farmacolgicas da noradrenalina que se mostraram coinciden-tes com as do produto de libertao dos nervos simpticos (Euler 1946; Holtz ef ai. 1947). Caracterizado o mediador procurou-se medir a quantidade dele libertada utilizando o mesmo mtodo. A aferio biolgica serviu a Peart (1949) para medir pela primeira vez a quantidade de noradrenalina libertada durante a estimulao de nervos simpticos. Estes mtodos, embora muito sensveis, so de execuo muito morosa e, por isso, o nmero de trabalhos dedicados medio da liberta-o do mediador adrenrgico endgeno foi pequeno (Mann e West 1950; Brown e Gillespie 1957).

Em 1959 chegou fisiofarmacologia a tcnica da utilizao de istopos radioactivos da adrenalina (Axelrod ef ai. 1959) e da noradrenalina (Whitby ef ai. 1961 ) e com ela surge um novo e dos mais explosivos surtos de informao nesta rea dando inteira razo a Julius Axelrod: "Major breakthroughs always seem to depend on developing ways of measuring body constituents that are sensitive, specific and perhaps most importantly, simple and reproducible" (citado por Sny-der e Taylor 1972).

O procedimento experimental nestes trabalhos consiste basicamente na oferta aos tecidos de um istopo radioactivo de noradrenalina ou outras substn-cias captadas pelo terminal adrenrgico, esperar o tempo considerado necessrio para que esses marcadores sejam incorporados pelos neurnios e estudar, depois, a sua libertao espontnea e induzida mediante a contagem de cintila-es emitidas pelo material recolhido. O mtodo assim sensvel porque as cintila-es que necessrio contar so emitidas por um nmero muito pequeno de molculas, especfico porque toda a radioactividade medida s pode resultar do marcador usado e dos seus metabolitos e simples porque o processo analtico est normalizado e largamente automatizado, permitindo leituras rpidas de mui-tas amostras.

bem claro que a validade dos estudos com istopos radioactivos como indi-cadores da libertao de substncias endgenas, depende de uma forma crtica, da demonstrao de que a noradrenalina tritiada administrada do exterior se vai acumular nos depsitos onde existe a noradrenalina endgena e ficar a sujeita a iguais influncias libertadoras. As provas reunidas, quanto a esta exigncia, no

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deixam dvidas: as catecolaminas radioactivas acumulam-se, de maneira estvel, nos tecidos ricamente inervados pelo sistema simptico (Whitby et al. 1961 ), desa-parecem nos animais desnervados (Hertting ef ai. 1961a), so mobilizadas pela estimulao nervosa (Hertting e Axelrod 1961 ; Chidsey e Harrison 1963; Roseli ef ai. 1963) e pelos frmacos simpaticomimticos de aco indirecta (Bum e Bum 1961 ; Hertting ef ai. 1961 b; Axelrod et ai. 1962) e so sensveis ao efeito inibidor da captao neuronial da cocana (Hertting et ai. 1961 b) e ao efeito depletor da reser-pina (Hertting et ai. 1961b).

Apesar disto, o mtodo no pode dar indicaes directas da libertao do mediador endgeno mas sim indicaes sobre uma substncia exgena que cap-tada do exterior se acumula na estrutura em estudo e para a qual se admitiu um comportamento semelhante ao da substncia endgena. As dedues feitas a partir destes resultados para a noradrenalina endgena baseiam-se na presuno aceitvel, mas no demonstrada, de que as substncias recentemente incorpora-das do exterior pelo terminal simptico se misturam de uma forma rigorosamente homognea com a noradrenalina endgena e com ela se libertam nas mesmas propores. Para que tal suceda necessrio que a amina exgena recentemente incorporada atinja todos os locais de armazenamento da noradrenalina endgena j formada, se misture continuamente com a que vai sendo sintetizada, no altere a distribuio intracelular da amina endgena, seja igualmente sensvel ao meca-nismo promotor da libertao e no tenha ela prpria a capacidade de modificar os processos de regulao da libertao do mediador. A amina exgena, partida do exterior e forada a seguir um trajecto diferente, dificilmente poder corresponder quelas exigncias. Mesmo que tal sucedesse necessrio definir qual o tempo de contacto mnimo do marcador com os tecidos, a partir do qual se no diferen-ciam os depsitos e entre que concentraes da substncia exgena acumulada se mantm essa homogeneidade.

A estas reservas feitas coincidncia do comportamento da noradrenalina biognica - sintetizada e arrumada dentro do neurnio - e do seu istopo radioac-tivo-fabricado e incorporado de fora-vem acrescentar-se, por um lado, a demonstrao feita por Trendelenburg (1961) de que a noradrenalina endgena se apresenta normalmente acumulada nos terminais adrenrgicos em depsitos separados com diferente significado funcional e, por outro, a caracterizao anat-mica de diferentes locais de acumulao de noradrenalina (ver Grillo 1966).

Todavia, muito poucos trabalhos (Chidsey e Harrison 1963; Hughes 1973a) se fizeram para comparar a libertao dos dois tipos de amina.

O desenvolvimento recente de dois mtodos de doseamento no radioacti-vos (o doseamento radioenzimtico e a cromatografia lquida de alta presso com deteco electroqumica) com um limite de deteco suficientemente baixo para medir as pequenas quantidades de noradrenalina libertadas para o lquido nutritivo veio permitir colocar prova aquela presuno.

Os objectivos directos deste trabalho foram assim: -Verificar se a noradrenalina endgena se liberta na mesma quantidade, com a

mesma velocidade e dos mesmos locais que as aminas utilizadas como marca-dores.

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-Observar se a presena de aminas exgenas no neurnio altera a libertao da noradrenalina endgena.

Verificar se as aminas incorporadas deslocam a noradrenalina endgena.

Estudar se a regulao da libertao dependente de receptores pr-sinpticos se faz sentir da mesma maneira sobre os mediadores endgenos e os marcado-res.

Mtodos

Todas as experincias para medio da libertao dos transmissores foram executadas em rgos isolados montados em pequenas cmaras de perifuso percorridas por um lquido nutritivo que era continuamente recolhido para anlise. No decurso da perifuso, a preparao isolada era submetida a diferentes estmu-los libertadores e procedia-se ao doseamento das aminas no lquido de perifuso em amostras colhidas antes e durante a interveno dos processos indutores de libertao.

A acumulao tecidual das aminas exgenas foi estudada pelo seu dosea-mento nos canais deferentes retirados da cmara de perifuso no fim da experin-cia e por auto-radiografias de luz preparadas com tecidos incubados em presena de istopos radioactivos dessas aminas.

Preparao dos rgos isolados

Utilizaram-se trs preparaes diferentes: a veia safena de Co isolada, o canal deferente de Cobaia isolado e a preparao de nervo hipogstrico-canal deferente de Cobaia in vitro.

Para obteno de fragmentos de veia safena, os ces (raa indeterminada, sexo masculino ou feminino, peso entre 6 e 20 Kg) eram anestesiados com pento-barbital sdico administrado por via endovenosa numa veia superficial da pata anterior na dose de 30 mg/Kg. Isolava-se a veia safena lateral na zona de conflun-cia dos seus ramos dorsal e plantar e removia-se o segmento que ocupava 3-5 cm em sentido proximal a partir daquela confluncia. Este segmento era cortado heli-coidalmente em tiras com cerca de 2,5x25 mm que eram libertadas de todos os tecidos envolventes, colocadas em pequenos recipientes de 5 ml de capacidade com Krebs-Henseleit (NaCI 6,94; KCI 0,35; CaCI2 0,28; KH2P04 0,16; MgS04,7H20 0,29; NaHC03 2,10; glicose 1,81 g/l) a que se adicionava EDTA (10 jjg/ml) para evi-tar a oxidao no enzimtica das catecolaminas (omitiu-se a adio de cido ascrbico correntemente utilizado tambm para aquele fim porque a sua presena no detector electroqumico empregue no doseamento das catecolaminas-ver

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adiante-interfere com o processo analtico) e posteriormente suspensas na cmara de perifuso (Guimares e Osswald 1969; Guimares e Paiva 1977).

Os canais deferentes de Cobaia eram removidos em toda a sua extenso desde o topo epididimal at ao prosttico e montados para perifuso sem abertura prvia. Para obteno de preparaes em que os canais eram removidos com a insero do nervo hipogstrico seguiu-se o mtodo descrito por Hukovic (1961) e algumas indicaes prticas de Holman (1975).

O canal deferente era seccionado no seu topo epididimrio e liberto da sua fixao ao testculo. Procedia-se depois identificao do nervo hipogstrico puxando para diante o mesocolon sigmide at que esse meso ficasse na posio de uma membrana inserida na parede abdominal posterior e colocada no plano sagital. A identificao dos dois nervos hipogstricos fazia-se observando o meso-colon transparncia e numa incidncia lateral. Os trajectos nervosos eram liber-tos das suas aderncias peritoneais, primeiro em sentido proximal at sua origem nos gnglios mesentricos inferiores e, em seguida, no sentido oposto at cerca de 5 mm do canal deferente. A este nvel o nervo hipogstrico ramifica-se num leque de fibras nervosas que penetram no tecido um pouco acima da terminao prosttica. Esta zona era removida com o peritoneu que a revestia depois de dis-seco cuidadosa para separao da terminao prosttica, da parede lateral da bexiga e das vesculas seminais. Esta manobra era facilitada pelo rebatimento para diante e para baixo da bexiga com auxlio de uma pina que prendia o vrtice vesical.

Depois de isolado, o conjunto nervo-canal deferente era mergulhado numa placa de Petri com Krebs j oxigenado e a integridade da transmisso nervosa tes-tada pela aplicao de um estmulo elctrico (25Hz, 5 a 10V, 2mseg, durante 5seg) atravs de dois elctrodos de prata ou platina encostados ao nervo. A pre-servao da preparao neuromuscular era comprovada pela verificao de que a uma estimulao do nervo correspondia uma resposta de contraco do rgo efector. A preparao nervo-canal deferente era depois montada numa cmara de perifuso cujo cilindro interno tinha 6 mm de dimetro e 50 mm de altura.

A extremidade proximal do canal deferente era fixada poro inferior da cmara de perifuso e a extremidade distai era suspensa numa alavanca isotnica de inscrio frontal submetida a uma tenso de 1 g e a contraco registada com uma ampliao de 6 vezes.

Carregamento com aminas exgenas

Utilizaram-se como aminas exgenas a incorporar nas preparaes a 3H-()-7- noradrenalina e a ()-adrenalina que eram adicionadas a um lquido de incubao em concentraes que variaram entre 0,6 e 160 |jmol/l. Veias, canais deferentes ou preparaes nervo hipogstrico-canal deferente eram colocados, logo que fossem retirados do animal de experincia em pequenos recipientes com soluo de Krebs contendo 41 pmol/l de hidrocortisona e 1 mmol/l de pargilina,

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onde permaneciam 30 min a 37C e com oxigenao mantida. Ao fim deste primeiro tratamento os tecidos eram transferidos para outro lquido de incubao que j no continha pargilina e ao qual tinha sido adicionada uma das aminas exgenas. Depois de uma incubao de 60 min, as preparaes eram montadas nas cmaras de perifuso (Fig. 1).

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C

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Fig. 1. Representao esquemtica da sequncia experimental habitualmente seguida. A: incubao da preparao em soluo de KrebsHenseleit contendo 1 mmol/l de pargilina durante 30 min; B: incubao em soluo de KrebsHenseleit contendo ()adrenalina ou 3H()noradrenalina durante 60 min; C: perifuso durante 120 min para remoo das catecolaminas dos compartimentos extraneuroniais; D: incio das colheitas dos lquidos de perifuso.

Perifuso

Os tecidos eram perifundidos a um fluxo de 0,8 ml/min com a soluo nutritiva atrs indicada e que continha sempre e at ao fim das experincias 41 |jmol/l de hidrocortisona. Ao fim de 120 min de lavagem iniciavase a colheita contnua das amostras de lquido de perifuso antes, durante e aps a aplicao de diferentes processos libertadores de aminas do terminal simptico.

Nas experincias de estimulao elctrica transmural usouse um estmulo de 100V, 2 mseg, 1 Hz, durante 25 min (Stimulator II X, Hugo Sachs Elektronik, MarchHugstetten, FRG). As colheitas de lquido eram feitas de 30 em 30 min e 20 min antes da aplicao da corrente adicionavase ao meio de perifuso cocana (7,5 (jmol/l) e fentolamina (3 pmol/l) com o objectivo de aumentar tanto quanto possvel a quantidade de catecolaminas libertadas no lquido a recolher para anlise. Nas experincias destinadas a medir a influncia do bloqueio prsinptico sobre a libertao da noradrenalina endgena e das aminas de carga, executavamse duas sries de estmulos e a fentolamina era apenas adicionada entre os dois perodos de estimulao.

Nas experincias de libertao por altas concentraes de potssio as colheitas de lquido eram feitas de 10 em 10 min. O perodo de contacto com o potssio (KCI 50 mmol/l) era tambm de 10 min e era antecedido, tal como se descreveu para a estimulao elctrica, do acrescento de cocana e fentolamina ao lquido nutritivo.

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Nas experincias em que o agente libertador era a tiramina (40 ou 160 umol/l, 15 min) recolhia-se o lquido de 15 em 15 min e no se adicionavam outros frma-cos soluo de Krebs alm da hidrocortisona.

Quando se utilizou a preparao de nervo-canal deferente o protocolo foi igual ao da estimulao transmural com excepo das caractersticas da corrente elctrica aplicada (estmulos de 25 Hz, 2 mseg, 5 ou 10 V, aplicados em salvas com a durao de 5 seg em cada min, durante 30 min).

Estimulao do nervo hipogstrico

A estimulao do nervo hipogstrico era feita atravs de um elctrodo de "Burn e Rand" (Burn e Rand 1960a). O elctrodo era fabricado com 2 fios de prata cujas extremidades eram enroladas volta de um tubo de silicone de dimetro externo ligeiramente superior ao do nervo. Cada fio era passado 3 vezes em torno do tubo de silicone e os dois enrolamentos ficavam distncia de 1 a 2 mm um do outro. O conjunto era envolvido com cola (Araldite) no aderente ao silicone. Assim, depois de seca, era possvel remover o tubo, criando-se um pequeno orifcio onde cabia o tronco nervoso. Os anis do fio de prata ficavam embebidos na cola que os isolava do meio lquido em toda a extenso excepto no seu permetro interno que ficava em contacto com o nervo. O elctrodo era colocado no interior da cmara de perifuso atravs de um orifcio aberto na parede de vidro e ligado ao estimulador (Fig. 2).

Fig. 2. Representao do dispositivo experimental para colheita do lquido de peri-fuso durante a estimulao nervosa da preparao nervo hipogstrico-canal deferente. O registo das contraes foi utilizado para verificar se a conduo ner-vosa e a transmisso neuroefectora estavam funcionantes.

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Extraco das catecolaminas dos tecidos e lquidos

O processo extractivo baseou-se no conhecido princpio da adsoro das catecolaminas alumina a pH alcalino e sua remoo pela acidificao do meio (ver, por exemplo, Anton e Sayre 1962).

Os lquidos de perifuso eram recolhidos em cido perclrico 0,1 N. A cada amostra adicionava-se 20 mg de alumina e o pH era elevado para 8,5 com soluo TRIS. Os recipientes eram agitados durante 30 min, o sobrenadante rejeitado e a alumina recolhida para a parte superior de um sistema de 2 tubos separados por uma membrana microporosa. A alumina era posta em contacto com 500 pi de cido perclrico 0,1 N e o sistema era rapidamente centrifugado. O lquido sem alu-mina recolhido na parte inferior era utilizado para injeco no cromatgrafo ou para leitura cintilomtrica.

Os tecidos retirados no fim da experincia ficavam mergulhados em 3 ml de cido durante pelo menos 24 h. O lquido sobrenadante era submetido a um pro-ceso extractivo semelhante ao j indicado.

Doseamento cromatogrfico

Na anlise das catecolaminas libertadas para os lquidos de perifuso utili-zou-se uma modificao das tcnicas j consagradas para doseamento das pequenas concentraes de noradrenalina e adrenalina que se encontram no plasma (Hjemdahl et ai. 1979; Hjemdahl 1984; para reviso dos princpios gerais da tcnica ver Kissinger 1983).

A separao das catecolaminas fez-se num sistema de cromatografia lquida de alta presso de fase inversa formado por uma fase fixa de partculas de octade-cilsilano com 5 pm de dimetro que preenchiam uma coluna de ao inoxidvel de 4,6 mm de dimetro interno e 250 mm de comprimento (Bioanalytical Systems, West Lafayette, IN, USA) atravessada por uma fase mvel constituda por uma soluo em gua tridestilada contendo 0,1 mol/l de acetato de sdio, 0,1 mol/l de cido ctrico, 0,5 pmol/l de octilsulfato de sdio e 10% (volume/volume) de metanol (Warnhoff 1984). A fase mvel tinha um pH de 3,7, encontrava-se temperatura ambiente e circulava com um fluxo de 1 ml/min criado por uma bomba de alta pres-so (modelo M-45, Waters, Milford, MA, USA ou modelo 302, Gilson, Middleton, Wl, USA). A fase mvel era filtrada por uma membrana com poros de 0,22 |jm (GSWP 04700, Millipore, Bedford, MA, USA) e desgaseificada sob vcuo com agitao constante durante 10 min antes de ser colocada no cromatgrafo.

A quantificao das catecolaminas fez-se, sada da coluna de cromatogra-fia, por amperometria com o uso de um detector electroqumico e de uma clula de fluxo em camada fina com um elctrodo de pasta de carvo colocado a um poten-cial de + 0,7 V em relao a um elctrodo de referncia de Ag/AgCI, todos obtidos atravs de Bioanalytical Systems.

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Nalguns ensaios utilizou-se outra fase mvel constituda por uma soluo amortecedora de cido monocloroactico 0,15 mol/l a pH 3,0, contendo Na2EDTA (2 mmol/l) e octilsulfato de sdio (25 mg/l) (Bioanalytical Systems 1981 ; Davis et al. 1981 ). O fluxo utilizado era de 2 ml/min e as restantes condies de cromatografia e deteco amperomtrica eram iguais s acima indicadas.

Para o clculo da quantidade de amina injectada no cromatgrafo (50-200 ul) media-se a relao das alturas dos picos correspondentes substncia em estudo e ao padro interno constitudo por uma quantidade fixa de diidroxibenzilamina adi-cionada a todas as amostras antes de iniciado o processo extractivo. Conhecida a relao de alturas obtida com a injeco de uma amostra padro que continha quantidades pr-determinadas de aminas aplicava-se a frmula seguinte em que "amina" e "DHBA" significam a altura dos picos da catecolamina em estudo e da dii-droxibenzilamina.

(cone. amina) amostra (amina: DHBA) amostra

(amina: DHBA) padro x (cone. amina) padro

A forma habitual dos registos cromatogrficos obtidos com o uso de cada uma das fases mveis atrs mencionadas est desenhada na Fig. 3.

I 1^1 li ^ LA

Fig. 3. Desenho da forma habitual dos registos cromatogrficos de uma soluo padro contendo noradrenalina (pico 1), adrenalina (pico 2) e diidroxibenzilamina (pico 3). A seta indica o momento em que a amostra foi introduzida na fase mvel. Todas as substncias foram injectadas na quantidade de 2 ng. A: traado obtido com uma fase mvel de monocloroacetato (0,15 mol/l) a pH 3,0, a que se adicio-nou Na2 EDTA (2 mmol/l) e octilsulfato de sdio (25 mg/l) ; B: cromatograma obtido com uma fase mvel de acetato de sdio (0,1 mol/l e cido ctrico (0,1 mol/l), a pH 3,7, a que se adicionou octilsulfato de sdio (0,5 pmol/l) e metanol (10% do volume).

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Doseamento cintilomtrico

A radioactividade foi medida em amostras do eludo da alumina por cintilome-tria lquida (Graefe eia/. 1973) num contador de cintilaes (Tri-Carb Scintillation Spectrometer modelo 3320, Packard, Warrenville, ILL, USA ou Liquid Scintillation Counter BF500, Berthold, Wildbad, FRG) usando como lquido de cintilao uma mistura de 300 ml de Triton X-100, 5,5 ml de Permablend III (Packard) e 1 I de tolueno (ver Brando 1977).

Auto-radiografias de luz

Utilizaram-se canais deferentes de Cobaia que foram incubados na presena de 2,3 |jmol/l de 3H-noradrenalina em condies iguais s descritas para as expe-rincias de efluxo.

Aps 1 h de incubao, os tecidos foram fixados numa soluo a 3% de gluta-raldedo em tampo cacodilato 0,1 mol/l, pH 7,3 temperatura de 4C. Depois de 1 h de permanncia no fixador, os fragmentos foram submetidos a desidratao atravs da passagem por solues com concentraes crescentes de etanol. Incluiram-se as amostras de tecido em Epon e os blocos foram seccionados num ultramicrtomo em cortes semi-finos com 2 um de espessura. Estes cortes foram colados em lminas de vidro com cola de albumina, cobertos com cido perclrico, reagente de Schiff e hematoxilina e cobertos com uma emulso fotogrfica (llford K-5 diluda em gua na proporo de 1/1). As lminas permaneceram numa cmara escura durante 90 dias ao fim dos quais se fez a revelao (Kodak D-170). As auto-radiografias foram observadas e fotografadas num microscpio de luz para localizar os gros de prata correspondentes s zonas de emisso radioactiva (Azevedo 1982).

Descrio e anlise estatstica dos resultados

Se no for referido de outra maneira, os resultados das experincias so expressos pelas mdias aritmticas e erros padro. Os valores calculados como quocientes de duas variveis so descritos estatisticamente pela sua mdia geo-mtrica e a sua disperso pelos intervalos fiducirios de 95%.

Para deduo estatstica das diferenas entre os vrios grupos de valores experimentais utilizou-se o teste f de Student para valores emparelhados ou inde-pendentes. A anlise foi sempre bilateral e o nvel de significncia estatstica colo-cado em 5%.

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Frmacos utilizados

(-)-[7-3H(N)]-noradrenalina (18,8-23,1 Ci/mmol, New England Nuclear, Dreieich, FRG), bitartarato de noradrenalina (Sigma, St. Louis, MO, USA), ()-adre-nalina (Sigma), cloridrato de cocana (Uquipa, Lisboa), cloridrato de fentolamina (Ciba Geigy, Basileia, Suia), cloridrato de pargilina (Sigma), hemisuccinato de hidrocortisona (Sigma), cloridrato de propranolol (Sigma), cloridrato de tiramina (Sigma), pentobarbital sdico (Siegfred Zofingen, Suia).

Resultados

As experincias foram realizadas em 3 preparaes diferentes (veia safena lateral de Co, canal deferente de Cobaia e preparao do nervo hipogstrico--canal deferente de Cobaia) que foram carregadas com adrenalina no radioactiva ou noradrenalina tritiada e expostas a 4 tipos diferentes de estmulo libertador (esti-mulao elctrica transmural, io potssio, tiramina e estimulao elctrica dos nervos) na ausncia ou na presena de bloqueio dos receptores a2. Para facilidade de exposio, os resultados sero agrupados em valores de acumulao e de libertao e apresentados na seguinte ordem: acumulao tecidual de adrenalina no canal deferente e na veia safena, e acumulao de noradrenalina tritiada no canal deferente seguindo-se a libertao pela estimulao transmural, libertao pela estimulao dos nervos, libertao pela despolarizao induzida pelo aumento da concentrao de potssio no meio e libertao provocada pela tira-mina. Por ltimo descrevem-se os resultados do bloqueio dos receptores o, na libertao do mediador adrenrgico e da amina artificialmente incorporada e, no fim do captulo, mostram-se os resultados morfolgicos conseguidos com as auto-radiografias de luz dos cortes de canais deferentes incubados com amina radioac-tiva.

Acumulao de adrenalina no canal deferente

Quando o canal deferente incubado durante 60 min com 2,3 umol/l de adre-nalina e aps uma lavagem de 120 min para arrastar toda a amina presente nos espaos intercelular e extraneuronial verifica-se que o teor em adrenalina do tecido de cerca de 10% do teor em noradrenalina (Fig. 4).

20

p g / g _, 30-< g h>. 20

C Q O tu h-Z O

10-

T n 0,6

zzzx. m 2,3 10 40

ADRENALINA (pmo l / l )

160

Fig. 4. Acumulao de adrenalina no canal deferente em comparao com a quantidade de noradrenalina endgena j existente. A altura das colunas repre-senta a concentrao tecidual de amina (pg/g). Colunas em branco: noradrenalina; colunas com traos: adrenalina. Os nmeros indicados abaixo das colunas so as concentraes de adrenalina adicionadas ao lquido de incubao (pmol/l). Mos-tra-se a mdia aritmtica e o erro padro da mdia de 4 a 8 experincias.

Como se v na figura 4, s aps incubao com 2,3pmol/l possvel detectar a acumulao de adrenalina. Essa quantidade acumulada proporcional con-centrao de adrenalina no meio de incubao e iguala o teor de noradrenalina nas experincias com 160 pmol/l.

Acumulao de adrenalina na veia safena

Na veia safena, a acumulao de adrenalina faz-se parcialmente custa de uma certa reduo de teor em noradrenalina (Fig. 5). Contudo, a quantidade de adrenalina exgena acumulada superior quantidade de noradrenalina que desaparece pois que a quantidade final total de amina superior ao controlo e a de noradrenalina menor. Tal facto torna-se evidente quando se incubam as veias na presena de uma concentrao cerca de 4 vezes superior (10 pmol/l).

21

< H979 g 3-

O o 3 z o ^ I

2,3 10

ADRENALINA (pmol/i;

Fig. 5. Acumulao de adrenalina na veia safena em comparao com a quanti-dade de noradrenalina endgena j existente. A altura das colunas representa a concentrao tecidual de amina (ug/g). Colunas em branco: noradrenalina; colu-nas com traos: adrenalina. Os nmeros indicados abaixo das colunas so as con-centraes de adrenalina adicionadas ao lquido de incubao ((jmol/l). Mostra-se a mdia aritmtica e o erro padro da mdia de 3 a 7 experincias.

Acumulao de noradrenalina tritiada

O contacto de 1 h do canal deferente com um meio de incubao contendo 2,3 (jmol/l de (-)-noradrenalina radioactiva (18,8-23,1 Ci/umol) com marcao pelo trtio em posio predominante no carbono 7, seguida de perituso de 120 min, leva a um teor tecidual de amina exgena de 1,13+0,29 pg/g (ou 6,691,72 |jmol/kg) semelhante ao que se obtm nas experincias com concentraes equi-molares de adrenalina no lquido de incubao (1,500,70 ug/g ou 8,20+3,83 |jmol/kg).

Libertao de adrenalina por estimulao transmural do canal deferente

Os resultados expressos na tabela 1 mostram a libertao de adrenalina a partir das preparaes incubadas com a concentrao de 2,3 |jmol/l de adrenalina.

22

Verifica-se que o aumento de efluxo (diferena entre os valores de efluxo espont-neo e de efluxo nos 30 min de colheita a partir do incio da estimulao) da noradre-naline endgena maior do que o da adrenalina. Tambm a noradrenalina a amina predominante no tecido mas a comparao dos resultados expressos em fraco de libertao (Luchelli-Fortis e Langer 1975), isto , pelo quociente entre a quantidade de amina libertada e a quantidade armazenada no tecido, mostra um valor significativamente mais elevado para a adrenalina (cerca de 5 vezes supe-rior).

A comparao dos efluxos de noradrenalina endgena induzidos pela esti-mulao elctrica de preparaes de controlo, isto , no sujeitas a carregamento com adrenalina, com o efluxo induzido nas preparaes incubadas com adrenalina no mostrou diferenas significativas.

Tabela 1. Canal deferente: contedo tecidual de noradrenalina e de adrenalina aps incubao com 2,3 umol/l de adrenalina durante 60 min seguida de 120 min de lavagem. Libertao por estimulao elctrica transmural (1 Hz, 2 mseg, 100 V, durante 25 min).

Teor tecidual M9/g

Efluxo de aminas no lquido de perifuso Teor tecidual

M9/g ng/30min fraco de libertao

(x 103) A B A B A B

Noradrenalina

Adrenalina

15,60 15,80 1,40 1,50

1,50 0,70

10,12 9,92 2,14 2,68

3,82 0,67

9,60 a 6,80 2,50 1,22 48,40 b 3,01

Resultados expressos em mdias aritmticas erro padro (n=5). Em A apresen-tam-se os resultados referentes ao tecido incubado com adrenalina e em B, os res-peitantes ao canal deferente contralateral incubado sem adrenalina (controlo). A diferena entre ae b estatisticamente significativa.

Numa srie de experincias em que se provocou uma impregnao varivel dos tecidos com adrenalina exgena atravs da incubao dos canais deferentes em presena de concentraes de adrenalina entre 0,6 e 160 umol/l verificou-se que o efluxo de adrenalina induzido pela estimulao transmural foi tanto maior quanto maior foi a concentrao de incubao (Fig. 6). Nas experincias em que se utilizou a concentrao de 0,6 umol/l de adrenalina o seu efluxo induzido electrica-mente no foi detectvel mas naquelas em que se empregou 160 umol/l j esse efluxo de adrenalina tornou-se duplo do da noradrenalina endgenea.

23

30

c -*

O X

20

10 J _ J L 1 n i 1 2 ^

0.6 160 2.3 10 40 I ADRENALINA (pmol / l ) 1

Fig. 6. Libertao de noradrenaline e de adrenalina por estimulao elctrica transmural do canal deferente de Cobaia aps incubao com concentraes crescentes de adrenalina. A altura das colunas representa o efluxo induzido pelo estmulo elctrico para o lquido de perifuso (ng/30 min) Colunas em branco: noradrenalina; colunas com traos: adrenalina. Os nmeros indicados abaixo das colunas so as concentraes de adrenalina adicionadas ao lquido de incubao (jjmol/l). Mostram-se mdias aritmticas e erros padro de 4 a 8 experincias.

No entanto, quando se exprime o efluxo das aminas em fraco de libertao, isto , dividindo a quantidade que libertada pela quantidade presente no tecido que submetido ao estmulo elctrico, obtem-se um quadro inverso (Fig. 7) ao que se mostrou na figura anterior. Atraco de libertao de adrenalina reduziu-se com o aumento da impregnao tecidual com aquela amina.

*- - 40- i UJ o

O (D

Na figura 8 mostrase que quanto maior for o teor tecidual de adrenalina menor a diferena entre as fraces de libertao da amina exgena e da noradrenalina. Os valores do efluxo da noradrenalina no sofrem variao com a crescente impregnao da preparao com adrenalina mas os valores do efluxo da adrenalina vose aproximando dos da amina endgena.

C 2,3 10 40 160

pg/g

T _I

^

1

1

_ L -

c/2 C 2,3 10 40 160

I ADRENALINA (pmol / l )

Fig. 8. Relao entre fraco de libertao e teores teciduais de amina nas experincias em que os canais deferentes de Cobaia incubados com concentraes crescentes de adrenalina foram submetidos a estimulao elctrica transmural (1 Hz,2 mseg, 100 V, executandose um total de 1500 estmulos). A parte superior da figura mostra o efluxo induzido pelo estmulo elctrico para o lquido de perifuso expresso em fraco de libertao (10~6 xpulso1). A parte inferior da figura mostra o teor tecidual de cada uma das aminas (ug/g). Colunas em branco: noradrenalina; colunas com traos: adrenalina. Os nmeros indicados abaixo das colunas so as concentraes de adrenalina adicionada ao lquido de incubao (umol/l). Mostramse mdias aritmticas e erros padro da mdia de 4 a 8 experincias.

25

Libertao de noradrenalina tritiada por estimulao transmural do canal deferente

As experincias referidas na seco precedente, em que se submeteram a estmulo transmural canais deferentes contendo adrenalina como amina exgena incorporada do meio de incubao, foram reproduzidas com o uso de preparaes submetidas a carregamento com 3H-(-)- noradrenalina. A concentrao utilizada foi a mesma (2,3 mmol/l) e a incorporao tecidual conseguida foi semelhante.

Os valores da tabela 2 mostram que, tal como no tecido, tambm no efluxo induzido electricamente a noradrenalina endgena predomina sobre a noradrena-lina radioactiva. No entanto, h uma diferena marcada entre os valores da fraco de libertao: tal como se observou nas experincias com adrenalina, tambm a fraco de libertao da noradrenalina exgena maior do que a da noradrenalina endgena.

Tabela 2. Canal deferente: contedo tecidual de noradrenalina endgena e de noradrenalina tritiada aps incubao com 2,3 umol/l 3H-(-)- noradrenalina durante 60 min seguida de 120 min de lavagem. Libertao por estimulao elc-trica transmural (1Hz, 2 mseg, 100 V, durante 25 min).

Teor tecidual Efluxo de aminas no lquido de

perifuso Teor tecidual

ng/30min fraco de libertao

(x10"3)

Endgena

Tritiada

20,84 2,04

1,13 0,29

10,11 1,62

3,91 2,10

6,45 a 2,27

38,28 b 11,31

Resultados expressos em mdias aritmticas e erro padro (n=5). A diferena entre a e b estatisticamente significativa.

Libertao de adrenalina por estimulao do nervo hipogstrico

A estimulao transmural no se pode considerar uma estimulao fisiol-gica, j que in vivo, nunca se realiza este tipo de estimulao. Por isso, fizeram-se algumas experincias para verificar o que se passa quando a preparao atin-gida por um estmulo aplicado sobre o nervo que a inerva.

26

Como se mostra na tabela 3, o teor total de aminas na preparao nervo hipo-gstrico-canal deferente de controlo ou na que foi incubada com 2,3 umol/l de adrenalina durante 60 min significativamente maior do que o que se regista no canal deferente isolado. Este facto deve-se tcnica diferente de remoo dos tecidos porque a preparao do nervo hipogstrico-canal deferente exige a con-servao do plexo nervoso muito rico existente no folheto de peritoneu que envolve o canal deferente enquanto que na tcnica habitualmente usada no isolamento apenas do canal deferente se faz a libertao das camadas mais externas deste rgo.

O contedo de adrenalina representa cerca de 6,8% do total. Quanto ao teor em noradrenalina endgena, no h diferena significativa entre o das prepara-es incubadas com adrenalina e o das que foram incubadas sem adrenalina (controlo). A comparao das fraces de libertao mostra que a diferena entre a da adrenalina e a da noradrenalina significativa sendo maior a da amina incorpo-rada do exterior do que a da amina endgena. Esta diferena da fraco de liberta-o (que cerca de 3 vezes mais elevada para a amina exgena) do mesmo grau da verificada para a estimulao transmural podendo depender, portanto, dos mesmos fenmenos.

Tabela 3. Preparao nervo hipogstrico-canal deferente: contedo tecidual de noradrenalina e de adrenalina aps incubao com 2,3 umol/l de adrenalina durante 60 min seguida de 120 min de lavagem. Libertao por estimulao do nervo hipogstrico (25 Hz, 2 mseg, 5 ou 10 V, 5 seg/min durante 30 min).

Teor tecidual ug/g

Efluxo de aminas no lquido de perifuso Teor tecidual

ug/g ng/30min. fraco de libertao

(x10-3) A B A B A B

Noradrelina

Adrenalina

30,57 31,84 3,96 1,94

2,23 0,51

3,79 3,87 1,29 1,66

0,64 0,18

0,58 a 0,75 0,17 0,30

1,83 b 0,59

Resultados expressos em mdias aritmticas erro padro (n=4). Em A apresen-tam-se os resultados referentes ao tecido incubado com adrenalina e em B, os res-peitantes ao canal deferente contralateral incubado sem adrenalina (controlo). A diferena entre ae b estatisticamente significativa.

27

Libertao de adrenalina pelo io potssio

Outro dos agentes usados no nosso estudo para induzir a libertao de ami-nas a partir de terminais adrenrgicos foi o io potssio. Segundo Thoa et ai. (1975), o mecanismo pelo qual se faz a libertao provocada pelo potssio do canal defe-rente de Cobaia muito semelhante ao que est na base da libertao induzida pela estimulao elctrica. Neste conjunto de experincias procedeu-se, tambm, previamente incorporao de adrenalina nos terminais mediante a incubao com 2,3 umol/l de adrenalina durante 60 min. No fim da incubao o teor em adre-nalina e noradrenalina era respectivamente de 2,38 e 19,14 ug/g (tabela 4). O teor de noradrenalina no foi significativamente diferente do do canal de controlo. Aps a lavagem de 120 min que se seguiu incubao, a adio de 50 mmol/l de KCI ao lquido de perifuso causou uma libertao de ambas as aminas. Mais uma vez, o teor em aminas do efluxo mostrou que a quantidade de adrenalina proporcional-mente maior do que a de noradrenalina. Enquanto que no tecido o teor de noradre-nalina cerca de 8 vezes maior do que o de adrenalina, no efluxo a noradrenalina s aparece numa quantidade 2 a 4 vezes superior.

Tabela 4. Canal deferente: contedo tecidual de noradrenalina e de adrenalina aps a incubao com 2,3 umol/l de adrenalina durante 60 min seguida de 120 min de lavagem. Sua libertao pelo potssio (50 mmol/l durante 10 min).

Teor tecidual ug/g

Efluxo de aminas no lquido de perifuso Teor tecidual

ug/g ng/10min fraco de libertao

(x103) A B A B A B

Noradrenalina

Adrenalina

19,14 19,31 1,50 1,71

2,38 0,90

9,89 9,84 1,62 0,60 3,47 0,82

6,38 a 7,28 1,40 0,52 18,00 b

3,26

Resultados expressos em mdias aritmticas erro padro (n=5). Em A apresen-tam-se os resultados referentes ao tecido incubado com adrenalina e em B, os res-peitantes ao canal deferente contralateral incubado sem adrenalina (controlo). A diferena entre ae b estatisticamente significativa.

Libertao de adrenalina pela tiramina

Apesar de se tratar de um estmulo que actua por um mecanismo diferente, tambm a adio de tiramina nas concentraes de 40 a 160 umol/l mostrou uma capacidade de induzir uma libertao com uma fraco de libertao que supe-rior no caso da adrenalina (tabelas 5 e 6).

28

Tabela 5. Canal deferente: contedo tecidual de noradrenalina e de adrenalina aps incubao com 2,3 (jmol/l de adrenalina durante 60 min seguida de 120 min de lavagem. Libertao pela tiramina (40 umol/l durante 15 min).

Teor tecidual ug/g

Efluxo de aminas no lquido de perifuso Teor tecidual

ug/g ng/15min

fraco de libertao (x103)

A B A B A B

Noradrenalina

Adrenalina

16,99 16,31 2,74 3,32

2,14 0,72

30,82 18,70 3,27 0,68

10,04 3,42

35,11a 22,36 1,71 0,91

89,88 b 5,71

Resultados expressos em mdias aritmticas erro padro (n=5). Em A apresen-tam-se os resultados referentes ao tecido incubado com adrenalina e em B, os res-peitantes ao canal deferente contralateral incubado sem adrenalina (controlo). A diferena entre ae b estatisticamente significativa.

Tabela 6. Canal deferente: contedo tecidual de noradrenalina e de adrenalina aps incubao com 2,3 umol/l de adrenalina durante 60 min seguida de 120 min de lavagem. Libertao pela tiramina (160 pmol/l durante 15 min).

Teor tecidual ug/g

Efluxo de aminas no lquido de perifuso Teor tecidual

ug/g ng/15min traco de libertao

(x 103) A B A B A B

Noradrenalina

Adrenalina

19,14 19,31 1,50 1,71

2,38 0,90

9,89 9,84 1,62 0,60

3,47 0,82

6,38 a 7,28 1,40 0,52

18,00 b 3,26

Resultados expressos em mdias aritmticas erro padro (n=3). Em A apresen-tam-se os resultados referentes ao tecido incubado com adrenalina e em B, os res-peitantes ao canal deferente contralateral incubado sem adrenalina (controlo). A diferena entre ae b estatisticamente significativa.

29

Influncia da inibio dos receptores pr-sinpticos a, na libertao da noradrenalina endgena e tritiada do canal deferente por estimulao transmural.

Outra forma de comparar o comportamento do mediador fisiolgico com o de aminas exgenas incorporadas do exterior nos terminais adrenrgicos estudar a influncia pr-sinptica exercida sobre a libertao de ambas. Como se v na tabela 7, o bloqueio dos receptores pr-sinpticos pela fentolamina provoca um factor de aumento de cerca de 1,9 vezes quer para a noradrenalina endgena quer para a tritiada.

Tabela 7. Canal deferente: efeito da fentolamina (3 umol/l) sobre o efluxo de nora-drenalina endgena e tritiada induzido por estimulao transmural (1 Hz, 2 mseg, 100 V durante 25 min). A preparao foi incubada com 2,3 umol/l de 3H-(-)- nora-drenalina durante 60 min, lavada durante 120 min e submetida a estimulao 50 min (S1) e140 min (S2) depois. A fentolamina foi introduzida entre S1 e S2.

Fraco de libertao (x 103)

S1 S2 S2/S1

Endgena

Tritiada

4,63 (3,38 6,33) a 13,64 (971 19,16) t>

8,55 (5,92 12,35) c

25,93 (21,54 31,21) d

1,85 e (1,42 2,40)

1,90 f (1,44 2,52)

Resultados expressos em mdias geomtricas e intervalos de 95% de confiana (n=5). As diferenas entre a e b e entre c e d so estatisticamente significativas. A diferena entre e e f no significativa.

Auto-radiografias

A distribuio dos gros de prata pelas diferentes camadas do canal defe-rente no foi quantificada atravs da determinao da sua densidade, mas a observao das lminas ao microscpio mostrou um padro constante com uma assimetria marcada. Os gros de prata no tm uma distribuio uniforme mas, em corte transversal pode verficar-se que a sua concentrao se faz de forma evi-dente nas camadas mais externas do tecido enquanto que as pores mais pro-fundas do canal deferente apresentam uma marcao muito mais rarefeita.

30

As fotografias reproduzidas nas figuras 9 e 10 mostram diferentes aspectos desta concentrao preferencial dos gros de prata nas camadas mais externas da preparao.

Como acontece noutras preparaes as artrias e veias de pequeno calibre existentes na espessura do parnquima apresentam-se intensamente marcadas (Fig. 11 e 12). As imagens lineares correspondem a trajectos nervosos.

Fig. 9 e 10. Auto-radiografias de luz de cortes transversais de canal deferente de Cobaia incubado em Krebs-Henseleit contendo 2,3 pmol/l de 3H-(-)-noradrena-lina durante 60 min. O meio contm 41 pmol/l de hidrocortisona e a preparao foi previamente tratada com pargilina (1 mmol/l). Os gros de prata acumulam-se pre-ferencialmente nas camadas mais externas do canal deferente. Imagens obtidas com 30 dias de exposio. Zona mais perifrica do rgo.

31

Mr '(If" SB-* * *#' *.v ". " '' -i

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Fig. 11 e 12. Autoradiografias de luz de cortes transversais de canal deferente de Cobaia incubado em KrebsHenseleit contendo 2,3 umol/l de 3H()noradrenalina durante 60 min. O meio contm 41 umol/l de hidrocortisona e a preparao foi exposta previamente a pargilina (1 mmol/l), durante 30 min. Observamse trajectos lineares com o aspecto habitualmente produzido pela acumulao de aminas marcadas em nervos adrenrgicos. Na zona entre a camada mdia e a adventcia da parede de um vaso de pequeno calibre pode observarse tambm uma deposio de gros de prata muito tpica das estruturas vasculares com uma inervao simptica de predomnio adventciomedial. Imagens obtidas com 30 dias de exposio.

32

Discusso

O objectivo directo das experincias realizadas foi quantificar, ao mesmo tempo, a libertao a partir de terminais neuroniais de noradrenalina endgena e de substncias exgenas incorporadas do exterior nesses terminais neuroniais, com o fim de serem utilizadas como marcadores da libertao da noradrenalina endgena. A medio do efluxo provocado de noradrenalina endgena e dos mar-cadores (adrenalina ou 3H-noradrenalina) por cromatografia lquida de alta pres-so com deteco electroqumica e por cintilometria lquida mostrou que, no canal deferente de Cobaia isolado ou na preparao de nervo hipogstrico-canal defe-rente da mesma espcie, as substncias recentemente incorporadas so armaze-nadas, em percentagem maior do que a amina endgena, em depsitos mais facil-mente mobilizveis por diversos agentes indutores da libertao.

O "efeito istopo"

O problema que foi abordado neste trabalho pode estar sujeito discusso mais geral sobre o emprego de substncias exgenas que, pela facilidade com que so detectadas e quantificadas, se introduzem experimentalmente em siste-mas biolgicos para identificar e medir os processos de transporte, de fixao ou de metabolizao que ocorrem com substncias difceis de isolar ou dosear. No objectivo do trabalho discutir os critrios gerais de definio de um marcador e pro-curar em seguida aplic-los, em particular, ao estudo da fisiologia do sistema adre-nrgico. Importa, no entanto, que a interpretao dos resultados se inicie a partir dum princpio bvio que por descuido de linguagem demasiadas vezes esque-cido: os compostos, radioactivos ou no, usados experimentalmente como "mar-cadores" (palavra aqui entendida no sentido restrito do termo "tracers" em expres-so inglesa) no marcam a presena de nenhuma substncia endgena com a qual possam ser mais ou menos parecidos; detectam, sim, a presena de enzi-mas ou de transportadores que provavelmente tm afinidade tambm para subs-tncias endgenas. Prolongando o risco de crtica por exerccio intil de linguagem - veja-se, a este propsito, o apelo feito por Trendelenburg (1983), para que se minimizem os efeitos laterais da linguagem imprecisa em Farmacologia pode dar-se o exemplo de que o istopo radioactivo da (-)- noradrenalina obtido por introduo de um tomo de trtio no carbono B no tem a propriedade de mar-car os locais onde est presente a noradrenalina fisiolgica. De maneira restrita, as experincias com noradrenalina tritiada permitem apenas concluir se h ou no sistemas de transporte ou metabolizao saturveis e selectivos para a noradrena-lina tritiada e medir as constantes cinticas (Km e Vmax) do transporte ou da bio-transformao desse istopo radioactivo. Do conhecimento geral que se tem do uso de istopos radioactivos presume-se que esses enzimas ou esses transporta-dores tm igualmente afinidade para a molcula no radioactiva do transmissor endgeno. Conhecida a cintica da substncia radioactiva "traa-se", assim, o modelo da cintica da substncia endgena.

33

Deve reconhecer-se que a situao extrema de falta de afinidade de um transportador ou de um enzima para a substncia endgena quando se demonstra uma alta afinidade do sistema para um istopo radioactivo dessa mesma substn-cia um fenmeno inslito. No entanto, no se podem transpor os valores do Vmax ou do Km obtidos com o substrato radioactivo para o substrato biolgico. O mtodo radioqumico excelente para indicar a presena de sistemas de transporte ou de biotransformao num determinado rgo mas no pode medir directamente as constantes cinticas para outros compostos que no sejam o prprio istopo usado.

O protocolo experimental seguido neste trabalho no permite a determinao de constantes cinticas. No entanto, os valores da acumulao obtidos no pre-sente trabalho so uma consequncia directa das constantes de proporcionali-dade (Km) e da capacidade (Vmax) da captao neuronial e da fixao intraneuro-nial (captao vesicular) a locais de armazenamento estvel. Se existirem valores diferentes para essas caractersticas cinticas entre a()- noradrenalina e a3H-()-noradrenalina os resultados da acumulao podero s por isso ser diferentes. Existem resultados publicados que mostram a validade deste argumento.

O "efeito istopo" do deutrio introduzido em aminas simpaticomimticas ficou conhecido bastante cedo (Belleau ef ai. 1961 ) com a descrio de uma redu-o da desaminao da tiramina pela MAO quando se colocava um tomo de deu-trio em posio 8.0 trtio um substituto ainda mais "volumoso" do que o deutrio e teria partida uma maior possibilidade de interferir na afinidade da molcula para sistemas biolgicos activos. No entanto o "efeito istopo" do trtio na noradrenalina s foi estudado em 1983 (Trendelenburg ef a/.), motivado por dificuldades na inter-pretao de resultados experimentais obtidos com o uso de preparaes comer-cialmente disponveis de 3H- noradrenalina (Starke et al. 1980). O estudo sistemati-zado (Trendelenburg et al. 1983;Grohmannefa/. 1986;Henseling 1987) de diver-sos istopos radioactivos contendo trtio em diferentes posies e em diferente nmero em cada molcula de catecolamina mostrou diferenas quantitativas que nalguns casos eram muito marcadas. Assim, a (-)-adrenalina de alta actividade especfica marcada com trtio no anel cateclico tem uma constante de proporcio-nalidade inicial para a captao extraneuronial no corao de Rato que 5,6 vezes menor do que a da (-)-adrenalina no radioactiva (Grohmann e Trendelenburg 1983).

bem claro que nas condies experimentais do presente trabalho, no possvel definir e comparar constantes cinticas para a noradrenalina endgena e para a 3H- noradrenalina. Uma preparao no homogeneizada tem diferentes pro-cessos de transporte e metabolizao a funcionar em simultneo, por vezes mesmo em srie e em vicarincia. Por isso s se pode estudar a cintica de um sis-tema quando os restantes esto bloqueados. No protocolo experimental seguido (ver mtodos) procurou-se apenas inibir a desaminao oxidativa (intra e extraneu-ronial) e a captao extraneuronial sensvel aos corticosterides. Ficam assim acti-vas, pelo menos, a captao vesicular (sensvel reserpina), a captao neuronial (sensvel cocana) e parte da O-metilao no dependente do transporte corti-costeride-sensvel. No entanto, a anlise dos valores das fraces de libertao mostrou diferenas de comportamento muito marcado entre a 3H- noradrenalina e a noradrenalina endgena.

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Os valores encontrados para a libertao por pulso esto de acordo com os descritos na literatura para o canal deferente de Cobaia e para caractersticas semelhantes do estmulo elctrico (Stjarne 1973a; Belis et ai. 1982).

Os resultados da fraco de libertao da noradrenalina endgena so mais dificilmente confrontados com os referidos por outros autores porque se referem a mtodos de doseamento diferentes e em regra menos sensveis e especficos, a outras estruturas ou a experincias em que se utilizaram tratamentos farmacolgi-cos diferentes. No entanto, o fenmeno descrito neste trabalho de que a fraco de libertao da noradrenalina endgena menor do que a do istopo radioactivo, est de acordo com diferentes autores. Assim, Hughes (1973) foi capaz de eviden-ciar no canal deferente, atravs do doseamento da noradrenalina por aferio bio-lgica segundo um mtodo anteriormente desenvolvido por esse mesmo autor (Hughes 1972), uma maior fraco de libertao para a 3H- noradrenalina quando empregava pequenas concentraes na incubao ( 10 ng/l). Usando uma tcnica de HPLC semelhante que foi empregue por ns, Kahan ef ai. (1984) descreveram uma fraco de libertao da noradrenalina tritiada dupla da da noradrenalina endgena na circulao do msculo gracilis de Co. Note-se ainda que o primeiro trabalho em que se estudou por HPLC a libertao da noradrenalina expressa em fraco o de Wakade e Wakade (1981) que registaram claramente (figura 3 desse trabalho) uma diferena de cerca de 7 vezes entre a libertao da noradre-nalina tritiada e a da noradrenalina total (corao de Cobaia, estimulao transmu-ral) embora no tenham feito qualquer comentrio a esse resultado no texto do seu trabalho.

Pode concluir-se, em resumo, que a 3H- noradrenalina tem uma libertao por estimulao transmural do canal deferente de Cobaia superior da noradrenalina biognica. Este fenmeno pode ser a consequncia de um efeito istopo do trtio mas pode tambm resultar apenas da via de incorporao da amina e ser por isso independente da natureza radioactiva ou no da molcula em causa. Os resulta-dos da libertao da adrenalina no radioactiva incorporada nos terminais simpti-cos em condies idnticas s utilizadas para a 3H-noradrenalina permitem res-ponder a esta questo.

Libertao de aminas exgenas diferentes utilizando o mesmo estmulo libertador

Para se verificar se a libertao preferencial da 3H-(-)- noradrenalina induzida pela estimulao elctrica transmural um fenmeno prprio dessa substncia incorporada foi necessrio escolher um outro composto que fosse captado pela terminao simptica, fosse acumulado no seu interior e fosse mobilizado pela estimulao elctrica. A adrenalina preenche todos estes requisitos e foi utilizada em experincias feitas nas mesmas condies em que decorreram as experin-cias com noradrenalina tritiada. Esta catecolamina oferecia ainda a vantagem adi-cional de ser facilmente distinguida da noradrenalina endgena por cromatografia

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lquida de alta presso, ficando assim dispensado o uso de uma molcula radioac-tiva para a qual se poderia sempre invocar um "efeito istopo".

A acumulao de adrenalina exgena em rgos com inervao simptica um facto bem provado e que curiosamente comeou a ser descoberto antes de idntica descrio para a prpria noradrenalina. No clssico trabalho de 1959, Axelrod ef ai verificaram que a 3H- adrenalina injectada por via endovenosa no Gato desaparece rapidamente do plasma, sobretudo por aco da COMT, mas uma grande parte permanece intacta durante algumas horas em vrios tecidos, sobre-tudo nos que tm inervao adrenrgica rica. Sem terem ainda proposto explicita-mente a acumulao neuronial simptica de adrenalina, os autores descreviam j que "It is possible that the bound form of epinephrine represents a local store from which epinephrine can be released". Estes resultados s dois anos mais tarde foram reproduzidos com a injeco endovenosa de noradrenalina tritiada (Whitby tal. 1961). A prova definitiva da incorporao das catecolaminas exgenas nos terminais adrenrgicos foi estabelecida de forma inequvoca pela ausncia de marcao radioactiva aps desnervao experimental dos tecidos (Hertting et ai. 1961a), pela abolio da captao dos compostos radioactivos por inibio da captao neuronial conseguida atravs da cocana (Hertting et ai. 1961b) pela mobilizao do marcador pelos mesmos estmulos que se sabe mobilizarem a noradrenalina dos terminais como o estmulo elctrico (Hertting e Axelrod 1961 ) ou a exposio tiramina (Bum e Burn 1961 ; Hertting e ai. 1961 b; Kopin e Gordon 1962) e pela depleo simultnea dos depsitos marcados e no marcados pelo trtio causada pelo tratamento dos animais com reserpina (Hertting et ai. 1961b; Kopin e Gordon 1962). A comprovao directa de que a adrenalina seguia o mesmo percurso, isto , acumulao intraneuronial simptica em depsitos mobi-lizadas pela estimulao nervosa foi obtida pouco tempo depois (Andn 1964; Roseli et ai. 1964).

A comparao directa da acumulao e libertao da adrenalina com a da noradrenalina exgena utilizando a mesma estrutura e o mesmo estmulo liberta-dor foi realizada na veia safena de Co por Guimares ef a/.(1978) e Brando ef ai. (1980b). Apesar da existncia de diferenas na libertao das duas aminas que podem ser atribudas a diferentes afinidades para locais de perda (Guimares e Pavia 1977; Paiva e Guimares 1978) e para os receptores presentes nas bifases da juno neuroefectora simptica (Guimares e Paiva 1981 a, 1981 b; Guimares 1982; Guimares et ai 1982) os resultados dos dois trabalhos atrs citados mos-tram uma grande similitude entre o processo de libertao neuronial de adrenalina e o que ocorre com a libertao de noradrenalina tritiada por estimulao nervosa (Brando e Guimares 1974; Brando 1977).

Estes conhecimentos tornam possvel comparar os resultados das experin-cias realizadas no presente trabalho com-noradrenaltna radioactiva e com adrena-lina no marcada. O facto posto em evidncia para a 3H-(-)- noradrenalina de que a amina exgena tem uma fraco de libertao maior do que a noradrenalina endgena foi tambm reproduzido nas experincias em que se incorporou adre-nalina na preparao. Assim, para a concentrao de adrenalina no lquido de incu-bao de 2,3 mmol/l o teor tecidual de amina exgena e a sua libertao induzida

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pela estimulao transmural so muito semelhantes aos observados com a nora-drenalina radioactiva. Este dado um argumento importante a favor duma interpre-tao que favorece mais a via de acesso do que a natureza da amina captada para o terminal simptico: as aminas recentemente incorporadas, independentemente da sua estrutura qumica, depositam-se em locais mais perifricos de cada termi-nal e que so mais acessveis aco libertadora do estmulo elctrico. Esta con-cluso est de acordo com a hiptese j proposta por Crout (1964) para explicar a curva de desaparecimento da noradrenalina tritiada do corao de cobaias previa-mente injectadas com a amina radioactiva: "It is postulated that "firmly-bound" 3H-norepinephrine released asa transmitter is derived largely from granules lying near the axonal membrane".

Libertao da mesma amina exgena utilizando diferentes agentes libertadores

Um argumento importante para distinguir se a elevada fraco de libertao das aminas exgenas est dependente de um tipo particular de mecanismo ou se pelo contrrio, resulta apenas de uma localizao mais perifrica no nervo de qual-quer marcador que nele seja incorporado do exterior, obtem-se com a analise dos resultados em que se utilizou sempre a incorporao de uma mesma amina (adre-nalina) e em que a preparao que a continha era submetida a estmulos de natu-reza diferente. Como a fraco de libertao da adrenalina se manteve sempre mais elevada do que a fraco de libertao da noradrenalina endgena, indepen-dentemente do estmulo (estimulao elctrica transmural, estimulao elctrica do nervo hipogstrico, exposio a concentraes elevadas de potssio ou exposi-o tiramina), conclui-se que a causa principal da maior libertao da amina recentemente incorporada a sua localizao mais prxima dos locais de liberta-o.

A libertao induzida pela tiramina tem muitas caractersticas adequadas sua utilizao como utenslio experimental para demonstrar que a incorporao recente de uma amina exgena se faz para locais prximos da membrana e que so, por isso, mais acessveis a qualquer forma de estmulo libertador: por um lado, possvel discriminar, atravs do seu uso, a existncia de diferentes compartimen-tos intraneuroniais quanto facilidade com que participam no efluxo provocado; por outro lado, o seu mecanismo de aco inteiramente diferente do da estimula-o elctrica, embora possa existir uma coincidncia topogrfica entre reas influenciadas por essas duas formas de estmulos promotores da libertao do transmissor adrenrgico.

Foi atravs da utilizao de tiramina que Trendelenburg (1961 ) props, no seu trabalho pioneiro, a existncia de diferentes locais de armazenamento intraneuro-nial da noradrenalina com significado funcional diferente: um pequeno depsito cuja mobilizao permitia a manuteno das respostas simpaticomimticas tira-mina ("available') e um segundo compartimento fixo {"bound') depletvel pela reserpina. Neste mesmo artigo se oferecia tambm a interpretao de que a nora

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drenalina circulante podia ser captada para o pequeno compartimento sensvel aco da tiramina o que explicaria os resultados de Muscholl ( 1960) que restabele-ceu o efeito hipertensor da tiramina em ratos reserpinizados atravs da injeco de pequenas doses de noradrenalina que no refizeram os depsitos tecidulares esgotados pela reserpina. Basta repor, por exemplo, 2% do teortecidual de nora-drenalina para restabelecer 70% da resposta da aurcula de Cobaia reserpinizada tiramina (Crout et ai. 1962).

A segunda razo importante da escolha da tiramina no presente trabalho foi a possibilidade de induzir libertao por um mecanismo diferente do da estimulao elctrica. Desde que Bum e Rand (1958) provaram em animais reserpinizados que a tiramina exerce os seus efeitos atravs da promoo da libertao de noradrena-lina o mecanismo de aco das aminas simpaticomimticas foi intensamente investigado encontrando-se numerosas diferenas em relao ao estmulo ner-voso: no sensvel aco da tetrodotoxina (Bell 1968), no depende da pre-sena extracelular do clcio (Thoenen ef ai. 1969), no afecta a libertao de dopa-mina-(3-hidroxlase (Chubb ef ai. 1972) no exocittico (Thoa ef ai. 1975) e no modulado pela angiotensina (Starke 1971a), pela activao de receptores a pr-sinpticos (Starke e Montei 1973,1974) ou pelo AMP cclico intracelular (Gthert e Hentrich 1986).

O mecanismo da libertao induzida pela tiramina dos terminais adrenrgi-cos tem como fase final um efluxo da noradrelina mediado por transportadores selectivos da membrana neuronial que carreiam a amina do axoplasma para o espao extracelular. Este movimento postulado pela primeira vez por Paton (1973) e a que o autor chamou "accelerative exchange diffusion process" realiza-se quando uma amina captada pelo sistema de transporte^ neuronial sensvel cocana. o mesmo transportador, trazido para a face interna da membrana celular durante a fase de captao da tiramina, que movimenta depois a noradrenalina recolhida do axoplasma em direco contrria, sendo o movimento tanto mais rpido e intenso quanto maior for a concentrao de tiramina oferecida (Bnisch e Rodrigues-Pereira 1983). Esta hiptese modificada para incluir um cotransporte de sdio (Sammet e Graefe 1979; Stute e Trendelenburg 1984) e de cloreto (Friedrich e Bnisch 1986) foi corroborada em experincias efectuadas com canais deferen-tes isolados submetidos ou no a tratamentos com reserpina e pargilina (Langeloh ef ai. 1987; Langeloh e Trendelenburg 1987).

No entanto este transporte de sada (afinal da mesma natureza, mas em sen-tido contrrio ao da captao neuronial sensvel cocana) apenas a fase final do mecanismo libertador da tiramina porque, em preparaes no reserpinizadas, como os canais deferentes que foram utilizados no trabalho presente, ocorre uma mobilizao muito intensa da amina vesicular para o axoplasma (requisito essen-cial para os libertadores bons - "good releasers"- como a tiramina e que falta nos libertadores fracos "poor releasers" como a guanetidina: Langeloh e Trende-lenburg 1987). Assim, qualquer que seja a aco da tiramina sobre as vesculas -elevao do pH intravesicular (Johnson ef ai. 1982; Philips 1982) ou inibio do transporte sensvel reserpina (Michalke ef ai. 1987)os factos relevantes para interpretar os resultados de libertao de uma amina recentemente incorporada

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pelo terminal so, por um lado, o de que a tiramina possui uma capacidade, segu-ramente grande, de mobilizar depsitos vesiculares e o de que as vesculas mais perifricas tm uma maior probabilidade de ser atingidas pela tiramina do que as vesculas mais profundas (Langeloh e Trendelenburg 1987).

A escolha da adrenalina como amina exgena a utilizar no presente trabalho justifica-se pela capacidade que a tiramina tem de libertar adrenalina incorporada do exterior de forma semelhante que se passa com a noradrenalina radioactiva. Este conhecimento vem j das experincias de Burn (1932) que mostrou, na circu-lao da pata posterior de Co, um aumento muito marcado do efeito hipertensor da tiramina e da efedrina pela adio prvia de adrenalina ao sangue do circuito de perfuso. Experincias mais recentes provaram de forma muito clara que a adrena-lina incorporada in vitro em terminais simpticos libertada pela tiramina (Guima-res e Paiva 1981b).

O facto da libertao da adrenalina provocada pela tiramina expressa em frac-o do seu teor tecidual ser superior libertao da noradrenalina endgena expressa da mesma forma, corrobora a interpretao de que as aminas recente-mente incorporadas no terminal simptico se armazenam em vesculas mais prxi-mas da superfcie celular, a partir das quais se d, com mais facilidade, a sada para o espao extracelular. Esta interpretao est de acordo com os resultados de experincias com incorporao de noradrenalina tritiada e exposio tiramina (no corao isolado e perfundido do Rato: Potter era/. 1962; no miocrdio de Co: Chid-sey e Harrison 1963).

A comparao dos resultados obtidos com 40 e 160 umol/l de tiramina mos-tram que o seu efeito libertador da adrenalina recentemente incorporada depen-dente da concentrao. No se observou, no entanto, uma diferena significativa entre a relao das fraces de libertao da adrenalina e da noradrenalina end-gena obtida com a concentrao mais baixa e a correspondente relao obtida com a concentrao mais alta. Este resultado no est de acordo com as previses da interpretao muito bem documentada pela srie de trabalhos de Brando e colaboradores (Brando ef ai. 1978, 1980b, 1981,1985) segundo a qual todos os depsitos da amina simptica participam no efluxo pela tiramina, ao contrrio do que se passa com o estmulo elctrico para o qual existe uma fraco de noradre-nalina inacessvel. As concentraes crescentes de tiramina atingem vesculas progressivamente mais profundas atingindo a sua totalidade se forem usadas con-centraes muito elevadas durante longas exposies. Assim, previa-se que a fraco de libertao da noradrenalina endgena se aproximasse da da adrenalina com a utilizao da concentrao mais elevada. A ausncia deste resultado pode, no entanto, dever-se ao pequeno tempo de actuao da tiramina (presente estudo: 15 min; Brando ef a/. 1981: 100 min) e pequena variao das concentraes usadas (presente estudo: 40 a 160 umol/l; Brando etal. 1981:0,49 a3240 umol/l).

Existe uma diferena fundamental entre o mecanismo de libertao da tira-mina, por um lado, e, pelo outro, da estimulao elctrica transmural, da estimula-o elctrica do nervo ou da exposio ao potssio uma vez que para todo este ltimo grupo de estmulos a libertao se faz por exocitose, dependente do clcio e modulada por activao de adreno-receptores pr-sinpticos (para reviso ver Smith e Winkler 1972; Smith 1973; Starke 1977).

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No entanto, apesar da natureza geral do processo libertador ser a mesma, existem diferenas importantes para que se no possam considerar as experin-cias da estimulao nervosa e da despolarizao induzida pelo potssio como duplicaes das experincias de estimulao elctrica transmural.

Sabe-se que a presena de potssio no meio exterior em concentraes superiores a 20 mmol/l promove um aumento da permeabilidade da membrana dos nervos ao clcio e consequente activao do processo de exocitose. No entanto, ao contrrio do que se passa com a estimulao elctrica, o potencial de aco gerado pelo excesso de potssio muito fugaz e a libertao de amina man-tm-se mesmo depois de extinto esse potencial (Haeusler ef ai. 1968). Como argu-mentos adicionais de que o mecanismo ntimo da aco libertadora do potssio apresenta diferenas em relao ao da estimulao transmural apontam-se a pos-sibilidade de uma mobilizao parcialmente independente do clcio (Wakade e Kirpekar 1974) e a ausncia de activao da sntese de prostaglandinas com efeito pr-sinptico frenador (Stjrne 1973a).

Para alm de ter um mecanismo de libertao algo diferente do da estimula-o elctrica, a despolarizao pelo potssio um processo de libertao que, tal como o que posto em marcha pela tiramina, atinge, por difuso atravs da parede da preparao, terminaes simpticas profundas. Este facto tem importncia por-que alguns autores admitem que a estimulao elctrica transmural pode no atin-gir todos os terminais se a resistncia elctrica passagem do estmulo for muito mais elevada nos planos mais profundos do tecido do que na periferia que est em contacto com o lquido nutritivo (Brando ef a/. 1978). Apesar destas diferenas entre a estimulao transmural e a despolarizao induzida pelo potssio, a frac-o de libertao de adrenalina recentemente incorporada superior da nora-drenaline endgena em qualquer dos casos.

Apesar destas diferenas entre a estimulao transmural e a despolarizao induzida pelo potssio, a fraco de libertao da adrenalina recentemente incor-porada superior da noradrenalina endgena em qualquer dos casos.

A estimulao do nervo hipogstrico produz tambm uma libertao por mecanismo diferente do da estimulao directa do canal deferente porque ao nvel a que foi colocado o elctrodo as fibras nervosas so pr-sinpticas (Weiner e Rabadjija 1968; Wakade e Kirpekar 1971). Para este tipo de estmulo est hoje pro-vado por registos electrofisiolgicos feitos atravs de uma tcnica recentemente descrita (Brock e Cunnane 1987) que os potenciais de aco atingem todas as varicosidades, embora a libertao em cada uma delas seja intermitente (para revi-so ver Cunnane e Stjrne 1982, 1984a, b). No existe por isso a limitao atrs apontada para a propagao do estmulo elctrico aplicado transmuralmente. Nestas condies continua a obter-se uma libertao preferencial da adrenalina quando comparada com a noradrenalina endgena.

Relao entre a acumulao tecidual de uma amina exgena e a sua libertao

Se as aminas incorporadas do exterior so libertadas em maior proporo relativa ao teor tecidual do que a noradrenalina endgena porque a via de acumu-lao favorece o armazenamento em locais mais acessveis aos estmulos induto

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res de libertao, pode-se aceitar, como hiptese, que possvel atenuar aquela diferena mudando algumas das condies experimentais em que se faz a acu-mulao ou a libertao. Assim, aceitvel conjecturar que os seguintes factores experimentais favorecem a aproximao do comportamento da noradrenalina endgena e da amina exgena: o aumento do tempo de contacto da preparao com a substncia exgena; o aumento da intensidade do estmulo; finalmente, o aumento da quantidade da amina que incorporada no terminal.

Esta ltima possibilidade foi posta prova no presente trabalho atravs das experincias em que se determinaram as fraces de libertao de adrenalina incorporada no canal deferente em presena de concentraes crescentes dessa amina no lquido de incubao. Estes resultados sero aqui discutidos. No fim desta seco faz-se referncia aos resultados obtidos por outros autores que estu-daram a influncia das outras duas variveis acima indicadas (tempo de contacto e aumento da intensidade do estmulo) na aproximao dos valores de acumulao e libertao das aminas exgena e endgena.

Nas nossas experincias empregaram-se concentraes de adrenalina no lquido de incubao que variaram mais de 200 vezes (entre 0,6 mmol/l e 160 mmol/l). Os resultados da acumulao tecidual de adrenalina foram dependentes da concentrao utilizada, sem modificao marcada do teor tecidual da noradre-nalina endgena. Tambm se no observaram mudanas na fraco de libertao dessa noradrenalina endgena. Assim, a interpretao dos resultados da liberta-o da adrenalina em preparaes incubadas na presena de diferentes concen-traes de adrenalina simples: a fraco de libertao da adrenalina vai-se tor-nando cada vez mais baixa, e, por isso, cada vez mais prxima da da noradrenalina endgena, medida que a acumulao tecidual dessa adrenalina aumenta por-que a incorporao neuronial crescente de adrenalina vai envolvendo depsitos sucessivamente mais profundos e menos acessveis estimulao elctrica.

Hughes (1973a) chegou mesma concluso tendo como ponto de partida experincias de libertao de noradrenalina tritiada provocada por estimulao transmural do canal deferente de Coelho incubado na presena de duas concen-traes diferentes de 3H-(-)- noradrenalina (10 ou 100 ng/ml). Os resultados daquele autor mostraram que para a concentrao de 10 ng/ml, a fraco de liber-tao do istopo radioactivo era maior do que a fraco de libertao da noradre-nalina endgena (determinada por fluorimetria) enquanto que para a concentrao de 100 ng/ml j se no detectavam diferenas.

Embora haja acordo entre a concluso final de Hughes e a do presente tra-balho, existe uma discrepncia que necessrio analisar. Assim, a concentrao para a qual j se no detectavam diferenas no comportamento das duas aminas muito pequena quando comparada com as concentraes mais elevadas usadas neste trabalho e para as quais ainda se no atinge uma libertao sobreponvel do marcador e do mediador (100ng/ml de noradrenalina correspondem a 592 nmol/l enquanto que nas experincias deste trabalho se atingiram 160 (jmol/l de adrena-lina). Duas diferenas nas condies experimentais podem contribuir para esta discrepncia: por um lado a diferena da frequncia de estimulao e, por outro, a existncia de valores do teor tecidual de noradrenalina mais baixos.

Sabe-se, em relao com o primeiro ponto, que a fraco de libertao de noradrenalina por pulso est na estreita dependncia da frequncia dos estmulos e cresce linearmente com a progresso logartmica dessa frequncia (canal defe

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rente de Coelho: Hughes 1972; canal deferente de Cobaia: Stjrne 1973a). Por isso pode aceitar-se que a frequncia utilizada nestas experincias (1Hz) mobilize menos noradrenalina endgena do que a empregue por Hughes (2 a 16 Hz).

Em relao ao segundo ponto, verifica-se uma diferena ntida nas concen-traes teciduais de noradrenalina no radioactiva no canal deferente de Coelho determinadas por fluorimetria e no canal deferente de Cobaia determinadas por cromatografia lquida de alta presso e deteco electroqumica: 8,5-10 (jg/g (Hughes 1972) versus 15-20 \iglg no estudo presente. Quer resulte de uma dife-rena de tcnica ou de espcie animal, a influncia deste valor, que constitui o denominador da fraco de libertao, parece clara.

Nas nossas experincias o tempo de contacto da preparao com as aminas exgenas foi fixo. No entanto, resultados descritos por outros autores apoiam a interpretao segundo a qual quanto mais tempo decorrer entre a exposio dos tecidos aos compostos exgenos e a estimulao dos terminais, mais semelhante se tornam os comportamentos das aminas endgena e exgena. Em experincias de estimulao in vivo do nervo cardioacelerador de Co aps a administrao endovenosa de noradrenalina tritiada, a relao entre noradrenalina radioactiva e noradrenalina total maior no sangue do seio coronrio do que no tecido cardaco quando se faz a injeco da substncia radioactiva 60 min antes da estimulao. No entanto, se a administrao do istopo tritiado ocorre 24 ou 48 h antes da esti-mulao do nervo cardioacelerador j se no detectam diferenas nas propores noradrenalina radioactiva/noradrenalina total medidas no sangue e no corao (Chidsey e Harrison 1963). Tambm a libertao provocada pela tiramina no cora-o de Rato isolado e perfundido obtido a partir de animais a quem foi injectada noradrenalina tritiada com uma antecedncia de 30 min a 48 h mostra a influncia do tempo de incorporao da amina exgena na formao de misturas cada vez menos heterogneas com a noradrenalina endgena (Potter et ai. 1962). Os resul-tados destes autores mostram que a percentagem de istopo radioactivo que mobilizado pela tiramina tanto menor quanto maior foi a antecedncia com que se fez a administrao do istopo radioactivo.

Um terceiro resultado que confirma este fenmeno foi descrito para a estimu-lao transmural do canal deferente de Coelho incubado com 3H- noradrenalina 3 ou 8 h antes. Com o decorrer do tempo a percentagem de noradrenalina libertada que radioactiva vai sendo menor e torna-se igual percentagem de marcao radioactiva da noradrenalina tecidual (Hughes 1973a).

Tambm no podemos retirar concluses sobre a influncia da intensidade do estmulo nas diferenas entre a libertao da amina endgena e a recente-mente incorporada, uma vez que a variao deste factor foi pequena nas nossas condies experimentais. S nas experincias com tiramina se utilizaram estmu-los de eficcia diferente e, mesmo neste caso, a diferena entre os valores extre-mos das concentraes empregues foi pequena (40 e 160 (jmol/l). As diferenas entre as fraces de libertao da noradrenalina e da adrenalina recentemente incorporada mantm-se com o emprego da concentrao maior de tiramina. No entanto, a tiramina administrada in vivo em doses de 40 a 1000 pg/kg, no Co pre-viamente injectado com 3H-noradrenalina mobiliza para o seio coronrio uma

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quantidade total de noradrenalina crescente. Simultaneamente, a percentagem de radioactividade na amina libertada vai sendo menor e aproxima-se da observada no miocrdio (Chidsey e Harrison 1963).

Hughes (1973a) refere tambm que no canal deferente de Coelho incubado com 3H- noradrenalina a percentagem da amina libertada que radioactiva maior nas experincias conduzidas com 2 Hz do que com 16 Hz.

Pode em resumo concluir-se que a libertao preferencial da amina recente-mente incorporada tanto mais marcada quanto menor for a quantidade incorpo-rada, quanto mais recente for a incorporao e quanto menor for a intensidade do estmulo. Este conjunto de resultados so um forte argumento a favor da topografia diferente dos locais de acumulao das aminas incorporadas a partir do espao extracelular e da noradrenalina pr-existente no terminal simptico.

Relao entre a acumulao tecidual de uma amina exgena e o teor em noradrenalina endgena

Dos resultados da acumulao de adrenalina obtidos com diferentes concen-traes da amina no lquido de incubao pode retirar-se um outro argumento a favor da heterogeneidade da mistura entre a noradrenalina endgena e as aminas incorporadas do exterior.

A capacidade de acumulao de catecolaminas pelos terminais simpticos da veia safena e do canal deferente claramente superior aos depsitos habituais de noradrenalina endgena porque o teor total de amina aps incorporao de adrenalina maior do que o teor em catecolaminas (noradrenalina endgena) na situao de controlo. Este fenmeno evidencia-se na veia safena sobretudo nas experincias com a concentrao de adrenalina mais elevada, nas quais tam-bm mais notria a ausncia de uma reduo equivalente no teor da amina end-gena.

Nas experincias com o canal deferente a variao das concentraes de carga foi maior e verifica-se de forma ntida uma acumulao de teores teciduais de adrenalina crescentes sem reduo paralela dos nveis endgenos de noradre-nalina (Fig. 4). O valor mais alto atingido pelas concentraes de adrenalina no lquido de incubao foi de 160 |jmol/l e a ele corresponde uma acumulao de adrenalina no canal deferente que representa cerca de 50% do teor total de ami-nas. At concentrao utilizada no se observou saturao do processo de acu-mulao tecidual. Esta adrenalina acumulada na preparao encontra-se prova-velmente em depsitos neuroniais e no em compartimentos extraneurais, porque resistente lavagem do espao intercelular e dos compartimentos extraneuro-niais (a partir do 100." min de perifuso, o efluxo de noradrenalina no canal defe-rente de origem neuronial: Graefe ef a/. 1977) e porque quanto mais adrenalina tem o tecido maior a quantidade libertada por estmulos que caracteristicamente mobilizam depsitos neuroniais.

A principal concluso a tirar destes resultados a de que a acumulao de adrenalina se faz principalmente por adio e no por substituio, isto , no h

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tracas estoiquiomtricas entre a adrenalina incorporada do exterior e a noradrena-line endgena.

Apesar de ser frequentemente referenciada na literatura a possibilidade da acumulao com troca estoiquiomtrica entre o composto vindo do exterior e a noradrenalina endgena (ver Euler 1972) no h evidncia experimental directa de que este fenmeno ocorra de forma regular. Pelo contrrio, a possibilidade de cap-tao pelos terminais simpticos de aminas exgenas com aumento do teor total em amina tem sido comprovado em estruturas diferentes. Muscholl (1960) mos-trou que a aurcula de Cobaia capta noradrenalina exgena de forma a que o con-tedo tecidual duplica. Garrett e Branco (1977) demonstraram que a capacidade das artrias mesentricas acumularem noradrenalina exgena muito elevada e que apesar de terem um contedo elevado de noradrenalina endgena so capa-zes de reter aproximadamente outro tanto.

Localizao da noradrenalina tritiada por auto-radiografia

Algumas reservas ao emprego de mtodos auto-radiogrficos tm como fun-damento a hiptese de que nos tecidos sujeitos a fixao em meios lquidos, a desidratao em solventes orgnicos ou a incluso em materiais como a parafina ou as epoxi-resinas, o material radioactivo possa sofrer arrastamento dos locais onde estava originariamente localizado para zonas artificialmente favorecidas por artefacto da tcnica empregue (ver VanOrden 1976). Existe, pelo contrrio, o argu-mento favorvel segundo o qual estes processos de fixao, desidratao e inclu-so removem a substncia livre ou fixada por ligaes pouco estveis e que por isso tem maior probabilidade de corresponder a locais de acumulao biologica-mente pouco significativos.

Existe um importante nmero de trabalhos em que se empregaram simulta-neamente mtodos de auto-radiografia e mtodos de doseamento radioqumico. A correlao entre os resultados obtidos por uma e outra via mostram a validade dos estudos morfolgicos (Azevedo 1982; Azevedo et ai. 1983).

O canal deferente de Cobaia uma estrutura muito rica em nervos com mui-tas varicosidades ao longo do seu trajecto ("boutons-en-passant') e que nas pre-paraes de histofluorescncia feitas pelo mtodo de Falck e Hillarp formam um plexo muito denso e uniformemente distribudo portadas as camadas muscula-res lisas (ver Burnstock e Costa 1975) e ao longo de todo o seu comprimento (Wakade e Kirpekar 1971 ). H autores que descrevem, no canal deferente de Rato, uma pequena assimetria na densidade dos nervos tornados fluorescentes pelo aldedo frmico (Anton et al. 1977). Essa assimetria ocorre apenas no topo epididi-mrio e o seu padro oposto ao que observmos nas preparaes de auto-radio-grafia obtidas com a noradrenalina tritiada: enquanto que as auto-radiografias mostram uma acumulao preferencial de gros de prata nas camadas mais exte-riores do rgo, a histofluorescncia da poro epididimria do canal deferente de Rato revela que a camada circular interna mais densamente inervada do que a camada longitudinal externa (Anton et al. 1977).

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trocas estoiquiomtricas entre a adrenalina incorporada do exterior e a noradrena-lina endgena.

Apesar de ser frequentemente referenciada na literatura a possibilidade da acumulao com troca estoiquiomtrica entre o composto vindo do exterior e a noradrenalina endgena (ver Euler 1972) no h evidncia experimental directa de que este fenmeno ocorra de forma regular. Pelo contrrio, a possibilidade de cap-tao pelos terminais simpticos de aminas exgenas com aumento do teor total em amina tem sido comprovado em estruturas diferentes. Muscholl (1960) mos-trou que a aurcula de Cobaia capta noradrenalina exgena de forma a que o con-tedo tecidual duplica. Garrett e Branco (1977) demonstraram que a capacidade das artrias mesentricas acumularem noradrenalina exgena muito elevada e que apesar de terem um contedo elevado de noradrenalina endgena so capa-zes de reter aproximadamente outro tanto.

Duas explicaes se podem invocar para interpretar este resultado da marca-o auto-radiogrfica predominante nas camadas exteriores do canal deferente: a presena nas camadas mais profundas do rgo de fibras nervosas no adrener-gics incapazes de captar noradrenalina ou a dificuldade da noradrenalina ex-gena atingir, durante a incubao, nervos profundos capazes de a captar.

A observao do canal deferente de Cobaia pelo mtodo de histofluorescn-cia de Falck e Hillarp, caracterstico das catecolaminas, mostra abundantes trajec-tos fluorescentes correspondentes a nervos nas camadas que nas nossas prepa-raes no so marcadas pelos gros de prata correspondentes noradrenalina.

Para alm disso, pe-se actualmente em dvida que exista na parede do canal deferente um contingente importante de nervos vegetativos desprovidos de mecanismos de sntese, captao, armazenamento e libertao de noradrenalina. certo que a existncia de uma neurotransmisso no adrenrgica e no colinr-gica proposta de uma forma explcita por Burnstock ef ai. (1963) est hoje bem estabelecida em numerosos tecidos, incluindo o canal deferente de Cobaia (Ambache e Zar 1971). No entanto, o conceito de um terceiro sistema nervoso vegetativo formado por um contingente distinto de nervos no adrenrgicos e no colinrgicos no se revelou satisfatrio e foi substitudo pela hiptese diferente de que as duas divises clssicas do sistema nervoso vegetativo podem conter, para alm da noradrenalina ou da acetilcolina, outros neurotransmissores em diferentes propores (para reviso ver Burnstock 1986). O canal deferente um dos rgos em que se tem encontrado um nmero maior de efeitos resultantes da actividade nervosa que no so mediados pela noradrenalina. Sabe-se que a fase inicial rpida da contraco muscular provocada pelo ATP (Fedan