Embed Size (px)
Citation preview
Lezione V-VI martedì 18-X-2011
corso di genomica
laurea magistrale Biotecnologia Industriale
aula 8orario : Martedì ore 14.00 - 16.00
Giovedì ore 13.00 - 15.00
non ci sarà lezione martedì 1 e giovedì 3 Novembre
D. Frezza
se vi indignate
Non prendetevela con me !
Certo si potrebbe protestare di più e meglio sullo scarso investimento sulla cultura, ma è un ventennio che nessuno ci investe ed i risultati si vedono
Poca tecnologia nei nuovi investimenti a tutti i livelli
Questo per esempio è un settore in grande sviluppo ma per operarci in Italia non ci sono molti spazi
perché le riflessioni su evoluzione
È come dover parlare di architettura senza sapere con quali materiali si costruisce
Nell’800 è stato iserito l’uso dell’acciaio in edilizia(tour Eiffel 1889)Anche i romani conoscevano il calcestruzzoed il ferro però ne producevano di meno
Poi il cemento armato ha permesso strutture molto più leggere
Senza sapere come sono venuti fuori i genomi la descrizione sarebbe piatta e di difficile comprensione
QuickTime™ e undecompressore TIFF (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
polarismi scoperta con i sequenziamenti
procarioti ed eucarioti : variazione e conservazione
mettiamo insieme queste due evenienze formamlmente in opposizione.
abbiamo visto che esiste una polarità una discrepanza logica che appare spesso in natura,
la polarità è compatibile senza dover eliminare una delle due forme polari ?come possiamo rendere compatibile una contrapposizione così forte?
la risposta la sapete già: è possibile
i meccanismi che rendono possibile abbiamo detto che giocano sulla variabile tempo
gestire il polarismo
salviamo il polarismo utilizzando questa contraddizione,possono coesistere entrambe: variabilità e conservazione
il primo nei tempi lunghi, il secondo nel tempo breve
Abbiamo già detto: era implicita in Mendel la conservazione
era implicita in Darwin la variabilità delle specie una nell’altra
quando è stata scoperta la mutagenesi si è aperta una nuova finestra per interpretare questi due
fenomeni!
Sembrava difficile trovare la soluzione
la variabilità come mutazione
In the 1920s, Hermann Muller discovered that x-rays caused mutations in fruit flies. He went on to use x-rays to create Drosophila mutants that he used in his studies of genetics. He also discovered that x-rays not only mutate genes in fruit flies but also have effects on the genetic makeup of humans.[1] The first mutagens to be identified were carcinogens, or cancer-causing substances. Early physicians detected tumors in patients more than 2,000 years before the discovery of chromosomes and DNA. In 500 B.C., the Greek Hippocrates named crab-shaped tumors cancer, meaning crab.
1 Campbell, Neil A. and Jane B. Reece. Biology. 7th ed. San Francisco, CA: Pearson Education, Inc, 2005.
scoperta legata ad un evento tragico
chi scoprì il fenomeno legato alla variabilità genetica se ne accorse associando l’uso di sostanze tossiche belliche ad eventi di trasformazione genetica: le mutazioni
prima Muller con Drosofila e raggi X, poi UV e poi la chimica: mostarda azotata, azoiprite ed altre in seguito, scoperte dalla Charlotte Auerbach
mutagenesi chimica
The discovery of Mustard Gas by Charlotte Auerbach and Robson Science. 1947 Mar 7;105(2723):243-7.The Chemical Production of Mutations.Auerbach C, Robson JM, Carr JG.
Nature. 1946 Mar 9;157:302.Chemical production of mutations.AUERBACH C, ROBSON JM.
Perspectives on genetics: anecdotal, historical, and critical ... - Google Books ResultJames Franklin Crow, William F. Dove - 2000 - Medical - 723 pagesJune 1993 The Discovery of Mustard Gas Mutagenesis by Auerbach and Robson in ... had been obtained from experiments on chemical mutagenesis prior to 1940. ...books.google.it/books?isbn=029916604X...
bilanciato il polarismo?
possono coesistere variabilità e conservazione
studio dei genomi tramite sequenziamento completo
slancio nella ricerca genomica e sviluppo di nuove tecniche
nuove applicazioni di tecniche già note per sveltire i metodi
i genomi a disposizione
procarioti compatti ma senza meiosi (aploidi)
eucarioti con nuove strutture per la diploidia
la complicazione a partire dagli eucarioti unicellulari
lieviti, funghi, (Saccharomyces, Neurospora)
strutture di base invariate già dai procarioti:
RNA, ribosomi, tRNA, polimerasi, membrane,
le nuove evidenze:
la conoscenza negli eucarioti
strutture paraloghe che assumono nuove funzioni
(omologie analogie)
ma le nuove strutture ancora non si conoscono
si parte dai geni, ma sono il 5%
TUTTO IL RESTO é nuovo e questa è GENOMICA
si sapeva che c’era il DNA ripetuto: trasposoni, regioni GC rich, mini e microsatelliti e poi?Si consideravano regioni ricche di AT poco informative
i meccanismi dell’evoluzione elementare
i processi evolutivi sono lontani da essere compresi nella complessità
alcuni sono evidenti dalle analisi genomiche più semplici
come abbiamo detto i confronti “evolutivi” ci aiutano
i confronti ci parlano del rapporto tra funzione e strutture
i geni divergono e si duplicano
Geni ortologhi e geni paraloghi
Geni ortologhi: geni simili riscontrabili in organismi correlati traloro. Il fenomeno della speciazione porta alla divergenza dei geni e quindi delle proteine che essi codificano.es. la -globina di uomo e di topo hanno iniziato a divergere circa 80 milioni di anni fa, quando avvenne la divisione che dette vita ai primati e ai roditori. I due geni sono da considerarsi ortologhi.
Geni paraloghi: geni originati dalla duplicazione di un unico gene nello stesso organismo.es. -globina e -globina umana hanno iniziato a divergere inseguito alla duplicazione di un gene globinico ancestrale. I due geni sono da considerarsi paraloghi.
variabilità per divergenza
Gene ancestrale
duplicazione genica
Gene A
Gene B
speciazione
ortologhi
paraloghi
Gene A1 Gene A2
Gene B1
Specie 1
ortologhi Gene B2
Specie 2
alla scoperta del genoma:
allontanandosi dai geni
ricerca delle funzioni: analogia con il periodo precedente alla scoperta del codice genetico
interpretazioni: studi attraverso i confronti su modelli
i modelli sono validi perchè è esistita l’evoluzione
conclusione: il genoma è dinamico a breve e lungo termine
come ha fatto ad attrezzarsi per poter evolvere?
(cod. geni < del 5% del genoma)
come mai si usano organismi modello: ribadiamolo
è possibile perchè ci sono:
- i geni ortologhi (stessa origine nell’ancestrale e divergenza nelle specie successive), hanno la stessa funzione nelle specie diverse- i geni paraloghi derivano da duplicazioni e possono mantenere funzioni simili (DNA binding, kinasi ecc.)
(l’evoluzione rimane la premessa inevitabile)
l’unica spiegazione sembra autocelebrativa,
tautologica
il genoma non poteva esistere senza interazione (per definizione)
se la vita è nata nel mondo ad RNA e poi è venuto il DNA ed ha cominciato ad interagire con proteine diventandone dipendente, ma anche il responsabile, l’informazione genetica non poteva non essere dinamica.
come sarebbe il genoma non interattivo?
da dove parte l’interattività del genoma
non c’è funzione che non preveda interazione con altre strutture ed enzimi, l’informazione passa attraverso interazioni
- potrebbe risultare passivo quando deve essere replicato/duplicato; la struttura rende possibile ogni altra funzione che già conosciamo o che è ancora da individuare
- sembra passivo ma non lo è nemmeno per la sintesi dell’mRNA, manda segnali e ne riceve continuamente
cambia strutturalmente : per il differenziamento: epigenetica
meiosi: gameti: zigote: embrione: adulto
interazione del genoma nelle varie fasi
sotto il nome della regolazione
la struttura (anatomia)
informazioni per le funzioni
anche solo per la trascrizione la cromatina si altera
la trasformazione inizia molto prima della trascrizione
trascrizione = una delle funzioni finali
non c’è soluzione di continuitàl’interazione non è saltuaria
tutto il ciclo vitale di ogni organismo prevede interazione dinamica
ad ogni passaggio il DNA-cromatina subisce trasformazione, alterazioni
dallo zigote alle mitosi al differenziamento, ogni fase prevede quella successiva,il genoma riceve messaggi continuamente per sapere se fermarsi, procedere e cambiare funzioni
ovvio ma fondamentale
l’interazione genoma “ ambiente “ è continuo
gli stimoli devono permettere la reattività
ci deve essere esecuzione del programma
ci deve essere flessibilità
il programma può andare avanti se c’è “feedback”
bidirezionalità della trasformazione funzionale
genoma (cromatina)
ambiente: nucleo, citoplasma, extracellulare.....ecc.
quando il genoma si attiva è perchè c’è l’ambiente giusto per far partire determinate funzioni
come si inserisce la variabilità
le differenze esistono, si sono accumulate,
ad ogni meiosi si rimescolano
ogni organismo che nasce ha un genoma “ricombinante”
cosa comporta questa diversificazione ?
microvariabilità
i polimorfismi :genetica quantitativa
Interattoma modulabile (non solo tra proteine)
modulazione dovuta ad effetti dei polimorfismi(osservati col confronto tra fenotipi/genotipi)
turn-over (rapidità-lentezza)
effetti a cascata (attivazioni tramite trasformazioni post-traduzionali: fosforilazioni, metilazioni, glicosilazioni ecc.)
trasduzione del segnale tipica dell’interazione intra-extra cellulare e citoplasmatica - nucleare
dal nucleo al genoma e viceversa (ciclo continuo)
andata e ritorno
l’informazione arriva all’informatore e riparte(difficile separare i ruoli nel ciclo continuo)
è un artificio porre un inizio e scegliere lo zigote come start-point, si potrebbero prendere i gameti o le gonadi o l’individuo adulto
la trasduzione del segnale mette in comunicazione le varie parti della cellula e quindi dell’organismo
ogni punto di un ciclo può essere scelto come inizio o fine
adesso prendiamo il genoma come nostro riferimento
come possiamo approcciare il genoma in maniera globale
la post genomica (di già?)
dopo il sequenziamento dei genomi interi
ancora una volta si scopre di non sapere
è l’inizio del salto verso la genomica regolativa / o dello studio del genoma non tradotto
è riduttivo credere che si conosca il genoma conoscendo solo la porzione codificante
conseguenza: una parte del trascrittoma non è noto ignorando una bella parte delle funzioni del genoma
post genomica non significa che la genomica sia superata,va capito che non basta conoscere le sequenze genomiche
approcci globali e olistici
nuove metodologie
trascrittoma
proteoma - interattoma
ma il restante 95%?
95% ? wide genome screening
screening con tecniche diverse
studio nuovo
cosa si può analizzare
in che maniera
genomica obbligatoriamente porta al confronto tra i vari possibili organismi modello o intraspecie
centralità del modello umano oppure riferimento al modello umano (ricchezza di polimorfismi)
ricerca di modelli per trovare semplificazioni e generalizzazioni
cosa si vuole vedere ?
come sempre: strutture e variabilità
micro-arrays per ibridazione
resequencing shot-gun parziali o globali
SNPs e VNR
ogni 500 bp del genoma
i vari approcci
i diversi modelli permettono di produrre i nuovi approcci e le diverse tecniche
dalle domande generali a quelle più specifiche verso i meccanismi sottostanti
allargare l’interattoma anche alla interazione col genoma
pensare in maniera globale
cercare di essere onnicomprensivi (presuntuoso ma necessario)
il problema globale
rischio di genericità tutto o niente
lo studio con le libraies è stato l’inizio
i metodi globali: osservazioni col grand’angolo
necessità di non perdere anche i particolari
guardare dal satellite ma con una risoluzione altissima
osservazione diretta e indiretta
in quasi tutte le scienze si passa alla oservazione indiretta
il DNA o le proteine non le vediamo, abbiamo prove indirette
ci fidiamo delle osservazioni indirette ed il metodo passa attraverso l’uso dei controlli ossia della contraffabilità del risultato
ancora di più vale per bioinformatica in cui si lavora sotto simulazione
convergenza delle osservazioni e riprove
l’uso di organismi modello come riprova della universalità
osservazioni riproposte anche su organismi di specie diverse
difficoltà di riscontrare patologie in organismi molto diversi
possibilità di osservare fenotipi simili in organismi anche molto diversi
generalità di un fenomeno riscontrabile su altre specie(quanto più è generale)
troppi esempi
a riprova dell’universalità dei promotori eucariotici e procariotici : tutti i costrutti inducibili o costitutivi transfettati
cosa possiamo fare per capire il genoma nell’era post-genomica
mantenere la capacità di analisi nelle interazioni / variazioni
nel contesto e fuori contesto
in vitro veritas
fenotipi mutanti e polimorfismi
come può essere l’approccio sperimentale?
dove si guarda: nei possibili target (regioni predette) o con un sistema non “bias” onnicomprensivo senza selezione
cercando le funzioni genomiche
creazione di esche per trovare con cosa interagiscono
riprova in vivo con l’organismo transgenico per avere una conferma
approccio simmetrico
da un fenotipo ricerca del fenomeno da riprodurre in vitro
verificare se lo stesso costrutto interagisce con le stesse proteine
Esempio: tentativi non sempre di successo con two-hybrid systems, le tecniche hanno delle approssimazioni
esca e oggetto interagente (isolamento e conferma in vitro)
transcription factories
Simposio sulla struttura e funzioni del genoma
Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative BiologyCSH 17 maggio 2011, vol. LXXV
CH Eskiw, NF Cope, I Clay, S Schoenfelder, T Nagano and P Fraser.
Laboratory of Chromatin and Gene Expression, The Babraham Institute, Cambridge CB22 3AT, United Kingdom Correspondence: [email protected]
Passando alla struttura del genoma, nuove tecniche ed ipotesi
abstract transcript fact.CSHQ
The dynamic compartmental organization of the transcriptional machinery in mammalian nuclei places particular constraints on the spatial organization of the genome. The clustering of active RNA polymerase I transcription units from several chromo- somes at nucleoli is probably the best-characterized and universally accepted example. RNA polymerase II localization in mam- malian nuclei occurs in distinct concentrated foci that are several-fold fewer in number compared to the number of active genes and transcription units. Individual transcribed genes cluster at these shared transcription factories in a nonrandom manner, pref- erentially associating with heterologous, coregulated genes. We suggest that the three-dimensional (3D) conformation and rel- ative arrangement of chromosomes in the nucleus has a major role in delivering tissue-specific gene-expression programs.
riassunto art. Eskiw- Fraser
Il sistema dinamico della compartimentazione della macchina della trascrizione nel nucleo dei mammiferi pone dei limiti alla organizzazione spaziale del genoma. La localizzazione delle unità attive di trascrizione della RNA pol I di parecchi cromosomi nei nucleoli è l’esempio meglio caratterizzato ed accettato universalmente. I foci della RNA pol II concentrati nei nuclei di mamm. sono di meno rispetto al numero di geni ed alle unità di trascrizione. Unità di trascrizione di cluster di geni sono associate in maniera non random a “transcription factories” condivise in preferenza con geni eterologhi coregolati. Suggeriamo che la conformazione 3D e arrangiamenti relativi dei cromosomi nel nucleo abbiano un ruolo importante per attivare programmi di espressione genica tessuto specifica.
introduzione dell’articolo
Nella introduzione si parla di molti argomenti di questo corso di genomica. E’ grande interesse però è una storia che vi dovete leggere voi e di cui in gran parte vi ho già parlato nelle lezioni introduttive sulla genomica, per definirla ed identificarla.
Differente conoscenza
QuickTime™ e undecompressore TIFF (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
QuickTime™ e undecompressore TIFF (Non compresso)
sono necessari per visualizzare quest'immagine.
Tra nucleo e citoplasma
del nucleo si sa abbastanza poco: nucleolo, nucleoplasma, membrana interna/esterna, pori, cromatina (eu-
etero), ribosomi, ~matrice nucleare
del citoplasma: vacuoli, RE, centrioli, lisosomi, mitocondri, Golgi app., vescicole, citosol, citoscheletro, pori etc.
attività trascrizionale dei geni
Trascrizione dei geni più attivi discontinua e ad impulsi
Geni singoli alternano brevi periodi ad alta attività trascrizionale a periodi inattivi di durata variabile.
Il 90% degli alleli di e globina sono attivi allo stadio corretto con analisi FISH (fluoresc. in situ hybridization)
Topi transgenici con LCR deleta mostrano un pattern on / off dinamico suggerendo che la presenza stabilizzi lo stato on.
Tutte le cellule esprimono un basso livello di globina, ma solo una frazione mostra segnali di trascrizione con RNA FISH.
Per la maggior parte degli altri geni con FISH con sonde introniche si vede che geni attivi sono “off” per la maggior parte del tempo. (LCR = locus control region)
conseguenze regolative
La conseguenza di questi stadi di inattività prolungata è che questi geni possono essere modulati variando i livelli di espreessione genica alternando dinamicamente le fasi “on” e fasi “off”.Molto diverso che non modulare una fase di trascrizione continua rallentandola o accelerandola.
geni associano dinamicamente con “transcription factories”
Le TF (transcription factories) sono foci nucleari discreti che contengono alte conc. di RNA pol II fosforilata e sti di produzione di RNA nascente.
Analisi di geni singoli con immuno-FISH mostra invariabilmente segnali associati ai foci di RNApol II con la nascente sintesi di RNA nelle TF.
Analisi con immuno-FISH mostrano che gli alleli inattivi di geni attivi sono lontani dalle TF.
la cromatina dinamica nei territori occupati
Ipotesi :la dinamica della cromatina porta molti geni in attività a ricollocarsi fuori dai territori cromosomici
I geni perciò si muovono in TF preassemblate quando sono attivi ?
Inoltre i movimenti dinamici della cromatina hanno un ruolo nella regolazione della trascrizione muovendosi dentro e fuori dalle TF?
gene modello -globina
Tecnica RNA-FISH
cellule eritroidi in fase di maturazione
associazione di quasi tutti gli alleli nelle TF
Doppia marcatura di geni lontani attivi dello stesso cromosoma associano e condividono gli stessi TF dei geni della globina ad alte frequenze.
Geni a megabasi di distanza colocalizzano al 40-50% di più di una localizzazione random.Colocalizzazione di geni distanti con un’altra tecnica: 3C chromosome conformational capture.
altre evidenze con linfociti B murini
Linfociti B murini “resting” di milza esprimono alti livelli di IgH
Quasi tutti i loci delle catena IgH mostrano segnali RNA-FISH associati a TF- è un sist. modello come la globina per le cellule eritroidi
- induz. di geni early (Fos, Myc) in B resting - Fos e Myc non erano espressi al t.0- dopo 5 minuti la > parte di alleli F e M erano trascritti ed associati nei foci con RNA pol II; al 30% Fos sta a ~30 Mb dal locus IgH sul chrms 12 di topo- Myc sul crms 15 risulta al 25% nelle TF del locus IgH
