LEONIDA KOVAČIČ VPELJAVA METODE DOLOČITVE MUTACIJ … · 2011. 2. 16. · mastocitoza, neklasificirane MPN . Diplomska naloga Leonida Kovačič 2 1.1.1 ESENCIALNA TROMBOCITEMIJA

UNIVERZA V LJUBLJANI FAKULTETA ZA FARMACIJO

LEONIDA KOVAČIČ

VPELJAVA METODE DOLOČITVE MUTACIJ W515L IN W515K V RECEPTORJU ZA TROMBOPOETIN, Z

NAČINOM VERIŽNE REAKCIJE S POLIMERAZO V REALNEM ČASU, PRI BOLNIKIH Z ESENCIALNO

TROMBOCITEMIJO

THE THROMBOPOIETIN RECEPTOR W515L AND W515K MUTATIONS DETECTION BY REAL TIME POLYMERASE CHAIN REACTION IN ESSENTIAL THROMBOCYTHEMIA

PATIENTS

DIPLOMSKA NALOGA

Ljubljana, 2011

Diplomsko nalogo sem opravljala v Specializiranem hematološkem laboratoriju Kliničnega

oddelka za hematologijo, Univerzitetnega kliničnega centra Ljubljana, pod mentorstvom

doc. dr. Uroša Mlakarja, dr. med. in somentorstvom asist. dr. Tadeja Pajiča, spec. med.

biokem.

Zahvala Iskreno se zahvaljujem vsem, ki so mi pri izdelavi diplomske naloge nesebično pomagali s

svojimi strokovnimi nasveti in praktičnimi izkušnjami. Na prvem mestu gre zahvala

somentorju asist. dr. Tadeju Pajiču, spec. med. biokem, ki me je vzel pod svoje okrilje in

mentorju doc.dr. Urošu Mlakarju, dr. med. za vodenje in pravilen potek diplomske naloge.

Posebna zahvala gre tudi celotnemu osebju Specializiranega hematološkega laboratorija

UKC Ljubljana, še posebno osebju, ki dela na področju molekularne genetike (Nejcu

Lamovšku, Martini Fink, Mariji-Jedrt Mandelc Mazaj, Anici Mihajlović in Urški Baruca),

ki me je zelo lepo sprejelo medse in mi omogočilo prijetno delovno okolje, v katerem se

strokovno izpopolnjujem že dobro leto in pol.

Na tem mestu pa se seveda zahvaljujem tudi vsem ostalim, predvsem staršem, bratu, moji

(naj)boljši polovici Damjanu in vsem sošolcem in prijateljem, ki ste me pri mojem študiju

vzpodbujali in bodrili ter mi vedno stali ob strani. Upam da vas nisem razočarala…

Izjava

Izjavljam, da sem diplomsko delo samostojno izdelala pod mentorstvom doc. dr. Uroša

Mlakarja, dr. med. in somentorstvom asist. dr. Tadeja Pajiča, spec. med. biokem.

Predsednik komisije: izr. prof. dr. Darko Černe, mag. farm., spec. med. biokem.

Član komisije: doc. dr. Tomaž Vovk, mag. farm.

Ljubljana, 2011

Diplomska naloga Leonida Kovačič

I

VSEBINA

VSEBINA.......................................................................................................I

KAZALO SLIK......................................................................................... III

KAZALO PREGLEDNIC ........................................................................ III

POVZETEK ................................................................................................ V

SEZNAM OKRAJŠAV..............................................................................VI

1 UVOD......................................................................................................... 1 1.1 MIELOPROLIFERATIVNE NOVOTVORBE (MPN)........................................1

1.1.1 ESENCIALNA TROMBOCITEMIJA (ET) .......................................................2

1.2 MUTACIJE V GENU MPL ...................................................................................5

1.3 KVANTITATIVNA VERIŽNA REAKCIJA S POLIMEZARO V REALNEM ČASU............................................................................................................................9

1.3.1 ALELNA DISKRIMINACIJA.........................................................................11

2 NAMEN DELA........................................................................................ 13

3 PREISKOVANCI IN METODE ............................................................ 14 3.1 PREISKOVANCI.................................................................................................14

3.2 METODE..............................................................................................................15 3.2.1 IZOLACIJA GRANULOCITOV IZ VZORCEV VENSKE KRVI Z GRADIENTNIM CENTRIFUGIRANJEM PREKO FIKOLA............................................................................15 3.2.2 IZOLACIJA CELOKUPNE DNA IZ GRANULOCITOV................................................18 3.2.3 MERJENJE KONCENTRACIJE IN ČISTOČE VZORCEV DNA .....................................20 3.2.4 KVANTITATIVNA DOLOČITEV MUTACIJ MPL W515L IN MPL W515K Z VERIŽNO REAKCIJO S POLIMERAZO V REALNEM ČASU................................................................21

3.3 STATISTIČNA OBDELAVA VZORCEV..........................................................24

4 REZULTATI IN RAZPRAVA ............................................................... 25 4.1 MERJENJE KONCENTRACIJE IN ČISTOČE DNA IZOLIRANE IZ GRANULOCITOV PERIFERNE KRVI..................................................................26

4.2 VERIŽNA REAKCIJA S POLIMERAZO V REALNEM ČASU .....................28 4.2.1 VREDNOSTI CQ POZITIVNIH, NEGATIVNIH KONTROLNIH IN RAZMEJITVENIH VZORCEV PRILOŽENIH H KOMPLETU MPL MUTASCREENTM KIT..................................28 4.2.2 DOLOČANJE VREDNOSTI CQ VZORCEV BOLNIKOV Z ET ......................................30

4.3 REZULTATI ALELNE DISKRIMINACIJE .....................................................34


II

5 ZAKLJUČKI........................................................................................... 38

6 LITERATURA ........................................................................................ 39

7 PRILOGE ................................................................................................ 42


III

KAZALO SLIK

Slika 1: Princip kvantitativne verižne reakcije s polimerazo v realnem času (qPCR). Prirejeno po Real-Time PCR Applications Guide (16) .....................................................10

Slika 2: Krivulja pomnoževanja pri PCR v realnem času. Prirejeno po Real-Time PCR Applications Guide (16). ..................................................................................................11

Slika 3: Prikaz rezultatov alelne diskriminacije ................................................................12

Slika 4: Ločitev posameznih frakcij celic z gradientnim centrifugiranjem preko fikola.....17

Slika 5 : Shema nanosa reakcijskih mešanic in vzorcev na mikrotitrsko ploščico.............23

KAZALO PREGLEDNIC

Preglednica I: Razvrstitev mieloproliferativnih novotvorb po SZO (2008) (2) .....................1

Preglednica II: Diagnostični kriteriji za esencialno trombocitemijo po SZO 2008 (2) .........3

Preglednica III: Sestava reakcijske mešanice za MPL W515L in MPL W515K..................22

Preglednica IV: Pogoji qPCR...........................................................................................23

Preglednica V: Alelna diskriminacija- program Post read ...............................................24

Preglednica VI: Rezultati merjenja koncentracije in čistoče (A260/A280) DNA izolirane iz granulocitov periferne krvi s kompletom QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) .......................27

Preglednica VII: Vrednosti Cq pozitivnih, negativnih kontrolnih in razmejitvenih vzorcev za mutaciji MPL W515K in MPL W515L, pridobljene v štirih reakcijah............................1

Preglednica VIII: Vrednosti Cq bolnikov z ET, ki niso imeli prisotne mutacije MPL W515K........................................................................................................................................30

Preglednica IX: Cq vrednosti bolnikov, ki niso imeli prisotne mutacije MPL W515L........32

Preglednica X: Vrednosti Cq vzorcev 4 bolnikov, ki so imeli prisotni mutaciji MPL W515L/K..........................................................................................................................34

Preglednica XI: Vrednosti mutiranega in nemutiranega alela razmejitvenega vzorca za mutacijo MPL W515K in mutacijo MPL W515L, pridobljenih v 4 analiznih poskusih ......35

Preglednica XII: Vrednosti mutiranega in nemutiranega alela pozitivne kontrole za mutacijo MPL W515L in mutacijo MPL W515K, pridobljenih v 4 analiznih poskusih ......36


IV

Preglednica XIII: Vrednosti mutiranega in nemutiranega alela negativne kontrole za mutacijo MPL W515L in mutacijo MPL W515K, pridobljenih v 4 analiznih poskusih ......36

Preglednica XIV: Vrednosti mutiranega in nemutiranega alela vzorcev bolnikov z ET in prisotno mutacijo MPL W515L ........................................................................................37

Preglednica XV: Vrednosti mutiranega in nemutiranega alela vzorcev bolnikov z ET in prisotno mutacijo MPL W515K ........................................................................................37

Preglednica XVI: Rezultati alelne diskriminacije za vzorce bolnikov z ET, ki niso imeli prisotne mutacije MPL W515L.........................................................................................42

Preglednica XVII: Rezultati alelne diskriminacije za vzorce bolnikov z ET, ki niso imeli prisotne mutacije MPL W515K ........................................................................................45


V

POVZETEK

Pri večini bolnikov s policitemijo vera (PV) in pri približno polovici bolnikov z esencialno

trombocitemijo (ET) in primarno mielofibrozo (PM) lahko dokažemo pridobljeno

somatsko mutacijo JAK2 V617F. Nadaljnje raziskave so pokazale, da v približno 1-9 %

bolnikov z ET in v 5-11 % bolnikov s PM ugotovimo somatske mutacije v genu za

trombopoetinski receptor MPL. Slednje se pri drugih mieloproliferativnih novotvorbah

(MPN) pojavijo redko. Določitev mutacije JAK2 V617F in mutacij v genu MPL sta

pomembni dodatni preiskavi pri postavitvi diagnoze mieloproliferativnih novotvorb.

Zamenjavi aminokisline triptofan za levcin (MPL W515L) in lizin (MPL W515K) na

mestu 515 aminokislinskega zaporedja receptorja za trombopoetin sta najpogosteje

ugotovljeni pridobljeni mutaciji trombopoetinskega receptorja pri bolnikih z ET in PM.

Mutaciji najverjetneje povzročata, da je beljakovina aktivna brez vezanega liganda.

Namen našega dela je bil vpeljava metode določitve mutacij MPL W515L/K v receptorju

za trombopoetin, z načinom verižne reakcije s polimerazo v realnem času (uporaba

reagenčnega kompleta MPL MutaScreenTM Kit (Ipsogen, Francija)) in določitev deleža

bolnikov z ET, ki so imeli mutaciji MPL W515L/K. Oblikovali smo delovni hipotezi in

sicer, da reagenčni komplet MPL MutaScreenTM Kit (Ipsogen, Francija) omogoča

določitev mutacij MPL W515L/K in da se mutaciji MPL W515L/K pojavljata pri 1-9 %

bolnikov z ET.

Da bi hipotezi dokazali smo iz vzorcev venske krvi 77 bolnikov z ET izolirali granulocite z

gradientnim centrifugiranjem preko fikola. Iz granulocitov smo izolirali celokupno DNA in

ji spektrofotometrično izmerili koncentracijo ter čistočo. Prisotnost mutacij MPL

W515L/K smo nato določili s kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo v realnem času

(qPCR) in alelno diskriminacijo.

Prisotnost mutacije MPL W515L/K smo dokazali pri štirih (5 %) bolnikih z ET, kar je v

skladu s podatki iz literature. Ugotovili smo tudi, da je mutacija MPL W515L pogostejša,

saj smo jo dokazali pri treh (4 %) bolnikih z ET. Mutacijo MPL W515K smo dokazali pri

enem (2 %) bolniku. Reagenčni komplet MPL MutaScreenTM Kit (Ipsogen, Francija)

omogoča določanje mutacij MPL W515L/K.


VI

SEZNAM OKRAJŠAV COS razmejitveni vzorec (ang. Cut-Off Sample) Cq cikel pri katerem fluorescenčni signal preseže predviden prag DNA deoksiribonukleinska kislina DNaza encim, ki cepi DNA EDTA etilendiamintetraocetna kislina ET esencialna trombocitemija FAM 6-karboksifluorescein Hb hemoglobin HU hidroksiurea JAK2 Janus kinaza 2 KML kronična mieloična levkemija KNL kronična nevtrofilna levkemija LDH holesterol majhne gostote M molarnost, koncentracija mol/L MDS mielodisplastični sindrom MPL gen za trombopoetinski receptor (ang. Myeloproliferative Leukemia

Virus Oncogene) MPN mieloproliferativne novotvorbe NC negativna kontrola PBS fosfatni pufer s soljo PC pozitivna kontrola PCR verižna reakcija s polimerazo Ph-kromosom spremenjen kromosom 22 PM primarna mielofibroza PV policitemija vera PVSG Polycythemia Vera Study Group qPCR kvantitativna verižna reakcija s polimerazo v realnem času RNA ribonukleinska kislina RNaza encim, ki cepi RNA STAT molekule, ki posredujejo signal in aktivirajo prepis DNA SZO Svetovna zdravstvena organizacija Taq -polimeraza polimeraza iz organizma Thermophilus aquaticus Tm temperatura taljenja UPD uniparentalna disomija WT divji tip, nemutiran (ang. Wild Tipe)


1

1 UVOD

1.1 MIELOPROLIFERATIVNE NOVOTVORBE (MPN) Mieloproliferativne novotvorbe so klonske bolezni, za katere je značilno zvečano

nastajanje krvnih celic zaradi motnje na ravni matične krvotvorne celice in kroničen potek

bolezni. Hematopoeza je še učinkovita, zato v odvisnosti od vrste MPN lahko poraste

število eritrocitov, levkocitov ali trombocitov v periferni krvi. Razraščajo se celice

kostnega mozga z znaki dozorevanja brez displastičnih sprememb. Bolezen opredelijo na

osnovi kliničnih znakov, krvni sliki in drugih laboratorijskih preiskavah, citoloških in

histoloških preiskavah kostnega mozga in drugega tkiva in v vse večjem obsegu na osnovi

molekularno genetskih sprememb. Bolezni imajo precej skupnih kliničnih značilnosti.

Potek je večinoma dolgotrajen, v končnem obdobju pa pospešen ali pa ima značilnosti

akutne levkemije. Ena oblika bolezni lahko prehaja v drugo, vendar to ni običajno. Bolniki

so nagnjeni h krvavitvam in trombozam v skladu z znaki in simptomi, povezanih z

razrastjo hematopoetske vrste (1).

Z izjemo kronične mieloične levkemije (KML), molekularno genetsko ozadje drugih MPN

dolgo ni bilo pojasnjeno.

Preglednica I: Razvrstitev mieloproliferativnih novotvorb po SZO (2008) (2) ______________________________________________________________________

kronična mieloična levkemija, BCR/ABL1 pozitivna (KML),

kronična nevtrofilna levkemija (KNL),

policitemija vera (PV),

primarna mielofibroza (PM),

esencialna trombocitemija (ET),

kronična eozinofilna levkemija,

mastocitoza,

neklasificirane MPN


2

1.1.1 ESENCIALNA TROMBOCITEMIJA (ET) Esencialna trombocitemija (ET) je klonska bolezen, ki jo uvrščamo v skupino

mieloproliferativnih novotvorb. Pojavnost bolezni je 1 do 2,5 na 100,000 prebivalcev.

Najbolj pogosta je med petdesetim in sedemdesetim letom starosti, nekoliko manj pogosta

pri ljudeh v tretji in četrti dekadi življenja, občasno se pojavi tudi pri otrocih. Pogosteje

obolevajo ženske (Ž:M = 2:1).

Za ET je značilno razraščanje velikih, zrelih megakariocitov v kostnem mozgu in zato se

posledično zveča število trombocitov v periferni krvi. Tvorba trombocitov je lahko šest do

petnajstkrat večja od normalne, njihova življenjska doba pa je lahko tudi normalna. Pri ET

ne ugotavljajo značilne genetske oziroma kromosomske spremembe. Značilna je

nagnjenost h krvavitvam in trombozam. Krvavitve so posledica motene funkcije

trombocitov.

Klinična slika

Dve tretjini bolnikov ob odkritju bolezni nimata simptomov. Redki znaki prisotnosti ET so

znaki povečane presnove, npr. izguba telesne teže, znojenje, utrujenost. Okoli 40 %

bolnikov ima povečano vranico, zato se pojavi napetost v trebuhu in tope bolečine pod

levim rebrnim lokom. Jetra so redko povečana. Pri 20 do 50 % bolnikov se bolezen

manifestira v obliki tromboz ali krvavitev, ki so tudi glavni vzrok smrti bolnikov.

Krvavitve so lahko v prebavila, v kožo, sluznice, iz nosu, po poškodbah in operacijah.

Arterijske tromboze so malo bolj pogoste kot venske, od venskih pa jih je četrtina v venah

spodnjih udov. Tromboza hepatične in vraničnih ven je zelo pogosta. Žilje je lahko

prizadeto tudi na ravni arteriol in kapilar in se klinično izraža kot ishemija prstov rok in

nog, kar imenujemo eritromelalgija.

Diagnoza

Diagnoza temelji na kliničnih znakih, krvni sliki, citoloških in histoloških preiskavah

kostnega mozga in v vse večjem obsegu na osnovi molekularno genetskih sprememb.


3

Sprva so uporabljali za opredelitev in zdravljenje ET klinična diagnostična merila PVSG

(Polycythemia Vera Study Group), danes pa bolezen opredeljujejo na osnovi kriterijev

Svetovne zdravstvene organizacije, ki s histološkim pregledom kostnega mozga ločijo ET

od obdobja prefibroze in zgodnje fibroze primarne mielofibroze. Histološki pregled

kostnega mozga s poudarkom na oceni stopnje fibroze ima diagnostični, predvsem pa

napovedni pomen. Praviloma ga morajo opraviti pred zdravljenjem z zdravili za

zmanjšanje števila trombocitov. Danes za potrditev ET redno določajo somatsko mutacijo

JAK2 V617F, ki je prisotna pri nas pri 61 % bolnikov z ET. Približno pri 9 % bolnikov z

ET dokažejo tudi mutacije v genu MPL. Izjemoma se zadovoljimo z opredelitvijo ET po

kriterijih PVSG pri starejših prizadetih bolnikih, ki že prejemajo zdravila za zmanjšanje

števila trombocitov (3).

Število trombocitov pri ET praviloma presega 450 × 109/L, pogosto je med 1000 in 2000 ×

109/L. Trombociti imajo večji volumen, posamezni so lahko zelo veliki in nepravilnih

oblik. Njihova funkcija je lahko zmanjšana.

Pri biopsiji kostnega mozga lahko dobijo normocelularen kostni mozeg ali pa blago

hipercelularen. Najbolj značilno je razraščanje zelo velikih, skoraj gigantskih

megakariocitov, ki imajo hiperlobulirana jedra in obilno citoplazmo (1).

Preglednica II: Diagnostični kriteriji za esencialno trombocitemijo po SZO 2008 (2)

Za potrditev ET vsa našteta merila:

stalno zvečano število trombocitov v krvi: > 450 × 109/L

značilne histološke spremembe v kostnem mozgu: povečano število pretežno

velikih zrelih megakariocitov s hiperlobuliranim jedrom in zrelo citoplazmo,

normalna celularnost kostnega mozga, odsotnost ali mejno povečana količina

retikulina brez proliferacije ali pomnožitve nezrelih granulocitov, normalna

normoblastna eritropoeza

prisotnost klonskega označevalca: JAK2 V617F, drugi klonski označevalci

Za izključitev ET, odsotnost meril SZO za:

prava policitemija, KML, MPN, MDS

odsotnost JAK2 V617F ali ni znakov za reaktivno trombocitozo


4

Diferencialna diagnostika: ET morajo razlikovati od reaktivne trombocitoze, prave policitemije, KML in mielofiboze.

Za razliko od ET pri reaktivnih trombocitozah ni krvavitev in tromboz, pa tudi število

trombocitov v krvi običajno ni večje od 1000 x 109/L. Trombociti so morfološko normalni,

tako kot tudi njihova funkcija.

Pri pravi policitemiji najdejo povečano maso eritrocitov, povečano aktivnost alkalne

fosfataze nevtrofilcev, v makrofagih kostnega mozga ne najdejo železa.

KML se od ET razlikuje po prisotnosti kromosoma Ph, ki je posledica translokacije med

kromosomoma 9 in 22 (t(9;22)), večinoma zmanjšani aktivnosti alkalne fosfataze

nevtrofilcev in izrazitem razrastu granulocitne vrste v kostnem mozgu. Izrazita

trombocitoza je le redko prisotna.

Mielofibrozo z mieloidno metaplazijo ločijo od ET po veliki vranici in po tem, da so v

razmazu kapljice periferne krvi pri PM značilni dakriociti.

Zdravljenje:

Osnovni namen zdravljenja je zmanjšati bolnikove težave, predvsem pa preprečevati

življenjsko ogrožajoče tromboze, trombembolije in krvavitve. Verjetnost krvavitev

zmanjšajo, če z zdravili zmanjšajo število trombocitov v krvi pod 1000 × 109/L in v času

zmanjševanja števila trombocitov prenehajo dajati antiagregacijska zdravila. Med

antikoagulacijskimi zdravili najpogosteje uporabljajo acetilsalicilno kislino (Aspirin), v

dnevnem odmerku 50 do 100 mg ali 100 mg vsak drugi dan. Acetilsalicilna kislina je pri

bolnikih z ET učinkovita pri preprečevanju arterijskih tromboz, posebno pri ishemiji v

predelu prstov rok in nog (eritromelalgija), preprečevanju gangrene in cerebrovaskularne

ishemije.

Hidroksiurea (HU) je zdravilo za zmanjšanje števila trombocitov. Zaradi možnosti, da po

daljši uporabi (okoli 10–15 let) povzroči pojav sekundarne akutne mieloične levkemije, se

naj ne bi uporabljalo pri mlajših bolnikih. Kljub temu pa hidroksiureo pogosto uporabijo za

nekajtedensko hitro zmanjševanje velikega števila trombocitov tudi pri mlajših bolnikih.


5

Trombofereza je indicirana za hitro zmanjšanje števila trombocitov, a le za kratek čas. Za

trajno zdravljenje uporabljajo interferon alfa. Rekombinantni interferon alfa učinkovito

zavre rast nenormalnega klona megakariocitov v kostnem mozgu.

Najnovejše zdravilo za zdravljenje ET je anagrelid. Dnevni odmerek 2 do 3 mg anagrelida,

ki zavira proliferacijo megakariocitov in ni citostatik, zelo hitro zmanjša število

trombocitov in skoraj ne vpliva na ostale celice v kostnem mozgu (4).

Potek in prognoza: ET velja za neozdravljivo bolezen, s kroničnim potekom. Življenjska doba bolnikov z ET

predvidoma ni skrajšana, odvisna je od mnogih dejavnikov, med drugim od naravnega

poteka bolezni in njenih zapletov ter načina zdravljenja. Najpogostejši vzrok smrti so

krvavitve in tromboze. S prihodom zdravila anagrelid na slovenski trg zdravil so poenotili

način zdravljenja ET z drugimi evropskimi državami. Kljub številnim raziskavam zaenkrat

še ni povsem pojasnjen pomen določanja mutacije V617F v genu JAK2 za oceno napovedi

izida bolezni.

1.2 MUTACIJE V GENU MPL Onkogen v-mpl so prvič odkrili leta 1990 pri miših z mieloproliferativnim levkemičnim

virusom (ang. Myeloproliferative leukemia virus). Leta 1992 so klonirali človeški

homolog, imenovan C-MPL. Gen C-MPL kodira protein, ki je homologen članom

hematopoetske receptorske naddružine. Trombopoetin, ki je ligand proteina C-MPL pa je

bil kloniran leta 1994. Trombopoetin je primarni in najpomembnejši regulator rasti in

diferenciacije megakariocitov ter nastanka trombocitov (5).

Gen MPL (ang. Myeloproliferative Leukemia Virus Oncogene, MPL) je sestavljen iz 12

eksonov, pri človeku se nahaja na kromosomu 1p34. Gen MPL kodira membranski protein,

ki je sestavljen iz 635 aminokislin, z dvema zunajceličnima receptorskima domenama za

citokine in dvema znotrajceličnima aktivacijskima domenama. Protein na površini celice

imenujejo tudi CD110 (ang. Cluster of Differentiation 110) (5, 6).


6

Najpogostejše somatske mutacije so MPL W515L, MPL W515K in MPL W515A.

Nahajajo se v juxtamembranski domeni receptorja za trombopoetin. Mutacije se zgodijo

znotraj eksona 10 gena MPL. Mutacija G→T na mestu 1544 nukleotidnega zaporedja

povzroči zamenjavo aminokisline triptofan z levcinom na mestu 515 aminokislinskega

zaporedja receptorja za trombopoetin (W515L). Mutacija GT→AA na mestih 1543 in 1544

nukleotidnega zaporedja povzroči zamenjavo aminokisline triptofan z lizinom na mestu

515 aminokislinskega zaporedja receptorja za trombopoetin (W515K). Tretja omenjena

mutacija pa povzroči zamenjavo aminokisline triptofan z alaninom na mestu 515

aminokislinskega zaporedja receptorja za trombopoetin (W515A).

Mutacija MPL W515L povzroča proliferacijo hematopoetskih celic neodvisno od citokinov

ter povečano odzivnost receptorja za trombopoetin in posledično konstantno fosforilacijo

signalnih proteinov in aktivacijo signalnih poti, kot so STAT3, STAT5, MAPK in

PI3K/AKT. Prvič je bila opisana leta 2006 pri bolnikih z JAK2 V617F-negativno primarno

mielofibrozo. Mutacija MPL W515L je najpogostejša izmed vseh opisanih mutacij v genu

MPL (7, 8, 9).

Triptofan na mestu 515 se nahaja v juxtamembranskem delu citoplazemske domene

proteina MPL in je del ohranjenega amfipatskega motiva (RWQFP), ki je pomemben pri

ohranjanju receptorja za trombopoetin v neaktivni obliki, ob odsotnosti trombopoetina

(10).

Zelo redko se pri bolnikih z ET pojavi mutacija MPL S505N. Mutacija (1073G→A)

povzroči zamenjavo aminokisline serin z asparginom na mestu 505 aminokislinskega

zaporedja. Mutacija MPL S505N je bila prvič opisana pri Japonski družini z avtosomno

dominantno trombocitozo. Identično mutacijo so odkrili tudi pri miših in sicer z mutacijsko

analizo, pri kateri so uporabili retroviruse. Pred kratkim so jo opisali tudi kot sporadično

mutacijo pri ET (10, 11, 19).

Poleg že omenjenih mutacij MPL W515L/K/A in MPL S505N so raziskovalci pri bolnikih

s primarno mielofibrozo odkrili še štiri mutacije in sicer MPL S204P, MPL A506T, MPL

L510P in MPL A519Y, katerih funkcija in pomen je še neznan (10).


7

Mutaciji S204F in Y591D so odkrili pri bolnikih z uniparentalno disomijo na kromosomu

1p (1pUPD). Tudi njuna funkcija je še neznana (12).

Pri približno 7 % afriških Američanov so odkrili mutacijo MPL K39N, imenovano tudi

MPL Baltimore, ki naj bi se nahajala na N-terminalni regiji proteina MPL. Mutacija G→T

na mestu 1238 nukleotidnega zaporedja povzroči zamenjavo aminokisline lizina z

asparginom na mestu 39 aminokislinskega zaporedja (K39N). Heterozigotni bolniki imajo

blago trombocitozo oz. število trombocitov na zgornji meji referenčnih vrednosti.

Homozigoti pa imajo število trombocitov med 600-800 x 109/L (10, 13).

Pred kratkim so pri družinah arabskega rodu odkrili tudi mutacijo MPL P106L.

Homozigotni bolniki imajo število trombocitov > 1000 x 109/L, medtem ko heterozigotni

bolniki izražajo blago trombocitozo ali pa imajo normalno število trombocitov. Bolniki

imajo v serumu povišano raven trombopoetina, kar kaže na to, da mutacija MPL P106L

interferira, sodeljuje z internalizacijo in/ali razgradnjo trombopoetina, ohrani pa zmožnost

vezave trombopoetina in aktivacijo receptorja (10).

Somatske mutacije v genu MPL so redke in ponavadi povezane z MPN. Pojavljajo se

predvsem pri bolnikih z ET in PM, pri bolnikih z PV niso prisotne. Ugotovili pa so jih tudi

pri bolnikih z akutno megakariocitno levkemijo (11,14). Pogostost pojavljanja mutacij

W515L in W515K je najvišja pri bolnikih s PM, pojavi se v 5 do 11 % (10, 15, 20).

Nekoliko nižjo pojavnost so ugotovili pri bolnikih z ET. Pojavi se v 1 do 9 % (10, 15, 20)

Razponi v pojavnosti mutacij so lahko posledica uporabe različnih kriterijev za postavitev

diagnoze (Polycythemia Vera Study Group ali Svetovne zdravstvene organizacije) in

verjetno tudi od občutljivosti testa s katerim so mutacije določili.

Istočasno prisotnost mutacije JAK2 V617F in MPL W515L/K so odkrili le pri redkih

bolnikih. Nejasno je tudi, ali so te mutacije pri istem bolniku prisotne v istem klonu ali

ločenih subklonih (8, 15).

Skupina raziskovalcev je leta 2008 pri bolnikih z ET ocenjevala povezavo med mutacijami

MPL, mutacijo JAK2 V617F in kliničnimi ter laboratorijskimi parametri, na osnovi katerih

so želeli nadalje opredeliti bolnike z ET v podskupine. Ugotovili so, da imajo bolniki s


8

prisotno mutacijo JAK2 V617F višjo raven hemoglobina in višje število nevtrofilcev ter

nižje število trombocitov, serumskega feritina in eritropoetina v primerjavi z bolniki, ki

nimajo prisotne mutacije JAK2 V617F. Ugotovili so tudi, da imajo bolniki z ET pri katerih

so prisotne mutacije v genu MPL, večje število trombocitov in nižjo raven hemoglobina

kot bolniki z ET pri katerih je prisotna mutacija JAK2 V617F, vendar se ne razlikujejo od

bolnikov z JAK2/MPL-divjim tipom. Poleg tega so številne študije pokazale, da lahko

endogene megakariocitne kolonije, ne pa tudi eritroidne, zrastejo iz MPL W515-pozitivnih

celic. Ti podatki kažejo na to, da lahko bolnike z ET opredelimo glede na različno stopnjo

megakariopoeze in eritropoeze. Tako je za bolnike z ET in prisotno mutacijo MPL W515

ali bolnike z JAK2/MPL-divjim tipom značilna višja stopnja megakariopoeze, višje število

trombocitov in nižja raven hemoglobina. Za bolnike z ET in prisotno mutacijo JAK2

V617F pa je značilna višja stopnja eritropoeze, nižja raven eritropoetina in višja raven

hemoglobina (8, 10). Vsekakor bodo potrebne še nadaljnje raziskave za potrditev teh

raziskav in vpeljavo v redno klinično prakso.


9

1.3 KVANTITATIVNA VERIŽNA REAKCIJA S POLIMEZARO V REALNEM ČASU Kvantitativna verižna reakcija s polimerazo v realnem času (qPCR) predstavlja nadgradnjo

klasičnega ali konvencionalnega PCR. Omogoča namreč sprotno zaznavanje in spremljanje

količine pridelka reakcije PCR v vsakem ciklu med samo reakcijo PCR. Detekcija

pridelkov reakcije PCR je mogoča zaradi fluorescenčnih molekul, ki prikazujejo povečanje

količine pridelkov DNA s sorazmernim povečanjem fluorescenčnega signala. Izmerjena

fluorescenca odraža količino podvojenih pridelkov PCR v vsakem ciklu (16).

Prednosti PCR v realnem času pred konvencionalnim PCR se odražajo v hitrosti izvajanja,

visoki občutljivosti in ponovljivosti, kot tudi v minimalni možnosti kontaminacije, saj

reakcija in vrednotenje podatkov poteka v zaprtem sistemu. Odlikuje ga široko dinamično

območje, kar omogoča sočasno analizo vzorcev z zelo različnimi koncentracijami.

Rezultati PCR v realnem času so lahko kvalitativni (prisotnost ali odsotnost zaporedja) ali

kvantitativni (število kopij DNA). Vrednotenje rezultatov poteka brez gelske elektroforeze,

kar skrajša čas preizkusa in poveča pretočnost vzorcev.

Za zaznavanje nastalega pridelka PCR se uporablja več načinov, med katerimi so najbolj

pogosti nespecifičen način zaznave z barvilom SYBR Green I in specifični načini zaznave

s hidrolizirajočimi sondami in dvojno hibridizacijskimi sondami.

Pri analizi s hidrolizirajočimi sondami se v reakcijski zmesi poleg začetnih

oligonukleotidov, nahaja še dvojno označena sonda (TaqMan), ki ima Tm (temperatura

taljenja) za 510 °C višjo od obeh začetnih oligonukleotidov. Sonda TaqMan je označena

s fluorescenčnim barvilom (ang. reporter) na 5´ koncu in z dušilcem fluorescenčnega

signala (ang. quencher) na 3´ koncu sonde. Ker dušilec signala ujame signal, ki ga pošilja

fluoresecenčno barvilo na drugi strani sonde, sonda ne fluorescira. Ko pa se med reakcijo

PCR izgrajuje preiskovano zaporedje (tarčni gen), se sonda TaqMan veže na ustrezno

mesto v novo nastajajoči verigi. Encim Taq-polimeraza s 5´ eksonukleazno aktivnostjo

sondo hidrolizira, zato se razdalja med fluorescenčnim barvilom in dušilcem poveča in

tako je onemogočeno prestrezanje fluorescence. Fluorescenca barvila zato poraste in je

sorazmerna s količino produkta PCR (Slika 1) (16).


10

Slika 1: Princip kvantitativne verižne reakcije s polimerazo v realnem času (qPCR).

Prirejeno po Real-Time PCR Applications Guide (16).

Metoda qPCR temelji na merjenju fluorescence v eksponentni fazi, in sicer na osnovi

izmerjenih podatkov narišemo krivuljo, ki podaja odvisnost intenzitete fluorescenčnega

signala posameznih vzorcev od števila ciklov. Krivulja pomnoževanja je razdeljena na dve

fazi: eksponentna faza in plato faza (Slika 2). V eksponentni fazi se količina produkta PCR

v vsakem ciklu podvoji. V poznejših ciklih se reakcija pomnoževanja postopno

upočasnjuje zaradi porabe sestavin reakcijske zmesi, manjše aktivnosti DNA-polimeraze in

kopičenja inhibitornih produktov in zaradi tega preide v plato fazo (cikli 2840 na Sliki 2).

V začetnih ciklih (cikli 118 na Sliki 2) intenziteta fluorescence ne preseže intenzitete


11

fluorescenčnega ozadja. Sčasoma pa je količina pridelka dovolj velika, da lahko zaznamo

fluorescenčni signal. Cikel, pri katerem se to zgodi, imenujemo cikel kvantifikacije (angl.

quantification cycle) oz. Cq (Slika 2) (21).

Vrednost Cq je sorazmerna številu kopij matrice v začetku reakcije. Pri večjem začetnem

številu kopij matrice signal prej preseže prag in tako določimo nižji Cq. Vrednosti Cq so

torej obratno sorazmerne z začetnim številom kopij matrice in na osnovi njih primerjamo

vzorce med seboj.

Slika 2: Krivulja pomnoževanja pri PCR v realnem času. Prirejeno po Real-Time PCR

Applications Guide (16).

1.3.1 ALELNA DISKRIMINACIJA Po končanem qPCR lahko v neeksponentni fazi krivulje qPCR izvedemo še alelno

diskriminacijo (ang. Allelic Discrimination). To je način ugotavljanja določene genske

spremembe po izvedenem qPCR-ju. Za učinkovito alelno diskriminacijo potrebujemo

smerni in protismerni oligonukleotidni začetnik ter par hidroliznih sond TaqMan,


12

označenih s 5´ reporterskim barvilom. Prva sonda ima na 5´ koncu vezano reportersko

barvilo, ki se razlikuje od reporterskega barvila druge sonde, na 3´ koncu pa imata obe

sondi vezan enak dušilec, ki je lahko fluorescenčno ali nefluorescenčno barvilo z

dodatkom za izboljšano vezavo na ciljno zaporedje DNA. Običajno je mutiran alel (alel 2)

označen z reporterskim barvilom FAMTM, nemutiran (alel 1) pa z VIC®. Z merjenjem

povečanja intenzitete fluorescence posameznega barvila po qPCR pridobimo podatke o

genotipu za gensko spremembo, ki jo želimo ugotoviti. Če izmerimo povečanje intenzitete

le fluorescenčnega barvila VIC® je vzorec homozigot za prvi alel. Če izmerimo povečanje

intenzitete le fluorescenčnega barvila FAMTM je vzorec homozigot za drugi alel. V primeru

da izmerimo povečanje intenzitete obeh fluorescenčnih barvil, potem je vzorec heterozigot

za preiskovana alela (Slika 3).

- homozigot alel Y (FAM) - heterozigot - homozigot alel X (VIC) - H2O

Slika 3: Prikaz rezultatov alelne diskriminacije


13

2 NAMEN DELA Mutaciji MPL W515L in MPL W515K sta pomemben dodaten diagnostičen kriterij pri

opredelitvi MPN (2). Sta dokaz klonalnosti in se pojavljajata pri približno 1 do 9 %

bolnikov z ET in pri 5 do 11 % bolnikov s PM (10, 15, 20).

Oblikovali smo hipotezi:

- reagenčni komplet MPL MutaScreenTM Kit (Ipsogen, Francija) omogoča določanje

mutacij MPL W515L in MPL W515K v receptorju za trombopoetin

- mutaciji MPL W515L in MPL W515K se pojavljata pri približno 1-9 % bolnikov z

ET.

Namen našega dela je:

- vpeljava metode določitve mutacij MPL W515L in MPL W515K v receptorju za

trombopoetin, z načinom verižne reakcije s polimerazo v realnem času (uporaba

reagenčnega kompleta MPL MutaScreenTM Kit (Ipsogen, Francija)). Način bomo

preizkusili na pozitivnih, negativnih kontrolnih vzorcih DNA reagenčnega kompleta in

na vzorcih DNA, dobljenih iz granulocitov bolnikov z ET.

- določiti delež bolnikov z ET, ki imajo mutacijo MPL W515L/K in rezultate

primerjati s podatki iz literature.

K delu bomo pristopili tako, da bomo izolirali granulocite z gradientnim centrifugiranjem

preko fikola iz periferne krvi 77 bolnikov z ET. Iz le-teh bomo izolirali celokupno DNA z

reagenčnim kompletom QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) in ji spektrofotometrično

izmerili koncentracijo ter čistočo. Prisotnost mutacij MPL W515L/K bomo nato določili s

kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo v realnem času (qPCR). Genotip mutacij bomo

določili z alelno diskriminacijo. Pričakujemo, da bomo hipotezi dokazali in potrdili.

Uvedba metode določitve mutacij MPL W515L in MPL W515K z reagenčnim kompletom

MPL MutaScreenTM Kit (Ipsogen, Francija) bo pripomogla k postavitvi diagnoze bolnikov

z ET in PM, v skladu s smernicami kriterijev diagnostičnih meril Svetovne zdravstvene

organizacije.


14

3 PREISKOVANCI IN METODE

3.1 PREISKOVANCI V raziskavo smo vključili 77 bolnikov z esencialno trombocitemijo, od tega 59 (77 %)

žensk in 18 (23 %) moških. Vsi bolniki so bili negativni za prisotnost mutacije JAK2

V617F. Starost bolnikov ob prvem odvzemu oz. ob napotni diagnozi je bila od 18 do 89

let. Mediana starosti bolnikov je znašala 48 let.

Vzorci periferne krvi bolnikov so bili odvzeti v ambulanti Kliničnega oddelka za

hematologijo, UKC Ljubljana. Meritve smo opravili na vzorcih DNA, shranjenih pri

temperaturi 20 °C v Specializiranem hematološkem laboratoriju kliničnega oddelka za

hematologijo, Univerzitetni klinični center Ljubljana.

Diagnoza je bila postavljena s strani zdravnika hematologa na osnovi kriterijev SZO 2008

(2).

DNA je bila izolirana iz granulocitov vzorcev periferne krvi. Granulocite smo pridobili z

liziranjem eritrocitov po odstranitvi mononuklearnih celic po gradientnem centrifugiranju

vzorcev periferne krvi preko fikola. DNA pa smo izolirali z reagenčnim kompletom

QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN).

Izvedeni postopki so bili v skladu z načeli Helsinške deklaracije o biomedicinskih

raziskavah na človeku (1975).


15

3.2 METODE

3.2.1 Izolacija granulocitov iz vzorcev venske krvi z gradientnim centrifugiranjem preko fikola Izolirani granulociti so izhodni material za izolacijo DNA, ki jo uporabljamo za

molekularno genetske preiskave pri MPN. Fikol se uporablja za izolacijo posameznih vrst

krvnih celic (granulociti, mononuklearne celice) iz periferne krvi ali kostnega mozga.

Različne krvne celice imajo različno specifično gostoto in se tako ločijo v gradientu s

fikolom, ki nastane med centrifugiranjem.

Reagenti, pribor in aparature:

Ficoll – PaqueTM PLUS (GE Healthcare Bio-Science AB) - brezbarvna, bistra

tekočina za gradientno ločevanje celic, hranimo jo v temnem prostoru;

1 × fosfatni pufer s soljo (PBS) - uporablja se za redčenje vzorcev periferne krvi in

kostnega mozga, za spiranje celic ter raztapljanje celic na koncu izolacije.

Pripravimo ga iz 10 × pufra PBS (GIBCO-Invitrogen), ki je fiziološka raztopina s

solmi (NaCl, KCl, Na2HPO4 × 7H2O, KH2PO4), a brez dodatka CaCl2 ter MgCl2;

pH: 7,2 ± 0,05;

(Priprava PBS: Za pripravo PBS z merilnim valjem odmerimo 100 mL 10 × pufra

PBS ter ga prenesemo v 1000 mL bučko in z redestilirano vodo, ki ne vsebuje

encimov DNaz in RNaz, redčimo do oznake);

raztopina za lizo eritrocitov – je pufer, ki povzroči lizo eritrocitov in nam tako

omogoča izolacijo čistih levkocitov. Najprej pripravimo 10 × matično raztopino za

lizo eritrocitov, ki vsebuje soli (82,6g NH4Cl, 10,0g KHCO3, 0,37g EDTA)

raztopljene v 1000mL redestilirane vode in prefiltrirane skozi vakuumsko-

filtracijski sistem.

(Priprava raztopine za lizo eritrocitov: Za pripravo raztopine za lizo eritrocitov z

valjem odmerimo 100 mL 10 × matične raztopine za lizo eritrocitov in jo

prenesemo v 1000 mL bučko ter z redestilirano vodo, ki ne vsebuje encimov DNaz

in RNaz, redčimo do oznake);

pipete in nastavki za pipete (10–100 µL, 100–1000 µL Eppendorf);

10 mL epruveta Vacuntainer z antikoagulantom K2/K3 EDTA;


16

15 mL plastične, sterilne epruvete Falcon (Greiner bio-one CELLSTAR PP-test

tube);

sterilna 50 mL centrifugirka (Falcon);

1,5 mL mikrocentrifugirke (Safe-lock tubes; Eppendorf Biopur);

sterilna brizga in igla za injiciranje fikola;

stojalo za epruvete;

komora, ki omogoča sterilno delo (Iskra Bio LFVP 12);

hematološki analizator Beckman Coulter LH 750 Analyzer;

centrifuga Labofuge 400 ( Heraeus);

orbitalni mešalnik

Postopek:

Odvzeli smo 10 mL venske krvi v epruveto Vacuntainer z antikoagulantom EDTA.

Vensko kri smo redčili s fosfatnim pufrom s soljo (PBS) v razmerju 1 : 1, ogretim na sobno

temperaturo. V 15 mL plastične epruvete smo z iglo in brizgalko nabrizgali 3 mL fikola.

Razredčeno vensko kri smo počasi in previdno pipetirali ob steni epruvete na plast fikola,

tako da je meja med fikolom in razredčeno vensko krvjo ostala popolnoma ostra. Nato smo

vzorce centrifugirali 22 minut pri 2200 obr./min (centrifuga Labofuge 400, Heraeus) pri

sobni temperaturi.

Po centrifugiranju so bile lepo vidne vse štiri plasti celic: eritrociti in granulociti, fikol,

mononuklearne celice in plazma. Eritrociti in granulociti so se zaradi večje specifične

gostote usedli na dno epruvete pod plast fikola. Plast fikola je ostala bistra, nad njo pa se je

nabrala plast mononuklearnih celic. Nad plastjo mononuklearnih celic v supernatantu so se

nabrali PBS, plazma in maščoba (Slika 4).


17

Slika 4: Ločitev posameznih frakcij celic z gradientnim centrifugiranjem preko fikola

Po centrifugiranju smo odstranili supernatant, plast mononuklearnih celic in fikola.

Granulocite smo s pipeto prenesli v sterilno 50 mL centrifugirko in dolili 45 mL raztopine

za lizo eritrocitov, premešali z obračanjem in inkubirali na sobni temperaturi 10 min. Nato

smo vzorce centrifugirali 5 min pri 1600 obr/min (centrifuga Labofuge 400, Heraeus). Po

centrifugiranju smo supernatant previdno odlili, skupek celic razbili z mešanjem na

orbitalnem mešalniku in dodali 25 mL raztopine za lizo eritrocitov. Ponovno smo

premešali z obračanjem in inkubirali na sobni temperaturi 10 min ter po inkubiranju vzorce

centrifugirali 5 min pri 1600 obr/min (centrifuga Labofuge 400, Heraeus).

Supernatant smo odlili in granulocite s pipeto prenesli v manjšo 15 mL sterilno epruveto.

V epruveto smo dolili 14 mL 1 x fosfatnega pufra s soljo (PBS), premešali z obračanjem

in centrifugirali 5 min pri 1600 obr/min (centrifuga Labofuge 400, Heraeus). Nato smo

odlili supernatant, celice raztopili v preostali tekočini in dolili 12 mL 1 x fosfatnega pufra s

soljo (PBS). Premešali z obračanjem in centrifugirali 5 min pri 1600 obr/min (centrifuga

Labofuge 400, Heraeus).

Po končanem spiranju granulocitov s fosfatnim pufrom s soljo smo odlili supernatant in

odpipetirali še vso preostalo tekočino nad celicami. Nato smo uravnali koncentracijo celic

na 5 × 106 celic v 200 µl raztopine PBS. Število celic smo prešteli s pomočjo


18

hematološkega analizatorja (Beckman Coulter LH 750 Analyzer). Te celice smo nato

prenesli v 1,5 mL sterilno mikrocentrifugirko, ki ni vsebovala encimov RNaz in DNaz.

Vzorec izoliranih granulocitov smo shranili v zamrzovalnik (-20 ºC).

3.2.2 Izolacija celokupne DNA iz granulocitov Reagenčni komplet QIAamp DNA Mini Kit (kat. št. 51304, QIAGEN) je namenjen

izolaciji celotne DNA iz različnih bioloških vzorcev, kot so polna kri, plazma, serum,

kostni mozeg in celice, vključno granulociti in mononuklearne celice. Reagenčni komplet

se lahko uporablja na svežih ali zamrznjenih vzorcih krvi, ki so jim dodani različni

antikoagulanti (EDTA, citrat, heparin).


1 × fosfatni pufer s soljo (PBS)

QIAamp DNA Mini Kit (kat. št. 51304, QIAGEN), ki vsebuje:

- pufer AL – pufer za lizo celic;

- pufer ATL;

- pufer AW1, ki se mu pred začetkom uporabe doda 25mL absolutnega etanola;

- pufer AW2, ki se mu pred začetkom uporabe doda 30mL absolutnega etanola;

- pufer AE;

- proteinaza K;

- filtrirne epruvetke z volumnom 700 µL;

- zbiralne epruvetke z volumnom 2 mL (sterilne, brez prisotnih encimov RNaz in

DNaz);

pipete in nastavki za pipete (10100 µL, 1001000 µL Eppendorf);

1,5 mL mikrocentrifugirke (Eppendorf Safe-lock tubes; Eppendorf Biopur);

stojalo za mikrocentrifugirke;

komora, ki omogoča sterilno delo (Iskra Pio LFVP 12);

centrifuga Biofuge Pico (Heraeus);

orbitalni mešalnik;

termoblok TDB-120 (Biosan).


19

Postopek: Pred začetkom izolacije smo segreli termoblok TDB-120 (Biosan) na 56 ºC. Vzorce s 5 x

106 celic resuspendiranih v 200 µL pufra PBS smo segreli na sobno temperaturo. K 200 µL

vzorca celic smo dodali 20 µL proteinaze K in 200 µL pufra AL. Zaprte mikrocentrifugirke

smo dobro (15–20 s) premešali z vorteksiranjem in nato še kratko centrifugirali (˝spin

down˝) v centrifugi Biofuge Pico (Heraeus). Nato smo vzorce vstavili v termoblok in jih

inkubirali 10 min pri 56 ºC.

Po končani inkubaciji smo k vzorcu celic dodali 200 µL absolutnega etanola. Dobro (15 –

20 s) premešali z vorteksiranjem in kratko centrifugirali (˝spin down˝) v centrifugi Biofuge

Pico (Heraeus). Medtem smo si v stojalu za mikrocentrifugirke sestavili zbiralne epruvete s

kolonami in nanje prenesli celotno raztopino iz mikrocentrifugirk. Nato smo centrifugirali

1 min na 9000 obr/min v centrifugi Biofuge Pico (Heraeus).

Po končanem centrifugiranju smo zavrgli zbiralno epruveto in znova sestavili kolono z

novo zbiralno epruveto. K vzorcu celic smo dodali 500 µL pufra AW1 in centrifugirali 1

min na 9000 obr/min v centrifugi Biofuge Pico (Heraeus).

Ponovno smo zavrgli zbiralno epruveto in sestavili novo zbiralno epruveto s kolono.

Dodali smo 500 µL pufra AW2 in centrifugirali 3 min na 13000 obr/min v centrifugi

Biofuge Pico (Heraeus).

Kolone smo nato vstavili v 1,5 mL mikrocentrifugirke, ki so bile RNaz in DNaz proste.

Dodali smo 200 µL pufra AE ter inkubirali 5 min na sobni temperaturi. Nato smo

centrifugirali 1 min na 9000 obr/min v centrifugi Biofuge Pico (Heraeus). Po končanem

centrifugiranju smo kolone zavrgli, v mikrocentrifugirki nam je ostal le še eluat DNA.

Mikrocentrifugirke z DNA smo shranili v zamrzovalniku (-20 °C).


20

3.2.3 Merjenje koncentracije in čistoče vzorcev DNA

Vzorcem z izolirano DNA smo pred nadaljnjo analizo najprej izmerili koncentracijo DNA

ter preverili njeno čistočo, saj smo za reakcijo potrebovali 25ng vzorčne DNA. To smo

določili s pomočjo spektrofotometra Parkin Elmer (program Lambda 20 Bio), z merjenjem

absorbance pri treh valovnih dolžinah 260 nm (A260), 280 nm (A280) in 320 nm (A320).

S spektrofotometrično metodo mora biti izmerjena absorbanca (A260) večja od 0,15. Če je

A260 = 1, pomeni, da smo imeli v vzorcu 50 µg/mL DNA. Ta povezava velja samo pri

nevtralnem pH.

Čistočo vzorcev smo preverjali z določanjem razmerja absorbance pri valovni dolžini 260

in 280 nm in odštetjem tega razmerja od absorbance pri valovni dolžini 320 nm.

Predpostavljamo, da je čistoča DNA ustrezna, če je razmerje A260/A280 = 1,7-2,0. V

primeru, da je razmerje A260/A280 manjše od 1,7, so v vzorcu lahko prisotni proteini in/ali

aromatske spojine (npr. fenol). Razmerje A260/A280 > 2,0 nakazuje, da je v vzorcu lahko

prisotna RNA.


raztopine za spiranje spektrofotometra:

- 70 % etanol,

- 0,1 M in 1 M NaOH,

- redestilirana voda,

- DNaza in RNaza prosta deionizirana voda,

2 mL epruvetke (Eppendorf, BioPure);

spektrofotometer Parkin Elmer (program Lambda 20 Bio).

Postopek:

V sterilno 2 mL epruvetko (Eppendorf, BioPure) smo odpipetirali 45 μL deionizirane vode

in dodali 5 μL vzorčne DNA ter dobro premešali. Nato smo zagnali program Lambda 20

Bio in z ukazom Wp določili aplikacijo DNA ter pričeli z merjenjem absorbanc.


21

3.2.4 Kvantitativna določitev mutacij MPL W515L in MPL W515K z verižno reakcijo s polimerazo v realnem času

Za določitev izražanja mutacij MPL W515L in MPL W515K smo uporabili kvantitativno

verižno reakcijo s polimerazo v realnem času z uporabo hidrolizirajočih sond. V reakciji

smo uporabili smerni in protismerni oligonukleotidni začetnik ter par sond označenih s 5'

reporterskim barvilom. Pri alelni diskriminaciji reakcijska mešanica vsebuje za vsak alel

specifično fluorescenčno označeno sondo (v našem primeru je bil mutiran alel označen z

reporterskim barvilom FAMTM, nemutiran pa z VIC®), kar omogoča spremljanje

pomnoževanja posameznega alela (17).


univerzalna reakcijska mešanica TaqMan® Universal PCR Master Mix 2X (Applied

Biosystems);

reagenčni komplet MPL MutaScreenTM Kit (Ipsogen), ki je sestavljen iz:

- IPSOGEN PPM–MPL W515L 10X (kat. št. PF-000552) je mešanica

specifičnih smernih in protismernih oligonukleotidov za gen MPL ter

specifičnih sond za mutacijo (W515L) FAMTM in divji tip VIC®;

- IPSOGEN PPM–MPL W515K 10X (kat. št. PF-000553) je mešanica

specifičnih smernih in protismernih oligonukleotidov za gen MPL ter

specifičnih sond za mutacijo (W515K) FAMTM in divji tip VIC®;

- PC-W515L (pozitivna kontrola) (kat. št. PF-000547);

- PC-W515K (pozitivna kontrola) (kat. št. PF-000548);

- NC-MPL (negativna kontrola) (kat. št. PF-000549);

- COS-MPL W515L (Cut–Off Sample oz. razmejitveni vzorec) = 1,5 %

W515L/WT (kat. št. PF-000550);

- COS-MPL W515K (Cut–Off Sample oz. razmejitveni vzorec) = 1,5 %

W515K/WT (kat. št. PF-000551);

redestilirana voda (brez encimov DNaz in RNaz);

sterilne pipete in nastavki za pipete (10100 µL, 0,510 µL Eppendorf);

avtomatska pipeta (Multipipette® stream, Eppendorf);

komora, ki omogoča sterilno delo (Holten LaminAir);

orbitalni mešalnik Multi-Spin MSC-6000 (Biosan)


22

mikrotitrska ploščica ABI PRISMTM 96-well Optical Reaction Plate;

ciklični pomnoževalnik ABI PRISM 7000 SDS (Applied Biosystems).

Postopek:

Reakcijo smo izvedli po navodilu priloženem kompletu MPL MutaScreenTM Kit (Ipsogen

Cancer Profiler, december 2008). Vzorce in reagente smo najprej prenesli iz

zamrzovalnika in jih odtalili na sobni temperaturi. Nato smo jih premešali z orbitalnim

mešalnikom in kratko centrifugirali (˝short spin˝). Vzorce in reagente smo ves čas hranili

na hladnem, raztopini IPSOGEN PPM W515L/K pa smo še dodatno zaščitili pred svetlobo

z aluminijasto folijo, ker sta vsebovali fluorescenčni barvili.

Najprej smo v dve 1,5 mL mikrocentrifugirki pripravili za ustrezno število reakcij

reakcijski mešanici za MPL W515L in MPL W515K in pri tem zaradi izgub pri pipetiranju

prišteli še 2 dodatni reakciji. Pripravljeni reakcijski mešanici smo z aluminijasto folijo

zaščitili pred svetlobo, rahlo premešali in kratko centrifugirali (˝short spin˝). Vsaka

reakcija je vsebovala v dvojniku pozitivno in negativno kontrolo, razmejitveni vzorec (Cut-

Off Sample), slepo kontrolo (DNaza in RNaza prosta voda) in do 20 preiskovanih vzorcev.

Preglednica III: Sestava reakcijske mešanice za MPL W515L in MPL W515K

REAGENT

Volumen za 1 vzorec

TaqMan Universal PCR Master Mix 2x 12,5 µL

IPSOGEN PPM-MPL W515L ali MPL

W515K 10x 2,5 µL

RNaza, DNaza prosta voda 5 µL

Celotna reakcijska zmes 20 µL

Nato smo si pripravili mikrotitrsko ploščico in v posamezne vdolbinice z avtomatsko

pipeto napipetirali 20 µL ustrezne reakcijske mešanice (Slika 5). V vsako vdolbinico, kjer

je že bila reakcijska mešanica, smo dodali 5 µL vzorca, tako da je bil končni volumen

reakcijske mešanice 25 µL. Po nanosu vseh vzorcev smo mikrotitrsko ploščico pokrili s


23

prozorno samolepilno folijo (MicroAmpTM Optical Adhesive Film, Applied Biosystems) in

jo centrifugirali 1 min pri 2000 obr./min (centrifuga Labofuge 400, Heraeus).

Slika 5 : Shema nanosa reakcijskih mešanic in vzorcev na mikrotitrsko ploščico

(Legenda: +K MPL W515L/K= pozitivna kontrola, NC= negativna kontrola, COS=

razmejitveni vzorec (Cut-Off Sample), H2O (RNaz in DNaz prosta voda). Z oranžno barvo

so označeni prostorčki, kjer smo določali prisotnost mutacije W515L, z rumeno barvo pa

so označeni prostorčki, kjer smo določali prisotnost mutacije W515K.

Mikrotitrsko ploščico smo prenesli v ciklični pomnoževalnik ABI PRISM 7000 SDS in

zagnali program absolutne kvantifikacije.

Preglednica IV: Pogoji qPCR

qPCR program Temperatura Čas Št. ponovitev 50 2 min 1x 95 10 min 1x 92 15 s 60 1 min

50x

Po končani reakciji je sledila še alelna diskriminacija (ang.: Allelic Discrimination, Post-

Read; sledili smo navodilom za uporabo aparata ABI PRISM 7000 SDS, User Guide,

Applied Biosystems 2001). Aparat je pri 60 ºC izvedel 1 cikel in zaznal jakost fluorescence

posameznega barvila.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A +K MPL W515L

+K MPL W515L

NC NC COS COS +K MPL W515K

+K MPL W515K

NC NC COS COS

B H2O H2O Vz.1 Vz.1 Vz.2 Vz.2 H2O H2O Vz.1 Vz.1 Vz.2 Vz.2 C Vz.3 Vz.3 Vz.4 Vz.4 Vz.5 Vz.5 Vz.3 Vz.3 Vz.4 Vz.4 Vz.5 Vz.5 D Vz.6 Vz.6 Vz.7 Vz.7 Vz.8 Vz.8 Vz.6 Vz.6 Vz.7 Vz.7 Vz.8 Vz.8 E Vz.9 Vz.9 Vz.10 Vz.10 Vz.11 Vz.11 Vz.9 Vz.9 Vz.10 Vz.10 Vz.11 Vz.11 F Vz.12 Vz.12 Vz.13 Vz.13 Vz.14 Vz.14 Vz.12 Vz.12 Vz.13 Vz.13 Vz.14 Vz.14 G Vz.15 Vz.15 Vz.16 Vz.16 Vz.17 Vz.17 Vz.15 Vz.15 Vz.16 Vz.16 Vz.17 Vz.17 H Vz.18 Vz.18 Vz.19 Vz.19 Vz.20 Vz.20 Vz.18 Vz.18 Vz.19 Vz.19 Vz.20 Vz.20


24

Preglednica V: Alelna diskriminacija- program Post read

Temperatura Čas Št. ponovitev

60 ºC 1 min 1x

3.3 STATISTIČNA OBDELAVA VZORCEV Statistično obdelavo vzorcev smo izvedli s pomočjo statističnega programa SPSS (Statsoft Inc, ZDA). Kot parametre opisne statistike smo določili povprečno vrednost, standardno deviacijo in

koeficient variacije.


25

4 REZULTATI IN RAZPRAVA Pri večini bolnikov s policitemijo rubro vera (PRV) in pri približno polovici bolnikov z ET

in PM lahko dokažemo pridobljeno somatsko mutacijo JAK2 V617F. Nadaljnje raziskave

so pokazale, da v približno 1-9 % bolnikov z ET in v 5-11 % bolnikov s PM ugotovimo

somatske mutacije v genu za trombopoetinski receptor MPL. Slednje se pri drugih MPN

pojavijo redko. Določitev mutacije JAK2 V617F in mutacij v genu MPL sta pomembni

dodatni preiskavi pri postavitvi diagnoze mieloproliferativnih novotvorb (2).

Glede na pomen določanja mutacij v MPL smo se odločili preiskavo vpeljati v redno delo

Specializiranega hematološkega laboratorija in določiti odstotek pojavljanja mutacij

W515L in W515K pri populaciji 77 bolnikov z ET. Prisotnost pridobljenih mutacij MPL

W515L/K smo določili s pomočjo reagenčnega kompleta MPL MutaScreenTM Kit

(Ipsogen) na aparatu ABI PRISM 7000 SDS.

Po navodilu priloženem kompletu MPL MutaScreenTM Kit (Ipsogen Cancer Profiler,

december 2008), smo za reakcijo potrebovali 25 ng vzorčne DNA s čistočo A260/A280 =1,7-

2,0. Zato smo najprej izmerili koncentracijo in čistočo vzorcev DNA s pomočjo

spektrofotometra Parkin Elmer (program Lambda 20 Bio).

MPL MutaScreenTM Kit (Ipsogen) je raziskovalno orodje namenjeno natančni detekciji

mutacij MPL W515L in MPL W515K ter določanju deleža mutiranega alela v genomski

DNA. Metoda je osnovana na verižni reakciji s polimerazo v realnem času s hidrolizo

fluorescenčno označenih oligonukleotidnih sond. Princip določanja genotipa pa je alelna

diskriminacija.

Izvedli smo štiri analizne preizkuse, kjer smo istočasno določali tako mutacijo MPL

W515L, kot tudi mutacijo MPL W515K. Pri vsakem analiznem preizkusu smo najprej

izvedli qPCR, da smo pridobili zadostno količino produkta PCR. Pridobili smo podatke o

vrednosti Cq, ki je sorazmerna številu kopij DNA segmenta v začetku reakcije. Z

določanjem vrednosti Cq in analize teh podatkov smo pridobili povprečno vrednost,

standardni odklon in koeficient variacije vrednosti Cq za posamezen genotip. Pri rednem


26

delu nam te vrednosti lahko služijo kot kontrola natančnosti določanja prisotnosti mutacij

MPL W515L/K v različnih preizkusih.

Po končanem qPCR smo izvedli še alelno diskriminacijo, kjer smo izmerili intenziteto

fluorescence posameznega barvila. Preizkuse smo opravili v dvojniku. Iz dobljenih

vrednosti intenzitete fluorescence reporterskih barvil za mutiran (barvilo FAMTM ) in

nemutiran (barvilo VIC®) alel smo za vsak vzorec najprej izračunali povprečno vrednost

mutiranega in nemutiranega alela, nato razmerje med povprečno vrednostjo mutiranega in

nemutiranega alela (povprečje FAMTM /povprečje VIC® oz. povprečje alel Y/povprečje

alel X) in to razmerje primerjali z razmerjem mutiranega in nemutiranega alela

razmejitvenega vzorca ((vzorec povprečje alel Y/povprečje alel X)/ (razmejitveni vzorec

povprečje alel Y/povprečje alel X)). Če je bilo to razmerje ≥ 1 je bil vzorec pozitiven za

mutaciji MPL W515L/K, če je bilo razmerje < 1 pa je bil vzorec WT za mutaciji MPL

W515L/K. Razmejitveni vzorec vsebuje 1,5 % mutiranega alela W5151L ali W515K.

Pomeni tudi občutljivost detekcije našega analitskega sistema.

4.1 MERJENJE KONCENTRACIJE IN ČISTOČE DNA IZOLIRANE IZ GRANULOCITOV PERIFERNE KRVI

Podatki o čistoči DNA kažejo na to, da reagenčni komplet QIAamp DNA Mini Kit

(Qiagen) omogoča izolacijo DNA ustrezne čistoče (A260/A280=1,7-2,0) in zadovoljive

koncentracije. V našem primeru sta le dva vzorca (J2170 in J2123) odstopala od

predpisanega intervala ustrezne čistoče, vendar smo ju kljub temu vključili v raziskavo in

ugotovili, da neustrezna čistoča ni vplivala na rezultat qPCR in alelne diskriminacije (glej

rezultate v preglednici VIII in preglednici IX). Povprečna koncentracija izolirane DNA je

znašala 90,88±51,72 ng/μL. Povprečno razmerje (A260/A280) je znašalo 1,8±0,1, razpon od

1,6 do 2,0.


27

Preglednica VI: Rezultati merjenja koncentracije in čistoče (A260/A280) DNA izolirane iz granulocitov periferne krvi s kompletom QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen)

Vzorec Koncentracija

(ng/μL) A260/A280 Vzorec Koncentracija

ng/μL) A260/A280

J2170 25,42 1,6 J1093 168,64 1,8 J2123 38,41 1,6 J1076 97,34 1,8 J2113 120,55 1,7 J1075 61,26 1,7 J2054 64,05 1,8 J1059 85,64 1,8 J2041 57,08 1,8 J1049 165,88 1,8 J1980 51,96 1,7 J1025 106,49 1,7 J1962 20,70 2,0 J1024 92,68 1,8 J1849 134,18 1,9 J1011 58,21 1,7 J1831 70,48 1,9 J982 70,66 1,8 J1795 183,02 1,8 J900 107,10 1,8 J1751 14,57 1,7 J896 111,72 1,9 J1693 24,51 2,0 J881 96,95 1,8 J1661 29,43 1,9 J867 73,55 1,8 J1629 58,92 1,9 J863 157,49 1,8 J1626 51,77 1,8 J855 125,29 1,9 J1583 217,81 1,8 J796 111,49 1,9 J1565 42,77 1,8 J707 87,23 1,8 J1557 70,25 1,9 J694 30,40 1,7 J1510 27,99 1,7 J643 96,86 1,9 J1509 48,88 1,9 J603 45,76 2,0 J1467 23,27 1,8 J589 64,72 2,0 J1466 36,74 1,8 J583 66,21 1,8 J1358 41,92 1,7 J541 77,80 1,9 J1319 244,01 1,8 J518 143,57 1,9 J1311 18,76 2,0 J498 80,41 1,8 J1293 171,96 1,8 J473 78,46 1,8 J1285 82,99 1,7 J452 127,10 1,8 J1281 81,76 1,8 J451 125,31 1,7 J1272 118,13 1,9 J411 87,55 1,7 J1255 77,13 1,7 J402 148,68 1,8 J1254 51,53 1,7 J392 145,55 1,8 J1235 194,20 1,8 J380 70,66 1,8 J1234 57,73 1,8 J325 99,46 1,8 J1230 229,18 1,8 J293 90,56 1,8 J1224 82,23 1,8 J291 27,40 1,8 J1133 112,58 1,9 J279 55,52 2,0 J1117 79,84 1,8 J277 79,25 1,8 J1113 114,04 1,8 J249 175,14 1,9 J1103 133,48 1,8


28

4.2 VERIŽNA REAKCIJA S POLIMERAZO V REALNEM ČASU

4.2.1 Vrednosti Cq pozitivnih, negativnih kontrolnih in razmejitvenih vzorcev priloženih h kompletu MPL MutaScreenTM Kit

Preizkus smo za pozitivni, negativni kontrolni ter razmejitveni vzorec (Cut-Off Sample)

naredili v dvojniku. Pozitivni, negativni kontrolni ter razmejitveni vzorec so sestavni del

reagenčnega kompleta MPL MutaScreenTM Kit. Določili smo povprečno vrednost,

standardno deviacijo in koeficient variacije Cq za pozitivni, negativni kontrolni ter

razmejitveni vzorec, kar prikazuje preglednica VII.

Vrednosti standardne deviacije in koeficienta variacije za pozitivni in negativni kontroli ter

razmejitveni vzorec, pridobljene v 4 analiznih preizkusih kažejo na dobro ponovljivost

vrednosti Cq. Priporočljivo bi bilo te vrednosti nadgraditi z nadaljnjimi preizkusi v rednem

delu v laboratoriju, z namenom pridobiti še natančnejše podatke. Že sedaj lahko te

vrednosti služijo za oceno natančnosti analiz za določitev prisotnosti mutacij MPL

W515L/K.

29

Preglednica VII: Vrednosti Cq pozitivnih, negativnih kontrolnih in razmejitvenih vzorcev za mutaciji MPL W515K in MPL W515L, pridobljene v štirih reakcijah

Pozitivni kontrolni vz. Negativni kontrolni vz. Razmejitveni vz. MPL W515K MPL W515L MPL W515K MPL W515L MPL W515K MPL W515L

Cq FAM Cq VIC Cq FAM Cq VIC Cq FAM Cq VIC Cq FAM Cq VIC Cq FAM Cq VIC Cq FAM Cq VIC Exp. 1 24,64 0 24,33 0 0 25,23 0 26,45 38,82 26,16 36,64 26,51 Exp. 1 24,73 0 24,31 0 0 26,03 0 26,13 38,24 26,83 35,67 26,64 Exp. 2 24,56 0 24,38 0 0 26,10 0 26,52 40,76 26,17 35,31 26,80 Exp. 2 24,48 0 24,29 0 0 25,98 0 26,46 39,25 26,29 35,83 26,73 Exp. 3 24,79 0 25,02 0 0 25,91 0 26,11 39,64 26,20 36,67 26,55 Exp. 3 24,79 0 25,02 0 0 26,31 0 26,07 40,16 26,56 37,30 26,66 Exp. 4 24,93 0 24,35 0 0 26,04 0 26,06 39,91 26,08 35,47 26,46 Exp. 4 25,01 0 24,31 0 0 25,84 0 26,26 41,13 26,21 34,55 26,48

Povprečje Cq 24,74±0,18

0 24,50±0,32

0 0 25,93±0,31 0 26,26±0,19 39,74±0,97 26,31±0,25 35,93±0,89 26,60±0,12

Koef. variacije (%) 0,73 0 1,31 0 0 1,20 0 0,72 2,44 0,95 2,48 0,45


30

4.2.2 Določanje vrednosti Cq vzorcev bolnikov z ET

Vsak vzorec smo analizirali v dvojniku. V preglednici VIII so zbrane vrednosti Cq za 76

vzorcev bolnikov z ET, ki niso imeli prisotne mutacije MPL W515K. Za te vzorce smo

izračunali povprečno vrednost, standardno deviacijo in koeficient variacije vrednosti Cq.

Povprečna vrednost Cq vzorcev bolnikov z odsotno mutacijo W515K je znašala

28,01±0,97. Povprečno vrednost in standardno deviacijo smo izračunali iz vseh vrednosti

Cq VIC. Izločili smo le enega ubežnika, vzorec z oznako J589, ki je bil nad mejo ±3

standardne deviacije srednje vrednosti Cq. Koeficient variacije je znašal 3,46 %.

Preglednica IX prikazuje vrednosti Cq vzorcev 73 bolnikov z ET, ki niso imeli prisotne

mutacije MPL W515L. Tudi za te vzorce smo izračunali povprečno vrednost, standardno

deviacijo in koeficient variacije vrednosti Cq VIC. Povprečna vrednost Cq vzorcev

bolnikov z odsotno mutacijo W515L je znašala 28,73±1,10. Koeficient variacije je znašal

3,82 %. Izločili smo ubežnike z oznako J589, J583 in eno paralelko vzorca J2041, ki so bili

nad mejo ±3 standardne deviacije srednje vrednosti Cq.

Pri bolnikih z ET, ki niso imeli prisotni mutaciji MPL W515L/K so vrednosti standardne deviacije in koeficienta variacije zelo podobne in kažejo na dobro ponovljivost analiznega

postopka (Preglednica VIII in IX).

Pri bolnikih s prisotno mutacijo MPL W515L smo opazili večji koeficient variacije, kar

kaže na različna deleža mutiranega in nemutiranega alela v posameznih vzorcih

(Preglednica X).

Preglednica VIII: Vrednosti Cq bolnikov z ET, ki niso imeli prisotne mutacije MPL W515K

Vzorec Ponovitev Cq VIC Cq

FAM Vzorec Ponovitev Cq VIC Cq

FAM J2170 1 27,64 0 J1467 1 27,12 0

2 27,68 0 2 26,93 0 J2123 1 27,99 0 J1466 1 28,12 0

2 27,70 0 2 28,13 0 J2113 1 26,14 0 J1358 1 27,39 0

2 26,37 0 2 27,67 0 J2054 1 27,88 0 J1319 1 28,26 0

2 27,66 0 2 28,20 0


31

J2041 1 25,48 0 J1311 1 29,49 0 2 25,51 0 2 29,29 0

J1980 1 27,78 0 J1293 1 29,12 0 2 27,82 0 2 29,09 0

J1962 1 27,17 0 J1285 1 28,22 0 2 27,15 0 2 28,20 0

J1849 1 28,67 0 J1281 1 28,11 0 2 28,57 0 2 27,86 0

J1831 1 27,12 0 J1272 1 28,62 0 2 27,41 0 2 28,62 0

J1795 1 29,31 0 J1255 1 27,80 0 2 28,90 0 2 27,71 0

J1751 1 29,19 0 J1254 1 27,71 0 2 29,23 0 2 27,86 0

J1693 1 28,67 0 J1235 1 29,24 0 2 28,31 0 2 28,86 0

J1661 1 28,06 0 J1234 1 26,26 0 2 27,76 0 2 26,34 0

J1629 1 27,45 0 J1230 1 28,80 0 2 27,34 0 2 29,01 0

J1626 1 27,77 0 J1224 1 28,33 0 2 27,33 0 2 28,33 0

J1583 1 29,81 0 J1133 1 27,53 0 2 29,67 0 2 27,28 0

J1565 1 27,06 0 J1117 1 28,52 0 2 27,08 0 2 28,47 0

J1557 1 26,58 0 J1113 1 27,76 0 2 26,51 0 2 27,66 0

J1093 1 28,37 0 J1103 1 30,02 0 2 28,16 0 2 29,36 0

J1076 1 27,44 0 J603 1 27,53 0 2 27,77 0 2 27,58 0

J1075 1 28,22 0 J589 1 24,63* 0 2 27,99 0 2 24,45* 0

J1059 1 27,26 0 J583 1 25,42 0 2 27,22 0 2 25,43 0

J1049 1 28,47 0 J541 1 28,26 0 2 28,92 0 2 28,07 0

J1025 1 27,05 0 J518 1 28,06 0 2 27,06 0 2 28,19 0

J1024 1 30,32 0 J498 1 27,90 0 2 30,28 0 2 27,82 0

J1011 1 27,38 0 J473 1 27,31 0 2 27,19 0 2 27,48 0

J982 1 26,47 0 J452 1 28,09 0 2 26,40 0 2 27,82 0

J900 1 28,72 0 J451 1 27,58 0 2 28,39 0 2 27,53 0

J896 1 27,96 0 J411 1 28,91 0 2 28,30 0 2 28,71 0


32

J881 1 27,76 0 J402 1 28,76 0 2 27,54 0 2 28,65 0

J867 1 27,97 0 J392 1 29,00 0 2 27,97 0 2 28,81 0

J863 1 28,01 0 J380 1 27,09 0 2 27,97 0 2 26,83 0

J855 1 29,03 0 J325 1 28,08 0 2 29,18 0 2 27,64 0

J796 1 28,00 0 J293 1 29,46 0 2 27,96 0 2 29,73 0

J707 1 27,48 0 J291 1 28,32 0 2 27,40 0 2 28,50 0

J694 1 28,94 0 J279 1 28,20 0 2 28,73 0 2 28,10 0

J643 1 29,54 0 J277 1 28,22 0 2 29,70 0 2 28,42 0 J1510 1 26,26 0 J249 1 30,04 0

2 26,14 0 2 29,66 0 Z * so označene meritve, ki zaradi velikih odstopanj pri nadaljnjem izračunu niso bile upoštevane.

Preglednica IX: Cq vrednosti bolnikov, ki niso imeli prisotne mutacije MPL W515L

Vzorec Ponovitev Cq VIC Cq

FAM Vzorec Ponovitev Cq

VIC Cq

FAM J2170 1 28,18 0 J1358 1 28,21 0

2 28,18 0 2 28,10 0 J2123 1 28,22 0 J1319 1 28,51 0

2 28,48 0 2 28,98 0 J2113 1 26,80 0 J1311 1 30,17 0

2 26,88 0 2 30,15 0 J2054 1 29,02 0 J1293 1 29,79 0

2 28,91 0 2 30,12 0 J2041 1 26,12 0 J1285 1 29,09 0

2 25,90* 0 2 28,83 0 J1962 1 27,89 0 J1281 1 28,53 0

2 28,01 0 2 28,47 0 J1849 1 29,19 0 J1272 1 29,39 0

2 29,04 0 2 29,23 0 J1831 1 27,44 0 J1255 1 28,84 0

2 27,50 0 2 28,71 0 J1795 1 30,10 0 J1254 1 28,30 0

2 29,85 0 2 28,40 0 J1693 1 30,19 0 J1235 1 29,68 0

2 30,20 0 2 29,81 0 J1661 1 29,01 0 J1234 1 27,04 0

2 28,85 0 2 26,89 0 J1629 1 28,26 0 J1230 1 29,77 0

2 28,73 0 2 29,63 0 J1626 1 29,26 0 J1224 1 29,11 0


33

2 29,16 0 2 28,70 0 J1565 1 27,94 0 J1133 1 28,10 0

2 28,23 0 2 27,89 0 J1557 1 27,97 0 J1117 1 29,60 0

2 27,35 0 2 29,35 0 J1510 1 27,00 0 J1113 1 28,42 0

2 27,19 0 2 28,60 0 J1509 1 30,02 0 J1103 1 30,70 0

2 29,92 0 2 30,56 0 J1467 1 28,40 0 J1093 1 29,44 0

2 27,46 0 2 29,31 0 J1075 1 30,36 0 J1076 1 28,51 0

2 29,77 0 2 28,58 0 J1059 1 28,30 0 J589 1 25,12* 0

2 27,82 0 2 25,02* 0 J1049 1 29,13 0 J583 1 25,92* 0

2 29,59 0 2 25,81* 0 J1025 1 27,51 0 J541 1 29,06 0

2 27,31 0 2 28,91 0 J1024 1 30,14 0 J518 1 28,56 0

2 31,06 0 2 28,52 0 J1011 1 27,92 0 J498 1 28,50 0

2 27,50 0 2 28,49 0 J982 1 27,05 0 J473 1 28,21 0

2 26,88 0 2 28,05 0 J900 1 28,94 0 J452 1 29,05 0

2 28,93 0 2 28,74 0 J896 1 29,53 0 J451 1 28,19 0

2 29,26 0 2 28,37 0 J881 1 28,69 0 J411 1 30,04 0

2 28,82 0 2 29,74 0 J867 1 29,00 0 J402 1 29,65 0

2 28,48 0 2 29,66 0 J863 1 28,47 0 J392 1 29,42 0

2 28,47 0 2 29,49 0 J855 1 29,32 0 J380 1 27,51 0

2 29,69 0 2 27,52 0 J796 1 28,85 0 J325 1 29,13 0

2 28,47 0 2 28,48 0 J707 1 27,74 0 J293 1 30,25 0

2 27,75 0 2 30,45 0 J694 1 29,65 0 J291 1 29,13 0

2 29,40 0 2 29,09 0 J643 1 30,74 0 J279 1 29,16 0

2 30,05 0 2 28,80 0 J603 1 27,90 0 J277 1 28,83 0

2 27,98 0 2 29,31 0 J1466 1 29,87 0 J249 1 30,78 0

2 29,28 0 2 30,46 0 Z * so označene meritve, ki zaradi velikih odstopanj pri nadaljnjem izračunu niso upoštevane.


34

Preglednica X: Vrednosti Cq vzorcev 4 bolnikov, ki so imeli prisotni mutaciji MPL

W515L/K

MPL W515L MPL W515K vzorec FAM VIC

vzorec FAM VIC

J1980 33,83 29,81 J1509 30,76 29,47 J1980 33,63 29,07 J1509 30,38 29,43 J1751 25,05 32,65 J1751 25,02 32,14 J1583 25,38 34,49 J1583 25,86 34,86

Povprečje Cq 28,13±4,35 32,17±2,37 30,57±0,27 29,45±0,03

Koef. variacije

(%) 15,46 7,37 0,88 0,10

4.3 REZULTATI ALELNE DISKRIMINACIJE

Iz dobljenih vrednosti intenzitete fluorescence za barvili FAMTM in VIC® smo za vsak

vzorec najprej izračunali povprečno vrednost mutiranega in nemutiranega alela, nato

razmerje med povprečno vrednostjo mutiranega in nemutiranega alela (povprečje FAMTM

/povprečje VIC® oz. povprečje alel Y/povprečje alel X) in to razmerje primerjali z

razmerjem mutiranega in nemutiranega alela razmejitvenega vzorca ((vzorec povprečje

alel Y/povprečje alel X)/ (razmejitveni vzorec povprečje alel Y/povprečje alel X)). Če je

bilo to razmerje ≥1 je bil vzorec pozitiven za mutaciji MPL W515L/K, če je bilo razmerje


35

zaznali na meji občutljivosti preiskave, v našem primeru 1,5 %. Izsledke je zato potrebno

vedno vrednotiti skupaj s klinično sliko in drugimi preiskavami.

S kompletom MPL MutaScreenTM Kit (Ipsogen) smo prisotnost mutacije MPL W515L

ugotovili pri 3 (4 %) bolnikih z ET (Preglednica XIV). Prisotnost mutacije MPL W515K

pa pri 1 ( 2 %) bolniku z ET (Preglednica XV). Obe mutaciji se skupno pojavljata pri

približno 5 % bolnikov z ET, ki smo jih vključili v raziskavo. Ugotovili smo, da se

vrednosti ujemajo z objavljenimi podatki iz literature in da je mutacija MPL W515L

pogostejša. Smatramo, da je preiskava primerna za redno uporabo v laboratoriju.

V prilogi se nahajata preglednici XVI in XVII, kjer so zbrani rezultati alelne diskriminacije

(intenziteta fluorescence za barvili FAMTM in VIC® ) vzorcev bolnikov z ET, ki niso imeli

prisotni mutaciji MPL W515L/K.

Preglednica XI: Vrednosti mutiranega in nemutiranega alela razmejitvenega vzorca za

mutacijo MPL W515K in mutacijo MPL W515L, pridobljenih v 4 analiznih poskusih

Alel X Alel Y Povprečje alel X Povprečje

alel Y Povprečje alel Y/ povprečje alel X

Razmejitveni vzorec W515K Exp. 1 1,965 1,009 Exp. 1 1,812 0,989

1,889 0,999 0,529

Exp. 2 2,164 1,353 Exp. 2 1,974 1,316

2,069 1,335 0,645

Exp. 3 1,974 1,035 Exp. 3 1,826 1,015

1,900 1,025 0,539

Exp. 4 2,051 1,289 Exp. 4 1,879 1,151

1,965 1,220 0,621

Povprečje 1,956±0,083 1,145±0,160 Koef. variacije (%) 4,243 13,973

Razmejitveni vzorec W515L Exp. 1 1,976 1,338 Exp. 1 1,972 1,242

1,974 1,290 0,653

Exp. 2 2,029 1,073 Exp. 2 2,029 1,048

2,029 1,061 0,523

Exp. 3 2,379 1,384 Exp. 3 2,384 1,401

2,382 1,393 0,585

Exp. 4 2,062 1,187 Exp. 4 2,043 1,241

2,053 1,214 0,591

Povprečje 2,109±0,184 1,239±0,140 Koef. variacije (%) 8,724 11,299


36

Preglednica XII: Vrednosti mutiranega in nemutiranega alela pozitivne kontrole za

mutacijo MPL W515L in mutacijo MPL W515K, pridobljenih v 4 analiznih poskusih

Alel X Alel Y povprečje alel X povprečje

alel Y alel Y/ alel X (alel Y/ alel X)/

(COS alel Y/alel X) +K W515L

Ekp. 1 0,585 4,047 Ekp. 1 0,609 3,978

0,597 4,013 6,721 10,285

Ekp. 2 0,480 3,541 Ekp. 2 0,499 3,653

0,490 3,597 7,348 14,059

Ekp. 3 0,783 4,651 Ekp. 3 0,795 4,660

0,789 4,656 5,901 10,091

Ekp. 4 0,675 3,737 Ekp. 4 0,672 3,750

0,674 3,744 5,558 9,397

Povprečje 0,637±0,126 4,002±0,468 10,958±2,102 Koef. variacije (%) 19,780 11,694 19,182

+K W515K Exp. 1 0,256 4,105 Exp. 1 0,245 4,188

0,251 4,147 16,553 31,291

Exp. 2 0,520 4,059 Exp. 2 0,507 4,102

0,514 4,081 7,946 12,320

Exp. 3 0,321 4,288 Exp. 3 0,300 4,283

0,311 4,286 13,802 25,584

Exp. 4 0,605 3,737 Exp. 4 0,561 3,720

0,583 3,729 6,395 10,301


Preglednica XIII: Vrednosti mutiranega in nemutiranega alela negativne kontrole za

mutacijo MPL W515L in mutacijo MPL W515K, pridobljenih v 4 analiznih poskusih

Alel X Alel Y povprečje alel X povprečje

alel Y

Povprečje alel Y/

povprečje alel X

(alel Y/ alel X)/ (COS alel Y/alel X)

W515L Exp. 1 2,019 0,786 Exp. 1 2,050 0,778

2,035 0,782 0,384 0,588

Exp. 2 2,026 0,682 Exp. 2 2,053 0,687

2,040 0,685 0,336 0,642

Exp. 3 2,393 0,831 Exp. 3 2,378 0,828

2,386 0,830 0,348 0,595

Exp. 4 2,463 0,942 Exp. 4 2,577 0,968

2,520 0,955 0,379 0,641

Povprečje 2,245±0,246 0,813±0,112 0,616±0,029 Koef. variacije 10,958 13,776 4,708


37

W515K Exp. 1 2,038 0,581 Exp. 1 2,039 0,591

2,039 0,586 0,287 0,499

Exp. 2 2,227 0,616 Exp. 2 2,211 0,604

2,219 0,610 0,275 0,421

Exp. 3 2,128 0,613 Exp. 3 2,061 0,607

2,095 0,610 0,291 0,557

Exp. 4 2,171 0,538 Exp. 4 2,149 0,579

2,160 0,559 0,259 0,442


Preglednica XIV: Vrednosti mutiranega in nemutiranega alela vzorcev bolnikov z ET in

prisotno mutacijo MPL W515L

vzorec Alel X Alel Y Povprečje alel X Povprečje

alel Y

Povprečje alel Y/ povprečje

alel X


1,884 1,652 J1980 1,939 1,652

1,912

1,652

0,864

1,461

1,374 4,136 J1751 1,329 3,899

1,352

4,018

2,973

5,026

1,213 3,802 J1583 1,230 3,906

1,222

3,854

3,155

5,334

Preglednica XV: Vrednosti mutiranega in nemutiranega alela vzorcev bolnikov z ET in

prisotno mutacijo MPL W515K

Vzorec Alel X Alel Y Povprečje alel X Povprečje

alel Y


alel X


1,549 2,655 J1509 1,584 2,811

1,567 2,733 1,745 3,298


38

5 ZAKLJUČKI

Na podlagi izsledkov naše raziskave lahko zaključimo:

da način osamitve DNA iz granulocitov z reagenčnim kompletom QIAamp DNA

Mini Kit (Qiagen) omogoča ustrezno količino in kakovost DNA za določitev

mutacij MPL W515L in MPL W515K pri bolnikih z ET.

da je reagenčni komplet MPL MutaScreenTM Kit (Ipsogen) primeren za redno

določitev prisotnosti somatskih mutacij MPL W515L in MPL W515K v vzorcih

DNA izoliranih iz granulocitov.

da se mutaciji MPL W515L in MPL W515K pojavljata v 5 % bolnikov z esencialno

trombocitemijo

da je mutacija MPL W515L pogostejša od mutacije MPL W515K


39

6 LITERATURA

1. Andoljšek D: Interna medicina; Poglavje 12: Bolezni krvi in krvotvornih organov;

Kronične mieloproliferativne bolezni. 3. izdaja, Littera Picta d.o.o., Ljubljana 2005: 1240–

1249.

2. Varidman, JW, Thiele J, Arber DA e tal.: The 2008 revision of the World Health

Organization (WHO) classification of myeloid neoplasms and acute leukemia: rationale

and important changes. Blood, 2009; 114: 937-951

3. Černelč P: Smernice za ugotavljanje in zdravljenje bolnikov z esencialno

trombocitemijo. Zdravstveni vestnik 2008; 77: I-15-7

4. Fabris F, Randi ML: Essential thrombocythemia: past and present. Intern Emerg Med

2009; 4: 381-388

5. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?Db=gene&Cmd=retrieve&dopt=full_report&list

_uids=4352 (03.08.2010)

6. http://www.nature.com/leu/journal/v24/n6/full/leu201069a.html (10.09.2010)

7. Tefferi A, Gilliland DG: Oncogenes in Myeloproliferative Disorders.Cell Cycle 2007; 6:

550-566

8. Levine RL, Heaney M: New Advances in the Pathogenesis and Therapy of Essential

Thrombocythemia. Hematology 2008; 7: 76-82

9. Beer PA, Campbell JP, Scott ML et. al: MPL mutations in myeloproliferative disorders:

analysis of the PT-1 cohort. Blood 2008; 112: 141-149

10. Skoda RC: Thrombocytosis. Hematology 2009; 159-167


40

11. Kralovics R: Genetic complexity of myeloproliferative neoplasms. Leukemia 2008; 22:

1841-1848

12. Kawamata N, Ogawa S, Yamamoto G, et al. Genetic profiling of myeloproliferative

disorders by singlenucleotide polymorphism oligonucleotide microarray. Exp Hematol.

2008;36:1471-1479.

13. Moliterno AR, Williams DM, Gutierrez-Alamillo LI, Salvatori R, Ingersoll RG, Spivak

JL. Mpl Baltimore: athrombopoietin receptor polymorphism associated with

thrombocytosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101:11444-11447.

14. Levine RL, Warnig G: Role of JAK-STAT signalinh in the pathogenesis of

myeloproliferative disorders. Hematology 2006; 233-239

15. Vannucchi AM, Guglielmelli P, Tefferi A: Advances in Understanding and

Management of Myeloproliferative Neoplasms. CA A Cancer J Clin 2009; 59: 171-191

16. Bio.Rad Laboratories, Inc.: Real-Time PCR Application Guide, 2006

17. MPL MutaScreenTM Kit for the detection of MPL W515L & W515K mutations.

Introduction for use, Ipsogen Cancer Profiler, Version 01, December 2008

18. User Guide , ABI PRISM 7000 Sequence Detection System, Applied Biosystems 2001

19. Ding J, Komatsu H, Iida S et. al: The ASN505 mutation of the c-MPL gene, which

causes familial essential thrombocythemia, induces autonomous homodimerization of

the c-Mpl protein due to strong amino acid polarity. Blood 2009; 114: 3325-3328

20. Delhommeau F, Jeziorowska D, Marzac C, Casadevall N: Molecular aspects of

myeloproliferative neoplasms. Int J Hematol 2010; 91: 165-173


41

21. Bustin SA, Benes V, Garson JA, Hellemans J, Huggett J, Kubista M, et al.: The MIQE

guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR

experiments. Clin Chem 2009; 55: 611–22.


42

7 PRILOGE Preglednica XVI: Rezultati alelne diskriminacije za vzorce bolnikov z ET, ki niso imeli

prisotne mutacije MPL W515L

Vzorec Alel X Alel Y Povprečje alel X

Povprečje alel Y


alel X (alel Y/ alel X)/

(COS alel Y/alel X)

J2170 1,910 0,704 1,942 0,702 0,361 0,611 1,974 0,700

J2123 1,977 0,718 1,968 0,714 0,363 0,613 1,959 0,710

J2113 1,714 0,696 1,728 0,710 0,411 0,703 1,741 0,724

J2054 1,872 0,744 1,901 0,742 0,390 0,660 1,929 0,740

J2041 2,003 0,753 2,011 0,748 0,372 0,629 2,019 0,743

J1962 1,970 0,747 2,007 0,769 0,383 0,647 2,044 0,790

J1849 1,738 0,692 1,756 0,689 0,392 0,751 1,774 0,686

J1831 1,838 0,695 1,843 0,696 0,378 0,723 1,848 0,697

J1795 1,700 0,706 1,694 0,700 0,413 0,707 1,688 0,694

J1693 1,872 0,759 1,897 0,750 0,395 0,668 1,922 0,740

J1661 1,937 0,778 1,956 0,785 0,401 0,678 1,974 0,791

J1629 2,033 0,811 1,992 0,802 0,402 0,680 1,950 0,792

J1626 1,921 0,760 1,937 0,758 0,391 0,662 1,952 0,756

J1565 1,943 0,752 1,942 0,746 0,384 0,649 1,941 0,740

J1557 1,892 0,769 1,892 0,776 0,410 0,693 1,892 0,782

J1510 1,902 0,807 1,925 0,783 0,407 0,688 1,947 0,759

J1509 1,834 0,709 1,829 0,716 0,391 0,661 1,824 0,722

J1467 1,771 0,799 1,808 0,796 0,440 0,745 1,844 0,793

J1466 1,786 0,809 1,805 0,790 0,438 0,740 1,824 0,771

J1358 1,903 0,735 1,890 0,750 0,397 0,671


43

1,876 0,765 J1319 1,880 0,742 1,874 0,742 0,396 0,606

1,867 0,741 J1311 1,715 0,762 1,723 0,748 0,434 0,830

1,731 0,733 J1293 1,871 0,730 1,891 0,748 0,395 0,605

1,911 0,765 J1285 1,756 0,785 1,802 0,782 0,434 0,664

1,848 0,778 J1281 1,872 0,755 1,879 0,763 0,406 0,621

1,886 0,770 J1272 1,893 0,778 1,900 0,781 0,411 0,629

1,907 0,783 J1255 1,842 0,764 1,852 0,775 0,418 0,640

1,862 0,786 J1254 1,905 0,768 1,932 0,770 0,399 0,610

1,959 0,772 J1235 1,936 0,773 1,907 0,769 0,403 0,617

1,877 0,765 J1234 1,875 0,809 1,875 0,793 0,423 0,647

1,875 0,776 J1230 1,887 0,783 1,918 0,778 0,405 0,620

1,948 0,772 J1224 1,960 0,782 1,959 0,788 0,402 0,615

1,957 0,793 J1133 1,833 0,802 1,847 0,815 0,441 0,675

1,861 0,828 J1117 1,825 0,784 1,852 0,795 0,429 0,657

1,879 0,806 J1113 1,955 0,811 1,935 0,807 0,417 0,647

1,915 0,803 J1103 1,755 0,804 1,775 0,803 0,452 0,692

1,795 0,801 J1093 1,849 0,804 1,874 0,794 0,424 0,648

1,898 0,783 J1076 1,910 0,785 1,918 0,791 0,412 0,631

1,926 0,796 J1075 1,733 0,860 1,726 0,837 0,485 0,742

1,718 0,814 J1059 1,780 0,792 1,782 0,781 0,438 0,670

1,784 0,769 J1049 1,817 0,772 1,827 0,772 0,422 0,646

1,837 0,771 J1025 1,925 0,653 1,909 0,652 0,341 0,653

1,892 0,650 J1024 1,859 0,653 1,880 0,659 0,350 0,670

1,901 0,664 J1011 1,795 0,721 1,835 0,709 0,386 0,739

1,874 0,697 J982 1,939 0,684 1,934 0,679 0,351 0,671


44

1,929 0,673 J900 1,937 0,685 1,930 0,678 0,351 0,672

1,923 0,670 J896 2,003 0,823 1,853 0,767 0,414 0,707

1,703 0,710 J881 1,932 0,888 1,977 0,869 0,439 0,751

2,022 0,849 J867 1,810 0,704 1,847 0,706 0,382 0,732

1,883 0,708 J863 1,920 0,695 1,950 0,701 0,359 0,687

1,980 0,706 J855 1,941 0,689 1,935 0,689 0,356 0,681

1,929 0,689 J796 1,872 0,729 1,881 0,720 0,383 0,733

1,889 0,711 J707 1,965 0,697 1,962 0,708 0,361 0,690

1,958 0,718 J694 1,855 0,721 1,860 0,727 0,391 0,748

1,865 0,733 J643 1,841 0,689 1,854 0,692 0,373 0,714

1,867 0,694 J603 1,956 0,701 1,955 0,714 0,365 0,677

1,953 0,727 J589 1,821 0,794 1,849 0,779 0,421 0,806

1,876 0,763 J583 1,891 0,720 1,911 0,708 0,370 0,708

1,931 0,695 J541 1,666 0,747 1,690 0,741 0,438 0,749

1,714 0,734 J518 1,873 0,699 1,883 0,705 0,375 0,717

1,892 0,711 J498 1,793 0,704 1,789 0,707 0,395 0,636

1,784 0,709 J473 1,795 0,790 1,802 0,755 0,419 0,717

1,809 0,720 J452 1,774 0,735 1,782 0,728 0,408 0,698

1,790 0,720 J451 1,817 0,715 1,812 0,719 0,397 0,678

1,806 0,722 J411 1,767 0,718 1,780 0,708 0,398 0,680

1,793 0,698 J402 1,749 0,725 1,767 0,710 0,402 0,687

1,784 0,695 J392 1,814 0,708 1,820 0,717 0,394 0,674

1,825 0,726 J380 2,239 0,831 2,056 0,783 0,381 0,651

1,873 0,735 J325 2,103 0,801 2,141 0,824 0,385 0,658

2,178 0,847 J293 2,161 0,814 2,153 0,820 0,381 0,651


45

2,145 0,825 J291 2,225 0,817 2,201 0,811 0,369 0,630

2,176 0,805 J279 2,044 0,830 2,076 0,834 0,402 0,687

2,108 0,838 J277 2,140 0,787 2,139 0,791 0,370 0,632

2,138 0,795 J249 2,099 0,779 2,106 0,777 0,369 0,631

2,113 0,775

Preglednica XVII: Rezultati alelne diskriminacije za vzorce bolnikov z ET, ki niso imeli

prisotne mutacije MPL W515K

Vzorec Alel X Alel Y Povprečje alel X Povprečje

alel Y


alel X (alel Y/ alel X)/

(COS alel Y/alel X)

J2170 1,888 0,580 1,907 0,592 0,310 0,586 1,926 0,603

J2123 1,788 0,596 1,831 0,626 0,342 0,646 1,873 0,655

J2113 2,350 0,663 2,269 0,671 0,296 0,476 2,188 0,678

J2054 1,920 0,603 1,932 0,598 0,310 0,585 1

Documents

LEONIDA KOVAČIČ VPELJAVA METODE DOLOČITVE MUTACIJ … · 2011. 2. 16. · mastocitoza, neklasificirane MPN . Diplomska naloga Leonida Kovačič 2 1.1.1 ESENCIALNA TROMBOCITEMIJA